Universidad Austral de Chile

Facultad de Ciencias Agrarias

Escuela de Ingeniería en Alimentos

Desarrollo y Validación de Metodología para

Determinación de Edulcorantes en Alimentos

Memoria presentada como parte de los

requisitos para optar al título de
Ingeniero en Alimentos

Pía Javiera Troncoso Gjakoni

Valdivia – Chile
2014
PROFESOR PATROCINANTE:

____________________________________
Ociel Muñoz Fariña
Bioquímico, Ph. D
Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos

PROFESORES INFORMANTES:

____________________________________
Bernardo Carrillo López
Ingeniero Agrónomo
Master en Ciencia e Ingeniería en Alimentos
Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos

___________________________________
Kong Shun Ah-Hen
Ingeniero en Alimentos
Doctor en Ingeniería
Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos
 i

INDICE DE MATERIAS

Capítulo 1 Página

RESUMEN 1

SUMMARY 2

1 INTRODUCCIÓN 3

2 MATERIAL Y MÉTODO 10

2.1 Ubicación del estudio 10

2.2 Materiales 10

2.2.1 Sacarina y aspartamo 10

2.2.2 Muestras de alimentos con sacarina y aspartamo 10

2.2.3 Reactivos 10

2.2.4 Soluciones 10

2.2.5 Equipos e instrumentos 10

2.3 Métodos 11

2.3.1 Método de extracción para muestras con edulcorantes 11

2.4 Determinación de parámetros instrumentales y experimentales para 11

la detección de sacarina por HPLC/UV visible

2.4.1 Preparación de los estándares 12

2.4.2 Preparación de la curva de calibración 12

2.5 Validación de metodología 13

2.5.1 13
 ii

2.5.2 Límite de decisión y capacidad de detección 14

2.5.3 Exactitud 14

2.6 Precisión 15

Cuantificación del contenido de sacarina en diversas muestras

2.7 Análisis estadístico de resultados 15

3 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 16

3.1 Determinación para análisis cromatográfico 16

3.2 Validación 17

3.2.1 Curvas de calibración 17

3.2.2 Sensibilidad, exactitud y precisión 18

3.3 Método de extracción 18

3.4 Análisis cromatográficos de las muestras 20

3.4.1 Materias primas para análisis 20

3.4.2 Mermeladas 21

3.4.3 Jugos en polvo 21

3.4.4 Bebidas analcohólicas carbonatadas 22

3.5 Análisis estadístico 22

3.5.1 Comparación de muestras analizadas con sacarina 23

3.5.2 Comparación de muestras analizadas con aspartamo 24

4 CONCLUSIONES 25
 iii

5 BIBLIOGRAFÍA 26

ANEXOS 28
 iv

INDICE DE CUADROS

Cuadro Página

1 Edulcorantes admitidos por el Reglamento Sanitario de los Alimentos 4

con su respectivo IDA

2 Condiciones de detección HPLC para sacarina y aspartamo 12

Características analíticas de la metodología para determinación

3 18
de sacarina y aspartamo

4 Contenido de sacarina presente en las materias primas utilizadas 20

para realizar el análisis cromatográfico

5 Contenido de aspartamo presente en las materias primas utilizadas 21

para realizar el análisis cromatográfico
 v

INDICE DE FIGURAS

Figura Página

1 Estructura química edulorantes, sacarina (1) y aspartamo (2) 6

2 Esquema general de un sistema de HPLC 7

3 Detector UV/Vis de longitud de onda variable 8

4 Cromatograma de mezcla de patrones, que muestra los tiempos de 17

retención de sacarina y aspartamo a una concentración de 10µg/mL
cada analito

5 Cromatograma curva de calibración de sacarina, obtenida con el 19

método de extracción que utiliza el reactivo de carrez

6 Cromatograma curva de calibración de aspartamo, obtenida con el 19

método de extracción que utiliza el reactivo de carrez

7 Gráfico de caja y bigotes que ilustra la comparación de la cantidad de 23

sacarina entre las diferentes muestras (n=6)

8 Gráfico de caja y bigotes que ilustra la comparación de la cantidad de 24

aspartamo entre las diferentes muestras (n=7)
 vi

INDICE DE ANEXOS

Anexo Página

1 Fotografía del equipo utilizado en la determinación de endulzantes 29

2 Curvas de calibración de analitos: sacarina, aspartamo 30

3 Curvas promedio 34

4 Límite de decisión Ccα para sacarina y aspartamo 36

5 Límite de decisión Ccα para sacarina y aspartamo 38

6 Exactitud y precisión 39

7 Resumen y presentación de la cuantificación de las muestras 40

expresadas en g/100g

8 Análisis estadístico 41
 1

RESUMEN

El propósito de esta investigación fue desarrollar una metodología para la extracción,

separación y cuantificación de dos edulcorantes artificiales: sacarina y aspartamo,
mediante cromatografía liquida de alta resolución acoplado a un detector UV visible
(HPLC-UV/VIS), con la finalidad de corroborar que se cumpla con lo declarado en el
etiquetado de los alimentos. Este estudio se realizó a varias muestras de alimentos
obtenidas en el mercado, tales como bebidas analcohólicas carbonatadas, jugos en
polvo y mermeladas.

El método analítico cromatográfico desarrollado permitió la separación y cuantificación

de sacarina y aspartamo, estos fueron ejecutados a las mismas condiciones hasta
conseguir la separación cromatográfica y detección de los analitos a diferentes tiempos
de retención. Se optimizó un método de extracción para lo analitos presentes en las
muestras.

A partir de los resultados obtenidos se logró determinar que las concentraciones de

estos analitos en las muestras, cumplía con la cantidad declarada en el etiquetado,
cumpliendo así mismo lo señalado en los parámetros establecidos por el Reglamento
Sanitario de los Alimentos

Además, se comprobó la separación de los analitos y se obtuvieron los diferentes

tiempos de retención de los picos cromatográficos de la sacarina y el aspartamo,
lográndose definir y validar el método para cuantificar estos edulcorantes
 2

SUMMARY

This investigation purpose was to develope an extraction, separation and quantification

methodology of two synthetic sweeteners (saccharin and aspartame) through high
resolution liquid chromatography coupled to an UV/ VIS detector. In order to verify
compliance of food nutrition facts, several samples like carbonated soft drinks powder
juices and jam were analyzed.

The analytical method developed allowed saccharin and aspartame separation and
quantification. Both sweeteners were treated in the same conditions until the
chromatographic separation were achieved and the analytes were detected at diferent
retention times. Then, a samples analytes extraction method were optimized.
From the results it was determinated that the analytes concentration in samples satisfy
the amount shown at the nutrition facts. Thus fulfilling the established Food regulation
parameters.

Moreover the analytes separation were checked and saccharine and aspartame
chromatographic peaks of differents retention times were obtained. Gettig the
sweetener quantification method define an validate.
 3

1 INTRODUCCIÓN

Hoy en día los consumidores tienden a elegir los alimentos con edulcorantes ya que
son bajos en calorías, porque prefieren el sabor de la dulzura sin calorías.

