MALDI-TOF

(matrix-assisted laser desorption ionization time-of flight)

El MALDI-TOF es una técnica acoplada a espectrometría de masas, la cual permite
detectar moléculas en un amplio rango de masas moleculares. Este tipo de
metodologia permite ionizar biomoléculas, como péptidos y proteínas, sin ruptura
durante el proceso.

Ionización MALDI
La muestra se mezcla con la matriz en exceso sobre una superficie de metal de tal
forma que ambas cocristalizan cuando se evapora el solvente. Esta preparación es
sometida a pulsos cortos de láser en alto vacío lo que provoca que la absorción de
energía por parte de la matriz sea convertida en energía de excitación y en
transferencia de electrones a la muestra (ionización) dando lugar, normalmente, a
especies monocargadas. El área irradiada, de unas pocas micras, se calienta dando
lugar a la desorción de los iones de fase sólida a fase gaseosa.

Analizador de Vuelo TOF

El analizador TOF, se basa en el hecho de que los iones acelerados por un campo
eléctrico adquieren distintas velocidades según el valor de su relación masa-Carga y
por tanto tardan distinto tiempo en recorrer una determinada distancia, parando y
detectando en una escala de tiempo determinado (tiempo de vuelo), es decir, las
moléculas más pequeñas llegarán primero al detector y las moléculas más grandes
después. La determinación de la masa en una región de alto vacío se realiza mediante
una medida muy precisa del período de tiempo desde la aceleración de los iones en
la fuente hasta que impactan con el detector. El hecho de que la ionización por MALDI
permita detectar moléculas termolábiles, como son las proteínas, de forma intacta, la
incluye dentro de los métodos de ionización suave (“soft-ionization”). No obstante,
durante el proceso de aceleración ó durante el “vuelo” a través del tubo, se da un
proceso de descomposición metastable denominado PSD (“Post Source Decay”). El
análisis de los iones que se producen mediante este fenómeno proporciona una
información estructural de la molécula original muy útil, para lo cual es necesario
separar estos fragmentos. En un analizador de tipo Linear esto no es posible ya que
los iones formados por PSD tienen la misma velocidad que el ion original y viajan
juntos hasta el detector; para separarlos se emplean analizadores de tipo reflector que
trabajan con voltajes variables para finalmente obtener un único espectro de
fragmentación-PSD compuesto de tantos espectros como voltajes empleados, que se
pegan con ayuda informática.

Detector
Recoge toda la información necesaria para generar un espectro de masas de cada
compuesto analizado. Un espectro obtenido es un gráfico que representa las masas
de diferentes iones generados a partir de una muestra analizada.

Espectrometría de masas MALDI – TOF

La espectrometría de desorción-ionización por láser con ayuda de una matriz (MALDI,

por sus siglas en inglés) es un método de ionización nuevo que permite
obtener información exacta sobre las masas moleculares de biopolímeros polares que
varían desde algunos miles a varios cientos de miles de Dalton.
El método fue descrito casi de manera simultánea por primera vez en 1988 por dos
grupos de investigación, uno alemán y otro japonés.6 Ya hay instrumentos
comerciales para esta técnica. En la técnica MALDI una baja concentración del analito
se dispersa de manera uniforme en una matriz sólida o líquida que está depositada
en el extremo de una sonda de acero inoxidable, o colocada en una placa de metal.
Esta última se coloca luego en una cámara de vacío y un rayo láser se enfoca sobre
la muestra. Además de la MALDI con cámara de vacío ordinaria,
también se ha descrito una que trabaja a presión atmosférica. La matriz para MALDI
debe absorber de manera intensa la radiación láser. Después, la matriz y el analito
son desorbidos y ionizados, lo que produce un penacho de iones.
El tipo más común de analizador de masas que se usa con MALDI es el denominado
de tiempo de vuelo (TOF, por sus siglas en inglés). Un espectro de masas obtenido
con un instrumento MALDI-TOF.

Ejemplo

En este caso, el material de la matriz es ácido nicotínico y el analito es un anticuerpo

monoclonal de un ratón, su masas molecular es de alrededor de 150 000 Da. Observe
que el espectro se caracteriza por un ruido de fondo muy bajo y la carencia absoluta
de fragmentación del ion analito grande. Están presentes múltiples iones cargados así
como picos de especies con dímeros y trímeros.
El mecanismo de la formación del penacho de iones en MALDI no se entiende aún
por completo, pero las opiniones dicen que tiene que ver con la absorción del rayo
láser por parte de la matriz seguida de la transferencia de energía desde la matriz al
analito.

Después se produce la desorción del analito y la matriz. Se supone que el analito

desorbe como moléculas neutras, luego se ionizará por medio de reacciones de
transferencia de protones. Estas reacciones se efectúan con iones protonados en la
matriz y en una fase densa sobre la superficie en la que está la matriz. Es posible que
una serie de reacciones fotoquímicas produzca los iones de matriz protonados.

