Universitat Autònoma de Barcelona

Facultat de Ciències

Departament de Genètica i de Microbiologia

Caracterización Genómica y Funcional

de las Reorganizaciones del Complejo
de Genes Hox en Drosophila

Genomic and Functional Characterization

of Hox Gene Complex Rearrangements in Drosophila

Bárbara Negre de Bofarull

Abril de 2005
Memoria presentada por la Licenciada en
Biología Bárbara Negre de Bofarull para la
obtención del título de Doctora en Ciencias
Biológicas.

Bellaterra, veintidós de abril de dos mil cinco.

El Doctor Alfredo Ruiz Panadero, Catedrático
del Departament de Genètica i de Microbiologia
de la Facultat de Ciències de la Universitat
Autònoma de Barcelona,

Certifica que: Bárbara Negre de Bofarull ha

llevado a cabo bajo su dirección el trabajo de
investigación realizado en el Departament de
Genètica i de Microbiologia de la Facultat de
Ciències de la Universitat Autònoma de
Barcelona que ha llevado a la elaboración de la
Tesis Doctoral titulada Caracterización
genómica y funcional de las reorganizaciones
del complejo de genes Hox en Drosophila.

Dr. Alfredo Ruiz Panadero

Al Marc
 To Alex

To Nicholas and Ivan

A la Paula
“The beauty of nature lies in detail;

the message in generality”

Stephen Jay Gould

Wonderful Life: The Burgess Shale and the Nature of History, 1988.
 INDICE

ÍNDICE
ÍNDICE DE TABLAS iii
ÍNDICE DE FIGURAS v
ABREVIATURAS vii
RESUMEN ix
ABSTRACT xi

1. INTRODUCCIÓN 1
1.1. LA UTILIDAD DE LOS ORGANISMOS MODELO 4
1.2. DROSOPHILA COMO MODELO 8
1.3. DROSOPHILA COMO MODELO EN BIOLOGÍA DEL DESARROLLO 12
1.3.1. Ciclo Vital 12
1.3.1.1. Embriogénesis 13
1.3.1.2. Metamorfosis 14
1.3.2. Genética del Desarrollo Embrionario 15
1.4. DROSOPHILA COMO MODELO EN GENÓMICA 17
1.4.1. El Número de Genes 18
1.4.2. Las Secuencias Reguladoras 19
1.4.3. Genómica Comparada 21
1.5. EVOLUCIÓN CROMOSÓMICA 22
1.5.1. Origen de las Reordenaciones Cromosómicas 24
1.5.2. Importancia Evolutiva de los Segmentos Conservados 24
1.6. EL COMPLEJO DE GENES HOX 26
1.6.1. Los Genes Homeóticos 26
1.6.2. Agrupación y Colinealidad 28
1.6.3. Origen del Complejo Hox 29
1.6.4. Los Genes Hox y la Evolución Morfológica 31
1.6.5. Estructura del Complejo en los Metazoos 35
1.7. LOS COMPLEJO DE GENES HOX EN DROSOPHILA 37
1.7.1. Estructura del Complejo 37
1.7.2. Activación y Mantenimiento de los Patrones de Expresión Hox 39
1.7.3. Función de los Genes Hox 40
1.7.4. Cambios Estructurales del HOM-C en el Género Drosophila 41
1.8. OBJETIVOS 44
1.8. OBJECTIVES 45

i
INDICE

2. RESULTADOS 47
2.1. ARTÍCULO 1 49
2.2. ARTÍCULO 2 65

3. DISCUSIÓN 115
3.1. EVOLUCIÓN DE LAS REGIONES CIS-REGULADORAS 117
3.2. EL HOM-C EN DROSOPHILA 119
3.2.1. Evolución de los Genes Hox: Estructura, Regulación y Función 119
3.2.1.1. Hox3: zen, bcd y zen2 119
3.2.1.2. lab 122
3.2.1.3. pb 124
3.2.1.4. abdA 127
3.2.2. Evolución de las Estructura del HOM-C en Drosophila 128
3.2.2.1. Estructura del HOM-C 128
3.2.2.2. Reconstrucción de la Evolución de la Estructura del
HOM-C 130
3.2.3. Mecanismo de las Reordenaciones 132
3.2.4. Causas y Consecuencias de las Roturas del HOM-C 133
3.2.5. ANT-C versus BX-C 136
3.3. CONSERVACIÓN Y DESINTEGRACIÓN DEL HOM-C EN LOS METAZOOS 138
3.3.1. Drosophila versus Vertebrados 138
3.3.2. Estructura del HOM-C en los Metazoos 139
3.3.3. ¿Qué Tienen en Común los Organismos con el Complejo
Fragmentado? 142

4. CONCLUSIONES 145
4. CONCLUSIONS 147

5. REFERENCIAS 149

ANEXO 1. PROTOCOLOS 175

ANEXO 2. MAPAS FÍSICOS 237
ANEXO 3. SECUENCIAS 243

ii
 ÍNDICE DE TABLAS

ÍNDICE DE TABLAS
INTRODUCCIÓN
Tabla 1. Homologías cromosómicas entre algunas especies del género
Drosophila. 23

RESULTADOS
Artículo 1 – Tabla 1. Secuencia de los cebadores utilizados para la
amplificación por PCR de diferentes regiones del gen lab en varias
especies de Drosophila. 53
Artículo 1 – Tabla 2. Estructura del gen lab en tres especies de Drosophila
y Tribolium castaneum. 55
Artículo 1 – Tabla 3. Estimas por máxima verosimilitud del número de
substituciones sinónimas (dS) y no sinónimas (dN) por posición en
regiones codificantes del gen lab en comparaciones a pares entre D.
buzzatii, D. virilis y D. melanogaster. 58
Artículo 1 – Tabla 4. Test de la razón de máxima verosimilitud de la
variación en la evolución molecular y razón ω del gen lab en el género
Drosophila. 59
Artículo 1 – Tabla 5. Logaritmos de los valores de verosimilitud y estimas
de los parámetros bajo modelos de sitios fijados. 59
Artículo 2 – Tabla 1. Características de las regiones conservadas no
codificantes (CNS) detectadas con mVISTA en comparaciones de las
regiones de los genes Hox entre D. melanogaster, D. pseudoobscura y
D. buzzatii. 70
Artículo 2 – Tabla 2. Características de las regiones conservadas no
codificantes (CNS) detectadas con mVISTA en comparaciones de las
regiones de los genes no Hox entre D. melanogaster, D. pseudoobscura
y D. buzzatii. 71
Artículo 2 – Tabla S1. Análisis estadístico de las características de los
CNS entre las tres comparaciones a pares entre especies. 77
Artículo 2 – Tabla S2. Análisis estadístico de las características de los
CNS entre parejas de especies para las diferentes regiones. 77

iii
ÍNDICE DE TABLAS

Artículo 2 – Tabla S3. Estadística del proceso de secuenciación de dos

78clones BAC de una genoteca de D. buzzatii. 78
Artículo 2 – Tabla S4. Parejas de cebadores utilizados para la
amplificación de cDNA. 78
Artículo 2 – Tabla S5. Listado de CNS encontrados en las comparaciones
con D. buzzatii. 79

iv
 ÍNDICE DE FIGURAS

ÍNDICE DE FIGURAS
INTRODUCCIÓN
Figura 1. Filogenia de los metazoos. 7
Figura 2. Filogenia de los principales grupos de artrópodos e insectos. 7
Figura 3. Árbol filogenético de los principales grupos de Drosophila. 11
Figura 4. Ciclo vital de Drosophila. 12
Figura 5. Fases del desarrollo embrionario de Drosophila. 14
Figura 6. Discos y tejidos imaginales de Drosophila. 15
Figura 7. Cascada de activación de los genes de segmentación. 17
Figura 8. Transformaciones homeóticas en Drosophila. 26
Figura 9. Conservación de la organización genómica y patrones de
expresión de los genes Hox. 30
Figura 10. Distribución de los genes Hox en los Bilateria. 32
Figura 11. Jerarquía de cambios evolutivos en los genes Hox según su
presunto efecto morfológico. 34
Figura 12. Estructura del HOM-C en D. melanogaster. 38
Figura 13. Genes que intervienen en la regulación del patrón de expresión
de los genes Hox. 40
Figura 14. Reconstrucción filogenética de la organización de los genes
Hox en el género Drosophila. 42

RESULTADOS
Artículo 1 – Figura 1. Reconstrucción filogenética de la organización de
los genes Hox en el género Drosophila. 52
Artículo 1 – Figura 2. Localización cromosómica de los genes lab y abdA
en el grupo repleta. 54
Artículo 1 – Figura 3. Mapa de restricción y organización molecular de la
región lab en D. buzzatii. 56
Artículo 1 – Figura 4. Alineamiento de la 5’ UTR y secuencias 5’ de lab
en D. buzzatii, D. virilis y D. melanogaster. 57
Artículo 1 – Figura 5. Gráfico VISTA mostrando la similaridad en las
secuencias nucleotídicas del gen lab entre D. melanogaster y D.
buzzatii. 58

v
ÍNDICE DE FIGURAS

Artículo 1 – Figura 6. Alineamiento múltiple de las proteínas codificadas

por los ortólogos de lab de diferentes organismos. 60
Artículo 2 – Figura 1. Posición genómica (A) y filogenética (B) de las tres
roturas del HOM-C descritas en el género Drosophila. 68
Artículo 2 – Figura 2. Organización génica de las regiones genómicas lab-
abdA y pb en D. buzzatii y comparación con las regiones homólogas de
D. pseudoobscura y D. melanogaster. 68
Artículo 2 – Figura 3. Conservación nucleotídica en las regiones lab-abdA
y pb entre especies de Drosophila. 69
Artículo 2 – Figura 4. Patrón de expresión de pb en embriones. 71
Artículo 2 – Figura 5. Reconstrucción de la evolución del HOM-C en el
subgénero Drosophila. 73
Artículo 2 – Figura S1. Detalle de dos módulos cis-reguladores (CRM). 111
Artículo 2 – Figura S2. Patrón de expresión de pb en discos imaginales. 112
Artículo 2 – Figura S3. Patrón de expresión de lab en embriones. 112
Artículo 2 – Figura S4. Patrón de expresión de lab en discos imaginal de
ojo-antena. 113
Artículo 2 – Figura S5. Patrón de expresión de abdA en embriones. 113
Artículo 2 – Figura S6. Patrón de expresión de abdA en discos imaginales. 113

DISCUSIÓN
Figura 15. Modelo de evolución del gen Hox3. 122
Figura 16. Expresión del gen pb en embriones de cinco especies de
Drosophila. 126
Figura 17. Modelo de evolución del HOM-C en Drosophila. 131
Figura 18. Estructura del HOM-C en los Metazoos. 140

vi
 ABREVIATURAS

ABREVIATURAS

abdA gen abdominal-A

AbdB gen Abdominal-B
ama gen amalgam
ANT-C Complejo Antennapedia
Antp gen Antennapedia
BAC Cromosoma Artificial de Bacteria (Bacteria Artificial Chromosome)
bcd gen bicoid
bx mutación bithorax
bxd gen no codificante bithoraxoid
BX-C Complejo Bithorax
Ccp genes del complejo de proteínas cuticulares (Cuticle Cluster Proteins)
cDNA DNA complementario al RNA mensajero (complementary DNA)
CNS Secuencias conservadas no codificantes (Conserved Noncoding
Sequences)
CRM Módulos cis-reguladores (Cis-Regulatory Modules)
Dfd gen Deformed
DPE Downstream Promoter Element
ftz gen fushi taratzu
Hox gen homeótico
HOM-C Complejo de genes homeóticos
iab infraabdominal
kb kilobases
lab gen labial
MARs Regiones de unión a la matriz (Matriz Attachment Regions)
Mb Megabases
mRNA RNA mensajero
ORF marco abierto de lectura (Open Reading Frame)
pb pares de bases
pb gen proboscipedia
pbx postbithorax
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polimerase Chain Reaction)
PFGE Electroforesis de campo pulsante (Pulsed Field Gel Electroforesis)

vii
ABREVIATURAS

RT-PCR PCR por transcriptasa inversa (Retro Transcriptase-PCR)

SAGE Análisis Serial de la Expresión Génica (Serial Analysis of Gene
Expression)
SARs Regiones de unión a la matriz (Scafolding Attachment Regions)
Scr gen Sex combs reduced
tRNA RNA de transferencia
UAS Secuencia activadora aguas arriba (Upstream Activating Sequence)
Ubx gen Ultrabithorax
UTR región transcrita pero no traducida (UnTranslated Region)
zen gen zerknüllt
zen2 gen zerknüllt2
WGS Secuenciación genómica aleatoria (Whole Genome Shotgun)

viii
 RESUMEN

RESUMEN
Los genes homeóticos (Hox) codifican factores de transcripción involucrados en
la especificación de la identidad segmental a lo largo del eje anteroposterior en el
embrión de los metazoos. Estos genes se presentan habitualmente agrupados y
organizados en el mismo orden en el que se expresan a lo largo del eje anteroposterior
del cuerpo. La conservación de esta organización genómica a lo largo de la filogenia ha
sugerido la existencia de constricciones funcionales actuando sobre ella, pero la
desestructuración del complejo en Caenorhabditis elegans y las tres roturas descritas en
el género Drosophila ponen en cuestión que esta organización sea realmente necesaria
para su correcto funcionamiento en algunos linajes. En este trabajo se han estudiado las
consecuencias genómicas y funcionales de las dos reorganizaciones del complejo de
genes Hox presentes en Drosophila buzzatii, especie perteneciente al grupo repleta. En
la primera parte del trabajo se han clonado y secuenciado las regiones codificantes del
gen labial (lab) en D. buzzatii y D. virilis. Se han comparado las secuencias de estas dos
especies y la de D. melanogaster para comprobar si el cambio de posición del gen lab
ocurrido en el linaje de D. buzzatii había producido algún cambio en la estructura del
gen o en la evolución de su secuencia. Los resultados muestran una tasa de cambio
heterogénea a lo largo del gen pero homogénea a lo largo de la filogenia. La tasa de
cambio nucleotídico de lab se ha mantenido constante a pesar del cambio de posición.
En la segunda parte del trabajo se han secuenciado dos regiones del genoma de D.
buzzatii, una contiene los genes lab y abdominal A (abdA) y la otra incluye el gen
proboscipedia (pb), y se ha comparado su organización génica con D. melanogaster y
D. pseudoobscura para localizar con precisión los puntos de rotura. También se han
comparado las secuencias no codificantes de estas regiones, se ha observado una
elevada presencia de bloques conservados en los intrones y regiones adyacentes de los
genes Hox. La comparación de los bloques conservados con las regiones reguladoras
conocidas de los genes Hox (lab, pb y abdA) en D. melanogaster muestra que la
posición y orientación de las regiones reguladoras está conservada entre las tres
especies, con excepciones menores. Finalmente se analizó el patrón de expresión de los
tres genes Hox en embriones y discos imaginales de D. buzzatii, D. repleta, D. virilis, y
D. melanogaster, cuatro especies con diferentes organizaciones de los genes Hox. Las
dos roturas estudiadas se produjeron mediante inversiones paracéntricas, con los puntos
de rotura respetando las regiones reguladoras de ambos genes. De manera que las
regiones reguladoras y patrones de expresión de los genes Hox adyacentes se han

ix
RESUMEN

conservado a pesar de las reorganizaciones. En Drosophila el complejo parece tener una

estructura formada por módulos (que incluyen los genes y las regiones reguladoras)
independientes, cuya agrupación no es necesaria para su correcto funcionamiento. La
organización de estos genes es modular y su agrupación parece ser el resultado de la
inercia filogenética más que de la necesidad funcional. El descubrimiento de más
reorganizaciones en otros linajes y la importancia de la colinealidad temporal en
algunos organismos sugieren que la causa funcional de la conservación de la
organización genómica podría ser la colinealidad temporal. Las reorganizaciones serían
consecuencia de la pérdida de colinealidad temporal en organismos con desarrollo
rápido por modificación de la embriogénesis.

x
 ABSTRACT

ABSTRACT
Homeotic (Hox) genes code for transcription factors involved in the
specification of segmental identity in the anteroposterior axis of the early metazoan
embryo. These genes are usually clustered and arranged in the same order as they are
expressed along the anteroposterior body axis. The conservation of this Hox gene
organization along the phylogeny has suggested the existence of functional constraints.
However, the partial disassembly of the Caenorhabditis elegans complex and the three
splits observed in the Drosophila genus question whether this organization is an
absolute necessity for proper function in some lineages. In this work, I analysed the
genomic and functional consequences of the two splits present in Drosophila buzzatii, a
member of the repleta species group. In the first part, the coding regions of the labial
(lab) gene were cloned in D. buzzatii and D. virilis. The sequences of these two species
were compared with that of D. melanogaster to test whether the change in position of
lab in de D. buzzatii lineage produced any change in gene structure or sequence
evolution. The results show that the substitution rate is heterogeneous along the gene
but homogeneous along the phylogeny. The nucleotide substitution rate of lab has been
constant in spite of the positional change. In the second part, two regions of the D.
buzzatii genome have been sequenced, one including the lab y abdominal A (abdA)
genes and the other containing the proboscipedia (pb) gene, and compared with the
genic organization of D. melanogaster and D. pseudoobscura to precisely locate the
breakpoints. The noncoding sequences of these regions have also been compared, and a
high presence of conserved blocks has been observed in the introns and surrounding
regions of Hox genes. The comparison of these conserved blocks with the known
regulatory regions of the Hox genes (lab, pb and abdA) in D. melanogaster shows that
the position and order of the regulatory regions is conserved between the three species,
with minor exceptions. Finally the expression pattern of the three Hox genes has been
analysed in embryos and imaginal discs of D. buzzatii, D. repleta, D. virilis, and D.
melanogaster, four species with different Hox gene arrangements. The two splits took
place through two paracentric inversions, with their breakpoints between the regulatory
regions of adjacent genes. So that the regulatory regions and expression patterns of
these Hox genes have been conserved in spite of the reorganizations. In Drosophila the
Hox gene complex seems to be composed by independent modules (including the gene
and its regulatory regions), whose association is not required for proper function. The
organization of these genes is modular and their clustering seems de result of

xi
ABSTRACT

phylogenetic inertia more than of functional necessity. The discovery of more

rearrangements in other lineages and the significance of temporal colinearity in some
organisms suggest that the functional cause of the conservation of this genomic
organization would be temporal colinearity. Rearrangements would be the consequence
of the loss of temporal colinearity in organisms with a very rapid mode of
embriogenesis.

xii
1. INTRODUCCIÓN
 INTRODUCIÓN

Existe una diversidad asombrosa de organismos en la tierra, con una variedad

morfológica y ecológica increíble. Todos los animales comparten un momento en su
ciclo vital en el que no son más que un zigoto unicelular. Resulta sorprendente pensar
en la gran variedad de formas con complejos planes corporales adultos que surgen de
una única célula por multiplicación y diferenciación, mediante el proceso de desarrollo
embrionario. ¿Cómo se forma la arquitectura tridimensional del organismo a partir de la
información codificada en una molécula lineal de DNA? La Biología del Desarrollo
estudia los mecanismos que median la formación de un organismo, desde que es una
célula indiferenciada hasta que alcanza su forma adulta y definitiva. El interés principal
de esta disciplina está en identificar y estudiar los genes que ayudan a transformar un
zigoto unicelular en un adulto pluricelular. En los últimos años el progreso en la
caracterización de estos genes ha sido extraordinario. En algunos casos se ha encontrado
que un mismo gen puede iniciar diferentes procesos de desarrollo y, en otros casos,
genes o grupos de genes son usados cómo módulos en el desarrollo de formas
biológicas diversas. Para entender cómo se forma un organismo hemos de entender qué
genes actúan en cada lugar y cómo se regula su expresión.
La información necesaria para generar el plan corporal de cada ser vivo está
cifrada en su genoma, lo que permite que las características básicas de los individuos se
transmitan de padres a hijos. Pero esta transmisión no es perfecta. La mutación
introduce continuamente nuevas variantes en la población, desde cambios nucleotídicos
o puntuales, pasando por inversiones, delecciones y duplicaciones parciales o totales.
Estos cambios estables y heredables del material genético son la materia prima de la
evolución. La selección natural actúa sobre ella escogiendo las variantes mejor
adaptadas al ambiente. La mayor parte de las nuevas variantes introducidas por la
mutación son rápidamente eliminadas, pero algunas sobreviven y pueden llegar a
incorporarse a todos los individuos de la población. La Biología Evolutiva busca
entender los cambios genéticos responsables de las diferencias en el fenotipo,
descifrando por ejemplo que cambios han sido fijados por la selección natural y cuáles
lo han sido por azar. Uno de sus mayores retos es identificar los cambios moleculares
responsables de las diferencias fenotípicas evolutivamente significativas.
En los últimos años se ha afianzado una nueva disciplina que marca la
intersección entre la Biología del Desarrollo y la Biología Evolutiva. Esta nueva
disciplina, Biología Evolutiva del Desarrollo (Evo-Devo – Evolution and
Development), busca entender cómo se originaron los diferentes planes corporales a lo

3
INTRODUCCIÓN

largo de la evolución (GILBERT 1997). Después de una primera época en la que ha

sorprendido la elevada conservación de los genes y redes génicas involucradas en el
desarrollo temprano de los metazoos, los estudios se centran ahora en describir cómo
estas redes génicas conservadas dan lugar a diferencias morfológicas. ¿Qué genes y
redes génicas están implicados? ¿Qué cambios en estos genes son los responsables de
los cambios evolutivos? El objetivo de la Evo-Devo es desvelar la secuencia de cambios
que llevan a la divergencia morfológica, y, eventualmente, el papel de la selección, la
deriva y la contingencia histórica en los cambios macroevolutivos. El problema
principal es entender cómo ocurrieron las grandes transiciones entre morfologías
diferentes, si fueron grandes mutaciones revolucionarias o una acumulación gradual de
mutaciones de pequeños efecto. ¿Qué cambios moleculares son responsables de los
cambios fenotípicos? ¿Qué cambios son neutros y cuáles son responsables de la
especiación y la diversificación morfológica? ¿Cómo se relacionan los procesos
microevolutivos con las diferencias macroevolutivas? ¿Se corresponden los genes
identificados por mutaciones que afectan al desarrollo en una especie con los genes
responsables de las diferencias entre especies?
Estudios comparativos del desarrollo temprano han mostrado que cambios en el
uso espaciotemporal de genes reguladores, así como en la especificidad de proteínas
reguladoras, están correlacionados con importantes diferencias morfológicas entre
especies filogenéticamente distantes. De todos modos, no se sabe cómo ocurren esos
cambios en poblaciones naturales, ni si son consecuencia de un cambio único o de
muchos cambios con efecto aditivo. El estudio comparativo del desarrollo en especies
filogenéticamente cercanas promete ser decisivo en la resolución de estas cuestiones
(GIBSON 1999; SIMPSON 2002).

1.1. LA UTILIDAD DE LOS ORGANISMOS MODELO

A pesar de la gran variedad de formas y complejidad, los animales son mucho

más parecidos de lo que parece a simple vista. En 1822, el zoólogo francés Geoffroy St.
Hilaire propuso una visión fantástica de los animales pasados y presentes según la cual
vertebrados y artrópodos tienen un patrón corporal común pero con el eje dorso-ventral
invertido, donde el cordón nervioso se extiende a lo largo de la línea media ventral en
insectos y dorsal en vertebrados, mientras el corazón late en la parte dorsal en insectos y

4
 INTRODUCIÓN

en la región ventral en vertebrados (MÜLLER 1997). Evidencias genéticas y moleculares

acumuladas durante los últimos 20 años en el campo de la Biología del Desarrollo han
detectado similitudes encubiertas en los diversos patrones de desarrollo. Muchos
órganos considerados análogos en diferentes organismos parecen estar controlados por
los mismos sistemas de patrón génico, de manera que a nivel del control genético de su
formación habría que considerarlos homólogos (HOLLEY et al. 1995). Así, el
conocimiento de los genes que controlan, por ejemplo, el desarrollo temprano de
embriones humanos se podría obtener del estudio detallado de organismos modelo
como nemátodos, moscas o ratones (VERAKSA et al. 2000).
La mayoría de procesos biológicos son similares en muchos organismos,
especialmente los procesos celulares. Por otro lado, cuanta más información se tiene
sobre un organismo, más fácil es estudiarlo a otros niveles. La puesta a punto de
técnicas conocidas sobre nuevas especies puede ser muy laboriosa, de manera que se
tiende siempre a utilizar el organismo dónde más fácil sea abordar el problema. Por
estas razones, la investigación se centra en unos pocos organismos que se convierten en
“sistemas modelo”. Estas especies son sujetas a un intenso y profundo estudio, con la
idea de que lo que es cierto para una especie es cierto para todas, o al menos para
muchas otras. Los estudios que se están realizando con diferentes sistemas modelo son
de gran importancia, no sólo para entender cómo funcionan estos organismos en
particular, sino para extrapolar los resultados obtenidos a un modelo general.
Los principios fundamentales se reconocen sólo cuando los sucesos se estudian
en diversos organismos, los cuales operan de forma diferente pero mostrando
características comunes. El uso de organismos modelo ha sido muy fructífero,
especialmente en cuanto al conocimiento general de los mecanismos genéticos
existentes. Por otro lado, la comparación entre estos organismos modelo, alejados
filogenéticamente, ha permitido iniciar el estudio de los grandes cambios
macroevolutivos. Pero no es posible comprender la evolución de una especie
estudiándola de forma aislada o comparándola con especies muy alejadas. Todas las
especies forman parte de grupos de especies más o menos cercanas, y cada una solo
puede ser entendida en el contexto histórico de grupos unidos en el pasado en un linaje
único. Para aprender los principios aplicables a otros organismos es necesario poner en
perspectiva evolutiva los conocimientos profundos que tenemos sobre una especie
modelo (POWELL 1997). El estudio comparativo entre especies modelo y especies
cercanas a estas permiten estudiar mejor que cambios son el motor de la evolución.

5
INTRODUCCIÓN

La comparación de secuencias de organismos muy alejados filogenéticamente

permite identificar grandes homologías conservadas a lo largo de la evolución, pero su
distancia dificulta la comparación y la descripción detallada de la función de las
diferentes regiones del genoma. Un prerrequisito esencial para hacer comparaciones
entre grupos es comprender las bases de esa característica dentro de los grupos. La
comparación de especies cercanas debería permitir cerrar este vacío, revelando
elementos esenciales evolutivamente conservados además de regiones variables que
pueden corresponder a elementos no esenciales o a elementos específicos de la especie.
Así esta comparación debería ayudarnos a entender mejor la función de cada una de las
partes que codifican para la proteína o de las secuencias nucleotídicas adyacentes, hasta
ser capaces de predecir si los cambios que observamos en la secuencia se traducen o no
en cambios en la estructura del producto génico y si estos cambios pueden o no suponer
un cambio en su función o funcionalidad. En definitiva, predecir qué cambios
nucleotídicos son responsables de los cambios fenotípicos tanto morfológicos como
etológicos (SIMPSON 2002).

Para poder aplicar los conocimientos que se van adquiriendo en una especie
modelo a otros organismos o hacer comparaciones entre especies modelo es importante
tener una perspectiva evolutiva. Los estudios evolutivos requieren una buena base
filogenética para poder interpretar los cambios detectados. La aplicación de métodos
moleculares en la elaboración de filogenias en las últimas dos décadas a cambiado
notablemente la filogenia de los metazoos. Este hecho ha influido en la interpretación de
algunas comparaciones. Especialmente notable es el cambio de posición sufrido por los
nemátodos que han pasado de ser considerados un grupo primitivo, rama basal a
protóstomos y deuteróstomos, a ser un grupo hermano de los artrópodos (AGUINALDO et
al. 1997).
Para referencia a lo largo del presente trabajo, se incluyen aquí dos árboles
filogenéticos. El primero es una filogenia de los grandes grupos de metazoos (Figura 1).
El segundo sitúa al género Drosophila dentro de los artrópodos, indicando también la
posición de otros géneros mencionados en el presente trabajo (Figura 2).

6
 INTRODUCIÓN

Figura 1. Filogenia de los Metazoos. Modificado de AGUINALDO et al. (1997), DE ROSA et al.
(1999) MARTINEZ et al. (1999) y DANCHIN y PONTAROTTI (2004).
Figure 1. Phylogeny of the Metazoan. Modified from AGUINALDO et al. (1997), DE ROSA et al.
(1999) MARTINEZ et al. (1999) and DANCHIN and PONTAROTTI (2004).

Figura 2. Filogenia de los principales grupos de artrópodos y de insectos, incluyendo la

posición de las especies citadas en este trabajo. Modificado de HUGHES y KAUFMAN (2002) y
POWERS et al. (2000).
Figure 2. Phylogeny of the main groups of arthropods and insects, including the position of
species cited along this work. Modified from HUGHES and KAUFMAN (2002) and POWERS et al.
(2000).

7
INTRODUCCIÓN

1.2. DROSOPHILA COMO MODELO

Drosophila es uno de los organismos modelo más utilizados, si no el que más. A

principios del siglo XX jugó un papel muy importante en los primeros pasos de la
genética. A mediados de siglo, fue un importante modelo para estudios empíricos en la
síntesis de la teoría genética y evolutiva. En tiempos más recientes, se ha hecho muy
popular como sistema modelo en Biología Molecular y del Desarrollo. De Drosophila
hay información sobre ecología, biología de poblaciones, sistemática, comportamiento,
genética, desarrollo y biología molecular. Ningún otro género ha sido tan estudiado a
tantos niveles (POWELL 1997).
Hace ya 100 años que T.H. Morgan convirtió Drosophila en el modelo líder de
la genética clásica. Morgan escogió esta especie por su corto ciclo vital, facilidad de
cultivo y elevada fecundidad. En 1910 descubrió el primer mutante, white eye. En
colaboración con sus estudiantes A.H. Sturtevant, C.B. Bridges y H.J. Muller
establecieron la “teoría cromosómica de la herencia”. En 1913, A.H. Sturtevant
construyó el primer mapa genético, que incluía seis loci del cromosoma X de
Drosophila melanogaster y mostraba que los genes están organizados en un orden
lineal. En 1914, Bridges, aprovechando la no-disyunción en hembras XXY, demostró
que los genes están contenidos en los cromosomas y que no se trata de elementos
heredables independientes. En 1918, Muller introdujo el uso de cromosomas
balanceadores para el mantenimiento estable de mutaciones letales como heterocigotos.
Una muestra y presentación de las fases tempranas de estos trabajos fue publicada por
Morgan, Sturtevant, Bridges y Muller en 1915 en el libro The Mechanism of Mendelian
Heredity. Sus trabajos, realizados con el único método experimental de contar la
descendencia de cruces controlados de diferentes mutantes, le valió a Morgan el Premio
Nobel de Fisiología o Medicina en 1933. Este premio supuso el primer reconocimiento
de que la genética podía beneficiar a la especie humana.
En 1927, Muller mostró que las radiaciones ionizantes causan daño genético, y
que por tanto los rayos X podían producir mutaciones, incluidos los reordenamientos
cromosómicos, llamando la atención sobre su posible implicación en el riesgo de
cáncer. Este descubrimiento le valió a Muller el Premio Nobel de Fisiología o Medicina
en 1946, el segundo otorgado a estudios genéticos sobre Drosophila.
El descubrimiento de los cromosomas politénicos en las glándulas salivales, en
1933, puso las bases para la cartografía física de los genes. Curiosamente estos

8
 INTRODUCIÓN

cromosomas fueron descubiertos en la mosca Bibio hortulanus, por Heitz y Bauer,

aunque rápidamente, en 1934, T.S. Painter publicó los primeros dibujos de cromosomas
politénicos de D. melanogaster, incluyendo ya la posición de algunos genes. Los
dibujos realizados por Bridges en 1935 y 1938 eran tan detallados que siguen
utilizándose hoy en día, así como los dibujos de Drosophila repleta realizados por
WHARTON (1942).
La primera clonación de un fragmento de DNA eucariótico se produjo en
Drosophila así como su localización en una posición específica del cromosoma. La
técnica de la hibridación in situ de ácidos nucleicos sobre cromosomas politénicos
(PARDUE et al. 1970) permite localizar las secuencias homólogas a las contenidas en
clones recombinantes, procedentes de la misma o de diferentes especies,
proporcionando datos sobre la localización de los genes hasta una resolución de unas 50
kb (HARTL et al. 1994). Esta técnica ha permitido elaborar mapas físicos detallados
(HARTL et al. 1994; HOSKINS et al. 2000; GONZÁLEZ et al. 2005) así como comparar la
organización molecular de los cromosomas de diferentes especies de Drosophila
(SEGARRA y AGUADE 1992; SEGARRA et al. 1995; SEGARRA et al. 1996; VIEIRA et al.
1997a; VIEIRA et al. 1997b; RANZ et al. 2001; GONZÁLEZ et al. 2002).
Aunque las primeras clonaciones se realizaban al azar, a principios de 1975 ya se
habían generado genotecas que representan la totalidad del genoma y se habían
desarrollado métodos de hibridación de colonias que permitían rastrear con clones que
contienen secuencias específicas (BURTIS et al. 2003). El primer “recorrido”
cromosómico con fragmentos clonados en fagos lambda cubría más de 200 kb a finales
de 1978. Una inversión que ligaba esta región al Complejo Bithorax permitió el primer
clonaje posicional de un gen, Ultrabithorax (Ubx), a principios de 1979 (BENDER et al.
1983a; 1983b; RUBIN y LEWIS 2000).
Otro avance importante en la manipulación del genoma se realizó a finales de
1981 con el desarrollo de los métodos para obtener moscas transgénicas. Así se
consiguió el primer rescate de un fenotipo mutante en un animal por transferencia
génica (RUBIN y SPRADLING 1982). Esta técnica se fue aplicando para diversos usos,
como la detección de secuencias cis-reguladoras (enhancers) (O'KANE y GEHRING
1987) o de genes regulados durante el desarrollo (WILSON et al. 1989). Se desarrolló
también un sistema versátil de sobreexpresión génica basado en el sistema de levadura
Gal4-UAS (Upstream Activating Sequence – UAS) (BRAND et al. 1985). También se
han desarrollado métodos para llevar a cabo recombinación en lugares específicos,

9
INTRODUCCIÓN

como el sistema Flp-FRP (XU y RUBIN 1993; GOLIC y GOLIC 1996), que permiten la
generación de inversiones o la delección de regiones determinadas. En los últimos años
han proliferado los usos de las técnicas de transgénesis gracias a ingenios y variaciones
sobre estas técnicas, y se están desarrollando también nuevos vectores para evitar las
limitaciones de los sistemas actuales como son el tamaño de las secuencias que se
pueden insertar o los efectos de posición (VENKEN y BELLEN 2005). Estas herramientas
de manipulación genética se han beneficiado del mantenimiento sencillo y económico
de Drosophila, que permite mantener de forma rutinaria gran cantidad de cepas
“salvajes” o mutantes, tanto espontáneas como inducidas.

Los avances que se han ido produciendo en el conocimiento de la Genética y en

las herramientas de manipulación genética van siendo rápidamente aplicados a otros
campos como la Biología del Desarrollo. Los trabajos de Lewis (ver apartado 1.6),
inicialmente encaminados a contrastar una teoría sobre la duplicación génica,
identificaron un grupo de genes responsables de asignar identidad a regiones del tórax y
abdomen y de controlar por tanto el desarrollo posterior de órganos especializados en
segmentos determinados. En 1980, C. Nusslein-Volhard y E. Wieschaus aplicaron por
primera vez a un animal el rastreo mutacional sistemático para identificar genes
involucrados en un proceso fundamental, este tipo de estudio sólo se había llevado a
cabo con microorganismos. En sus estudios utilizaron la mosca D. melanogaster cómo
sistema experimental y fueron capaces de identificar y clasificar un pequeño número de
genes clave en la determinación del patrón corporal y la formación de los segmentos.
Los principios que descubrieron y describieron para Drosophila son aplicables también
a organismos “superiores” incluyendo al hombre, y fueron claves para entender muchas
malformaciones congénitas. La importancia del estudio de Drosophila para la salud
humana fue nuevamente reconocida con la concesión del premio Nobel de Medicina y
Fisiología a Edward Lewis, Christiane Nusslein-Volhard y Eric Wieschaus en 1995.

La conservación de procesos biológicos de mosca a humanos extiende la

influencia de Drosophila en la salud humana. Cuando se identifica en Drosophila un gen
homólogo a un gen de mamífero importante pero poco conocido, el conjunto de técnicas
genéticas desarrolladas en Drosophila puede ayudar a caracterizarlo. La identificación y
caracterización de las redes génicas en Drosophila puede elucidar las redes homólogas
en mamíferos. Estos métodos se han aplicado para identificar redes génicas

10
 INTRODUCIÓN

involucradas en cáncer y ciclo celular (KORNBERG y KRASNOW 2000). Actualmente

Drosophila sigue siendo un modelo clave tanto para la investigación básica como
aplicada. Es muy utilizada en Desarrollo, por ejemplo como modelo de la red genética
del desarrollo ocular (WAWERSIK y MAAS 2000). Es utilizada también en investigación
sobre envejecimiento (ZOU et al. 2000; HELFAND y INOUYE 2003), en enfermedades
humanas como cáncer (POTTER et al. 2000) o Parkinson (FEANY y BENDER 2000), en
estudios de susceptibilidad y efectos de las drogas adictivas (HEBERLEIN 2000;
GUARNIERI y HEBERLEIN 2003; WOLF y HEBERLEIN 2003), y un largo etcétera.
Las características e importancia histórica de D. melanogaster la han llevado a
ser uno de los organismos mejor caracterizados, hasta convertirse en el tercer eucariota
y el segundo metazoo con el genoma secuenciado (ADAMS et al. 2000), después de la
levadura Saccharomyces cerevisiae (GOFFEAU et al. 1996) y el nemátodo
Caenorhabditis elegans (TCES 1998). Actualmente Drosophila es también un modelo
fundamental en genómica y genómica comparada (ver apartado 1.4).

El género Drosophila contiene alrededor de 2000 especies conocidas, aunque

seguro hay más especies en regiones aún poco estudiadas como el África Subsahariana,
el Sudeste Asiático y las islas del Pacífico Sur (POWELL 1997). Análisis filogenéticos

Figura 3. Árbol filogenético de los principales grupos de Drosophila. Se muestra la posición de

las especies utilizadas en este trabajo. Modificado de POWELL (1997) y Tamura et al. (2004).
Figure 3. Phylogenetic tree showing the main groups of Drosophila. The position of the species
used in this work is shown. Modified from POWELL (1997) and Tamura et al. (2004).

11
INTRODUCCIÓN

indican la existencia de dos linajes principales dentro del género Drosophila, los cuales
divergieron hace entre 40 y 62 millones de años (Figura 3) (POWELL y DESALLE 1995;
RUSSO et al. 1995; TAMURA et al. 2004). Uno de los linajes dió lugar al subgénero
Sophophora el cual contiene unas 300 especies, entre ellas se encuentra D.
melanogaster. El segundo linaje dió lugar a los subgéneros Drosophila y Idiomyia
(Drosophilas Hawaianas), que incluyen unas 700 y 375 especies descritas
respectivamente (POWELL 1997) (http://taxodros.unizh.ch).

1.3. DROSOPHILA COMO MODELO EN BIOLOGÍA DEL DESARROLLO

1.3.1. Ciclo Vital

Como todos los insectos holometábolos Drosophila ocupa dos hábitats durante
su ciclo vital (Figura 4). Las hembras ponen sus huevos en un substrato blando apto
para el desarrollo de las larvas.
Después de la embriogénesis, el huevo
eclosiona dando lugar a una larva de
primer estadio que pasará su tiempo
cavando el sustrato, comiendo casi
constantemente. Después de dos
mudas, la larva dejará de alimentarse y
buscará un lugar seco en el que pupar.
La duración del período de
embriogénesis y el larvario varia de
especie a especie y con factores
ambientales tales como la temperatura.
En la pupa se produce la histólisis de
los órganos y tejidos larvarios y se
forman las estructuras adultas a partir
de las estructuras y tejidos imaginales
de la larva. El proceso de pupación
Figura 4. Ciclo vital de Drosophila. dura al menos cuatro días.
Figure 4. Drosophila life cicle.

12
 INTRODUCIÓN

Debido a que un descenso en la temperatura disminuye la velocidad del

desarrollo, especies que habitan regiones templadas tienen, generalmente, tiempos de
desarrollo más largos que las especies tropicales. Concretamente, D. melanogaster
requiere un mínimo de 11 días entre huevo y huevo en condiciones ideales de
laboratorio, es el tiempo de desarrollo más corto conocido para un Drosophilido
(POWELL 1997).
Cuando eclosiona el adulto, éste habita un ambiente muy diferente al de la larva.
Son voladores potentes que pasan su tiempo buscando comida y parejas. Generalmente
machos y hembras se encuentran en las zonas de alimentación, ya que no se conocen
feromonas de largo alcance en Drosophila. Además los adultos a menudo se alimentan
del mismo substrato que las larvas, aunque puedan utilizar una variedad más amplia
(CARSON 1971). En general los drosophilidos se alimentan de material vegetal y fúngico
en descomposición. La nutrición de muchas especies se basa en los hongos y bacterias
que descomponen estos materiales (POWELL 1997).

1.3.1.1. Embriogénesis (de zigoto a larva)

Después de la fecundación, las primeras divisiones del zigoto, realizadas de
forma sincrónica, darán lugar a un sincitio. A medida que se producen las divisiones, los
nucleos migran hacia la superficie donde formaran una monocapa (blastodermo
sincital). Después de trece divisiones, extensiones de la membrana se introducen entre
los núcleos formando células individuales (blastodermo celular). La región ventral del
blastodermo celular forma la llamada banda germinal, que dará lugar a las regiones
metaméricas del embrión. A pesar de que toda la superfície del embrión parece
homogénea, los futuros metámeros ya están determinados por los patrones de expresión
de los genes de formación del patrón (ver apartado 1.3.2).
La gastrulación, o formación de las capas germinales, empieza con la
invaginación del surco ventral en al línea media de la banda germinal. La parte central
de esta invaginación dará lugar al mesodermo y al cordón nervioso ventral. En el
extremo anterior del surco se forma una estria transversal que constituirá el primordio
endodérmico anterior. En la parte posterior tiene lugar una compleja remodelación,
asociada a la elongación de la banda germinal, que formará el primordio endodérmico
posterior (Figura 5).
A diferencia de otros insectos en los que los diferentes segmentos se forman por
proliferación a partir de un primordio de la banda germinal (insectos de banda germinal

13
INTRODUCCIÓN

corta), en Drosophila todos los segmentos han quedado ya determinados en el

blastodermo celular (banda germinal larga). En este caso, el proceso de elongación de la
banda germinal no implica proliferación celular, sino que consiste en una
reestructuración de ésta.
La elongación de la banda germinal comporta cambios drásticos en el ectodermo
a través de los cuales se hace evidente el patrón corporal. Durante este proceso aparece
el surco cefálico que delimitará el procefalon de la banda germinal metamérica.
Posteriormente tiene lugar la retracción de la banda germinal, durante la cual se
fusionan los primordios endodérmicos anterior y posterior y se forman las gónadas. En
este momento empiezan los complejos movimientos morfogenéticos de retracción de la
región cefálica (head involution) que darán lugar a la cabeza de la larva.

Figura 5. Fases del desarrollo embrionario de Drosophila. Los embriones se muestran con la
región anterior en la izquierda y la dorsal arriba. El número sobre cada embrión indica el estadío
que representa. Tomado de HARTENSTEIN (1993).
Figure 5. Phases of embryonic development in Drosophila. The embryos are shown with
anterior to the left and posterior up. The number over each embryo corresponds to the stage.
Taken from HARTENSTEIN (1993).

1.3.1.2. Metamorfosis (de larva a imago)

Durante el primer estadío larvario, una fracción de células se separa y se
mantiene diploide, en vez de poliploide como la mayoría de células somáticas de la
larva. La función de estas células será formar los tejidos del imago, insecto adulto. En la
cavidad larval, la mayoría de estas células forman pequeñas bolsas planas y
redondeadas llamadas discos imaginales, otras células quedan aisladas en el interior de
determinados órganos (Figura 6). Durante la metamorfosis, los discos imaginales se
evaginarán y expandirán dando lugar a la cutícula del imago (BATE et al. 1993).

14
 INTRODUCIÓN

Figura 6. Discos y tejidos

imaginales de Drosophila. En
color se marcan los discos donde
se expresan los genes estudiados
en este trabajo: disco labial en
amarillo, disco de ojo-antena en
naranja y disco genital en rojo.
Modificado de LAWRENCE
(1992).

Figure 6. Imaginal discs and

tissues of Drosophila. Imaginal
discs where the studied genes
show expression are in color:
labial disc in yellow, eye-
antennal disc in orange and
genital disc in red. Modified
from LAWRENCE (1992).

Muchos de los genes que se expresan durante el desarrollo embrionario muestran

un segundo pico de expresión durante el período pupal, mientras aquellos que se
expresan en la larva se vuelven a expresar en el adulto (ARBEITMAN et al. 2002). A
pesar de las diferencias morfológicas entre estadios de desarrollo, diferentes “edades”
muestran similitudes moleculares. Los genes Homeóticos (ver apartado 1.6) se
encuentran en ese grupo de genes que muestran un pico durante el desarrollo
embrionario y un segundo pico de expresión en la pupa, concretamente en los discos
imaginales.

1.3.2. Genética del Desarrollo Embrionario

Los ejes corporales quedan preestablecidos ya en el oocito dentro de la cámara
ovárica debido al aporte asimétrico de tránscritos y proteínas de origen materno. Esta
primera asimetría activará diferentes cascadas génicas encargadas de la diferenciación
anteroposterior, dorsoventral y terminal. La cascada de interacciones entre factores de
transcripción que definen la organización anteroposterior del embrión de Drosophila es
una de las jerarquías transcripcionales más investigadas (Figura 12). Los trabajos de
Nusslein-Volhard y Wieschaus (ver apartado 1.2) fueron capaces de identificar y

15
INTRODUCCIÓN

clasificar un pequeño número de genes clave en la determinación del patrón corporal y

la formación de los segmentos. Su investigación generó el modelo de tres tipos de genes
que controlan la subdivisión del embrión en desarrollo: los genes gap, los genes pair-
rule, y los genes de polaridad segmental.

En Drosophila el núcleo del zigoto es transcripcionalmente inactivo hasta el

ciclo 10, cuando las interfases mitóticas empiezan a alargarse se inicia la transcripción
génica. En un par de horas, se ha establecido una huella segmental bastante completa a
través de los patrones de expresión de los genes de segmentación. Características
morfológicas repetidas segmentalmente aparecen en pocas horas, y se completan en
menos de un día (NASIADKA et al. 2002).
La jerarquía de genes de segmentación empieza con la acción de los genes
subministrados de forma materna. Los productos de los genes maternos combinan
multitud de mecanismos moleculares para establecer los gradientes de tres factores de
transcripción (Bicoid, Hunchback y Caudal) a lo largo del eje anteroposterior del
embrión sincital. Durante este mismo período, otros grupos de genes se encargarán de la
señalización dorsoventral y terminal del embrión (NASIADKA et al. 2002).
Los promotores de los primeros genes expresados por el zigoto, los genes gap,
responden a diferentes concentraciones y combinaciones de los tres factores de
transcripción maternos. Así cada gen gap se expresa en una banda amplia, que incluye
varios de los futuros segmentos, situada en una región diferente del eje del embrión. La
mayoría de proteínas codificadas por estos genes son factores de transcripción del tipo
dedos de zinc (NASIADKA et al. 2002). Al final del blastodermo sincital se inicia la
transcripción de los genes pair-rule, los cuales presentan los primeros patrones de
expresión con dominios periódicos. De nuevo, los promotores de estos genes responden
a las combinaciones y niveles de los factores de transcripción expresados antes, es decir,
genes maternos y genes gap. Las siete bandas en segmentos alternos que conforman sus
patrones de expresión se refinan gracias a complejas interacciones entre los mismos
genes pair-rule. Finalmente, la acción combinatoria de los factores de transcripción pair-
rule actúa sobre los promotores de los genes de polaridad segmental, los cuales se
expresan en 14 bandas, una por segmento. Estos genes establecen la polaridad del
patrón de elementos de cada futuro segmento y actúan para mantener el destino celular a
lo largo del resto del desarrollo. Así como la mayor parte de genes gap y pair-rule
codifican factores de transcripción, sólo una pequeña parte de los productos de

16
 INTRODUCIÓN

polaridad segmental son de este tipo. Esta diferencia se debe principalmente a que
cuando estos genes se expresan las células ya se han formado, y por tanto es necesario
activar, entre otros, los mecanismos de comunicación celular para enviar y recibir
señales entre células (NASIADKA et al. 2002) lo que permitirá el desarrollo coordinado
de las diferentes partes.

Figura 7. Cascada de activación de

genes de segmentación. Los
embrinones están orientados igual que
en la Figura 5. A, anterior; P, posterior;
D, dorsal, y V, ventral.

Figure 7. Segmentation genes

activation cascade. Embryos are
shown as in Figure 5. A, anterior; P,
posterior; D, dorsal, y V, ventral.

Así se distinguen cuatro tipos de genes que intervienen en la formación de los

segmentos: los genes maternos, los genes gap, los genes pair-rule y los genes de
polaridad segmental. La acción de estos cuatro grupos de genes ocurre en una cascada
de acontecimientos dependientes encargados de definir la división segmental, es decir,
globalmente determinan el número correcto de segmentos en cabeza, tórax y abdomen.
Un quinto grupo de genes, los genes Homeóticos (ver apartado 1.6), son necesarios no
para formar segmentos sino para asignar una identidad a los segmentos en formación.
Estos genes interpretan la información posicional establecida y actúan como
interruptores que determinan las identidades de los segmentos.

1.4. DROSOPHILA COMO MODELO EN GENÓMICA

Los datos genómicos sin ordenar son simplemente una retahíla de As, Ts, Gs y
Cs. En este estado, los datos de secuencia aportan muy poco conocimiento biológico.
Para entender el legado genético de un organismo debemos interpretar su secuencia
genómica, traduciendo la información que contiene en forma molecular en anotaciones

17
INTRODUCCIÓN

leíbles por el hombre (LEWIS et al. 2002). El proceso de anotación es la tarea de anclar
en la secuencia de ácidos nucleicos notaciones explicativas de sus características o
función: transcrito, exón, promotor, elemento transponible, región reguladora, etc. La
anotación funcional de las secuencias genómicas de los eucariotas es uno de los
principales retos de la biología moderna.
El pequeño tamaño del genoma de Drosophila con 176 Megabases (Mb)
(HOSKINS et al. 2002), la ha convertido en un modelo fundamental en Genómica,
disciplina centrada en el estudio de la secuencia, estructura y función del genoma.
Aprender cómo identificar, exponer, interrogar e interpretar las características del
genoma en un organismo bien caracterizado como Drosophila, es crucial para entender
los genomas de organismos más complejos, incluyendo humanos. Añadir anotaciones a
la secuencia de un genoma de forma rigurosa y consistente es un prerrequisito para el
uso eficiente de esa secuencia en la investigación biológica (MISRA et al. 2002).
La secuencia anotada del genoma de D. melanogaster es resultado de la primera
aplicación del método “shotgun” para la secuenciación de un genoma animal (ADAMS et
al. 2000), y supone un modelo para la anotación a gran escala de las secuencias
genómicas. En los últimos años se han desarrollado multitud de programas informáticos
encaminados a identificar los genes y las regiones cis-reguladoras que controlan su
expresión, con el objetivo final de automatizar el proceso de anotación de los genomas.

1.4.1. El Número de Genes

Actualmente se define un gen, en términos moleculares, como “un segmento
cromosómico completo responsable de producir un producto funcional” (SNYDER y
GERSTEIN 2003). Esta definición tiene varios componentes lógicos: la inclusión de
regiones codificantes y reguladoras, la expresión del producto génico y la funcionalidad
de este. A pesar de que esta definición implica unos criterios concretos para identificar
los genes, su aplicación es aún problemática (SNYDER y GERSTEIN 2003) y no
disponemos todavía de mecanismos eficientes para predecir de forma directa los genes
de la secuencia nucleotídica. Incluso en un organismo tan estudiado como D.
melanogaster y cuatro años después de la publicación de su genoma (ADAMS et al.
2000) aún no hay consenso ni siquiera sobre el número de genes codificantes que
contiene (HILD et al. 2003; OLIVER y LEBLANC 2003).
La primera anotación del genoma de D. melanogaster detectaba 13.601 genes
codificantes (ADAMS et al. 2000). En la notación del “Release 3” el número disminuyó

18
 INTRODUCIÓN

ligeramente, 13.379 genes, a pesar de presentar una secuencia más completa e incluir la
heterocromatina, ausente en el ensamblaje inicial (MISRA et al. 2002). Aunque entre el
Release 1 y el Release 3 el número de genes anotados ha variado poco, sí ha variado la
estructura de muchos de ellos. Con una predicción menos restrictiva usando Fgenesh,
análisis de la expresión por “microarrays” y validación por RT-PCR e hibridación in
situ, HILD et al (2003) identifican al menos 2,000 nuevos genes en el genoma de D.
melanogaster no incluidos en la anotación del Release 3. Aunque se ha liberado un
Release 4 de la eucromatina, donde se han cerrado 21 gaps de secuencia, la anotación
no ha variado respecto al Release 3 (http://www.fruitfly.org/annot/release4.html).

1.4.2. Las Secuencias Reguladoras

A pesar de que la mayor parte de la secuencia genómica de los metazoos está
formada por DNA no codificante, poco se sabe sobre la función o constricciones
evolutivas que actúan sobre estas enigmáticas secuencias. Aunque es probable que
algunas porciones de esta fracción del genoma demuestren ausencia de función
biológica mesurable, está ampliamente asumido que gran parte de nuestra complejidad
genética es debida a sofisticadas señales reguladoras no codificantes que determinan
cuando, dónde y cuánto un gen desarrolla su actividad transcripcional. A pesar de la
importancia de las secuencias no codificantes en la regulación génica, nuestra habilidad
para identificar y caracterizar computacionalmente estos elementos es muy limitada. La
reciente disponibilidad de datos de secuencias de genomas completos ha generado una
oportunidad sin precedentes, y un reto, para buscar el significado del DNA no
codificante (CLARK 2001).
En los organismos multicelulares, la modulación de la expresión génica se
produce a través de la interacción de las proteínas reguladoras (factores de
transcripción) y las regiones específicas del DNA (secuencias cis-reguladoras), y son los
cambios en la expresión génica los responsables de gran parte de la variación fenotípica
(MARKSTEIN et al. 2002; DE MEAUX et al. 2005). Las regiones cis-reguladoras están
altamente estructuradas y exhiben una elevada organización modular formada por
aisladores (insulators o boundary elements), silenciadores (silencers), intensificadores
(enhancers), y promotores basales (core promoters) (LEVINE y TJIAN 2003).