El Reglamento Sanitario de los Alimentos (artículo 146), considera como edulcorante

no nutritivo a sustancias que no aportan energía, los que se agregan a los alimentos
para proporcionar un sabor dulce y se emplean para reemplazar total o parcial el
azúcar.

CHATTOPADHYAY et al. (2011), señalan que las personas están cada vez más
preocupadas por el peso y por las consecuencias relacionadas con la salud, es por
esto que la gran mayoría hace un esfuerzo por mantener o bajar su peso y a su vez
cuidar su salud. Por esta razón, la industria alimentaria está utilizando varias
alternativas de edulcorantes como reemplazo de la sacarosa en alimentos, para poder
así ofrecer a los consumidores un sabor dulce que no aporte calorías, y a su vez,
dichos productos podrán ser utilizados especialmente en tratamientos de obesidad y
diabetes.

Existen muchas alternativas que reemplazan la sacarosa. Dentro de estas alternativas

están los edulcorantes no nutritivos, los que se utilizan en diversos alimentos, bebidas,
productos farmacéuticos y cosméticos (DI PIETRA et al., 1990). Estos proporcionan un
dulzor 200 o 300 veces más que la sacarosa y son comúnmente usados para el
control de calorías en personas con sobrepeso o bajo ciertas condiciones médicas
como diabéticos o hiperglicemicos (UNTERHALT, 1975). Por otro lado, los
edulcorantes artificiales funcionan también como sustituyentes de la sacarosa para
abaratar costos en variados productos. Estos sustituyentes no producen grandes
cambios ni alteraciones en las características sensoriales del producto. Sin embargo, el
Reglamento Sanitario de los Alimentos (artículo 146), sólo permite usar edulcorantes
no nutritivos en los alimentos para regímenes de control de peso; en los alimentos
bajos en grasas y/o calorías; y en los alimentos libres, bajos, reducidos o livianos en
calorías, pudiendo emplearse únicamente los que se indican a continuación (CUADRO
1):
 4

CUADRO 1. Edulcorantes admitidos por la FAO/OMS con su respectiva Ingesta

Diaria Admitida (I.D.A.)

Edulcorante no nutritivo I.D.A.

mg/kg peso corporal

Acesulfamo de potasio 0 – 15

Alitamo 0–1

Aspartamo 0 – 40

Ciclamato de sodio y de calcio 0–7

Sacarina de sodio y de calcio 0–5

Sucralosa 0 – 15

Neotamo 0–2

Glicosidos de esteviol (estevia) 0–4

FUENTE: CHILE MINISTERIO DE SALUD (2014).

En cuanto a la salud, muchos atribuyen el papel de los edulcorantes en el riesgo de

cáncer, pero, durante la última década, los edulcorantes artificiales y el posible riesgo
de producir cáncer no se ha discutido como en años anteriores, aunque algunas de las
investigaciones sobre la sacarina y el ciclamato han sido recientemente completadas y
publicadas (GIANNUZZI y MOLINA, 1995). Después que se comenzó a utilizar el
ciclamato y el aspartamo en la industria de alimentos, enfermedades como el cáncer
de vejiga no se podía asociar solo al consumo de sacarina, porque la mayoría de los
consumidores acostumbraban a ingerir diferentes edulcorantes artificiales. Con
respecto al aspartamo, un estudio realizado en Estados Unidos logró determinar que
no existe relación entre el aspartamo que contienen las bebidas dietéticas y el riesgo
de algún tipo de cáncer. (DURÁN et al., 2011).

Por otro lado, ALONSO (2010), señala que los estudios referidos a edulcorantes
sintéticos y su seguridad, aún son tema de debate sin obtener todavía conclusiones
definitivas.
 5

Los edulcorantes no nutritivos no son dañinos para la salud ya que tienen una cantidad
estipulada por la FAO/OMS, la cual puede ser consumida durante toda la vida sin que
esta dañe la salud de las personas, por eso, es importante que en la elaboración de los
alimentos se respete el I.D.A. que debe estar indicado en la rotulación de los alimentos
que contienen estos productos, deberá indicarse en forma destacada su agregado
como aditivo y la cantidad de edulcorante por porción de consumo habitual servida y
por cada 100 g o 100 mL del producto listo para el consumo, señalando, además, para
cada edulcorante utilizado los valores de ingesta diaria admisible (I.D.A.), en mg/kg de
peso corporal, según recomendaciones de FAO/OMS (CHILE, MINISTERIO DE
SALUD 2014).

El primer endulzante químico de distribución masiva en los alimentos bajos en calorías

fue la sacarina (FIGURA 1). Es el edulcorante más antiguo, es una sulfamida. La
sacarina es aproximadamente 300 veces más dulce que el azúcar y no aporta calorías,
presenta un gusto metálico en altas concentraciones (DURÁN et al., 2013)

El aspartamo (FIGURA 1) (N-L- alpha-asparti-L-fenilalanina-1-metil ester; Nutrasweet),

se usa principalmente para reemplazar edulcorantes naturales y su dulzor es entre 200
y 300 veces más que el de la sacarosa (SALES et al., 2013).

Según SOFFRITTI et al., (2006), este producto se encuentra en más de 6.000

productos, dentro de los cuales incluye bebidas analcoholicas carbonatas, jugos en
polvo, chocolates, gomas de mascar, mermeladas, postres, yogurt, entre otros.
La molécula de aspartame está compuesta por dos aminoácidos naturales: fenilalanina
y ácido aspártico, los cuales le dan al aspartame características hidrofóbicas e
hidrofilicas (CUPPEN et al., 2004). CHILE. MINISTERIO DE SALUD (2014) señala que
al contener el compuesto fenilalanina, este debe estar especificado en el producto
como se indica en el en caso de empleo de aspartamo, se deberá indicar en forma
destacada en la rotulación: “Fenilcetonúricos; contiene fenilalanina”.
 6

FIGURA 1. Estructura química edulorantes, sacarina (1) y aspartamo (2).

FUENTE: ORDÓÑEZ et al. (2012).

Los niveles de consumo diario de estos productos se expresan mediante el valor de

IDA (Ingesta Diaria Admisible) la cual representa la cantidad de sustancia que puede
ser consumida todos los días durante toda la vida de una persona sin producir daño a
la salud. La misma se expresa en mg/kg de peso corporal/día. El CUADRO 1, muestra
la IDA la que es estipulada por los organismos internacionales regulatorios sobre
alimentos (ALONSO, 2010).

Para la determinación de los edulcorantes en los alimentos se utilizó cromatografía

líquida de alto rendimiento, la que es ahora una de las herramientas más poderosas y
empleadas en la química analítica (QUATTROCCHI et al., 1992). Tiene la capacidad
de separar, identificar y cuantificar los compuestos que están presentes en cualquier
muestra que se puede disolver en un líquido. Hoy en día, compuestos en
concentraciones tan bajas como partes por billón [ppb = ng/mL] pueden ser fácilmente
identificados. La utilización del HPLC-UV/Vis se ha aplicado a casi cualquier muestra,
tales como productos farmacéuticos, alimentos, nutracéuticos, cosméticos, matrices
ambientales, muestras forenses, y productos químicos industriales. En la FIGURA 2 se
observa un esquema de un HPLC-UV/Vis.