En la siguiente tabla se enlistan algunos de los materiales para la matriz que se

utilizan en las biomoléculas junto con las longitudes de rayo láser que se han utilizado.
Entre los rayos láser empleados se incluyen nitrógeno (337 nm), Nd-YAG(266 y 355
nm), excímero (308 nm), Er-YAG(2.94 μm) y CO2 (10.6 μm). El método más común
para preparar la muestra es la técnica de la gota seca, en la cual una gotita de la
matriz con el analito se deposita en la plancha metálica y luego se seca.
Por lo regular, la relación entre analito y matriz es 1 :103 a 1:105. Las concentraciones
de analito están casi siempre en una escala de micro moles.

Fundamentos

La ionización MALDI (desorción/ionización mediante láser asistida por Matriz),

acoplada a un analizador TOF (tiempo de vuelo), es una técnica de ionización suave
utilizada en espectrometría de masas que permite el análisis de biomoléculas
(biopolímeros como proteínas, péptidos y azúcares) y moléculas orgánicas grandes
(como polímeros, dendrímeros y otras macromoléculas) que tienden a hacerse frágiles
y fragmentarse cuando son ionizadas por métodos más convencionales.
En esta técnica la muestra se mezcla con la matriz en exceso sobre una superficie de
metal de tal forma que ambas cocristalizan cuando se evapora el solvente. Esta
preparación es sometida a pulsos cortos de láser en alto vacío lo que provoca que la
absorción de energía por parte de la matriz sea convertida en energía de excitación y
en transferencia de H+ a la muestra (ionización) dando lugar, normalmente, a especies
monocargadas que son analizadas mediante TOF. Este analizador permite la
determinación de la masa en una región de alto vacío mediante una medida muy
precisa del período de tiempo desde la aceleración de los iones en la fuente hasta que
impactan con el detector.

Luego de que el analito y la matriz cocristalizan, se ingresa la placa metálica al

espectrómetro de masas donde es bombardeada por pulsos de luz láser para producir
la desorción e ionización de las moléculas que son aceleradas por medio de un campo
electrostático. En el analizador TOF, los iones más pequeños viajan más rápidamente
que los iones más grandes. El detector recepta los iones y como resultado se produce
un espectro, específico para cada analito, que se compara con una base de datos
parja la identificación de género, especie o cea. Imagen modificada de Croxatto et al.
(2012).

Aplicaciones
● Determinación del peso molecular de la proteína intacta.
● Obtención del mapa peptídico (PMF) e identificación de proteínas de muestras
biológicas (clínicas, alimentos, cultivos microbianos, plantas, etc.) utilizando
MASCOT, como algoritmo de búsqueda.
● Identificación de polipéptidos.
● Análisis de macromoléculas, polímeros, drogas y metabolitos.
Equipamiento
● Sistema de espectrometría de masas con analizador de tiempo de vuelo y
desorción mediante láser asistida por matriz (MALDI-TOF), BRUKER Daltonics
modelo Autoflex.