Se define un módulo cis-regulador (Cis-Regulatory Module – CRM) como aquel

módulo funcional que produce un aspecto discreto del patrón global de expresión de un

19
INTRODUCCIÓN

gen cuando es situado al lado de un promotor basal (ARNONE y DAVIDSON 1997;

BERMAN et al. 2002; WRAY et al. 2003). Los CRM son segmentos de DNA (desde unos
cientos de pares de bases a una kilobase) que regulan la transcripción génica en los
eucariotas superiores. Contienen uno o varios lugares de unión para diferentes factores
de transcripción, que actúan de forma cooperativa para activar o reprimir la
transcripción del gen diana. Por tanto el término CRM incluye tanto silenciadores
(BRAND et al. 1985) como intensificadores, ya que su efecto depende del contexto, es
decir, su función será una u otra según la región del organismo y el momento en que lo
observemos, y de las características del promotor basal. Los CRM pueden estar a
distancias diversas del promotor y en cualquier orientación, lo que hace difícil en
algunas ocasiones predecir sobre qué promotor y por tanto sobre qué gen actúan.
Algunos CRM son específicos de un promotor, es decir, actúan por ejemplo sobre un
promotor con caja TATA o con DPE (Downstream Promoter Element), pero otros son
promiscuos, actúan sobre cualquier tipo de promotor (BUTLER y KADONAGA 2002). En
estos casos la presencia de un aislador evita la acción promiscua del CRM, aislando a
uno de los posibles promotores. En otros casos los aisladores se sitúan entre CRM
diferentes para garantizar su acción independiente.

Varios trabajos han definido la localización de diferentes regiones reguladoras

basándose en delecciones, inserciones o inversiones en mutantes y en el análisis del
potencial efecto regulador de fragmentos determinados sobre el promotor lacZ (O'KANE
y GEHRING 1987; CHOUINARD y KAUFMAN 1991; GINDHART y KAUFMAN 1995;
GINDHART et al. 1995; KAPOUN y KAUFMAN 1995; KEYS et al. 2005). La mayoría de
estos estudios son relativamente groseros en cuanto a la localización y el tamaño de las
regiones reguladoras. Los estudios detallados sobre secuencias mínimas necesarias son
escasos debido a que la disección funcional de los módulos cis-reguladores es muy
laboriosa (LUDWIG et al. 2000; MICHELSON 2002). Actualmente se está realizando un
gran esfuerzo para desarrollar métodos para la identificación y análisis bioinformático
de estas regiones a partir de la secuencia.

La agrupación de lugares de unión de uno o varios factores de transcripción

puede ser utilizada para la detección de CRM (BERMAN et al. 2002; MARKSTEIN et al.
2002; LIFANOV et al. 2003; BERMAN et al. 2004). Pero la ausencia de datos sobre los
lugares de unión de la mayoría de factores de transcripción, representa actualmente una

20
 INTRODUCIÓN

gran limitación para la aplicación generalizada de este método. Como los CRM están
sujetos a constricciones funcionales para mantener la expresión del gen diana su
secuencia evoluciona más despacio que las secuencias no funcionales. Por lo tanto, la
conservación de secuencias no codificantes entre especies filogenéticamente distantes
(huella filogenética) puede utilizarse como guía para identificar secuencias reguladoras
(TAGLE et al. 1988). Varios estudios recientes avalan el uso del análisis comparativo de
secuencias y la caracterización de las secuencias no codificantes conservadas (CNS –
Conserved Noncoding Sequences) como una aproximación útil para la detección de
posibles CRM en Drosophila (BERGMAN y KREITMAN 2001; BERGMAN et al. 2002),
mamíferos (DERMITZAKIS et al. 2002; BOFFELLI et al. 2003; COOPER y SIDOW 2003;
NOBREGA et al. 2003; BOFFELLI et al. 2004; FRAZER et al. 2004b; GAFFNEY y
KEIGHTLEY 2004; MARTIN et al. 2004), vertebrados (SANTINI et al. 2003) y plantas
(GUO y MOOSE 2003; BUCHANAN et al. 2004). En Drosophila, la interpretación de los
CNS como probables regiones reguladoras está respaldada por la elevada tasa de
substitución nucleotídica neutra (MORIYAMA y GOJOBORI 1992) y la elevada tasa
intrínseca de pérdida de DNA (PETROV et al. 1996; SINGH y PETROV 2004). No se
espera que las secuencia no codificantes estén conservadas entre especies poco
relacionadas a no ser que estén sometidas a constricciones funcionales (O'NEIL y
BELOTE 1992).

1.4.3. Genómica Comparada

La comparación de secuencias se está utilizando de forma generalizada para la
validación de las predicciones de genes (HUDEK et al. 2003). Especialmente la
comparación de secuencias de organismos cercanos promete ser una herramienta
fundamental para la identificación tanto de genes codificantes como de regiones cis-
reguladoras. En los últimos años se están desarrollando y mejorando los métodos
informáticos para el alineamiento y visualización de secuencias largas como VISTA
(MAYOR et al. 2000; FRAZER et al. 2004a) o PipMaker (SCHWARTZ et al. 2000). El
género Drosophila proporciona un fabuloso sistema modelo para la genómica
comparativa y el desarrollo de métodos informáticos (CLARK et al. 2003).

En el género Drosophila el genoma tiene habitualmente entre unas 100 y 400

Megabases (Mb). Unos tamaños bastante típicos dentro de los Dípteros (por ejemplo el
genoma de Anopheles gambiae tiene 260 Mb) pero muy pequeño en comparación con

21
INTRODUCCIÓN

otros eucariotas multicelulares, ya que representan entre el 6% y el 10% del genoma

típico de un mamífero (3.000 Mb) (POWELL 1997). Por ejemplo el genoma de D.
melanogaster contiene 176 Mb (HOSKINS et al. 2002), el de D. simulans unas 119 Mb
(POWELL 1997), el de D. hydei y las especies del grupo repleta alrededor de 220 Mb
(LAIRD 1973; SCHULZE y LEE 1986; RANZ et al. 2001), y el de D. virilis 313 Mb
(HARTL y LOZOVSKAYA 1995). Además el tiempo de divergencia entre diferentes
especies o grupos del género Drosophila es equiparable a la divergencia entre especies
de primates o de mamíferos (NEI et al. 2001; GLAZKO y NEI 2003; TAMURA et al.
2004).
Las diferencias entre especies se deben tanto al contenido en eucromatina como
en heterocromatina: D. melanogaster contiene 116.9 Mb (CELNIKER et al. 2002) y 58.8
Mb (HOSKINS et al. 2002) respectivamente, mientras D. virilis contiene ~150 y ~163
Mb (HARTL y LOZOVSKAYA 1995). La variación en el DNA altamente repetitivo explica
las diferencias en la heterocromatina, mientras que en la eucromatina se ha propuesto
que la diferencia podría ser reflejo de la diferente longitud de los intrones (MORIYAMA
et al. 1998) y del DNA repetitivo disperso (elementos móviles).

Actualmente se ha secuenciado una segunda especie de Drosophila, D.

pseudoobscura (RICHARDS et al. 2005), y se están secuenciando otras 10 (BEGUN y
LANGLEY 2003; CLARK et al. 2003). Ya están disponibles los ensamblajes provisionales
de D. ananassae, D. erecta, D. simulans y D. yakuba (subgénero Sophophora) y de D.
virilis y D. mojavensis (subgénero Drosophila)
(http://rana.lbl.gov/drosophila/multipleflies.html).

1.5. EVOLUCIÓN CROMOSÓMICA

En las especies del género Drosophila el cariotipo es muy variable por lo que refiere al
número haploide de cromosomas que está habitualmente entre 3 y 6. Gracias a la
información de mapas citológicos y de ligamiento, MULLER (1940) formuló la hipótesis
de que el cariotipo ancestral del género estaba formado por seis elementos
cromosómicos que se han conservado como cromosomas o brazos cromosómicos en
todo el género. Estableció homologías entre las diferentes especies de Drosophila
elaborando una nomenclatura que permite relacionar los cariotipos. Así los elementos

22
 INTRODUCIÓN

A, B, C, D y E corresponden a los cinco brazos cromosómicos y el elemento F al dot o

cromosoma puntiforme (Tabla 1) (MULLER 1940). La conservación del contenido
génico de los elementos cromosómicos parece extenderse más allá del género
Drosophila, habiendose encontrado en otros dípteros como Lucilia cuprina o Musca
domestica (WELLER y FOSTER 1993). HILLIKER y TRULLIS-COULTER (1987) mostraron
que alterar esta agrupación cromosómica no tiene efecto sobre viabilidad o esterilidad,
indicando la ausencia de significado funcional de la sinténia a nivel cromosómico. En
otros dípteros más alejados como Anopheles, cuyo genoma ha sido secuenciado y
comparado detalladamente con el de D. melanogaster, el contenido génico de los
elementos está escasamente conservado (ZDOBNOV et al. 2002). Por otro lado, estudios
de cartografía física, mediante hibridación in situ sobre cromosomas politénicos, han
demostrado que a pesar de la gran conservación en el contenido génico de los brazos
cromosómicos, el orden de sus genes no esta conservado (RANZ et al. 1999; GONZÁLEZ
et al. 2000; RANZ et al. 2001; GONZÁLEZ et al. 2002; RICHARDS et al. 2005). La
evolución del cariotipo de Drosophila es el resultado de la acción de inversiones
paracéntricas (que no incluyen el centrómero) y, en menor medida, de fusiones y
fisiones de los centrómeros (CLAYTON y GUEST 1986) generando la variedad de
configuraciones del cariotipo actual (POWELL y DESALLE 1995; POWELL 1997).
También se han descrito algunos cambios de posición no explicables por inversiones

Tabla 1. Homologías cromosómicas entre algunas especies del género Drosophila.

Table 1. Chromosomal homologies between some Drosophila species.
Elemento de Muller
Especie A B C D E F
D. melanogaster (S) X 2L 2R 3L 3R 4
D. pseudoobscura (S) XL IV III XR II V
D. virilis (D) X 4 5 3 2 6
D. repleta (D) X 3 5 4 2 6
D. buzzatii (D) X 3 5 4 2 6
En los cromosomas metacéntricos L y R indican los brazos cromosómicos izquierdo y derecho
respectivamente. (S) Subgénero Sophophora, (D) Sugénero Drosophila. (SCHAFER et al. 1993; POWELL
1997).
In metacentric chromosomes L and R show the left and rigth arm respectively. (S) Subgenus Sophophora,
(D) Sugenus Drosophila. (SCHAFER et al. 1993; POWELL 1997).

23
INTRODUCCIÓN

paracéntricas lo que indica la existencia de transposiciones, aunque a muy baja

frecuencia (BETRÁN et al. 2002; RANZ et al. 2003; GONZÁLEZ et al. 2004).

1.5.1. Origen de las Reordenaciones Cromosómicas

La formación de una inversión cromosómica implica la escisión del DNA en dos
puntos, el giro del fragmento generado y la unión de los extremos. Entre los posibles
mecanismos implicados en este proceso se han descrito las rotura al azar, los puntos
frágiles (NOVITSKI 1946; PEVZNER y TESLER 2003) y la recombinación ectópica (LIM y
SIMMONS 1994). Aunque la recombinación ectópica se puede producir entre cualquier
tipo de secuencia repetida en orientación inversa, hay que destacar la importancia de los
elementos móviles. Se han logrado clonar los puntos de rotura de dos inversiones
polimórficas naturales demostrando por primera vez la implicación de los elementos
transponibles en la generación de inversiones naturales (CACERES et al. 1999; CASALS
et al. 2003). En otros casos no se han encontrado restos de elementos transponibles o
secuencias repetidas, ni evidencias de presencia de puntos fràgiles (WESLEY y EANES
1994; CIRERA et al. 1995).

1.5.2. Importancia Evolutiva de los Segmentos Conservados

A pesar de la gran reorganización intracromosómica que ha habido durante la
evolución del género Drosophila los estudios de cartografía comparativa permiten
identificar segmentos conservados entre las especies que se comparan (VIEIRA et al.
1997b; RANZ et al. 1999; GONZÁLEZ et al. 2000; RANZ et al. 2001; GONZÁLEZ et al.
2002). Estos fragmentos serán más grandes y frecuentes entre especies cercanas y más
pequeños a medida que las especies se alejan filogenéticamente. A menudo se ha
interpretado que la conservación de asociaciones génicas entre especies
filogenéticamente alejadas podía ser debida a la existencia de restricciones funcionales
(MARTINEZ-CRUZADO et al. 1988; COLOMBO et al. 1992; STATHAKIS et al. 1995). De
todos modos, cuando se detecta un segmento conservado no se sabe si esta conservación
se debe a restricciones funcionales, que impiden la fijación de reordenaciones que
rompan el segmento, o si bien es el resultado de la distribución al azar de puntos de
rotura de un numero finito de reordenaciones cromosómicas producidas desde la
divergencia de los linajes comparados (NADEAU y TAYLOR 1984). Complejos génicos
cuyos genes presentan elementos cis-reguladores compartidos en D. melanogaster,
como achaete-scute (MODOLELL y CAMPUZANO 1998), el complejo Iroquois (GOMEZ-

24
 INTRODUCIÓN

SKARMETA et al. 1996) o knirps y knirps related (LUNDE et al. 1998) están conservados
en D. repleta (GONZÁLEZ et al. 2002) lo que sugiere la acción de la selección natural al
menos en algunos casos.

Estudios recientes parecen indicar que la organización lineal de los genes en los
cromosomas no es aleatoria (KOSAK y GROUDINE 2004). Varios estudios mediante
microarrays o “análisis serial de la expresión génica” (SAGE – Serial Analysis of Gene
Expression) muestran agrupación genómica de genes coexpresados en Drosophila
(BOUTANAEV et al. 2002; SPELLMAN y RUBIN 2002), nemátodos, mamíferos (LERCHER
et al. 2002) o Arabidopsis (WILLIAMS y BOWLES 2004). Se ha detectado la agrupación
de genes “housekeeping” con nivel de transcripción elevado (LERCHER et al. 2002), de
genes con patrones de expresión similares (SPELLMAN y RUBIN 2002) o de genes de
tejidos específicos (BOUTANAEV et al. 2002). ¿Podría la coexpresión ser un factor en el
mantenimiento de la sintenia? Si la expresión coordinada de estos genes es ventajosa,
deberíamos encontrar en las regiones coexpresadas más sintenia de la esperada
(SPELLMAN y RUBIN 2002).
Las presiones selectivas que promueven la agrupación no están relacionadas
simplemente con la tasa de transcripción, sino que favorecen la unión de los genes que
son activos en un tejido determinado o en todos los tejidos (LERCHER et al. 2002). La
corregulación transcripcional en eucariotas superiores opera en extensos dominios
cromatínicos que comprenden múltiples genes (BOUTANAEV et al. 2002). La estructura
de la cromatina, y por tanto, la accesibilidad de diferentes regiones genómicas a la
maquinaria transcripcional, puede variar según el tipo celular. En esta situación, podría
ser ventajoso agrupar los genes “housekeeping” en una región que mantenga una
conformación accesible en cualquier tipo celular o los genes específicos de testículo en
una región que se active sólo en esta fase. Aunque todavía falta verificación
experimental, la regulación transcripcional coordinada al nivel de la cromatina podría
ser un sistema económico de remodelar las estructuras cromosómica (BOUTANAEV et al.
2002; LERCHER et al. 2002; UEDA et al. 2002). Por otro lado, la agrupación de genes
coexpresados podría también ser el resultado de la expresión residual de genes próximos
a los verdaderamente activos debido a la descompactación de la cromatina de la región.

Uno de los casos más paradigmáticos de conservación de agrupaciones génicas

es el de los genes homeóticos. Estos genes, implicados en la formación del patrón

25
INTRODUCCIÓN

anteroposterior de los metazoos, se presentan agrupados en el cromosoma y en el mismo

orden en el que se expresan a lo largo del eje anteroposterior del embrión. Esta
agrupación, o colinealidad, se mantiene en casi todos los grupos estudiados y se ha
convertido en un paradigma de la Evo-Devo.

1.6. EL COMPLEJO DE GENES HOX

1.6.1. Los Genes Homeóticos

Ya en el inicio de la genética de Drosophila, en el laboratorio de Morgan, se
encontraban ocasionalmente ejemplares con malformaciones (Figura 8). En uno de estos
mutantes bithorax (bx), descubierto por Bridges en 1915, los órganos del equilibrio
(halterios) aparecían engrosados y con una apariencia parcial de ala. Esta malformación
se interpretó como una transformación del tercer segmento torácico (T3) hacia segundo
(T2). El término “homeosis”, acuñado por Bateson en 1894 para referirse a la
conversión de una estructura en la apariencia de otra homóloga, fue utilizado para
describir este tipo de malformaciones en las que células de una región se comportan
cómo si estuvieran localizadas en otra región del organismo. Y las mutaciones fueron
llamadas homeóticas. Así, bx fue el primer mutante homeótico.

Figura 8. Transformaciones homeóticas

en Drosophila. Arriba, mutaciones
múltiples del BX-C (abx bx3 pbx)
transforman los halterios en un segundo
par de alas (LEWIS 1998). Abajo, una
mutación del gen Antennapedia en
homozigosis transforma las antenas en un
par de patas. Dibujos de MÜLLER (1997).

Figure 8. Homeotic transformations in

Drosophila. Up, multiple mutations of the
BX-C (abx bx3 pbx) transform halteres in
a second pair of wings (LEWIS 1998).
Down, a mutation of the Antennapedia
gene in homozigosis transforms the
antenna in a pair of legs. Drawings from
MÜLLER (1997).

26
 INTRODUCIÓN

Desde principios de los 40, Lewis analizó las bases genéticas de las
transformaciones homeóticas, en un intento de contrastar la hipótesis de Bridges, basada
en evidencias citológicas, de que el genoma contiene duplicaciones génicas naturales, a
menudo en tandem. Empezó trabajando con diferentes mutantes ya descritos que
causaban transformaciones similares a bx y que, en muchos casos, complementaban a
esta mutación. Estas mutaciones tenían la particularidad de estar agrupadas en una
región del cromosoma, que fue bautizada como Complejo Bithorax (BX-C). Los genes
responsables de este fenómeno resultaron ser miembros de una familia génica que
controla la identidad de los segmentos a lo largo del eje anteroposterior del cuerpo.
Lewis trabajó en estos problemas durante décadas y en 1978 publicó un resumen de sus
resultados. En esta revisión formuló teorías sobre cómo interactúan los genes
homeóticos, cómo el orden de estos genes se corresponde al orden de los segmentos a lo
largo del eje corporal y sobre cómo se expresan los genes individuales.
Paralelamente, Kaufman y colaboradores, estudiando mutantes homeóticos que
afectaban a las regiones anteriores del organismo, describieron un segundo complejo, el
Complejo Antennapedia (ANT-C) e hicieron predicciones similares a las del BX-C
(LEWIS et al. 1980b; KAUFMAN et al. 1990).
Reglas de la regulación en cis de los genes del BX-C (LEWIS 1978; LEWIS 1998):
1.- Colinealidad (COL): El orden de los loci en el cromosoma es igual al orden en que
esos loci se expresan a lo largo del eje anteroposterior del cuerpo.
2.- Inactivación en cis (CIN): Las mutaciones de pérdida de función asociados con una
región cis-reguladora determinada tienden a inactivar la región siguiente del complejo
en sentido distal.
3.- Sobreexpresión en cis (COE): Las mutaciones de pérdida de función asociados con
una región cis-reguladora determinada tienden a ir acompañados por una sobreexpresión
de la función asociada con la región cis-reguladora proximal a ella.

Los primeros estudios ya apuntaban a que se trataba de un grupo de genes

relacionados y apoyaba la hipótesis de que los nuevos genes se originan por duplicación
y divergencia de genes preexistentes. En 1964, y basándose en el modelo bioquímico
del operón, Lewis interpretó la función de los genes del BX-C como “represores de
ciertos sistemas de diferenciación celular, permitiendo la acción de otros sistemas”.
Posteriormente, García-Bellido puntualizó que también podrían funcionar como
activadores de estos sistemas (LEWIS 1998).

27
INTRODUCCIÓN

En 1984, MCGINNIS et al. y SCOTT y WEINER descubrieron, de forma

independiente, que los genes homeóticos contienen una secuencia de 180 nucleótidos
altamente conservada. Esta secuencia, llamada caja homeótica o homeobox, codifica un
dominio proteico de 60 aminoácidos, el homeodominio, que forma una estructura
angular de tipo hélice-giro-hélice. Este dominio es capaz de reconocer y unirse a
motivos nucleotídicos específicos y la proteína que lo contiene puede por tanto actuar
como factor de transcripción.
La secuencia del homeobox permitió identificar rápidamente, mediante técnicas
de hibridación de ácidos nucleicos o amplificación por PCR con cebadores degenerados,
secuencias similares en organismos tan diversos como hidra (SCHUMMER et al. 1992;
GAUCHAT et al. 2000), nemátodos (WANG et al. 1993), sanguijuelas (NARDELLI-
HAEFLIGER y SHANKLAND 1992), anfioxo (HOLLAND et al. 1992), peces (NJOLSTAD y
FJOSE 1988; NJOLSTAD et al. 1988) o humanos (ACAMPORA et al. 1989). Actualmente
se conocen gran cantidad de genes con homeobox, que actúan como factores de
transcripción habitualmente en procesos de desarrollo. Dentro de este conjunto de genes
con homeobox, los genes homeóticos, también llamados genes con homeobox de la
clase Antennapedia (ZHANG y NEI 1996) o genes Hox, son aquellos que determinan el
patrón de desarrollo a lo largo del eje anteroposterior del embrión, especificando la
identidad de los segmentos y dando información posicional a lo largo del este eje.

1.6.2. Agrupación y Colinealidad

Cuando se empezaron a caracterizar a nivel molecular los genes de ratón
homólogos a los genes homeóticos de Drosophila, se encontró que también estaban
organizados en complejos génicos, y que sus patrones de expresión en el inicio de la
embriogénesis también seguían la regla de colinealidad entre el orden génico y el patrón
axial de expresión (Figura 9). Así, no solo los genes estaban conservados sino también
su estructura cromosómica en un complejo génico y su patrón de expresión a lo largo
del eje corporal principal (AKAM 1989; BOTAS 1993). Una diferencia destacable era que
mientras en la mosca hay un único complejo (aunque partido en dos fragmentos) en el
ratón se encontraron cuatro copias del complejo situadas en cromosomas diferentes. A
pesar de esta diferencia, se hizo evidente que los complejos génicos de ratón que
contenían estos genes son verdaderos homólogos a los complejos Hox de Drosophila
(AKAM 1989).

28
 INTRODUCIÓN

Los complejos de vertebrados e insectos contienen los descendientes de una

familia génica cuyos miembros principales divergieron antes de la separación de estos
dos linajes y mantienen en ambos el mismo orden en el cromosoma. Fue inevitable
deducir que insectos y vertebrados habían heredado un mecanismo molecular común
para indicar las regiones anterior, central y posterior (AKAM 1989). La colinealidad ha
llevado a la convicción de que la organización física de los genes en el cromosoma es
significativa para su función normal en el desarrollo y se ha convertido en el paradigma
de la Evo-Devo (DUBOULE y MORATA 1994).

1.6.3. Origen del Complejo Hox

Los genes Hox forman parte de un sistema de regulación del desarrollo que se ha
conservado como una unidad para llevar a cabo una función abstracta necesaria en los
animales pluricelulares, asignar valores posicionales en un campo de células (MCGINNIS
y KRUMLAUF 1992). No forman estructuras específicas sino que especifican la posición
a lo largo del eje anteroposterior del organismo durante el desarrollo embrionario
temprano. Esta función, demostrada en artrópodos, cordados y nemátodos, seguramente
fue adquirida temprano en la evolución de los metazoos y se ha conservado a pesar de
los cambios surgidos en otros mecanismos del desarrollo (MCGINNIS y KRUMLAUF
1992; SLACK et al. 1993). Los genes Hox parecen estar estableciendo una
representación molecular del plan corporal en estadíos tempranos de todos los animales.
Lo que ha llevado a considerar a estos genes y sus patrones de desarrollo un carácter
definitorio, sinapomorfía, de los metazoos (SLACK et al. 1993).

No todos los organismos presentan el mismo número de genes Hox, pero

estudios filogenéticos han permitido identificar los genes ortólogos en las diferentes
especies estudiadas y establecer la probable dotación génica del ancestro común a los
metazoos. Así la mayoria de organismos poseen un único complejo Hox formado por
entre 6 y 14 genes, los cuales se pueden agrupar, dentro de cada phylum, en al menos 8
tipos o grupos parálogos. La comparación de los grupos parálogos de los linajes más
distantes muestra que esta dotación no se ha adquirido de forma reciente, sino que el
último ancestro común de los Bilateria (Urbilateria) poseía un complejo de similar
complejidad. Se estima que este complejo poseía ya dos genes anteriores, un gen Hox3,
tres genes centrales y un gen posterior (Figuras 9 y 10) (DE ROSA et al. 1999; FERRIER y
MINGUILLON 2003).

29
INTRODUCCIÓN

Figura 9. Conservación de la organización genómica y de los patrones de expresión de los

genes Hox. Se muestran los complejos de genes Hox de Drosophila (arriba) y de mamíferos
(abajo), y una representación de sus patrones de expresión. En mamíferos, varios genes
posteriores de los complejos HOXA y HOXD se expresan también en los primordios de las
extremidades; indicados en color amarillo. La dotación génica hipotética del complejo en el
ancestro se muestra en el centro. Tomado de VERAKSA et al. (2000).
Figure 9. Conservation of the genomic structure and expression patterns of Hox genes. The
Hox gene complexes of Drosophila (up) and mammals (down), and their expression patterns
are shown. In mammals, several posterior genes of HOXA and HOXD complexes are also
expressed in limb primordia; shown in yellow. The hypothetical gene complement of the
ancestor is shown in the middle. From VERAKSA et al. (2000).

El complejo de genes Homeóticos surgió por duplicaciones en tandem y

divergencia a partir de un gen Hox ancestral. Pero no solo se duplicaron genes
individuales, sino también el complejo entero. Un duplicación del complejo ancestral
ProtoHox originó los complejos Hox y ParaHox (BROOKE et al. 1998). Esta duplicación
ocurrió antes de la divergencia entre los linajes de Cnidarios y animales triploblásticos

30
 INTRODUCIÓN

(FINNERTY y MARTINDALE 1999). Los genes ParaHox se expresan de forma colinear en

el endodermo, al igual que los genes Hox lo hacen en ectodermo y mesodermo.

De las relaciones entre los genes Hox y ParaHox se dedujo la presencia de

cuatro genes en el complejo ancestral ProtoHox (BROOKE et al. 1998). Pero un
reanálisis de los datos existentes muestra otro posible escenario en el que el complejo
inicial habría contenido solo dos genes: uno anterior y uno posterior. Después de la
duplicación en los complejos Hox y ParaHox se habrían originado los genes Hox3 y
centrales en el complejo Hox. En este escenario, el aumento en la diversidad de genes
Hox habría coincidido con el origen de los bilateria (GARCIA-FERNÀNDEZ 2004).

Se ha descrito un tercer complejo de genes con homeobox presente en

Drosophila y vertebrados. Los genes de estos complejos, 93D/E en Drosophila o NKL
en vertebrados, se expresan en el mesodermo del embrión en desarrollo donde
participan en el establecimiento de su patrón y diferenciación. La presencia de genes
ortólogos en las dos especies muestra que su agrupación no se debe a una formación
reciente por duplicaciones en tándem (HOLLAND 2001; JAGLA et al. 2001).

Pero ¿por qué estos genes han permanecido agrupados y en el mismo orden
lineal durante más de 500 millones de años de evolución? Se considera que la
conservación de estas agrupaciones génicas es reflejo de la necesidad funcional para la
correcta activación y función de estos genes. Entre estas necesidades funcionales
encontraríamos la existencia de regiones reguladoras compartidas entre genes, los
efectos de posición o, más recientemente, la colinealidad temporal.

1.6.4. Los Genes Hox y la Evolución Morfológica

La ausencia de información acerca de genes homeóticos fuera de Drosophila,
llevó a Lewis 1978, a hipotetizar que los genes del BX-C habían surgido durante la
evolución de las especializaciones morfológicas de la mosca. Se creía que la diversidad
morfológica a lo largo del organismo era debida a la diversidad de genes Hox, uno para
cada tipo de segmento. Pero la presencia en miriápodos, que no presentan tagmosis, de
homólogos de todos los genes Hox de Drosophila mostró que no fueron necesarios
nuevos genes Hox para la diversifiacción morfológica de los artrópodos (GRENIER et al.
1997). La transformación de un par de alas en halterios en el linaje de los dípteros no

31
INTRODUCCIÓN

fue el resulado de la aparición de un nuevo gen que inhibía la formación del ala, sino la
adaptación de un gen existente que a través de pequeños cambios había ido modificando
los procesos morfogenéticos que llevan a la formación del ala. Poco a poco, el
descubrimiento de que estos genes son mucho más antiguos y la presencia de dotaciones
complejas en todos los grupos ha ampliado el abanico de hipótesis acerca de su
repercusión sobre la evolución morfológica (DENELL et al. 1996).

Figura 10. Distribución de los genes Hox en los bilateria. El árbol muestra la filogénia del DNA
ribosómico 18S obtenida por AGUINALDO et al. (1997). B, ancestro común a los bilateria
(Urbilateria); D, deuteróstomos; E, ecdisozoos; L, lofotrocozoos; P, protóstomos. Las líneas
horizontales indican datos de cartografía. Las barras blancas verticales delimitan genes o grupos
de genes ortólogos. Las relaciones de ortología inciertas están marcadas con un interrogante, los
rectángulos punteados indican pequeños fragmentos de PCR, los rectángulos sólidos indican
homeobox completos o casi completos, y los rectángulos a rayas indican genes Hox de
artrópodos que muestran evolución rápida. Tomado de DE ROSA et al. (1999).
Figure 10. Distribution of Hox genes in bilaterians. Phylogenetic tree obtained with ribosomic
DNA 18S by AGUINALDO et al. (1997). B, common bilaterian ancestor (Urbilateria); D,
deuterostomes; E, ecdisozoans; L, lofotrocozoans; P, protostomes. Horizontales black lines
indicate mapping data. Vertical white bars delineate orthologous genes or groups of genes.
Uncertain orthology relationships are indicated by question marks, dashed boxes indicate short
PCR fragment, solid boxes indicate complete or almost complete homeoboxes, and striped
colours indicate fast evolving arthropod Hox sequences. From de DE ROSA et al. (1999).

32
 INTRODUCIÓN

Los genes homeóticos desarrollan funciones cruciales durante la embriogénesis

y han sido estudiados profundamente desde el punto de vista de la evolución del
desarrollo. Parece contradictorio que los genes Hox, que muestran una elevada
conservación, puedan ser los responsables de las dramáticas diferencias entre los planes
corporales dentro y entre phyla. De todos modos, cambios en número y regulación han
sido instrumentos en la evolución y diversificación de los planes corporales a diferentes
niveles (Figura 11) (GELLON y MCGINNIS 1998). Se ha propuesto que la divergencia
entre clases o phyla ha ido acompañada por cambios moleculares en el complejo de
genes Hox o en el uso de sus miembros. Estos cambios incluirían duplicaciones del
complejo, pérdida o ganancia de determinados genes, cambios en los niveles de
expresión y cambios en las interacciones reguladoras entre los genes Hox y sus genes
diana. Análisis genómicos comparativos avalan la hipótesis que las drásticas diferencias
en el desarrollo entre diferentes phyla son debidos al uso diferencial de productos
génicos conservados estructural y funcionalmente más que de la invención de proteinas
de novo (CARROLL 1995; GELLON y MCGINNIS 1998).

Aunque la dotación del ancestro de los bilateria era ya compleja (ver apartado
1.6.3) el número y tipo de genes Hox centrales y posteriores difiere entre Ecdisozoos,
Lofotrocozoos y Deuteróstomos (DE ROSA et al. 1999; CARROLL 2000), lo cual sugiere
la relación del número y tipos de genes con las diferencias entre estos grandes grupos.
Incluso la aparición de los genes Hox centrales podría haber coincidido con el origen de
los animales triploblásticos (GARCIA-FERNÀNDEZ 2004).
Dentro de los Artrópodos, la diferencia entre crustáceos, miriápodos e insectos
no es el número o el tipo de genes Hox, sino sus dominios de expresión. El límite
anterior de expresión de los genes Ubx or abdominal-A (abdA) está correlacionada con
transiciones en la morfología de los apéndices entre esto grupos (GRENIER et al. 1997).
En insectos, cambios en la morfología del aparato bucal se han relacionado con cambios
en el patrón de expresión de proboscipedia (pb) (ROGERS et al. 2002). En cordados,
cambios en el área de expresión de genes Hox específicos se han utilizado para explicar
la transición de las aletas de los peces a las extremidades de los anfibios (SHUBIN et al.
1997), o los cambios en el número relativo de vértebras cervicales, torácicas y lumbares
en anfibios, pájaros y mamíferos (BURKE et al. 1995).

33
INTRODUCCIÓN

Figura 11. Jerarquía de cambios evolutivos en los genes Hox según su presunto efecto
morfológico. Sobre los recuadros, se muestran los cambios en los planes corporales asociados a
los cambios en los genes Hox. Bajo los recuadros, probables mecanismos moleculares
responsables de estos cambios. Tomado de GELLON y MCGINNIS (1998).
Figure 11. Hierarchy of evolutionary changes in Hox genes arranged by their presumed
morphological impact. Above the boxes, modifications of body plans associated with changes in
Hox genes. Below the boxes, likely molecular mechanims responsible of such changes. From
GELLON y MCGINNIS (1998).

En otros casos han sido cambios en las proteínas codificadas por los genes Hox
lo que ha modificado su acción sobre los genes diana y, en consecuencia su efecto
fenotípico. Así, la diversificación morfológica de los segmentos torácicos en insectos se
ha producido gracias a la ganancia de nuevos genes diana (WEATHERBEE et al. 1999)
como resultado de la adquisición de un nuevo dominio en una proteína Hox (GALANT y
CARROLL 2002).
Cambios sutiles tienen también efecto fenotípico. El momento y lugar de
expresión de un gen Hox dentro de un dominio pueden ser cruciales para su efecto. Por
un lado la expresión de un mismo gen en una misma célula tendrá efectos diferentes
según el momento en que se produzca, por otro lado pequeños cambios cuantitativos
podrán también producir pequeños cambios fenotípicos. Dentro del mismo género,

34
 INTRODUCIÓN

pequeñas diferencias en el patrón de quetas en el segundo par de patas de Drosophila

parece ser resultado de diferencias sutiles en la regulación de Ubx (STERN 1998).
Incluso diferencias morfológicas entre segmentos de un organismo se deben a pequeñas
diferencias en el momento en el que un determinado gen se expresa en cada una de las
células del segmento (CASTELLI-GAIR y AKAM 1995; CASTELLI-GAIR y LOVEGROVE
2003).

Aunque hace tiempo que sabemos que los genes homeóticos codifican factores
de transcripción capaces de cambiar el destino de un segmento entre vías de desarrollo
alternativas, todavía sabemos muy poco sobre cómo controlan la morfología detallada
de estos segmentos (AKAM 1998). Se creía que los genes Hox determinan los patrones
de expresión de los genes realizadores. Ahora se considera que lo que hacen es
modificar la acción de las vias de señalización, modificando esos patrones de expresión
según la región del organismo. A pesar de la cantidad de trabajos realizados sobre estos
genes todavía sabemos muy poco sobre sus genes diana. Los productos de los genes
Hox parecen ser generalistas versátiles. Actúan en numerosos tipos celulares y tejidos,
donde modulan, unas veces de forma dramática pero habitualmente sutil, una amplia
variedad de procesos de desarrollo (AKAM 1998). Pequeños cambios tanto en el
homeobox como en la secuencia diana pueden, en teoría, modificar la afinidad y
producir pequeños cambios de reconocimiento. Las nuevas herramientas genómicas se
están aplicando para la identificación de los genes diana de los genes Hox. Por un lado
el uso de microarrays para detectar genes con expresión diferencial en cepas “salvajes”
versus mutantes (LEEMANS et al. 2001). Por otro lado, el estudio del funcionamiento y
la evolución de las regiones cis-reguladoras donde se unen los genes Hox, para poder
predecir los genes diana a partir de las secuencias genómicas (EBNER et al. 2005; HERSH
y CARROLL 2005).

1.6.5. Estructura del Complejo en los Metazoos

La reconstrucción de la historia evolutiva de la familia de genes Hox es central
para entender la evolución de los planes corporales de los bilateria y las relaciones entre
la complejidad génica y morfológica. A pesar de que la conservación de la estructura
del HOM-C se ha convertido en paradigma de la Evo-Devo, las conclusiones se
obtuvieron básicamente comparando Drosophila y ratón. Se han clonado fragmentos de
genes Hox en multitud de organismos, pero tenemos datos de solo unos pocos grupos en

35
INTRODUCCIÓN

cuanto a su organización genómica (DE ROSA et al. 1999). Aunque en los últimos años
han aumentado los datos disponibles a este respecto, me centraré aquí en los datos
disponibles cuando se inició este trabajo, en diciembre de 1999 (Figura 10). La
organización cromosómica de los genes Hox ha sido caracterizada solamente en
insectos, cordados, un equinodermo y un nemátodo. No se ha analizado la organización
de estos genes en ningún Lofotrocozoo, a pesar de la gran variedad de phyla incluidos
en este grupo.

El complejo del nemátodo Caenorhabditis elegans contiene solo seis genes,

formando tres pares separados por multitud de genes no relacionados. El orden de uno
de los pares está invertido respecto al orden esperado según el patrón de colinealidad.
Generalmente se había considerado que los nemátodos habían divergido antes de la
separación de protóstomos y deuteróstomos. Como representaban organismos
primitivos, esta estructura de los genes Hox se había interpretado como una simplicidad
ancestral. Pero la nueva filogenia de los metazoos ha situado a los nemátodos como
grupo hermano de los artrópodos lo cual cambia radicalmente su posición filogenética
(AGUINALDO et al. 1997). Si añadimos los datos sobre la dotación de genes Hox en el
ancestro de los bilateria (BALAVOINE y TELFORD 1995; DE ROSA et al. 1999), todo
indica que esta organización es en realidad una simplificación derivada.

Aparte de Drosophila, la organización del complejo ha sido estudiada en algunos

insectos no Drosophilidos. El escarabajo Tribolium castaneum (BEEMAN 1987), la
polilla Bombyx mori (UENO et al. 1992) o el saltamontes Schistocerca gregaria
(FERRIER y AKAM 1996) parecen tener un único complejo con homólogos del ANT-C y
BX-C de D. melanogaster. En T. castaneum y B. mori los datos provienen del análisis
de mutantes homeóticos similares a los descritos en Drosophila. Los genes Hox de estos
dos insectos se encuentran a 2 o 3 centimorgans, por lo que parece que forman un único
complejo indiviso. En el caso de S. gregaria, datos obtenidos por hibridación sobre
electroforesis de campo pulsante (PFGE – Pulsed Field Gel Electroforesis) sugieren que
el complejo Hox no está fragmentado, al menos entre Sex comb reduced (Scr) y
Abdominal-B (AbdB) (FERRIER y AKAM 1996).

Dentro de los equinodermos se han estudiado los genes Hox en dos erizos de
mar. Heliocidaris erythrogramma posee al menos ocho genes Hox que parecen estar

36
 INTRODUCIÓN

agrupados en un fragmento de unas 300 kb (POPODI et al. 1996) y Stronglylocentropus

purpuratus presenta 10 genes Hox en un único complejo de algo más de 500 kb
(MARTINEZ et al. 1999). A pesar de ser organismos con simetría pentaradial poseen un
complejo Hox con un contenido génico similar a los complejos de vertebrados.

Los cordados son el grupo más estudiado en cuanto a la organización del

complejo Hox, concretamente se ha estudiado el anfioxo y varios vertebrados. El
anfioxo posee un único complejo (GARCIA-FERNÀNDEZ y HOLLAND 1994). En
vertebrados el complejo homeótico se ha duplicado diversas veces, probablemente con
el resto del genoma, de manera que se encuentran cuatro copias del complejo en
mamíferos y hasta siete en el pez zebra (AMORES et al. 1998). En estos complejos se
han definido 13 grupos parálogos, pero no todos los complejos presentan el mismo
número de genes, ya que la presencia de copias redundantes a permitido la pérdida de
algunos de ellos.

1.7. EL COMPLEJO DE GENES HOX EN DROSOPHILA

1.7.1. Estructura del Complejo

En Drosophila el complejo de genes Hox (HOM-C) está formado por ocho genes
Hox, cuatro genes con homeobox y varios genes no relacionados. Los genes Hox fueron
descubiertos y descritos inicialmente en D. melanogaster (LEWIS 1978). En esta especie
el HOM-C se encuentra partido en dos bloques el ANT-C y el BX-C situados a unas 7,5
Mb en el brazo derecho del cromosoma 3 (elemento de Muller E, Tabla 1) (Figura 12).
El ANT-C contiene cinco genes Hox: labial (lab), pb, Deformed (Dfd), Scr y
Antennapedia (Antp); cuatro genes con homeobox: zerknüllt (zen), zerknüllt related
(zen2), bicoid (bcd) y fushi tarazu (ftz); y genes sin homeobox como el complejo de
genes cuticulares (Ccp), amalgam (ama) y los RNA de transferencia de la lisina (tRNA-
lys). Los genes lab, pb y Dfd especifican los segmentos cefálicos, mientras que Scr y
Antp contribuyen a dar identidad a segmentos torácicos (KAUFMAN et al. 1980; LEWIS et
al. 1980a; LEWIS et al. 1980b; KAUFMAN et al. 1990). El BX-C contiene tres genes
Hox: Ubx, abdA y AbdB; dos genes no codificantes: bithoraxoid (bxd) y
infraadbdominal 4 (iab4), y un gen no relacionado Glucose transporter type 3 (Glut).
Ubx es requerido para especificar la identidad del tercer segmento torácico y al primer

37
INTRODUCCIÓN

segmento abdominal, mientras que abdA y AbdB dan identidad a los restantes
segmentos abdominales (LEWIS 1978; SÁNCHEZ-HERRERO et al. 1985; DUNCAN 1987;
MARTIN et al. 1995).
De los genes no homeóticos contenidos en el ANT-C, tres son genes con
homeobox que desempeñan funciones importantes en el establecimiento del plan
corporal del embrión: el gen materno bcd codifica un morfógeno importante para
establecer la polaridad anteroposterior (BERLETH et al. 1988), ftz es un gen pair rule
(WEINER et al. 1984) y zen un gen zigótico involucrado en la diferenciación
dorsoventral (RUSHLOW et al. 1987). El gen zen2 contiene un homeobox similar al de
zen, pero no tiene función conocida (RUSHLOW et al. 1987). Genes como ama (SEEGER
et al. 1988) o los Ccp (PULTZ et al. 1988) no están implicados en el control del
desarrollo.

Figura 12. Estructura del HOM-C en D. melanogaster.

Figure 12. HOM-C structure in D. melanogaster.

El HOM-C de D. melanogaster contiene unas 650 kilobases (kb) de secuencia

genómica. La mayoría de unidades transcripcionales del HOM-C son largas para lo
habitual en Drosophila, por ejemplo Antp mide unas impresionantes 103 kb. El resto de
unidades de transcripción van de 6 a 70 kb (MCGINNIS y KRUMLAUF 1992). La mayoría
de los genes homeóticos tienen unidades de transcripción largas con regiones cis-
reguladoras que se extienden a lo largo de decenas de kb (BENDER et al. 1983a; SCOTT
et al. 1983; KARCH et al. 1985; BOULET y SCOTT 1988; CELNIKER et al. 1990; SIMON et
al. 1990; IRVINE et al. 1991; HOOPER et al. 1992). El elevado tamaño de los genes Hox
y del HOM-C se debe al gran tamaño y complejidad de las regiones reguladoras, las
cuales incluyen tanto enhancers que promueven la expresión de los transcritos en

38
 INTRODUCIÓN

dominios específicos, como regiones “barrera” que aislan las diferentes regiones
reguladoras.

1.7.2. Activación y Mantenimiento de los Patrones de Expresión Hox

En Drosophila todos los segmentos se forman casi simultáneamente durante el
blastodermo sincital gracias a la acción de los genes de la cascada de segmentación (ver
apartado 1.3.2). En este momento el embrión posee una distribución asimétrica de
numerosos factores de transcripción de origen materno y zigótico, producidos por los
genes gap y pair-rule. La serie de gradientes y bandas sobrepuestas que forman estas
proteínas exponen cada núcleo en el eje anteroposteior a combinaciones únicas de
factores de transcripción. Estos factores se unen a los lugares de unión de las regiones
cis-reguladoras de los genes Hox y activan o reprimen la transcripción (Figure 13). De
manera que cada gen es activado por una combinación única de factores de
transcripción generado en una posición particular a lo largo del eje del embrión. Aunque
todavía no caracterizados al mismo nivel de detalle, los elementos reguladores que
establecen las bandas de expresión de los genes Hox son presumiblemente similares a
los enhancers que dirigen las bandas de expresión de los genes pair-rule. Los genes Hox
anteriores y posteriores son activados al mismo tiempo, sin dependencia de los genes
posteriores en la activación previa de los genes anteriores (AKAM 1987; MCGINNIS y
KRUMLAUF 1992; KENNISON 1993; QIAN et al. 1993).
Se requiere una combinación específica de proteinas gap y pair-rule para iniciar
la transcripción de cada gen Hox en una banda única de células del blastodermo. Una
vez establecido el patrón de expresión, este es mantenido por la acción combinada de
autoregulación, regulación cruzada entre genes Hox, y acción de los productos de los
genes del grupo trithorax y del grupo polycomb (Figura 13). Los genes del grupo
trithorax mantienen activa la expresión de los genes Hox. Mientras los genes del grupo
polycomb mantienen la represión de los genes Hox, en las regiones donde no ha sido
activado con anterioridad. Estos genes parecen actuar mediante cambios en la estructura
de la cromatina que la mantendría accesible o inaccesible a la maquinaria
transcripcional (KENNISON 1993; NASIADKA et al. 2002).

39
INTRODUCCIÓN

Figura 13. Genes que intervienen en la regulación de los genes Hox: activación por la cascada
de segmentación y mantenimiento del patrón por polycomb y trithorax.
Figure 13. Genes involved in Hox gene regulation: activation by the segmentation cascade and
maintenance of the expression patterns by polycomb and trithorax.

1.7.3. Función de los Genes Hox

Los genes Hox controlan el desarrollo de estructuras y órganos específicos más
que los segmentos en si mismos. Una vez se han establecido los límites segmentales, se
encargan de especificar las características estructurales. Los genes del HOM-C
especifican la identidad en dominios segmentales o parasegmentales tanto durante la
primera fase del desarrollo de Drosophila (embriogénesis) como durante la segunda
(metamorfosis) (MCGINNIS y KRUMLAUF 1992). Como las estructuras cuticulares de
larva y adulto son muy distintas, podemos concluir que la identidad segmental ejercida
por los genes del HOM-C tiene caracter abstracto. O bién estos genes actúan sobre
diferentes genes diana en estos dos procesos, o bién es el diferente contexto en el que
actúan lo que da diferentes funciones a sus genes diana.
La mayoría de estudios de genes Hox se han basado en la observación de
alteraciones de la cutícula. Pero en realidad los genes Hox intervienen también en la
formación de tejidos internos. Reorganizaciones con puntos de rotura en iab4, cuando
son viables en heterocigosis aparentan ser “salvajes”, pero internamente carecen de
gónadas. Esta fue la primera indicación de que los fenotipos BX-C no se limitan a
tejidos ectodérmicos. Siempre es peligroso deducir la función de un gen a partir de
mutaciones de pérdida de función, especialmente para genes que afectan a la morfología

40
 INTRODUCIÓN

(LEWIS 1998). Las fenotipos homeóticos de pérdida de función se producen sólo cuando
hay otro gen Hox expresandose en la región, ya sea por que la expresión normal es
solapante o porque la ausencia de un gen desreprime la expresión de otro. Cuando esto
no ocurre, como en el caso de lab y Dfd, no se produce una transformación homeótica
sino una deficiencia estructural, como es la ausencia de involución cefálica en los
mutantes para lab (MCGINNIS y KRUMLAUF 1992).

1.7.4. Cambios Estructurales del HOM-C en el Género Drosophila

Es remarcable la conservación de la estructura del complejo de genes Hox de
Drosophila a humanos, y se han realizado muchos intentos para explicarlo. La mayoría
de los autores sugiere la existencia de complicadas relaciones reguladoras entre los
genes que hacen imposible modificar esta organización durante la evolución. El estudio
de la organización de los genes Hox en otras especies del género Drosophila debería dar
información sobre la conservación de la estructura del complejo y la presencia de genes
no homeóticos. La información disponible es muy escasa.

La mayoría de trabajos sobre genes Hox en Drosophila se han centrado en

estudiar la posición o la secuencia de un gen determinado.
TEROL et al. (1991) localizaron por in situ la posición de Antp en los
cromosomas en nueve especies del grupo obscura de Drosophila. Posteriormente,
localizaron también lab, pb y zen, en una posición citológica adyacente. Intentaron
clonar la región lab-pb iniciando un recorrido cromosómico desde pb, pero sólo
lograron llegar a zen, en esta especie la distancia entre zen y pb resulta ser cuatro veces
mayor que en D. melanogaster (TEROL et al. 1995).
MAIER et al. (1990) secuenciaron el gen ftz y sus regiones reguladoras en D.
hydei, perteneciente al grupo repleta. En esta especie observaron una orientación del gen
inversa respecto a D. melanogaster. Posteriormente extendieron el estudio al análisis de
las regiones reguladoras de ftz en 11 especies del género (MAIER et al. 1993).
Observaron por ejemplo que, en D. virilis, la orientación del gen era igual que en D.
hydei.
HOOPER et al. (1992) clonaron y secuenciaron el gen Antp en D. virilis y
parcialmente en D. subobscura. Vieron que la estructura del gen está conservada entre
las tres especies. Observaron también la presencia de bloques de secuencia conservados
en los intrones largos, y hasta 15 kb en la región 5’ y 3 kb en la región 3’ del gen.

41
INTRODUCCIÓN

Figura 14. Reconstrucción filogenética de la organización de los genes Hox en el género

Drosophila. Se ha incluido toda la información disponible (detalles en el texto) sobre la
localización de genes Hox. Los genes Hox se muestran como triangulos cuando se conoce su
orientación (5’→3’), si no aprarecen como rectángulos. Donde no aparecen líaneas de conexión,
el orden de los genes se ha dibujado como en D. melanogaster pero todavía no se ha
demostrado. Las flechas indican las roturas conocidas del complejo Hox. La línesa verticales
indican discontinuidades cromosómicas del comlejo Hox. De RANZ, CÁCERES y RUIZ
(comunicación personal).
Figure 14. Phylogenetic reconstruction of Hox gene organization in the genus Drosophila. All
known information of Hox gene localization (see text for details) has been plotted. Hox genes
are shown as triangles when the orientation (5’→3’) is known, they appear as rectangles
otherwise. Unless a connecting line appears, the order of the genes has been assumed as in D.
melanogaster but has not yet been demonstrated. Arrows indicate known splits in the Hox
complex. Vertical lines indicate chromosomal discontinuities in the Hox complex. Map position
of genes is shown. From RANZ, CÁCERES and RUIZ (personal communication).

42
 INTRODUCIÓN

BOMZE y LÓPEZ (1994) secuenciaron fragmentos de cDNA de Ubx de D.

pseudoobscura, D. hydei y D. virilis. Observaron que los diferentes transcritos, fruto del
procesamiento alternativo, descritos en D. melanogaster estaban también presentes en
estas especies. También analizaron el patrón de expresión de Ubx en embriones de las
cuatro especies, concluyendo que el patrón de expresión de las diferentes isoformas está
conservado.

En cuanto a la organización genómica de los genes Hox, RANDAZZO et al.

(1993) estudiaron la estructura del ANT-C en D. pseudoobscura. Concluyeron que su
estructura era igual a la descrita para D. melanogaster con solo dos diferencias, la
orientación del gen Scr y la ausencia de zen2. Estos autores no estudiaron la región del
BX-C. En 1996, VON ALLMEN et al. describían una organización diferente en D. virilis.
Mediante hibridaciones in situ sobre cromosomas politénicos observaron que Ubx está
situado al lado de Antp en lugar de adyacente a los genes abdA y AbdB. Lo que suponía
que la organización descrita para D. melanogaster no era válida para todo el género
como se había supuesto en muchas ocasiones. Esta observación también implica que el
ancestro del género Drosophila debía tener un complejo único como se observa
actualmente en Tribolium.

RANZ et al. (2001; 2003) mediante hibridación in situ sobre cromosomas

politénicos localizaron la posición citológica de los genes Hox pb, Antp, Ubx, abdA y
AbdB en D. repleta y D. buzzatii. En estos trabajos se observó que estas especies
presentaban la rotura Ubx-abdA descrita en D. virilis (VON ALLMEN et al. 1996).
Posteriormente, la localización del gen lab mostró la presencia de una segunda rotura en
estas especies. Esta rotura que afecta a la región anterior del complejo, concretamente
entre los genes lab y pb. Esta reorganización situó al gen lab en una posición citológica
indistinguible de la de los genes abdA y AbdB (RANZ, CÁCERES y RUIZ comunicación
personal). Hibridaciones in situ sobre otras especies del subgénero Drosophila
permitieron delimitar la distribución filogenética de estas roturas (Figura 14).

43
INTRODUCCIÓN

1.8. Objetivos
Los genes Hox codifican factores de transcripción cuya función es especificar la
identidad de los segmentos en el embrión temprano. Estos genes están habitualmente
agrupados y organizados en el mismo orden en el que se expresan a lo largo del eje
anteroposterior del cuerpo de los metazoos. Aunque la conservación de la organización
genómica ha sugerido la existencia de constricciones funcionales actuando sobre ella, la
explicación mecanística de la colinealidad ha sido esquiva y bien puede ser que no
exista una causa única y universal. La desestructuración del complejo en C. elegans y la
presencia de tres roturas en dos linajes de Drosophila ponen en cuestión que esta
organización genómica sea realmente necesaria para su correcto funcionamiento.