En la actualidad la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC-UV/Vis) ha llegado a

ser una de las técnicas de laboratorio más importantes como herramienta analítica
para separar y detectar compuestos químicos. Según BRUNO et al. (2014), la técnica
de la cromatografía líquida de alta resolución con detección ultravioleta (HPLC-UV/Vis),
 7

es la comúnmente utilizada para la separación, identificación y cuantificación de

endulzantes en alimentos y bebidas libre de azúcar.

Junto con el HPLC-UV/Vis, se utiliza una columna, donde una sílice unida-C8, es el
tipo de columna más utilizado para HPLC-UV/Vis de fase reversa, ya que, por tener
una capacidad mas reproducible y una amplia aplicabilidad, la cromatografía de fase
reversa se utiliza en al menos 75% de los métodos de HPLC. Se usa principalmente
una fase móvil de mezcla acuosa de agua con disolvente miscible, polar orgánico como
acetonitrilo o metanol. Esto garantiza la correcta interacción de analitos con la
superficie de la partícula no polar o hidrófoba.

FIGURA 2. Esquema general de un sistema de HPLC-UV/Vis

Fuente:http://www.waters.com/waters/en_US/HowDoesHighPerformanceLiquidChroma
tographyWork%3F/nav.htm?locale=es_ES%20.&cid=10045

En la FIGURA 3, se puede observar un detector UV/Vis de longitud de onda variable.

Los detectores UV más modernos son capaces de trabajar a cualquier longitud de
onda entre 190 y 900 nm. En la realización de esta memoria, se utilizó una detección
de analitos por medio de HPLC-UV/Vis con una longitud de onda fija de 220 nm (REE y
STOA, 2011). Esto se aplicó para sacarina y aspartamo, a esta absorbancia fueron
detectados ambos analitos y a diferentes tiempos.
 8

FIGURA 3. Detector UV/Vis de longitud de onda variable

Fuente:http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia/cro
matografia_liquida_de_alta_eficacia.pdf

Hipótesis:

Determinar y cuantificar sacarina y aspartamo mediante cromatografía líquida de alta

resolución acoplada a un detector UV visible (HPLC-UV/Vis) utilizando las mismas
condiciones para ambos analitos.

Objetivo general

Desarrollar y validar un método para la extracción, separación y cuantificación de dos

edulcorantes artificiales: sacarina y aspartamo, mediante un equipo de HPLC-UV/Vis.

Objetivos específicos

 Desarrollar un método de extracción de edulcorantes artificiales.

 Desarrollar y validar un método para la determinación simultánea y

cuantificación de dos edulcorantes artificiales: sacarina y aspartamo, mediante
la técnica de cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un detector de
ultravioleta (HPLC-UV/Vis).
 9

 Cuantificar sacarina y aspartamo en diferentes muestras de alimentos

adquiridas en el mercado y con esto comprobar si se cumple con los niveles
establecidos por la autoridad sanitaria.
 10

2 MATERIAL Y MÉTODO

2.1 Ubicación del estudio

El desarrollo de la parte experimental fue realizado en el laboratorio de análisis

instrumental, ubicado en el Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos ICYTAL,
perteneciente a la Facultad de Ciencias Agrarias, de la Universidad Austral de Chile.

2.2 Materiales

2.2.1 Sacarina y aspartamo. La sacarina sódica utilizada para los análisis

cromatográficos fue adquirida en Merck. El aspartamo fue adquirido en el mercado.

2.2.2 Muestras de alimentos con sacarina y aspartamo. Se realizó una búsqueda

de todos los posibles alimentos que tuvieran como ingrediente estos edulcorantes:
jugos en polvo, bebidas analcoholicas carbonatadas y mermeladas. Estas muestras
fueron obtenidas de diferentes supermercados.

2.2.3 Reactivos. Acetonitrilo (PA), ácido fosfórico, ácido acético glacial, acetato de
zinc, ferrocianuro de potasio adquiridos en Merck.

2.2.4 Soluciones. En la extracción de edulcorantes se utilizó:

Solución de Carrez I. Se preparó disolviendo 24 g de acetato de zinc

Zn(CH3COO)2*2H20 y 3 g de ácido acético glacial en 50 ml de agua desionizada,
aforado a 100 mL con agua (calidad HPLC).

Solución de Carrez II: se disuelven 10,6 g ferrocianuro potásico Fe (CN)6 K4*3H20 en 50

ml de agua (calidad HPLC) y se afora a 100 mL con agua desionizada.

2.2.5 Equipos e instrumentos. Se utilizaron los siguientes equipos e instrumentos:

cromatógrafo de alta resolución Merk Hitachi L-6200 A Intelligent pump, detector Merk
Hitachi L-450 UV-VIS, WatersTM 717 plus Autosampler, horno columna WatersTM
temperature control Module II; columna: LiChroCART® HPLC-Kartusche, HPLC
cartridge, LiChrospher®100 RP-18 (5µm) (250 x 4,6 mm) y columna: Nucleosil C18
(5µm) (250 x 4,6 mm); la integración de los picos cromatográficos se realizó mediante
el Software integrador Clarity®.
 11

2.3 Métodos

2.3.1 Método de extracción para muestras con edulcorantes. Se pesaron 2,5 g de

muestra homogenizada (muestra sólida) o 10 mL de muestra líquida y trasladar a tubo
falcon de 50 mL, se adicionan 10 mL de agua desionizada y se calienta a 60°C por 30
minutos. Luego enfriar y agregar 5 mL de carrez I y 5 mL de carrez II, agitar y enrazar a
50 mL con agua grado HPLC. Se dejó decantar y se tomó con una pipeta 1.5 mL de
una alícuota del sobrenadante, el cual es trasladado a un tubo eppendorf, este es
centrifugado a 12.000 rpm por 12 minutos. Una vez que la muestra esté transparente
se inyecta en HPLC-UV/Vis (ANEXO 1).

2.4 Determinación de parámetros instrumentales y experimentales para la

detección de sacarina por HPLC/UV visible

Primero se realizó la preparación de los patrones para obtener las curvas de

calibración, y lograr validar esta metodología. Una vez validado el método se llevó a
cabo el proceso de extracción de cada muestra la cual es inyectada en el HPLC/UVvis,
este entrega los cromatogramas con las áreas de cada analito. Finalmente, se
cuantifican las muestras, para determinar la sacarina y su concentración. El CUADRO
2 presenta las condiciones instrumentales para la determinación de sacarina y
aspartamo.
 12

CUADRO 2. Condiciones de detección HPLC-UV/Vis para sacarina y aspartamo

Sacarina Aspartamo

Columna LiChroCART® HPLC- Alitech Nucleosil C18

Kartusche, HPLC cartridge, 250 x 4,6 mm, 5µm de
LiChrospher®100 RP-18 tamaño de particula.
(5µm) (250 x 4,6 mm)
Fase móvil Buffer fosfato/acetonitrilo Buffer fosfato/acetonitrilo
95:5 v/v 95:5 v/v
Flujo (ml/min) 1,0 1,0
Presión (bar) 146 146
Temperatura (°C) 30 30
Tiempo de retención 5,167 16,097
(min)
Detección (nm) 220 220
Volumen de inyección 20 20
(muestras) (μl)
Modo Isocrático Isocrático

2.4.1 Preparación de los estándares. Los patrones de sacarina se prepararon

pesando 0.625 g de este aditivo, enrazado con agua grado HPLC a 25 mL. La muestra
patrón queda a una concentración de 25.000 µg/mL.