maldi – tof bruker instrumentals

Requisitos de las muestras

● Las muestras deben entregarse adecuadamente etiquetadas, envasadas y
acondicionadas para asegurar su identificación, integridad y conservación
durante el transporte y garantizar la seguridad del personal que lo realiza.
● Para el análisis de proteínas y péptidos:
○ La manipulación de las muestras de proteínas debe realizarse siempre
con guantes de látex sin polvo, para evitar la contaminación de muestras
por queratinas.
○ Para la obtención de la huella peptídica, las muestras digeridas
procedentes de spots o de bandas se enviarán evaporadas después de
desalar y concentrar usando zip-tips o se solicitará el servicio de limpieza
a través de @LIMS (digestión de proteínas).
● Para el análisis de macromoléculas, polímeros, drogas, metabolitos etc.:
○ Las muestras deben suministrarse en viales de cristal perfectamente
sellados y etiquetados, en estado sólido, indicando la solubilidad del
compuesto, o totalmente disueltas en un disolvente orgánico conocido,
indicando el disolvente y volumen.
FUNCIONAMIENTO
Un espectrómetro de masas se compone de tres unidades funcionales, una fuente
de ionizante para transferir iones a las moléculas de la muestra en una fase
gaseosa, un analizador de masas que separa los iones de acuerdo con su relación
masa/carga y un dispositivo de detección para monitorizar los iones separados.
Como se ilustra en la figura, en el método que emplea células intactas del
microorganismo, una pequeña porción de una colonia de bacterias crecida en medio
de cultivo sólido se deposita directamente sobre una placa metálica conductora; un
pequeño número de células entre, 104 a 105 unidades formadoras de colonias son
necesarias para el análisis12. Microorganismos cuya lisis es más difícil, como ciertas
bacterias Gram-positivas, micobacterias, levaduras y mohos, a menudo requieren un
tratamiento previo adicional con un ácido orgánico fuerte o por lisis mecánica13.
Posteriormente, a la placa con el microorganismo se adiciona una solución saturada
de un compuesto orgánico de baja masa, denominada matriz. Tras el secado, la
muestra del microorganismo y la matriz se cristalizan y forman un depósito sólido de
muestra incrustado en la matriz, la cual es esencial para la ionización exitosa de la
muestra pues actúa como un “andamio” en el cual puede ocurrir la ionización y como
un proveedor de protones para la ionización.
Después de la cristalización de la matriz y del compuesto, la placa metálica se
introduce en el espectrómetro de masas, en donde la mezcla es irradiada con pulsos
cortos de un rayo láser UV (por lo general, un haz de láser con longitud de onda de
337 nm). La interacción entre los fotones de las moléculas de láser y de la matriz,
causados por la absorción de la energía del haz, desencadena una sublimación de
la matriz en una fase gaseosa, seguida por la ionización de la muestra del
microorganismo con mínima fragmentación (por ello se denomina “ionización
suave”). Al ionizarse, las proteínas son aceleradas a través de un campo
electrostático y luego son expulsadas en un tubo de vuelo al vacío donde se separan
en función de su velocidad o tiempo de vuelo, llegando finalmente al detector de
masas que genera información característica de la composición del microorganismo
mediante un espectro de picos, frente a su relación masa/carga (m/z), llamada
también huella digital de la masa de los péptidos (peptide mass fingerprinting).
Una vez generado, el perfil espectral del microorganismo de prueba es comparado
automáticamente mediante un programa informático con una base de datos de
espectros que es construida a partir de cepas de referencia, permitiendo la
identificación del microorganismo. La identificación de los microorganismos por
MALDI-TOF MS se basa en que las huellas digitales espectrales varían entre los
microorganismos, algunos picos son específicos del género, otros de la especie y
otros, a veces, de las subespecies. Aunque la reproducibilidad de los espectros
depende de las condiciones de cultivo de los microorganismos, Valentine y
colaboradores demostraron en su estudio que, a pesar de que se presentan
diferencias visibles en los espectros al someter a los microorganismos a diferentes
condiciones de crecimiento, un conjunto básico de proteínas permanece constante,
permitiendo la identificación consistente de microorganismos; ya que la mayoría de
los espectros de masas del MALDI-TOF se componen de proteínas muy
conservadas que son afectadas en un grado mínimo por las condiciones
ambientales.
FIGURA.
Una pequeña porción de una colonia bacteriana se deposita directamente sobre una
placa metálica conductora. Después de la cristalización de la matriz y el material
microbiano, la placa de metal se introduce en el espectrómetro de masas y se
bombardea con pulsos de láser breves. Las moléculas ionizadas se aceleran a
través de un campo electrostático y son expulsadas a través de un tubo de vuelo de
metal sometido a vacío hasta que alcanzan un detector, los iones más pequeños
viajan más rápido que los iones más grandes, por lo tanto, los analitos son
separados para crear un espectro de masas que está compuesto por picos masa a
carga (m/z) con intensidades variables. Un espectro es una firma del
microorganismo que se compara automáticamente con una base de datos para la
identificación a nivel de género y especie. Los resultados son revisados con base en
el valor de puntuación (Bruker) o nivel de confianza (Biomérieux) y, de ser
aceptables, son posteriormente exportados o consignados en el sistema de
información propio del laboratorio.
Los sistemas comerciales más empleados en la actualidad que usan la tecnología
MALDI-TOF MS para identificación de microorganismos son el sistema VITEK®MS
(bioMérieux, Durham, NC) y el sistema MALDI Biotyper® (Bruker Daltonics Inc.,
Billerica, MA). Las bases de datos de los espectros de referencia se comercializan
como parte de un sistema patentado y son construidas y mantenidas por los
fabricantes, por lo que la capacidad de agregar espectros y construir bases de datos
personalizados es importante para un análisis discriminatorio adicional usando
MALDI-TOF MS que además, permita la tipificación de cepas e investigaciones
epidemiológicas. Debido a que los espectros obtenidos por MALDITOF MS
generalmente no son completamente idénticos a los que están incluidos en las
bases de datos, estos sistemas asignan un valor de puntuación (MALDI Biotyper®) o
nivel de confianza (VITEK®MS) a cada coincidencia, con base en las similitudes del
microorganismo de prueba con los espectros de referencia.
Aunque los principios técnicos de los sistemas VITEK®MS y MALDI Biotyper® son
similares, existen diferencias en las bases de datos de espectros de referencia,
sistemas operativos y en los algoritmos empleados para la identificación, por lo que
los resultados numéricos de ambos sistemas no son directamente comparables.

https://www.creative-proteomics.com/technology/maldi-tof-mass-spectrometry.htm
https://sstti.ua.es/es/instrumentacion-cientifica/unidad-de-genomica-y-
proteomica/espectrometria-de-masas-maldi-tof.html