Como objetivo de esta tesis nos propusimos investigar las causas y

consecuencias de las reorganizaciones naturales del complejo HOM-C de Drosophila.
Los objetivos concretos son los siguientes:

- Puntos de rotura y mecanismo que las produjo:

1. Determinar en que punto de la región entre labial y proboscipedia se produjo la
rotura presente en las especies del grupo repleta de Drosophila.
2. Determinar la distancia entre los genes lab y abdA que presentan la misma posición
citológica en D. buzzatii.
3. Identificar el mecanismo responsable de la rotura lab-pb. Si se trata de una inversión,
determinar el segundo punto de rotura y si este es coincidente con la rotura Ubx-
abdA. Si se trata de una transposición, delimitar la región transpuesta.

- Efectos funcionales de las roturas del HOM-C sobre los genes Hox adyacentes:
4. Determinar si la separación de lab del resto de genes del HOM-C (cambio de
posición) ha tenido algún efecto en la estructura del gen o en la evolución de su
secuencia.
5. Determinar si la rotura ha separado algún elemento regulador de los genes Hox
adyacentes.
6. Determinar si la rotura ha tenido algún efecto en la expresión de los genes Hox
adyacentes.

44
 INTRODUCIÓN

1.8. Objetives
Hox genes code for transcription factors whose function is to specify segment
identity in the early embryo. Those genes are usually clustered and arranged in the
same order as they are expressed along the antero-posterior body axis of the metazoan.
Although the conservation of the genomic organization has suggested the existence of
functional constrictions acting over it, the mechanistic explanation of colinearity has
been elusive and it can well be that a unique and universal cause does not exist. The
disassembly of the complex in C. elegans and the presence of three splits in two lineages
of Drosophila call into question if this genomic organization is really necessary for
proper functioning.

The objective of this thesis was to investigate the causes and consequences of
natural HOM-C rearrangements in Drosophila. The concrete objectives are the
following:

- Breakpoints and mechanism responsible:

1. Determine the exact position between labial and proboscipedia of the breakpoint
present in the species of the repleta group of Drosophila.
2. Determine the distance between lab and abdA, which show the same cytological
position in D. buzzatii.
3. Identify the mechanism responsible for the lab-pb split. If it is an inversion,
determine the second breakpoint and if it is coincident with the breakpoint of the
Ubx-abdA split. If it is a transposition, determine the transposed region.

- Functional effects of HOM-C splits on the adjacent Hox genes:

4. Determine if the separation of the lab gene from the HOM-C (positional change) had
any effect in the structure or sequence evolution of this gene.
5. Determine if the split has separated any regulatory element of the adjacent Hox
genes.
6. Determine if the split had any effect on the expression of the adjacent Hox genes.

45
2. RESULTADOS
 RESULTADOS

2.1. Artículo 1
La primera parte de este trabajo describe el descubrimiento de una nueva rotura
del HOM-C en las especies del grupo repleta de Drosophila. Este resultado fue obtenido
previamente al inicio de esta tesis doctoral. Esta rotura ha recolocado el gen más
anterior del complejo, lab, en una posición cromosómica distante pero indistinguible de
la posición citológica de los genes Hox más posteriores, abdA y AbdB.

Para investigar las consecuencias evolutivas de las reorganizaciones naturales

del HOM-C, se ha clonado y secuenciado el gen lab en D. buzzatii, un miembro del
grupo repleta de Drosophila, y parcialmente en D. virilis, miembro del grupo virilis, que
no presenta la rotura. Los resultados muestran que la estructura de lab en D. buzzatii
está intacta y sitúan la rotura a más de 8 kb del inicio de transcripción. La evolución de
la secuencia nucleotídica de lab en el género Drosophila ha sido investigada mediante
métodos de máxima verosimilitud. Aunque la tasa de substitución nucleotídica varía
drásticamente a lo largo de la secuencia codificante, no se ha observado variación
significativa entre linajes en la tasa de substitución nucleotídica o en la razón entre las
substituciones no sinónimas y sinónimas. Por lo tanto, el cambio de posición de lab no
ha inducido cambios en la tasa de evolución o en el grado de constricciones funcionales.

NEGRE B., J.M. RANZ, F. CASALS, M. CÁCERES y A. RUIZ (2003) A New Split of the
Hox Gene Complex in Drosophila: Relocation and Evolution of the Gene labial.
Molecular Biology and Evolution 20(12):2042-2054.

49
RESULTADOS

50
A New Split of the Hox Gene Complex in Drosophila: Relocation and Evolution
of the Gene labial
Bárbara Negre, José Marı́a Ranz,1 Ferran Casals, Mario Cáceres,2 and Alfredo Ruiz
Departament de Genètica i de Microbiologia, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra (Barcelona) Spain

Hox genes encode transcription factors involved in the specification of segment identity in the early metazoan embryo.
These genes are usually clustered and arranged in the same order as they are expressed along the anteroposterior body
axis. This conserved genomic organization has suggested the existence of functional constraints acting on the genome
organization. Partial disassembly of the Hox gene complex (HOM-C) in Caenorhabditis elegans and in two different
Drosophila lineages, however, calls into question whether this cluster organization is absolutely required for proper
function. Here we report a new split of the HOM-C discovered in the species of the Drosophila repleta group, which
relocated the most anterior gene of the complex, lab, to a distant chromosomal site near the two most posterior Hox
genes, abd-A and Abd-B. To investigate the evolutionary consequences of natural rearrangements of the Hox gene
complex, the gene lab has been cloned and sequenced in D. buzzatii, a member of the D. repleta group with the split, and
in D. virilis, a member of a different species group without the split. The results show that the structure of lab in D.
buzzatii is intact and place the breakpoint at least 8 kb from its transcription start site. The nucleotide sequence evolution
of lab in the genus Drosophila has been investigated by means of maximum likelihood methods. No significant variation
has been observed among lineages in the rate of nucleotide substitution or in the nonsynonymous/synonymous
substitution ratio. Seemingly, the relocation of lab has not induced a change in evolution rate or degree of functional
constraint. Nevertheless, further work is needed to ascertain whether the lab-pb split has had any effects on gene
expression.

Introduction
Homeotic (Hox) genes encode transcription factors order): labial (lab), proboscipedia (pb), Hox3, Deformed
that specify the future cellular identity along the ante- (Dfd), Sex comb reduced (Scr), fushi tarazu (ftz), Anten-
roposterior axis in the early metazoan embryo by activating napedia (Antp), Ultrabithorax (Ubx), abdominal-A (abd-
or repressing their target genes (Gehring and Hiromi 1986). A), and Abdominal-B (Abd-B). This was probably also the
In the genome, Hox genes are found clustered and arranged organization in the ancestor of the Drosophila genus,
in the same order as they are expressed along the although in insects Hox3 and ftz have lost their Homeotic
anteroposterior body axis (Lewis 1978; McGinnis and function (Hughes and Kaufman 2002). Two rearrangements
Krumlauf 1992). This colinearity appeared before the of this ancestral Hox complex are known to have occurred
separation between vertebrates and invertebrates, and it is during the evolution of the Drosophila genus (fig. 1). In the
widely conserved across the bilaterian phylogeny, which lineage leading to D. melanogaster a split between Antp and
has suggested the existence of functional constraints acting Ubx separated the genes in two complexes: the Anten-
on their genome organization (Duboule and Morata 1994). napedia complex (ANT-C) (Kaufman, Seeger, and Olsen
Partial disassembly of Hox complexes in Caenorhabditis 1990) and the Bithorax complex (BX-C) (Lewis 1978;
elegans (Ruvkun and Hobert 1998) and Drosophila Duncan 1987). These two complexes are located on the
(vonAllmen et al. 1996; Adams et al. 2000; Ranz, Casals right arm of D. melanogaster chromosome 3, separated by
and Ruiz 2001), together with reported experimental breaks approximately 9.6 Mb of euchromatic sequences. The
of the Drosophila complexes (Hazelrigg and Kaufman ANT-C spans ; 400 kb (Adams et al. 2000) and comprises
1982; Struhl 1984; Tiong, Whittle and Gribbin 1987), calls five Hox genes (lab, pb, Dfd, Scr, and Antp), which are
into question whether this organization is absolutely expressed in those segments that will become the head and
required for proper function. the anterior thorax. The BX-C spans ;350 kb (Martin et al.
A single Homeotic gene cluster (HOM-C) is postulated 1995; Adams et al. 2000) and contains three Hox genes
to have existed in the ancestor of the arthropods (Hughes (Ubx, abd-A, and Abd-B), which are expressed in the
and Kaufman 2002), although most sequences are partial posterior thorax and abdomen. A different arrangement of
and, usually, there are no data about the chromosomal the Hox genes was found in D. virilis, a species of the
localization of the genes (Finnerty and Martindale 1998; Drosophila subgenus (vonAllmen et al. 1996). In this
deRosa et al. 1999; Cook et al. 2001). The 10 Hox genes species Ubx mapped by in situ hybridization with Antp
included in this ancestral complex are (in anteroposterior instead of with abd-A, indicating that in the lineage leading
to this species a disruption of the Hox complex occurred
1
Present address: Department of Genetics, University of Cam- between the genes Ubx and abd-A (fig. 1).
bridge, Cambridge, United Kingdom. The diversity in Hox gene arrangement observed
2
Present address: Department of Human Genetics, Emory Univer- among Drosophila species along with the reported
sity School of Medicine, Atlanta, Georgia. flexibility of its genome (Stone 1962; Hartl and Lozovskaya
Key words: labial, Hox complex, Drosophila buzzatii, chromo- 1994; Powell 1997; Ranz, Casals, and Ruiz 2001) prompted
somal rearrangement, genome evolution.
us to investigate the organization of Hox genes in D. buzzatii
E-mail: [email protected]. and D. repleta, two representative species of the D. repleta
Mol. Biol. Evol. 20(12):2042–2054. 2003 species group of the Drosophila subgenus. The in situ
DOI: 10.1093/molbev/msg238
Molecular Biology and Evolution, Vol. 20, No. 12, hybridization to the salivary gland chromosomes of the

Society for Molecular Biology and Evolution 2003; all rights reserved. Antp, ftz, pb, Ubx, abd-A, and Abd-B genes (Ranz, Segarra,

2042
 Evolution of the Drosophila Hox gene labial 2043

FIG. 1.—Phylogenetic reconstruction of Hox gene organization in the genus Drosophila. All known information of Hox gene localization has been
plotted in a phylogenetic tree to establish when each reorganization took place. The evolutionary relationships among species and divergence times are
from different sources (Powell 1997; Ranz, Segarra, and Ruiz 1997; Kwiatowski and Ayala 1999). Hox genes are shown as triangles when the
orientation (59 fi 39) is known; they are otherwise shown as rectangles. Hox genes expressed in the anterior and posterior parts of the embryo
appear in red and blue gradients, respectively. The genes ftz, zen1, and Pxd are also included (Wharton 1942; leCalvez 1953; vonAllmen et al.
1996; Powell 1997; Adams et al. 2000); the gene zen2 found in the Hox complex of D. melanogaster (Adams et al. 2000) is not represented.
Unless a connecting line appears, the order of the genes has been assumed as in D. melanogaster but has not yet been demonstrated. Arrows
indicate known splits in the Hox complex. Vertical lines indicate chromosomal discontinuities in the Hox complex. When known, map
position of genes is shown. Information for D. canalinea and D. immigrans: this work; D. melanogaster: Adams et al. 2000; D. pseudoobscura:
Terol, Perez-Alonso, and Frutos 1991, Randazzo et al. 1994; and D. virilis: Maier, Preiss, and Powell 1990, Maier, Sperlich, and Powell 1993,
vonAllmen et al. 1996, and this work. For all the D. repleta group species, a representative organization obtained from D. buzzatii (Ranz,
Segarra and Ruiz 1997; this work), D. hydei (Maier, Preiss, and Powell 1990; Maier, Sperlich, and Powell 1993; this work), D. mercatorum
(this work), and D. repleta (Ranz, Segarra, and Ruiz 1997; Ranz, Casals, and Ruiz 2001; this work) is shown.
2044 Negre et al.

Table 1
Sequence of Oligonucleotide Primers Used for PCR Amplification of Different Regions of the Gene labial in Different
Drosophila Species
Gene Region Species Forward (59–39) Reverse (59–39) Product Size
Exons 2–3 (homeobox) D. buzzatii TCCAGCACCGAAACTACCTG TTCACGCGCTTCTTCTGCTTCAT 1,122 bp
D. hydei 954 bp
D. mercatorum 725 bp
D. repleta 727 bp
D. virilis 1,172 bp
Exon 1 D. buzzatii ATGATGGACGTAAGCAGCATG CATTCCTCTTGAGTTGCATCCA 1,285 bp
D. virilis 1,261 bp
cDNA D. buzzatii CATCCGTGTCAGCTGCTAAC TTCACGCGCTTCTTCTGCTTCAT 570 bp
D. virilis CCTCGTCATCAACAACATCTG TTCACGCGCTTCTTCTGCTTCAT 548 bp
Intron 1 fragment D. buzzatii CCTGGAGCCATATAATAGGT GCTCGATTAATTGATGGATG ;3.5 kb
59 UTR D. virilis TGCTCGGCCAGCAATCAG AGGCAGTGGCTGTGGCATGA 818 bp

and Ruiz 1997; Ranz, Casals, and Ruiz 2001; Ranz et al. the amplified products. The clone of D. virilis was used to
2003) indicated that both species lack the Antp-Ubx split map lab in D. immigrans and D. canalinea.
present in D. melanogaster and share the split between Ubx Preparations of slides, probe labeling, and hybridiza-
and abd-A with D. virilis (fig. 1). However, the location of tion to salivary gland chromosomes were performed
the lab gene was not yet known in those species. Here, we as previously described (Ranz, Segarra, and Ruiz 1997).
have mapped the lab gene in different Drosophila species Homologous and heterologous hybridizations were per-
and show that a new split has separated this gene from the formed at 378C and 258C, respectively. Micrographs were
other anterior Hox genes and relocated it near abd-A and taken by phase contrast with a Nikon Optiphot-1
Abd-B, which direct the posterior development of the fly. To microscope and a Nikon H-III photomicrographic system
determine if the lab-pb split has altered in any way the at 6003 magnification using EKTAR-25 Kodak film and
structure or evolution of lab, we have cloned and sequenced a blue filter. The chromosome map of D. repleta (Wharton
this gene in D. buzzatii (which presents the split) and also 1942) was used to localize the in situ hybridization signals
partially in D. virilis (which lacks the split). The results in all D. repleta group species and D. canalinea; the
show that the molecular structure of lab is conserved cytological maps of D. immigrans (leCalvez 1953) or D.
between D. buzzatii, D. melanogaster, and D. virilis, and virilis (Gubenko and Evgen’ev 1984) were used in the
that the breakpoint must be located at least 8 kb upstream of remaining cases.
this gene. In addition, they indicate that lab is a relatively
fast evolving gene, although there was no evidence for Southern Hybridization and Library Screening
positive or relaxed selection either before or after the split.
Genomic DNA extraction was performed as described
in Piñol et al. (1988). DNA was digested with different
Materials and Methods restriction enzymes and transferred from the agarose gels to
Drosophila Stocks nylon membranes by capillarity transfer under neutral
The following species and stocks were used (code conditions (Sambrook, Fritsch, and Maniatis 1989). Probes
numbers of the Tucson Drosophila Species Stock Center are were labeled with digoxygenin-11-dUTP by random
given in parenthesis): D. buzzatii (st-1 and j-19; see primer with the DIG DNA Labeling and Detection Kit
Cáceres, Puig, and Ruiz 2001), D. canalinea (15050– (Roche). Hybridization was performed at 428C for 16 h
1201.0), D. hydei (Carboneras, Spain), D. immigrans using standard hybridization buffer with formamide (50%).
(15111–1731.0), D. mercatorum (Comarapa, Bolivia), D. Filters were washed twice for 15 min in 23 SSC 0.1%
repleta (15084–1611.2), and D. virilis (Tokyo, Japan). All sodium dodecyl sulfate (SDS) at room temperature and
stocks are fixed for the standard chromosomal arrangements twice for 20 min in 0.13 SSC 0.1% SDS at 688C.
except line j-19 of D. buzzatii, which is homozygous for A lambda genomic library derived from D. buzzatii
inversion 2j. line j-19 (Cáceres, Puig, and Ruiz 2001) was amplified
following Sambrook, Fritsch, and Maniatis (1989) and used
In Situ Hybridization to Salivary Gland Chromosomes for cloning of lab. Screening was done by plaque
hybridization under the same conditions as for the Southern
Clones used as probes to map by in situ hybridization hybridization. Two probes were used to clone lab in D.
the Antp, Ubx, abd-A, and Abd-B genes have been reported buzzatii, one corresponding to exons 2–3 and the other to
elsewhere (Ranz, Segarra, and Ruiz 1997; Ranz, Casals, and exon 1, separated in D. melanogaster by a large intron of
Ruiz 2001). To localize the lab gene in D. buzzatii, D. hydei, nearly 14 kb. The probe containing exons 2 and 3 was the
D. mercatorum, D. repleta, and D. virilis, homologous same 1,122 bp fragment used in the in situ hybridization
probes were generated in each species by polymerase chain (see above). The exon 1 probe consisted in a 1,285-bp
reaction (PCR) amplification of a 725–1,172-bp segment fragment amplified by PCR using specific primers (table 1).
encompassing exons 2–3 of the gene and including the Sequencing of the PCR product confirmed its homology
homeobox (table 1), followed by cloning and sequencing of with exon 1 of D. melanogaster lab.
 Evolution of the Drosophila Hox gene labial 2045

cDNA was obtained by random primer with the First Strand

cDNA Synthesis Kit for reverse transcriptase polymerase
chain reaction (RT-PCR; AMV-Roche). Amplification con-
ditions for RT-PCR were as described for PCR.

DNA Sequencing and Sequence Analysis

Polymerase chain reaction products and restriction
fragments from lambda phages were cloned into pGEM-T
(Promega) and Bluescript II SK (Stratagene) and sequenced
with universal primers. In some cases internal specific
primers were designed for primer walking. Sequencing was
performed in an ALF express DNA automated sequencer
(Pharmacia Biotech) and an ABI 373 A (PerkinElmer)
automated sequencer. Nucleotide sequences were analyzed
with the Wisconsin Package (Genetics Computer Group).
Similarity searches were done with algorithms Fasta,
BlastN, and BlastX. ClustalW (Thompson, Higgins, and
Gibson 1994) was used to perform multiple alignments.
AVID was used to align long sequences (.3 kb) and
mVISTA to visualize the alignments (Mayor et al. 2000;
Dubchak et al. 2000). Untranslated region (UTR) functional
FIG. 2.—Chromosomal localization of the genes lab and abd-A in the elements were searched with UTRscan (Pesole and Liuni
D. repleta group. Large arrowheads indicate the hybridization signals of
the abd-A (a) and lab (b) probes at G4g-5a of chromosome 2 of D. 1999).
buzzatii, one representative species of the D. repleta group of Drosophila. Maximum likelihood estimates of the number of
Small arrowheads indicate the chromosomal localization of the Hox genes synonymous and nonsynonymous substitutions per site (dS
Antp, pb, and Ubx (Ranz, Segarra, and Ruiz 1997 and Rantz et al. 2003). and dN, respectively) were obtained with the program
codeml of the PAML package (Yang 1997). For hypothesis
testing, the base model assumed a rooted tree with constant
nucleotide substitution rate (global clock) and a single
Polymerase Chain Reaction Amplification x ¼ dN/dS ratio. Codon equilibrium frequencies pi were
estimated from the nucleotide frequencies of the three
Primers (table 1) were designed with Primer Designer
codon sites (F3X4 option of codeml; Yang 1997). The base
(1.01—1990 Scientific and Educational Software). Primers
model included 13 parameters: the transition/transversion
used to amplify the lab segment comprising exons 2–3
rate ratio (j), the nonsynonymous/synonymous substitution
(homeobox) in all species were designed according to the
ratio (x), two relative branch lengths (rs), and nine
D. melanogaster lab sequence. Exon 1 of D. buzzatii and D.
nucleotide frequencies.
virilis were amplified using the regions conserved between
Labial proteins of D. melanogaster (AAD19811.1) and
Tribolium castaneum (AAF64147.1). To amplify the Results and Discussion
cDNA of D. buzzatii and D. virilis, forward primers were Chromosomal Localization of labial in D. buzzatii and
designed in each species exon 1 sequence. Primers located Other Species in the Drosophila Subgenus
in the transcription initiator (Inr) sequence of D. buzzatii
To map labial in D. buzzatii, a fragment encompassing
and the beginning of the coding region of D. virilis were
exons 2–3 and including the homeobox was obtained by
used to amplify the 59 UTR in the latter species.
PCR and used for in situ hybridization to the salivary gland
Polymerase chain reaction was carried out in a volume
chromosomes. Surprisingly, the lab probe hybridized to the
of 50 ll, including 100–200 ng of genomic DNA or cDNA
dense polytene band G4g-5a of chromosome 2 (fig. 2),
or 1 ll of phage lysate, 20 pM of each primer, 200 lM
separated by about 70 bands from the site (F1c-e) where the
dNTPs, 1.5 mM MgCl2, and 1 unit Taq DNA polymerase.
other anterior genes of the Hox complex (pb, ftz, Antp) had
Temperature cycling conditions were 30 rounds of 30 s at
been previously localized (Ranz, Casals, and Ruiz 2001).
948C, 30 s at the annealing temperature, and 60 s at 728C,
Furthermore, lab cytological position was almost indistin-
with annealing temperature varying between 558 and 618C
guishable from that of abd-A and Abd-B (Ranz, Casals, and
depending on the primer pair used.
Ruiz 2001). The localization of lab in D. buzzatii
chromosomes was later corroborated by hybridization of
other probes of the gene (see Materials and Methods) and
RNA Isolation and Reverse Transcriptase-Polymerase
indicates a split of the Hox gene complex between lab and
Chain Reaction
pb. To date this split and reconstruct the evolutionary
Total RNA from 0–12-h-old embryos from D. buzzatii history of the Hox gene complex in the Drosophila
(line j-19) and D. virilis was isolated with TRIZOL subgenus, the same gene fragment was amplified by PCR
(GIBCO) following the manufacturer’s instructions. Glass- and cloned in D. hydei, D. mercatorum, D. repleta, and
ware was washed with DEPC-water to eliminate RNases. D. virilis. The resulting clones were sequenced and used for
2046 Negre et al.

Table 2
Structure of the labial Gene in Three Drosophila Species and Tribolium castaneum
Gene Region D. buzzatiia D. virilisa D. melanogasterb T. castaneumc
d
Promoter Inr þ DPE Inr þ DPE Inr þ DPE TATA
59 UTR 757 bp 738 bp 239 bp 181 bp
Exon 1 1,300 bp 1,276 bp 1,216 bp 630 bp
Intron 1 ;19 kb ND 14 kb 11.5 kb
Exon 2 380 bp 380 bp 416 bp 431 bp
Intron 2 687 bp 737 bp 245 bp —
Exon 3 288 bp .50 bp 258 bp —
39 UTR 619–831 bp ND 647 bp 144 bp
NOTE.—ND: not determined.
a
Data from this work.
b
Accession number NG_000062.
c
Data from Nie et al. (2001).
d
Inr: transcription initiator; DPE: downstream promoter element.

in situ hybridization to the chromosomes of those four including exons 2 and 3, and kj-19/68 and kj-19/89,
species, as well as those of D. canalinea and D. immigrans including exon 1. Because those phages did not contain the
(fig. 1). D. buzzatii, D. hydei, D. mercatorum, and D. whole gene, another phage was obtained (kj-19/77), and the
repleta are representative species of four subgroups of the remaining gap (3.5 kb) was closed by PCR amplification
D. repleta group (Wasserman 1992), and in all of them lab (table 1 and fig. 3). Overall, 12,069 bp of Db lab were
was localized at band G4g-5a of chromosome 2. Likewise, sequenced, corresponding to the entire coding sequence
in D. canalinea, which belongs to a closely related species (CDS), intron 2, the 59 UTR, the 39 UTR, and 6,241 bp from
group (Wasserman 1992), Antp and lab mapped to different the upstream regulatory region (table 2 and fig. 3). Intron 1,
chromosomal sites. However, in D. virilis, a phylogeneti- with an estimated size of ;19 kb, was only partially
cally more distant species, lab mapped to 24E, the same sequenced.
constricted region of chromosome 2 where the genes Antp, In the analysis of the genomic sequence of Db lab
zen, and Ubx have been previously localized (vonAllmen (12,069 bp) no other conserved coding regions were found
et al. 1996). Finally, five Hox genes (abd-A, Abd-B, Antp, apart from those corresponding to the lab gene. However,
lab, and Ubx) were mapped by in situ hybridization to the two transposable element insertions were identified: a new
chromosomes of D. immigrans, an even more distantly copy of the ISBu2 element (Cáceres, Puig, and Ruiz 2001)
related species. In this species, lab, Antp, and Ubx mapped of 738 bp and an ISBu3 element of 993 bp, inserted 5,500
to the same chromosomal site, whereas abd-A and Abd-B bp and 1,663 bp, respectively, upstream from the Db lab
mapped to another location of the same chromosome transcription start site (fig. 3). Both elements are closely
(fig. 1). Therefore, we conclude that the virilis-immigrans related to the ISBu1 element of D. buzzatii (Cáceres, Puig,
Hox gene organization (including the split between Ubx and Ruiz 2001), and all three belong to the mini-me class
and abd-A) appears to be ancestral within the Droso- described by Wilder and Hollocher (2001).
phila subgenus. The newly discovered lab-pb split occur- In D. virilis three genomic fragments of the lab gene
red before the radiation of the D. repleta group, 15–22 (Dv lab) where amplified by PCR and sequenced (table 2):
MYA, but after the divergence between the repleta and a 1,172-bp fragment corresponding to exons 2 and 3 and
virilis species groups, 20–30 MYA (Spicer 1988; Russo, intron 2, a 1,268-bp fragments corresponding to exon 1, and
Takezaki, and Nei 1995). To our knowledge, the split a 1,818-bp fragment containing the 59 UTR. In addition,
lab-pb is unique among the eukaryotes and provides the op- a 548-bp cDNA fragment comprising the area from the end
portunity to investigate the evolutionary consequences of of exon 1 to the beginning of exon 3 was also cloned and
natural Hox gene complex rearrangements. sequenced. Overall, 3,184 bp were sequenced, with only
intron 1, part of exon 3, and the 39 UTR remaining.
The molecular structure of Db lab and Dv lab is similar
Molecular Structure of labial in D. buzzatii
to that of Dm lab, comprising three exons and two introns
and D. virilis
(table 2 and fig. 3). Therefore, the structure of the lab
To determine if the lab-pb split has affected in any way transcription unit has not been altered by the lab-pb split in
the molecular structure of lab, this gene was cloned and D. buzzatii and the exact breakpoint must be located at least
sequenced in D. buzzatii and partially in D. virilis. The gene 8 kb upstream from the lab transcription start point. In
lab of D. melanogaster (Dm lab) has three exons and two contrast, Db lab is 32% larger than Dm lab, mostly because
introns, intron 1 being rather long (table 2 and fig. 3). of changes in noncoding regions. The total length of the
Cloning of lab in D. buzzatii (Db lab) was carried out by CDS is about 4% larger (1,968 bp versus 1,890 bp),
screening a lambda library of D. buzzatii genomic DNA whereas intron 1 is ;5 kb longer and intron 2 and the 59
with two probes corresponding to the two distantly located UTR are more than twice as large in D. buzzatii (table 2). In
exon 1 and exon 2–3 regions (see Materials and Methods). general, the D. virilis gene is more like that of D. buzzatii
Three positive phages coming from these two regions were than that of D. melanogaster (table 2), as expected from
subcloned and partially sequenced (fig. 3): kj-19/21, their phylogenetic relationships (fig. 1). Interestingly, the
 Evolution of the Drosophila Hox gene labial 2047

FIG. 3.—Restriction map and molecular organization of the lab region in D. buzzatii. The lines underneath the map represent lambda clones studied
during gene cloning and fragments obtained by PCR amplification. Thick segments of lambda clones represent sequenced regions. The structure of lab
is shown above the map, for both D. buzzatii and D. melanogaster. The arrow indicates the start point and direction of transcription, black boxes
represent coding regions, and empty boxes show untranslated regions (UTRs). Gray boxes represent transposable elements found in D. buzzatii; none
has been described in this region in D. melanogaster. Restriction sites: B, BamHI; E, EcoRI; H, HindIII; P, PstI; S, SalI; X, XbaI.

lab structure differs widely between Drosophila and The open reading frame and translation start site for
Tribolium castaneum (table 2). In the latter species, the Db lab were predicted by identification of consensus
CDS is 1,061 bp long with two exons only, and intron 1, the sequences and homology with Dm lab. To find the promoter
59 UTR, and the 39 UTR are also significantly shorter (Nie and transcription start sites, 1,308 bp of genomic DNA
et al. 2001). sequence from the 59 region of Db lab were aligned with
630 bp from the 59 region of Dm lab (X13104 X12834)
Expression of labial and Identification of Regulatory including the 59 UTR and 400 additional nucleotides
Sequences upstream (fig. 4). The most conserved region between the
two sequences corresponds to the transcription start site
To verify the predicted exon structure of Db lab, total
described for Dm lab (Mlodzik, Fjose, and Gehring 1988;
RNA from 0–12-h-old embryos was amplified by RT-PCR.
Diederich et al. 1989). In Db lab, we find in this conserved
Primers were designed on exon 1 and exon 3 (table 1 and
fig. 3), allowing us to examine both exon junctions at the region the sequence TCAGTC that fits well the proposed
same time. The amplified cDNA fragment had the expected consensus TCAþ1G/TTT/C of the initiator (Inr) of Drosophila
size of 570 bp, and its sequence confirmed precisely the genes, where Aþ1 is the transcription start site (Arkhipova
predicted exon-intron junctions. In certain D. melanogaster 1995). No other sequence similar to the Inr consensus was
lines, an alternative splicing of lab intron 1 that produces found in the 59 upstream region of Db lab. An additional
two mRNAs with 18 nucleotides of difference has been alignment including the 738-bp upstream sequence of Dv
described (Mlodzik, Fjose, and Gehring 1988). This lab and using the ClustalW algorithm (Thompson, Higgins,
alternative splicing is caused by a small duplication at the and Gibson 1994) with a gap extension penalty of 0.05
end of intron 1 that provides a new functional splice indicated also a high identity around both the transcription
acceptor site and gives rise to the longer form of the mRNA (Inr) and the translation (Met) start sites between the three
(FlyBase 2002). The analysis of the genomic and cDNA Drosophila species (fig. 4). There is a high homology
sequences of Db lab indicates that in D. buzzatii there is no between the Inr and positionþ32 in the three species (fig. 4),
alternative splicing and only the short form of mRNA is with the sequence CACG located between positions þ29
present. In D. virilis, the sequenced cDNA fragment also and þ32 being fully conserved. This agrees with the
corresponds to the short mRNA. To identify the end of the characterization of this sequence as the Downstream
39 UTR, polyadenylation signals were searched along the Promoter Element (DPE) in Dm lab (Kutach and Kadonaga
sequence 39 from the stop codon. Four possible polyA 2000). Because no TATA box was found upstream of the
signals were identified between 623 and 825 bp from the transcription start site, we conclude that Db lab and Dv lab
stop codon of Db lab. No conserved sequences were found present a TATA-less promoter with Downstream Promoter
between Dm lab and Db lab on the 39 UTR. Element (DPE), as does Dm lab and all other homeotic
2048 Negre et al.

FIG. 4.—Alignment of 59 UTR and upstream sequences of lab from D. buzzatii (Db), D. virilis (Dv) and D. melanogaster (Dm). Alignment was
performed with ClustalW and revised by hand. The primer used to amplify this region in D. virilis is indicated in lowercase. The Initiator (Inr),
downstream promoter element (DPE), and first codon of the protein (Met) are shown. Shaded regions show conservation of three nucleotides in
a window of four in at least two sequences.

genes described in Drosophila (Nie et al. 2001). Analysis of 82.8%, and a second segment 108 bp long in the 59 region
with the UTRscan software (Pesole and Liuni 1999) of the with 84.3% identity. In addition, downstream of this second
59 UTRs of the three Drosophila species identified internal conserved segment there is a ;750-bp region with 50%–
ribosome entry site (IRES) elements in all of them. These 75% identity. A Blast search with those conserved
IRES elements promote cap-independent translation in sequences from D. buzzatii shows similarity only with the
different genes (Hellen and Sarnow 2001). In the Hox genes same sequence in D. melanogaster.
Ubx and Antp, they regulate translation during development We have compared the position of those noncoding
(Ye et al. 1997). conserved sequences with the regulatory elements de-
Given the time elapsed since the separation of the scribed for Dm lab (Chouinard and Kaufman 1991). The
Sophophora and Drosophila subgenera (40–60 Myr), no conserved regions upstream of lab are inside the 2.4-kb
significant nucleotide identity should be expected in fragment that promotes the initiation of procephalon
noncoding regions in the absence of selective pressure to expression. The small fragment with 50%–65 % identity
conserve the function (O’Neil and Belote 1992). Thus, located 4,800 bp upstream of Db lab corresponds to the 1.2-
conserved structures may be interpreted as functionally kb Dm lab fragment that drives expression in the anterior
important for gene expression. The entire sequence for midgut via a decapentaplegic (DPP)-regulated enhancer
Db lab (12,069 bp; fig. 3) was aligned with Dm lab (lab550 – Marty et al. 2001). Finally, the 180-bp conserved
(NG_000062) with the AVID algorithm and visualized with segment at the end of intron 1 corresponds to a fragment not
the VISTA software (Mayor et al. 2000; Dubchak et al. tested by Chouinard and Kaufman (1991), which might
2000). The resulting graph (fig. 5) highlights those contain the regulatory element required for embryonic
segments with a nucleotide identity .50% between Db peripheral nervous system (PNS) expression.
lab and Dm lab. Conserved regions both in coding and
noncoding sequences are shown relative to their position in
Nucleotide Sequence Comparisons
Db lab. There is a high variability in conservation along the
coding sequence. Several peaks of conserved sequence The coding sequences of Db lab and Dv lab were
appear along exon 1, which could be a consequence of the aligned and compared to that of Dm lab (NM_057265).
folding pattern of the protein. Two peaks of conserved Table 3 shows the number of synonymous and non-
sequence at the end of exon 2 and the beginning of exon 3 synonymous substitutions per site (dS and dN) for pairwise
correspond to the homeobox. In the noncoding regions, two comparisons between the three Drosophila species. These
prominent peaks of conserved sequence show up, one numbers have been estimated using maximum likelihood
segment 180-bp long at the end of intron 1 with an identity methods (Yang and Bielawski 2000; Yang and Swanson
 Evolution of the Drosophila Hox gene labial 2049

FIG. 5.—VISTA plot showing similarity between the nucleotide sequences of the lab gene of D. melanogaster and D. buzzatii. Conserved regions
are shown relative to their position in Db lab (horizontal axis), and their percent identities (50%–100%) are indicated on the vertical axes. The location
of coding exons (black rectangles) and 59 and 39 UTRs (empty rectangles) are shown above the profile, where the thin arrow indicates the direction of
transcription and gray boxes represent transposable elements. Peaks with an identity of at least 70% over 100 bp are shaded.

2002) for the entire coding sequence (CDS) as well as for complex. Likewise, the x ratio is not different in the
three separate (non-overlapping) regions: exon 1, exon 2 þ phylogenetic branch leading to D. buzzatii than in the rest of
3 (excluding the homeobox) and the homeobox. The ratio Drosophila, and there is no evidence that positive selection
between the number of nonsynonymous and synonymous or relaxation of selection has occurred after the relocation of
substitutions (x ¼ dN/dS) provides information on the type lab by the lab-pb split.
of selection acting on amino acid sequences. The low Finally, we tested for differences among the three
average x values for the entire gene (0.0696–0.0910) separate coding regions, fitting a series of fixed-sites models
suggest a relatively high degree of functional constraint, but as described by Yang and Swanson (2002). A detailed list
there is wide variation among regions (see below). of the models and their results is given in table 5. We were
To investigate if the molecular evolution of lab had particularly interested in the among-region variation in x
been affected by the lab-pb split in the D. repleta species ratio. To test the hypothesis of no variation, model D (which
group, three hypotheses related to the molecular evolution assumes different rs, j, and x) was compared with model B
of lab were tested by comparing the likelihood of different (which assumes different rs). The log-likelihood difference,
models. First, we tested the constancy of the evolutionary 2(lD
lB)¼71.65, is highly significant (df¼19
15¼4; P ,
rates by comparing the base model (which assumes 0.001) indicating differences either in the transition/trans-
a molecular clock and a single x ratio for all lineages) version ratio j or the ratio x. A modified D model
with a model assuming no clock. The results were (designated D9) with a fixed j value was compared to model
nonsignificant for the entire CDS and the three separate B, and the resulting log-likelihood difference, 2(lD9
lB) ¼
coding regions (table 4). Second, we tested for variation in 64.36, showed that the variation in x ratio was indeed
the x ratio among lineages by comparing the base ‘‘one significant (df ¼ 16
15 ¼ 1; P , 0.001). Similar tests can be
ratio’’ model with a ‘‘free-ratio’’ model, involving as many conducted comparing model E (which assumes different rs,
x ratios as branches in the tree (four). The results again were j and x, and ps) with model C (which assumes different rs
nonsignificant both for the entire CDS and for the three and ps). The difference in log-likelihood, 2(lE
lC)¼85.06,
separate coding regions (table 4). Therefore, the evolution- is highly significant (df ¼ 37
33 ¼ 4; P , 0.001), indicating
ary rate of lab has not accelerated or decelerated again significant differences either in the transition/trans-
significantly after its separation from the anterior Hox gene version ratio j or the ratio x. If a modified E model

Table 3
Maximum Likelihood Estimates of the Number of Synonymous (dS) and Nonsynonymous (dN) Substitutions per Site in
the Coding Regions of the Gene labial for Pairwise Comparisons Between D. buzzatii, D. virilis, and D. melanogaster
Comparison Regiona Codons t j S dS N dN x
D. buzzatii-D. virilis CDS 545 0.7982 1.9050 424.2 0.8140 1,210.8 0.0741 0.0910
Exon 1 413 0.9009 1.7786 340.3 0.9053 898.7 0.0712 0.0786
Exon 2 þ 3 78 0.7204 2.7602 56.9 0.4878 177.1 0.1605 0.3289
homeobox 54 0.7578 0.4796 20.7 1.9608 141.3 0.0020 0.0010
D. buzzatii-D. melanogaster CDS 595 2.4155 1.5918 419.3 2.6722 1,365.7 0.2318 0.0868
Exon 1 395 3.0631 1.4996 286.7 3.4913 898.3 0.2325 0.0666
Exon 2 þ 3 140 2.0560 1.9818 111.7 1.4648 308.3 0.4028 0.2750
homeobox 60 0.8506 1.1505 23.3 2.1726 156.7 0.0022 0.0010
D. virilis-D. melanogaster CDS 525 2.5782 1.4040 345.4 3.1407 1,229.6 0.2186 0.0696
Exon 1 395 3.6802 1.2985 274.2 4.4807 910.8 0.2470 0.0551
Exon 2 þ 3 76 1.7824 1.8819 49.9 1.5643 178.1 0.3223 0.2061
homeobox 54 1.7454 4.8507 34.7 2.7077 127.3 0.0027 0.0010
NOTE.—t: branch length; j: transition/transversion rate ratio; S: number of synonymous sites; N: number of nonsynonymous sites; x: dN/dS ratio.
a
Exon 2 þ 3 does not include homeobox.
2050 Negre et al.

Table 4 the Drosophila Labial proteins (629–655 aa) compared to

Likelihood Ratio Tests of Variation in the Rate of those of T. castaneum (353 aa) or H. sapiens (335 aa).
Molecular Evolution and the x Ratio of the Gene labial in Whereas Labial has almost duplicated its size in Drosophila
the Genus Drosophila in relation to the other species, other Hox genes do not show
Difference in Log-Likelihood from Base Modelb this variation. For example, the gene abd-A presents
Number No Clock Lineage-specific x Ratio in a similar size in T. castaneum and D. melanogaster (Shippy,
Regiona of Codons (df ¼ 1) x ratio (df ¼ 3) Base Model Brown, and Denell 1998) and it is only slightly smaller in A.
CDS 695 0.98 2.43 0.0971 gambiae (Devenport, Blass, and Eggleston 2000).
Exon 1 449 3.66 3.55 0.0766 The most conserved region between all Labial proteins
Exon 2 þ 3 186 1.19 3.17 0.3374 is the 65-aa homeodomain, located at the C-terminal region,
Homeobox 60 0.28 0 0.0001 with an identity between 83% and 100%. Outside the
a
Exon 2 þ 3 does not include homeobox. homeodomain there are some other conserved regions. The
b
Base model assumes a molecular clock and a single x ratio for all lineages. YKWM motif, a variant of the core of the hexapeptide
motif, YPWM, involved in the interaction with the cofactor
EXD (Gehring, Affolter, and Bürglin 1993; Rauskolb and
(designated E9) with a fixed j value is compared to model
Wieschaus 1994, Johnson, Parker, and Krasnow 1995),
C, then the likelihood difference, 2(lE9
lC) ¼ 81.03, also
presents an identity between 60% and 100% through 15 aa.
provides evidence for significant variation in x ratio among
There is also a short region around the YTNLD motif with
the three coding regions (df ¼ 34
33 ¼ 1; P , 0.001). The
an identity between 44% and 100%. Finally the N-terminal
homeobox, which is fully conserved between the three
region presents between 50% and 100% identity. The
Drosophila species, shows the lowest x ratio, which implies
conservation of these amino acid sequences across long
a strong constraint. The portion of exons 2–3 after
phylogenetic distances suggests that they suffer functional
excluding the homeobox shows the highest x ratio (around
constraints and are probably involved in highly conserved
0.3 depending on the model; table 5), which indicates
interactions, such as the YKWM domain (Johnson, Parker,
a substantially lower constraint. Finally, the x ratio is
and Krasnow 1995). These results are fully consistent with
intermediate in exon 1 (around 0.08 depending on the
the previous nucleotide comparison between Drosophila
model; table 5).
species. The homeodomain is the most conserved region of
the protein and shows a high level of nucleotide sequence
Amino Acid Sequence Comparisons
evolution constraint, whereas all other conserved domains
Seven different proteins encoded by lab orthologous are located in exon 1, which is more constrained than exons
genes were aligned with the ClustalW algorithm (fig. 6). 2 and 3 (excluding the homeobox).
These include the complete Labial sequences from D. Outside those conserved domains there is a very low
buzzatii (present work), D. melanogaster (Mlodzik, Fjose, conservation, which is surprising when compared with other
and Gehring 1988; Diederich et al. 1989), T. castaneum (Nie proteins. The Labial proteins from D. buzzatii and D.
et al. 2001), and HoxA1 gene from Homo sapiens (Hong melanogaster have an overall identity of only 62.8%, much
et al. 1995) and partial Labial sequences from D. virilis lower than the 95% identity found by Hooper et al. (1992)
(present work), Anopheles gambiae (Powers et al. 2000) and between the Antp proteins from D. virilis and D.
Thermobia domestica (Peterson et al. 1999). Complete melanogaster (with the same divergence time). There are
sequences were aligned with default parameters. To avoid very few direct comparisons of homologous genes between
artifacts, partial sequences were aligned one by one with D. D. melanogaster and D. buzzatii, but D. melanogaster and
buzzatii increasing gap extension penalty and included in D. virilis homologous proteins usually have an identity
the global alignment afterwards. The most intriguing between 80% and 90%, with values ranging from 36% to
observation in this comparison is the much larger size of 97% (O’Neil and Belote 1992). Interestingly, all regions

Table 5
Log-Likelihood Values and Parameter Estimates Under Fixed-Sites Models
Model p l r2 r3 j x
A (homogeneous model) 13
5147.69 1 1 1.6552 0.0971
B (different rs) 15
5125.17 1.569 0.387 1.6433 0.0862
C (different rs and ps) 33
5087.45 1.398 0.277 1.6547 0.0813
D (different rs, j, and x) 19
5089.34 0.942 0.983 j1 ¼ 1.4036; j2 ¼ 0.0853; x1 ¼ 0.2857; x2 ¼ 0.7401;
j3 ¼ 2.5631 x3 ¼ 0.0001
D9 (j fixed to 1.643) 16
5092.99 0.888 0.966 j ¼ 1.643 x1 ¼ 0.0883; x2 ¼ 0.2718;
x3 ¼ 0.0001
E (different rs, j and (x), 37
5044.93 0.726 0.613 j1 ¼ 1.4864; j2 ¼ 0.0809; x1 ¼ 0.3255; x2 ¼ 1.1217;
and ps) j3 ¼ 2.3396 x3 ¼ 0.0001
E9 (j fixed to 1.655) 34
5046.94 0.703 0.670 j ¼ 1.655 x1 ¼ 0.0824; x2 ¼ 0.3107;
x3 ¼ 0.0001
F (separate analysis) 39
5042.39 j1 ¼ 1.4978; j2 ¼ 2.3044; x1 ¼ 0.0766; x2 ¼ 0.3374;
j3 ¼ 1.0623 x3 ¼ 0.0001
NOTE.—p: number of parameters of the model; l: log-likelihood value; r2 and r3: relative branch lengths.
 Evolution of the Drosophila Hox gene labial 2051

FIG. 6.—Multiple alignment of proteins coded by lab orthologs from different organisms. D. buzzatii (Db) and D. virilis (Dv) from present work.
GenBank accession numbers: D. melanogaster (Dm, CAB57787), A. gambiae (Ag, AAF91398.1 and AAAB01008961), Tribolium castaneum (Tc,
AAF64147.1 and AAF64148.1), Thermobia domestica (Td, AAD50360.1), Homo sapiens HoxA1 (HsHoxA1, NP_005513.1). Dv, Ag, and Td are
partial sequences. Amino acids in lowercase correspond to degenerate primers. Alignments were performed with ClustalW with default parameters,
except for Ag and Td, which have been aligned individually with Db, increasing the gap extension penalty and included in the global alignment
2052 Negre et al.

conserved between Db lab and Dm lab are also more or less melanogaster revealed by sequence analysis. Genetics
conserved in all other sequences studied, including the 139:1359–1369.
human gene HoxA1. The domain conservation suggests that Cáceres, M., M. Puig, and A. Ruiz. 2001. Molecular character-
the protein functionality relies basically on a few domains, ization of two natural hotspots in the Drosophila buzzatii
leaving the rest of the sequence with more freedom to genome induced by transposon insertions. Genome Res.
11:1353–1364.
change. This fact could explain why minigenes carrying the
Chouinard, S., and T. C. Kaufman. 1991. Control of expression
chicken Hoxb1 gene are able to rescue null mutants for the of the homeotic labial (lab) locus of Drosophila melanogas-
lab gene in D. melanogaster (Lutz et al. 1996). Thus, Labial ter: evidence for positive and negative autogenous regulation.
proteins seem to be built on highly conserved blocks joined Development 113:1267–1280.
by rapidly evolving sequences. For example, the spacer or Cook, C. E., M. L. Smith, M. J. Telford, A. Bastianello, and M.
‘‘gene specific region’’ (Peterson et al. 1999) localized Akam. 2001. Hox genes and the phylogeny of arthropods.
between the YKWM motif and the homeodomain is much Curr. Biol. 11:759–763.
more variable, both in sequence and in length, in the lab gene DeRosa, R., J. K. Grenier, T. Andreeva, C. E. Cook, A. Adoutte,
than in other Hox genes even between Drosophila species. M. Akam, S. B. Carroll, and G. Balavoine. 1999. Hox genes
in brachiopods and priapulids and protostome evolution.
Nature 399:772–776.
Concluding Remarks Devenport, M. P., C. Blass, and P. Eggleston. 2000. Character-
Although Hox gene colinearity and cluster conserva- ization of the Hox gene cluster i the malaria vector mosquito,
tion represents a paradigm in Evo-Devo, in the genus Anopheles gambiae. Evol. Dev. 2:326–339.
Drosophila the Hox cluster has been split at least three Diederich, R. J., V. K. L. Merrill, M. A. Pultz, and T. C.
Kaufman. 1989. Isolation, structure, and expresion of labial
times. The lab-pb split described here is the most recent
a homeotic gene of the Antennapedia Complex involved in
example. Even after moving to a new location, labial Drosophila head development. Genes Dev. 3:399–414.
appears to evolve consistently, showing no alteration of its Dubchak, I., M. Brudno, G. G. Loots, L. S. Pachter, C. Mayor,
molecular evolutionary patterns. A paracentric inversion as E. M. Rubin, and K. A. Frazer. 2000. Active conservation of
well as a gene transposition event might, in principle, noncoding sequences revealed by three-way species compar-
account for the lab-pb disruption and the relocation of lab isons. Genome Res. 10:1304–1306.
near the genes abd-A and Abd-B observed in the repleta Duboule, D., and G. Morata. 1994. Colinearity and functional
group of Drosophila. However, the former possibility hierarchy among genes of the homeotic complexes. Trends
seems more likely given the extensive reorganization of the Genet. 10:358–364.
Drosophila genome produced by chromosomal inversions Duncan, I. 1987. The Bithorax complex. Annu. Rev. Genet.
(Powell 1997; Ranz, Casals, and Ruiz 2001). The molecular 21:285–319.
characterization of the chromosomal regions 59 of lab and Finnerty, J. R., and M. Q. Martindale. 1998. The evolution of the
Hox cluster: insights from outgroups. Curr. Opin. Genet. Dev.
39 of pb in D. buzzatii should help to determine which was
8:681–687.
the molecular mechanism that caused such a split and the FlyBase 2002. The FlyBase database of the Drosophila genome
precise location of the breakpoint between lab and pb. This projects and community literature. Nucleic Acids Res.
study would also elucidate the exact physical relationship, 30:106–108. (http//flybase.bio.indiana.edu/)
if any, between lab and the genes abd-A and Abd-B. Gehring, W. J., M. Affolter, and T. Bürglin. 1993. Homeodomain
Furthermore, although the rearrangement has not altered the proteins. Annu. Rev. Biochem. 63:487–526.
lab coding region, and although some of its regulatory Gehring, W. J., and Y. Hiromi. 1986. Homeotic genes and the
sequences seem to be in place, whether the relocation of lab homeobox. Annu. Rev. Genet. 20:147–173.
had any consequences upon the level or spatiotemporal Gubenko, I. S., and M. B. Evgen’ev. 1984. Cytological and
pattern of expression of this gene remains an open question, linkage maps of Drosophila virilis chromosomes. Genetics
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Hartl, D. L., and E. R. Lozovskaya. 1994. Genome evolution:
between the nucleosome and the chromosome. Pp 579–592 in
Acknowledgments B. Schierwater, B. Streit, G. P. Wagner, and R. DeSalle, eds.
We thank S. Celniker, J. E. Hooper, and E. Sánchez- Molecular ecology and evolution: approaches and applica-
tions, Birkhauser Verlag, Basel.
Herrero for probes; the National Drosophila Species
Hazelrigg, T., and T. C. Kaufman. 1982. Revertants of dominant
Resource Center (Bowling Green, Ohio, USA) for fly mutations associated with the Antennapedia gene complex of
strains; and J. González and E. Betrán for advice and helpful Drosophila melanogaster: cytology and genetics. Genetics
comments on the manuscript. This work was supported by 105:581–600.
grant PB98-0900-C02-01 from the Dirección General de Hellen, C. U. T., and P. Sarnow. 2001. Internal ribosome entry
Enseñanza Superior e Investigación Cientı́fica (MEC, sites in eukaryotic mRNA molecules. Genes Dev. 15:1593–
Spain) awarded to A.R. and by a doctoral FI/DGR fellow- 1612.
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RESULTADOS

64
 RESULTADOS

2.2. Artículo 2
Este segundo trabajo va dirigido a resolver dos cuestiones. La primera se centra
en deteminar de forma precisa los puntos en los que se rompió el complejo de genes
Hox y el mecanismo que produjo las roturas, y la segunda en determinar si estas roturas
han tenido algún efecto funcional sobre los genes Hox adyacentes a ellas.
Primero, hemos secuenciado dos regiones del genoma de D. buzzatii. Una
contiene los genes lab y abdA y la otra incluye el gen pb, con un total de 257 kb. Se han
anotado los genes presentes en estas regiones y se ha comparado su organización con la
de D. melanogaster y D. pseudoobscura para localizar con precisión los puntos de
rotura. Se ha observado la presencia de bloques conservados en la secuencia no
codificante y se ha comparado con las regiones reguladoras conocidas. Las roturas se
han producido respetando los genes completos, es decir, la unidad de transcripción más
sus regiones cis-reguladoras. La posición de las roturas se ha reducido hasta un margen
de unas 3 kb. Todo indica que el mecanismo que produjo las roturas són la inversiones
paracéntricas.
La elevada presencia de bloques conservados en la secuencia no codificante y la
conservación de las regiones reguladoras apuntan a que los patrones de expresión de
estos genes deberían estar conservados. No parece haber habido pérdida de regiones
reguladoras con las roturas, pero se podrían haber adquirido nuevas secuencias que
modificaran el patrón de expresión. Para contrastar esta posibilidad, se ha analizado la
expresión de los tres genes Hox, lab, pb y abdA, en embriones y discos imaginales de
cuatro especies de Drosophila portadoras de diferentes organizaciones del complejo.
Los resultados muestran que las roturas del HOM-C no han alterado los patrones de
expresión de los genes Hox adyacentes a ellas. Concluímos que, en Drosophila, la
agrupación de los genes Hox no es imprescindible para su correcto funcionamiento.
Mas bién la organización de los genes Hox parece ser modular y su agrupación
genómica el resultado de la inercia evolutiva.

NEGRE B., S. CASILLAS, M. SUZANNE, E. SÁNCHEZ-HERRERO, M. AKAM, A.

BARBADILLA, M. NEFEDOV, P. DE JONG y A. RUIZ (2005) Conservation of regulatory
sequences and gene expression patterns in the disintegrating Drosophila Hox gene
complex. Genome Research 15: 692-700.