Los patrones de aspartamo se prepararon pesando 8,33g de este aditivo en un matraz

aforado y enrazado con agua grado HPLC a 25 mL. La muestra patrón queda a una
concentración de 10.000 µg/mL.

2.4.2 Preparación de la curva de calibración. La curva de calibración se realizó

preparando en un matraz aforado una solución que contenía 0,625 g de sacarina,
luego se llevó al aforo (25 mL) con agua desionizada, obteniendo una solución de
25.000 µg/mL. A partir del patrón inicial de 25.000 µg/mL, se prepararon diferentes
 13

patrones de sacarina con distintas concentraciones: 2,5, 12,5, 25, 62,5, 87,5 y 125
µg/mL.
Para la curva de calibración de aspartamo, se preparó de la misma manera pero se
pesaron 8,33g de aspartamo, luego se llevo al aforo (25 mL) con agua desionizada,
obteniendo una solución de 10.000 µg/mL. A partir del patrón inicial de 10.000 µg/mL,
se prepararon diferentes patrones de aspartamo con distintas concentraciones: 2,5,
12,5, 25, 62,5, 87,5 y 125 µg/mL.
Los patrones de sacarina y aspartamo, fueron inyectados en el cromatógrafo, se
analizó 6 veces donde se obtuvieron 6 curvas de calibración.

2.5 Validación de metodología

Para validar la metodología se determinaron los límites de decisión, capacidad de

detección, precisión y exactitud.
2.5.1 Límite de decisión (Ccα) y capacidad de detección (Ccβ). Son los valores
establecidos por la norma ISO 11.843. Ccα corresponde, según la definición ISO, al
límite en el cual y a partir del cual se puede concluir con una probabilidad de error “α”
que una muestra no es conforme. Dicho límite igualmente corresponde a una
concentración mínima, que establece en este caso una probabilidad de un falso
positivo de un 1%. Se obtiene con el valor del intercepto de una curva de calibración
promedio 𝜸𝒐 , pero se le suma la desviación estándar (σ) del valor multiplicado por 2,33
(que representa un α=0.01 con una varianza constante en el intervalo del ruido a σ).
Ccβ es la capacidad de detección que por definición corresponde al contenido mínimo
de la sustancia que puede ser detectado, identificado o cuantificado en una muestra
con una probabilidad de error β.
Estadísticamente corresponde a la probabilidad de obtener un falso negativo en un 5%.
Se procede analizando un blanco de muestra enriquecido con analito hasta el límite de
decisión (Ccα). Este blanco enriquecido pasa por todo el proceso analítico del método.
El proceso se repite 20 veces. Se analiza y se calcula desviación estándar (σ) de la
determinación. El resultado se obtiene sumando al límite de decisión la σ obtenida
multiplicada por 1,64.

𝐶𝑐𝛼 = 𝛾𝑜 + (2,33 × 𝜎) 𝐶𝑐𝛽 = 𝐶𝑐𝛼 + (1,64 × 𝜎)

 14

2.5.2 Exactitud. Es el grado de concordancia entre el resultado del ensayo y un valor

de referencia aceptado, también la exactitud indica la proximidad de la medición con
respecto del valor de referencia que se ha usado para calibrar el instrumento,
expresándose como porcentaje de recuperación (%R).
Para calcular la exactitud, en el caso de no existir patrones de referencia certificados
para el analito en cuestión se recurre a la determinación de la “Recuperación”, para ello
debe usarse un blanco de muestra adicionado de una cantidad conocida de analito,
sometido al procedimiento analítico. Esto debe repetirse a los menos 3 veces.

(𝐶𝐹 − 𝐶𝑉)
%𝑅 = × 100
𝐶𝐴

Donde:
Porcentaje (%) R: Porcentaje de recuperación
CF: Concentración del analito medida en la muestra fortificada.
CV: Concentración del analito medida en la muestra sin fortificar.
CA: Concentración del analito adicionada.

2.5.3 Precisión. Describe la reproducibilidad de los resultados, concordancia entre los

valores numéricos de diferentes mediciones obtenidos analíticamente determinados en
el mismo equipo bajo las mismas condiciones, se expresa habitualmente como el
coeficiente de variación (CV).

𝜎
%𝐶𝑉 = 𝑥100
X
Donde:
Porcentaje (%) CV: Porcentaje de coeficiente de variación.
σ : Desviación estándar.

X : Promedio.
 15

2.6 Cuantificación del contenido de sacarina en diversas muestras

Los cromatogramas de cada muestra fueron solapados con los obtenidos al inyectar
los patrones, esto se hizo con la finalidad de comparar los picos conseguidos en cada
muestra con los estándares evaluados y saber si realmente correspondían a los
edulcorantes en estudio; hay que tener en cuenta que en un equipo de HPLC los
cambios de temperatura y fase móvil, afectan el tiempo de retención de los analitos, y
las muestras pueden poseer distintos componentes, es por esta razón que se usa un
horno columna para mantener la temperatura constante mientras dure el análisis.

2.7 Análisis estadístico de resultados

Los datos obtenidos de los edulcorantes presentes en las muestras, se analizaron con
el programa STATGRAPHICS centurión (ANEXO 7).
 16

3 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

3.1 Determinación para análisis cromatográfico

Se utilizó un eluente isocratico para la separación de la sacarina y el aspartamo,

SERDAR y KNEZEVIC (2011), propone que la fase móvil utilizada para la
determinación de los respectivos edulcorantes, debe contener los solventes buffer
fosfato (0,0125 mol L-1 y pH3,5) y acetonitrilo en proporción 75:15 v/v, con un flujo de
1,5 mL/min y un volumen de inyección de 10 µL. Sin embargo, las condiciones se
modificaron antes de comenzar los análisis, quedando entonces la fase móvil con los
solventes buffer fosfato (0,0125 mol L-1 y pH 3,25) y acetonitrilo, en proporción 95:5v/v.
Se utilizó un flujo de 1,0 ml/min como señala REE y STOA. (2011) y un volumen de
inyección de 20 µL. La temperatura de columna recomendada por el autor era de 35°C,
la cual fue modificada y se utilizó una temperatura de 30°C. La detección de ambos
analitos fue de 220 nm.

Se determinó que la separación óptima de los 2 patrones, es en forma isocrática,

donde se utilizaron dos columnas: LiChroCART® HPLC-Kartusche, HPLC cartridge,
LiChrospher®100 RP-18 (5µm) (250 x 4,6 mm) y Nucleosil C18 (5µm) (250 x 4,6 mm),
esto se debió a que una vez terminado los primeros análisis (sacarina) la columna tuvo
que ser reemplazada y para el análisis de aspartamo se utilizó otra columna que
cumplía con las mismas características. Fue necesaria también una mezcla de
solventes Buffer fosfato y acetonitrilo en proporción 95:5 v/v, con un flujo de 1,0mL/min,
detección de 220 nm y una temperatura del horno columna de 30°C.

