UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS

FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACION

PROYECTO CURRICULAR LICENCIATURA EN BIOLOGIA

Genética molecular

Informe de laboratorios de extracción de DNA en base a muestras de

tejido vegetal y animal.

José matias Figueroa niño cod. 20141140078

Sergio stiven Suarez García cod.20141140118

Introducción.

El trabajo se llevó a cabo en 3 sesiones de 4 horas diarias, buscando estandarizar

y realizar un protocolo específico para la extracción de DNA, tanto en tejido animal,
como en tejido vegetal, obteniendo, por medio de kits de extracción y
procedimientos antes descritos entender las diversas técnicas de reacción en
cadena de polimerasa PCR.
Se realizó además una extracción a libre elección, utilizando el protocolo de
extracción de ADN proporcionado por Cerda y Díaz (2013) para Pino Pátula,
además de la valiosa ayuda del profesor, se acortaron los tiempos de los
procedimientos, utilizando una metodología un poco reestructurada. En este caso
se utilizaron diferentes lisis y compuestos químicos, que comúnmente no se
utilizaron para las extracciones anteriores, como es el caso del Beta-
mercaptoetanol, entre otros que más adelante se describen.
A modo de conclusión, los tres laboratorios se llevaron a cabo sin mayores
problemas, siguiendo el procedimiento del profesor con las diferentes extracciones,
acertando en los resultados esperados (suspensión final), donde se apreciaba a
contra luz las hebras de información genética de la sangre, siete cueros y pino
pátula.
Palabras clave: PCR, ADN, POLIMERASA, KITS DE EXTRACCION, PRIMER
PROTOCOLO
ABSTRACT
The work was carried out in 3 sessions of 4 hours a day, seeking to standardize and
perform a specific protocol for DNA extraction, both in animal tissue and in plant
tissue, obtaining, through extraction kits and procedures described above
understand the various PCR polymerase chain reaction techniques.
A free choice extraction was also carried out, using the DNA extraction protocol
provided by Cerda y Díaz (2013) for Pino Pátula, in addition to the valuable help of
the professor, the procedures were shortened, using a slightly restructured
methodology. In this case, different lysis and chemical compounds were used, which
were not commonly used for the previous extractions, as is the case of Beta-
mercaptoethanol, among others that are described below.
By way of conclusion, the three laboratories were carried out without major
problems, following the procedure of the professor with the different extractions,
correcting in the expected results (final suspension), where the strands of genetic
information of the blood, seven hides and pine patula were appreciated against light.
Keywords: PCR, DNA, POLYMERASA, EXTRACTION KITS, PRIMER.

