FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE MEDICINA HUMANA

“OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE
FRACCIONES CELULARES”

Estacio Chambi Rocio, Silva Sánchez Keiko, Valenzuela Honores Rafael,

Valero Surichaqui Cristhian, Villarreal Alvaro Aarón

DOCENTE
ARMANDO VELEZ AZAÑERO

2019
INTRODUCCIÓN
Para poder estudiar un organismo desde su más mínima estructura, se necesita
estudiar su célula y sus componentes y la técnica para la investigación de los
orgánulos de una célula es el fraccionamiento celular. El fraccionamiento celular
es la separación o aislamiento de principales orgánulos de las células, este nos
permite preparar componentes celulares en cantidades masivas para estudiar la
composición y sus funciones, utilizando este método, los biólogos han sido
capaces de poder asignar diversas funciones a los diferentes orgánulos de las
células, una tarea que hubiera sido mucho más difícil con células intactas (1).
Esta técnica de fraccionamiento celular se utiliza rutinariamente en
prácticamente todos los laboratorios del mundo, pero sus inicios se remontan a
los trabajos de Albert Claude, en la década de 1940, puesto que él estableció las
bases para la obtención de organelos morfológicos, organelos bioquímicamente
intactos y organelos intracelulares como el núcleo, mitocondrias, lisosomas, etc.
(2).
El fraccionamiento celular está dividido en tres etapas, la primera etapa es el
homogeneizado, este proceso consiste en el rompimiento o destrucción de
células en un amortiguador apropiado y también se encarga de separar a los
componentes de la célula, la solución que se utiliza es la solución Buffer ya que
esto ayuda a mantener el pH constante para que los orgánulos no se vean
afectados por el agua. Para los tejidos animales se utiliza un homogeneizador
con el denominado “Potter”, este método es muy suave y por eso se lo utiliza
para el aislamiento de estructuras y moléculas frágiles. Otros métodos usados
para el rompimiento de las células son las lisis enzimáticas de la pared celular o
el rompimiento mecánico mediante la moledura del tejido congelado. (3) La
segunda etapa es el filtrado este proceso consiste en separar los componentes
no deseados presentes en la suspensión celular mediante un medio poroso, este
proceso en corto ya que solo se hace uso para poder hacer el centrifugado. La
tercera etapa es el centrifugado, esta etapa consiste en la separación de los
organelos, para poder realizar la centrifugación se hace uso de la centrifuga
(instrumento de laboratorio), gracias a esto podemos separar los organelos de
mayor tamaño como el núcleo, también separar partículas según la velocidad de
sedimentación (1).
El objetivo de la practica fue, identificar las fracciones celulares a partir del
hígado de res, deducir el rendimiento y pureza de cada fracción y conocer la
técnica de fraccionamiento celular para el estudio de las organelas celulares.
MATERIALES Y MÉTODOS
Homogenizado
Se procedió a medir una cierta cantidad exacta de hígado de res en la balanza
de precisión, la cantidad requerida es de 10 g, luego se trituró mediante un
proceso mecánico el hígado de res usando instrumentos como el mortero y el
pilón hasta que se logre destruir la mayor cantidad de hígado de res, mientras
se va triturando el hígado se le fue echando 100 ml de buffer al compuesto con
la finalidad de preservar las partes de las células y así evitar que se oxiden y se
malogren hasta que la mezcla se vuelva muy diluida. (4)
Filtrado
Se procedió a filtrar la mezcla usando para ello un embudo, un beacker pequeño
y una gasa, luego de vaciar la mezcla poco a poco en el beacker se procedió a
eliminar el resto de la mezcla solida del hígado, una vez separado el líquido de
las partículas pequeñas de hígado en el beacker se procedió a llenar dos tubos
de centrifugado con una micropipeta. (5)
Centrifugado
Se procedió a centrifugar las dos muestras en el rotor giratorio por tres minutos.
Luego de centrifugar las muestras se procedió a sacarlas del rotor giratorio y se
volvió a separar las muestras ya que todas tenían dos fases dentro pero se
separó en dos tubos de centrifugado diferente el sobrenadante del precipitado
rotulando estos últimos como mitocondrias y a las primeras como núcleo ya que
en el sobrenadante que se trasvaso ultimo era de mitocondrias y lo que quedo
en el primer recipiente es el núcleo, luego a la muestra liquida de mitocondrias
también se le centrifugo por un tiempo de ocho minutos para luego separar las
dos fase que se están formando en la cual la parte precipitada son las
mitocondrias sedimentadas en el fondo del recipiente.(6)
Reconocimiento
Núcleo
Para reconocer el núcleo luego de haber separado el precipitado(núcleo) del
sobrenadante(mitocondria) se procedió a extraer una pequeña muestra de
núcleo del tubo con la micropipeta, luego se colocó la parte extraída en tres
placas de muestra con la finalidad de corroborar la presencia del núcleo en
alguno de ellos, luego a cada muestra se le añadió 5uL del reactivo azul de
metileno con la finalidad de darle mayor coloración al núcleo, luego se observó
en el microscopio las muestras primero a una medida de 400X y si lo ameritaba
a una medida de 1000X.(7)
Mitocondria
Para reconocer la mitocondria luego de haber separado el precipitado del
sobrenadante se procedió a extraer de las dos muestras que estaban rotuladas
como mitocondrias una muestra del tubo con la micropipeta, luego se colocó la
parte extraída tres placas de muestra con la finalidad de corroborar la presencia
de las mitocondrias en alguno de ellos, luego a cada muestra se le añadió 5uL
de verde de janus con la finalidad de darle mayor coloración a las mitocondrias,
luego se observó en el microscopio las muestras primero a una medida de 400X
y si lo ameritaba a una medida de 1000X.(8)
RESULTADO

Célula animal - Núcleo:

Se observó al núcleo por la utilización de azul de metileno en la muestra de la

célula del hígado de res al momento que se separó en el recipiente tubo de
centrifugado se notó la presencia de dos fases, la primera fase solida
(precipitado) y la segunda fase liquida (sobrenadante),(figura 1) por lo que se
presenció en el microscopio a 400x fue una lisis celular sin que sufrieron mayores
daños y se encontró en condiciones adecuadas por lo que se purifico (figura 2).