A partir de las condiciones de fase móvil, temperatura de horno de columna y el flujo

detallado anteriormente, se determinó el orden de elusión de los edulcorantes, que
corresponde a sacarina y aspartamo, obteniéndose también los tiempos de retención.
Inicialmente los estándares (sacarina y aspartamo), se analizaron por separado, donde
se hicieron pruebas a distintas concentraciones. Una vez establecidos los parámetros
para obtener una separación adecuada, para identificar los picos cromatrográficos se
preparó una mezcla de patrones para determinar en una sola inyección los tiempos de
retención de cada analito. El tiempo de corrida de la muestra fue de 21 minutos.
 17

En la FIGURA 4 se puede ver una clara definición y separación de los analitos en

estudio (en el cromatograma se designa a cada endulzante con su siglas en
mayúscula). Además se presentan los picos con su tiempo de retención para cada
analito, apareciendo en primer lugar la sacarina a los 5,167 min, seguido por el
aspartamo a los 16,097 min. Con esta primera aproximación se determinó que este
método era adecuado para la separación y cuantificación de los dos edulcorantes
analizados.

FIGURA 4. Cromatograma de la mezcla de patrones, que muestra los tiempos

de retención de sacarina y aspartamo a una concentración de
10µg/mL cada analito.

3.2 Validación
Una vez desarrollado un método de análisis por HPLC-UV/Vis, al igual que toda técnica
analítica, esta debería validarse para demostrar su idoneidad, es decir, se debe
confirmar y documentar que los resultados producidos por el son confiables.
(QUATTROCCHI et al., 1992).
3.2.1 Curva de calibración. Para validar la metodología se realizaron 6 curvas de
calibración, pero como se determinaron dos endulzantes en forma simultánea se
genera una curva de calibración para cada uno de los analitos, obteniendo 12 curvas
en total (ANEXO 2), las que mostraron una buena linealidad. Para cada edulcorante en
estudio se obtuvo una curva de calibración promedio (ANEXO 3). Con las curvas de
calibración promedio, se obtienen las ecuaciones para el cálculo de la concentración
 18

de estos analitos presentes en las muestras. Los resultados del ensayo se resumen en
en el ANEXO 7.
3.2.2 Sensibilidad, exactitud y precisión. Estos parámetros fueron determinados
separadamente para los dos edulcorantes en estudio.
Según QUATTROCHI et al. (1997), la sensibilidad de un método, corresponde a la
mínima cantidad de analito que puede producir un resultado significativo. Los límites de
decisión y capacidad de detección definidos por ISO (Ccα y Ccβ), no presentan una
diferencia dramática entre sí.
La precisión se relaciona con la dispersión de las medidas alrededor de su valor medio
o central, el cual corresponde al grado de concordancia entre ensayos individuales. Por
otro lado, la exactitud de un método o error sistemático, corresponde al valor medio
obtenido comparado con el verdadero o aceptado. Estos parámetros se presentan en
el CUADRO 3.

CUADRO 3. Características analíticas de la metodología para determinación de

sacarina y aspartamo
Parámetros Sacarina Aspartamo
Límite de decisión Ccα (ppm) 0,79 2,27
Capacidad de detección Ccβ (ppm) 1,00 2,11
Exactitud (%) 102,4 73,8
Precisión (%) 4,2 4,4

3.3 Métodos de extracción

En este estudio se desarrolló el método de extracción, que se utiliza para diversas

matrices orgánicas, el cual es un procedimiento para la extracción de pequeñas
moléculas solubles que se ha usado habitualmente en la determinación de
conservantes como ácido sórbico y benzoico por HPLC-UV/Vis en alimentos de origen
vegetal, utilizando el reactivo de carrez.
Esta técnica fue probada haciendo una curva de calibración (FIGURA 5 y 6) y luego
obtenida la curva se fue inyectando cada muestra por triplicado en el HPLC-UV/Vis, la
cual demostró ser una técnica de extracción muy eficiente, obteniéndose una buena
 19

separación y definición de los picos. Este método logró una extracción donde se obtuvo
una matriz transparente y homogénea.

FIGURA 5. Cromatograma curva de calibración de sacarina, obtenida con el

método de extracción que utiliza el reactivo de carrez.

FIGURA 6. Cromatograma curva de calibración de aspartamo, obtenida con el

método de extracción que utiliza el reactivo de carrez.
 20

3.4 Análisis cromatográficos de las muestras

Una vez validada la metodología se comenzó a probar la técnica de extracción

propuesta anteriormente, donde se realizaron pruebas para la determinación de
edulcorantes en alimentos en diferentes muestras adquiridas en el mercado.

Se analizaron primero los patrones, para poder identificar si las condiciones

cromatográficas de trabajo eran las adecuadas para la identificación de los picos. Una
vez identificados los picos de sacarina y aspartamo, se prepararon las diferentes
muestras de jugos en polvo, gaseosas dietéticas y mermeladas, a las cuales se les
aplicó un método de extracción con reactivo de carrez.

3.4.1 Materias primas para análisis. Se analizaron las diferentes muestras adquiridas
en el mercado. Estas muestras correspondían a mermeladas (MM, MJ y MW), jugos en
polvo (JF, JC, JY y JLV) y bebidas analcohólicas carbonatadas (BM, CC, CD, LS) de
diferentes marcas. Las cantidades promedio de los analitos y la cantidad de
edulcorante que contiene cada muestra, están representados en los CUADROS 4 y 5,
donde se observa la diferencia entre el contenido de edulcorante rotulado y la cantidad
de analito determinado. Algunos de los productos no indican la cantidad exacta que se
le agrega, como es en el caso de la muestra BM y MJ (CUADROS 4 y 5), sin embargo
en el caso de la muestra MJ no se excede la cantidad de edulcorante artificial
recomendada por la FAO/OMS (CUADRO 1).

CUADRO 4. Contenido de sacarina presente en las materias primas utilizadas

para realizar el análisis cromatográfico

Sacarina rotulada Sacarina determinada

Muestras (mg/100g) (mg/100g)
BM 7,5 52,22
MM 36,00 31,33
MJ 9,45 10,75
JF 12,50 9,79
JC 14,00 16,10
JY 18,00 9,72
 21

CUADRO 5. Contenido de aspartamo presente en las materias primas utilizadas

para realizar el análisis cromatográfico

Aspartamo rotulado Aspartamo determinado

Muestras (mg/100g) (mg/100g)
BM 7,7 9,08
CC 48,00 21,1
CD 50,00 47,73
LS 50,00 65,62
MW 50,00 84,71
MJ 100,50 157,26
JLV 34,00 19,87

3.4.2 Mermeladas. Con la denominación genérica de "confituras", se entienden los

productos obtenidos por cocción de frutas, hortalizas o tubérculos (enteros o
fraccionados), sus jugos y/o pulpas, con azúcares (azúcar, dextrosa, azúcar invertido,
jarabe de glucosa o sus mezclas) con o sin adición de otros edulcorantes, aditivos e
ingredientes (CHILE. MINISTERIO DE SALUD, 2014).