Marco teórico
Los métodos utilizados para el basados en la hidrólisis con proteínas,
genotipeo de los animales y vegetales otros con exposición a ultrasonidos y
en laboratorio, incluye el aislamiento otros usando detergentes o álcalis.
del ADN de biopsias de tejido, Los métodos que utilizan la hidrólisis
seguidas de la amplificación, mediante con proteinasas tienen como principio
la técnica de la reacción en cadena de básico, el uso de la proteinasa K, la
la polimerasa (PCR). Es importante cual digiere proteínas y remueve
para el desarrollo de esta técnica, contaminantes a partir de las
poder contar con un molde de ADN de preparaciones de los ácidos nucleicos.
óptima calidad. La bibliografía reporta (Gonzales, 2011).
distintos métodos de extracción de
Extracción de ADN por salting out.
diferentes tipos de tejidos, algunos
También conocido como cristalización enzimática contribuyen a su
antisolvente, cristalización estabilidad. Las proteínas serán
precipitación o ahogado en un método completamente digeridas si el tiempo
para separar proteínas basadas en el de incubación es largo, y la
principio de que las proteínas son concentración de proteasa lo
menos solubles a altas suficientemente alta. Las condiciones
concentraciones de sal. La potencian la actividad de la proteinasa
concentración general de sal K haciendo que sus sitios de escisión
necesaria para la proteína a precipitar de sustrato sean más accesibles.
difiere de proteína a proteína. Es una Temperaturas superiores a 65°, acido
técnica de extracción de proteínas que tricloruro acético (TCA) o los
consiste en concentrar la fase liquida inhibidores de la cerina, la cerina
tanto como sea requerido para que las proteasa AEBSF, PMSF o DFP
proteínas se precipiten, lo que se inhiben la actividad. (Muller. 1994).
produce es que, al solubilizar la sal,
La proteinasa K se usa comúnmente
esta se rodea de agua limitando las
en Biología Molecular para ingerir
moléculas que solubilizan a las
proteínas y eliminar la concentración
proteínas, logrando que al final no
de las preparaciones de ácidos
halla moléculas disponibles de agua
nucleicos. La adición de proteinasa K
precipitando las proteínas (Velásquez,
a las preparaciones de ácidos
2011).
nucléicos inactivan rápidamente las
nucleasas que de otro modo podrían
degradar el ARN o el ADN durante la
Proteinasa K.
purificación. La proteinasa K se utiliza
Es una cerina proteasa de amplio para la destrucción de proteínas en
espectro, la encima fue descubierta en lisados celulares (tejido, células de
1974 con extractos del hongo cultivo celular) y para la liberación de
Engydontyum album. La proteinasa K ácidos nucleicos, ya inactiva
es capaz de digerir el cabello: eficazmente las ADNasas y las
queratina, de ahí el nombre proteinasa ARNasas microbianas o de
K. el sitio predominante de escisión es mamíferos, son activadas
el enlace peptídico adyacente al grupo rápidamente por la encima,
carboxilo de los aminoácidos alifáticos particularmente en presencia de 0.5 -
y aromáticos con grupos amino alfa 1% de SDS. Purificación de ADN
bloque A2, se usa comúnmente por su genómico a partir de bacterias (Mini
amplia especificidad. (Eveling, 1974). preparación): las bacterias de un
cultivo líquido saturado se lisan y las
Activada por calcio la enzima digiera proteínas se eliminan mediante un
las proteínas preferentemente digerido con 100 micro gramos sobre
después de aminoácidos hidrofóbicos mililitro de proteinasa K durante una
(aminoácidos alifáticos, aromáticos y hora a 37°C. (Hilz,1975)
otros hidrófobos). Aunque los iones de
calcio no afectan la actividad
Antes se hacían estudios genéticos Los RAPD son ampliamente
con referente a los aspectos empleados en análisis genómicos de
morfológicos más que a los aspectos individuos y poblaciones (Smith y
moleculares sin embargo el pequeño Chin, 1992), debido a que estos
número de marcadores morfológicos marcadores permiten detectar un
distintos en un mismo linaje reducía la mayor porcentaje de loci polimórficos
probabilidad de encontrar que las aloenzimas. (Szmidt et al.,
asociaciones significativas entre estos 1996). Es menester recalcar que hay
marcadores y eco tipos de una diversas variaciones de la técnica de
especie o a su vez con caracteres de PCR. Una de estas es la RAPD por
importancia económica, lo cual sus siglas random amplified
limitaba su empleo en estudios de polimorfism DNA, que como tal busca
diversidad y mejoramiento genético la amplificación simultanea de varios