65
RESULTADOS

66
Letter

Conservation of regulatory sequences and gene

expression patterns in the disintegrating Drosophila
Hox gene complex
Bárbara Negre,1 Sònia Casillas,1 Magali Suzanne,2 Ernesto Sánchez-Herrero,2
Michael Akam,3 Michael Nefedov,4 Antonio Barbadilla,1 Pieter de Jong,4
Alfredo Ruiz1,5
1
Departament de Genètica i de Microbiologia, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra, Barcelona, Spain; 2Centro
de Biologı́a Molecular “Severo Ochoa”, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid, 28049 Cantoblanco, Madrid,
Spain; 3Department of Zoology, University of Cambridge, Downing Street, Cambridge CB2 3EJ, United Kingdom; 4Children’s
Hospital Oakland Research Institute, Oakland 94609, California, USA

Homeotic (Hox) genes are usually clustered and arranged in the same order as they are expressed along the
anteroposterior body axis of metazoans. The mechanistic explanation for this colinearity has been elusive, and it may
well be that a single and universal cause does not exist. The Hox-gene complex (HOM-C) has been rearranged
differently in several Drosophila species, producing a striking diversity of Hox gene organizations. We investigated the
genomic and functional consequences of the two HOM-C splits present in Drosophila buzzatii. Firstly, we sequenced two
regions of the D. buzzatii genome, one containing the genes labial and abdominal A, and another one including
proboscipedia, and compared their organization with that of D. melanogaster and D. pseudoobscura in order to map
precisely the two splits. Then, a plethora of conserved noncoding sequences, which are putative enhancers, were
identified around the three Hox genes closer to the splits. The position and order of these enhancers are conserved,
with minor exceptions, between the three Drosophila species. Finally, we analyzed the expression patterns of the same
three genes in embryos and imaginal discs of four Drosophila species with different Hox-gene organizations. The results
show that their expression patterns are conserved despite the HOM-C splits. We conclude that, in Drosophila, Hox-gene
clustering is not an absolute requirement for proper function. Rather, the organization of Hox genes is modular, and
their clustering seems the result of phylogenetic inertia more than functional necessity.
[Supplemental material is available online at www.genome.org. The sequence data from this study have been
submitted to GenBank under accession nos. AY900631–AY900632 and AY897430–AY897434.]

Homeotic (Hox) genes were discovered in Drosophila melanogaster cestral HOM-C of arthropods (Cook et al. 2001; Hughes and Kauf-
as mutations that transform one body part into another. Lewis man 2002; Hughes et al. 2004). In winged insects, including Dro-
(1978) and Kaufman et al. (1980) found that these genes are sophila, the genes Hox3 and fushi tarazu (ftz) lost their homeotic
clustered and arranged in the chromosome in the same order as function, and thus, only eight truly homeotic genes remain.
their domains of action in the body of flies. Homologous Hox Three different splits of the ancestral HOM-C have been found so
genes were subsequently found in many other animals and their far in the Drosophila genus (Fig. 1A). In D. melanogaster, the com-
arrangement in complexes (HOM-C) shown to be the general plex is split between the genes Antennapedia (Antp) and Ultrabi-
rule (McGinnis and Krumlauf 1992; Ruddle et al. 1994). Hox thorax (Ubx), leaving two separate gene clusters as follows: the
genes encode transcription factors involved in the determination Antennapedia complex, ANT-C (Kaufman et al. 1990) that speci-
of segment identity along the anteroposterior body axis, and fies the identity of the mouth parts and anterior thorax, and the
thus, play a fundamental role in animal development. The con- Bithorax complex, BX-C (Duncan 1987; Martin et al. 1995) in-
served colinearity between Hox gene chromosomal arrangement volved in the development of the posterior thorax and abdomen.
and expression domain is a basic notion of developmental biol- In D. pseudoobscura, the HOM-C is also similarly divided in the
ogy, yet this is an enigmatic phenomenon for which no single ANT-C and BX-C complexes (Lewis et al. 2003). A different split
satisfactory explanation exists (Kmita and Duboule 2003). Fur- between Ubx and abdominal A (abdA) occurs in D. virilis (Von
thermore, HOM-C splits have been observed in Drosophila (Von Allmen et al. 1996), D. repleta (Ranz et al. 2001), D. buzzatii, and
Allmen et al. 1996; Lewis et al. 2003; Negre et al. 2003), Bombyx other species of the Drosophila subgenus (Negre et al. 2003; Fig.
(Yasukochi et al. 2004), nematodes (Aboobaker and Blaxter 1B). Finally, an additional split, between labial (lab) and probosci-
2003), and tunicates (Ikuta et al. 2004; Seo et al. 2004). pedia (pb), is present in D. buzzatii and other species of the repleta
Ten genes arranged in a single complex comprised the an- group (Negre et al. 2003). This third split separated the gene lab
far from pb and the anterior genes of the Hox complex and relo-
5
Corresponding author. cated it near the posterior genes abdA and Abdominal B (AbdB) in
E-mail [email protected]; fax 0034-93-581-23-87.
Article and publication are at http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/ a flagrant violation of the colinearity rule. The functional conse-
gr.3468605. quences of these splits are unknown.

692 Genome Research 15:692–700 ©2005 by Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISSN 1088-9051/05; www.genome.org
www.genome.org
 Drosophila Hox gene complex splits

Results
Molecular characterization of Hox-gene complex breakpoints
To characterize the two HOM-C splits present in D. buzzatii,
we isolated and sequenced two BAC clones, one (5H14, 124,024
bp) containing the lab-abdA region, and another (40C11,
132,938 bp) including the pb region (see Methods). The organi-
zation of the two regions of D. buzzatii chromosome 2 is shown
in Figure 2 along with the homologous regions of D. melanogaster
and D. pseudoobscura for comparison. D. melanogaster and D.
pseudoobscura are homosequential in the analyzed regions,
except where indicated. The sequenced pb region (Fig. 2A)
contains 16 ORFs including Dbuz\pb, Dbuz\zerknüllt
(Dbuz\zen), Dbuz\zerknüllt-related (Dbuz\zen2), and
Dbuz\bicoid (Dbuz\bcd). These four genes are present in the
ANT-C of D. melanogaster and also in the homologous region of
D. pseudoobscura (Fig. 2B,C). The orientation of Dbuz\zen2 is
Figure 1. Genomic (A) and phylogenetic (B) localization of the three
Hox gene complex splits observed in the Drosophila genus. (A) Ancestral the same as that of Dpse\zen2, but inverted with regard to
arrangement of the eight Hox genes within the insects is as follows: labial Dmel\zen2. The remaining 12 genes in this region are ortholo-
(lab), proboscipedia (pb), Deformed (Dfd), Sex combs reduced (Scr), Anten- gous to D. melanogaster genes from four different regions (84D1–
napedia (Antp), Ultrabithorax (Ubx), abdominal A (abdA), and Abdominal B 2, 89D2, 84E5, and 91D4–5) of chromosomal arm 3R. One of the
(AbdB). (B) Phylogenetic relationships and divergence times for the five
Drosophila species included in this study. D. melanogaster and D. pseudo- genes, CG14609, is represented by six copies, in contrast to the
obscura belong to the Sophophora subgenus. D. repleta and D. buzzatii single copy present in D. melanogaster or D. pseudoobscura. A
(both in the repleta species group) and D. virilis (virilis species group) total of four breakpoints are fixed in this region between D. buz-
belong to the Drosophila subgenus (see Negre et al. 2003 for details). zatii and D. melanogaster beside the zen2 microrearrangement.
That corresponding to the lab-pb split is located in the ∼3-kb
intergenic segment between Dbuz\pb and Dbuz\CG17836
In order to ascertain the consequences of Drosophila HOM-C (Fig. 2A).
splits, we have carried out a genomic and functional character- The sequenced lab-abdA region contains 11 ORFs, including
ization of the two splits present in D. buzzatii. We isolated and Dbuz\lab, the cuticular cluster genes (Dbuz\Ccp), and Dbuz\abdA
sequenced two BAC clones containing
the lab-abdA and pb chromosomal re-
gions of D. buzzatii. The gene organiza-
tion in these regions is compared with
that of the homologous regions in D.
melanogaster and D. pseudoobscura to
map the precise site of the two splits.
None of the two splits has altered the
coding regions of Hox genes. We then
searched for Conserved Noncoding Se-
quences (CNS), which are putative regu-
latory sequences, around the genes lab,
pb, and abdA, to find out whether the
splits removed or altered any Hox-gene
enhancer. The position of CNS around
Hox genes is compared with experimen-
tally identified Hox-gene enhancers, and
the arrangement of CNS is compared
between Hox and non-Hox genes. Fi-
nally, we analyzed the expression pat-
terns of three Hox genes, lab, pb, and
abdA, in four Drosophila species with dif- Figure 2. Gene organization of the lab-abdA and pb genomic regions of D. buzzatii compared with
ferent Hox-gene organizations (with and the homologous regions of D. melanogaster and D. pseudoobscura. The localization of the lab-pb split
without the splits) in whole-mount em- (arrow) and the Ubx-abdA split (large arrowhead) are indicated. (A) Sequence of D. buzzatii BAC 40C11
containing the pb region. (B) Organization of the lab-pb region in D. melanogaster. (C) Idem in D.
bryos and imaginal discs. The results
pseudoobscura. (D) Sequence of D. buzzatii BAC 5H14 containing the lab-abdA region. (E) Organization
show that, in Drosophila species, Hox of the abdA region in D. melanogaster and D. pseudoobscura. Genes are represented as open (UTRs) and
genes, as well as their regulatory regions filled boxes (coding sequences) with arrows indicating the sense of transcription. Hox genes are colored
and expression patterns, are conserved, in dark blue, Hox-derived genes in light blue, non-Hox genes in red, noncoding RNA genes in orange,
despite the Hox complex breaks. Thus, and the BcDNA:LP03188 and orthologous sequences in green. Transposable element insertions (usu-
ally ISBu elements, see Negre et al. 2003) are shown as yellow boxes. Large shaded rectangles include
the functional significance of the Hox- homologous Hox-gene regions in different species. Ochre triangles denote small inversions and inser-
gene clustering in Drosophila is question- tions or deletions. Small arrowheads show breakpoints between D. buzzatii and D. melanogaster in
able. non-Hox regions.

Genome Research 693

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Negre et al.

(Fig. 2D). The number of Ccp copies (including the gene Edg) is Conserved noncoding sequences in Hox gene regions
eight in the three species, but there is a small inversion encom-
passing two copies (plus the cDNA BcDNA:LP03188) in D. mela- We analyzed the conservation of noncoding sequences around
nogaster in comparison to D. buzzatii or D. pseudoobscura, as well the three Hox genes lab, pb, and abdA by comparing the se-
as one gain and one loss (Fig. 2B–D). These 11 genes come from quences of the three species D. buzzatii, D. melanogaster, and D.
three different regions (84A2–5, 86E11–13, and 89E2) of D. me- pseudoobscura as done previously by other authors (Bergman and
lanogaster chromosomal arm 3R, which means two fixed break- Kreitman 2001; Bergman et al. 2002) (see Methods). Figure 3
points between D. buzzatii and D. melanogaster, beside the small shows the VISTA graph, where the conservation between the
inversion of Ccp genes. One breakpoint corresponds to the lab-pb aligned sequences is plotted (when higher than 50%) and the
split and is found ∼40 kb upstream of Dbuz\lab, in the 5-kb regions that meet the selected criteria (75% identity in a 25-bp
between the sequence similar to BcDNA:LP03188 and the gene window) are highlighted for both coding and noncoding se-
Dbuz\CG31363. The second breakpoint is that of the Ubx-abdA quences. A preliminary analysis showed no differences between
split and is located between 11 and 15 kb downstream of intergenic and intronic regions, in agreement with previous stud-
Dbuz\abdA. The two breakpoints are separated by a DNA seg- ies (Bergman and Kreitman 2001). Thus, CNS are defined as in-
ment of only ∼22 kb encoding a single gene, Dbuz\CG31363 tergenic (excluding UTRs) or intronic sequences that meet the
(Fig. 2D). above criteria. The characteristics of observed CNS are given in

Figure 3. Nucleotide sequence conservation in the lab-abdA and pb regions between Drosophila species. The three panels in each VISTA plot represent
pairwise comparisons between D. melanogaster and D. pseudoobscura (mel/pse), D. melanogaster and D. buzzatii (mel/buz) and D. pseudoobscura and D.
buzzatii (pse/buz). The x-axis represents D. melanogaster coordinates, and y-axis sequence identity (50%–100%). Gray arrows show the location and
orientation of genes. Conservation in exons and UTRs is shown in dark and light blue, respectively. Pink regions represent CNS. Experimentally identified
regulatory sequences (solid purple bars) or segments with negative results (empty bars) are indicated on top of each plot. Five microinversions detected
in the lab or pb regions are enclosed in blue frames, and the VISTA graphs generated with the inverted sequences shown to the right of the main plots.
VISTA plots for the CG17836-CG14290, CG31363, and CG1288-CG14609-CG2520 regions (adjacent to Hox genes) are shown at the bottom of the figure
for comparison.

694 Genome Research

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 Drosophila Hox gene complex splits

Tables 1 and 2, and the results of statistical analysis are shown in the CG31363 gene region, between lab and abdA, and the
Supplemental Tables S1 and S2. CG17836-CG14290 and CG1288-CG2520 regions, near pb (Fig.
When D. buzzatii is compared with D. melanogaster or D. 2). These regions include one, two, and three genes, respectively.
pseudoobscura, 395 and 440 CNS are found, respectively, around The pattern of CNS detected is shown in Figure 3 and summa-
the three Hox genes (Table 1). This gives a density of 4.5 and 5 rized in Table 2. In the comparisons with D. buzzatii, we found
CNS per kilobase, respectively. These conserved blocks show a around 100 CNS (∼2/kb), which represents <8% of noncoding
mean size of 44 bp with 86.5% nucleotide identity and represent sequence. Thus, in these non-Hox regions, a much smaller num-
20%–22% of the analyzed noncoding sequence. When D. mela- ber of CNS is observed and the proportion of sequence in CNS is
nogaster and D. pseudoobscura are compared, 563 CNS are de- also significantly lower than in Hox-gene regions (Supplemental
tected (6.5/kb) with a mean size of 55 bp and an average identity Table S1). In the D. melanogaster–D. pseudoobscura comparison,
of 87.4%. In this comparison, the sequence in CNS represents there are 326 CNS (5.7/kb) which represents a 23% of noncoding
36% of noncoding sequence. In all three comparisons, the three sequence. Thus, in this case, the density is similar between Hox
regions around the Hox genes lab, pb, and abdA are homogeneous and non-Hox-gene regions, but the size of CNS is significantly
with little variation either in CNS density, size, or nucleotide smaller in the latter regions (Supplemental Table S1). Conse-
identity (Supplemental Table S1). It is worth noting that CNS are quently, the proportion of sequence in CNS is also significantly
coincident in all three comparisons (Fig. 3), which means that all lower in the non-Hox-gene regions. It should be noted that non-
CNS detected when comparing D. buzzatii with either D. mela- Hox regions show a significant variation for CNS density and also
nogaster or D. pseudoobscura are also found in the comparison for the proportion of sequence in CNS that is not observed in
between the latter two species. Although most CNS keep colin- Hox-gene regions (Supplemental Table S1). The higher variation
earity (relative position and orientation), we could identify four observed between non-Hox regions is probably due to the het-
microinversions, around 1–2 kb in size. One is located within the erogeneity of the sample from a functional point of view. There
large intron of lab and the other three in introns 2 and 3 of pb is little information available on the function and expression
(Fig. 3). pattern of the six non-Hox genes analyzed, which probably rep-
D. buzzatii is equally distant phylogenetically from either D. resent a mixture of genes with different regulatory needs and
melanogaster or D. pseudoobscura (Fig. 1). The latter two species number of enhancers.
belong to the same subgenus and are phylogenetically closer. We
compared the characteristics of the CNS found in the three pair- Conservation of known regulatory sequences
wise comparisons. As expected, there are no statistical differences
Regulatory sequences of the genes lab, pb, and abdA have been
between the CNS found when comparing D. buzzatii with either
experimentally identified in D. melanogaster (Karch et al. 1985;
D. melanogaster or D. pseudoobscura (Supplemental Table S2). The
Chouinard and Kaufman 1991; Kapoun and Kaufman 1995; Mar-
CNS density and the proportion of sequence in CNS are signifi-
tin et al. 1995). We compared their position with the pattern of
cantly higher when comparing the phylogenetically closer spe-
CNS found around Hox genes. As shown in Figure 3, the regula-
cies D. melanogaster and D. pseudoobscura. Increasing divergence
tory sequences identified in D. melanogaster generally contain or
time does not seem to affect the nucleotide identity of the CNS,
correspond to CNS in D. buzzatii. For instance, CNS are found in
although the size of the CNS detected in the Hox-gene regions
the sites corresponding to the iab2 PRE and iab2(1.7) enhancers
shows a significant decrease (Supplemental Table S2).
of abdA (Shimell et al. 1994, 2000). Similarly, a prominent con-
servation peak is observed at the site of the lab550 enhancer,
Conserved noncoding sequences in non-Hox gene regions which directs the expression of lab in the embryo midgut (Marty
To find out whether the observed pattern of CNS is a particular et al. 2001). Also, the inverted segment found in the large intron
feature of Hox genes, we also analyzed the presence of CNS in of the lab gene roughly corresponds to the segment responsible
regions of the sequenced BACs adjacent, but unrelated, to Hox for lab expression in the posterior midgut. Sequence details of the
genes. We used the three microsyntenic regions between D. buz- lab550 and iab2(1.7) enhancer and binding site conservation are
zatii, D. melanogaster, and D. pseudoobscura longer than 10 kb, i.e., shown in Supplemental Figure S1. The Homeotic Response Ele-

Table 1. Characteristics of conserved noncoding sequences (CNS) detected with mVISTA in comparisons of Hox gene regions between
D. melanogaster (mel), D. pseudoobscura (pse), and D. buzzatii (buz)

Noncoding Species Number Mean size Mean nucleotide Sequence in

Region nucleotides pair of CNS Densitya (SD) (nt) (SD) identity (%) CNS (%)

lab 19,227 mel/pse 129 6.71 (0.59) 53.20 (34.03) 87.69 35.69
mel/buz 73 3.80 (0.44) 46.70 (24.35) 87.33 17.73
pse/buz 84 4.37 (0.48) 44.54 (27.05) 88.08 19.46
pb 42,056 mel/pse 265 6.30 (0.39) 55.04 (35.79) 87.29 34.68
mel/buz 196 4.66 (0.33) 41.88 (22.38) 87.09 19.52
pse/buz 215 5.11 (0.35) 42.92 (24.65) 86.38 21.94
abdA 26,043 mel/pse 169 6.49 (0.50) 59.29 (38.43) 87.44 38.45
mel/buz 126 4.84 (0.43) 45.98 (26.15) 86.18 22.25
pse/buz 141 5.41 (0.46) 46.11 (24.97) 85.44 24.97
Total 87,326 mel/pse 563 6.45 (0.27) 55.89 (36.23) 87.42 36.03
Hox gene regions mel/buz 395 4.52 (0.23) 44.08 (24.04) 86.83 19.94
pse/buz 440 5.04 (0.24) 44.25 (25.53) 86.39 22.30

a
Density = number of CNS per kilobase.

Genome Research 695

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Negre et al.

Table 2. Characteristics of conserved noncoding sequences (CNS) detected with mVISTA in comparisons of non-Hox gene regions
between D. melanogaster (mel), D. pseudoobscura (pse), and D. buzzatii (buz)

Noncoding Species Number Mean size Mean nucleotide Sequence in

Region nucleotides pair of CNS Densitya (SD) (nt) (SD) identity (%) CNS (%)

CG1288-CG2520 18,333 mel/pse 127 6.93 (0.61) 43.48 (28.16) 86.31 30.12
mel/buz 65 3.55 (0.44) 45.26 (31.51) 86.30 16.05
pse/buz 67 3.65 (0.45) 42.44 (29.40) 86.81 15.59
CG17836-CG14290 10,921 mel/pse 46 4.21 (0.62) 45.02 (33.27) 82.67 18.96
mel/buz 18 1.65 (0.39) 39.61 (22.67) 82.88 6.53
pse/buz 22 2.01 (0.43) 42.09 (24.34) 84.34 8.48
CG31363 27,510 mel/pse 153 5.56 (0.45) 35.51 (14.95) 87.17 19.75
mel/buz 22 0.80 (0.17) 26.09 (3.94) 82.93 2.09
pse/buz 23 0.84 (0.17) 28.78 (7.70) 83.23 2.41
Total 56,764 mel/pse 326 5.74 (0.32) 39.96 (24.15) 86.09 22.95
non-Hox gene regions mel/buz 105 1.84 (0.18) 40.28 (27.50) 85.27 7.45
pse/buz 112 1.97 (0.19) 39.59 (25.88) 85.76 7.83

a
Density = number of CNS per kilobase.

ment (HOMRE) of the lab550 enhancer contains four binding Hox gene expression patterns
sites; all of them are conserved in the three species. In the
iab2(1.7) enhancer, there are five Hunchback (HB)-binding sites, The conservation of regulatory sequences suggests that splits of
three of which are conserved in the three species, whereas the the HOM-C had no consequences on Hox-gene expression. To
other two vary in position between species. This enhancer also test this prediction, we compared the expression patterns of the
contains a unique Krüppel (KR)-binding site, where point muta- Hox genes lab, pb, and abdA between D. melanogaster, D. virilis, D.
tions in D. melanogaster cause gain-of-expression mutants (Hab1 buzzatii, and D. repleta. These four Drosophila species represent
and Hab2) (Shimell et al. 1994). This binding site is conserved in three different Hox-gene organizations (Figs. 1,2). D. melanogaster
all three species (Supplemental Fig. S1). The conservation be- possess the Antp-Ubx split only, whereas D. virilis has the Ubx-
tween D. melanogaster and D. buzzatii around abdA ends 9 kb (in abdA split instead. Both D. buzzatii and D. repleta present the
D. melanogaster) and 11 kb (in D. buzzatii) downstream of this Ubx-abdA and lab-pb splits. We used in situ hybridization and
gene (Fig. 3). This boundary lies between the iab2 and pbx regu- antibody staining to whole-mount embryos and to imaginal
latory sequences, which control the expression of abdA and Ubx, discs from third instar larvae and prepupae (see Methods). De-
respectively (Karch et al. 1985). We have shown that the iab2 tailed results are given in Figure 4 and Supplemental Figures S2–
region downstream of abdA is conserved in D. buzzatii. We have S6. The expression patterns of the four species closely follow
not sequenced the Ubx region in D. buzzatii, but we assume that those described for D. melanogaster (for review, see Hughes and
the pbx regulatory sequence will conserve its position upstream Kaufman 2002). Interspecific variation was detected only in the
of Ubx, i.e., there are no rearrangements between Ubx and its pb gene, which in D. virilis presents an extra domain in the em-
regulatory sequences (see below). bryo mesoderm (Fig. 4). As this expression domain is not shared
It is worth noting though, that CNS were also found in by D. melanogaster, it is seemingly not related with the lab-pb
fragments not experimentally tested or described as with no ef- split. Although our analysis is qualitative, and slightly quantita-
fect on expression (Fig. 3). This observation suggests that the tive changes or domain changes of a few cells may remain un-
regulation of these genes may be even more complex than cur- detected, it shows that the reorganization of the HOM-C caused
rently envisaged, and that more regulatory modules may be op- no major alterations of the expression patterns of the three Hox
erative in nature than those experimentally identified in the genes adjacent to the splits, in good agreement with the conser-
laboratory. vation of regulatory sequences (see above). Likewise, Bomze and

Figure 4. Expression pattern of pb in embryos. (A–D) stage 11 embryos, (E–H) stage 17 embryos. (A,E) D. melanogaster, (B,F) D. virilis, (C,G) D. buzzatii,
and (D,H) D. repleta. (A–D) Expression on the ectoderm of the maxillary and labial lobes. Later in development (E–H) pb is detected in the derivatives
of the maxillary (white arrowhead) and labial (black arrowhead) lobes, and in the ventral nervous system (boxed area). (A–D) pb expression is detected
in the mesodermal layer of the mandibular segment (black arrow) in all four species. In D. virilis only (B), pb is also expressed in the mesodermal layer
of the maxillary segment (white arrow). The mandibular (mn), maxillary (mx), and labial (lab) segments are shown in A.

696 Genome Research

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 Drosophila Hox gene complex splits

López (1994) found that the expression pattern of Ubx in em- a higher degree of conservation in noncoding regions than more
bryos is conserved between D. melanogaster, D. pseudoobscura, D. simple genes with metabolic or housekeeping functions (Berg-
virilis, and D. hydei (a species of the repleta group), despite their man and Kreitman 2001; Bergman et al. 2002; Halligan et al.
different Hox-gene organization (Figure 1). 2004). Moreover, Hox genes are associated with larger noncoding
regions. Hox genes harbor some of the longest introns of any
Drosophila gene (Moriyama et al. 1998) and mean intron size is
Discussion significantly greater in the Hox than in the non-Hox genes ana-
lyzed here (F = 4.69, df = 1, P < 0.05). This observation also fits
zen2 predates the Drosophila radiation
with the notion that the amount of noncoding DNA must be
The zen and bcd genes come from a duplication of Hox3 in the larger in those genes with complex developmental functions in
ancestor of Cyclorraphan flies (Stauber et al. 2002). A second order to harbor the required CRM (Nelson et al. 2004).
duplication of zen gave birth to zen2, which was thought to be a
recent event in D. melanogaster (Randazzo et al. 1993), where it
has no discernible function. However, the existence of Dpse\zen2 HOM-C evolution in Drosophila
and Dbuz\zen2 shows that the zen–zen2 duplication must predate In Drosophila, Hox genes are arranged in the same 5⬘→3⬘ orien-
the divergence of the Sophophora and Drosophila subgenus, and tation (with only one exception, the Deformed gene in D. mela-
that this gene has been kept during at least 40–60 Myr of evolu- nogaster). Their regulatory sequences are usually located up-
tion. Whether this gene is also present in other flies outside of stream of each gene and in the introns. If we look at the three
the Drosophila genus is still unknown. HOM-C splits known in Drosophila, a common pattern arises. As
can be seen in Figure 2, the lab–pb split took place close to the 3⬘
Patterns of conserved noncoding sequence evolution end of pb and far from the lab 5⬘ end. Likewise, the split between
Cis-Regulatory Modules (CRM) are transcription regulatory DNA the genes Ubx and abdA took place near the abdA 3⬘ end and far
segments (from a few hundred base pair to 1 kb in size) that from the Ubx 5⬘ end, in the short space between their respective
control gene expression in higher eukaryotes (Wray et al. 2003). regulatory sequences pbx and iab2. This is approximately the
CRM have a complex structure still not fully understood. They same position where an experimental break that does not affect
contain one or several binding sites for different transcription development has been observed (Struhl 1984), although the de-
factors, which act cooperatively to activate or repress transcrip- ficiencies used in the complementation tests both carry a fraction
tion of the target gene. As CRM are functionally constrained to of the pbx and iab2 regions. Finally, sequence comparison be-
maintain the expression of the target gene, they evolve slower tween D. melanogaster and D. virilis (Lewis et al. 2003) show that
than nonfunctional sequences. Therefore, the conservation of both the insertion of the CG31217 gene and the Antp–Ubx split
noncoding sequences between phylogenetically distant species took place close to the Ubx 3⬘ end, and far from the Antp 5⬘ end
may be used as a guide for identification of regulatory sequences. (results not shown). Thus, all three splits seem to have occurred
Several recent studies (Bergman and Kreitman 2001; Bergman et far from the 5⬘ end of one gene and much closer to the 3⬘ end of
al. 2002; Cooper and Sidow 2003; Nobrega et al. 2003; Santini et the next one, in such a way as to keep in place the regulatory
al. 2003) support the use of comparative sequence analysis and sequences of both genes. In this way, rearrangements did not
characterization of CNS as a useful approach to detect putative alter any of the known regulatory sequences of these Hox genes;
CRM in Drosophila and other organisms. The clustering of previ- this would explain the absence of gene expression changes.
ously characterized transcription-factor binding sites may be also In the repleta group species, the anterior gene lab is located
used for detection of CRM (Berman et al. 2004). However, the near the posterior genes abdA and AbdB. The sequence analysis
absence of high-quality binding data for most Drosophila tran- shows that lab and abdA are only 75 kb apart and show the same
scription factors represent a great current limitation in the wide- orientation. The breakpoint of the lab–pb split occurred at ∼22 kb
spread application of this method. from that of the Ubx–abdA split. None of those splits seem to
We exhaustively searched for CNS around lab, pb, and abdA have affected the regulatory regions of the Hox genes, because the
and around adjacent non-Hox genes by comparing three species expression patterns of lab and abdA are unaffected. Although it is
pairs. A plethora of highly conserved blocks was found surround- intriguing, the proximity between these genes in the D. buzzatii
ing the three Hox genes in the comparison between the phylo- genome seems purely accidental and lacking any functional sig-
genetically distant species D. buzzatii and D. melanogaster or D. nificance.
pseudoobscura (Fig. 1). The proportion of noncoding sequence The most likely mechanisms for the generation of the
included in CNS was 20%–22%. In most cases, these CNS keep HOM-C splits are paracentric inversions (Ranz et al. 2001; Gonza-
their relative position and colinearity, although a few microrear- lez et al. 2002). A plausible reconstruction of HOM-C evolution
rangements were found. The interpretation of these CNS as regu- in the Drosophila subgenus that accounts for the current organi-
latory sequences is supported by the high neutral substitution zation of Hox genes in D. buzzatii is shown in Figure 5. In lower
rate (Moriyama and Gojobori 1992) and intrinsic rate of DNA Dipterans, such as Anopheles gambiae, the eight Hox genes, plus
loss (Petrov et al. 1996; Singh and Petrov 2004) in Drosophila. Hox3 and ftz, are arranged as a single cluster (Powers et al. 2000).
Noncoding sequences are not expected to be conserved between Before the radiation of the Drosophila genus, two transpositions
such distantly related species unless they are functionally con- occurred as follows: the Ccp gene cluster between lab and pb, and
strained. The coincidence between CNS and known enhancers the gene CG31217 between Antp and Ubx (Lewis et al. 2003).
such as iab2 PRE or lab550 (Supplemental Fig. S1) further sup- Also, zen, zen2, and bcd evolved from the Hox3 gene (see above).
ports this interpretation. In the lineage of the Drosophila subgenus, an inversion took place
A lower CNS density was observed around non-Hox genes. with one breakpoint between Ubx and abdA (split 2 in Fig. 1) and
This result fits well with previous observations showing that the other one between CG31363 and an unknown ORF (X). This
genes with complex developmentally regulated expression show HOM-C structure is now present in species of the Drosophila sub-

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Negre et al.

Figure 5. Reconstruction of the Hox gene complex evolution in the Drosophila subgenus. Genes are shown as arrows when the orientation 5⬘→3⬘ is
known, and as rectangles otherwise. Hox genes are in black, Hox-related genes in gray, and non-Hox genes in white. (A) Lower Dipterans. (B) Before the
radiation of the Drosophila genus. (C) Drosophila subgenus after its separation from that of the Sophophora subgenus. (D) Ancestor of the repleta group.
(E) Present arrangement of Hox genes in Drosophila buzzatii (cf. Fig. 2A,D).

genus outside the repleta group, such as D. virilis (see Fig. 1). A guillon 2003). In nematodes, the pattern of Hox-gene evolution
second inversion, in the ancestor of the repleta group, split the seems indicative of the move to a deterministic developmental
HOM-C between lab and pb (split 3 in Fig. 1). This inversion, mode (Aboobaker and Blaxter 2003). Bombyx embryogenesis,
which relocated lab close to abdA, had one breakpoint between which is difficult to assign to a short or a long germ insect, is
pb and the Ccp cluster genes and the second breakpoint between characterized by a quick development (Davis and Patel 2002).
CG31363 and CG17836. These two genes are not adjacent in the Drosophila is a long germ insect, where all Hox genes are activated
D. melanogaster genome, but we infer that they were so in the almost simultaneously during the cellular blastoderm stage.
ancestor of the Drosophila subgenus. Thus, none of these organisms seems to show temporal colinear-
ity. A common feature between all organisms shown so far to
Do flies have a Hox gene complex? have a split Hox complex seems to be a derived mode of embryo-
Despite the striking conservation of Hox-gene clustering in meta- genesis characterized by a fast early development.
zoans, if we compare two of the most deeply studied organisms, The loss of temporal progression in the activation of Hox
Drosophila and vertebrates, important differences arise (Ferrier genes in a very rapid mode of embryogenesis could be the ulti-
and Minguillon 2003; Santini et al. 2003; Wagner et al. 2003). mate cause for the modular organization of those Hox “clusters,”
Drosophila Hox-gene regions (1) are much larger than those of where modules can be taken apart without loss of function.
vertebrates, e.g., the human HoxA cluster is only 110 kb long, Given the high rate of chromosomal rearrangement in the genus
whereas the D. melanogaster HOM-C spans 665 kb; (2) contain Drosophila (Ranz et al. 2001; Gonzalez et al. 2002), we anticipate
transposable element insertions, which are remarkably absent in that an even greater variety of Hox-gene organizations will be
those of vertebrates; (3) contain also non-Hox genes that are in- discovered when more species are investigated. It is ironical that
serted between the Hox genes, and tandem duplications within Hox-gene colinearity was discovered in Drosophila, an organism
the complex, such as those of the zen-related genes; (4) allow for with a partially disassembled complex, which may be the by-
small inversions of Hox genes, such as Dfd (Randazzo et al. 1993), product of phylogenetic inertia more than that of functional ne-
and non-Hox genes, such as zen2 (Fig. 2); and (5) are split in three cessity.
ways in different lineages, apparently without consequences on
gene expression. These observations suggest a highly dynamic Methods
evolution in Drosophila that contrasts with the compact structure
seen in vertebrates. Thus, the splits of HOM-C in Drosophila in- Flies
dicate a release of functional requirements present in other meta- D. buzzatii stock st-1 was used for construction of a genomic BAC
zoan. library (González et al. 2005). The following species and stocks
Moreover, Drosophila is not the only organism known to were used for gene expression experiments: D. buzzatii (j19), D.
have a split HOM-C. Split Hox-gene complexes were also known repleta (1611.2), D. virilis (Tokyo-Japan), and D. melanogaster
in nematodes, and recently have been described in Bombyx and (Canton S and Oregon R).
tunicates. What do those organisms have in common in addition
to the split HOM-C? Vertebrate development follows a rostral- BAC sequencing
to-caudal temporal progression, and the colinearity of Hox genes The genomic BAC library was screened with probes from the lab,
is not only spatial, but also temporal (the Hox clock) (Kmita and pb, and abdA genes (González et al. 2005). Positive clones were
Duboule 2003). In the tunicate Oikopleura, Hox gene expression used to build physical maps for the lab-abdA and pb chromo-
still evokes spatial colinearity but not temporal (Seo et al. 2004), somal regions, and one BAC clone from each region was chosen
which favors the argument that the constraining force of HOM-C for sequencing. Shotgun sublibraries were constructed for each
structure conservation is temporal colinearity (Ferrier and Min- BAC using the vector TOPO, and enough plasmid clones were se-

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 Drosophila Hox gene complex splits

quenced by both ends to reach an ∼6⳯ redundancy. Reads were Josefa González, Roger Hoskins, Barret Pfeiffer, Theresa Ren, Ar-
assembled with the PHRED-PHRAD-CONSED software (Ewing mand Sánchez, Chung Li Shu, and three anonymous referees for
and Green 1998; Ewing et al. 1998; Gordon et al. 1998) and help or comments on the manuscript. This work was supported
sequences finished with one round of AUTOFINISH (Gordon et by grants BMC2002-01708 awarded to A.R. and BMC2002-00300
al. 2001), followed by PCR to bridge the remaining gaps. A con- to E.S.-H. from the Dirección General de Enseñanza Superior e
tinuous high-quality sequence (PHRED score >40) was obtained Investigación Cientı́fica (MEC, Spain), an Institutional Grant
for BAC clones 5H14 (124,024 bp), and 40C11 (132,938 bp). Sta- from the Fundación Ramón Areces, a doctoral FI/DGR fellowship
tistic details of the sequencing process are given in Supplemental from the Generalitat de Catalunya awarded to B.N., and a doc-
Table S3. toral FPI fellowship from the Ministerio de Ciencia y Tecnologı́a
(BES-2003–0416) awarded to S.C.
Sequence annotation
Nucleotide sequences were annotated with the aid of GENE-
SCRIPT (Hudek et al. 2003) and ARTEMIS (Berriman and Ruther- References
ford 2003). Predicted ORFs were corroborated with GOFIGURE
Aboobaker, A. and Blaxter, M. 2003. Hox gene evolution in nematodes:
(Khan et al. 2003) for automatic Gene Ontology (Harris et al. Novelty conserved. Curr. Opin. Genet. Dev. 13: 593–598.
2004) annotation, and BLAST (McGinnis and Madden 2004) for Alonso, C.R. and Akam, M. 2003. A Hox gene mutation that triggers
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those of homologous regions in D. melanogaster (Celniker et al. Drosophila development. Nucleic Acids Res. 31: 3873–3880.
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DMU31961 (BX-C), and AE003692, AE003672, AE003713, Bergman, C., Pfeiffer, B., Rincon-Limas, D., Hoskins, R., Gnirke, A.,
AE003676, and AE003724 (other regions). D. pseudoobscura con- Mungall, C., Wang, A., Kronmiller, B., Pacleb, J., Park, S., et al. 2002.
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We thank Claudio Alonso, Joaquin Ariño, Anna Barceló, James Gordon, D., Abajian, C., and Green, P. 1998. Consed: A graphical tool
Castelli-Gair, Jose Felix de Celis, Susan Celniker, Ariel Chipman, for sequence finishing. Genome Res. 8: 195–202.

Genome Research 699

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700 Genome Research

www.genome.org
RESULTADOS

76
 RESULTADOS

SUPPLEMENTAL MATERIAL

Table S1. Statistical analysis of CNS characteristics between regions for the three pair-wise
species comparisons.
Species Nucleotide Sequence in
(1)
Source of variation pair Density Size distribution identity (%) CNS (%)
d.f. F d.f. G d.f. F d.f. F
Between the six regions mel-pse 5 1.74 60 104.34*** 5 4.84*** 5 7.17***
mel-buz 5 15.31*** 60 58.19 5 2.13 5 16.16***
pse-buz 5 18.75*** 60 64.82 5 3.30* 5 18.76***
Between Hox regions mel-pse 2 0.23 24 30.63 2 0.13 2 1.06
mel-buz 2 1.40 24 26.52 2 0.49 2 1.19
pse-buz 2 1.18 24 38.04* 2 4.55* 2 1.56
Between non-Hox regions mel-pse 2 3.34* 24 24.90 2 9.71*** 2 3.64*
mel-buz 2 9.44*** 24 16.68 2 2.69 2 11.71***
pse-buz 2 11.02*** 24 9.65 2 0.40 2 10.52***
Hox vs non-Hox regions mel-pse 1 1.58 12 60.36*** 1 4.54* 1 26.48***
mel-buz 1 54.87*** 12 17.41 1 4.29* 1 55.00 ***
pse-buz 1 69.34*** 12 19.59 1 6.63* 1 69.65***
* P < = 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001.
(1)
Variation between the six regions (df = 5) can be partitioned into three components: variation between
the three Hox gene regions (df = 2), variation between the three non-Hox gene regions (df = 2) and
variation between Hox and non-Hox gene regions (df = 1).

Table S2. Statistical analysis of CNS characteristics between species pairs for the different
regions.
Nucleotide Sequence in
(1)
Source of variation Region Density Size distribution identity (%) CNS (%)
d.f. F d.f. G d.f. F d.f. F
Between the three Hox genes 2 15.58*** 24 28.23 2 0.70 2 43.97***
species pairs Non-Hox genes 2 49.44*** 24 9.59 2 1.89 2 34.10***
Mel/buz versus pse/buz Hox gene 1 2.09 12 2.96 1 0.08 1 1.69
Non-Hox gene 1 0.10 12 3.60 1 0.19 1 0.03
Mel/pse versus Hox gene 1 29.06*** 12 27.69** 1 1.32 1 86.24***
Mel/buz or pse/buz Non-Hox gene 1 98.78*** 12 5.28 1 3.59 1 68.17***
** P < 0.01; *** P < 0.001.
(1)
Variation between the three species pairs, mel/pse, mel/buz and pse/buz (df = 2) can be partitioned into
variation between the equally distant species pairs mel/buz and pse/buz (df = 1) and variation between the
closely related mel/pse and the other two species pairs (df = 1).

77
RESULTADOS

Table S3. Statistics of the sequencing process of two BAC clones from a Drosophila buzzatii
genomic library.
BAC clone 5H14 40C11
Number of clones in plasmid library (insert size 1.5 kb) 960 1,056
Number of clones sequenced by one end 77 -
Number of clones sequenced by both ends 712 864
Number of reads in shotgun sequencing 1,501 1,728
Coverage 7.7x 6x
Number of contigs (> 2kb) after automatic assembly 7 7
Number of contigs (> 2kb) after manual editing 4 6
Number of contigs (< 2kb) after manual editing 2 0
Number of extra reads from plasmid library (clone ends) 47 43
Number of extra reads from plasmid library (custom primers) 22 31
Number of PCR fragments sequenced (physical gaps) 1 3
Number of reads from PCR fragments 4 11
Number of reads for finishing 73 85
Total number of reads produced 1,574 1,813
Total number of reads in final assembly 1,391 1,396
Average read size (bp) 829 890
Size of BAC clone insert (bp) 124,024 132,938
Error rate (per 10 kb) < 0.01 0.17

Table S4. Primer pairs used for cDNA amplification.

gene Species forward reverse Size
lab D. buzzatii CATCCGTGTCAGCTGCTAAC 570 bp
D. replete 400 bp
TTCACGCGCTTCTTCTGCTTCAT
D. virilis TCCAGCACCGAAACTACCTG 400 bp
D. melanogaster 433 bp
pb D. buzzatii 458 bp
TCAATTCGCAGCCGTCGATG GAGAGCGTTTGCCTCTTGTG
D. melanogaster 475 bp
abdA D. buzzatii 504 bp
CTGTGTGCAAGCGTTGC
D. virilis TCGCAGTACTCGTCTCTG 501 bp
D. repleta CTGGTAGAACTGCGCAA 424 bp

78
 RESULTADOS

Table S5. List of observed CNS.

proboscipedia
D. buzzatii 40C11 D.melanogaster D. pseudoobscura
AE001572 AADE01000149
inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin
128178 128091 = 90 al 85.6 pse 59361 59272
127928 127889 = 41 al 80.5 mel 302111 302151
127882 127808 = 76 al 84.2 pse 59157 59083
127881 127808 = 74 al 85.1 mel 302160 302230
127738 127712 = 27 al 85.2 mel 302271 302295
127738 127718 = 21 al 81.0 pse 59010 58990
127592 127536 = 58 al 79.3 pse 58880 58827
127569 127536 = 34 al 94.1 mel 302404 302437
127513 127500 = 14 al 100.0 pse 58779 58766
127365 127350 = 16 al 100.0 pse 58692 58677
125591 125571 = 21 al 81.0 pse 56735 56715
125293 125263 = 31 al 93.5 mel 304260 304290
125293 125240 = 58 al 84.5 pse 56472 56416
125256 125240 = 17 al 94.1 mel 304300 304316
125178 125159 = 20 al 95.0 mel 304346 304365
125175 125159 = 17 al 100.0 pse 56382 56366
125064 125019 = 46 al 93.5 pse 56266 56221
125061 125020 = 43 al 90.7 mel 304497 304539
124813 124790 = 24 al 95.8 mel 304687 304710
124813 124790 = 24 al 95.8 pse 56010 55987
124742 124687 = 56 al 82.1 mel 305074 305129
124735 124671 = 67 al 82.1 pse 55888 55822
124583 124554 = 30 al 80.0 mel 305225 305254
124580 124563 = 18 al 100.0 pse 55753 55736
124505 124437 = 69 al 82.6 pse 55682 55615
124483 124441 = 43 al 93.0 mel 305351 305393
124275 124241 = 36 al 91.7 pse 55433 55398
124274 124241 = 34 al 85.3 mel 305559 305592
124166 124131 = 36 al 97.2 mel 305627 305662
124166 124126 = 41 al 95.1 pse 55341 55301
124094 124040 = 58 al 82.8 pse 55261 55204
124085 124045 = 41 al 97.6 mel 305692 305732
123957 123919 = 39 al 74.4 pse 55129 55094
123949 123918 = 32 al 81.3 mel 305847 305878
123075 122988 = 89 al 93.3 mel 306157 306245

79
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

123075 122988 = 91 al 90.1 pse 54802 54713
122714 122670 = 47 al 78.7 mel 306382 306428
122714 122670 = 47 al 80.9 pse 54541 54495
122549 122504 = 46 al 82.6 pse 54407 54365
122540 122521 = 20 al 90.0 mel 306535 306554
121839 121815 = 25 al 80.0 mel 306656 306680
121782 121671 = 114 al 86.0 pse 53961 53848
121775 121671 = 107 al 84.1 mel 307050 307155
121573 121542 = 32 al 93.8 mel 307227 307258
121573 121542 = 32 al 90.6 pse 53742 53711
121491 121464 = 28 al 89.3 mel 307302 307327
121488 121464 = 26 al 92.3 pse 53660 53635
121455 121443 = 13 al 100.0 mel 307339 307351
121455 121437 = 19 al 100.0 pse 53557 53539
121380 121346 = 35 al 82.9 mel 307396 307428
121371 121346 = 26 al 100.0 pse 53489 53464
121221 121174 = 53 al 79.2 mel 307468 307520
121221 121180 = 46 al 78.3 pse 53425 53380
121151 121123 = 30 al 83.3 mel 307576 307605
121151 121129 = 24 al 83.3 pse 53331 53308
121023 120957 = 70 al 91.4 pse 52887 52818
121021 120957 = 68 al 83.8 mel 308208 308275
120947 120900 = 48 al 97.9 mel 308299 308346
120946 120888 = 59 al 86.4 pse 52789 52731
120276 120255 = 24 al 79.2 mel 308771 308794
120240 120229 = 12 al 100.0 pse 52275 52264
120185 120160 = 26 al 76.9 mel 308863 308888
120167 120144 = 24 al 79.2 pse 52205 52182
119994 119955 = 40 al 80.0 pse 52017 51978
119932 119826 = 107 al 78.5 pse 51904 51798
119916 119887 = 30 al 73.3 mel 309200 309229
119883 119856 = 28 al 78.6 mel 309233 309260
119754 119729 = 26 al 76.9 mel 309347 309372
119725 119654 = 72 al 77.8 pse 51705 51634
119685 119660 = 26 al 80.8 mel 309416 309441
119576 119464 = 113 al 80.5 pse 51533 51421
119569 119461 = 109 al 78.0 mel 309543 309651
119455 119431 = 25 al 76.0 mel 309657 309681
119455 119403 = 53 al 75.5 pse 51412 51360

80
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

119427 119403 = 25 al 76.0 mel 309685 309709
119094 119061 = 34 al 88.2 mel 310004 310034
119078 119043 = 36 al 83.3 pse 51120 51085
118966 118941 = 26 al 80.8 pse 51058 51033
118893 118802 = 92 al 95.7 mel 310160 310251
118893 118802 = 92 al 95.7 pse 50925 50834
118707 118656 = 59 al 81.4 mel 310655 310713
118703 118585 = 127 al 79.5 pse 50696 50574
118639 118589 = 51 al 96.1 mel 310725 310775
117995 117966 = 30 al 80.0 mel 311221 311248
117982 117966 = 17 al 100.0 pse 50084 50068
117922 117888 = 35 al 80.0 mel 311307 311338
117922 117888 = 35 al 91.4 pse 50006 49972
117767 117716 = 53 al 90.6 mel 311419 311471
117767 117714 = 55 al 92.7 pse 49873 49819
117333 117306 = 28 al 78.6 pse 49570 49547
117243 117221 = 23 al 78.3 pse 49500 49478
116764 116725 = 40 al 82.5 pse 49114 49075
116636 116569 = 68 al 77.9 pse 48995 48928
116541 116473 = 69 al 75.4 pse 48900 48832
116260 116231 = 30 al 80.0 pse 48593 48564
116057 116038 = 20 al 100.0 pse 48315 48296
115629 115592 = 38 al 78.9 mel 311999 312036
115599 115575 = 25 al 80.0 pse 47935 47911
115526 115505 = 23 al 78.3 pse 47852 47830
115420 115400 = 25 al 76.0 pse 47724 47700
113402 113371 = 34 al 82.4 mel 314230 314263
113380 113326 = 56 al 89.3 pse 46625 46570
113350 113317 = 34 al 85.3 mel 314266 314299
113308 113280 = 29 al 86.2 mel 314301 314329
113307 113291 = 17 al 100.0 pse 46558 46542
113206 113137 = 70 al 87.1 pse 46392 46323
113204 113148 = 57 al 89.5 mel 314396 314449
113060 113031 = 31 al 83.9 pse 46190 46160
113056 113032 = 25 al 76.0 mel 314565 314589
110974 110950 = 26 al 76.9 mel 315914 315938
109495 109473 = 23 al 95.7 mel 317519 317541
109488 109447 = 42 al 92.9 pse 43768 43728
109471 109442 = 30 al 83.3 mel 319277 319305

81
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

109292 109269 = 24 al 83.3 pse 43633 43610
109222 109200 = 23 al 100.0 mel 319445 319467
109217 109200 = 18 al 100.0 pse 43579 43562
109174 109119 = 57 al 91.2 mel 319480 319536
109174 109130 = 45 al 100.0 pse 43545 43501
109006 108976 = 31 al 83.9 mel 319584 319614
109006 108972 = 35 al 82.9 pse 43438 43405
108953 108895 = 59 al 91.5 mel 319688 319745
108953 108894 = 60 al 91.7 pse 43366 43308
108766 108697 = 72 al 88.9 pse 43271 43200
108751 108697 = 56 al 94.6 mel 319777 319832
108585 108557 = 29 al 82.8 pse 43141 43114
108576 108553 = 26 al 80.8 mel 319882 319907
107869 107831 = 39 al 84.6 mel 320514 320552
107862 107825 = 38 al 89.5 pse 42283 42246
107830 107801 = 30 al 80.0 mel 320565 320594
107781 107759 = 23 al 78.3 mel 320625 320647
107656 107620 = 37 al 97.3 mel 320742 320778
107654 107608 = 50 al 90.0 pse 42024 41975
107589 107570 = 20 al 100.0 pse 41966 41947
107587 107555 = 33 al 81.8 mel 320789 320820
107513 107453 = 61 al 91.8 pse 41895 41835
107505 107451 = 55 al 96.4 mel 320875 320929
107362 107282 = 82 al 81.7 pse 41802 41722
107348 107278 = 71 al 87.3 mel 320965 321035
106522 106480 = 43 al 83.7 mel 321340 321382
106521 106486 = 36 al 83.3 pse 41377 41342
106312 106255 = 60 al 78.3 pse 41247 41195
106276 106255 = 22 al 95.5 mel 321513 321534
106178 106150 = 29 al 82.8 mel 321585 321613
106067 106042 = 26 al 80.8 mel 321661 321684
106066 106042 = 25 al 80.0 pse 41056 41034
105963 105915 = 50 al 90.0 mel 321713 321762
105937 105910 = 28 al 96.4 pse 40936 40909
105850 105727 = 124 al 89.5 mel 321817 321940
105845 105709 = 137 al 89.1 pse 40845 40710
105672 105615 = 58 al 98.3 mel 321992 322049
105671 105583 = 91 al 92.3 pse 40679 40590
105614 105593 = 22 al 100.0 mel 322069 322090

82
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

105316 105293 = 25 al 76.0 pse 39920 39896
105233 105168 = 66 al 84.8 mel 322469 322533
105233 105168 = 68 al 80.9 pse 39692 39626
105071 105036 = 36 al 100.0 mel 322614 322649
105071 105036 = 36 al 100.0 pse 39549 39514
104997 104932 = 70 al 77.1 mel 322669 322738
104992 104965 = 30 al 90.0 pse 39484 39455
104900 104860 = 41 al 90.2 mel 322780 322820
104896 104857 = 43 al 90.7 pse 39349 39307
104843 104823 = 21 al 95.2 pse 39288 39269
104788 104755 = 34 al 94.1 mel 322894 322927
104783 104755 = 29 al 93.1 pse 39219 39191
103960 103908 = 54 al 83.3 pse 38928 38875
103945 103907 = 39 al 97.4 mel 323291 323329
103848 103803 = 46 al 87.0 pse 38752 38707
103846 103778 = 70 al 82.9 mel 323430 323498
103800 103772 = 29 al 82.8 pse 38694 38666
103564 103445 = 121 al 89.3 mel 323576 323693
103563 103447 = 118 al 92.4 pse 38534 38419
103404 103383 = 22 al 86.4 pse 38371 38350
103403 103383 = 21 al 90.5 mel 323728 323748
103311 103250 = 62 al 98.4 pse 38298 38237
103307 103250 = 58 al 94.8 mel 323787 323843
103240 103178 = 64 al 96.9 pse 38182 38119
103237 103175 = 63 al 95.2 mel 323879 323941
103122 103104 = 19 al 94.7 mel 323961 323979
103113 103101 = 13 al 100.0 pse 38075 38063
102933 102883 = 55 al 76.4 pse 37903 37851
102930 102881 = 53 al 75.5 mel 324103 324154
102792 102769 = 24 al 83.3 mel 324222 324245
102788 102769 = 20 al 85.0 pse 37773 37754
102118 102069 = 53 al 92.5 pse 37038 36986
102114 102080 = 35 al 94.3 mel 324724 324758
101975 101902 = 79 al 81.0 pse 36884 36806
101965 101901 = 66 al 97.0 mel 324834 324899
101787 101744 = 44 al 88.6 mel 324994 325037
101781 101744 = 40 al 90.0 pse 36699 36660
101717 101670 = 48 al 83.3 pse 36622 36577
101711 101685 = 27 al 100.0 mel 325085 325111