La dosis máxima de sacarina permitida según el Codex Aditivos (2007), en confituras,

jaleas y mermeladas es de 20 mg/100g. De las muestras analizadas y mencionadas en
el CUADRO 4, la muestra MJ cumple con el rango establecido tanto en el rotulado
como en la muestra de mermelada analizada, a diferencia de la muestra MM que
sobrepasa en 11 mg/100g la dosis máxima establecida.

En cuanto al aspartamo, para el Codex Aditivos (2007), la dosis máxima de aspartamo

es de 100 mg/100g. En el CUADRO 5 se puede observar que la muestra MW cumple
con lo establecido, no así, la muestra MJ, ya que la muestra analizada sobrepasa en
57 mg/100g la dosis máxima establecida.

3.4.3 Jugos en polvo. El Reglamento Sanitario de los Alimentos (CHILE. MINISTERIO

DE SALUD, 2014) indica que los polvos para preparar refrescos o bebidas
instantáneas en polvo son los productos constituidos por mezclas de azúcares o
mezclas de azúcares y edulcorantes autorizados o mezclas de edulcorantes
autorizados, acidulantes, saborizantes, colorantes, con o sin adición de enturbiantes y
otros ingredientes.
 22

Las dosis máxima recomendada de sacarina para jugos en polvo es de 20 mg/100g

(CODEX STAN 192-1995). Según lo observado en el CUADRO 4, las muestras JF, JC
y JY cumplen con la cantidad de analito establecido en el Codex Aditivos (2007).

El Codex Aditivos (2007), señala que la dosis máxima de aspartamo es de 100

mg/100g. En el CUADRO 5, se observa que la muestra JLV cumple con lo establecido
en el rotulado y en los valores de aspartamo analizado.

3.4.4 Bebidas analcohólicas carbonatadas. Según el Reglamento Sanitario de los

Alimentos (CHILE. MINISTERIO DE SALUD, 2014), son bebidas analcohólicas
aquellas elaboradas a base de agua potable, carbonatada o no, y adicionadas de una o
más de las siguientes sustancias: azúcares, jugos de fruta, extractos vegetales, ácidos,
esencias, proteínas, sales minerales, colorantes y otros aditivos permitidos; que no
contengan más de 0,5% en volumen de alcohol etílico, con excepción de los jarabes,
los que podrán contener hasta 2,5 % en volumen de alcohol etílico.

Se establece una dosis máxima para sacarina en bebidas de 8 mg/100g según lo

mencionado en el Codex aditivos (2007). En el CUADRO 4, la muestra BM cumple con
lo establecido en el rotulado, sin embargo, la cantidad de analito analizado sobrepasa
la dosis máxima en 44 mg/100g.

Para el aspartamo, se recomienda una dosis máxima de 60 mg/100g según lo

establecido por el Codex Aditivos (2007). El rotulado de las cuatro muestras de bebidas
indicadas en el CUADRO 5 (BM, CC, CD y LS) cumplen con lo establecido, sin
embargo, la muestra LS sobresale levemente del rango que se establece como dosis
máxima, superándolo en 5 mg/100g de aspartamo. Las muestras BM, CC y CD,
cumplen con la dosis máxima señalada.

3.5 Analisis estadístico

Se llevó a cabo un análisis estadístico para cada muestra, donde se compara cada
variable dependiente sacarina y aspartamo, con 6 y 7 niveles de muestras que incluían:
mermeladas, jugos en polvo y bebidas analcohólicas carbonatadas.
 23

3.5.1 Comparación de muestras analizadas con sacarina. Se realizó un análisis de

Kruskal-Wallis con la finalidad de determinar cuáles medianas son significativamente
diferentes de otras. La FIGURA 7, presenta a la variable dependiente Sacarina (mg)
versus el factor muestra expresado en un gráfico de caja y bigotes.

FIGURA 7. Gráfico de cajas y bigotes que ilustra la comparación de la cantidad

de sacarina entre las diferentes muestras (n=6)

Según lo observado en la FIGURA 7, a partir del análisis estadístico para la

determinación de sacarina en las diferentes muestras, la prueba de Kruskal-Wallis,
arrojó que si existen diferencias estadísticamente significativas (valor p<0,05) entre las
medianas de este analito, con un nivel de confianza del 95,0%. Los resultados de este
análisis, cumplen con lo declarado en el etiquetado del envase de cada muestra en
estudio, sin embargo, en el CUADRO 4, se observa que la muestra BM sobrepasa en
aproximadamente 44 mg/100g de sacarina según lo declarado en el rotulado del
envase. La alta cantidad de sacarina analizada en este producto, hace factible que los
consumidores sobrepasen el I.D.A. recomendado por la FAO/OMS según lo descrito en
el CUADRO 1, ya sea un niño de 6 años, con un peso promedio de 20,5kg, que
consume 250 mL del producto BM o un adolecente de 18 años, con un peso de 67kg
que beba un litro de este mismo producto (CHILE, MINISTERIO DE SALUD 2003).

A partir de la FIGURA 7 se observa que los niveles de sacarina varían para las
diferentes muestras en estudio; donde la mayor dispersión de datos, está en la muestra
 24

BM. Se observa también que en las muestras JC, JF y MJ, no hay diferencias
estadísticamente significativas, en comparación con las muestras BM, JY, MM, que si
hay diferencias estadísticamente significativas entre ellas.

3.5.2 Comparación de muestras analizadas con aspartamo. Se aplica la prueba de

Kruskal-Wallis la cual evalúa la hipótesis de las medianas de aspartamo para
determinar cuáles son significativamente diferentes unas de otras. En la FIGURA 8,
presenta a la variable dependiente aspartamo (mg) versus el factor muestra expresado
en un gráfico de caja y bigotes.

FIGURA 8. Gráfico de cajas y bigotes que ilustra la comparación de la cantidad

de Aspartamo entre las diferentes muestras (n=7)

A partir de las FIGURA 8, mediante la prueba de Kruskal-Wallis, se determinó que

existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medianas de este analito
(valor p<0,05) con un nivel del 95,0% de confianza. En la FIGURA 8, se observa que
en la muestra MJ hay una mayor dispersión de datos; la muestra MJ indicada en el
CUADRO 5, sobrepasa aproximadamente los 57 mg/100g lo declarado en el rotulado
del envase. Sin embargo, la cantidad de aspartamo no excede los valores del I.D.A.
recomendado por la FAO/OMS en los consumidores (CUADRO 1).
 25

4 CONCLUSIONES

 Fue posible la determinación y cuantificación de dos edulcorantes artificiales:

sacarina y aspartamo mediante HPLC acoplado a un detector UV.

 Se logró desarrollar y validar un método de extracción, separación y

cuantificación para los dos analitos en estudio. Los parámetros analíticos Ccα,
Ccβ, precisión y exactitud fueron los adecuados para los fines requeridos.