Figura 1: Se observo las dos fases del núcleo, la primera fase solida (precipitado)
en la parte inferior del tubo y la segunda fase liquida en la parte superior del tubo
(sobrenadante).
Figura 2: Núcleos de la célula del hígado de res identificados con azul de
metileno en una lisis celular.

Célula animal – Mitocondria:

Se observó a la mitocondria por la utilización de verde janus en la muestra de la

célula del hígado de res que fue la parte más liquida de la muestra denominada
sobrenadante, (figura 1). se llegó apreciar a 400x y luego con mayor nitidez a
1000x, es aquí donde se puede determinar las formas que poseen estas
organelas denominadas mitocondrias ubicadas en el citosol de la célula animal
(figura 2).

Figura 1: Se observo en la mitocondria solo una fase que es la sobrenadante

(fase liquida).
Figura 2: Mitocondria de la célula del hígado de res reconocidos por la
intervención de Verde Janus.

DISCUSIÓN
Fraccionamiento celular
El fraccionamiento celular por medio de la centrifugación fue una herramienta
sumamente útil a la hora de separar los organelas de forma masiva (1) gracias
a la diferencia en el coeficiente de sedimentación de las organelas, sin embargo,
no se pudo asegurar que las muestras obtenidas estaban libres de otras
organelas que pudieran haberse filtrado a la muestra, es por eso que se
precisaba purificar de manera más eficiente las muestras sedimentarias. Los
anticuerpos monoclonales pudieron haber sido excelentes a la hora de aislar
completamente las organelas que se infiltraron a las muestras (9) que se
deseaban. Inclusive para una determinación fiable de una muestra libre de
organelas que no se deseaban ver, se pudo utilizar un microscopio electrónico
pues son mejores como instrumentos de visualización de objetos microscópicos
(1).
Identificación del Núcleo Celular
Durante la identificación de la estructura más importante de las células se apreció
que la utilización del azul de metileno fue útil para diferenciar al núcleo de la
película de fondo, pues es un colorante catiónico, que sirve para teñir diversas
estructuras celulares (10). Y la forma esférica y relativamente sencilla del núcleo
celular (11) se visualizó completamente, sin embargo, no se diferenciaron las
estructuras más pequeñas que la componían como las ribo nucleoproteínas (2)
y para lograrlo se debió usar un microscopio electrónico.
Identificación de la mitocondria
Las mitocondrias fueron fácilmente identificadas por el verde Janus (2), por su
reacción a las proteínas que posee esta organelas, y los pliegues que este
debería haber presentado (11) no fueron visibles por la obstrucción de ciertas
sustancias en la muestra, algo que pudo haberse evitado con una correcta
filtración del pellet y sobrenadante. Se requirió de un método más efectivo de
aislamiento de organelas tales como la utilización de anticuerpos monoclonales
(9), útiles para dicha acción. Sin embargo, la visualización general de las
organela responsable de la respiración celular fue permisible.
CONCLUSIONES

● Es necesario una buena homogeneización (triturar) para el método de

fracción celular.
● Es importante el uso del aceite de inmersión para la observación de la
célula animal.
● Es indispensable el reactivo del Verde Janus para la observación de las
mitocondrias.
● Es indispensable el reactivo azul de metileno para la observación del
núcleo.

REFERENCIAS
1. Neil A. Campbell, Jane B. Reece, Biología, 7ma ed. España: Medica
Panamericana; 2007
2. Jimenez, Biología Celular y Molecular, 1a ed. México: Pearson Educación;
2003
3. Jan Koolman, Klaus-Heinrich Röhm, Bioquímica: Texto y Atlas, 3a ed.
Madrid: Medica Panamericana; 2005
4. Eduardo D. P. De Robertis, Wiktor W. Nowinski, Francisco Alberto Sáez.
Biología Celular.Vol 1. 15ª Edicion.España: Editorial El Ateneo;1996
5. Escrito por José M. Macarulla, Aída Marino, Bioquímica Cuantitativa:
Volumen II. España: Cuestiones Sobre Metabolismo.Vol 2. 1ª Ed. 1.
Editorial Revete;1993
6. F. Pino Perez y D. Perez Bendito. Análisis de elementos traza por
espectofotometria de absorción molecular ultravioleta sensible.Vol 1.1ª
Ed. Cordova:Imprenta San Pablo;1983.
7. Juan Carlos Duró Pujol. Reumatología clínica. Vol 1. 1ª Ed. España:
Editorial E l Sevier;2010
8. Alan Stevens. Texto y atlas de histología. Vol1. 1ª Ed. Madrid: Editorial
Mosby libros;1993
9. Harvey Lodish, Arnold Berk, et al. Biología Celular y Molecular. 5ª ed.
España: Medica Panamericana; 2005
10. Claudio Montero. Manual de técnica de histoquímica básica. 1ª ed.
México: Universidad Autónoma de San Luis Potosi; 1997
11. Gary A. Thibodeau, Kevin T. Patton. Estructura y Función del Cuerpo
humano. 13ª ed. España: Elsevier; 2012