(Ferreira y Grattapaglia, 1998). loci en el genoma por medio del uso
de primers o iniciadores de secuencia
Posteriormente se descubrieron los
arbitraria. (Williams et al., 1990; Welsh
marcadores iso-enzimaticos, que junto
y McClelland, 1991).
con las técnicas de extracción y
purificación de DNA que surgieron
después generaron una revolución en
Otras de las ventajas que presentan
el campo genético, permitiendo la
estos marcadores es que no se
identificación de dimorfismo genético.
necesita del conocimiento previo de la
(Stuber, 1992).
secuencia del DNA para poder
En la actualidad se cuenta con varios aplicarlos, cosa muy común en
métodos de extracción de DNA especies forestales, de las cuales
genómico en plantas, cada uno de prácticamente poco a nada se conoce.
ellos está basado en el uso de un Sin embargo, una de las limitantes del
compuesto especifico como lo es el empleo de esta técnica es el bajo
bromuro de cetiltrimetilamonio contenido de información genética por
(Shagai-Maroof et al., 1984; Doyle y locus que genera (Ferreira y
Doyle, 1987) otros en el uso del SDS Grattapaglia, 1998). Por otro lado, la
(dodecil sulfato de sodio) (Dellaporta obtención de datos es por lo menos
et al., 1983) y en el empleo de la dos órdenes de magnitud más rápida
proteinasa K (Kaya y Neale, 1993). que los RFLP, esto se debe a la
posibilidad de detectar polimorfismo
Luego surgieron las técnicas de
por visualización directa de las bandas
reacción en cadena de polimerasa
en el gel (Paran et al., 1991).
PCR, lo cual fue un hito y una
revolución en el campo biológico tanto Todo esto es posible siempre y
en la búsqueda de la comprensión de cuando se cuente con un protocolo de
procesos biológicos, como en las extracción y purificación de DNA
áreas aplicadas incluyendo estudios estandarizado para la especie de
genéticos, diagnóstico y mejora (Mullis interés, debido a que este proceso
y Faloona, 1987). constituye una etapa clave de todos
los estudios de genética molecular con cationes como Na+ que reducen
(Motte, 2001). Es necesario decir que las fuerzas repulsivas entre las
en la actualidad hay varios métodos cadenas de nucleótidos y permiten
para obtención de DNA vegetal es que el ADN precipite (Sambrook et al.
necesario un protocolo específico para 1989). Por otro lado, la carga neta
cada especie para que el proceso sea negativa del ADN le permite unirse a
optimo y tenga las condiciones moléculas y matrices inorgánicas
idóneas para el desarrollo de la cargadas positivamente (Nasón 1965,
técnica RAPD Travaglini 1973, Sambrooket al. 1989,
Sinden 1994).
En los años 90 se empezaron a usar
Como tal dicha extracción se basa en
kits de extracción que utilizan matrices
el aislamiento y purificación de
inorgánicas compactas capaces de
moléculas de ADN y tiene de
retener varios microgramos de DNA y
fundamento las características
separarlos exitosamente del resto de
fisicoquímicas de la molécula. Como
la biomolécula obteniendo así un
es bien sabido el ADN está
extracto libre de inhibidores. Dichos
conformado por dos cadenas de
combos se venden en perlas
nucleótidos unidas entre sí formando
magnéticas o membranas de sílice,
una doble hélice. Los nucleótidos
las cuales están conformadas las
están integrados por un azúcar, un
primeras por un centro de hierro y una
grupo fosfato y una base nitrogenada
cubierta de resina y las segundas por
(adenina, guanina, timina o citosina).
resina, (Guinn 1966, Dundass et al.
Esta unión de nucleótidos se da entre
2008). Esta membrana esta insertada
el grupo fosfato y el azúcar, a través
dentro de un micro tubo de
de enlaces fosfodiéster, dando lugar al
polipropileno y las micro esferas se
esqueleto de la molécula. Las bases
encuentran suspendidas en una
de cadenas opuestas se unen por
solución amortiguadora.
puentes de hidrógeno y mantienen
estable la estructura. Los grupos
fosfato están cargados negativamente
Dichos combos también poseen
y son polares, lo que le confiere al
soluciones de lisis, unión y lavado, las
ADN una carga neta negativa y lo hace
cuales no contienen fenol ni
altamente polar. Los grupos fosfato
cloroformo para la extracción de
tienen una fuerte tendencia a
proteínas, tampoco hay necesidad de
repelerse, debido a su carga negativa,
etanol para la precipitación de DNA,
lo que permite disolver al ADN en
(Qiagen 2005, Invitrogen 2005). A
soluciones acuosas y formar una capa
medida que avanza el tiempo los kits
hidratante alrededor de la molécula.