83
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

101645 101607 = 39 al 89.7 mel 325260 325298
101645 101592 = 54 al 87.0 pse 36451 36401
101578 101515 = 68 al 77.9 mel 325335 325402
101578 101535 = 48 al 83.3 pse 36370 36323
101263 101179 = 86 al 84.9 pse 36090 36006
101260 101192 = 69 al 84.1 mel 325606 325674
101113 101087 = 27 al 81.5 pse 35943 35917
100930 100904 = 27 al 85.2 mel 325815 325841
100930 100899 = 32 al 81.3 pse 35856 35825
100859 100820 = 40 al 92.5 mel 325904 325942
100859 100786 = 74 al 81.1 pse 35764 35699
100695 100674 = 23 al 78.3 mel 326033 326055
100673 100648 = 28 al 78.6 pse 35639 35616
100662 100648 = 15 al 100.0 mel 326098 326112
100565 100546 = 20 al 85.0 mel 326158 326177
100539 100512 = 28 al 78.6 pse 35533 35507
100329 100299 = 31 al 71.0 mel 326361 326391
99852 99824 = 33 al 81.8 pse 35066 35034
99807 99768 = 41 al 82.9 pse 34972 34932
99802 99768 = 35 al 82.9 mel 326603 326637
99659 99641 = 21 al 81.0 pse 34864 34844
99564 99536 = 29 al 89.7 mel 326806 326834
99558 99536 = 23 al 87.0 pse 34781 34759
99505 99466 = 40 al 92.5 mel 326905 326944
99505 99457 = 49 al 87.8 pse 34719 34676
99305 99284 = 22 al 86.4 mel 327049 327070
99120 99050 = 73 al 95.9 mel 327205 327277
99120 99051 = 72 al 95.8 pse 34412 34341
99039 99005 = 35 al 85.7 mel 327336 327370
99039 99005 = 35 al 91.4 pse 34279 34245
98946 98917 = 31 al 74.2 pse 34192 34162
98940 98921 = 21 al 81.0 mel 327423 327443
98889 98864 = 26 al 88.5 mel 327448 327471
98889 98866 = 24 al 87.5 pse 34161 34140
98680 98583 = 105 al 89.5 pse 34035 33931
98669 98579 = 93 al 89.2 mel 327895 327987
98524 98508 = 17 al 94.1 pse 33885 33869
98404 98381 = 24 al 91.7 mel 328168 328191
98404 98386 = 19 al 89.5 pse 33796 33778

84
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

97783 97757 = 27 al 77.8 mel 328506 328531
97700 97682 = 19 al 100.0 mel 328586 328604
97597 97534 = 64 al 76.6 mel 328704 328767
97255 97223 = 33 al 93.9 mel 328974 329006
97255 Inv 97229 = 27 al 100.0 pse 33043 33069
97150 97128 = 23 al 95.7 mel 329043 329065
97145 inver 97121 = 25 al 96.0 pse 33107 33131
96486 sión 96461 = 26 al 76.9 pse 33218 33243
95974 95893 = 83 al 90.4 mel 330006 330088
95961 95891 = 74 al 83.8 pse 31814 31741
95869 95830 = 40 al 95.0 mel 330181 330220
95858 95804 = 55 al 81.8 pse 31627 31582
95207 95165 = 44 al 93.2 pse 30649 30606
95204 95162 = 46 al 89.1 mel 330438 330483
95068 95036 = 33 al 78.8 mel 330605 330637
95065 95045 = 21 al 90.5 pse 30432 30412
94900 94880 = 25 al 76.0 pse 30299 30275
94850 94830 = 21 al 81.0 pse 30249 30229
94819 94795 = 25 al 76.0 pse 30218 30194
94782 94755 = 28 al 78.6 mel 331268 331294
94743 94719 = 25 al 96.0 mel 331320 331344
94741 94716 = 26 al 96.2 pse 30153 30128
94532 94507 = 27 al 81.5 pse 29438 29412
94334 94311 = 24 al 79.2 pse 25970 25949
94185 94161 = 25 al 76.0 pse 27372 27348
94017 93984 = 35 al 80.0 mel 333133 333167
93974 93957 = 18 al 100.0 mel 333103 333120
93974 93957 = 18 al 100.0 pse 28012 27995
93952 93906 = 47 al 74.5 mel 333016 333062
93952 93911 = 42 al 81.0 pse 28090 28049
93825 inver 93802 = 24 al 91.7 mel 332505 332528
93825 sión 93802 = 24 al 91.7 pse 28391 28368
93776 93677 = 103 al 83.5 pse 28533 28435
93769 93676 = 94 al 86.2 mel 332397 332486
93629 93601 = 29 al 75.9 pse 28678 28650
93483 93457 = 27 al 81.5 mel 332202 332228
93473 93463 = 11 al 100.0 pse 28781 28771
93456 93418 = 39 al 82.1 pse 28833 28797
93439 93418 = 22 al 90.9 mel 332174 332195

85
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

93396 93360 = 37 al 83.8 mel 332129 332161
93386 93360 = 27 al 96.3 pse 28873 28847
92374 92322 = 54 al 90.7 pse 26132 26080
92371 92322 = 50 al 92.0 mel 334667 334715
92307 92276 = 32 al 96.9 mel 334616 334647
92307 92270 = 38 al 94.7 pse 26190 26153
92138 92108 = 31 al 93.5 mel 334505 334535
92136 92108 = 31 al 87.1 pse 26316 26286
92093 92082 = 12 al 100.0 pse 26351 26340
92009 91969 = 41 al 92.7 mel 334387 334427
92009 91969 = 41 al 97.6 pse 26461 26421
91942 91925 = 18 al 100.0 mel 334341 334358
91900 91873 = 28 al 78.6 pse 26550 26523
91885 91862 = 24 al 79.2 mel 334293 334316
91772 91746 = 27 al 88.9 mel 334021 334047
91772 91749 = 24 al 91.7 pse 26667 26644
91614 91580 = 35 al 97.1 pse 26764 26730
91608 91580 = 29 al 100.0 mel 333921 333949
inver
91540 91517 = 25 al 80.0 pse 26825 26801
sión
91497 91405 = 93 al 92.5 mel 333751 333842
91495 91408 = 88 al 95.5 pse 26958 26871
91323 91232 = 94 al 85.1 pse 27212 27120
90743 90693 = 52 al 88.5 mel 335390 335441
90733 90693 = 41 al 90.2 pse 25469 25429
90687 90665 = 23 al 82.6 mel 335455 335477
90597 90567 = 34 al 79.4 pse 25349 25316
90563 90502 = 63 al 90.5 mel 335577 335639
90550 90502 = 50 al 92.0 pse 25283 25234
90469 90404 = 66 al 81.8 pse 25150 25085
90468 90423 = 46 al 82.6 mel 335688 335733
90345 90323 = 23 al 91.3 pse 25013 24992
90270 90210 = 63 al 79.4 pse 24938 24878
90265 90217 = 52 al 80.8 mel 336091 336140
90097 90070 = 28 al 82.1 mel 336243 336267
90032 89984 = 52 al 76.9 pse 24723 24678
90002 89984 = 19 al 100.0 mel 336324 336342
89979 89967 = 13 al 100.0 pse 24626 24614
88498 88442 = 59 al 81.4 mel 337242 337299
88498 88437 = 62 al 83.9 pse 23604 23543

86
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

88427 88409 = 19 al 100.0 mel 337334 337352
88419 88394 = 26 al 92.3 pse 23473 23448
88381 88339 = 44 al 84.1 mel 337385 337428
88376 88339 = 39 al 79.5 pse 23437 23399
88232 88188 = 45 al 77.8 mel 337486 337528
88231 88189 = 43 al 79.1 pse 22965 22928
88175 88155 = 21 al 95.2 mel 337571 337591
88072 87962 = 115 al 88.7 mel 337662 337776
88072 87955 = 123 al 86.2 pse 22751 22629
87757 87726 = 32 al 84.4 mel 337926 337957
87757 87727 = 31 al 87.1 pse 22491 22461
87702 87680 = 26 al 76.9 mel 337979 338004
87592 87565 = 28 al 85.7 pse 22367 22340
87554 87531 = 24 al 87.5 mel 338062 338085
87552 87520 = 33 al 75.8 pse 22339 22308
86715 86681 = 35 al 91.4 mel 338401 338435
86715 86681 = 36 al 88.9 pse 21887 21852
86593 86568 = 26 al 84.6 mel 338522 338546
86587 86569 = 19 al 89.5 pse 21732 21715
86506 86459 = 53 al 81.1 mel 338575 338627
86489 86453 = 38 al 84.2 pse 21646 21610
86432 86389 = 44 al 86.4 mel 338668 338711
86432 86400 = 36 al 83.3 pse 21532 21497
86326 86268 = 60 al 78.3 pse 21394 21335
86311 86268 = 44 al 86.4 mel 338848 338891
86190 86138 = 54 al 87.0 mel 339315 339367
86169 86112 = 61 al 82.0 pse 20668 20608
85787 85762 = 26 al 80.8 mel 339726 339749
85780 85759 = 22 al 90.9 pse 20093 20072
85726 85680 = 48 al 83.3 mel 339790 339837
85726 85680 = 48 al 85.4 pse 20021 19974
85654 85635 = 20 al 85.0 pse 19915 19896
85584 85518 = 72 al 91.7 pse 19877 19806
85583 85523 = 61 al 100.0 mel 339913 339973
85506 85480 = 27 al 81.5 pse 19722 19696
85379 85357 = 23 al 78.3 pse 19663 19641
85353 85319 = 35 al 80.0 mel 340085 340118
85353 85336 = 22 al 81.8 pse 19633 19612
85215 85158 = 58 al 84.5 pse 19476 19419

87
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

85202 85186 = 17 al 100.0 mel 340241 340257
84890 84865 = 26 al 76.9 mel 340537 340561
84578 84545 = 34 al 85.3 mel 340824 340857
84573 84532 = 42 al 83.3 pse 19039 18998
84438 84356 = 84 al 90.5 mel 340935 341018
84382 84356 = 27 al 100.0 pse 18938 18912
84221 84179 = 43 al 76.7 mel 341169 341211
84206 84188 = 19 al 94.7 pse 18778 18760
84154 84096 = 59 al 83.1 mel 341237 341295
84154 84103 = 53 al 90.6 pse 18719 18667
83851 83791 = 63 al 82.5 mel 341420 341482
83840 83783 = 60 al 85.0 pse 18496 18437
83738 83689 = 52 al 80.8 mel 341515 341566
83738 83709 = 30 al 83.3 pse 18406 18377
83699 83671 = 29 al 79.3 pse 18363 18338
83628 83586 = 43 al 79.1 pse 18286 18244
83618 83606 = 13 al 100.0 mel 341629 341641
83580 83542 = 39 al 74.4 mel 341654 341692
83567 83539 = 29 al 79.3 pse 18203 18175
83446 83430 = 17 al 100.0 pse 18091 18075
83381 83355 = 27 al 85.2 mel 341804 341827
83268 83241 = 28 al 100.0 pse 17965 17938
83266 83222 = 47 al 89.4 mel 341919 341965
83172 83156 = 17 al 100.0 mel 342033 342049
83170 83156 = 15 al 100.0 pse 17889 17875
83138 83105 = 34 al 94.1 pse 17855 17822
83125 83097 = 32 al 81.3 mel 342064 342095
82236 82216 = 21 al 81.0 mel 342440 342460
82172 82126 = 47 al 85.1 pse 17503 17458
82167 82128 = 41 al 95.1 mel 342502 342541
81969 81903 = 67 al 82.1 pse 17303 17237
81960 81871 = 90 al 81.1 mel 342709 342798
81895 81871 = 26 al 80.8 pse 17212 17187
81741 81670 = 73 al 90.4 mel 342963 343031
81740 81670 = 73 al 90.4 pse 17000 16932
81606 81578 = 30 al 83.3 mel 343061 343090
81606 81588 = 19 al 100.0 pse 16862 16844
81529 81494 = 36 al 94.4 mel 343161 343196
81529 81489 = 41 al 90.2 pse 16699 16659

88
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

81420 81327 = 95 al 93.7 mel 343278 343372
81418 81339 = 80 al 97.5 pse 16596 16517
81216 81152 = 67 al 82.1 mel 343392 343456
81210 81149 = 64 al 82.8 pse 16437 16375
81137 81111 = 29 al 82.8 pse 16367 16339
81047 80936 = 119 al 84.0 mel 343537 343653
81022 80976 = 47 al 93.6 pse 16218 16173
80974 80939 = 36 al 100.0 pse 16157 16122
80855 80821 = 35 al 82.9 mel 343790 343824
80855 80832 = 24 al 100.0 pse 15973 15950
80679 80655 = 25 al 76.0 pse 15617 15593
80170 80154 = 17 al 100.0 pse 15035 15019
80121 80065 = 60 al 81.7 pse 14985 14929
80113 80067 = 47 al 93.6 mel 344455 344501
79896 79862 = 35 al 91.4 mel 344637 344671
79896 79856 = 41 al 90.2 pse 14794 14754
79620 79581 = 41 al 80.5 pse 14628 14589
79609 79581 = 30 al 83.3 mel 344845 344874
79249 79227 = 25 al 76.0 pse 14306 14282
79170 79136 = 35 al 80.0 pse 14217 14183
78869 78844 = 27 al 77.8 mel 345407 345433
78324 78273 = 52 al 86.5 pse 13815 13764
78315 78277 = 42 al 78.6 mel 345638 345679
76843 76827 = 17 al 94.1 pse 12444 12428
75250 75225 = 26 al 76.9 mel 349109 349134

89
 RESULTADOS

labial
D. buzzatii 5H14 D.melanogaster D. pseudoobscura
AE001572 AADE01000437
inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin
93374 93409 = 36 al 77.8 pse 58888 58853
93856 93884 = 29 al 75.9 mel 374162 374190
94584 94606 = 23 al 78.3 pse 57871 57849
94627 94656 = 30 al 80.0 mel 374573 374601
94627 94664 = 38 al 84.2 pse 57813 57776
94675 94692 = 18 al 94.4 pse 57771 57754
94683 94699 = 17 al 94.1 mel 374622 374637
94749 94764 = 16 al 93.8 pse 57699 57684
94835 94865 = 31 al 87.1 pse 57636 57606
94891 94915 = 25 al 100.0 mel 374807 374831
94891 94922 = 32 al 96.9 pse 57558 57527
95039 95101 = 66 al 84.8 mel 374880 374945
95039 95109 = 72 al 84.7 pse 57475 57404
95273 95292 = 20 al 90.0 pse 57242 57224
95274 95296 = 23 al 82.6 mel 375131 375152
96975 96997 = 23 al 82.6 pse 56750 56729
97580 97604 = 25 al 76.0 mel 375584 375607
100621 100694 = 75 al 89.3 pse 56160 56086
100635 100728 = 97 al 88.7 mel 376536 376632
100849 100888 = 40 al 87.5 mel 376678 376717
100849 100892 = 44 al 88.6 pse 55975 55932
100943 100981 = 39 al 94.9 pse 55885 55847
100947 100981 = 35 al 97.1 mel 376771 376805
101045 101087 = 43 al 100.0 pse 55755 55713
101050 101087 = 38 al 100.0 mel 376871 376908
101149 101189 = 43 al 83.7 mel 376973 377014
101167 101197 = 31 al 83.9 pse 55625 55596
101200 101227 = 29 al 82.8 mel 377019 377047
101267 101297 = 31 al 87.1 pse 55442 55413
101277 101292 = 16 al 100.0 mel 377163 377178
101416 101434 = 20 al 90.0 pse 55359 55340
101438 101462 = 26 al 88.5 pse 55325 55300
101545 101581 = 38 al 86.8 mel 377931 377968
101604 101627 = 26 al 76.9 mel 378013 378037
101692 101714 = 24 al 83.3 mel 378096 378119

90
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

101786 101828 = 43 al 88.4 mel 378172 378214
105496 105535 = 40 al 85.0 mel 380440 380476
105496 105532 = 37 al 91.9 pse 52438 52402
105556 105621 = 66 al 90.9 mel 380688 380753
105556 105614 = 59 al 98.3 pse 51931 51873
105676 105811 = 145 al 80.7 mel 380855 380993
105689 105768 = 81 al 91.4 pse 51756 51677
105774 105803 = 30 al 86.7 pse 51665 51637
106376 106399 = 25 al 80.0 pse 51217 51193
106473 106566 = 94 al 97.9 mel 381608 381701
106483 106576 = 94 al 100.0 pse 51111 51018
106687 106714 = 28 al 92.9 mel 382145 382172
106693 106714 = 22 al 100.0 pse 50772 50751
106867 106966 = 100 al 90.0 pse 50638 50542
106877 106921 = 45 al 95.6 mel 382271 382314
106931 106966 = 38 al 84.2 mel 382322 382357
107107 107236 = 131 al 90.8 pse 50446 50320
107141 107237 = 98 al 92.9 mel 382478 382575
107319 107371 = 56 al 87.5 pse 50223 50168
107323 107370 = 50 al 90.0 mel 382607 382656
108406 108466 = 61 al 85.2 pse 49346 49291
108417 108471 = 55 al 87.3 mel 383359 383413
108538 108575 = 38 al 86.8 pse 49238 49202
108539 108579 = 41 al 85.4 mel 383464 383503
108924 108947 = 26 al 76.9 pse 49141 49116
109002 109066 = 65 al 96.9 mel 383649 383712
109002 109066 = 65 al 96.9 pse 49063 49000
109081 109112 = 32 al 96.9 mel 383750 383781
109081 109138 = 58 al 84.5 pse 48967 48913
109175 109243 = 69 al 92.8 mel 383858 383926
109175 109243 = 69 al 95.7 pse 48864 48796
109279 109313 = 35 al 85.7 mel 383991 384022
109284 109314 = 31 al 83.9 pse 48717 48687
109421 109497 = 78 al 82.1 pse 48279 48202
109424 109497 = 75 al 84.0 mel 384629 384703
109574 109592 = 19 al 89.5 pse 48079 48061
109600 109624 = 25 al 92.0 mel 384877 384901
109600 109624 = 25 al 96.0 pse 48051 48027
109801 109840 = 43 al 83.7 pse 47860 47818

91
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

109806 109846 = 41 al 85.4 mel 384995 385034
109860 109892 = 35 al 80.0 mel 385064 385098
109860 109892 = 35 al 85.7 pse 47777 47743
110042 110054 = 13 al 100.0 pse 47555 47543
110178 110223 = 52 al 76.9 pse 47521 47472
110191 110253 = 70 al 80.0 mel 385578 385645
110226 110262 = 37 al 86.5 pse 47455 47419
110296 110354 = 59 al 88.1 pse 47357 47300
110300 110355 = 56 al 89.3 mel 385732 385787
110388 110417 = 30 al 80.0 mel 385829 385855
110395 110417 = 23 al 82.6 pse 47238 47217
110791 110816 = 26 al 76.9 mel 386011 386035
111279 111307 = 29 al 82.8 pse 46823 46795
111375 111408 = 34 al 85.3 mel 386374 386407
111375 111411 = 39 al 79.5 pse 46744 46706
111598 111640 = 43 al 86.0 pse 46572 46530
111660 111691 = 32 al 81.3 pse 46510 46479
111830 111899 = 71 al 85.9 pse 46429 46359
111831 111883 = 54 al 81.5 mel 386656 386708
112384 112410 = 27 al 92.6 mel 386855 386881
112384 112420 = 39 al 87.2 pse 46215 46177
112434 112459 = 26 al 84.6 mel 386903 386926
112437 112461 = 25 al 84.0 pse 46162 46139
113018 113047 = 30 al 76.7 pse 44020 43993
113613 113697 = 88 al 88.6 mel 388435 388522
113615 inver 113639 = 25 al 100.0 pse 44662 44638
113646 sión 113705 = 61 al 93.4 pse 44761 44701
113774 113821 = 48 al 77.1 pse 44818 44774
113788 113814 = 27 al 85.2 mel 388377 388403
113888 113906 = 19 al 100.0 pse 44906 44888
113889 113919 = 31 al 80.6 mel 388293 388323
113917 113939 = 23 al 91.3 pse 44958 44936
114013 114042 = 30 al 83.3 pse 45032 45003
114531 inver 114572 = 42 al 78.6 mel 387971 388010
114537 sión 114563 = 27 al 88.9 pse 45135 45109
114716 114774 = 59 al 86.4 pse 45233 45175
114726 114774 = 49 al 91.8 mel 387887 387935
114852 114891 = 40 al 100.0 pse 45335 45296
114853 114891 = 39 al 100.0 mel 387785 387823

92
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

114995 115013 = 21 al 85.7 pse 45404 45384
115106 115132 = 27 al 100.0 mel 387599 387625
115106 115131 = 26 al 96.2 pse 45528 45503
115232 115302 = 74 al 82.4 mel 387478 387551
116595 116622 = 28 al 92.9 mel 389264 389291
116938 116968 = 31 al 80.6 pse 43622 43592
116944 116968 = 25 al 76.0 mel 389589 389613
116980 117003 = 24 al 95.8 mel 389617 389640
116980 117003 = 24 al 95.8 pse 43588 43565
117143 117166 = 24 al 83.3 pse 43425 43403
117179 117247 = 72 al 79.2 pse 43390 43319
117210 117247 = 38 al 84.2 mel 389854 389891
118161 118189 = 31 al 87.1 pse 42992 42962
118239 118334 = 96 al 88.5 mel 390353 390447
118240 118342 = 103 al 86.4 pse 42820 42719
118376 118397 = 22 al 86.4 mel 390493 390514
118536 118590 = 55 al 87.3 pse 42551 42499
118537 118590 = 54 al 83.3 mel 390583 390634
119202 119224 = 23 al 78.3 pse 42064 42046
119262 119326 = 66 al 80.3 mel 391099 391161
119268 119328 = 62 al 82.3 pse 41998 41939
119456 119516 = 61 al 85.2 mel 391235 391294
119471 119497 = 27 al 92.6 pse 41874 41848
119669 119756 = 88 al 86.4 pse 41643 41557
119685 119756 = 72 al 88.9 mel 391427 391496
119777 119827 = 51 al 90.2 mel 391504 391554
119780 119827 = 48 al 91.7 pse 41546 41499
119981 120046 = 67 al 92.5 pse 41096 41030
119992 120053 = 64 al 79.7 mel 392235 392297
120072 120091 = 20 al 95.0 pse 41021 41002
120216 120246 = 32 al 84.4 mel 392489 392520
120216 120235 = 20 al 100.0 pse 40778 40759
121351 121410 = 61 al 95.1 pse 40557 40497
121370 121416 = 48 al 81.3 mel 392759 392806
121970 122038 = 69 al 94.2 mel 393143 393211
121971 122132 = 170 al 84.1 pse 40084 39918
122047 122135 = 91 al 91.2 mel 393230 393319
122230 122267 = 38 al 84.2 mel 393389 393426
122230 122281 = 53 al 84.9 pse 39874 39822

93
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

122393 122413 = 21 al 100.0 mel 393776 393796
122393 122416 = 24 al 95.8 pse 39757 39734
123457 123522 = 66 al 83.3 pse 39123 39058
123460 123522 = 63 al 85.7 mel 394437 394499

94
 RESULTADOS

abd-A
D. buzzatii 5H14 D.melanogaster D. pseudoobscura
DMU31961 AADE01000036
inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin
300 346 = 47 al 80.9 pse 77999 78045
317 343 = 27 al 77.8 mel 152630 152656
404 464 = 61 al 88.5 pse 78115 78175
407 456 = 50 al 94.0 mel 152739 152788
514 562 = 49 al 87.8 pse 78297 78344
518 572 = 56 al 76.8 mel 152855 152909
737 774 = 39 al 79.5 pse 78399 78437
753 780 = 28 al 78.6 mel 152948 152975
970 1052 = 83 al 84.3 mel 152998 153079
1211 1235 = 25 al 96.0 pse 79197 79221
1216 1243 = 28 al 85.7 mel 153102 153129
1363 1389 = 28 al 78.6 pse 79311 79338
1710 1727 = 18 al 100.0 pse 79528 79545
3529 3544 = 17 al 88.2 pse 81189 81205
4112 4168 = 57 al 78.9 mel 155222 155277
4125 4162 = 38 al 84.2 pse 81627 81664
4321 4344 = 24 al 79.2 pse 81880 81903
5232 5242 = 11 al 100.0 mel 156597 156607
5964 6007 = 44 al 86.4 mel 156698 156741
5974 6007 = 34 al 88.2 pse 83110 83143
6068 6129 = 62 al 82.3 pse 83226 83287
6073 6147 = 76 al 84.2 mel 156832 156907
6136 6152 = 17 al 100.0 pse 83316 83332
7240 7259 = 20 al 100.0 mel 158026 158045
7241 7259 = 19 al 94.7 pse 83955 83973
7288 7341 = 55 al 80.0 pse 84033 84087
7294 7340 = 48 al 83.3 mel 158116 158163
7433 7492 = 61 al 83.6 mel 158185 158243
7443 7480 = 38 al 86.8 pse 84203 84238
7558 7618 = 61 al 88.5 pse 84301 84361
7563 7611 = 49 al 87.8 mel 158270 158318
7689 7708 = 20 al 95.0 mel 158355 158373
7727 7763 = 37 al 75.7 mel 158376 158412
7863 7919 = 57 al 78.9 pse 84467 84523
7870 7919 = 52 al 82.7 mel 158454 158505

95
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

7992 8033 = 42 al 76.2 mel 158615 158656
7992 8022 = 31 al 80.6 pse 84646 84676
8360 8457 = 99 al 84.8 pse 85200 85298
8371 8457 = 88 al 89.8 mel 159191 159278
8462 8527 = 66 al 90.9 pse 85341 85406
8464 8527 = 64 al 93.8 mel 159292 159355
8797 8880 = 84 al 97.6 mel 159666 159749
8797 8880 = 84 al 98.8 pse 85747 85830
8907 8928 = 22 al 90.9 mel 159756 159777
8917 8930 = 14 al 100.0 pse 85856 85869
8970 9026 = 59 al 89.8 pse 85933 85989
8978 9026 = 49 al 89.8 mel 159853 159898
9368 9384 = 17 al 100.0 mel 160332 160348
9393 9496 = 104 al 80.8 mel 160380 160479
9393 9458 = 66 al 86.4 pse 86395 86460
9477 9506 = 30 al 93.3 pse 86478 86507
9595 9624 = 31 al 80.6 pse 86592 86622
9671 9691 = 21 al 85.7 pse 86675 86695
10072 10088 = 17 al 100.0 pse 86988 87004
10074 10094 = 21 al 85.7 mel 161019 161039
10134 10153 = 22 al 90.9 mel 161069 161090
10205 10230 = 26 al 80.8 pse 87107 87132
10224 10249 = 26 al 76.9 mel 161151 161175
10290 10315 = 26 al 76.9 mel 161239 161260
10341 10367 = 27 al 77.8 mel 161261 161282
10400 10432 = 33 al 81.8 pse 87356 87388
10401 10427 = 27 al 85.2 mel 161320 161346
10636 10664 = 30 al 83.3 mel 161463 161492
10638 10674 = 38 al 78.9 pse 87538 87575
10712 10723 = 12 al 100.0 pse 87606 87617
10728 10757 = 31 al 80.6 pse 87625 87655
10742 10765 = 25 al 76.0 mel 161529 161553
10993 11066 = 75 al 85.3 mel 161660 161734
11004 11070 = 68 al 83.8 pse 87776 87843
11138 11166 = 29 al 79.3 mel 161767 161795
11151 11174 = 24 al 91.7 pse 87945 87968
11249 11284 = 38 al 78.9 pse 88024 88060
11364 11395 = 35 al 74.3 pse 88123 88157
11647 11665 = 19 al 89.5 pse 88617 88635

96
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

11805 11852 = 48 al 85.4 mel 162573 162620
11808 11852 = 45 al 84.4 pse 88810 88854
11929 11984 = 56 al 94.6 mel 162713 162768
11929 11984 = 56 al 92.9 pse 88959 89014
13155 13177 = 23 al 78.3 pse 89371 89393
13379 13398 = 20 al 90.0 mel 163627 163646
13470 13491 = 22 al 81.8 pse 89549 89570
13503 13523 = 22 al 81.8 pse 89583 89604
13671 13760 = 95 al 90.5 mel 163782 163876
13676 13749 = 80 al 88.8 pse 89751 89830
13777 13799 = 24 al 87.5 pse 89881 89904
13828 13847 = 20 al 85.0 pse 89925 89944
13901 13946 = 46 al 93.5 pse 89976 90021
13902 13929 = 28 al 100.0 mel 163964 163991
13964 13985 = 22 al 95.5 mel 164050 164071
13964 14003 = 42 al 83.3 pse 90035 90075
14103 14180 = 79 al 91.1 mel 164103 164181
14103 14178 = 76 al 96.1 pse 90088 90163
14189 14211 = 23 al 78.3 pse 90173 90195
14353 14408 = 59 al 86.4 mel 164280 164338
14356 14408 = 55 al 90.9 pse 90271 90325
14734 14753 = 20 al 90.0 pse 90560 90579
14860 14885 = 26 al 80.8 pse 90692 90717
16251 16271 = 22 al 90.9 mel 165609 165630
16423 16480 = 58 al 86.2 mel 165701 165757
16430 16480 = 51 al 82.4 pse 91924 91973
16491 16516 = 26 al 92.3 mel 165761 165786
16491 16528 = 38 al 78.9 pse 91977 92011
16576 16599 = 24 al 87.5 mel 165854 165877
16625 16658 = 34 al 91.2 pse 92073 92106
16637 16657 = 21 al 95.2 mel 165899 165919
16740 16773 = 34 al 97.1 pse 92128 92161
16741 16773 = 33 al 87.9 mel 165951 165983
16817 16842 = 26 al 76.9 mel 166022 166047
16817 16845 = 29 al 79.3 pse 92208 92236
16869 16982 = 115 al 87.8 mel 166125 166239
16877 16954 = 79 al 86.1 pse 92305 92382
16990 17037 = 48 al 91.7 mel 166272 166319
16990 17081 = 98 al 86.7 pse 92389 92484

97
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

17052 17080 = 29 al 79.3 mel 166341 166367
17202 17246 = 45 al 75.6 mel 166709 166752
17206 17231 = 26 al 92.3 pse 92815 92840
17318 17425 = 115 al 74.8 pse 92925 93039
17322 17431 = 112 al 81.3 mel 166857 166968
17446 17474 = 32 al 75.0 pse 93130 93161
17460 17485 = 26 al 76.9 mel 167008 167033
17576 17662 = 87 al 88.5 pse 93248 93333
17586 17666 = 83 al 89.2 mel 167062 167144
18091 18190 = 100 al 93.0 mel 167344 167443
18097 18190 = 94 al 91.5 pse 93615 93708
18331 18417 = 87 al 86.2 pse 93750 93834
18346 18417 = 72 al 90.3 mel 167496 167565
18473 18494 = 22 al 81.8 mel 167591 167612
18674 18705 = 32 al 71.9 mel 167776 167806
18728 18750 = 23 al 78.3 mel 167816 167836
19144 19207 = 66 al 87.9 mel 168099 168164
19154 19202 = 49 al 87.8 pse 94486 94534
19285 19317 = 33 al 97.0 mel 168252 168284
19285 19319 = 35 al 94.3 pse 94664 94698
19455 19506 = 55 al 85.5 mel 168332 168386
19457 19492 = 36 al 86.1 pse 94770 94805
19595 19670 = 78 al 84.6 pse 94939 95016
19598 19655 = 58 al 86.2 mel 168463 168520
19701 19733 = 33 al 75.8 mel 168566 168598
19702 19737 = 36 al 80.6 pse 95056 95090
19765 19798 = 35 al 82.9 mel 168656 168687
19765 19798 = 34 al 91.2 pse 95131 95162
19837 19873 = 37 al 81.1 pse 95182 95218
19849 19873 = 25 al 84.0 mel 168719 168743
19944 19981 = 40 al 85.0 mel 168853 168892
19944 19971 = 28 al 96.4 pse 95324 95351
20126 20225 = 100 al 87.0 pse 95488 95587
20142 20225 = 84 al 89.3 mel 169006 169089
20958 21025 = 68 al 80.9 mel 169736 169803
20977 21022 = 46 al 80.4 pse 96425 96470
21066 21091 = 26 al 88.5 mel 169892 169917
21066 21088 = 23 al 91.3 pse 96556 96578
21370 21439 = 70 al 87.1 pse 96748 96817

98
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

21376 21453 = 78 al 87.2 mel 170040 170117
21477 21515 = 39 al 92.3 mel 170164 170202
21483 21523 = 41 al 87.8 pse 96881 96921
21531 21560 = 30 al 96.7 mel 170205 170234
21531 21560 = 30 al 96.7 pse 96922 96951
21838 21876 = 39 al 79.5 mel 170539 170577
21851 21914 = 65 al 80.0 pse 97328 97390
22541 22576 = 39 al 82.1 pse 97835 97873
22740 22849 = 110 al 84.5 pse 97946 98055
22753 22817 = 67 al 85.1 mel 171457 171522
22831 22849 = 19 al 94.7 mel 171539 171557
22866 22970 = 105 al 92.4 pse 98074 98178
22885 22971 = 87 al 96.6 mel 171599 171685
23001 23032 = 32 al 78.1 pse 98224 98255
23003 23015 = 13 al 100.0 mel 171728 171740
23284 23308 = 25 al 76.0 pse 98529 98550
23313 23361 = 50 al 80.0 pse 98561 98610
23323 23364 = 42 al 81.0 mel 172198 172239
23368 23426 = 59 al 76.3 pse 98635 98691
23382 23430 = 49 al 87.8 mel 172277 172323
23469 23494 = 27 al 85.2 mel 172378 172404
23506 23550 = 45 al 88.9 pse 98816 98860
23515 23552 = 38 al 84.2 mel 172440 172477
23608 23661 = 54 al 77.8 mel 172502 172555
23624 23663 = 40 al 82.5 pse 98881 98920
23802 23813 = 12 al 100.0 mel 172678 172689
23803 23824 = 22 al 81.8 pse 99042 99062
23875 23899 = 25 al 76.0 mel 172738 172760
23910 23934 = 25 al 80.0 pse 99140 99163
27534 27558 = 25 al 80.0 pse 102373 102397
27623 27644 = 23 al 87.0 mel 175933 175955
27625 27642 = 18 al 83.3 pse 102462 102479
27788 27827 = 40 al 82.5 mel 176034 176073
27788 27824 = 37 al 83.8 pse 102578 102614
28119 28168 = 53 al 77.4 pse 102886 102935
28916 28955 = 40 al 80.0 pse 103592 103630
28940 28962 = 23 al 78.3 mel 176712 176733
29076 29174 = 99 al 88.9 pse 103735 103833
29081 29169 = 89 al 86.5 mel 176822 176910

99
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

29307 29364 = 58 al 87.9 pse 103913 103970
29325 29365 = 41 al 90.2 mel 177045 177085
29387 29494 = 110 al 84.5 pse 103991 104099
29406 29478 = 73 al 91.8 mel 177111 177183
29557 29641 = 90 al 85.6 mel 177275 177364
29557 29596 = 40 al 97.5 pse 104236 104275
29612 29654 = 43 al 81.4 pse 104294 104336
30601 30622 = 22 al 86.4 pse 104874 104895
30625 30659 = 35 al 82.9 mel 177761 177795
30625 30690 = 66 al 84.8 pse 104920 104985
30672 30690 = 19 al 100.0 mel 177803 177821
30721 30761 = 41 al 75.6 pse 105034 105074
30723 30761 = 39 al 79.5 mel 177860 177898
30836 30929 = 94 al 81.9 mel 177951 178044
30836 30918 = 83 al 89.2 pse 105157 105239
31435 31489 = 55 al 96.4 mel 178192 178246
31439 31489 = 51 al 98.0 pse 105506 105556
31554 31579 = 26 al 76.9 pse 105615 105640
31601 31635 = 35 al 82.9 mel 178376 178410
31601 31632 = 32 al 81.3 pse 105674 105705
31645 31681 = 37 al 70.3 pse 105730 105766
31649 31681 = 33 al 75.8 mel 178441 178473
31966 31995 = 30 al 80.0 mel 178992 179021
31966 31995 = 30 al 83.3 pse 106145 106174
32156 32276 = 123 al 83.7 pse 106371 106487
32157 32263 = 109 al 88.1 mel 179181 179289
33687 33705 = 21 al 81.0 pse 106773 106793
33866 33904 = 39 al 74.4 pse 107121 107159
33931 33952 = 22 al 86.4 pse 107231 107252
34014 34052 = 40 al 82.5 pse 107291 107330
34027 34056 = 30 al 86.7 mel 180107 180136
34088 34110 = 23 al 78.3 pse 107381 107402
34141 34167 = 27 al 77.8 pse 107429 107455
34142 34168 = 27 al 77.8 mel 180196 180222
34220 34248 = 29 al 79.3 mel 180262 180290
34232 34248 = 17 al 100.0 pse 107534 107550
34279 34303 = 25 al 88.0 pse 107579 107603
34354 34431 = 78 al 85.9 pse 107702 107776
34373 34433 = 61 al 88.5 mel 180386 180446

100
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

34474 34515 = 43 al 83.7 pse 107784 107826
34475 34513 = 39 al 84.6 mel 180455 180493
34657 34688 = 32 al 81.3 mel 180566 180596
34657 34698 = 42 al 88.1 pse 107843 107884
34782 34829 = 48 al 83.3 pse 107929 107976
34783 34826 = 44 al 81.8 mel 180644 180687
34867 34892 = 26 al 92.3 mel 180744 180768
34867 34944 = 82 al 81.7 pse 108046 108122
34897 34919 = 25 al 80.0 mel 180778 180802
34938 35010 = 73 al 87.7 mel 180847 180919
34947 35010 = 64 al 87.5 pse 108137 108200
36293 36367 = 75 al 84.0 pse 108918 108988
36299 36367 = 69 al 85.5 mel 181825 181890
36386 36421 = 36 al 77.8 pse 109009 109044
36401 36419 = 19 al 89.5 mel 181914 181932
36512 36596 = 87 al 77.0 mel 181967 182053
36547 36594 = 48 al 85.4 pse 109143 109190
36688 36757 = 70 al 87.1 pse 109355 109420
36690 36740 = 51 al 94.1 mel 182446 182496
36810 36833 = 24 al 91.7 pse 109443 109466
36816 36826 = 11 al 100.0 mel 182538 182548
36953 36977 = 25 al 84.0 pse 109542 109565
37041 37078 = 40 al 80.0 pse 109567 109606
37050 37066 = 17 al 94.1 mel 182671 182687
37204 37219 = 16 al 100.0 mel 182776 182791
37204 37219 = 16 al 100.0 pse 109709 109724
37267 37343 = 77 al 90.9 mel 182850 182926
37267 37343 = 77 al 92.2 pse 109768 109844
37422 37518 = 97 al 88.7 pse 109922 110017
37427 37530 = 104 al 82.7 mel 182989 183091
37543 37556 = 14 al 100.0 mel 183119 183132
37543 37572 = 30 al 83.3 pse 110048 110077
37594 37627 = 34 al 76.5 pse 110114 110146
37599 37625 = 27 al 81.5 mel 183188 183214
37678 37803 = 126 al 80.2 pse 110147 110272
37679 37775 = 97 al 82.5 mel 183215 183311
42033 42056 = 24 al 79.2 pse 112138 112161

101
 RESULTADOS

CG17836-CG14290
D. buzzatii 40C11 D.melanogaster D. pseudoobscura
AE003724 AADE001000175
inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin
69953 69874 = 83 al 81.9 pse 313 395
69794 69762 = 33 al 78.8 pse 475 507
69632 69607 = 26 al 92.3 pse 641 666
69555 69525 = 31 al 80.6 pse 732 762
69512 69448 = 67 al 76.1 pse 769 835
69137 69109 = 29 al 79.3 mel 54961 54989
68556 68531 = 26 al 76.9 pse 1167 1192
67779 67755 = 25 al 76.0 mel 57456 57479
67719 67687 = 33 al 90.9 pse 1919 1949
67717 67662 = 56 al 82.1 mel 57532 57587
67658 67622 = 37 al 78.4 pse 1909 1942
67637 67580 = 62 al 80.6 mel 57597 57658
67597 67550 = 48 al 83.3 pse 2007 2054
67575 67532 = 48 al 77.1 mel 57663 57710
67457 67421 = 37 al 75.7 pse 2182 2217
67161 67047 = 117 al 89.7 pse 2502 2616
67148 67047 = 103 al 87.4 mel 58061 58163
67026 66997 = 30 al 86.7 mel 58187 58216
67026 66997 = 30 al 93.3 pse 2640 2669
66966 66915 = 56 al 78.6 mel 58240 58295
66966 66929 = 39 al 89.7 pse 2706 2744
65976 65954 = 24 al 95.8 mel 59263 59286
65976 65924 = 57 al 82.5 pse 3829 3885
65945 65924 = 22 al 90.9 mel 59300 59321
65885 65851 = 35 al 97.1 pse 3925 3959
65884 65847 = 38 al 94.7 mel 59370 59407
65797 65722 = 78 al 84.6 pse 4005 4081
65791 65723 = 71 al 83.1 mel 59444 59514
64307 64285 = 25 al 76.0 pse 4631 4655
63430 63413 = 18 al 88.9 pse 5181 5198
61461 61450 = 12 al 100.0 mel 62855 62866
61240 61216 = 26 al 76.9 mel 62991 63016
61237 61212 = 27 al 88.9 pse 7929 7955
59356 59327 = 30 al 80.0 pse 9792 9821
59264 59247 = 19 al 94.7 pse 9859 9877

102
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

59221 59197 = 25 al 76.0 mel 64919 64943
58424 58393 = 36 al 75.0 mel 65814 65848

103
 RESULTADOS

CG31363
D. buzzatii 5H14 D.melanogaster D. pseudoobscura
AE003692
inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin
59041 59017 = 25 al 80.0 mel 70059 70083 AADE01002495
59041 59008 = 38 al 78.9 pse 11971 11934
58917 58891 = 27 al 77.8 mel 70206 70232
58114 58095 = 21 al 85.7 pse 10251 10231
57090 57064 = 30 al 80.0 mel 75953 75982
56143 56123 = 21 al 100.0 mel 76122 76142
56113 56073 = 41 al 90.2 pse 6029 5989
56091 56067 = 25 al 96.0 mel 76215 76239
56007 55976 = 32 al 81.3 pse 5908 5877
55994 55957 = 38 al 84.2 mel 76302 76339
55607 55585 = 25 al 76.0 mel 76904 76927
55332 55299 = 34 al 91.2 pse 4920 4888
55320 55298 = 23 al 100.0 mel 77264 77286
55297 55275 = 23 al 95.7 pse 4870 4848
55293 55270 = 28 al 78.6 mel 77299 77326
51694 51682 = 13 al 100.0 pse 2602 2590
51394 51371 = 25 al 76.0 mel 81016 81040
50844 50812 = 33 al 87.9 mel 81456 81488
50844 50812 = 33 al 87.9 pse 1595 1563
50778 50759 = 20 al 90.0 mel 81500 81519
50778 50759 = 20 al 90.0 pse 1507 1488
50561 50534 = 28 al 89.3 mel 81610 81636
50561 50533 = 31 al 83.9 pse 1293 1263
50510 50484 = 28 al 78.6 mel 81672 81699
49361 49335 = 27 al 81.5 pse 889 866
35316 35291 = 26 al 80.8 mel 84411 84435 AADE01000322
29277 29253 = 25 al 88.0 pse 884 860
27772 27750 = 23 al 78.3 mel 85276 85298
26246 26222 = 25 al 76.0 pse 738 762
25320 25295 = 26 al 80.8 mel 90906 90931
22691 22654 = 38 al 76.3 pse 1026 1063
22568 22545 = 26 al 80.8 pse 1257 1282
22123 22091 = 33 al 78.8 pse 1341 1373
19528 19502 = 28 al 75.0 pse 8256 8283
19390 19368 = 23 al 87.0 pse 8395 8417

104
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

17336 17312 = 26 al 76.9 mel 93578 93602
17268 17245 = 24 al 87.5 pse 16983 17006
16722 16675 = 48 al 79.2 pse 19213 19260
15114 15091 = 24 al 79.2 mel 94199 94222
15079 15053 = 27 al 81.5 pse 65030 65056
12663 12639 = 25 al 76.0 mel 94350 94374
1694 1669 = 26 al 80.8 mel 95860 95885
1190 1169 = 22 al 81.8 mel 96324 96345

105
 RESULTADOS

CG1288-CG14609-CG2520
D. buzzatii 40C11 D.melanogaster D. pseudoobscura
AE003672 AADE000014
inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin
1087 1167 = 82 al 86.6 mel 125136 125056
1095 1156 = 62 al 93.5 pse 204478 204539
1228 1249 = 22 al 95.5 mel 125042 125021
1233 1266 = 34 al 82.4 pse 204564 204594
1288 1306 = 19 al 100.0 mel 124977 124959
1303 1368 = 71 al 81.7 pse 204680 204749
1317 1377 = 67 al 80.6 mel 124936 124870
2386 2416 = 31 al 93.5 mel 124735 124706
2673 2702 = 30 al 83.3 pse 205258 205286
2854 2886 = 33 al 84.8 pse 205482 205514
2857 2886 = 30 al 90.0 mel 123983 123954
2982 3022 = 42 al 85.7 mel 123858 123817
2983 3022 = 43 al 79.1 pse 205672 205714
3054 3079 = 26 al 96.2 mel 123398 123373
3054 3081 = 28 al 96.4 pse 205765 205792
3170 3235 = 68 al 91.2 pse 205816 205883
3175 3268 = 103 al 81.6 mel 123342 123241
3236 3258 = 23 al 91.3 pse 205893 205915
3297 3308 = 12 al 100.0 pse 205965 205976
4378 4398 = 21 al 85.7 pse 206342 206361
4388 4411 = 26 al 84.6 mel 122681 122656
4488 4529 = 42 al 78.6 pse 206379 206417
4499 4522 = 24 al 91.7 mel 122622 122599
4720 4779 = 60 al 81.7 mel 122404 122345
4731 4781 = 51 al 90.2 pse 206679 206729
4792 4818 = 28 al 78.6 pse 206739 206764
8582 8609 = 28 al 78.6 pse 208343 208367
8626 8661 = 36 al 83.3 pse 208396 208431
8628 8672 = 45 al 88.9 mel 120781 120737
8704 8742 = 39 al 89.7 mel 120713 120675
8708 8736 = 29 al 96.6 pse 208466 208494
8965 8989 = 25 al 80.0 mel 120566 120542
9021 9048 = 28 al 82.1 mel 120518 120495
9024 9048 = 25 al 88.0 pse 208671 208695
10255 10286 = 33 al 90.9 mel 120408 120376

106
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

10414 10445 = 32 al 84.4 mel 120253 120223
10485 10528 = 46 al 78.3 mel 120188 120143
10495 10528 = 34 al 85.3 pse 209019 209052
10628 10648 = 21 al 81.0 pse 209162 209182
10701 10757 = 57 al 86.0 mel 119971 119915
10701 10751 = 51 al 88.2 pse 209245 209295
10787 10817 = 31 al 87.1 pse 209341 209371
10798 10817 = 20 al 100.0 mel 119853 119834
11213 11238 = 26 al 100.0 mel 119395 119370
11249 11299 = 51 al 94.1 pse 209862 209912
11255 11296 = 42 al 97.6 mel 119306 119265
11478 11548 = 73 al 83.6 pse 210050 210121
11481 11558 = 83 al 83.1 mel 119114 119034
11854 11884 = 32 al 87.5 pse 210337 210368
11890 11919 = 32 al 78.1 pse 210378 210409
11905 11927 = 24 al 79.2 mel 118736 118713
11935 11994 = 60 al 90.0 mel 118705 118646
11935 11994 = 60 al 90.0 pse 210430 210489
12003 12063 = 61 al 88.5 mel 118637 118577
12009 12063 = 55 al 96.4 pse 210562 210616
12095 12123 = 29 al 89.7 pse 210657 210684
12202 12237 = 36 al 83.3 mel 118476 118441
12209 12238 = 30 al 86.7 pse 210772 210801
12501 12512 = 12 al 100.0 pse 210992 211003
12953 12977 = 25 al 76.0 mel 118166 118142
12957 12978 = 22 al 86.4 pse 211203 211224
13051 13084 = 34 al 82.4 mel 118076 118043
13066 13089 = 25 al 76.0 pse 211309 211333
13314 13353 = 40 al 75.0 mel 117904 117869
13331 13350 = 22 al 81.8 pse 211476 211497
14000 14018 = 19 al 89.5 mel 117553 117536
14135 14160 = 27 al 77.8 mel 117419 117393
14152 14193 = 42 al 76.2 pse 212021 212061
14294 14332 = 39 al 82.1 mel 117249 117211
14294 14321 = 28 al 92.9 pse 212223 212250
14391 14422 = 34 al 82.4 mel 117177 117146
31047 31063 = 17 al 100.0 mel 114662 114646
31047 31063 = 17 al 100.0 pse 214754 214770
33813 33839 = 28 al 85.7 pse 217958 217985

107
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

34470 34584 = 115 al 93.9 pse 218563 218675
34477 34617 = 142 al 89.4 mel 111407 111271
34632 34659 = 29 al 82.8 mel 111259 111231
34700 34737 = 38 al 78.9 mel 111230 111193
34759 34785 = 27 al 77.8 mel 111155 111132
34766 34791 = 26 al 76.9 pse 218763 218788
34824 34916 = 100 al 84.0 mel 111087 110989
34842 34941 = 108 al 84.3 pse 218800 218904
35079 35103 = 28 al 78.6 pse 219030 219057
35104 35131 = 29 al 75.9 pse 219070 219098
35222 35244 = 23 al 82.6 mel 110757 110736
35240 35262 = 25 al 80.0 pse 219201 219225
35395 35407 = 13 al 100.0 mel 110534 110522
35530 35564 = 35 al 77.1 mel 110424 110391
35712 35749 = 38 al 76.3 pse 219664 219700
35831 35996 = 167 al 92.2 pse 219837 220000
35834 35996 = 163 al 92.6 mel 110153 109993
36641 36769 = 132 al 85.6 pse 220355 220486
36654 36780 = 127 al 85.8 mel 109640 109514
36793 36816 = 24 al 79.2 pse 220516 220539
36902 36935 = 34 al 97.1 mel 109431 109398
36908 36980 = 73 al 83.6 pse 220643 220712
36941 36978 = 38 al 84.2 mel 109386 109349
37133 37154 = 22 al 86.4 mel 109149 109129
37215 37249 = 36 al 83.3 mel 109041 109006
37222 37249 = 30 al 90.0 pse 221103 221132
37292 37360 = 73 al 82.2 pse 221161 221233
37307 37373 = 69 al 85.5 mel 108953 108885
38385 38399 = 15 al 100.0 pse 221993 222007
38431 38452 = 22 al 100.0 mel 108293 108272
38508 38538 = 31 al 83.9 pse 222196 222226
38513 38567 = 55 al 81.8 mel 108137 108083
38549 38579 = 31 al 77.4 pse 222243 222273
38661 38687 = 27 al 88.9 mel 107971 107945
38755 38781 = 27 al 77.8 mel 107904 107878
39281 39414 = 134 al 87.3 mel 107430 107297
39281 39398 = 118 al 88.1 pse 222832 222949
39399 39422 = 24 al 79.2 pse 222961 222984
39516 39573 = 60 al 88.3 mel 107145 107087

108
 RESULTADOS

inicio fin tamaño % inicio fin inicio fin

39517 39572 = 60 al 81.7 pse 223117 223174
39909 39978 = 72 al 90.3 pse 223491 223562
39915 39978 = 64 al 93.8 mel 106770 106707
40440 40488 = 49 al 77.6 mel 106275 106230
40440 40488 = 49 al 79.6 pse 224044 224089
40515 40540 = 26 al 80.8 mel 106179 106154
40669 40694 = 26 al 76.9 pse 224157 224182
41702 41721 = 20 al 90.0 mel 104921 104902
42098 42134 = 37 al 78.4 pse 225399 225434
42100 42127 = 28 al 78.6 mel 104778 104755
42189 42223 = 36 al 80.6 mel 104703 104671
42199 42221 = 23 al 82.6 pse 225502 225523
42853 42875 = 24 al 79.2 pse 226598 226620
45071 45095 = 25 al 76.0 pse 227757 227781
46972 46997 = 26 al 92.3 mel 102031 102006
46972 46996 = 25 al 92.0 pse 228673 228697
47087 47134 = 48 al 89.6 mel 101953 101906
47090 47134 = 45 al 95.6 pse 228761 228805
47137 47162 = 26 al 76.9 pse 228812 228833
47431 47458 = 28 al 78.6 pse 229124 229151

109
RESULTADOS

Correspondence of regulatory sequences shown in Figure 3 with their domains of

expression

labial gene (CHOUINARD y KAUFMAN 1991)

1 No Enhancer Activity
2 Anterior Midgut
3 Maintenance in Procephalon; Eye-Antennal Disc
4 Initiation in Procephalon
5 Imaginal Disc Repressor
6 No Enhancer Activity
7 Dorsal Ridge
8 Posterior Midgut
9 Late Embryonic Head Expression
10 No Enhancer Activity

proboscipedia gene (KAPOUN y KAUFMAN 1995)

1 Imaginal Antennal and Thoracic Enhancers
2 Basal Promoter
3 Embryonic Mesodermal, Maxillary, and Labial Lobe Enhancers
4 Embryonic Maxillary and Labial Lobe Enhancers and Labial Discs Enhancers
5 Late Embryonic Labial Lobe Enhancers (weak) and Labial Discs Enhancers
6 Redundant Maxillary and Labial Lobe Enhancers
7 “Cryptic” Enhancers

110
 RESULTADOS

A lab550 HOMRE (Homeotic Response Element)

mel ggagcggtga cagtcggcgc cgggcaatcc atcaatttgg ttgcagtgcc aattacgcca gttact

pse .......... .......... .......... .........- -.....c... .......... ......
buz .....ttg.. .....-...a .......... .........- -.....c... .......a.t ......
HTH MAD-MEDEA LAB EXD binding sites

B iab2(1.7) (fragment) HB KR CNS

mel actgttcagt ctcataaaaa atgcagcgga aactagaaaa aatcacaatg attta----c aactgcagcc gagcaacata tacaattctg cacctttca-
pse ....ccg.a. a......... .....ta..t ttga----.. .cc.ga.... .....----. .g.....a.t ...a.cgca. cgg.gaatc. ..aga.atgc
buz ---------- ---------- ---------- ---------- ...t.tg..t ta.g.tatg. ....a....g .----.a..c .g..caaa.. .........-

mel --------ta atattacgta aaaattgtcc cttttttatt ttgtctgctt gaacagt--- -taccgttgg aaagtcgcaa cttgca-aac cataaaaaat
pse acctttcac. g.......c. .......... t......... ----.g...c ...tgt.gtt g..gt.--.. .......... ....a.-... ..........
buz --------a. ........c. ...tc..... ...gca.-.g .....g..-- ---------- ---------- -.ct...... .....cc... ..........

mel –tgccgttga catgaaaacc ttttgccag- -aaaactcgg cacaaaggca gcagtgcaaa aaaga----- --agagacat gaaa------ -gccataaaa
pse –...t.cc.. ..c......a ....a.ag.a a........a .......ca. .a.ca.ag.g .g...ggcac ag........ a...------ -.........
buz a.....c... .g.a...... ...ataa.a- -..------- ---------. -------... ...a.----- --c..a.a.. tg..aggtgc t.t.......

mel cggcaagcgg gtat----aa gtga-----g aggctgttag gctgggact- ---gggacag caatttgtag atagcgaatt tttgatttcc gtaacataaa
pse .......... tcgaccca.. ....-----. .....c.g.t c.----.gag gat.c.g... .......... ........a. .......... .a........
buz .a........ .-.a----.. c...tgcct. .cca..ca.t tt.----.-- ---------- --------.. .....t..a. .a........ aa........

mel cacggagcct gtgccattcc g--------- ---------- ---------- -agcgcatct –ccgcacacc gtcgcgcaaa aaattcgcac aggtagcatg
pse .......... ...------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------.... .......... .......... .......g..
buz ....a.a.a. aaa.gca.t. ccatttctac tattctgctg caattccctt tgctg..... gc..c.c... a.....t... .......t.. .......g..

mel gaaaattgct aaaaataaga aacaaaaa-- ---------- -actagacaa g----aaagt agagaaagga atgcggg--- gaaaatcggg gaaaag-cgc
pse ......c.g. .....a.ga. ..t..c.c-- ---------- -.ag.at.gc ctggc.t..g ..c.t.g.a. .---ac.--- .....c..a. tc....a.a.
buz c.g....taa .....a..a. .ga.g...ta aaaacagcca g..a.at... c----....a .a.tc...a. .a.t.a.aca ....gg.at. .....c-gtt

mel tgg------c tgctggccac cagggcgaga cctgccgctg ggcgagtcgg tgtcggtatt ggta------ --gcttcacc Cttt-cacgc actgcgtgcg
pse a..gccata. ......g... .gc....... ........a. c.g...c... ...------- -..t------ --t....... ....-..t.. .........a
buz .c.------. .------..a .cca...g.. gt..gt...a caaa..ct.c .tct.c.tc. .c.tctgctt ct........ ....a..t.. cg...agt..