 Los niveles de aspartamo encontrados en las muestras, no presentan grandes

diferencias con lo indicado en el rotulado de los envases, sin embargo, la
muestra MJ es la que presenta una mayor diferencia entre lo indicado en el
envase y el aspartamo analizado. Pese a esto, no son de preocupación para la
salud de los consumidores ya que están dentro de los parámetros entregados
por la FAO/OMS.

 Los niveles de sacarina encontrados en las muestras están acorde a lo indicado

en el rotulado; sin embargo, la muestra BM sobrepasan lo indicado en el
rotulado del envase.

 La metodología implementada y validada en este estudio demostró ser una

técnica rápida y eficiente en la determinación de sacarina y aspartamo, además
de tener un bajo costo.
 26

5 BIBLIOGRAFÍA

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 28

ANEXOS
 29

ANEXO 1 Fotografía del equipo utilizado en la determinación de endulzantes.

Determinación de endulzantes: Cromatografía líquida de alta eficiencia acoplada a

un detector de detector ultravioleta HPLC-UV.
 30

ANEXO 2 Curvas de calibración de analitos: sacarina, aspartamo.

Curva 1.

Sacarina 1
4000,00
Área (mV) y = 29,28x + 8,1261
3000,00 R² = 0,9997
2000,00
Series1
1000,00
Lineal (Series1)
0,00
0 25 50 75 100125150
Contración (ppm)

Aspartamo 1
4000,00 y = 29,28x + 8,1261
Área (mV)

3000,00 R² = 0,9997
2000,00
Series1
1000,00
Lineal (Series1)
0,00
0 50 100 150
Concentración (ppm)

Curva 2.

Sacarina 2
4000,00
y = 29,173x + 10,987
Área (mV)

3000,00 R² = 0,9997
2000,00
Series1
1000,00
0,00 Lineal (Series1)
0 25 50 75 100125150
Contración (ppm)
 31

(Continuación ANEXO 2)

Aspartamo 2
4000,00
y = 29,173x + 10,987

Área (mV)
3000,00 R² = 0,9997
2000,00
Series1
1000,00
0,00 Lineal (Series1)
0 50 100 150
Concentración (ppm)

Curva 3.
Sacarina 3
4000,00
y = 29,342x + 8,5073
Área (mV)

3000,00 R² = 0,9996
2000,00
Series1
1000,00
0,00 Lineal (Series1)
0 25 50 75 100125150
Contración (ppm)

Aspartamo 3
4000,00
y = 29,342x + 8,5073
Área (mV)

3000,00 R² = 0,9996
2000,00
Series1
1000,00
0,00 Lineal (Series1)
0 50 100 150
Concentración (ppm)
 32

(Continuación ANEXO 2)

Curva 4.

Sacarina 4
4000,00
Área (mV) y = 29,262x + 13,335
3000,00 R² = 0,9996
2000,00
Series1
1000,00
0,00 Lineal (Series1)
0 25 50 75 100125150
Contración (ppm)

Aspartamo 4
4000,00
y = 29,262x + 13,335
Área (mV)

3000,00 R² = 0,9996
2000,00
Series1
1000,00
0,00 Lineal (Series1)
0 50 100 150
Concentración (ppm)

Curva 5.

Sacarina 5
6000,00
y = 32,131x - 16,457
Área (mV)

4000,00 R² = 0,9963

2000,00 Series1

0,00 Lineal (Series1)

0 25 50 75 100125150
Contración (ppm)
 33

(Continuación ANEXO 2)

Aspartamo 5
6000,00
y = 32,131x - 16,457

Área (mV)
4000,00 R² = 0,9963

2000,00 Series1

0,00 Lineal (Series1)

0 50 100 150
Concentración (ppm)

Curva 6.
Sacarina 6
6000,00
y = 31,189x - 10,553
Área (mV)

4000,00 R² = 0,9987
2000,00 Series1

0,00 Lineal (Series1)

0 25 50 75 100125150
Contración (ppm)

Aspartamo 6
6000,00
y = 31,189x - 10,553
Área (mV)

4000,00 R² = 0,9987

2000,00 Series1

0,00 Lineal (Series1)

0 50 100 150
Concentración (ppm)
 34

ANEXO 3 Curvas promedio.

Curva promedio para sacarina.

Concentración Curva 1 Curva 2 Curva 3 Curva 4 Curva 5 Curva 6

(ppm)
0 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

2,5 79,180 79,610 82,497 84,769 86,451 85,247

12,5 393,734 395,084 397,724 401,050 400,728 412,448

25,0 744,597 746,317 742,789 749,652 745,406 770,173

62,5 1818,328 1817,318 1822,743 1821,104 1886,624 1883,455

87,5 2539,304 2531,754 2537,396 2536,039 2690,344 2650,478

125 3696,727 3685,401 3710,709 3704,974 3943,111 3959,559

Pendiente 8,13 10,99 8,51 13,34 -16,46 -10,55

Intercepto 29,28 29,17 29,34 29,26 32,13 31,19
R² 0,9998 0,9998 0,9997 0,9997 0,9969 0,9989

Pendiente 2,3267
Intercepto 30,0617
R² 0,9991
 35

(Continuación ANEXO 3)

Curvas promedio aspartamo

Concentración Curva 1 Curva 2 Curva 3 Curva 4 Curva 5 Curva 6

(ppm)
0 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

2,5 8,459 10,508 10,087 11,237 10,268 12,594

12,5 51,936 50,259 49,134 51,287 50,377 50,833

25,0 103,557 105,722 106,723 106,700 102,084 105,259

62,5 261,530 263,972 262,535 271,050 263,005 266,483

87,5 382,226 371,525 375,759 375,176 381,090 374,664

125 545,267 537,977 539,067 535,964 536,862 541,567

Pendiente -3,43 -1,79 -2,22 -0,27 -2,50 -1,35

Intercepto 4,37 4,29 4,31 4,30 4,32 4,32
R² 0,9996 0,9999 0,9998 0,9999 0,9997 0,9999

Pendiente 4,3194
Intercepto -1,9265
R² 0,9999
 36

ANEXO 4 Límite de decisión Ccα para sacarina y aspartamo.

Formulas para calcular el límite de decisión Ccα

Ccα (área) = Promedio de los interceptos en área + (2,33 * Desviación estándar de los
interceptos)

Ccα (concentración) = (Ccα área – Promedio intercepto) / Promedio pendiente

Límite de decisión Ccα para sacarina

Compuesto (%) Error estándar Intercepto Pendiente

Sacarina 1 99,967 25,343 8 29
Sacarina 2 99,967 25,043 11 29
Sacarina 3 99,955 29,842 9 29
Sacarina 4 99,955 29,682 13 29
Sacarina 5 99,535 104,97 -16 32
Sacarina 6 99,841 59,605 -11 31
Promedio 99,870 45,748 2,333 29,833
D. Estándar 0,171 31,798 12,485 1,329

Ccα 0,792
Concentración (ppm) 0,970
 37

(Continuación ANEXO 4)

Límite de decisión Ccα para aspartamo

Error
Compuesto (%) estándar Intercepto Pendiente
Aspartamo 1 99,952 4,615 -4,82 4,39
Aspartamo 2 99,985 2,526 -2,52 4,30
Aspartamo 3 99,979 3,010 -3,12 4,32
Aspartamo 4 99,992 1,876 -0,38 4,30
Aspartamo 5 99,962 4,065 -3,52 4,33
Aspartamo 6
99,982 2,807 -1,91 4,33
Promedio
99,975 3,150 -2,712 4,328
D. Estándar
0,015 1,013 1,509 0,033

Ccα 2,273
Concentración (ppm) 0,810
 38

ANEXO 5 Capacidad de detección Ccβ para sacarina y aspartamo.