de extracción mejoran y se simplifican
Pero, en presencia de etanol, se
en número de pasos, pero no por
rompe la capa hidratante y quedan
simplificarse significa que bajen su
expuestos los grupos fosfato. Bajo
calidad antes todo lo contrario si se
estas condiciones se favorece la unión
siguen las instrucciones y
recomendaciones del proveedor se compuestos fenólicos (Pandey,
puede garantizar una extracción de Adams & Flournoy, 1996; Porebski et
alta pureza ya que la recuperación de al., 1997). Estos compuestos en sus
DNA como la eliminación de formas oxidadas se enlazan
contaminantes es muy efectiva. covalentemente a los ácidos nucleicos
(Qiagen 2005, Invitrogen 2005). durante la extracción y los inutilizan
para la mayoría de las aplicaciones en
La selección del método de extracción
investigación (Katterman & Shattuck,
es un paso fundamental en las téc-
1983, Peterson et al., 1997). Los
nicas moleculares y depende del
polisacáridos son visualmente
organismo bajo estudio, el tejido
evidentes en extracciones de ADN por
disponible y su estado de
su textura viscosa, como de goma, y
conservación, la técnica que se
hacen que el ADN sea no manejable
aplicará posteriormente, así como la
en el pipeteo y no amplificable en el
infraestructura de los laboratorios, los
PCR debido a la inhibición de la Taq
recursos económicos y tiempo para
ADN polimerasa (Fang, Hammar &
obtener resultados.
Grumet, 1992).
Independientemente del método
seleccionado es recomendable la sangre es un tejido líquido que
encontrar un equilibrio entre pureza y recorre el organismo a través de los
rendimiento de acuerdo a la aplicación vasos sanguíneos. la cantidad de
posterior. (Qiagen 2005, Invitrogen sangre se encuentra en un organismo
2005). en relación con la edad, el peso, se6o,
y la altura. Esta es un tejido renovable
Las técnicas moleculares requieren el
del cuerpo humano, esto quiere decir
aislamiento de ADN genómico de
que la médula ósea se encuentra
pureza apropiada para la PCR
fabricándolo toda la vida. Ante una
(reacción en cadena de la polimerasa)
hemorragia aumenta hasta siete
y digestión enzimática (Katterman &
veces la producción de glóbulos rojos
Shattuck, 1983; Peterson, Boehm &
y ante una infección ésta aumenta la
Stack, 1997). El crecimiento del
producción de glóbulos blancos.
número de protocolos de extracción
de ADN para especies de plantas Pino patula
específicas sugiere que la extracción
Árbol de porte mediano a grande, que
de ADN no es siempre simple y los
en ejemplares longevos puede
protocolos publicados no son
alcanzar alturas de hasta 40 m y 120
necesariamente reproducibles para
cm de diámetro. El tronco es recto,
todas las especies (Porebski, Bailey &
cilíndrico en un comienzo y bastante
Baum, 1997). El problema a menudo
cónico en casi toda su longitud. En
encontrado durante la extracción de
árboles jóvenes, inicialmente la
ADN es separar el ADN de los
corteza es lisa y rojiza, y luego, ésta se
contaminantes que existen
torna marrón, áspera y se desprende
naturalmente en la célula de la planta,
en escamas. La distribución de las
tales como polisacáridos y
ramas es des-uniforme, aunque en
general son verticiladas, las ramas Las técnicas moleculares requieren el
pequeñas son escamosas y rojizas. aislamiento de ADN genómico de
Los rebrotes con algunos nódulos pureza apropiada para la PCR
glabros, son verdes pálidos hasta (reacción en cadena de la polimerasa)
pardo rojizos. La copa es extendida y digestión enzimática (Katterman &
con ramas largas y colgantes. Esta Shattuck, 1983; Peterson, Boehm &
especie desarrolla un buen sistema Stack, 1997). El crecimiento del
radical, pivotante y profundo. (Ospina número de protocolos de extracción
et al, 2011) de ADN para especies de plantas
específicas sugiere que la extracción
Se le explota principalmente por su
de ADN no es siempre simple y los
buena calidad de papel que
protocolos publicados no son
proporciona y se le ha introducido en
necesariamente reproducibles para
diversas partes del mundo. Se ha
todas las especies (Porebski, Bailey &
plantado en grandes altitudes en
Baum, 1997). El problema a menudo
Ecuador (3500 m),
encontrado durante la extracción de
Bolivia, Colombia (3300 m), Kenia, Ta
ADN es separar el ADN de los
nzania, Angola, Zimbabue, Papúa
contaminantes que existen
Nueva Guinea, Hawái (3000 m).
naturalmente en la célula de la planta,
En Hawái está reemplazando a los
tales como polisacáridos y
herbazales alpinos nativos. Es