Figure S1. Detail of two CRM. Fragments of the AVID alignments (mel/pse and mel/buz) used
to generate the VISTA plots of Figure 3. (A) lab550-HOMRE (Homeotic Response Element):
The four binding sites of this CRM are conserved between all three species in one CNS. (B)
iab2(1.7) (fragment): All species show five Hunchback (HB) binding sites (three are conserved
between all three species; one is shared by D. melanogaster and D. pseudoobscura; another one
is shared by D. pseudoobscura and D. buzzatii; and there is one unique in D. melanogaster and
another one in D. buzzatii); a unique Krüppel (KR) binding site, where point mutations (red
uppercase) in D. melanogaster cause gain of expression mutants (Hab1 and Hab2) (Shimell et
al. 1994), is conserved in all three species. This region contains 9 CNS in the D. melanogaster-
D. pseudoobscura comparison and 6 CNS between D. melanogaster-D. buzzatii. PATCH
(http://www.gene-regulation.com/cgi-bin/pub/programs/patch/bin/patch.cgi) was used for
Hunchback binding site prediction in the iab2(1.7) enhancer.

111
RESULTADOS

Figure S2. Expression pattern of pb in imaginal discs. Labial disc: pb is expressed in the
labial disc of late third instar larvae and prepupae of the four tested species. Expression is
detected over the whole disc, which will give rise to the proboscis. Eye-antennal disc: pb is also
expressed in the presumptive palpus (arrowhead) of the eye-antennal disc of prepupa and white
pupa, which will give rise to the maxillary palps. In overstained discs some pb expression can
be detected in the presumptive ocellus. Some staining has also been observed in the lateral side
of the stalk in white pupae eye-antennal discs of D. repleta. However, it has not been
determined whether this expression domain is shared by the other species, as this region is
easily broken.

Figure S3. Expression pattern of lab in embryos. Cephalic region: lab is expressed in a
ventral stripe just anterior to the cephalic furrow, which corresponds to the intercalary segment
(black arrow). This domain of expression was first detected at stage 6 in D. buzzatii and at stage
8 in the other species. Later on lab is expressed in the dorsal ridge (white arrow) (stage 11-13)
and in sensory structures derived from the intercalary segment (boxed area). Midgut: at stage 8
lab expression is detected weakly in the anterior and posterior midgut primordial (arrowheads).
When the two primordia fuse (stage 12-13) lab expression in this region suddenly increases.
Expression is kept at high levels in the second midgut constriction and finally in the second
midgut chamber (stage 17).

112
 RESULTADOS

Figure S4. Expression pattern of lab in the eye-antennal disc. Expression of lab was detected
in the peripodial membrane of the eye-antennal disc from late third instar larvae and prepupae.
This region will give rise to the lateral and posterior head capsule. No expression has been
detected in other imaginal discs.

Figure S5. Expression pattern of abdA in embryos. ABD-A protein is detected in

parasegments 7 through 13 (PS7-13). It is first detected in the ectoderm at stage 10 and later on
(stage16-17) is detected on the ventral nervous system.

Figure S6. Expression pattern of abdA in imaginal discs. Female genital disc: ABD-A
protein is observed in the presumptive internal genitalia region (derived from the A8 segment)
of the female genital disc. Proper staining with anti-ABD-A was only obtained for D.
melanogaster and D. buzzatii. All imaginal discs were tested for abdA expression. Central
nervous system of the larva: ABD-A protein is always detected in seven stripes in the larval
central nervous system of the four species, although the morphology of the larval central
nervous system is slightly different.

113
RESULTADOS

114
3. DISCUSIÓN
 DISCUSIÓN

3.1 EVOLUCIÓN DE LAS REGIONES CIS-REGULADORAS

Las regiones cis-reguladoras controlan el momento y el lugar en el que se

expresan los genes, y son los cambios en la regulación génica los responsables de gran
parte de la variabilidad fenotípica. Actualmente la comparación de secuencias no
codificantes se está conviertiendo en una importante herramienta para la detección de
regiones reguladoras, aunque todavía quedan muchos interrogantes sobre como detectar
las regiones funcionales (CLARK 2001) o sobre la relación entre la conservación de las
secuencias y su función (LUDWIG et al. 2000).
Dos estudios con muestras finitas de regiones (BERGMAN y KREITMAN 2001;
BERGMAN et al. 2002) muestran la utilidad de los estudios comparativos entre D.
pseudoobscura y D. melanogaster para la detección de regiones cis-reguladoras. De la
comparación del genoma completo, RICHARDS et al. (2005) concluyen que estas
especies están demasiado alejadas para este tipo de estudio, y sugieren el uso de
especies más cercanas a D. melanogaster. Teniendo en cuenta estos datos y los
resultados aquí obtenidos y descritos (ver Artículo 2), podemos deducir que el tiempo
de divergencia “ideal” para estas comparaciones depende del tipo de genes a estudiar.
Como hemos mostrado, para genes de desarrollo con patrones complejos de expresión
como son los genes Hox, distancias mayores como la que hay entre D. buzzatii y D.
melanogaster son adecuadas. Para obtener una idea global y poder detectar regiones
reguladoras de genes bajo diferentes niveles de regulación, sería necesario disponer de
secuencias de varias especies situadas a diferente distancia filogenética. La adición de
una tercera especie a las comparaciones mejora notablemente la detección de secuencias
involucradas en la expresión génica (KOLBE et al. 2004). Seria muy informativo
disponer de varias especies a esta distancia así como especies cercanas a cada una de
ellas. La comparación de varias especies a diferentes tiempos de divergencia es lo que
propone precisamente la técnica del sombreado filogenético (phylogenetic shadowing),
lo que permite en principio detectar regiones funcionales importantes para diferentes
grupos de especies (BOFFELLI et al. 2003; CLARK et al. 2003). Para regiones del tipo de
los genes Hox haría falta añadir especies más alejadas para identificar en más detalle las
regiones cis-reguladoras. En cambio para genes con menos regulación, las especies a
añadir deberían ser más cercanas.
Los genes con expresión compleja durante el desarrollo requieren una región de
DNA no codificante mayor para albergar las regiones reguladoras necesarias para

117
DISCUSIÓN

desarrollar el patrón completo (NELSON et al. 2004). Esta tendencia se ve claramente en

los genes Hox, los cuales poseen algunos de los intrones más largos de los genes de
Drosophila (MORIYAMA et al. 1998). Pero estos genes no solo tienen mayor tamaño de
regiones reguladoras sinó que además éstas están más conservadas. Los CNS cubren el
20-22% de la secuencia no codificante en estas regiones cuando comparamos especies
filogenéticamente distantes como D. buzzatii y D. melanogaster o D. pseudoobscura.
Este patrón también es común a los genes con expresión compleja durante el desarrollo,
los cuales muestran un nivel de conservación en las regiones no codificantes mucho
mayor que los genes con funciones metabólicas o “House-keeping” (BERGMAN y
KREITMAN 2001; BERGMAN et al. 2002; HALLIGAN et al. 2004).
Un factor que dificulta la detección de CRM a partir de la comparación de
secuencias es la presencia de reordenaciones. En el caso de los genes lab y pb hemos
detectado pequeñas inversiones de entre 1 y 2 kb que contienen secuencias altamente
conservadas pero en orientación inversa en una de las especies comparadas. Cómo un
aspecto de los CRM es que son funcionales en cualquier orientación estas
reordenaciones son probablemente neutras cuando los puntos de rotura se situan entre
CRM. Por otro lado, las regiones invertidas correspondan probablemente a CRM
individuales, de manera que la presencia de estas microreordenaciones podría utilizarse
como guía para delimitar la posición o los límites entre CRM independientes.
Otra dificultad radica en que la importancia relativa de la arquitectura y
composición de los lugares de unión para mantener la funcionalidad de los CRM a lo
largo de la evolución es un tema sin resolver. En los casos mirados con detalle, Artículo
2 Figura S1, podemos observar alguna tendencia. Cuando sólo hay un lugar de unión
para un determinado factor de transcripción, tanto su posición como su secuencia
nucleotídica son mantenidos bajo una fuerte selección purificadora. Cuando hay varios
lugares de unión para un mismo factor de transcripción, la presión selectiva que actúa
sobre él parece menor y hay por tanto una mayor variabilidad en la secuencia, el número
de lugares de unión parece permanecer constante pero no su posición o secuencia
exacta. En este segundo caso, parece haber selección estabilizadora para mantener la
composición de lugares de unión, pero no siempre el orden u orientación de estos, como
se ha mostrado en otros estudios (LUDWIG et al. 1998; LUDWIG et al. 2000; BERMAN et
al. 2004). Habitualmente habrá varias secuencias con el potencial de convertirse en
lugares de unión activos con un solo cambio nucleotídico (MACARTHUR y BROOKFIELD
2004). CNS y CRM no tienen una relación uno a uno, los CRM son más largos y suelen

118
 DISCUSIÓN

contener agrupaciones de CNS, donde cada uno contiene uno o varios lugares de unión.
Habría que estudiar más casos para ver cuán general es el patrón observado, ya que la
muestra es excesivamente pequeña. En el caso del módulo de la banda 2 de even-
skipped (eve S2E – even-skipped Stripe 2 Element) existen múltiples lugares de unión
para cada uno de los factores de transcripción involucrados (LUDWIG et al. 2000) lo que
concuerda con la observación anterior de elevada variación en la secuencia de algunos
lugares de unión.
De todos modos, esta dinámica y variabilidad en los lugares de unión no será
siempre neutra. Aunque la conservación de las secuencias no codificantes esté
demostrando ser un buén método para la detección de los módulos reguladores, no hay
que olvidar que la variabilidad fenotípica se debe en muchos casos a la variabilidad de
estas regiones (DE MEAUX et al. 2005). De manera que el uso de la conservación para la
detección de las regiones debería ir seguido de la disección de la variabilidad
nucleotídica y su posible relación con la variabilidad en la expresión génica y en último
término la variabilidad fenotípica. Debemos centrarnos en los cambios funcionales en
vez de en la conservación para entender la dinamica evolutiva a corto plazo de las
regiones cis-reguladoras.

3.2. EL HOM-C EN DROSOPHILA

3.2.1. Evolución de los genes Hox: Estructura, Regulación y Función

3.2.1.1. Hox3: zen, bcd y zen2
Muchos genes del desarrollo están extraordinariamente conservados entre
vertebrados e invertebrados, siendo los genes Hox un paradigma de esta conservación.
Por otro lado, el desarrollo de nuevas funciones y estructuras no se produce siempre
mediante la aparición de nuevos genes, sino que a menudo se basa en la reutilización de
genes existentes. Así, a pesar de esta elevada conservación incluso los genes Hox
pueden cambiar de forma dramática durante la evolución. Buen ejemplo de ello son los
genes Hox3 y ftz que han perdido su función Hox y adquirido nuevas funciones en el
desarrollo temprano de Drosophila (HUGHES et al. 2004).
En D. melanogaster, tres genes con homeobox ocupan la posición de Hox3, pero
ninguno de ellos presenta función o patrón de expresión de tipo homeótico: bcd es un
morfógeno materno implicado en el establecimiento temprano de la polaridad

119
DISCUSIÓN

anteroposterior (BERLETH et al. 1988), zen es un gen zigótico que se expresa en el tejido
extraembrionario del embrión, la amnioserosa (RUSHLOW et al. 1987), y zen2 es un gen
con patrón de expresión similar a zen pero sin función conocida ya que la ausencia de
este gen no presenta alteraciones en el fenotipo (RUSHLOW et al. 1987). Los genes bcd y
zen no son miembros del sistema Hox de determinación del patrón anteroposterior sino
que representan genes con homeodominio de evolución rápida (DE ROSA et al. 1999).
La clonación de los genes de tipo Hox3 en S. gregaria y T. castaneum mostró la
homología de este gen con zen. Mientras el homeodominio de estos genes era
claramente de la familia Hox3, tanto motivos de secuencia fuera del homeobox como su
patrón de expresión en los tejidos extraembrionarios mostraban que eran homólogos del
gen zen de D. melanogaster (FALCIANI et al. 1996). La descripción, en el ácaro
Archegozetes longisetosus, de un gen homólogo a zen pero con patrón de expresión tipo
Hox confirmó que en realidad zen era el gen Hox3 modificado (TELFORD y THOMAS
1998). En este organismo Hox3 presenta un patrón de expresión ampliamente solapado
con pb, coincidiendo en su límite anterior, lo que llevó a la hipótesis de que deben
presentar una cierta redundancia funcional. Esta redundancia entre pb y Hox3 habría
sido aprovechada por los insectos para utilizar Hox3 para una nueva función (FALCIANI
et al. 1996; TELFORD y THOMAS 1998). Un estudio reciente en el insecto áptero
Thermobia domestica muestra que Hox3 todavía retiene el patrón de expresión Hox,
pero ha extendido su expresión a los tejidos extraembrionarios (HUGHES et al. 2004). En
el ancestro de los insectos alados, como S. gregaria o T. castaneum, este gen perdió su
dominio de expresión Hox y reforzó su expresión en los tejidos extraembrionarios
(FALCIANI et al. 1996). El gen Hox3 parece haber evolucionado directamente a zen
durante la diversificación de los insectos (HUGHES et al. 2004).
Posteriormente, durante la diversificación de los dípteros, zen adquirió un nuevo
dominio de expresión que provee un aporte materno en el embrión (STAUBER et al.
2002). Una duplicación de este gen en la línea de las moscas ciclorrafas permitió la
separación de ambos dominios de expresión, dando lugar a dos genes con funciones
diferenciadas: el morfógeno materno bcd y el gen zigótico zen (STAUBER et al. 1999;
STAUBER et al. 2002).
Una segunda duplicación de zen originó el gen zen2. Un análisis comparativo de
la estructura del ANT-C entre D. pseudoobscura y D. melanogaster fue incapaz de
detectar un homólogo de zen2 ni en la región estudiada ni en el resto del genoma, de
manera que se pensó que zen2 era una duplicación muy reciente en el linaje de D.

120
 DISCUSIÓN

melanogaster (RANDAZZO et al. 1993). En D. subobscura las evidencias también

parecían indicar la ausencia de zen2 (TEROL et al. 1995). Pero en el análisis de la
secuencia de la región pb en D. buzzatii, se predijo un gen entre pb y zen que parecía ser
el homólogo de zen2. La localización de zen2 en D. buzzatii en la misma posición que
en D. melanogaster, aunque en orientación invertida, nos llevó a mirar en detalle la
secuencia de esta región en D. pseudoobscura. En esta especie zen2 se encuentra
también entre pb y zen, y en la misma orientación que en D. buzzatii.
Curiosamente, una búsqueda usando BLASTN con la secuencia del mRNA de
zen2 de D. melanogaster (NM_057446) contra las secuencias derivadas de los
ensamblajes genómicos (WGS – Whole Genome Shotgun) da un mejor resultado con la
secuencia del gen zen de D. pseudoobscura (49 bp; E=0.002) que con el gen zen2 de
esta misma especie (29 bp; E=6.6). Pero cuando la búsqueda se realiza utilizando las
secuencias aminoacídicas (TBLASTN) la proteína zen2 de D. melanogaster identifica a
zen2 de D. pseudoobcura, y zen de D. melanogaster identifica al gen zen de D.
pseudoobscura. Estos resultados, debidos a la rápida divergencia de los genes zen2,
explicaría los resultados obtenidos por RANDAZZO et al. (1993) que hicieron pensar en
la ausencia de zen2.
La existencia de este gen en D. pseudoobscura y D. buzzatii indica que es
bastante más antiguo de lo supuesto hasta ahora, la duplicación que lo originó fue
anterior a la divergencia de los subgéneros Sophophora y Drosophila. Al pensarse que
zen2 era más reciente, los trabajos de STAUBER et al. (1999; 2002) no han intentado
identificarlo en otros grupos de dípteros, así que la existencia de este gen en otras
especies fuera del género Drosophila es todavía una incognita, al igual que la edad de la
duplicación.
Así como la primera duplicación de Hox3-zen permitió una subdivisión
funcional, esta segunda duplicación no parece haber tenido el mismo efecto. De
momento zen2 parece ser un gen superfluo con el mismo patrón de expresión que zen, al
menos en D. melanogaster. De todos modos, el mantenimiento del ORF en las tres
especies de Drosophila que divergieron hace entre 40 y 62 millones de años (POWELL y
DESALLE 1995; RUSSO et al. 1995; TAMURA et al. 2004) hace pensar que pueda tratarse
de un gen funcional, aunque su elevada tasa de substitución podría ser indicativo de un
gen en proceso de adquirir una nueva función.

121
DISCUSIÓN

En las tres especies de Drosophila analizadas, el gen zen2 está situado dentro de
las regiones reguladoras de pb, aunque en orientaciones diferentes. Esta situación se
podría interpretar como que la orientación ancestral es la común a D. pseudoobscura y
D. buzzatii, y que el gen se ha invertido en D. melanogaster. Pero el hecho que las
duplicaciones en tándem suelen dar lugar a dos genes situados en la misma orientación
y la posición de zen2 situado entre el promotor basal de pb y sus regiones cis-
reguladoras, apuntan a una evolución más compleja.
Después de las dos duplicaciones que dieron lugar a zen, bcd y zen2 a partir del
gen Hox3 tuvieron lugar dos inversiones (Figura 15). Una primera inversión con un
punto de rotura entre el promotor basal de pb y sus regiones reguladoras 5’ y el otro
entre zen y zen2 se habría producido en el ancestro de los subgéneros Drosophila y
Sophophora, dando lugar a la estructura que observamos en D. pseudoobscura y D.
buzzatii. Una segunda inversión, en el linaje de D. melanogaster, afectó únicamente al
gen zen2. Esta segunda inversión habría reutilizado el punto de rotura entre zen2 y el
promotor basal de pb, y tendría el segundo punto de rotura entre zen2 y la región
reguladora 5’ de pb. Este modelo explica, mediante solo dos inversiones, la orientación
del gen zen2 y la posición de las regiones reguladoras de pb en las tres especies donde
se ha analizado la región.

Figura 15. Modelo de evolución del gen Hox3.

Figure 15. Model of evolution of the Hox3 gene.

3.2.1.2. lab
labial (lab) es el gen más proximal del ANT-C de D. melanogaster (WAKIMOTO
y KAUFMAN 1981). Corresponde al primer grupo parálogo (PG1). Los mutantes para

122
 DISCUSIÓN

este gen presentan letalidad en el embrión, morfológicamente se observa ausencia de

estructuras cefálicas pero no transfomaciones homeóticas obvias. En el adulto, según
observaciones de mutaciones hipomórficas y análisis clonal, se producen ausencia de
estructuras ventrales, como los palpos maxilares, y alteraciones en la región dorsal de la
cabeza que muestra apariencia de tejido torácico (MERRILL et al. 1989). El producto del
gen lab se acumula en un patrón complejo en tejidos embrionarios e imaginales que
podemos agrupar en dos dominios de expresión durante la morfogénesis: el primero en
la cabeza, es el gen Hox expresado en una región más anterior, y el segundo en una
región del intestino (MLODZIK et al. 1988; DIEDERICH et al. 1989; DIEDERICH et al.
1991). Durante la embriogénesis, lab se expresa en células endodérmicas del intestino,
en células ectodérmicas del procefalon y el cresta dorsal, y en un pequeño grupo de
células progenitoras sensoriales. La expresión imaginal se limita a una región estrecha
de la membrana peripodial del disco de ojo-antena (CHOUINARD y KAUFMAN 1991).
Se interpreta que la expresión de lab en la cabeza del embrión marca el
segmento intercalar, pequeño metámero desprovisto de apéndices y situado entre el
lóbulo procefálico y el gnathocephalon, que consiste en los lóbulos mandibulares,
maxilares y labiales (DIEDERICH et al. 1991; ABZHANOV y KAUFMAN 1999). El gen lab
es necesario para la correcta involución cefálica. Las células que expresan lab en los
lóbulos procefálicos parecen estar situadas en puntos clave respecto a los movimientos
celulares que conlleva el proceso de involución. Este proceso, que resulta gravemente
alterado en los mutante para lab, parece ser el responsable de los defectos observados en
estos mutantes. La pérdida de las glándulas salivales, la pieza H, y el brazo ventral del
aparato cefalofaríngeo parece que no son debidas directamente a la falta de
especificación por lab, sino una consecuencia secundaria de la disrupción del proceso
de involución (MERRILL et al. 1989). Dentro del segmento intercalar lab también se
expresa en el tritocerebro, donde su inactivación produce defectos en la elongación de
axones (HIRTH et al. 1998). La acción de lab es necesaria para la diferenciación
neuronal en el cerebro en desarrollo (HIRTH et al. 1998).
La expresión de lab en el intestino coincide con las células del cobre. lab tienen
un papel no solo en la determinación y diferenciación de estas células, sino también en
el mantenimiento de su estado diferenciado. Estas células parece que absorben iones
metálicos del lúmen intestinal (HOPPLER y BIENZ 1994) y que están involucradas en la
acidificación del intestino. La conservación de la expresión del gen lab en el intestino

123
DISCUSIÓN

del embrión en desarrollo en las diferentes especies analizadas muestra que esta función
fue adquirida por lab por lo menos antes de la diversificación del género Drosophila.
La comparación de la secuencia codificante de lab realizada entre tres especies
de Drosophila (ver Artículo 1) muestra una elevada tasa de substitución nucleotídica. Se
contrastó la posibilidad de una variación en la tasa de substitución nucleotídica como
consecuencia del cambio de posición. Los resultados mostraron una tasa homogénea a
lo largo de la divergencia del género, aunque heterogénea a lo largo de la región
codificante. La región más conservada corresponde al homeobox, pudiendose observar
la presencia de otras pequeñas regiones que se encuentran también conservadas, a nivel
de proteína, en especies alejadas como T. castaneum o incluso en Humanos. Esta
conservación a nivel de dominio proteicos explica como minigenes de Hoxb-1 de pollo,
expresados bajo el control de regiones reguladoras de lab de D. melanogaster, eran
capaces de rescatar mutantes nulos para lab (LUTZ et al. 1996). Aunque para algunas
funciones del gen los cambios en la proteína pueden ser significativos, para otras
funciones es más importante el momento y lugar de expresión, es decir, las regiones cis-
reguladoras.

Las regiones reguladoras de lab fueron estudiadas por CHOUINARD y KAUFMAN

(1991). Como hemos visto (Artículo 2) estas regiones están muy conservadas entre
especies de Drosophila. Las regiones reguladoras todavía no identificadas
probablemente están localizadas en las regiones conservadas que no han sido probadas.
Dos de las regiones analizadas por CHOUINARD y KAUFMAN (1991) que eran
aparentemente no funcionales presentan algunas zonas altamente conservadas, es
probable que estas regiones sean funcionales pero que formen parte de un elemento
regulador de mayor tamaño, no siendo capaces de inducir espresión por si solas. Por
otro lado hay que destacar que, especialmente en la región 5’, las regiones reguladoras
identificadas son solapantes. Cabe destacar la elevada superposición y la aparente falta
de orden de las regiones identificadas respecto a su dominio de expresión en el embrión
o discos imaginales.

3.2.1.3. pb
proboscipedia (pb) es el segundo gen del HOM-C de Drosophila. El primer
mutante de pb fue descrito en 1933 por Bridges y Dobzhansky. Las mutaciones nulas de
pb producen transformación homeótica específica del adulto, donde los palpos labiales

124
 DISCUSIÓN

se transforman en patas protorácicas. En mutantes de pérdida parcial de función, los

palpos labiales resultan transformados en aristas de antena (KAUFMAN 1978). A
diferencia de las transformaciones en el adulto, la ausencia de pb en el embrión no
presentan alteraciones detectables (PULTZ et al. 1988). La acción de pb es por tanto
única entre los genes homeóticos, ya que parece ser innecesario en el embrión.
A pesar de ser necesario solo en el adulto, pb se expresa en el embrión además
de en los estadíos de larva y pupa. En el embrión se expresa en los lóbulos labial y
maxilar del gnatocéfalon que dan lugar a estructuras específicas de la cabeza de larva y
adulto, en el mesodermo ventral del segmento mandibular, y posteriormente se expresa
también en el sistema nervioso central (PULTZ et al. 1988). La expresión de pb se
detecta también en los discos labiales, que dan lugar al labrum del adulto (RANDAZZO et
al. 1991). Minigenes de pb expresados en los discos labiales son capaces de recuperar la
transformación homeótica de los mutantes para pb, pero no se expresan en el sistema
nervioso central, lo que da lugar a moscas con deficiencias a nivel de comportamiento
(RANDAZZO et al. 1991).
El significado de la expresión embriónica de pb no está claro, ya que la
delección del locus tiene consecuencias solo en adultos. KAUFMAN et al. (1990) propone
varias hipótesis para explicar la aparente ausencia de función de la expresión de pb en el
embrión. Una posibilidad es que los defectos del embrión sean sutiles y hayan escapado
a la detección. Otra posibilidad es que la expresión temprana de pb represente un
vestigio evolutivo del patrón de expresión en insectos más primitivos donde el
desarrollo de la cabeza no está tan modificado como en los dípteros superiores.
Alternativamente, esta acumulación temprana podría representar el mecanismo por el
cual se asegura la expresión de pb posteriormente en los discos imaginales. Los dos
segmentos en que se expresa pb en el ectodermo son los lugares lógicos de las células
progenitoras de las estructuras afectadas del adulto.
Otra peculiaridad del gen pb es su patrón de expresión en el sistema nervioso
central de la mosca. En esta estructura pb se expresa en algunas células más anteriores
que lab, lo que supone una excepción a la regla de colinearidad. La colinearidad sí se
mantiene en el ectodermo, dónde la expresión de pb es posterior a lab (HIRTH et al.
1998).

En cuanto al análisis comparativo de expresión, el único cambio que hemos

detectado concierne al gen pb en D. virilis. En esta especie, el gen pb presenta un

125
DISCUSIÓN

dominio extra de expresión no detectado en el resto de especies analizadas. Este

dominio se sitúa en el mesodermo del embrión en la región ventral del segmento
maxilar. El estudio de expresión de pb en embriones incluído en el Artículo 2 se ha
completado posteriormente con la especie D. pseudoobscura. Al analizar la secuencia
alrededor de la rotura se observa que en D. melanogaster hay una pequeña inversión de
dos genes Ccp con un punto de rotura muy cerca del extremo 3’ de pb, en la misma
posición que la rotura lab-pb. Para poder descartar que el dominio de expresión presente
sólo en D. virilis no se haya perdido en los otros dos linajes debido a las roturas
mencionadas, se estudió la expresión de pb en embriones de D. pseudoobscura, que
parece tener la disposición ancestral en esta región de la secuencia. Los resultados
muestran (Figura 16) que D. pseudoobscura presenta, en esta fase del desarrollo, el
mismo patrón de expresión que D. melanogaster. De manera que podemos descartar
esta hipótesis, y confirmar los resultados mostrados en el segundo artículo.

Figura 16. Expresión del gen pb en embriones (estadío 11) de cinco especies de Drosophila. La
flecha negra muestra la expresión en el mesodermo ventral del segmento mandibular, la flecha
blanca señala la expresión en el mesodermo ventral del segmento maxilar. El segmento
mandibular (mn), maxilar (mx) y labial (lab) se muestran en el primer recuadro.
Figure 16. Expression of pb in embryos (stage 11) from five Drosophila species. The black
arrow shows the expression in the ventral mesoderm of the mandibular segment, the white
arrow shows the expression in the ventral mesoderm of the maxillary segment. The mandibular
(mn), maxilar (mx) and labial (lab) segments are shown on the first embryo.

126
 DISCUSIÓN

Así este cambio no parece relacionado con la rotura lab-pb. La expresión de pb

es prescindible en el embrión, pero la ausencia de función o alteraciones detectables se
refiere exclusivamente a la cutícula. No se sabe qué función realiza pb en el mesodermo
ventral, lo cual dificulta la interpretación de las diferencias observadas.
Aunque es más parsimonioso pensar en una ganancia de un dominio de
expresión en el linaje de D. virilis que en dos pérdidas en los otros dos linajes, algunas
evidencias apoyan la segunda opción. Estudios en otros artrópodos apuntan hacia una
reducción en el dominio de expresión de pb en la evolución hacia Drosophila (HUGHES
y KAUFMAN 2002). Por otro lado, se considera que D. virilis retiene muchos caracteres
ancestrales dentro de los drosophilidos (CLARK et al. 2003). Podría por tanto ser que el
dominio de expresión de pb en el mesodermo del segmento maxilar de D. virilis sea en
realidad la retención de un carácter ancestral. Representando un vestigio de un dominio
de expresión más extenso que se ha perdido de forma independiente en los linajes de D.
buzzatii/D. repleta y D. melanogaster/D. pseudoobscura. El hecho de que en los dos
linajes se haya perdido el mismo dominio podría indicar que el dominio retenido es
funcional o podría ser una cuestión casual.
Un análisis detallado de la secuencia de pb en D. virilis, especialmente de sus
regiones cis-reguladoras, podría quizás ayudar a detectar el elemento cis-regulador
responsable de este dominio extra. De todos modos, aún es dificil relacionar la
secuencia con la función en las regiones cis-reguladoras.

3.2.1.4. abdA
Cuando Edward Lewis (1978) describió el complejo Bithorax, indicó la
presencia de al menos ocho genes, responsable cada uno de dar identidad a un
segmento. Posteriormente, el aislamiento y caracterización de mutaciones letales en
heterocigosis con defiencias del BX-C mostraron la existencia de solo tres grupos de
complementación (SÁNCHEZ-HERRERO et al. 1985; TIONG et al. 1985). Estudios
moleculares confirmaron la existencia de solo tres genes codificantes: Ubx, abdA y
AbdB (CELNIKER et al. 1989; KARCH et al. 1990). Los “genes” identificados por LEWIS
(1978) eran en realidad regiones cis-reguladoras de estos tres genes. Cada una de estas
regiones cis-reguladoras se encarga de activar y mantener la expresión de uno de estos
genes en un segmento (o parasegmento) determinado, y están situadas de forma
colineal.

127
DISCUSIÓN

El gen abdominal A (abdA) es el penúltimo gen del HOM-C de Drosophila,

ortólogo a los genes centrales de otros organismos. La mutaciones en abdA son letales,
estos embriones presentan los parasegmentos 7 a 9 transformados en copias del
parasegmento 6, y los parasegmentos 10 a 13 también muestran transformación, aunque
más leve, a parasegmento 9. La expresión de este gen está regulada por las regiones cis-
reguladoras iab. Mutaciones localizadas en estas regiones iab alteran la función del gen
únicamente en el segmento en el que guían la expresión de abdA. Los número de las
regiones iab se refieren a los segmentos abdominales donde se observan las alteraciones
en los mutantes, aunque en realidad estas regiones dirigen la expresión en
parasegmentos. La región iab2 se refiere al segundo segmento abdominal, que
corresponde al parasegmento 7; la region iab3 al tercer segmento abdominal,
parasegmento 8, etc.

De los genes Hox estudiados en este trabajo, abdA parece ser el que presenta
más constricciones funcionales. La región abdA no presenta ninguna microinversión, a
diferencia de lab y pb, ni inserción de elementos móviles, los cuales son muy
abundantes en el gen lab situado a tan solo 75 kb (Artículo 2 Figura 2). Además los
elementos reguladores de abdA, a diferencia de lab y pb, presentan colinealidad.

3.2.2. Evolución de la Estructura del HOM-C en Drosophila

3.2.2.1. Estructura del HOM-C
A pesar de que la agrupación y colinealidad de los genes Hox son un paradigma
de la Evo-Devo, la poca información disponible sobre la organización de los genes Hox
en Drosophila (VON ALLMEN et al. 1996), ya indicaba que la organización descrita en
D. melanogaster no era válida para todo el género. Por otro lado la elevada tasa de
reordenaciones en este género (GONZÁLEZ et al. 2002) hacía probable la existencia de
más alteraciones del complejo, hipótesis que se vió confirmada con el análisis de su
estructura en especies del grupo repleta de Drosophila (RANZ, CÁCERES y RUIZ
comunicación personal) (Figura 14).
Los proyectos de secuenciación de varias especies del género Drosophila van a
aportar más información sobre la organización del HOM-C. Las especies más
informativas serán probablemente D. willistoni, perteneciente al subgénero Sophophora,
y D. grimshawi, única especie del subgénero Idiomyia en proceso de secuenciación.
Desgraciadamente aún no disponemos de ningún ensamblaje de la secuencia de estas

128
 DISCUSIÓN

especies. De momento, además de los datos descritos en la introducción (apartado 1.7.4)

disponemos de la secuencia de las regiones lab-abdA y pb de D. buzzatii (Artículo 2),
del trabajo de LEWIS et al. (2003), donde analizan la rotura Antp-Ubx, y de las
secuencias genómicas de D. pseudoobscura (RICHARDS et al. 2005), D. ananasae, D.
erecta, D. simulans, D. yakuba, D. virilis y D. mojavensis
(http://rana.lbl.gov/drosophila/multipleflies.html). He realizado un breve análisis de
estas nuevas secuencias genómicas para ver la organización de los genes Hox. Estos
datos no indican la existencia de más roturas, pero permiten delimitar cuando se
produjeron algunas de las inserciones y reorganizaciones del complejo.

Actualmente se conocen tres organizaciones genómicas diferentes de los genes

Hox en el género Drosophila (Figura 14). De estas agrupaciones se deduce que el
ancestro del género Drosophila presentaba un único complejo completo como el que se
observa en Anopheles (VON ALLMEN et al. 1996). Las diferentes roturas del complejo
se produjeron después de la separación de los subgéneros Drosophila y Sophophora.
La organización en dos complejos, el ANT-C y el BX-C, descrita en D.
melanogaster parece ser común a los diferentes linajes del subgénero Sophophora
(LEWIS et al. 2003). Esta organización es resultado de un inversión que rompió el
complejo entre los genes Antp y Ubx. Habrá que esperar a la secuenciación de D.
willistoni para discriminar si esta rotura se produjo en el ancestro de todo el subgénero o
en el ancestro común a los grupos obscura y melanogaster.
La segunda organización es la descrita en D. virilis y presente también en otras
especies como D. immigrans. En estas especies, el complejo también se encuentra
dividido en dos fragmentos, el primero contiene desde lab hasta Ubx (es decir ANT-C
más Ubx) y el segundo los dos genes abdominal (abdA y AbdB) (VON ALLMEN et al.
1996, RANZ et al. 2001, RANZ, CÁCERES y RUIZ comunicación personal). La rotura
entre Ubx y abdA está presente en todas la especies estudiadas del subgénero
Drosophila. Falta saber si se produjo en el ancestro de este subgénero o si está también
presente en el subgénero Idiomyia.
La tercera organización, descrita en D. buzzatii y común a todo el grupo repleta
y a D. canalinea, presenta dos roturas del complejo. Estas especies presentan la rotura
entre Ubx y abdA común a todo el subgénero Drosophila y además una segunda rotura
entre lab y pb. A pesar de esta segunda rotura, los genes siguen agrupados a nivel

129
DISCUSIÓN

citológico en solo dos regiones genómicas, ya que el gen lab está a tan solo 75 kb de
abdA.

3.2.2.2. Reconstrucción de la Evolución de la Estructura del HOM-C

En dípteros basales, como Anopheles gambiae, ocho genes Hox más Hox3 y ftz
están agrupados en un único complejo (POWERS et al. 2000). Antes de la radiación del
género Drosophila, ocurrieron cuatro transposiciones: el complejo de genes Ccp se
insertó entre lab y pb (Artículo 2), el gen Ama entre bcd y Dfd, y el gen CG31217 entre
Antp y Ubx (LEWIS et al. 2003) y Glut3 entre Ubx y abdA. Durante este mismo período,
Hox3-zen dio lugar, a través de dos duplicaciones, a los genes bcd, zen y zen2. Después
zen2 sufrió una inversión, junto con la región reguladora 5’ de pb (ver apartado 3.2.1.1).
Esta organización parece ser la ancestral a todo el género Drosophila (Figura 17, 1).

En el linaje que condujo al subgénero Drosophila, después de la separación del

subgénero Sophophora, tuvo lugar una inversión con un punto de rotura entre los genes
abdA y Glut3 y el otro entre CG31363 y un gen X (Artículo 2). En la secuencia de D.
virilis el gen situado en la región 3’ de Ubx es el CG6073, este debería ser es gen X
siempre que no haya habido más reorganizaciones en esta región en este linaje (Figura
17, 2). Esta estructura del HOM-C es la que encontramos actualmente en especies del
subgénero Drosophila no pertenecientes al grupo repleta, como por ejemplo D. virilis.
Una segunda inversión, en el ancestro del grupo repleta, rompió el HOM-C entre
los genes lab y pb. Esta inversión, que situó a lab cerca de abdA, tuvo un punto de
rotura entre pb y el complejo de genes Ccp y el segundo entre CG31363 y CG17836
(Figura 17, 3). Estos dos genes no son adyacentes en el genoma de D. melanogaster, D.
pseudoobscura ni D. virilis, pero inferimos que lo eran en el ancestro del subgénero
Drosophila.

En el linaje que condujo al subgénero Sophophora, el HOM-C se rompió,

mediante una inversión, entre los genes Ubx y Antp, dando lugar a los complejos ANT-
C y BX-C. Los puntos de rotura se situaron, concretamente, uno entre Ubx y CG31217
y el otro entre Sodh y CCTg (Figura 17, 4) (LEWIS et al. 2003). Durante este mismo
período, una microinversión cambió la orientación del gen ftz (Figura 17, 5). Esta
estructura parece ser la actual en la especie D. pseudoobscura. Posteriormente, en el
linaje de D. melanogaster ocurrieron otras dos microinversiones. El gen zen2 volvió a

130
 DISCUSIÓN

Figura 17. Modelo de evolución del HOM-C en Drosophila. Arriba, filogenia de las especies de
Drosophila estudiadas en este trabajo. Se muestra el lugar de la filogenia en que tuvieron lugar
los diferentes eventos. El recuadro con el número (1) muestra los eventos sucedidos antes de la
diversificación del género. Los otros dos recuadros muestran el estado del complejo antes de la
diversificación, punto de partida donde se produjeron el resto de reorganizaciones. Símbolos y
colores igual que en la Figura 15.
Figure 17. Model of the evolution of the HOM-C in Drosophila. Up, phylogeny of the
Drosophila species studied in this thesis. The numbers show where in the phylogeny each event
took place. The rectangle with number (1) shows those events that happened before the
diversification of the Drosophila genus. The other rectangles show the structure of the complex
before the diversification, starting point where the rearrangements took place. Symbol and
colours as in Figure 15.

131
DISCUSIÓN

invertirse, quedando nuevamente en la misma orientación que la mayoría de genes del

complejo (Figura 17, 6). La otra microinversión invirtió la orientación del gen Dfd
(Figura 17, 7).

Globalmente, en el ancestro del género Drosophila se produjeron dos

transposiciones (genes Ccp y CG31217) y una microinversión (zen2). Dentro del género
Drosophila se han producido, en los diferentes linajes, un total de tres inversiones
(roturas Ubx-abdA, Antp-Ubx y lab-pb) y otras tres microinversiones (ftz, zen2 y Dfd).
De todos modos, esta descripción es incompleta, ya que falta determinar cuando se
produjeron al menos otra transposición más: la agrupación de tRNA de la lisina (lys-
tRNA) situados entre Dfd y Scr en el ANT-C de D. melanogaster.

Todos los genes Hox, excepto el gen Dfd en D. melanogaster, presentan la

misma orientación 5’ → 3’. Sus regiones reguladoras están habitualmente situadas en la
región 5’ del gen y en sus intrones. Todas la transposiciones y roturas entre genes Hox
se han producido cerca del extremo 3’ de un gen y lejos del 5’ del otro gen, respetando
así las regiones reguladoras de ambos genes. De este modo, las reordenaciones no han
alterado ninguna región reguladora conocida de estos genes Hox, lo que explicaría la
ausencia de efecto sobre su expresión.

3.2.3. Mecanismo de las Reordenaciones

Una vez determinado que las roturas del complejo de genes Hox han sido
debidas a inversiones paracéntricas, se ha analizado en detalle la secuencia de las
regiones de los dos puntos de rotura de la inversión lab-pb y de uno de la Ubx-abdA en
D. buzzatii (ver Artículo 2) para intentar determinar el mecanismo que las produjo. En
dos de estos tres puntos de rotura (lab-CG31363 y CG31363-abdA) existen inserciones
de elementos transponibles tipo IsBu. Estos elementos presentan un tamaño pequeño
(alrededor de una kilobase), producen duplicaciones de tan solo 2 pb al insertarse y
tienden a encontrarse agrupados o incrustados uno dentro de otro. Estas caraterísticas
hacen difícil la identificación de elementos quiméricos que serían el resultado de la
recombinación ectópica responsable de una inversión (CACERES et al. 1999; CACERES et
al. 2001; CASALS et al. 2003). Aunque no lo podemos descartar completamente, parece
poco probable que estos elementos hayan estado relacionados con el origen de estas
inversions.

132
 DISCUSIÓN

3.2.4. Causas y Consecuencias de las Roturas del HOM-C

¿Cuál es el significado funcional de la agrupación de los genes Hox? Varias
razones se han postulado para explicar la sorprendente conservación de los complejos
Hox a lo largo de la filogenia. La similitud de los complejos no se debe a una
convergencia evolutiva sino a la conservación de un estado ancestral, pero para que esta
estructura se haya mantenido durantes más de 600 millones de años de evolución tienen
que haber constricciones funcionales actuando sobre el complejo como unidad
(MCGINNIS y KRUMLAUF 1992). ¿Cuales son estas constricciones funcionales? Dos
hipótesis podrían explicar la existencia de los complejos Hox: (A) estos genes no
pueden funcionar o no funcionan correctamente fuera del dominio del complejo, quizás
por requerimientos de la estructura cromatínica o por efectos de posición; (B) la
yuxtaposición de los genes miembros y sus complejas regiones cis-reguladoras hace la
separación por procesos genéticos al azar improbable o incluso imposible (RANDAZZO
et al. 1993).

La existencia de elementos reguladores compartidos entre varios genes explica

en algunos casos la conservación de los complejos génicos. En el caso de los genes
Hox, inversiones que rompen el ANT-C de D. melanogaster dentro de un gen no
afectan a otros genes del complejo, lo que sugiere que estos genes no poseen elementos
reguladores compartidos (ABBOTT y KAUFMAN 1986; PULTZ et al. 1988; DIEDERICH et
al. 1989; AVEROF et al. 1996). Por otro lado, en la región anterior del HOM-C de
Drosophila, encontramos dos ejemplos de regiones cis-reguladoras intercaladas: Scr-ftz
y pb-zen2. En el primer caso ftz se encuentra entre las regiones reguladoras 5’ de Scr
(MAIER et al. 1990). De forma similar, zen2 está situado entre el promotor basal de pb y
sus regiones reguladoras 5’. En ambos casos el segundo gen, que ha perdido su función
Hox, se encuentra entre el primer gen (Scr o pb) y parte de sus regiones cis-reguladoras
5’. Esta organización hace inviable la separación de los dos genes mediante inversión,
pero parece indicar que el gen no Hox podría cambiar de posición mediante
transposición, aunque la tasa de transposición en el género Drosophila es muy baja
(RANZ et al. 2003).
En cuanto a los genes posteriores, según KARCH et al. (1985) el BX-C de D.
melanogaster está formado por dos unidades separables entre ellas pero no dentro de
ellas: la región Ultrabithorax y la región Abdominal. La región Ultrabithorax contiene el
gen Ubx y su región reguladora que incluye el RNA no codificante bxd, el cual presenta

133
DISCUSIÓN

procesamiento alternativo. Esta región se puede separar de la región Abdominal sin

efecto fenotípico (STRUHL 1984), y está separada de forma natural en las especies del
subgénero Drosophila (rotura Ubx-abdA) (RANZ et al. 2001, VON ALLMEN et al. 1996 y
Artículo 1). La región Abdominal contiene los genes abdA y AbdB separados por 100
kb que contienen las regiones cis-reguladoras iab2 a iab9. Las regiones iab, separadas
entre ellas por elementos aisladores, presentan colinealidad entre su orden en el
cromosoma y los parasegmentos donde determinan la expresión de abdA o AbdB
(SANCHEZ-HERRERO 1991). Alguna de estas regiones iab, concretamente iab5, parecen
actuar tanto sobre abdA como sobre AbdB, lo que haría inviable la separación de esta
región de alguno de los dos genes. TIONG et al. (1987) intentaron demostrar que la
unidad de esta región Abdominal no era esencial para su función. Utilizaron una línea
que presentaba una translocación de las regiones Ubx y abdA, una de las roturas se sitúa
aproximadamente entre iab6 e iab7; y otra línea que presentaba una delección de las
regiones Ubx y abdA, en este caso una de las roturas se sitúa aproximadamente entre
iab4 e iab5. Mostraron que estas dos deficiencias se complementan dando lugar a
individuos fenotípicamente salvajes, mostrando que las regiones abdA y AbdB no
necesitan estar en cis para su correcto funcionamiento. Pero en realidad no se trata de
una rotura “limpia”, sino que hay una región duplicada. Las regiones iab5 e iab6 están
presentes en cis tanto al lado de abdA como al lado de AbdB. Este trabajo más otros
indicios de que iab5 regula tanto la transcripción de abdA como de AbdB (DUNCAN
1987; CELNIKER et al. 1990) parecen indicar que estas dos regiones podrían separarse
físicamente sin efecto funcional siempre y cuando la región iab5 se duplicara y
estuviera presente al lado de ambos genes.

Otra posible explicación para la selección a lo largo de la evolución en contra de

la dispersión de los genes homeóticos serían las consecuencias detrimentales de los
efectos de posición. Según esta teoría los genes homeóticos podrían estar residiendo en
el complejo cómo prisioneros cuya escapada causaría, en muchos casos, efectos
deletéreos para el organismo (RANDAZZO et al. 1991). Inversiones dentro del complejo
podrían influir en la transcripción de los genes homeóticos acercando secuencias
portadoras de nuevos elementos reguladores o modificando la estructura global de la
cromatina. Mientras algunos genes han mostrado ausencia de efecto cuando se expresan
de forma ectópica en Drosophila (BONNER et al. 1984; BASLER y HAFEN 1989), la
expresión ectópica de los genes homeóticos Antp, Ubx, abdA o pb tienen efectos

134
 DISCUSIÓN

deletéreos graves sobre el organismo (GONZALEZ-REYES et al. 1990; CRIBBS et al.

1992; SÁNCHEZ-HERRERO et al. 1994).
Los genes de los grupos trithorax y polycomb mantienen la activación y
represión, respectivamente, de los genes Hox. Estos genes parecen realizar su función
actuando sobre la estructura de la cromatina manteniendo la región accesible o
inaccesible a la maquinaria transcripcional. Este efecto sobre la cromatina podría ser el
responsable del mantenimiento de la agrupación de los genes Hox en Drosophila.
CHIANG et al. (1995) mostraron que los elementos que mantienen la represión de los
genes Hox por acción de polycomb actúan de forma cooperativa. Un reordenamiento de
estas regiones podría prevenir esta acción cooperativa, disminuyendo la acción
represiva de estos elementos o haciendo al individuo más sensible a alteraciones en el
sistema polycomb. El mantenimento de la acción cooperativa de estos elementos
represores podría ser una de los factores que mantienen la integridad de los complejos.
El complejo de genes Iroquois está también regulado por los genes polycomb y trithorax
a través de la estructura cromatínica, de forma similar a los genes del HOM-C (NETTER
et al. 1998).
Por otro lado, existen evidencias de la necesidad de apareamiento de los
cromosomas homólogos para la correcta regulación de algunos genes, así como la
existencia de regiones de unión a la matriz (SARs – Scafolding Attachment Regions, o
MARs – Matrix Attachment Regions) en diferentes posiciones del complejo, lo que
sugiere la importancia de la arquitectura cromosómica en el correcto funcionamiento de
estas regiones (RANDAZZO et al. 1993).

Hay que destacar que a pesar de la importancia del complejo de genes Hox, en
Drosophila es posible romper este complejo y tener una mosca viable. Trabajos de
roturas inducidas o rescates por minigenes parecían indicar la posibilidad de estas
roturas en condiciones de laboratorio, pero cuestionaban si serían capaces de sobrevivir
a las presiones selectivas de la naturaleza (RANDAZZO et al. 1991). Hay que recalcar que
las roturas del HOM-C descritas en el apartado 3.2.2.1 son naturales. No se trata de
roturas experimentales cuyos portadores sobreviven en el laboratorio sin aparentes
malformaciones, sino que se trata de inversiones fijadas en grupos de especies con
elevado éxito evolutivo. Incluso la rotura más reciente, entre lab y pb, está fijada en
todo el grupo repleta, uno de los grupos más exitosos con más de 100 especies.

135
DISCUSIÓN

3.2.5. ANT-C versus BX-C

Tradicionalmente los estudios de genes Hox en Drosophila se han centrado o en
un gen en concreto o en uno de los complejos, lo que hace que los estudios existentes
sobre los genes del ANT-C y del BX-C sean bastante diferentes y que no existan
trabajos globales. Quizás por este motivo, algunas diferencias entre los genes anteriores
y posteriores del complejo pueden haber pasado desapercibidas.
En el análisis de la conservación de las regiones no codificantes (ver Artículo 2),
se han detectado cuatro microinversiones en las regiones reguladoras de lab y pb, en
cambio no se ha encontrado ninguna inversión semejante en abdA. Es en la región de
los genes abdominal donde las regiones reguladoras de cada parasegmento mantienen la
colinealidad. Es posible que en estas regiones la colinealidad siga siendo un requisito
funcional. El efecto de una mutación en la que pbx se sitúa aguas abajo en vez de aguas
arriba de Ubx sugiere que el orden de las regiones reguladoras del complejo tiene
significado funcional (DUNCAN 1987). Además las regiones iab se transcriben, también
de forma ordenada, para activar la transcripción de los genes abdominal en cada uno de
los parasegmentos. La transcripción de estas regiones reguladoras activa los genes
codificantes a través de la apertura de la cromatina que efectúa la maquinaria
transcripcional (SÁNCHEZ-HERRERO y AKAM 1989; SANCHEZ-HERRERO 1991; BAE et
al. 2002; DREWELL et al. 2002).

También hemos observado diferencias en la presencia de inserciones de TE entre

lab y abdA, a pesar de que ambos genes están muy próximos en el genoma de D.
buzzatii, a tan solo 75 kb. El gen lab presenta un elevado número de inserciones de
elementos tipo ISBu, tanto en la región 5’ como en los intrones. En cambio los otros dos
genes Hox no presentan casi inserciones. Teniendo en cuenta la mayor abundancia de
TE en regiones pericentroméricas (CASALS et al. 2005) destaca la ausencia de TE en la
región abdA, a pesar de estar muy próximo al centrómero y adyacente a lab.

En Drosophila los genes Hox posteriores mantienen la colinealidad entre genes y

entre regiones reguladoras de estos genes (especialmente los genes abdominal), pero en
la región anterior del complejo la situación es diferente. La cabeza de Drosophila es una
estructura compleja con un proceso de desarrollo altamente derivado. Esta puede ser la
causa de que algunos de los genes Hox que se expresan en esta región anterior hayan

136
 DISCUSIÓN

perdido la colinealidad en los dominios de expresión. Por ejemplo pb tiene una

expresión más anterior que lab en el sistema nervioso central (HIRTH et al. 1998).
Pero no solo están perdiendo la colinealidad, sino que estan perdiendo su
función Hox. Aparte de zen y ftz, que han perdido completamente esta función, los
genes lab, pb y Dfd solo presentan fenotipo Hox en el adulto, pero no en el embrión.
Los complejos patrones de expresión de los genes Hox en estadíos tardíos del desarrollo
sugieren que estos genes son utilizados en otros procesos de desarrollo no relacionados
con la diferenciación axial (AKAM 1989). Efectivamente, estos genes están adquiriendo
nuevas funciones. El gen lab realiza tres funciones diferentes: (1) función Hox,
especifica la identidad de la región posterior de la cabeza del imago; (2) involución
cefálica, la ausencia de expresión de lab en el embrión produce alteraciones en el
proceso de involución cefálica, y (3) diferenciación de un tipo celular, la expresión de
lab en el intestino interviene en la diferenciación de las células del cobre y en el
mantenimiento de su estado diferenciado. El gen pb realiza también dos funciones
diferentes: (1) función Hox, especifica la identidad de los palpos maxilares y labiales, y
(2) sistema nervioso central de la larva, al final del desarrollo embrionario se expresa en
grupos de células a lo largo de todo el sistema nervioso central de la larva, su ausencia
produce alteraciones de comportamiento.
Estos dos genes podrían representar una situación preliminar que podría llevar a
un caso similar a Hox3, donde se ha ido perdiendo la función Hox y adquiriendo nuevas
funciones que, como en el caso de zen-bcd, pueden llegar a subdividirse mediante
duplicación génica. AVEROF et al (1996) sugieren que la diversificación funcional de los
genes Hox empieza con la adquisición de múltiples y distintos elementos cis-
reguladores responsables de diferentes aspectos de la expresión génica.