Sacarina Área Aspartamo Área

1 35,770 1 2,857
2 36,337 2 2,023
3 35,148 3 2,091
4 35,363 4 1,854
5 34,898 5 4,313
6 34,482 6 4,572
7 35,095 7 3,754
8 35,828 8 4,769
9 35,129 9 3,694
10 34,757 10 4,313
11 35,279 11 4,129
12 36,307 12 3,730
13 35,610 13 3,257
14 35,279 14 4,775
15 35,669 15 4,109
16 34,598 16 4,627
17 35,555 17 4,209
18 35,284 18 3,503
19 35,892 19 3,866
20 34,963 20 4,173
Promedio 35,362 Promedio 3,853
D. Estándar 0,513 D. Estándar 0,713
CV 0,014 CV 0,185
Pendiente 30,0631 Pendiente 4,3282
Intercepto 2,3243 Intercepto -2,7118

Ccα (mV) 0,792 Ccα (mV) 2,273

Ccα (ppm) 0,970 Ccα (ppm) 0,810
Ccβ (mV) 32,39 Ccβ (mV) 1,98
Ccβ (ppm) 1,000 Ccβ (ppm) 2,110
 39

ANEXO 6 Exactitud y precisión.

Muestra fortificada con los analitos: sacarina y aspartamo.

Sacarina agregada
Muestras (ppm) Sacarina hallada (%) Sacarina recuperada (%)
Sacarina 1 225,00 227,80 101,20
Sacarina 2 225,00 232,50 103,30
Sacarina 3 225,00 231,30 102,80

Aspartamo agregado Aspartamo hallado Aspartamo recuperado

Muestras (ppm) (%) (%)
Aspartamo 1 225,00 166,50 74,00
Aspartamo 2 225,00 165,90 73,70
Aspartamo 3 225,00 165,80 73,70

Promedio (Área) Sacarina Aspartamo

Promedio M Enriquecida 6927,79 721,46

Promedio (Concentración ppm) Sacarina Aspartamo

M Enriquecida (ppm) 230,52 166,06
M Referencia (ppm) 225,00 225,00
Diferencia 5,52 58,94

Porcentaje de Recuperación o Exactitud.

%R (225) 102,4 73,8

Porcentaje de coeficiente de variación o Precisión.

%CV 4,40 2,70

 40

ANEXO 7 Resumen y presentación de la cuantificación de las muestras

expresadas en g/100g

Cuantificación del contenido de sacarina en las diferentes materias primas.

Sacarina determinada
Muestras Sacarina Rotulada (mg/100g) (mg/100g)
BM 7,5 52,22
MM 36,00 31,33
MJ 9,45 10,75
JF 12,50 9,79
JC 14,00 9,72
JY 18,00 16,10

Cuantificación del contenido de aspartamo en las diferentes materias primas.

Aspartamo determinado
Muestras Aspartamo Rotulado (mg/100g) (mg/100g)
BM 7,7 9,08
CC 48,00 21,1
CD 50,00 47,73
LS 50,00 65,62
MW 50,00 84,71
MJ 100,50 157,26
JLV 34,00 19,87
 41

ANEXO 8 Análisis estadístico.

ANOVA Simple – Sacarina por muestra

Resumen estadístico para sacarina

Coef.
Muestras Recuento Promedio Variación Varianza Mínimo Máximo Rango
BM 3 52,23 1,430 2,05 51,26 53,87 2,610
JC 3 9,72 0,169 0,03 9,558 9,896 0,338
JF 3 9,79 0,650 0,42 9,273 10,524 1,251
JY 3 16,10 0,963 0,93 14,984 16,652 1,668
MJ 3 10,73 0,640 0.40 10,00 11,10 1,100
MM 3 31,33 0,640 0.41 30,60 31,80 1,200
Total 18 21,6506 16,0758 258,43 9,273 53,87 44,597

Muestras Sesgo estandarizado Curtosis estandarizada

BM 1,16836
JC 0,321684
JF 0,905619
JY -1,22474
MJ -1,22474
MM -1,09276
Total 2,04936 -0,0420749
 42

(Continuación ANEXO 8)

Resumen estadístico para aspartamo

Coef.
Muestras Recuento Promedio Variación Varianza Mínimo Máximo Rango
BM 3 9,080 0,225167 0,0507 9,31 9,31 0,45
CC 3 21,10 0,697352 0,4863 20,57 21,89 1,32
CD 3 47,73 0,668356 0,4467 46,96 48,16 1,20
JLV 3 19,873 0,586202 0,343633 19,20 20,27 1,07
LS 3 65,617 2,08102 4,33063 63,36 67.46 4,10
MJ 3 157,260 20,5407 421,922 142,56 180,73 38,17
MW 3 84,707 2,05383 4,21823 83,01 86,99 3,98
Total 21 57,9095 49,3338 2433,83 8,86 180,73 171,87

Muestras Sesgo estandarizado Curtosis estandarizada

BM 0,141038
CC 1,02145
CD -1,19981
JLV -1,16726
LS -0,607075
MJ 1,11091
MW 0,834755
Total 2,23456 0,735889
 43

(Continuación ANEXO 8)

Cuadro ANOVA para sacarina por muestra

Fuente Suma de cuadrados Gl Cuadrado medio Razon - F Valor - P

Entre grupos 4384,83 5 876,966 1240.33 0.000

Intra grupos 8,48454 12 0,707045

Total (Corr.) 4393,31 17

Cuadro ANOVA para aspartamo por muestra

Fuente Suma de cuadrados Gl Cuadrado medio Razon - F Valor - P

Entre grupos 47812,9 6 7968,82 129,18 0.000

Intra grupos 863,596 14 61,6854

Total (Corr.) 48676,5 20

 44

(Continuación ANEXO 8)

Prueba de Kruskal-Wallis para sacarina por muestra

Muestras Tamaño muestra Rango promedio

BM 3 17,00
JC 3 3.67
JF 3 3.67
JY 3 11,00
MJ 3 7,67
MM 3 14,00
Estadística = 15,8397 Valor – P = 0,007317

Prueba de Kruskal-Wallis para aspartamo por muestra

Muestras Tamaño muestra Rango promedio

BM 3 2,0
CC 3 8,0
CD 3 11,0
JLV 3 5,0
LS 3 14,0
MJ 3 20,0
MW 3 17,0
Estadística = 19,6364 Valor – P = 0,0032136