compuestos fenólicos (Pandey,
cultivado en más bajas altitudes que
Adams & Flournoy, 1996; Porebski et
en su país de origen: Sur
al., 1997). Estos compuestos en sus
de Brasil, Sudáfrica, India, y en las
formas oxidadas se enlazan
provincias argentinas
covalentemente a los ácidos nucleicos
de Córdoba y San Luis es plantado
durante la extracción y los inutilizan
con fines de forestación para crear
para la mayoría de las aplicaciones en
bosques artificiales en tierras que
investigación (Katterman & Shattuck,
anteriormente estaban cubiertas por
1983; Peterson et al., 1997). Los
matorrales. Ha sido introducido cerca
polisacáridos son visualmente
del nivel del mar: Nueva Gales del
evidentes en extracciones de ADN por
Sur, Australia, donde se expande
su textura viscosa, como de goma, y
naturalmente por el viento y es muy
hacen que el ADN sea no manejable
favorecido por las lluvias que son más
en el pipeteo y no amplificable en el
abundantes en verano. También ha
PCR debido a la inhibición de la Taq
sido introducido en Nueva
ADN polimerasa (Fang, Hammar &
Zelanda con propósitos comerciales y
Grumet, 1992).
está totalmente naturalizado. También
se le ha introducido en el Reino
Unido como ornamental y crece bien.
Técnica RAPD
(Richardson, 2005)
La técnica de ADN polimórfico
amplificado al azar (RAPD) es un
método simple para detectar el
polimorfismo genético del ADN. La sitios de acoplamiento, aumentará o
habilidad de detectar regiones disminuirá el tamaño de la molécula
altamente variables en el ADN a partir amplificada. (Navarro, 1999).
de un método rápido tiene una gran
Hidrólisis de proteínas.
importancia en las investigaciones
biomédicas, en la detección de varios La hidrólisis de proteínas se realiza
tipos de daños y mutaciones en el normalmente en un reactor, con
ADN, en la caracterización de control de agitación, pH, temperatura y
aislamientos, en el mapeo de genes, tiempo del proceso. El sustrato se
en el estudio de poblaciones, en la disuelve o re suspende en agua hasta
identificación de cepas, en estudios que el pH y la temperatura se
epidemiológicos y taxonómicos, así estabilizan; a continuación, se
como en el análisis de rasgos simples agregan las proteasas dando inicio a
y complejos del fenotipo como es el la hidrólisis. A medida que esta
fenómeno de la resistencia. (Fraga, progresa se produce una disminución
2004) del pH debido a la ruptura de los
enlaces peptídicos. En los casos de
Los RAPDs son una técnica que
hidrólisis enzimática, el pH debe ser
consiste en la amplificación de
mantenido en el óptimo de la enzima
segmentos de ADN con iniciadores
mediante la adición de base diluida.
pequeños (generalmente de 10
Para finalizar la hidrólisis proteica la
nucleótidos de longitud) de
enzima puede ser inactivada con
secuencias aleatorias no-
calor, mediante una disminución del
palindrómicas, con un contenido de G
pH o con una combinación de ambos;
+ C entre 50 y 80%, (Lynch y Milligan
o también puede ser retirada del
1994). La secuencia del iniciador es
medio mediante filtración y la proteína
elegida a priori de manera arbitraria y
finalmente precipitada. (Benítez et al,
sólo se utiliza un iniciador por
2008)
reacción, que actuará al mismo tiempo
como iniciador sentido y anti sentido.
Los fragmentos obtenidos se
visualizan como un patrón de bandeo
característico del individuo y cada
banda observada se considera un
locus. La presencia o la ausencia de
las bandas entre individuos se deben
a cambios en la secuencia (o a la
pérdida) de los sitios a los que se
alinea el iniciador. La inserción o
eliminación de nucleótidos en la
secuencia intermedia entre los dos
Materiales y métodos.
Materiales
Lisis, soluciones y reactivos.
 Lisis 1(rompimiento membrana celular): 0.15 gr cloruro de amonio, o,21 gr trisbase
 Lisis 2 (rompimiento membrana nuclear): 0,06 gr trisbase, 1,17gr NACL, 200 ur decita
o.5 molar PH 8.2
 Lisis 3 (precipitación de proteínas): 2.5 ml SDS 20%, 0,5 gr, 9,6 gr acetato de amonio.
 Lisis 4 (resuspension): isopropanol 99,9 %
 Lisis 5 (lavado de proteínas): etanol 70 %
 Lisis 6 (suspensión final):0,06 gr trisbase, 100 ul CDTQ 0,5 molar PH 82
 Tampón de extracción: 2% CTAB, 100mM Tris-HCl (pH 8.0), 20 mM EDTA∙Na2∙2H2O,
1.4 M NaCl2
 β-mercaptoetanol
 10 mg/ml proteinasa K
 Cloroformo:AIA [24:1 (v/v)]
 Tampón TE: 10 mM Tris-HCl (pH 7.4); 1 mM EDTA∙Na2∙2H2O
 Tampón de lavado: 76% etanol; 10mM acetato de amonio
 100% isopropanol
 10mg/ml ARNasa A
 7.5 M acetato de amonio
 100% etanol