Globalmente queda patente el diferente comportamiento de los genes Hox

anteriores y posteriores de Drosophila. Mientras los genes anteriores del complejo
parecen estar en proceso de perder su función Hox y adquirir nuevas funciones, los
genes posteriores parecen mantener la colinealidad a nivel de genes y de regiones
reguladoras.

137
DISCUSIÓN

3.3. CONSERVACIÓN Y DESINTEGRACIÓN DEL HOM-C EN LOS METAZOOS

3.3.1. Drosophila versus Vertebrados

La presencia de genes Hox agrupados en un complejo se ha observado en el
genoma de muchos metazoos, y cuando se ha probado, se ha mostrado que estos genes
especifican la diferenciación en diferentes posiciones a lo largo del eje anteroposterior
del organismo. De todos modos, a pesar de esta conservación, la estructura del complejo
de genes Hox difiere considerablemente en cada uno de los grupos en los que se ha
examinado. Varias características diferencian el HOM-C de Drosophila del de
vertebrados (FERRIER y MINGUILLON 2003; SANTINI et al. 2003; WAGNER et al. 2003).
Los complejos de vertebrados son compactos (100-200 kb) y las unidades de
transcripción cortas, aunque múltiples complejos están presentes en el genoma
(MCGINNIS y KRUMLAUF 1992). El complejo de Drosophila es extenso (unas 700 kb),
con intrones y regiones reguladoras intergénicas excepcionalmente largas comparado
con lo compacto que es el resto del genoma. Las regiones reguladoras parecen estar
organizadas en dominios discretos, específicos de un segmento, y ampliamente
autónomos (AVEROF et al. 1996).
En Drosophila hay multitud de inserciones de elementos transponibles en estas
regiones, mientras que estos son prácticamente inexistentes en los complejos de
vertebrados (LANDER et al. 2001). También hay inserciones de genes no Hox entre los
genes Hox (además de los que han perdido su función Hox) y duplicaciones en tandem
dentro del complejo. Drosophila permite la inversión de genes Hox, como Dfd, y de
genes no Hox, como zen2. Además el HOM-C de Drosophila se ha roto en diferentes
puntos sin aparente efecto en su función. Estas observaciones sugieren una evolución
dinámica en Drosophila que contrasta con la económica estructura y la conservación
observada en vertebrados.

Estas diferencias sugieren que los complejos de vertebrados y Drosophila están

actualmente sometidos a constricciones estructurales y reguladoras muy diferentes. La
rotura del complejo de genes Hox en Drosophila parece el proceso final de
desintegración, hecho posible sólo después del resto de cambios observados, los cuales
han ido esponjando el complejo.

138
 DISCUSIÓN

De todos modos, muchas diferencias entre especies deben reflejar accidentes

históricos congelados que no tienen ningún significado funcional (p.e. algunas
reorganizaciones cromosómicas) o no tienen una relevancia directa en la función de los
genes Hox (p.e. un incremento en el tamaño génico por acumulación y deterioro de
elementos transponibles). No hay modo seguro de diferenciar cambios significativos de
cambios triviales, pero una manera de comprovar relaciones propuestas entre la
estructura y la función de los complejos Hox es determinar si la distribución de
características particulares es consistente con la función propuesta (FERRIER y AKAM
1996). ¿Existen reorganizaciones del complejo Hox en muchos linajes de artrópodos,
pero rara vez o nunca en cordados? ¿Son los complejos grandes una característica única
de insectos con desarrollo rápido o se encuentran también en insectos que invierten días
en vez de horas en establecer el patrón de regulación de los genes Hox?

3.3.2. Estructura del HOM-C en los Metazoos.

Los datos sobre la organización genómica de los genes Hox han aumentado
desde el inicio de este trabajo (ver apartado 1.6.4). De todos modos siguen siendo pocos
y muy irregulares a lo largo de la filogénia. En la Figura 18 se muestra la estructura de
los complejos en los organismos donde se ha estudiado. A medida que se estudia la
organización genómica de los génes Hox en más organismos, están apareciendo más
casos de roturas del complejo. En el último año se han descrito roturas del HOM-C en
tres organismos.

Aunque se han clonado muchos fragmentos de genes Hox en los Lofotrocozoos,

sigue sin haber datos sobre su organización genómica. Únicamente en el nemertino
Lineus sanguineus hay alguna evidencia de agrupación de dos genes Hox, obtenida por
hibridación sobre electroforesis de campo pulsante (KMITA-CUNISSE et al. 1998).

En cuanto a los Ecdisozoos, los datos siguen limitados al nemátodo C. elegans y

a insectos. Como ya se ha comentado, C. elegans posee solo seis genes Hox agrupados
en parejas. Esta dotación génica se interpreta como una reducción derivada debido a su
desarrollo determinista (WANG et al. 1993; BALAVOINE y TELFORD 1995).

139
DISCUSIÓN

Figura 18. Estructura del HOM-C en los Metazoos. Árbol filogenético con la información
disponible sobre la organización genómica de los genes Hox. Información obtenida de: S.
gregaria (FERRIER y AKAM 1996); T. castaneum (DENELL et al. 1996; BROWN et al. 2002); A.
gambiae (POWERS et al. 2000; LEWIS et al. 2003); B. mori (YASUKOCHI et al. 2004); C. elegans
(DE ROSA et al. 1999); D. rerio (AMORES et al. 2004); H. francisci de (KIM et al. 2000; CHIU et
al. 2002); B. floridae (MINGUILLÓN et al. 2004); C. intestinalis (SPAGNUOLO et al. 2003; IKUTA
et al. 2004); O. Dioica (SEO et al. 2004), y S. purpuratus (MARTINEZ et al. 1999).
Figure 18. HOM-C structure in the Metazoan. Phylogenetic tree with the available information
on the genomic organization of Hox genes. Information from: S. gregaria (FERRIER y AKAM
1996); T. castaneum (DENELL et al. 1996; BROWN et al. 2002); A. gambiae (POWERS et al.
2000; LEWIS et al. 2003); B. mori (YASUKOCHI et al. 2004); C. elegans (DE ROSA et al. 1999); D.
rerio (AMORES et al. 2004); H. francisci (KIM et al. 2000; CHIU et al. 2002); B. floridae
(MINGUILLÓN et al. 2004); C. intestinalis (SPAGNUOLO et al. 2003; IKUTA et al. 2004); O. Dioica
(SEO et al. 2004), y S. purpuratus (MARTINEZ et al. 1999).

De nuevo, aunque hay muchos datos de presencia de genes Hox en diversos

Artrópodos y, en este caso, también patrones de expresión, solamente en insectos se ha
determinado la organización genómica de estos genes.
El complejo del saltamontes es al menos tan largo como el ANT-C y el BX-C de
Drosophila combinados (alrededor de 700 kb), y posiblemente comprende hasta 2 Mb.
No se conoce la longitud de las unidades de transcripción, pero estas no pueden ser tan
cortas como las de vertebrados. La gran longitud de los genes, y del complejo, sugiere

140
 DISCUSIÓN

que S. gregaria contiene extensos elementos reguladores específicos de cada gen, más
que elementos compactos y sobrepuestos como en vertebrados. (FERRIER y AKAM 1996)
El escarabajo T. castaneum también posee un HOM-C (BEEMAN 1987). En
algunos aspectos, este complejo es más parecido al HOM-C de vertebrados que al de
Drosophila, por ejemplo en que incluye unidades de transcripción grandes y distancias
intergénicas largas importantes para la elaborada regulación de los genes (DENELL et al.
1996). El HOM-C de Tribolium forma un bloque contiguo y no presenta genes
accesorios (MCGINNIS y KRUMLAUF 1992). Se ha clonado y secuenciado la región
equivalente al ANT-C (BROWN et al. 2002).
En el 2000 dos trabajos estudiaron la organización genómica de los genes Hox
en A. gambiae (DEVENPORT et al. 2000; POWERS et al. 2000). Posteriormente, la
secuencia genómica ha completado los datos restantes confirmando la presencia de un
complejo único y entero. Las transposiciones en el ancestro de Drosophila, así como las
duplicaciones génicas (Hox3), se produjeron después de la separación de los linajes de
Drosophila y Anopheles (LEWIS et al. 2003).

En cambio, en Bombyx mori se había identificado, mediante analisis de mutantes

con fenotipo homeótico, un sólo complejo Hox equivalente a los complejos ANT-C y
BX-C de D. melanogaster (UENO et al. 1992). Pero un estudio reciente, en el que se ha
clonado en clones BAC todo el complejo, se ha visto que en realidad el gen labial se
encuentra fuera del complejo y por tanto el complejo está en esta especie partido en dos
fragmentos (YASUKOCHI et al. 2004).

En los deuteróstomos, además de los datos existentes sobre equinodermos,

cefalocordados y vertebrados, recientemente se ha descrito la organización de los genes
Hox en dos urocordados. La ascidea Ciona intestinalis presenta nueve genes Hox, pero
no están agrupados en un complejo sino en cinco fragmentos con entre uno y tres genes
(SPAGNUOLO et al. 2003; IKUTA et al. 2004). El larváceo Oikopleura dioica presenta
nueve genes Hox que no muestran ningún tipo de agrupación (SEO et al. 2004). A
diferencia del resto de deuteróstomos estudiados, estos dos organismos muetran pérdida
de genes Hox y desestructuración del complejo.

141
DISCUSIÓN

3.3.3. ¿Que Tienen en Común los Organismos con Complejos Fragmentados?

Como hemos visto, Drosophila no es el único organismo el que se han descrito
roturas del HOM-C. La presencia de un complejos de genes Hox fragmentado se
conocía ya en el nemátodos C. elegans, y recientemente se ha sido descrito en el
lepidóptero B. mori y en dos tunicados, C. intestinalis y O. dioica. ¿Que tienen en
común los organismos con el HOM-C fragmentado?
El desarrollo de los vertebrados sigue una progresión antero-posterior, y se ha
visto que la colinealidad de los genes Hox no es solo espacial sino también temporal (el
reloj Hox) (KMITA y DUBOULE 2003). En el tunicado Oikopleura la expresión de los
genes Hox todavía mantiene la colinealidad espacial, pero no la temporal (SEO et al.
2004), lo que favorece la idea de que la fuerza que mantiene conservada la estructura
del HOM-C es la colinealidad temporal (FERRIER y MINGUILLON 2003). En los
nemátodos, el patrón evolutivo de los genes Hox se ha relacionado con el cambio hacia
un tipo de desarrollo determinístico (ABOOBAKER y BLAXTER 2003). En el caso de
Bombyx, su desarrollo embrionario es bastante particular. Se han hecho diversos
intentos de caracterizarlo, y según que características se han usado se ha clasificado a
veces como un insecto de banda germinal corta (formación de los segmentos por
proliferación) otra veces como un insecto de banda germinal larga (todos los segmentos
se forman de manera simultanea). De todos modos, en lo que coinciden todos los
estudios es en que presenta un desarrollo complejo y rápido (DAVIS y PATEL 2002).
Finalmente, Drosophila es un insecto de banda germinal larga, con un desarrollo rápido
donde todos los genes Hox se activan casi simultáneamente durante el estadío de
blastodermo celular.
Una característica común a todos los organismos donde se ha descrito un
complejo Hox fragmentado parece ser la presencia de un tipo de embriogénesis derivada
caracterizada por un desarrollo temprano muy rápido. Ninguno de estos organismos
parece mostrar colinealidad temporal. La pérdida de la progresión temporal en la
activación de los genes Hox en una embriogénesis rápida podría ser la causa primera de
la organización modular de los “complejos” Hox, donde los módulos pueden separarse
sin que se produzca una pérdida de función.

142
4. CONCLUSIONES
 CONCLUSIONES

1. Las secuencias nucleotídicas obtenidas de las regiones lab-abdA y pb de D.

buzzatii y su comparación con las secuencias de D. melanogaster y D. pseudoobcura
muestran que la rotura del HOM-C entre los genes lab y pb se produjo a menos de 3 kb
del extremo 3’ de pb, entre este gen y la agrupación de genes cuticulares (Ccp).

2. En D. buzzatii los genes lab y abdA, situados en la misma posición citológica,

se encuentran a tan solo 75 kb. En esta región encontramos un solo gen, CG31363, que
no está relacionado con los genes Hox. A pesar de su proximidad, la posición de estos
dos genes Hox parece ser casual y sin significado funcional.

3. La secuencia obtenida de las regiones lab y pb en D. buzzatii y su

comparación con D. melanogaster y D. pseudoobscura muestran que la rotura lab-pb se
produjo mediante una inversión paracéntrica y no por transposición. El segundo punto
de rotura se produjo entre los genes CG31363 y CG17836. De todos modos, no parecen
quedar evidencias del mecanismo de la inversión.

4. El análisis comparativo de la secuencia de la región codificante del gen lab

entre D. buzzatii, D. virilis y D. melanogaster muestra una evolución heterogénea a lo
largo del gen, pero homogénea a lo largo de la filogenia. El cambio de posición no
parece haber afectado a su tasa de substitución nucleotídica.

5. La comparación de las secuencias no codificantes alrededor de los tres genes

Hox (lab, pb y abdA) entre D. buzzatii, D. melanogaster y D. pseudoobscura muestra
una elevada presencia de bloques conservados. Estos bloques conservados, que llegan a
ocupar un 22% de la secuencia no codificante en la comparación entre las especies más
distantes, representan probablemente regiones reguladoras de la expresión génica

6. La comparación de los bloques conservados con las regiones reguladoras

conocidas de estos genes Hox en D. melanogaster muestra que la posición y orientación
de las regiones reguladoras está conservada entre las tres especies, excepto pequeñas
regiones invertidas que probablemente corresponden con CRM individuales.

145
CONCLUSIONES

7. Las tres roturas del HOM-C conocidas en el género Drosophila se han

producido respetando las regiones reguladoras de los genes adyacentes. En los tres
casos la rotura se ha producido cerca del extremo 3’ de un gen y lejos del extremo 5’ del
otro.

8. Los patrones de expresión de los genes Hox lab y abdA están conservados
entre D. melanogaster, D. virilis, D. repleta y D. buzzatii. El gen pb presenta un
dominio extra de expresión en los embriones de D. virilis, pero esta diferencia no parece
estar relacionada con la rotura lab-pb. Por lo tanto las roturas del HOM-C no han tenido
efecto sobre el patrón de expresión de los genes Hox adyacentes (lab, pb o abdA).

9. En Drosophila los genes Hox presentan una estructura modular donde su

agrupación es prescindible para su correcto funcionamiento. En estas especies el HOM-
C se ha ido desestructurado a través de la inserción de genes no relacionados mediante
transposición y la rotura del complejo mediante inversiones paracéntricas. Además los
genes Hox de la región anterior (lab y pb) están en proceso de modificar su función o
adquirir nuevas, como ya ha sucedido con Hox3 y ftz.

10. Además de Drosophila actualmente se conocen cuatro especies que

presentan roturas en el HOM-C: el nemátodo C. elegans, el lepidóptero B. mori y los
tunicados C. intestinalis y O. dioica. Estos organismos parecen mantener la colinealidad
espacial pero no la temporal. La presencia de un desarrollo embrionario rápido y
derivado podría ser la causa de la pérdida de colinealidad temporal y la
desestructuración del HOM-C.

146
 CONCLUSIONS

1. The nucleotide sequences from the regions lab-abdA and pb of D. buzzatii and
their comparison with the sequences of D. melanogaster and D. pseudoobcura shows
that the split of the HOM-C between the genes lab and pb was produced at less than 3
kb from the 3’ end of pb, between this gene and the cluster of cuticular genes (Ccp).

2. In D. buzzatii the genes lab and abdA, located at the same cytological
position, are at 75 kb only. In the intervening region there is only one gene, CG31363,
which is not related with the Hox genes. Despite their proximity, the position of these
two genes seems fortuitous and without functional meaning.

3. The sequences from the lab and pb regions of D. buzzatii and their
comparison with those of D. melanogaster and D. pseudoobscura show that the lab-pb
split was produced through a paracentric inversion and not by transposition. The
second breakpoint was located between the CG31363 and CG17836 genes. However,
there is no firm evidence about the mechanism that produced this inversion.

4. The comparative analysis of the coding regions of the lab gene between D.
buzzatii, D. virilis and D. melanogaster shows that the evolution rate is heterogeneous
along the gene, but homogeneous along the phylogeny. Thus, the change in position had
no effect on the nucleotide substitution rate of lab.

5. The comparison between D. buzzatii, D. melanogaster and D. pseudoobscura

of the noncoding sequences around the three Hox genes (lab, pb and abdA) shows a
high number of conserved blocks. These blocks represent up to a 22% of noncoding
sequences in the comparisons between the more distant species and are putative
enhancers.

6. The comparison between the conserved blocks and the known regulatory
regions in D. melanogaster shows that the position and orientation of the regulatory
regions is conserved between the three species, except small inverted regions that
probably correspond to individual CRM.

147
CONCLUSIONS

7. The three HOM-C splits known in the Drosophila genus have been produced
between the regulatory regions of the adjacent genes. In all three cases the splits took
place near the 3’ end of one gene and far from the 5’ end of the other gene.

8. The expression patterns of the Hox genes lab and abdA are conserved
between D. melanogaster, D. virilis, D. repleta and D. buzzatii. The gene pb presents an
extra domain of expression in the embryos of D. virilis, but this difference seems
unrelated to the lab-pb split. Thus, the HOM-C splits had no effect on the expression
pattern of the adjacents Hox genes (lab, pb or abdA).

9. In Drosophila the Hox genes present a modular structure where their

clustering is unnecessary for their correct function. In these species the HOM-C is
being disassembled by the insertion of nonrelated genes through transposition and split
through paracentric inversions. Moreover, the anterior Hox genes (lab and pb) are in
process of modifying their function or acquiring new ones, as it has happened with
Hox3 and ftz.

10. Besides Drosophila, four species are known to have a split HOM-C: the
nematode C. elegans, the lepidopteran B. mori and the tunicates C. intestinalis and O.
dioica. These organisms seem to keep spatial but not temporal colinearity. The presence
of a derived and quick mode of embryogenesis could be the ultimate cause of the loss of
temporal colinearity and the HOM-C disassembly.

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174
ANEXO 1. PROTOCOLOS
 ANEXO 1

PROTOCOLOS
1. PROCEDIMIENTOS BÁSICOS 181
1.1. Medios de Cultivo 181
1.2. Soluciones Estoc 182
1.3. Electroforesis en Gel de Agarosa 183
1.4. Digestión con Enzimas de Restricción 184

2. OBTENCIÓN DE EMBRIONES DE DROSOPHILA 185

2.1. Puesta 185
2.2. Recolección de Embriones 186
2.3. Decorionización 186
2.4. Almacenaje 187

3. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 188

3.1. Extracción de DNA Plasmídico por Lisis Alcalina 188
3.2. Extracción de DNA Genómico de Adultos de Drosophila 190
3.3. Extracción de DNA de Fagos 192
3.4. Extracción de DNA a Partir de Geles de agarosa 194
3.5. Extracción de RNA 196

4. AMPLIFICACIÓN POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA – PCR 197

4.1. Obtención de cDNA (RT-PCR) 197
4.1.1. Tratamiento con DNasa 197
4.1.2. Síntesis de cDNA 197
4.2. Amplificación de DNA (PCR) 199

5. CLONACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA 200

5.1. Obtención de DNA del Inserto 200
5.2. Ligación 200
5.3. Obtención de Células Competentes 201
5.4. Transformación 202
5.5. Selección de Colonias Transformantes 202

177
ANEXO 1

6. HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 203

7. HIBRIDACIÓN POR TRANSFERENCIA A FILTRO – SOUTHERN BLOT 204

7.1. Digestión del DNA y Electroforesis de Transferencia 204
7.2. Transferencia 204
7.3. Marcaje y Comprovación de las Sondas 206
7.4. Hibridación 207
7.4.1. Prehibridación e Hibridación 207
7.4.2. Lavados Posthibridación 208
7.5. Revelado e Interpretación de los Resultados 208

8. HIBRIDACIÓN IN SITU SOBRE CROMOSOMAS POLITÉNICOS 210

8.1. Preparaciones Cromosómicas 210
8.1.1. Siliconizado de los Cubreobjetos 210
8.1.2. Tratamiento de los Portaobjetos 210
8.1.3. Disección de las Glándulas Salivares 211
8.2. Marcaje y Tratamiento de las Sondas 212
8.3. Hibridación 215
8.3.1. Prehibridación 215
8.3.2. Hibridación 215
8.3.3. Posthibridación 216
8.3.4. Revelado 216
8.4. Localitzación e Interpretación de las Señales de Hibridación 217

9. HIBRIDACIÓN IN SITU SOBRE EMBRIONES DE DROSOPHILA 218

9.1. Marcage de Sondas RNA 218
9.2. Fijación de Embriones 219
9.3. Hibridación 220
9.4. Lavados 221
9.5. Revelado 221
9.6. Montaje 222

178
 ANEXO 1

10. HIBRIDACIÓN IN SITU SOBRE DISCOS IMAGINALES DE DROSOPHILA 223

10.1. Marcaje de Sondas RNA 223
10.2. Disección de Discos Imaginales 223
10.3. Fijación de Discos Imaginales 224
10.4. Hibridación 224
10.5. Revelado 224
10.6. Montaje de Discos en Glicerol 226

11. TINCIÓN CON ANTICUERPOS 227

11.1. Tinción de Embriones 227
11.1.1. Fijación de Embriones 227
11.1.2. Anticuerpo, Revelado y Montaje 227
11.2. Tinción de Discos Imaginales 228
11.2.1. Disección y Fijación 228
11.2.2. Anticuerpo 228
11.2.3. Revelado y Montaje 228

12. GENOTECA DE FAGOS LAMBDA 230

12.1. Infección de Fagos 230
12.2. Obtención de Lisados 231
12.3. Amplificación de Genotecas 232
12.4. Rastreo 232
12.4.1. Infección y Transferencia a Filtro 232
12.4.2. Hibridación y Revelado 234
12.4.3. Selección de Fagos Positivos 234

13. SECUENCIACIÓN 235

13.1. Secuenciación de Productos de PCR 235
13.2. Secuenciación Mediante Subclonación 235
13.3. Secuenciación Aleatoria 235

14. PROGRAMAS PARA EL ANÁLISIS DE SECUENCIAS 236

179
ANEXO 1

180
 ANEXO 1

1. PROCEDIMIENTOS BÁSICOS

1.1. Medios de Cultivo

LB (Luria-Bertani)
Preparación 1 g triptona
0,5 g extracto de levadura
0,5 g NaCl
Enrasar a 100 mL con agua destilada
Autoclavar

TB (Terrific Broth)
Preparación 1,2 g triptona 0,231g KH2PO4
2,4 g extracto de levadura 1,254 g K2HPO4
0,4 mL glicerol 10 mL agua
90 mL agua destilada Autoclavar
Autoclavar
Dejar enfriar y mezclar las dos soluciones

X-gal 20 mg/mL
Preparación 200 mg 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-galactopiranosido
10 mL dimetilformamida (en tubo de polipropileno)
Hacer alícuotas de 1 mL
Guardar a –20ºC.
Usar 2 µL por mL de cultivo

Ampicilina 25 mg/mL
Preparación 250 mg Ampicilina
10 mL agua destilada
Esterilizar por filtración
Guardar a 4ºC.
Usar 2 µL por mL de cultivo

181
ANEXO 1

1.2. Soluciones Estoc

20xSSC 3 M NaCl; 0,3 M Na3C6H5O7 x 2H2O
Preparación 175,32 g NaCl
88,23 g Na3C6H5O7 x 2H2O
Ajustar a pH 7 con HCl
Enrasar a 1 L, Autoclavar

10xPBS 1,3 M NaCl, 0,07 M Na2HPO4x12H2O,

0,03 M NaH2PO4H2O
Preparación 75,972 g NaCl
25,07 g Na2HPO4x12H2O
4,14 g NaH2PO4H2O
Enrasar a 1 L, Autoclavar

EDTA 0,5 M
Preparación 186,1 g etilendiamintetraacetatox2H2O
800 mL agua destilada
Añadir unos 20 g de NaOH
Ajustar a pH 8
Enrasar a 1 L, Autoclavar

TrisHCl 1M
Preparación 121,1 g Tris
800 mL agua destilada
Añadir unos 65 mL de HCl 35%
Ajustar al pH deseado (7, 7,5 ó 8)
Enrasar a 1 L, Autoclavar

SDS 20%
Preparación 20 g SDS
100 mL agua destilada
Calentar a 68ºC

182
 ANEXO 1

1.3. Electroforesis en Gel de Agarosa

La comprovación del estado del DNA, la cuantificación y la separación de
fragmentos se realitzan mediante electroforesis horitzontal en minigeles de agarosa. Los
geles se hacen a una concentración de agarosa del 0,7 % en 1xTAE, excepto cuando se
quieren separar bandas menores a 2 kb que se utiliza 1 ó 1’5%. Las electroforesis se
realizan a 70-80V, controlando la migración de las bandas mediante los colorantes azul
de bromofenol y cianol xileno contenidos en el tampón de carga. Los geles se tiñen una
vez finalizada la electroforesis para no interferir con la migración del DNA. La tinción
se realiza sumergiendo los geles durante 20 minutos en una solución de bromuro de
etidio en H2O destilada. El DNA se visualiza en un transiluminador de 312 nm y se
fotografia mediante Polaroid (película Polaroid 667, 3.000 ASA) o cámara digital.

Tampón de electroforesis 40mM Tris, 1mM EDTA pH 8, 1M àcid acètic

1xTAE(Tris-acetate-EDTA)
Preparación 50xTAE 242 g Tris base
100 mL EDTA 0,5 M
50 mL ácido acético
750 mL agua destilada
Ajustar a pH 7,5
Enrasar a 1 L

Tampón de carga 30% glicerol, azul de bromofenol, cianol xileno

Preparación 1,5 mL glicerol
3,5 mL agua destilada
Añadir una punta de espátula de cada colorante
Guardar a 4ºC.
El azul de bromofenol migra de forma similar al DNA lineal de 300 pb,
y el cianol xileno como el DNA lineal de unas 4 kb.

Patrones de peso molecular: DNA del fago λ digerido con HindIII

100 bp DNA Ladder (GIBCOBRL®)
pBSK circular
pBSK lineal (2.961 pb)

183
ANEXO 1

1.4. Digestión con Enzimas de Restricción

Poner en un eppendorf: 0’5 µL de enzima (10 unitades/µL)

1 µL de tampón de enzima
X µL de DNA
Y µL de agua destilada
10 µL totales

Mezclar, hacer un pulso e incubar a la temperatura indicada para cada enzima

(Habitualmente 37ºC).

Tiempo de incubación:
DNA genómico Toda la noche
DNA plasmídicos De 2 horas a toda la noche
DNA fagos lambda 1-2 horas
DNA BACs 3 horas

Con DNA plasmídico o de fagos se pueden realizar digestiones de comprovación

rápidas incubando 1 minuto en el microondas a máxima potencia, en estas condiciones
algunos enzimas producen fácilmente digestiones parciales.

184
 ANEXO 1

2. OBTENCIÓN DE EMBRIONES DE DROSOPHILA

2.1. Puesta
1. Preparar los medios de puesta.
(Las placas con el medio se pueden guardar a 4ºC varios días).
2. Precalentar las placas y poner la levadura justo antes de usar.
3. Poner la placa de medio con levadura en la Caja o Falcon de puesta (Figura A1).
Dejar a la temperatura óptima de la cepa.
4. Cambiar los medios de puesta después del tiempo deseado.
5. Los embriones se pueden recolectar inmediatamente o dejar las placas hasta un par
de días en la nevera (adecuado cuando las puestas contienen muy pocos embriones).
# Es conveniente empezar siempre con dos puestas de 1 hora, descartar estas puestas.

Medios de puesta:
D. melanogaster Agar al 2% con zumo de manzana, y una pizca de levadura.
D. pseudoobscura
D. virilis Agar con zumo de manzana y una capa fina de levadura (para
evitar que los huevos queden demasiado undidos en el medio).
D. buzzatii Agar al 2% con ácido acético y una capa fina de levadura
D. repleta (sólo ponen embriones sobre la levadura).

Figura A1. Cajas de puesta. Cuando no se dispone de cajas

de puesta, se utilizan tubos Falcon de 50 mL con agujeros de
ventilación. El medio de puesta se pone en una placa o tapón.

185
ANEXO 1

2.2. Recolección de Embriones

Para medios de puesta con una pizca de levadura
1. Poner el filtro Falcon (Figura A2) sobre un embudo y este sobre un erlenmeyer.
2. Coger los embriones con un pincel bajo la lupa y pasarlos al filtro.
3. Lavar con solución de lavado o con agua del grifo (No usar agua destilada).

Para medios de puesta con una capa de levadura

2. Con solución de lavado a cierta presión (utilizar una botella como la de limpiar el
pHmetro) soltar la levadura del medio sobre el filtro Falcon. Lavar la levadura con
los embriones sobre el filtro, la levadura se irá disolviendo y los embriones quedarán
retenidos en el filtro.

bjhjkhfkfuk

Figura A2. Filtro Falcon. El filtro se realiza con un trozo

de tubo Falcon de 50 mL y un trozo de malla de nylon.
Desmontar y lavar bien después de cada uso.

Solución de lavado 0,03% Triton-X100, 0,7% NaCl

Preparación 10x 300 µL Triton-X100
7 g NaCl
100 mL agua destilada

2.3. Decorionización
Decorionizar los embriones mediante inmersión en lejía.
1. Introducir el filtro con los embriones en un vaso de precipitados
pequeño con lejía 50%.
2. Mantener entre 2 y 5 minutos.
3. Controlar el proceso bajo la lupa.
4. Lavar con agua del grifo o con solución de lavado.
5. Secar ligeramente.

186
 ANEXO 1

2.4. Almacenaje
Para extracción de RNA:
1. Colocar el filtro boca abajo sobre una placa de Petri.
2. Hacer caer los embriones en la placa de petri con solución de lavado.
3. Rotar lentamente la placa de forma que los embriones se acumulen en el centro.
4. Recoger los embriones con una pipeta Pasteur y pasarlos a un eppendorf
(poner la pipeta vertical para que los embriones no se enganchen a la pared).
5. Centrifugar brevemente y eliminar el líquido.
6. Guardar los embriones a –20ºC.

Para hibridación in situ o tinción con anticuerpo fijar según protocolo (ver
Apartados 9.2 y 11.1.1).

187
ANEXO 1

3. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

3.1. Extracción de DNA Plasmídico por Lisis Alcalina

(Partiendo de glicerinado) 1. Sembrar en placa para obtener colonias aisladas.
Incubar toda la noche a 37ºC. Guardar a 4ºC.
2. Inocular un tubo con 3 mL de LB ó TB + antibiótico con una colonia aislada de la
bacteria. Incubar toda la noche a 37ºC en agitación.
3. Pasar 1,5 mL del cultivo a un eppendorf. (En caso de haber poco pellet se pueden
4. Centrifugar 30 segundos. añadir otros 1,5 mL de cultivo)
5. Eliminar el sobrenadante por aspiración.
6. Centrifugar 10 segundos.
7. Eliminar los restos de medio con punta amarilla.
8. Resuspender en 100 µL de solución I fría (4ºC).
9. Vortear hasta homogeneizar.
10. Poner en hielo.
11. Añadir 200 µL de solución II (reciente).
12. Agitar por inversión hasta que esté transparente (lisis celular).
13. 5 minutos en hielo (no pasarse).
14. Añadir 150 µL de solución III fría (4ºC).
15. Agitar por inversión hasta que se forme precipitado.
16. 5-10 minutos en hielo.
17. Centrifugar 5 minutos.
18. Pasar el sobrenadante a otro eppendorf, NO arrastrar sedimento.
19. Desproteinizar con fenol:cloroformo (1:1)
a. Añadir 1 volumen (450 µL) de fenol:cloroformo.
b. Agitar hasta obtener emulsión homogénea.
c. Centrifugar 5 minutos.
d. Transferir la fase acuosa (superior) a otro eppendorf.
20. Desproteinizar con cloroformo isoamílico (24:1, v/v)
a. Añadir 1 volumen de cloroformo isoamílico.
b. Mezclar por inversión.
c. Centrifugar 5 minutos.
d. Transferir la fase acuosa (superior) a otro eppendorf.

188
 ANEXO 1

# Opcional: segundo lavado con cloroformo isoamílico.

21. Precipitar con etanol absoluto

a. Añadir 2 volúmenes (900 µL) de etanol absoluto frío (-20ºC).
b. Mezclar por inversión.
c. Dejar a -20ºC durante 20 minutos (hasta un fin de semana).
d. Centrifugar 10 minutos.
e. Eliminar el sobrenadante por aspiración.
22. Lavar el sedimento con 1 volumen de etanol 70%.
23. Secar: con espaditas de papel Whatman + vacío.
24. Resuspender en 15-20 µL de H2O mQ.
25. Añadir 0,5 µL de RNasa. Dar un pulso.
26. Incubar 30 minutos a 37ºC.
27. Guardar a 4ºC. # Utilizar 1 µL para el gel de comprobación.

Solución I 50 mM glucosa, 10 mM EDTA pH 8, 25 mM Tris HCl pH 8

Preparación 0,9 g de glucosa
2 mL de EDTA 0,5 M
2,5 mL de Tris 1M
Agua hasta 90 mL
Ajustar pH a 8,0
Enrasar a 100 mL con agua destilada

Solución II NaOH 0,2 M, SDS 1%

Preparación 500 µL SDS 20%
200 µL NaOH 10N
Enrasar a 10 ml con agua destilada

Solución III
Preparación 11,5 mL ácido acético glacial
60 mL acetato potásico
28,5 mL agua destilada

189
ANEXO 1

3.2. Extracción de DNA Genómico de Adultos de Drosophila

La extracción de DNA genómico de Drosophila se basa en el protocolo descrito
por Piñol et al. (1988).

1. Cargar el homogeneizador con 0,2 g de moscas anestesiadas en hielo.

2. Añadir 5 mL de tampón A (a 4ºC).
3. Homogeneizar la mezcla con 10 emboladas del pistón del taladro a 2.000 rpm.
4. Filtrar a través de una malla de nylon de 150 mesh sobre un tubo de 10 mL.
5. Añadir 5 mL de tampón A.
Trabajar a 4ºC.

6. Centrifugar 10 minutos a 4.000 rpm.

7. Decantar el sobrenadante.
8. Lavar 3 veces con 10 mL de tampón B. a. añadir 10 mL tampón B.
b. resuspender.
c. centrifugar 10 minutos a
4.000 rpm.
d. decantar sobrenadante.
9. Resuspender los núcleos en 1,5 mL de tampón B.
10. Añadir 1 mL de perclorato sódico 4 M. Mezclar bien.
11. Añadir 1 mL de SDS 4%. Mezclar bien.
12. Desproteinizar con 1 volumen de fenol-cloroformo (1:1).
(centrifugar cada vez 5 minutos a 4.000 rpm)
13. Desproteinizar dos veces con 1 volumen de cloroformo-isoamilalcohol (24:1, v/v).
14. Añadir 2,5 volúmenes de etanol absoluto frío.
Mezclar por inversión con cuidado. (Deberían verse los “hilos” de DNA.)
15. Dejar a –20ºC durante un mínimo de 30 minutos.
16. Pasar los “hilos” de DNA con cuidado a un eppendorf de 1,5 mL.
17. Centrifugar 10 minutos a 12.000 rpm.
18. Lavar con etanol 70%.
19. Secar al vacío.
20. Añadir 50 µL de agua destilada miliQ, resuspender unas horas a 37 ó 42ºC.
21. Guardar a 4ºC.

190
 ANEXO 1

Tampón A 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0’5% Triton X-100,

20 mM Tris-HCl pH 7’5
Preparación 100 mL Tampón B
500 µL Triton X100 (sacar de la nevera para descongelar)

Tampón B 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 7’5

Preparación 20 mL de NaCl 5 M
20 mL de EDTA 0’5 M
20 mL de Tris 1 M
900 mL de agua destilada
Ajustar pH a 7,5
Enrasar a 1 L

191
ANEXO 1

3.3. Extracción de DNA de Fagos

El método utilizado para la extracción de DNA de fagos se basa en el Plate
Lysate Method descrito por Sambrook et al. (1989).

(Partir de un lisado previamente 1. Infectar una placa de LBosa a una concentración

titulado) suficiente para producir una lisis total.
2. Incubar toda la noche a 37ºC.
3. Añadir 3 mL de λ diluent.
4. Dejar a 4ºC toda la noche (se puede prescindir de este paso,
(o un fin de semana). pero se obtiene un rendimiento menor)
5. 1 ó 2 horas en agitación a temperatura ambiente.
6. Recuperar el líquido en un tubo de 10 mL.
7. Añadir 0,5 mL de λ diluent en la placa.
8. Mantener las placas inclinadas 15 minutos a temperatura ambiente.
9. Recuperar el resto del líquido.
10. Centrifugar 10 minutos a 4.000 rpm a 4ºC.
11. Transferir el sobrenadante, por decantación, a un tubo nuevo.
12. Añadir 0,5 µL de RNasa (0,5 µg/µL) y 0,5 µL de DNasa (1 µg/µL).
13. Incubar 30 minutos a 37ºC.
14. Añadir un volumen (3 mL) de solución de precipitación de fagos.
15. Mezclar bien e incubar 1 hora a 0ºC. (Poner los tubos en un vaso de precipitados
con agua y hielo, dentro de un recipiente con
hielo)

16. Repartir el contenido de cada tubo de 10 mL en 3 eppendorf de 1,5 mL.

17. Centrifugar 10 minutos a 12.000 rpm.
18. Eliminar completamente el sobrenadante.
19. Resupender el sedimento en 170 µL de agua destilada miliQ, con ayuda del vortex.
20. Juntar de nuevo el contenido de los 3 eppendorf correspondientes a una misma
extracción.

21. Añadir 5 µL de SDS 10%.

22. Incubar 5 minutos a 65ºC.

192
 ANEXO 1

23. Añadir 10 µL de NaCl 5M.

24. Desproteinizar con 1 volumen de (mismo procedimiento que en la
fenol-cloroformo (1:1). extracción de DNA plasmídico.)
25. Desproteninizar 2 veces con 1 volumen de cloroformo-isoamilalcohol (24:1, v/v).
26. Precipitar con 500 µL de isopropanol frío (-20ºC).
27. Dejar 1 hora a –20ºC.
28. Centrifugar 15 minutos a 12.000 rpm.
29. Lavar el sedimento con etanol 70%.
30. Resuspender en 50 µL de agua destilada miliQ.

En las primeras extracciones se realizaba un tratamiento con RNasa similar al de

la extracción de DNA plasmídico, este tratamiento se ha eliminado del protocolo para
reducir la degradación de los fagos en las digestiones posteriores con enzimas de
restricción.

λ diluent 10 mM TrisHCl pH 7’5, 10 mM MgSO4

Preparación 1 mL de Tris HCl 1 M pH 7,5
1 mL de MgSO4 1 M
98 mL de agua destilada

Solución de precipitación de fagos 20% w/v polietilenglicol, 2M NaCl en λ diluent

Preparación 10 g PEG8000 (20%)
Disolver en λ diluent (hace muchas burbujas)
Dejar reposar
5,844 g NaCl
Enrasar a 50 mL en λ diluent

193
ANEXO 1

3.4. Extracción de DNA a Partir de Geles de Agarosa

El DNA de bandas de restricción o de productos de PCR se ha purificado
mediante extracción a partir de gel de agarosa. Para fragmentos de > 500 pb se ha
utilizado el Kit Geneclean® (BIO101 Inc.) basado en la utilitzación del GLASSMILK®,
o la variante Kit Geneclean SPIN® si se quería secuenciar el producto. Para fragmentos
< 500 pb se ha utilizado el kit Wizard® PCR Preps DNA Purification System (Promega)
basado en la utilización de resinas.

1. Separar la muestra en un gel de agarosa (preferiblemente al 0,7 %).

Teñir el gen con bromuro de etidio y fotografiar (Cuidado con el transiluminador)
2. Cortar la banda. Poner en un eppendorf (Geneclean) o tubo de 5 mL (Wizard).
3. Añadir 3 µL de NaI 6 M por mg de agarosa.
4. Dejar 5 minutos en un baño a 55ºC, o hasta que se deshaga la agarosa.

Kit Geneclean® Kit Geneclean SPIN®

5. Resuspender bién el GLASSMILK® con ayuda del vortex,
si está sólido o muy denso añadir agua destilada.
6. Poner 5 µL de GLASSMILK®. Resuspender bien.
7. Dejar 20 minutos en hielo. Mezclar cada 5 minutos.
8. Centrifugar 1 minuto. 8. Transferir la suspensión a una columna.
Centrifugar 1 minuto.
9. Lavar el sedimento 3 veces con 500 µL de Solución NEW.
10. Secar el sedimento con “espaditas”, 10. Centrifugar para eliminar el resto del
y 2 minutos al vacío. líquido. Dejar el tubo abierto 2 minutos.
11. Añadir 7-15 µL de agua miliQ 11. Añadir 20-30 µL de agua miliQ
y resuspender bien. precalentada a 55ºC.
12. Incubar 5 minutos a 55ºC. 12. Centrifugar sobre un eppendorf nuevo.
13. Centrifugar 1 minuto. # Opcional: volver a pasar el agua por la
14. Pasar el sobrenadante a otro eppendorf. columna para aumentar el rendimiento.
(Controlar que no quede GLASSMILK®)
# Opcional: Para aumentar el rendimiento,
repetir pasos 11 a 14 con un volumen
menor.

194
 ANEXO 1

Wizard® PCR Preps DNA Purification System

5. Resuspender bién la resina en el vórtex
6. Añadir 1 mL de resina. Mezclar bién.
7. Masar la mezcla por una Wizard Minicolumn con ayuda de una jeringa.
8. Hacer dos lavados de la columna con 3 mL de isopropanol (con la jeringa).
9. Pasar la minicolumna a un eppendorf de 1,5 mL.
10. Centrifugar 2 minutos para eliminar el líquido de la columna.
11. Dejar secar a temperatura ambiente entre 5 y 15 minutos.
12. Transferir la minicolumna a un eppendorf nuevo
13. Añadir 25-50 µL de agua miliQ precalentada a 50-55ºC sobre la resina
y esperar 2 minutos.
14. Centrifugar 1 minuto.
# Opcional: volver a pasar el agua por la columna para aumentar el rendimiento.
15. Descartar la columna.
16. Guardar a 4ºC.

195
ANEXO 1

3.5. Extracción de RNA

Todo el proceso de extracción debe hacerse con material libre de RNasa y con
guantes. Cambiar los guantes regularmente o cuando toquemos alguna fuente de
contaminación con RNasa. Usar el reactivo TRIZOL y el cloroformo en la campana de
gases. Todos los volúmenes de reactivos se dan para muestras de 50-100 mg de tejido.

Homogeneización: 1. Añadir a la muestra 1 mL de TRIZOL. Homogeneizar con

la pipeta de 1 mL o con una varilla autoclavada.
(Especialmente los embriones son difíciles de homogeneizar, pero aunque parezcan
bastante enteros siempre se obtiene RNA).

Separación de fases: 2. Incubar las muestras 5 minutos a temperatura ambiente

(entre 15 y 30ºC).
3. Añadir 200 µL de Cloroformo (SIGMA C2432).
4. Agitar vigorosamente durante 15 segundos.
5. Incubar a temperatura ambiente 2 ó 3 minutos (o más).
6. Centrifugar a ≤12.000x g a 4ºC durante 15 minutos.
Precipitación del RNA: 7. Transferir la fase acuosa (superior) a otro eppendorf.
8. Añadir 500 µL de isopropyl alcohol.
9. Mezclar por inversión.
10. Incubar 15 minutos a -20ºC.
11. Centrifugar a ≤12.000x g a 4ºC durante 15 minutos.
Lavado del RNA: 12. Eliminar el sobrenadante.
13. Añadir 1 mL de etanol 75%.
14. Mezclar con el Vórtex (para soltar el pellet).
15. Centrifugar a 7.500x g a 4ºC durante 5 minutos.
Redisolución del RNA: 16. Eliminar el sobrenadante y secar el pellet al aire o en la
cámara de vacío 1 ó 2 minutos.
17. Disolver en 50 µL de DEPC-H2O. Incubar a 55ºC
durante 10 minutos.
18. 5 minutos en hielo.
19. Guardar a -20ºC.

196
 ANEXO 1

4. AMPLIFICACIÓN POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA – PCR

4.1. Obtención de cDNA (RT-PCR)

4.1.1. Tratamiento con DNasa
Protocolo para la “RQ1 RNase-Free DNase” (Promega).
1. Poner en un eppendorf: 2 µL de RNA
1 µL tampón de enzima 10x
1 µL DNasa
6 µL H2O miliQ estéril
2. Hacer un pulso.
3. Incubar 30 minutos a 37ºC.
4. Añadir 1 µL stop solution.
5. Incubar 10 minutos a 65ºC.
6. Poner en hielo.
#Si no se usa inmediatamente, guardar a -4ºC unas horas o a -20ºC.

4.1.2. Síntesis de cDNA

Protocolo para el “1st Strand cDNA Síntesis Kit for RT-PCR (AMV)” (Roche).
1. Poner en un eppendorf: 10 µL de RNA tratado con DNasa 2 µL de RNA sin tratar
1,2 µL H2O miliQ estéril 5,2 µL H2O miliQ estéril
4 µL MgCl2 25 mM.
2 µL tampón de enzima 10x
2 µL dNTP Mix
2 µL Random primers
1 µL RNase inhibitor
1 µL de gelatina
0,8 µL AMV
2. Hacer un pulso.
3. Incubar 10 minutos a 25ºC.
4. Incubar 60 minutos a 42ºC.
5. Incubar 5 minutos a 99ºC.
6. Poner en hielo.
#Si no se usa inmediatamente, guardar a -4ºC unas horas o a -20ºC.

197
ANEXO 1

Protocolo para la “Transcriptor Reverse Transcriptasa” (Roche).

1. Poner en un eppendorf: 10 µL de RNA tratado con DNasa.
4 µL tampón de enzima 5x
2 µL dNTP Mix
2 µL Random primers
0,5 µL RNase inhibitor
0,5 µL transcriptasa (20 U/ µL)
1 µL H2O miliQ estéril
2. Hacer un pulso.
3. Incubar 10 minutos a 25ºC.
4. Incubar 30 minutos a 55ºC.
5. Incubar 5 minutos a 85ºC.
6. Poner en hielo.
#Si no se usa inmediatamente, guardar a -4ºC unas horas o a -20ºC.

198
 ANEXO 1

4.2. Amplificación de DNA (PCR)

Las reacciones de PCR se realizan en un volumen de 25 µL si se trata de una
comprobación o de 50 µL cuando se quiere obtener cantidad para usos posteriores (en
este caso hay que duplicar los volúmenes indicados). Habitualmente se amplifica DNA
o cDNA, pero también se puede amplificar directamente fagos en SM sin purificación
previa del DNA.

Poner en un eppendorf: 0,5 ó 1 µL de muestra

(de 0,5 ó 0,2 µL) 2,5 µL de tampón de enzima
0,75 µL de MgCl2 50mM*
2,5 µL de mezcla de nucleótidos
0’1 µL de cada oligonucleótido (100 pmol/µL)
ó 2,5 µL (4 pmol/µL)
0,1 µL Taq polimerasa
Hasta 25 µL de agua miliQ estèril
*Si no está incluido en el tampón de enzima.

Incorporar siempre una reacción de resultado conocido como control positivo y

una reacción sin DNA como control negativo.
Las condiciones de amplificación se especifican en la Tabla siguiente.

Tabla A1. Condiciones de la amplificación por PCR

Nº de ciclos Temperatura Tiempo
5’ genomico
Desnaturalitzación 1 94º
1’ cDNA
Desnaturalitzación 94º 30’’
Amplificación 30 Apareamiento Según reacción 30’’
Polimeritzación 72º 1’ 30’’
Finalización de
1 Polimeritzación 72º 7’
reacciones

199
ANEXO 1

5. CLONACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA

Los fragmentos de DNA provinentes de digestión con enzimas de restricción se
han clonado en pBSK y los productos de PCR en pGEM-T o pGEM-Teasy.

5.1. Obtención de DNA del Inserto

Para clonar el DNA procedente de digestión o de PCR se purifica segun los
protocolos del Apartado 3.4. El DNA obtenido se resuspende en el volumen mínimo
que pemite el método de purificación utilizado.

5.2. Ligación
En pBSK: 1. Poner en un eppendorf: 7 µL DNA inserto
1 µL DNA vector linealizado
2. Incubar 5 minutos a 65ºC.
3. 10 minutos en hielo
4. Añadir: 1 µL de tampón de Ligasa 10x
1 µL de T4 DNA ligasa (1 unidad/ µL)
5. Incubar toda la noche a 14-16ªC,
ó 3-4 horas a temperatura ambiente.

En pGEM-T o pGEM-Teasy:
Tampón 10x 1. Poner en un eppendorf:
7 µL DNA inserto
1 µL vector
1 µL tampón ligasa 10x
1 µL ligasa
2. Incubar a 4ºC durante toda la noche.

Tampón 2x 1. Poner en un eppendorf:

3 µL DNA inserto
1 µL vector
5 µL tampón ligasa 2x
1 µL ligasa
2. Incubar 2 horas a temperatura ambiente

200
 ANEXO 1

5.3. Obtención de Células Competentes

El método de obtención de células competentes se basa en que el tratamiento con
cationes bivalentes y a baja temperatura desestructura la membrana celular favoreciendo
la incorporación de DNA plasmídico.

1. Inocular 3 mL de medio LB con una colonia de DH5αf’.

2. Crecer a 37ºC en agitación durante toda la noche.
3. Inocular 20 mL de medio LB con 200 µL del cultivo anterior.
4. Incubar a 37ºC en agitación hasta que la OD550 esté a 0,5 (unas 3 horas).
5. Mantener el cultivo en hielo durante 15-20 minutos.
6. Repartir el cultivo en 2 tubos de 10 mL.
7. Centrifugar 10 minutos a 4.000 rpm a 4ºC.
8. Descartar el sobrenadante.
9. Resuspender las células en ½ del volumen inicial de CaCl2 50 mM frío y estéril
(5 mL por tubo).
10. Mantener 1 hora en hielo.
11. Centrifugar 10 minutos a 4.000 rpm a 4ºC.
12. Descartar el sobrenadante.
13. Resuspender, muy suavemente, las células en 1/10 del volumen inicial de
CaCl2 50 mM (1 mL por tubo).
14. Mantener 1 hora en hielo.
15. Añadir un 15% de glicerol (176 µL por tubo) .
16. Hacer alícuotas de 50 ó 100 µL.
17. Guardar a –70ºC hasta su utilización.

201
ANEXO 1

5.4. Transformación
La tranformación se ha realizado por el método de choque térmico.
Rutinariament se han utilitzado 5 µL de ligación para transformar una alíquota de
células competentes, pero en casos en que es partía de poco DNA o de mala calidad se
utilizan los 10 µL.

1. Descongelar una alícuota de células competentes en hielo durante 10 – 15 minutos.

2. Añadir 5-10 µL de ligación, mezclar con suavidad.
3. Dejar 20 minutos en hielo.
4. Someter a un choque térmico a 42ºC durante 2 minutos.
5. Añadir 500 µL de medio LB precalentado a 37ºC, mezclar suavemente.
6. Incubar 1 hora a 37ºC.
7. Sembrar, con el asa de Digralsky, 200 µL en una placa de LB Amp-XGal.
8. Incubar a 37ºC con agitación durante toda la noche.

5.5. Selección de Colonias Transformantes

La selección de colonias transformantes se realiza por α-complementación
mediante la observación de la activitat β-galactosidasa en placas con Ampicilina y X-
Galactosa. Las colonias transformantes aparecen de color blanco, pero en el caso de
insertos pequeños (menores de 2 kb) el plásmido puede producir proteína parcialmente
funcional dando lugar a colonias azuladas que pueden resultar difíciles de distinguir de
las colonias con plásmidos no recombinantes.

Una vez identificados los posibles positivos se resiembran en placa y se realiza

un cultivo de noche para extraer DNA plasmídico y analitzar los clones con enzimas de
restricción para verificar que contienen el inserto deseado. La comprovación de los
clones se realiza por digestión con los mismos enzimas de la clonación, en el caso de
pBSK, con EcoRI para pGEM-Teasy, o con otros enzimas segun la información previa
disponible. De los clones seleccionados se guardan dos alícuotas de cultivo de 750 µL
en glicerol al 30% a –20ºC.

202
 ANEXO 1

6. HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Las técnicas de Hibridación de ácidos nucleicos se basan en la hibridación

específica de un DNA o RNA marcado con la secuencia o secuencias complementarias
existentes en una determinada muestra. El esquema de la Figura A3 muestra los pasos
básicos de cualquier proceso de hibridación. Se denomina hibridación in situ cuando la
muestra consite en una sección de tejido, células o cromosomas preservados
morfológicamente (Wilkinson 1992).

Preparación de la Marcaje de
muestra la sonda

Desnaturalización de la sonda
y de la muestra

Hibridación

Lavados

Revelado

Visualización

Figura A3. Esquema de los principales pasos de las técnicas de hibridación.

203
ANEXO 1

7. HIBRIDACIÓN POR TRANSFERENCIA A FILTRO – SOUTHERN BLOT

La técnica de transferencia descrita por Southern (1975) permite la localitzación

de una determinada secuencia en DNA genómico, clonado o producto de PCR. El DNA
se corta con enzimas de restricción y los fragmentos obtenidos se separan mediante un
gel de agarosa. El DNA se desnaturaliza in situ y se transfiere a un filtro donde se
hibrida con una sonda marcada y se revela de manera que podemos localizar las
posiciones de las bandas complementarias a la sonda.

7.1. Digestión del DNA y Electroforesis de Transferencia

Realizar las digestiones en un volumen total de 25 µL (ver Apartado 1.3. para
proporciones y tiempos de incubación). Comprobar 5 µL de digestión en un minigel.
Realizar la eletroforesis de tranferencia en una cubeta larga, correr el gel despacio y
fotografiarlo con una regla fluorescente al lado del marcador de peso molecular,
situando el cero a la altura de los pocillos. Irradiar la mitad superior del gel durante un
minuto para fragmentar el DNA de gran tamaño y facilitar su transferencia.