Practica # 1 Practica #2 Practica #3

 Tubo tapa rosca  Mortero  Congelador

 Micro pipeta  Tubo tapa rosca  Mortero

 Jeringuillas  Micro pipeta  Tubos eppendorf

 Vórtex  Jeringuillas  Baño María

 Centrifuga  Vórtex  Centrifuga

 Lisis 1,2,3,4,5,6.  Centrifuga  Vórtex

 Guantes  Lisis 1,2,3,4,5,6  Micro pipeta, Lisis

anteriormente utilizadas
 Tapabocas  Proteinasa k.
 Proteinasa K
Métodos

Protocolo en tejido animal. (Laboratorio #1).

Se extrae la sangre y se mantiene en un tubo con anticoagulante, luego de esto se

agregan 300 microlitros de esta sangre en un tubo eppendorf, se agita por inmersión
más de 5 veces, se le agregan 900 microlitro de lisis 1, se deja incubar por 10 min,
luego se pasa a la centrifugadora a 12 000 rpm por 15 min, para posteriormente
evaluar la calidad del pellet obtenido y conforme a esto se estima la necesidad de
desechar el sobrenadante y agregar nuevamente lisis 1 u o continuar el proceso
desechando solo el sobrenadante dejando el pellet para luego adicionar 300
microlitros de lisis 2, pasar por el vórtex 5 minutos y luego adicionar 300 microlitros
de lisis 3, de nuevo llevar a vórtex por 5 minutos, centrifugar a 12000 rpm por 15
minutos, el sobrenadante se transfiere a un tubo eppendorf, se adiciona 300
microlitros de lisis 4 se agita por inversión y se saca el sobrenadante adicionando
posteriormente la lisis 5 de lavado para posteriormente dejar la muestra secar.
Protocolo en tejido vegetal. (Laboratorio #2).

Se trituran las hojas con un peso aproximado de 5 mg, luego se maceran con la
ayuda de un mortero, se adicionan 900 microlitros de lisis 1, para luego agregar
100 microlitros de proteínas k, en el tubo de tapa rosca se agregan hasta 0,5 de la
muestra, Para luego agregar 500 ml de la lisis 1, se lleva al vórtex por 2 minutos, se
tapa bien y se lleva a baño seco a 37 grados por 12 minutos, se aumenta luego la
temperatura a 52 grados por 5 minutos para luego volver a aumentar la temperatura
por 5 minutos a 63 grados, se lleva a la centrifuga a 12000 rpm por 12 minutos para
sacar el sobrenadante y agregar las lisis 2 y 3 para volver a centrifugar, se sacan
400 microlitros, de nuevo llevar a vórtex por 5 minutos, centrifugar a 13.000 rpm por
15 minutos, el sobrenadante se transfiere a un tubo eppendorf, se adiciona 300
microlitros de lisis 4 se agita por inversión y se saca el sobrenadante adicionando
posteriormente la lisis 5 de lavado para posteriormente dejar la muestra secar.
Protocolo en tejido vegetal (Laboratorio #3).
Macerar 3-5 mega gametofitos en 500 µl de tampón de extracción precalentado a
65°C. Al momento de la extracción adicionar 0.2% β mercaptoetanol y 50 μg de
proteinasa K. Seguidamente incubar a 60°C por 30 min agitando ocasionalmente.
Se agrega 1 volumen de cloroformo-AIA (24:1) y mezclar por inversión para formar
una emulsión. Centrifugar a 12000 rpm por 5 min a 4°C. Cuidadosamente trasferir
la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Se Repiten pasos 2, 3 y 4. A la fase
acuosa ya transferida en un nuevo tubo, adicionar isopropanol frío al 100% (2/3
volúmenes). Mezclar por inversión conservándolo a -20°C por 2 h. Centrifugar a
12000 rpm por 5 min a 4ºC, descartar el isopropanol y lavar el sedimento con 2 ml
de tampón de lavado (2 veces) ayudando a resuspender el sedimento con una
micropipeta. Centrifugar a 12000 rpm por 5 min a 4ºC después de cada lavado.
Eliminar el sobrenadante y dejar secar el precipitado a temperatura ambiente 15–
20 min. Resuspender los ácidos nucleicos en 500 μl de tampón TE. Agregar 5 μl
de ARNasa A (10μg/ml) e incubar a 37°C por 30 min. Adicionar 7.5 M acetato de
amonio (pH 7.7) a una concentración final de 2.5 M y 1 volumen de etanol puro
frío. Mezclar muy bien por inversión para precipitar el ADN. Centrifugar a 12000
rpm por 5 min a 4ºC, descartar el sobrenadante y dejar secar el ADN a
temperatura ambiente unos 30 min, eliminando bien el alcohol. Resuspender a
100 µl de tampón TE y conservar a -20ºC.
Resultados

Práctica número 1.

A la muestra de sangre se
agregan 300 microlitros de esta
sangre en un tubo eppendorf, se
agita por inmersión más de 5
veces, se le agregan 900
microlitro de lisis 1, se dejar
incubar por 10 min.

Se pasa a la centrifugadora a 12
000 rpm por 15 min, para
posteriormente evaluar la
calidad del pellet obtenido y
conforme a esto se estima la
necesidad de desechar el
sobrenadante.
Continuar el proceso
desechando solo el
sobrenadante dejando el pellet
para luego adicionar 300
microlitros de lisis 2

Pasar por el vórtex 5 minutos y

luego adicionar 300 microlitros
de lisis 3

Agregar nuevamente lisis 1 u o

continuar el proceso
desechando solo el
sobrenadante dejando el pellet
para luego adicionar 300
microlitros de lisis 2, pasar por el
vórtex 5 minutos y luego
adicionar 300 microlitros de lisis
3, de nuevo llevar a vórtex por 5
minutos
 Centrifugar a 13.000 rpm por 15
minutos

El sobrenadante se transfiere a
un tubo eppendorf, se adiciona
300 microlitros de lisis 4 se agita
por inversión y se saca el
sobrenadante adicionando
posteriormente la lisis 5 de
lavado para posteriormente
dejar la muestra secar.

Practica numero 2

Se trituran las hojas con un peso

aproximado de 5 mg, luego se
maceran con la ayuda de un
mortero, se adicionan 900
microlitros de lisis 1
Luego agregar 100 microlitros
de proteínas k, en el tubo de
tapa rosca se agregan hasta 0,5
de la muestra

Para luego agregar 500 ml de la

lisis 1, se lleva al vortex por 2
minutos

Se tapa bien y se lleva a baño

seco a 37 grados por 12
minutos. se aumenta luego la
temperatura a 52 grados por 5
minutos para luego volver a
aumentar la temperatura por 5
minutos a 63 grados
Se lleva a la centrifuga a 12000
rpm por 12 minutos para sacar el
sobrenadante y agregar las lisis
2 y 3 para volver a centrifugar

Se sacan 400 microlitros, de

nuevo llevar a vortex por 5
minutos, centrifugar a 13.000
rpm por 15 minutos,

El sobrenadante se transfiere a
un tubo eppendorf, se adiciona
300 microlitros de lisis 4 se agita
por inversión y se saca el
sobrenadante adicionando
posteriormente la lisis 5 de
lavado para posteriormente
dejar la muestra secar.
Práctica numero 3

Se lava el material vegetal, y se

almacena a -54°C durante 20
minutos (se resguarda la muestra
en papel aluminio. Se macera hasta
pulverizarse en un mortero pre
enfriado.

Se agregan las soluciones (tampón

de extracción) precalentado a 65°C.
Se adiciona mercaptoetanol y
Proteinasa K. Se incuba a 60°C por
30 minutos.

Se adiciona Cloroformo y se
centrifuga a 12000 rpm por 5
minutos.
 Se repiten varios puntos del
protocolo (pasos2,3,4), pero
antes se transfiere la fase
acuosa a un tubo nuevo.

Se adiciona isopropanol frío, se

mezcla la inversión y se
centrifuga nuevamente.

Se descarta el isopropanol y se
lava con el tampón de lavado;
todo esto se realiza dos veces,
re suspendiendo el sedimento.
Se incuba a temperatura
corporal, adicionando acetato
de amonio, y etanol. Se mezcla.
Todo esto se hace con el fin de
precipitar el ADN.
 Se centrifuga por última vez, se
descarta el sobrenadante y se
pone a secar a temperatura
ambiente, asegurándose de
eliminar el alcohol de la
muestra. Al momento del
secado se espera unos cuantos
minutos, después de esto, se
aprecia claramente varias
hebras a contra luz.

Análisis de resultados

Práctica numero 1

Buscando una optimización del proceso, se deben utilizar agujas de calibre

apropiado, respetando la relación muestra/anticoagulante y homogeneizar
correctamente la muestra para evitar la hemólisis y/o coagulación, y la
contaminación bacteriana. Una vez obtenida la muestra es importante evitar
movimientos bruscos durante el transporte. (Velásquez. 2014).

Con el fin de facilitar su maceración, el tejido se deshidrata con etanol o bien,

congelarse con nitrógeno líquido. Se transporta la muestra usando un buffer
especializado que inactive las endonucleasas, por ejemplo, el RNAlater
(Ambion®). Otra opción es homogenizar el tejido en buffer de lisis que contenga
sales de gua-nidina o ß-mercaptoetanol que inhiben DNAasas y RNAasas.