7.2. Transferencia
Se utiliza el protocolo de transferencia por capilaridad a membrana de nylon en
condicions neutras descrito en Sambrook et al. (1989).

1. Desnaturalizar el gel 1 hora en solución de desnaturalización fresca,

a temperatura ambiente y agitación suave.
2. Neutralitzar el gel en solución de neutralització durante 1 hora y en agitación suave.
3. Montar la transferencia:
a. Lavar bien con agua destilada todo el material incluidos los gastos.
b. Cortar un trozo de filtro de nylon y tres de papel Whatmman del tamaño del gel
y un trozo de papel Whatmman largo.
c. Poner 200 mL de 10xSSC nuevo en la fiambrera de transferencia.
d. Colocar la placa de la transferencia perpendicular sobre la fiambrera.
e. Humedecer el papel Whatman largo en el 10xSSC y colocar perpendicular
a la placa con los extremos sumergidos en el 10xSSC.
f. Eliminar la burbujas del papel Whatman con una pipeta de vidrio.

204
 ANEXO 1

g. Poner en la fiambrera hasta 1 L de 10xSSC reutilizado.

h. Colocar el gel boca abajo sobre el papel Whatman (el DNA queda hacia arriba).
i. Eliminar el aire con la pipeta de vidrio.
j. Preparar 100 mL de 2xSSC, poner en una fiambrera pequeña.
k. Humedecer el filtro de nylon en el 2xSSC, y colocarlo sobre el gel.
l. Eliminar el aire con la pipeta de vidrio.
m. Humedecer los tres papeles Whatman y colocar uno a uno sobre el filtro.
n. Eliminar el aire con la pipeta de vidrio.
o. Poner parafilm alrededor del gel.
p. Poner 8-10 cm de papel absorbente (servilletas) sobre los papeles Whatman.
q. Colocar un peso sobre el papel absorbente.
r. Dejar transferir por capilaridad durante unas 16 horas.
4. Retirar el peso y los papeles absorbentes.
5. Invertir los papeles Whatman con el gel y el filtro en su interior.
(Queda el gel encima y el filtro debajo)
6. Marcar los pocillos en el filtro y
marcar una esquina para reconocer la posición del DNA.
7. Lavar el filtro en 2xSSC (guardado del dia anterior) y dejar secar.
8. Irradiar el filtro 3 minutos por cara para fijar el DNA.
9. Teñir de nuevo el gel para comprobar como ha ido la transferncia.

pes (500-1000 g)
placa de vidre

paper absorbente
3 papers Whatman 3MM
FILTRE gel d’electroforesis
marc impermeable
paper Whatman 3MM
10 x SSC

Figura A4. Esquema del dispositivo de transferencia.

205
ANEXO 1

Solución de desnaturalización 1,5M NaCl, 0,5M NaOH

Preparación 5 g NaOH
21,9 g NaCl
250 mL agua destilada

Solución de neutralización 1,5M NaCl, 0,5M TrisHCl pH 7,5

Preparación 500 mL TrisHCl 1 M pH 7,5
87,7 g NaCl
Enrasar a 1 L con agua destilada
Autoclavar

7.3. Marcaje y Comprovación de la Sonda

La sonda se marcan de forma no radioactiva con digoxigenina (digoxygenin-11-
dUTP) utilizando el kit “DIG DNA Labeling and Detection Kit” (ROCHE), siguiendo el
protocol de “random primer”. Para una mayor eficiencia en el marcaje y para evitar
posibles inespecificidades, se realiza una extracción del DNA a partir de gel de agarosa
(ver Apartado 3.4.), eliminando así los restos de PCR o el DNA del vector.

1. Desnaturalizar 15 µL de DNA hirviendo 10 minutos.

2. Poner en hielo.
3. Añadir en hielo 2 µL de hexanucleótidos
2 µL de dNTP de marcaje
1 µL de Klenow
4. Mezclar bien y hacer un pulso.
5. Incubar a 37ºC de 1 a 24 horas.
6. Añadir 2 µL de EDTA 0,2 M pH 8 para parar la reacción.
7. Añadir 2,5 µL de ClLi 4 M y 75 µL de etanol absoluto frío.
8. Precipitar 2 horas a –20ºC.
9. Centrifugar 15 minutos.
10. Lavar el pellet con 50 µL de etanol 70% frío.
11. Secar el pellet.
12. Resuspender en 50 µL de agua miliQ.
13. Guardar a –20ºC.

206
 ANEXO 1

Comprobar el macaje mediante “dot blot”.

1. Hacer 4 diluciones de la sonda (dil –1: 1 µL de sonda + 9 µL de agua;
dil –2: 1 µL dil –1 + 9 µL de agua...)
2. En un fragmento de filtro de nylon poner 1 µL de cada dilución de sonda
y de DNA control.
3. Dejar secar
4. Fijar el DNA al filtro.
5. Revelar el filtro. (ver Apartado 6.5.) (5 mL solución de anticuerpo)
(2 mL solución de coloración)

7.4. Hibridación
7.4.1. Prehibridación e Hibridación
1. Incubar el filtro 1-2 horas en 10 mL de solución de hibridación,
a la temperatura de hibridación (42ºC para homólogas y 37ºC para heterólogas)
2. Mientras desnaturalizar la sonda: Hervir 5 minutos
Poner en hielo
3. Poner la sonda desnaturalizada en 10 mL de solución de hibridación
precalentada a temperatura de hibridación.
# Las sondas reutilizadas se desnaturalizan 10 minutos a 65ºC.
4. Descartar la solución de prehibridación y
añadir la solución de hibridación con sonda.
5. Incubar a la temperatura de hibridación durante mínimo 16 horas para DNA
genómico ó 12 horas para DNA de clones.

50% formamida, 0’02% SDS,

Solución de hibridación 0’1% N-laurilsarcosina,
2’5% reactivo de bloqueo, 25% 20xSSC
Preparación 50 mL formamida
0,1 mL SDS 20%
0,1 g N-laurilsarcosina
2,5 g reactivo de bloqueo (ó 25 mL al 10%)
Enrasar a 10 mL con agua destilada
Guardar a –20ºC

207
ANEXO 1

7.4.2. Lavados Posthibridación

1. Dos lavados de 15 minutos en 2xSSC 0’1% SDS a temperatura ambiente.
2. Dos lavados de 20 minutos en 0’1xSSC 0’1% SDS a 68ºC (homólogo)
ó 50ºC (heterólogo).

2xSSC 0’1% SDS

Preparación 100 mL 20xSSC
5 mL SDS 20%
Enrasar a 1 L
Autoclavar

0,1xSSC 0’1% SDS

Preparación 5 mL 20xSSC
5 mL SDS 20%
Enrasar a 1 L
Autoclavar

7.5. Revelado e Interpretación de los Resultados

1. Lavar 5 minutos en Tampón 1, en agitación.
2. Incubar 30 minutos en 100 mL de solución de bloqueo a temperatura ambiente,
con agitación suave.
3. Incubar 30 minutos en 20 mL de solución de anticuerpo a temperatura ambiente.
4. Lavar 2 veces 15 minutos en Tampón 1, en agitación.
5. Equilibrar 5 minutos en Tampón 3.
6. Revelar entre 2 y 20 horas, a oscuras, en 10 mL solución de coloración
recién preparada.
7. Lavar con abundante agua destilada.
8. Dejar secar.

Para estimar el tamaño de las bandas reveladas se utilitza como referencia la

fotografía del gel con la regla milimetrada al lado del marcador de peso molecular.

208
 ANEXO 1

Tampón 1 0,1 m ácido maleico, 0,15 M NaCl, pH 7,5

Preparación 11,607 g ácido maleico
8,766 g NaCl
7,5 g NaOH
Ajustar a pH 7,5
Enrasar a 1 L con agua destilada

Tampón 3
Preparación 100 mL TrisHCl 1 M
5,844 g NaCl
10,17 g MgCl2
Ajustar a pH 9,5 con NaOH (26-30 lentejas)
Enrasar a 1 L con agua destilada

Solución de bloqueo
Preparación 100 mL Tampón 1
1 g leche en polvo
ó 90 mL Tampón 1
10 mL Reactivo de bloqueo 10%

Solución de anticuerpo
Preparación 20 mL Solución de bloqueo
4 µL anticuerpo (Antidigoxigenin-AP)

Solución de coloración
Preparación 10 mL Tampón 3
200 µL NBT/BCIP Stock Solution

209
ANEXO 1

8. HIBRIDACIÓN IN SITU SOBRE CROMOSOMAS POLITÉNICOS

El protocolo de hibridación in situ utilizado ha sido el descrito por Montgomery

et al. (1987) con pequeñas modificaciones.

8.1. Preparaciones Cromosómicas

Para la obtención de preparaciones cromosómicas es necesario en primer lugar
siliconizar los cubreobjetos y tratar los portaobjetos para aumentar la adherencia del
material biológico y evitar así la perdida de material durante el proceso de hibridación
in situ.

8.1.1. Siliconizado de los Cubreobjetos

1. Hervir ácido clorhídrico 1 N en un vaso de precipitados.
2. Colocar 50-100 cubreobjetos y moverlos con una varilla mientras hierven
durante 5 minutos.
3. Aclarar los cubreobjetos con H2O destilada.
4. Dejar secar 20 minutos.
5. Sumergir los cubreobjetos uno a uno en etanol.
6. Dejar secar.
7. En una campana de gases pasar los cubreobjetos uno a uno por una
solución Repel-Silane (20 g/l dimetilclorosilano en 1,1,1-triclorometano).
8. Dejar secar dentro de la campana.
9. Lavar los cubreobjetos uno a uno en etanol.
10. Dejar secar.
11. Guardar a temperatura ambiente en una caja protegidos del polvo.

8.1.2. Tratamiento de los Portaobjetos

1. Hervir ácido clorhídrico 1 N en un vaso de precipitados.
2. Colocar los portaobjetos de 20 en 20 y dejar hervir 5 minutos.
3. Poner los portaobjetos en una cubeta con H2O destilada.
4. Sacarlos y pasarlos uno a uno bajo un chorro de H2O destilada.
# Opcionalmente se pueden dejar toda la noche en una cubeta con H2O destilada.
5. Secar los portaobjetos durante una hora.

210
 ANEXO 1

6. Poner los portaobjetos en una cubeta con solución SSC Denhart en una baño a 65°C.
Dejarlos en esta solución entre 2 y 3 horas.
7. Poner los portaobjetos en una cubeta con etanol:ácido acético (3:1)
durante 20 minutos.
8. Sumergir los portaobjetos durante 2 segundos unas 10 veces en una cubeta
con etanol al 95%.
9. Dejar secar y guardarlos a 4°C.

SSC Denhart
Preparación 0,012 g polivinilpirrolidona
0,012 g ficoll
0,012 g albúmina de suero bovino
90 ml 20xSSC
600 ml H2O destilada

8.1.3. Disección de las Glándulas Salivares

Pera obtener un buen material que maximice la probabilidad de éxito en la
hibridación se utilizan larvas de tercer estadio crecidas a baja densidad.

1. Lavar la zona de trabajo con alcohol.

2. Colocar una gota de ácido acético al 45% (recién preparado) sobre un portaobjetos
limpio.
3. Poner sobre el acético una larva de tercer estadio y diseccionarla bajo la lupa con dos
pinzas: unas sujetando la larva por la parte distal y las otras por la parte proximal.
Estirar en línea recta de modo que queden a la vista las glándulas salivares.
4. Con dos alfileres finos eliminar la grasa que queda adherida a las glándulas.
5. Poner sobre un cubreobjetos siliconizado 8 µl de solución
ácido láctico:H2O destilada:ácido acético (1:2:3).
6. Transferir las glándulas a esta gota donde se dejan 8-10 minutos.
7. Dejar caer con cuidado un portaobjetos tratado sobre el cubreobjetos.
8. Girar el portaobjetos y mirarlo al microscopio. Se han de ver los núcleos y dentro
de ellos los cromosomas separados por la acción del ácido láctico.

211
ANEXO 1

9. Picar sobre el cubreobjetos con una punta de pipeta para romper los núcleos y
separar bien los cromosomas.
10. Poner un pliegue de papel absorbente sobre el cubreobjetos y presionar con el
pulgar. Hay que evitar el desplazamiento del cubreobjetos para que los
cromosomas no se rompan.
11. Observar las preparaciones al microscopio, seleccionar las mejores y colocarlas
en una carpeta plana que se dejará en posición horizontal toda una noche.
12. Coger un portaobjetos y sumergirlo en nitrógeno líquido hasta que este deje
de burbujear.
13. Colocar el filo de una cuchilla entre una esquina del cubreobjetos y el portaobjetos
y tirar hacia arriba hasta que salte el cubreobjetos.
14. Colocar el portaobjetos en una cubeta con etanol al 95% un mínimo de 15 minutos.
15. Dejar secar los portaobjetos y mirar al microscopio para seleccionar las mejores
preparaciones que se guardarán a 4°C hasta su hibridación.

8.2. Marcaje y Tratamiento de las Sondas

Las sondas se marcan con dUTP-biotina mediante el método de desplazamiento
de mella o “nick translation” descrito por Montgomery et al. (1987) cuando se trata de
fagos o clones o por “random primer” en el caso de productos de PCR sin clonar.

La reacción de desplazamiento de mella se basa en la utilización de dos enzimas:

DNasa I y DNA polimerasa. La DNasa I introduce cortes de cadena sencilla en la
molécula de DNA. La actividad exonucleasa 5´→3´ de la DNA polimerasa elimina
mononucleótidos en el extremo 5´ del nick. Esta enzima cataliza también la
incorporación de nucleótidos marcados y no marcados a las dos cadenas del DNA. El
parámetro más crítico en la reacción de es la actividad DNasa I. Si la actividad es
demasiado baja la incorporación de nucleótidos marcados es muy baja y las sondas
serán demasiado largas. Si es demasiado alta las sondas serán demasiado pequeñas
(Leitch et al. 1994).

212
 ANEXO 1

1. Poner en un eppendorf: 500 ng de sonda

hasta 16 µL de H2O estéril
2. Añadir 2,5 µL de tampón de la reacción de marcaje.
3. Añadir 3,75 µL de nucleótidos no marcados.
4. Añadir 1,25 µL de 16-biotina-UTP.
5. Añadir 1 µL de DNasa que previamente hemos disuelto en SM gel.
6. Añadir 0,5 µL de DNA polimerasa I.
7. Hacer un pulso.
8. Colocar en un baño que esté entre 12°C –14°C durante 90 minutos.
9. Hacer un pulso.
10. Añadir 1,5 µL de EDTA 0,5 M.
11. Incubar en un baño de 65°C durante 5 minutos.
12. Poner en hielo y añadir 2,9 µL de NaOAc 3 M y 58 µL de etanol absoluto frío.
13. Agitar y guardar a -20° C.

tampón de la reacción 100 mM DTT; 100 mM Cl2Mg;

de marcaje 500 mM Tris HCl pH 8; 1 mg/mL de gelatina
Preparación 100 µL DTT 1 M
100 µL Cl2Mg 1 M
500 µL Tris HCl pH 8
100 µL gelatina 10 mg/mL
200 µL agua miliQ

SM gel 6 mM NaSO4 x 7H2O; 0,099 M NaCl;

0,05 M Tris HCl 1 M pH 7,5; 0,1 µg/ml gelatina
Preparación 0,58 g NaCl
0,2 g NaSO4 x 7H2O
5 mL de TrisHCl 1 M pH 7,5
1 mL de gelatina 10 mg/mL
Enrasar a 100 mL con agua destilada

213
ANEXO 1

El marcaje por “random primer” de basa en la incorporación de nucleótidos

marcados durante la amplificación del DNA molde por la enzima Klenow, que actúa a
partir de cebadores hexanucleótidos al azar.

1. Desnaturalizar el DNA (13 µL) hirviendo 10 minutos

2. Poner en hielo.
3. Añadir a cada reacción 2 µL de hexanucleótidos
1 µL de dCTP
1 µL de dATP
1µL de dGTP
1 µL de biotina dUTP
1 µL de Klenow
4. Incubar a 37ºC durante 15-20 horas.
5. Añadir 2 µL de EDTA pH 8 para parar la reacción.
6. Añadir 2,5 µL de LiCl 4 M y 75 µL de Etanol absoluto frío, para precipitar el DNA.
7. Guardar a –20ºC hasta su utilización (mínimo 2 horas).

Antes de hibridar se ha de precipitar la sonda:

1. Centrifugar la sonda marcada a 4°C durante 15 minutos.
2. Eliminar el sobrenadante con micropasteurs.
3. Secar con espaditas y 2 minutos en la bomba de vacío.
4. Resuspender el DNA en 30 ó 60 µL de solución de hibridación.
5. Vortear 1 minuto.
6. Mantener en hielo.

Solución de hibridación 2xSSC; 10% dextrán sulfato;

50% formamida; DNA de esperma de salmón
Preparación 100 µL de 20xSSC
200 µL dextrán sulfato al 50%
500 µL formamida
80 µL DNA de esperma de salmón (5mg/ml)
120 µL agua miliQ
Vortear 1 minuto y guardar a –20ºC.

214
 ANEXO 1

8.3. Hibridación
8.3.1. Prehibridación
1. Incubar las preparaciones cromosómicas 30 minutos en 2xSSC en un baño a 65°C.
2. Poner las preparaciones en una cubeta con etanol al 70% durante 5 minutos.
3. Pasar las preparaciones a otra cubeta de etanol 70% donde se dejarán otros 5 minutos.
4. Pasar las preparaciones a otra cubeta con etanol 95% durante 5 minutos.
5. Dejar secar las preparaciones cromosómicas (mínimo 15 minutos).

8.3.2. Hibridación
Se han realizado dos tipos de hibridaciones: homólogas, cuando el DNA de la
sonda proviene de la misma especie que el material donde se hibrida, y heterólogas,
cuando el DNA de la sonda proviene de una especie diferente.

1. Poner las preparaciones en una cubeta con solución de desnaturalización

(NaOH 0,07 N) durante 2 minutos.
2. Pasar las preparaciones a una cubeta con 2xSSC durante 5 minutos.
Repetir 2 veces.
3. Poner las preparaciones en una cubeta con etanol 70% durante 5 minutos.
Repetir la operación con otra cubeta de etanol 70% y una tercera con etanol al 95%.
4. Dejar secar las preparaciones al menos 15 minutos.
5. Desnaturalizar la sonda incubándola a 65°C durante 15 minutos.
6. Hacer un pulso para que baje el líquido evaporado y mantener la sonda en hielo.
7. Añadir 20 µL de sonda a la preparación cromosómica.
8. Poner un cubreobjetos sobre la zona donde se ha añadido la sonda.
Si quedan burbujas eliminarlas con la punta de la pipeta.
9. Incubar la preparación cromosómica en una cámara húmeda un mínimo de 14 horas
a 25°C (hibidaciones heterólogas) o a 37°C (hibridaciones homólogas).

215
ANEXO 1

8.3.3. Posthibridación
1. Poner las preparaciones cromosómicas en una cubeta con 2xSSC a 37°C,
incubar durante 10 minutos.
2. Incubar otros 10 minutos en una segunda con 2xSSC a 37°C.
3. Incubar 10 minutos en una cubeta de 2xSSC a temperatura ambiente.
Repetir la operación.
4. Poner las preparaciones en una cubeta con 1xPBS durante 5 minutos.

8.3.4. Revelado
1. Añadir a 210 µL de solución I 3,5 µL de reactivo A y
3,5 µL de reactivo B del kit Elite.
2. Añadir a cada preparación 20 µL de la solución anterior.
3. Poner un cubreobjetos sobre la zona donde se ha añadido la solución.
Si quedan burbujas eliminarlas con la punta de la pipeta.
4. Incubar las preparaciones a 37°C durante 45 minutos en una cámara húmeda.
5. Poner las preparaciones en 1xPBS durante 10 minutos.
Repetir dos veces.
6. Añadir a cada preparación 500 µL de solución III.
7. Incubar las preparaciones a 37°C durante 45 minutos en una cámara húmeda.
8. Poner las preparaciones en 1xPBS de 5 minutos a 1 hora.
9. Preparar la solución de tinción añadiendo 5 mL de Giemsa a 100 mL de tampón P.
10. Poner las preparaciones en la solución de tinción durante 1 minuto.
11. Poner las preparaciones en una cubeta con H2O destilada.
Repetir en otra cubeta de H2O destilada.
12. Dejar secar las preparaciones.
13. Añadir a cada preparación una gota de montador de preparaciones biológicas
y poner un cubreobjetos.

216
 ANEXO 1

solución I 10 mL Tris 50 mM pH 7,6; 4% de BSA

Preparación Utilizar material de vidrio autoclavado
0,4 g de BSA (albúmina de suero bovino)
10 mL Tris 50 mM pH 7,6 autoclavado
Hacer alícuotas de 210 µL
Guardar a –20ºC

solución III
Preparación 5 µg de diaminobencidina (DAB)
1 mL de Tris HCl 50 mM pH 7,6
1 µL de H2O2

tampón P
Preparación 40% NaH2PO4H2O 50 mM
60% Na2HPO4 12 H2O 50 mM
Ajustar a pH 7 con las soluciones anteriores

8.4. Localitzación e Interpretación de las Señales de Hibridación

Las preparaciones se han observado con un microscopio Nikon Optiphot-2. Se
tomaron fotografías de las preparaciones cromosómicas utilizando las películas
EKTAR-25 y Royal Gold 25 ASA de Kodak. Las señales de hibridación muestran un
color rosado o azul intenso que contrasta con el color azul-liláceo de los cromosomas.
El resultado de una hibridación se considera positivo cuando la señal o señales se
observan en la misma posición de un determinado cromosoma en varios núcleos de la
preparación. En casos de señales múltiples a veces se distingue una señal más intensa
que corresponde a la señal primaria. Para poder determinar con precisión la banda o
bandas donde se observan las señales de hibridación se han utilizado los siguientes
mapas: la reconstrucción del mapa de D. buzzatii de Ruiz y Wasserman (1993) basada
en el mapa de D. repleta (Warthon 1942) y para D. virilis los mapas de Gubenko y
Evgen’ev (1984) y Kress (1993).

217
ANEXO 1

9. HIBRIDACIÓN IN SITU SOBRE EMBRIONES DE DROSOPHILA

9.1. Marcaje Sondas RNA

1. Extracción DNA plasmídico
2. Linealización del DNA (utilizar una enzima que corte el plásmido en el extremo
del inserto opuesto al promotor que queramos utilizar):
a. Poner en un eppendorf: 20 µL DNA
5 µL tampón de la enzima
5 µL enzima de restricción
20 µL H2O miliQ
b. Incubar 2-3 horas a 37ºC (o temperatura optima de la enzima).
c. Hacer la electroforesis, cortar la banda del gel y purificar el DNA.
d. Resuspender en 10 µL de H2O miliQ estéril.
3. Reacción de transcripción
a. Poner en un eppendorf: 10 µL DNA linealizado
2 µL 10x transcription buffer
2 µL DIG RNA labelling mix (10x rNTP)
1 µL inhibidor RNasa (40 U/µL)
2 µL RNA polimerasa (20 U/µL) T7 o SP6
3 µL H2O miliQ
b. Incubar 2 horas a 37º (o toda la noche)
4. Hidrólisis
a. Añadir a cada marcaje: 5 µL H2O miliQ
25 µL 2x carbonate buffer.
b. Incubar 40 minutos a 65ºC.
5. Parar la reacción y precipitar el RNA
a. Añadir a cada tubo: 50 µL stop solution
10 µL LiCl 4M
5 µL tRNA (20 mg/µL)
300 µL EtOH 100%
b. Precipitar el RNA 15 minutos a –20ºC.
c. Centrifugar 15 minutos a 4ºC.

218
 ANEXO 1

d. Lavar con Etanol 70%.

6. Resuspender RNA marcado en 150 µL de solución de hibridación.
7. Guardar a –20ºC.

2x carbonate buffer 120 mM Na2CO3, 80 mM NaHCO3

Stop solution 0,2 M NaAc pH 6

Preparación 0,82 g NaAc
50 mL agua destilada
Ajustar a pH 6 con ácido acético

9.2. Fijación de Embriones

1. Recolectar y decorionizar los embriones (ver Apartado 2).
2. Poner 1 mL de heptano en un eppendorf de 2 mL.
3. Recoger los embriones del filtro Falcon con el pincel bajo la lupa y pasarlos al epp.
4. Añadir 1 mL de PAF 4% (Los embriones deberian quedar en la interfase).
5. Dejar en agitación durante 20 minutos
6. Retirar el fijador (PAF- fase inferior)
7. Añadir 1 mL de metanol .
8. Agitar vigorosamente durante 1 minuto. (Se forma una emulsión que se separa
lentamente mientras los embriones desvitelinizados caen al fondo del tubo.)
9. Retirar todo el líquido y substituirlo por metanol.
10. Repetir 3 veces.
11. Pasar los embriones a un eppendorf nuevo.
12. Cambiar el metanol 3 veces.
13. Guardar a –20ºC de forma indefinida.

219
ANEXO 1

PAF 4%
Preparación 10 mL 10xPBS
70 mL H2O destilada
Calentar a 55ºC.
Añadir 4 g de paraformaldehído.
(Al disolverse queda transparente)
Poner 1 gota de NaOH 1M.
Ajustar el pH a 7,3 a Temperatura ambiente.
Enrasar a 100 mL con agua destilada.
Alicuotar y guardar a –20ºC.
paraformaldehído Fluka-Chemika 76240 (CH2O)n Mr 30.03n

9.3. Hibridación
1. Rehidratar los embriones con baños de 5 minutos em 1 mL de metanol/PBT:
70:50, 50:50, 25:75, 10:90.
2. Lavar 3 veces con 1 mL de PBT 5 minutos.
3. Incubar 30 minutos en i mL de PBT.
4. Reemplazar 0,5 mL de PBT con 0,5 mL de solución de hibridación.
5. Incubar 10 minutos.
6. Prehibridar en 1 mL de solución de hibridación 1 hora a 60ºC.
7. Mientras desnaturalizar la sonda: Hervir 10 minutos
Poner en hielo
8. Poner la sonda desnaturalizada en 300 µL de solución de hibridación
precalentada a temperatura de hibridación.
# Las sondas reutilizadas se desnaturalizan 10 minutos a 80ºC.
9. Descartar la solución de prehibridación y añadir la solución de hibridación con sonda.
10. Incubar toda la noche a 60ºC.

PBT PBS, 0,1% TritonX-100

Preparación 10 mL 10xPBS
90 mL H2O destilada
100 µL TritonX-100

220
 ANEXO 1

Solución de Hibridación
Preparación 50 mL Formamida
25 mL 20x SSC
200 µL tRNA (50 mg/ml)
1 mL Heparina (50 mg/ml)
1 mL Tween 10%
23 mL H2O destilada

9.4. Lavados
1. Retirar la solución de hibridación con sonda.(Guardar la sonda a –20ºC).
2. Añadir 1,5 mL de solución de hibridación.
3. Incubar 1 hora a 60ºC.
4. Retirar 1 mL de soluciuón y 750 µL de PBT prescalentado a 60ºC.
5. Incubar 5 minutos a 60ºC.
6. Retirar el líquido. Añadir 1 mL de solución de hibridación/PBT 1/1 a 60ºC.
7. 15 minutos en agitación a temperatura ambiente.
8. Lavar 5 veces con PBT durante 5 minutos.

9.5. Revelado
1. Poner 100 µL de anti-DIG-AP 1/2000 en PBT.
2. Incubar 2 horas a temperatura ambiente o toda la noche a 4ºC.
3. Lavar 5 veces con PBT durante 5 minutos.
4. Lavar 3 veces con APB durante 5 minutos.
5. Colorear en un pocillo con 1 mL de APB + 10 µL NBT + 5 µL BCIP.
6. Parar la coloración con 3 lavados de 15 minutos con PBT.

APB 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 0,01% Tween-20,

100 mM TrisHCl pH 9,5
Preparación 100 mL Tampón 3 2 mL NaCl
(Revelado Southern) 5 mL MgCl2
10 µL Tween-20 10 mL TrisHCl pH 9,5
10 mL Tween-20
Hasta 100 mL agua dest.

221
ANEXO 1

9.6. Montaje
1. Lavar 2 veces con PBS.
2. Deshidratar los embriones con lavados sucesivos en etanol/PBS:
30:70, 50:50, 70:30 y etanol.
3. Lavar 3 veces con etanol 100%.
4. Montar con DURCUPAN
a. Poner una gota de medio DURCUPAN en el centro de un portaobjetos.
b. Colocar a cada lado medio cubreobjetos (del nº cero).
c. coger los embriones (con un poquito de etanol)
con una pipeta de 200 µL con la punta cortada.
d. poner los embriones sobre la gota de medio.
e. colocar un cubreobjetos de 24x, con cuidado de que no quede aire.
f. moviendo con cuidado el cubreobjetos podemos girar los embriones
para verlos en diferente orientación.
Guardar a –20ºC mientras queramos poder girar los embriones. Siempre en horizontal.
Para endurecer el medio dejar un par de días a temperatura ambiente.

DURCUPAN ACM FLUKA

Preparación 5,4 g Resin A
4,45 g Hardener B
0,25 g Accelerator C
1,109 g Plasticiser D
Mezclar vigorosamente, alicuotar y guardar a –20ºC

Para montar en GLICEROL

4. Rehibratar con lavados sucesivos en etanol/PBS:
70:30, 50:50, 30:70 y PBS.
5. Substituir el PBS por glicerol en lavados sucesivos en agitación suave.
6. Poner los embriones en glicerol 100% en un portaobjetos, colocar un cubreobjetos
(con cuidado de que no queden burbujas) y sellar con pintauñas (mejor transparente).
8. Guardar a 4ºC.

222
 ANEXO 1

10. HIBRIDACIÓN IN SITU SOBRE DISCOS IMAGINALES DE DROSOPHILA

10.1. Marcaje Sondas RNA Ver apartado 9.1.

10.2. Disección de Discos Imaginales

Para obtener buen material, crecer las moscas a baja densidad.
Utilizar dos placa de tres pocillos.

1. Poner una placa sobre hielo para mantener el material frío durante la disección.
2. Poner 1xPBS en tres pocillos de cada placa.
3. Colocar las larvas del estadio deseado o las pupas a diseccionar en el primer pocillo
de la placa en hielo.
4. Coger una larva o pupa y situarla en el primer pocillo de la segunda placa o en un
porta para realizar la disección.

Bajo la lupa:
5. Eliminar los restos de medio adheridos a la larva o pupa y pasarla a otro pocillo.
6. Partir la larva o pupa por la mitad con dos pinzas finas (larvas)
o con tijeras de disección (pupas).
7. Coger cada mitad y dar la vuelta a la cutícula como si fuera un guante, colocando
una pinza en el extremo y moviendo la parte abierta de la cutícula con la otra pinza.
(si solo se quiere un tipo determinado de disco, la otra mitad se desecha directamente)
8. Eliminar con cuidado la grasa y las estructuras internas de la larva.
9. Los discos quedan unidos a la cutícula por las tráqueas, separarlos un poco para que
queden accesibles pero sin soltarlos de la cutícula.
10. Pasar las mitades invertidas y limpias al tercer pocillo.
11. Eliminar los restos adheridos y pasarlas a un pocillo de la placa en hielo.

La disección debe durar un máximo de 20 minutos, para evitar la degradación del RNA.

12. Fijar según el protocolo a usar (hibridación in situ o tinción con anticuerpo).
(Si se ha obtenido poco material, después de fijadas se pueden juntar dos
o más muestras)

223
ANEXO 1

10.3. Fijación de Discos Imaginales

1. Disección en PBS. Guardar discos en hielo (4ºC).
2. Fijar 20 minutos con PAF 4% (en balancín).
3. Lavar 3 veces 5 minutos con PBS.
4. Fijar 20 minutos con PAF 4% 0,1% Tween.
5. Lavar 3 veces 5 minutos con PBT. Pasar a eppendorf.
6. Lavar en 70:30, 50:50, 30:70 PBT/solución de hibridación.
7. Guardar en solución de hibridación a -20ºC (mínimo 3 días).

10.4. Hibridación
1. Prehibridar 1 hora en solución de hibridación a 55º (en bloque).
2. Desnaturalizar la sonda 10 minutos a 80ºC.
(5 µL de sonda en 50 µL de solución de hibridación)
(Sondas reutilizadas suelen dar mejor resultado, se reduce el fondo.)
3. Mantener la sonda en hielo.
4. Descartar la solución de prehibridación.
5. Poner la solución de hibridación con sonda desnaturalizada.
Incubar toda la noche a 55ºC (en bloque).

10.5. Revelado
1. Precalentar (5 minutos) 3 mL de solución de hibridación por cada muestra.
2. Quitar la sonda de cada muestra, sin que quede completamente seco
(guardar la sonda a –20ºC para reutilizar).
3. Lavar 2 minutos a 55ºC (en el bloque) con 1 mL de solución de hibridación
precalentada.
4. Dos lavados de 15 minutos a 55ºC con 1 mL de solución de hibridación precalentada.
5. Lavar 15 minutos con 50% solución de hibridación:50% PBT en balancín.
(Quitar 500 µL de sol hibridación y añadir 500 µL PBT).
6. Cinco lavados de 10 minutos en PBT (o más lavados más cortos p.e. 7 x 5 minutos).
7. Incubar con anti-DIG 1/2000 1,5 horas a Temperatura ambiente.
Usar 5 µL de anti-DIG (1/50) preabsorvido en 200 µL de PBT.
8. Cuatro lavados de 20 minutos en PBT.
9. Preparar el tampón de coloración.

224
 ANEXO 1

10. Dos lavados de 5 minutos con tampón de coloración recién preparado.

11. Preparar la solución de coloración.
12. Calentar la solución de coloración 5 minutos a 37ºC.
13. Pasar los discos del eppendorf a un pocillo.
14. Poner 500 µL de solución de coloración caliente.
15. Controlar la tinción a la lupa.
16. Parar el revelado con 3 lavados de 10 minutos con PBT.
17. Deshidratar los discos con lavados sucesivos con
30, 50, 70, 90 y 100% etanol en PBS.
18. Guardar las muestras en 100% etanol absoluto a 4ºC durante toda la noche.
19. Rehidratar los discos con lavados sucesivos con
100, 90, 70, 50 y 30% etanol en PBS.
20. Lavar con PBS

Solución de Hibridación
Preparación 50 mL Formamida
25 mL 20x SSC
200 µL tRNA (50 mg/ml)
1 mL Heparina (50 mg/ml)
1 mL Tween 10%
23 mL H2O destilada
tRNA 109525 ROCHE

Tampón de coloración
Preparación 500 µL NaCl 1M (o 125 µL 4M)
250 µL MgCl2 1M
200 µL tRNA (50 mg/ml)
500 µL Tris 1M pH 9,5)
50 µL Tween 10%
3,75 mL H2O destilada

225
ANEXO 1

Solución de coloración
Preparación 1 mL de tampón coloración
9 µL de NBT
7 µL de BCIP (llamado también XPhos)

10.6. Montaje de Discos en Glicerol

1. Después de la hibridación (o la tinción) los discos vuelven a estar en 1xPBS.
2. Sustituir la mitad del PBS por glicerol 50% (en PBS).
Mezclar bien mediante agitación suave.
3. Sustituir tres cuartos del volumen por glicerol 50% (en PBS).
Mezclar bien mediante agitación suave.
4. Sustituir tres cuartos del volumen por glicerol.
Mezclar bien mediante agitación suave.
5. Colocar una de las mitades sobre una gota de glicerol sobre un portaobjetos.

Bajo la lupa:
6. Diseccionar los discos uno a uno y colocarlos sobre una gota de glicerol en un
portaobjetos nuevo.
(Se pueden levantar con las pinzas o agujas de disección o con una pipeta de 20 µL
con la punta cortada, en este segundo caso tener cuidado de lo coger otros restos)
7. Una vez diseccionada toda la muestra, colocar un cubreobjetos (con cuidado de que
no queden burbujas) y sellar con pintauñas (mejor si es transparente).
8. Guardar a 4ºC.

226
 ANEXO 1

11. TINCIÓN CON ANTICUERPOS

11.1. Tinción de Embriones

11.1.1. Fijación de Embriones
1. Recolectar y decorionizar los embriones (ver Apartado 2).
2. Fijar los embriones según Apartado 9.2, excepto:
Fijador (preparar en el momento) 3,2 mL agua destilada
500 µL PBS 10X
1,3 mL formaldehído 37%
Fijar durante 25 minutos.

11.1.2. Anticuerpo, Revelado y Montaje

1. Lavar 3 veces con PBT
2. Poner el anticuerpo (dilución según anticuerpo).
3. Incubar toda la noche a 4ºC.
4. Quitar el anticuerpo (guardar para reutilizar)
5. Lavar 3 veces con PBT.
6. Poner el anticuerpo secundario biotinilado.
7. Incubar 1,5 horas en rotación.
8. Lavar 3 veces con PBT.
9. Preparar el AB complex 500 µL PBT
5 µL A
5 µL B
10. Añadir el AB complex e incubar durante 45 minutos.
11. Lavar 3 veces con PBT.
12. Revelar con DAB (ver Apartado 11.2.3).
13. Lavar 3 veces con PBT.
14. Montar en glicerol.

227
ANEXO 1

11.2. Tinción de Discos Imaginales

11.2.1. Disección y fijación
1. Disección en PBS (ver Apartado 10.2.). Guardar los discos en hielo.
2. Fijar 20 minutos con PAF 4%.
3. Fijar 20 minutos con 500 µL PAF 4% + 5 µL DOC + 5 µL Triton 10%.
4. Lavar 3 veces 20 minutos con PBT/BSA.

11.2.2. Anticuerpos
1. Incubar con anticuerpo primario a 4ºC toda la noche (o 4h a temperatura ambiente).
Siempre en balancín.
2. Lavar 4 veces 20 minutos con PBT/BSA.
3. Incubar con anticuerpo secundario 2 h a Temperatura ambiente.
4. Lavar 3 minutos 20 minutos con PBT/BSA.
Al empezar el segundo lavado preincubar el AB complex
300 µL PBT + 3 µL A + 3 µL B
30 minutos a temperatura ambiente
5. Incubar los discos con el AB complex 45 minutos.

11.2.3. Revelado y Montaje

1. Lavar 3 veces 10 minutos en PBT.
2. Poner 2 µL H2O2 al 30% en 1 mL de DAB (0,5 mg/ml en PBS)
3. En una placa de 4 x 6 pocillos poner un “colador” en el primer pocillo,
0,5 ml de DAB con H2O2 en el segundo y PBT en los 4 siguientes.
4. Con una pipeta de 1 mL con la punta cortada pasar las larvas del eppendorf
al colador del primer pocillo.
5. Controlando bajo la lupa pasar el colador al DAB. Máximo 3 minutos.
Si se oscurecen muy rápidamente retirar antes.
6. Hacer un lavado rápido en el primer PBT, mover un poco en el segundo
y dejar un rato en el tercero. Pasar al cuarto PBT y pasar a eppendorf.
7. Lavar 3 veces 5 minutos en PBT.
8. Diseccionar discos y montar en glicerol.

228
 ANEXO 1

PBT/BSA 1xPBT, 0,3% triton, 1% BSA

Preparación 200 mL PBS
0,6 mL triton 100%
2 g BSA

Anticuerpos secundarios
Anti-rabbit Ig, biotinylated species-specific whole antibody (from
donkey) 2 ml. RPN 1004. Amersham Pharmacia Biotech.
Anti-mouse Ig, biotinylated species-specific whole antibody (from
sheep) 2 ml. RPN 1001. Amersham.

229
ANEXO 1

12. GENOTECA DE FAGOS LAMBDA

12.1. Infección de Fagos

1. Inocular 3 mL de LB enriquecido con 30 µL MgSO4 1 M y 30 µL Maltosa 20%
con una colonia aislada de LE392. El cultivo es adecuado durante 24 h.
2. Preparar las diluciones pertinentes de fagos en SM buffer.
3. En tubos de 5 mL mezclar 100 µL de células (LE392) con 100µL de fago.
(Poner primero las células para evitar contaminaciones)
4. Incubar la mezcla 30 minutos a 37ºC.
5. Calentar tubos de 5 mL a 46ºC. Tantos como infecciones queramos hacer.
6. Poner 3 mL de TopAgar en cada tubito a 46º.
(Poner el TopAgar con pipeta de vidrio, hay que limpiarla al momento para
evitar que el agar solidifique en su interior).
7. Precalentar a 37ºC placas LB ligeramente secas.
8. Volcar los 3 mL de TopAgar en el tubo de células con fagos mezclar mediante
2 ó 3 inversiones suaves.
9. Volcar la mezcla sobre una placa de LB, repartir bien y dejar solidificar 15 minutos.
10. Incubar a 37ºC durante 8-10 horas o durante la noche.

LB TopAgar
Preparación 1 g Tryptona
0,5 g Yeast extract
0,5 g NaCl
0,6 g Agarosa
Enrasar a 100 mL con agua destilada
Autoclavar
Guardar a 45º
Antes de usar añadir 1 mL de MgSO4 1 M

230
 ANEXO 1

SM buffer
Preparación 1 mL gelatina 10 mg/ml
5 mL Tris-HCl 1 M
0,58 g NaCl
0,8 mL MgSO4 1 M
Enrasar a 100 mL con agua destilada
Autoclavar

12.2. Obtención de Lisados

1. Infectar una placa de LB con el fago a concentración suficiente para obtener una lisis
total (no pasarse con la concentración del fago, ya que demasiada cantidad produce
una lisis demasiado rápida y poco crecimiento del fago).
2. Añadir 2,5 mL de SM buffer por placa y dejar a 4ºC.
3. Poner en agitación 11/2-2 horas.
4. Recuperar el líquido con la pipeta de 1 mL y ponerlo en un tubo de 10 mL.
5. Añadir 0,5 mL de SM buffer a cada placa.
6. Dejar las placas inclinadas 15 minutos (para que escurra el líquido).
7. Recuperar el líquido.
8. Añadir 50 µL de cloroformo (Triclorometano) en cada tubo.
9. Mezclar por inversión.
10. Centrifugar 10 minutos a 4000 rpm.
11. Recuperar el sobrenadante con pipeta pasteur.
12. Añadir 50 µL de cloroformo por tubo.
13. Mezclar por inversión.
14. Guardar a 4º.

231
ANEXO 1

12.3. Amplificación de Genotecas

Protocolo de Sambrook et al. (1989) con pequeñas modificaciones.

1. Añadir a un vial de genoteca tampón SM hasta un volumen final de 1 mL.

2. Infectar 1 mL de cultivo de células LE392 reciente y repartir en 10 placas.
(Ver infección de fagos)
3. Repartir en 10 placas (200 µL por placa).
4. Incubar a 37ºC durante solo 7 horas.
5. Añadir 2,5 mL de SM buffer por placa. Dejar a 4ºC toda la noche.
6. Recuperar el lisado. Juntar las placas.
7. Guardar a 4ºC.

12.4. Rastreo
12.4.1. Infección y Transferencia a Filtro
Para tener una probabilidad de 0,99 de obtener un fago positivo, se rastrean unos
75.000 fagos distribuidos en 10 placas (~7.500 calvas/placa). Los cálculos se muestran
en la Figura A5.

ln (1-P) N - nombre de clons que cal hibridar

N=
ln (1-f) P - probabilitat d’obtenir un clon positiu (0’99)

ln (1 – 0’99)
N= = 75.045 clons
Ln (1 – 13’5 / 2’2x105)

longitud mitjana de l’insert (~13’5 kb)

f=
longitud del genoma (~220 Mb = 2’2 x 105 kb)

Figura A5. Cálculo del numero de fagos que hay que rastrear para obtenir como mínimo un
positivo (Sambrook et al. 1989, Klug y Cummings 1999).

232
 ANEXO 1

1. Sembrar los fagos a hibridar en placas LB, a baja densidad para poder identificar
luego los fagos positivos. Crecer a 37ºC.
2. Guardar las placas 1 hora a 4ºC (para que el agar se endurezca).
3. Cortar filtros circulares del tamaño de las placas, uno por placa.
4. Numerar las placas y los filtros (estos últimos a lápiz), y hacer tres marcas
asimétricas en la placa que servirán de referencia para posicionar los positivos.
5. Abrir la placa y colocar el filtro correspondiente con el número hacia arriba y
haciéndolo coincidir con el de la placa. Dejar caer el filtro poco a poco para que
no queden burbujas, haciendo que toque primero el centro.
6. Dejar transferir 3 minutos.
7. Pinchar el filtro con una aguja al lado de cada una de las tres marcas hechas en la
placa, aprovechando el último pinchazo para levantar el filtro.
8. Coger el filtro con las pinzas y colocarlo boca arriba sobre papel Whatmann.
9. Dejar secar.
10. En dos cápsulas de petri de vidrio de mayor tamaño que los filtros poner dos
papeles Whatmann impregnados uno con solución de Desnaturalización (recién
preparada) y el otro con solución de Neutralización.
11. En una fiambrera grande de vidrio poner otro papel Whatmann con 2xSSC.
12. Poner los filtros, siempre boca arriba y controlando que la solución no los cubra
ni que se seque el papel: 5 minutos en sol. de desnaturalización
5 minutos en sol. de neutralización
15 minutos en 2xSSC
13. Dejar secar.
14. Fijar el ADN irradiando 3 minutos por cara con UV.

233
ANEXO 1

12.4.2. Hibridación y Revelado

Las sondas se han de provar siempre en Southern sobre DNA genómico antes de
usarlas para rastrear la genoteca.
El proceso de prehibridación, hibridación y revelado de los filtros es el mismo
que en el Southern, únicamente cambian los volúmenes de las soluciones.

Soluciones de lavado posthibridación 1 L de cada

Solución de bloqueo 100 mL
Solución de anticuerpo 10 mL/filtro
Solución de coloración 5 mL/filtro

12.4.3. Selección de Fagos Positivos

Una vez revelados los filtros, los fagos positivos se ven en el filtro como una
manchita circular con una pequeña estela. Hacer una fotocopia de los filtros en
transparencia. Se coloca la transparencia boca abajo bajo la placa y se orienta con ayuda
de las marcas asimétricas hechas durante la transferencia. Así se identifican las calvas
correspondientes a los positivos, en cas de duda se recuperan varias calvas. Las calvas
identificadas se recuperan con una pipeta Pasteur esterilizada y se deposita el agar
recuperado en un eppendorf con 500 µL de tampón SM y 20 µL de triclormetano. Se
deja una hora a temperatura ambient y se guarda a 4ºC.

Para descartar falsos positivos y eliminar la posible contaminación con otros

fagos, se vuelven a hibridar los fagos recuperados. Se infecta una placa de LB agar amb
cada fago recuperado, esta vez a baja densidad, y se repite el proceso de transferencia e
hibridación. Esta vez los fagos se recupera en 300 µL de SM y 15 µL de triclorometano.

234
 ANEXO 1

13. SECUENCIACIÓN

Las reacciones de secuenciación se han realizado en un secuenciador automático

ABI 373 A (Upgrade Stretch Kit) en el Servei de Seqüenciació de DNA de la UAB.

13.1. Secuenciación de Productos de PCR

Para secuenciar productos de PCR sin clonar, se extraer el DNA a partir de gel
de agarosa (ver Apartado 3.4) y se secuencia con los mismos primers utilizados para la
PCR. Cuando los productos de PCR se quieren utilizar posteriormente como sondas, se
clonan en pGEM-T y se secuencian con primers universales M13.

13.2. Secuenciación mediante Subclonación

Para secuenciar los fagos lambda se realiza un mapa de restricción mediante
restricciones con varios enzimas (especialmente EcoRI, BamHI y HindIII) y con ayuda
de Sothern blots. Los fragmentos de interés se subclonan en pBSK y se secuencian con
primers universales M13. Se intenta obtener clones de un tamaño aproximado de 0,9 kb
ligeramente solapantes para facilitar el ensamblaje. En caso necesario se diseñan
primers específicos para completar la secuencia o verificar el ensamblaje. Las
secuencias se corrigen y ensamblan manualmente con la ayuda del programa Genetool.

13.3. Secuenciación Aleatoria

Para secuenciar completamente clones BAC se realiza una subclonación
aleatoria del clon (inserto + vector) con un tamaño promedio de los subclones de 1,5 kb.
Se secuencian por los dos extremos (con primers universales) el número de clones
necesarios para obtener una secuencia 6x. Las secuencias se ensamblan con el paquete
Fred-Frap-Consed. Se realiza un edición manual del ensamblaje y se realiza una ronda
de autofinish. Se completan las secuencias propuestas por este programa (con primers
universales o específicos) y se unen al ensamblaje. En los dos BAC secuenciados la
secuencia se ha finalizado cerrando los gaps restantes mediante PCR.

235
ANEXO 1

14. PROGRAMAS PARA EL ANÁLISIS DE SECUENCIAS

GENETOOL: Editor de secuencias.

FRED-FRAP-CONSED y AUTOFINISH: Ensamblaje, edición y finalización de

secuencias “shotgun”.

ARTEMIS: Para la anotación de secuencias.

FASTA, BLASTN y BLASTX: Búsquedas por similitud en las bases de datos.

ClustalW: Alineamientos múltiples de secuencias nucleoídicas y aminoacídicas.

mVISTA: Alineamiento de secencias largas (>3 kb).

DnaSP y PAML: Análisis de divergencia y evolución nucleotídica.

236
ANEXO 2. MAPAS FÍSICOS
 ANEXO 2

1. MAPAS DE LAS REGIONES labial-abdominalA Y proboscipedia EN D. buzzatii.

Estos mapas se han realizado a partir de los clones BAC obtenidos de cada
región al rastrear la genoteca CHORI-225 de D. buzzatii. Los mapas se han utilizado
para escoger un BAC de cada región para secuenciar.
Actualmente se dispone de un mapa físico detallado de D. buzzatii realizado a
partir de esta misma genoteca. Los clones de la región labial-abdominalA se encuentran
en el contig 976 de dicho mapa y la región proboscipedia en el 968.

1.1. Región labial-abdominalA

El mapa de esta región (Figura A5) se ha realizado utilizando la información
obtenida de las tres sondas con las que se rastreó la genoteca (307, 310.5 y 3’abdA), dos
Southern blots realizados con sondas adicionales (302.1.1 y abdA2) y las estimas del
tamaño de los clones realizadas mediante electroforesis de campo pulsante de
digestiones con la enzima NotI.

1.2. Región proboscipedia

Para realizar el mapa físico de esta región (Figura A6) se han secuenciado los
extremos de los clones BAC obtenidos. De los 11 clones BAC se han obtenido 20
secuencias (de dos clones solo se ha obtenido un extremo). Con estas secuencias se
realizaron búsquedas en las bases de datos (con blastn) para obtener una primera idea de
la región que contenían y para poder descartar aquellas secuencias que contuvieran
elementos repetitivos. Cinco secuencias contienen elementos transponibles tipo IsBu,
otras cinco contienen regiones de homología con el complejo ANT-C de D.
melanogaster, concretamente con las regiones zen-zen2 (2), ama-Dfd (1) y Scr-ftz (2),
una secuencia corresponde al gen CG14606 (localizado en D. melanogaster en 84D2) y
el resto de secuencias no muestran homología con regiones conocidas. Se han escogido
diez secuencias, aparentemente alejadas, sobre las que se han diseñado primers para
amplificar sobre el resto de clones. Han funcionado seis de las diez STS. La
información de las secuencias, la presencia de estas STS y de digestiones con las
enzimas NotI y AvrII han permitido realizar un mapa bastante preciso de la región. Uno
de los 11 BAC iniciales no presenta ninguno de los STS ni un mapa de restricción
similar al resto de clones, por lo que se trata de un falso positivo.

239
240
ANEXO 2

Figura A5. Mapa de la región lab-abdA. Arriba se muestra la posición de las sondas utilizadas y el gen al que corresponden. Las sondas de abdA se muestran
en relación a la estructura y tamaño del gen de D. melanogaster, única información disponible al realizar el mapa. Abajo se muestran los clones BAC, se
agrupan aquellos que contienen los mismos marcadores. Para la región del gen lab se han utilizado como sondas 3 clones en pBSK: pGPE307 (región 3’),
pGEP 302.1.1 (fragmento del intrón 1) y pGPE320.5 (extremo 5’). Para el gen abdA se ha utilizado una oligoprove diseñada sobre secuencia de D. virilis
(3’abdA) y un fragmento del gen (exones 2-4) amplificado a partir de DNA genómico de D. melanogaster (abdA2).
 Figura A6. Mapa de la región pb. Arriba se muestra, como referencia, la estructura de parte del complejo ANT-C de D. melanogaster. Sobre los clones BAC
se muestra el mapa de restricción de NotI y AvrII de la región. Los puntos negros muestran la posición de los STS. La sonda utilizada para el reastreo de la
genoteca es un clon de cDNA de pb de D. buzzatii (pGPE 332).

241
ANEXO 2
ANEXO 2

242
ANEXO 3. SECUENCIAS
 ANEXO 3

1. NÚMEROS DE ACCESO DE LAS SECUENCIAS DEPOSITADAS EN GENBANK

Número de acceso Especie Gen o región

AY035293 D. repleta labial gene, exons 2 and 3 and partial cds

AY035294 D. mercatorum labial gene, exons 2 and 3 and partial cds
AY035295 D. hydei labial gene, exons 2 and 3 and partial cds
AY035296 D. buzzatii (st1) labial gene, exons 2 and 3 and partial cds
AY035297 D. virilis labial gene, exons 2 and 3 and partial cds

AY313767 D. virilis labial (lab) gene, cDNA fragment

AY313768 D. virilis labial (lab) gene, exon 1
AY313769 D. virilis labial (lab) gene, exons 2 and 3 and
partial cds
AY313770 D. buzzatii (j19) labial (lab) gene, cDNA fragment
AY313771 D. buzzatii (j19) labial gene, exon 1
AY313772 D. buzzatii (j19) labial gene, exons 2 and 3 and CDS

AY897430 D. buzzatii (j19) proboscipedia (pb) mRNA, partial cds

AY897431 D. buzzatii (j19) abdominal A (abdA) mRNA, partial cds
AY897432 D. virilis abdominal A (abdA) mRNA, partial cds
AY897433 D. repleta abdominal A (abdA) mRNA, partial cds
AY897434 D. repleta labial (lab) mRNA, partial cds

AY900631 D. buzzatii (st1) Drosophila buzzatii clone BAC 5H14,

complete sequence;
labial - abdominalA gene region
AY900632 D. buzzatii (st1) Drosophila buzzatii clone BAC 40C11,
complete sequence;
proboscipedia gene region

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ANEXO 3