Se pueden apreciar ciertas diferencias en los procesos de extracción

específicamente en el uso de DTT y el uso de proteinasa K, cuando se usa el
DTT junto con un buffer de lisis este tienen un papel de reductor y antioxidante,
que puede romper puentes de disulfuro, lo que permite la degradación de la
membrana celular, este reactivo se usa generalmente para soluciones liquidas
(Gonzales, 2007), mientras que la proteinasa K se usa para muestras sólidas,
donde se ve la interacción en el rompimiento de enlaces peptídicos, permitiendo
la degradación de la membrana y proteínas que puedan afectar el DNA ( Van
Waters, Rogers, 2011).
Cuando se realiza el proceso de lisis las moléculas que conforman la pared
interactúan, las membranas tanto celular como nuclear se modifican o en otros
casos se destruyen permitiendo la liberación de los ácidos nucleicos. Se deben
usar soluciones básicas, con el fin de disolver la membrana celular, así como
inhibidores para inactivar las enzimas que degradan el ADN. Muchas soluciones
de lisis contienen también E DTA, que forma un complejo con los iones de Mg2+
e impide el funcionamiento de las DNAasas (Sambrook et al. 1989). Los
componentes celulares no solubles como el material fibroso y proteínas que
permanecen en solución se separan del ADN por centrifugación. (Velásquez.
2014).

Práctica numero 2

Para con los tejidos vegetales, se debe colectar tejido joven por su alto contenido
por unidad de peso con respecto al tejido viejo ya que posee menos
polisacáridos y poli fenoles que generan una dificultad al momento de la
extracción. Cuando se colecta el tejido, este debe congelarse inmediatamente
en nitrógeno líquido para evitar la formación de cristales y que se sinteticen meta-
bolitos secundarios después de la abscisión. Si el tejido es obtenido de
invernaderos o cultivo in vitro, no es necesario congelar el material, se puede
hacer la extracción directamente. (Velásquez. 2014).

Se logró la extracción de ADN con calidad para PCR a partir de muestras frescas
y secas de plantas. Estos resultados son importantes en la Extracción de ADN
teniendo en cuenta que para la ejecución de estudios con marcadores
moleculares y en particular con secuencias, uno de los métodos más usado en
la actualidad, es importante contar con ADN de buena calidad y cantidad.
Además, la realización de dichos estudios incluye muestras frescas provenientes
del campo o muestras secas como las disponibles en los herbarios o procesadas
para conservación. En la actualidad el éxito de iniciativas mundiales como la del
código genético de barras para identificar plantas, depende del ADN con el cual
se inicia el proceso de identidad molecular para el material vegetal, en particular
si se considera que algunos compuestos polifenólicos, azucares de cadenas
largas y otros metabolitos secundarios pueden afectar el proceso de extracción
y amplificación de las regiones de interés en algunas plantas (Zhu et al. 2006).

Práctica Número 3

Se hizo la extracción de ADN vegetal siguiendo el protocolo recomendado por

Cerda y Díaz (2013) para gimnospermas; este, está basado en el método de
extracción CTAB de Doyle y Doyle (1990) para tejidos vegetales frescos. Este
protocolo está destinado a una especie de pino (P. tecunumanii), y también en una
buena manera al Pino pátula. Sim embargo, como todas las especies son
diferentes y tienen modificaciones.
La modificación principal es la utilización de Proteinasa K, esta homogeniza el
tampón de extracción del tejido, seguida de Cloroformo: AIA, y una segunda
lavada con tampón de lavado (lisis5). Tales modificaciones hacen que el ADN
quede libre de polisacáridos y proteínas, haciendo que el ADN sea de muy buena
calidad y más fácil de diluir. (Cerda y Díaz, 2013).
En el laboratorio, se ve como resultado de la metodología a contra luz las hebras
bien definidas; en cuanto a la Proteinasa K, es una poderosa enzima proteolítica
con un amplio espectro de acción; es una proteasa molde que bloquea las
enzimas degradantes en la lisis de la pared celular y desproteiniza al ADN de
forma eficiente (Gross-Bellard, Oudet &Chambon, 1973). También se realizó una
segunda extracción con Cloroformo: AIA para asegurar la precipitación de las
proteínas y la Proteinasa K y así obtener los ácidos nucleicos al extraer la fase
acuosa. La remoción de proteínas es un paso clave que a menudo es llevado a
cabo por la extracción de la fase acuosa de los ácidos nucleicos con fenol y/o
cloroformo (Sambrook & Russell, 2001).
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