Máster en Biotecnología Aplicada a la Conservación y Gestión

Sostenible de Recursos Vegetales

TRABAJO FIN DE MÁSTER

Identificación y caracterización morfológica y

genética de algas invasoras en Asturias

Marcos Montes Berdasco

22-07-2014
Máster en Biotecnología Aplicada a la Conservación y Gestión
Sostenible de Recursos Vegetales

TRABAJO FIN DE MÁSTER

Identificación y caracterización morfológica y genética

de algas invasoras en Asturias.

Marcos Montes Berdasco

Firma

José Manuel Rico Ordás Yaisel Juan Borrell Pichs

Firma Firma
 Índice de contenidos
1. Introducción Pág. 1

1.1. Planteamiento y objetivos Pág. 3

2. Materiales y métodos Pág. 4

2.1. Sitio de estudio Pág. 4

2.2. Muestras de estudio Pág. 5

2.3. Análisis molecular Pág. 9

2.3.1. Extracción de ADN. Pág. 9

2.3.2. PCR Pág. 9
2.3.3. Secuenciacion Pág. 9
2.3.4. Barcoding en genebank y Bold Pág. 10
2.3.5. Análisis filogenéticos Pág.10
3. Resultados Pág. 10
3.1. Morfología externa de Prionitis sp 3jeju Pág. 14

3.2. Morfología externa de Prionitis sp 2 jeju Pág. 14

3.3. Morfología externa de Grateloupia turuturu Pág. 15

3.4. Análisis filogenético Pág. 14

4. Discusión Pág. 17

5. Conclusiones Pág. 24

6. Bibliografía Pág. 25
RESUMEN
La introducción de especies exóticas marinas y su posible actividad invasiva se
considera hoy en día la 3ª gran amenaza global para la biodiversidad. Para evitar
estos daños es necesario mantener controles que permitan una certera y rápida
identificación de las especies que están invadiendo o siendo introducidas. Los
métodos morfológicos muchas veces no son capaces de discernir especies cripticas
por lo que hoy en día se usan métodos de identificación genética, con especial
relevancia el uso de barcoding. El caso de las algas rojas foliosas es muy
característico en Europa, ya que debido a que su simple morfología han ocurrido
introducciones cripticas, como el caso de G. turuturu que se confundía con G.
doryphora. La presencia de esta Galicia nos pone en antecedentes, de que esto
sucede en costas cantábricas. Por lo que nosotros proponemos un estudio para la
identificación de especies cripticas introducidas en Asturias, mediante el uso de
técnicas de barcoding usando a COI como marcador principal. Se encontraron dos
especies alóctonas, nunca antes descritas en Europa (Grateloupia hawaiiana and
Prionitis sp 3jeju).

ABSTRACT
The introduction of exotic species and there possible invasive activities are nowadays
considered the 3º greatest threat to global biodiversity. In order to evade these
damages it is necessary to maintain regular controls that may allow a quick and precise
identification of species that are involved in introduction or invasive process.
Morphological identification methods are, in many times, no longer able to discern
cryptic species, and so, genetic identification it is gaining new relevance, especially
genetic barcoding. A particular case in Europe would be of the foliose red algae
because of their simple morphology, cryptic introductions have occurred, like the
introduction of G turuturu which was confused with G doryphora. The presence of G
turuturu in Galicia gives as enough background to tell that this same process may be
happening in Cantabrian coasts as a cryptic invasion. We propose an algae
identification study centered on foliose red algae using Barcoding techniques, as COI
as the main marker. We found two species that were never described before in Europe
(Grateloupia hawaiiana and Prionitis sp 3jeju).
 AGRADECIMIENTOS
Este trabajo no podría haber sido posible sin la colaboración de ciertas personas a las
que quiero mostrar mi agradecimiento:

A Yaisel y a Rico, mis tutores, por su dedicación, entusiasmo, y ante todo paciencia, y
también por ser muy majos.

A Eva García Vázquez y a todo el departamento de genética por darme un agradable

recibimiento el tiempo en el que he estado trabajando ahí, y a toda la gente que me ayudo
ahí.

Al área de Fisiología Vegetal, por dejarme todos los materiales que he necesitado y su
gran amabilidad, con mención especial para M.J. Cañal, Luis Valledor, Chus, Mauro y Daniel.

A todos mis compañeros pero en especial a Mario, Alejandro Rivera, Javi Alfaro y a Fran.

Y más importante, a mi novia Lucia, por ser lo mejor que me ha pasado en la vida.

Gracias a todos.
1. INTRODUCCIÓN
La introducción de especies alóctonas en ambientes marinos puede suponer una
amenaza para los ecosistemas marinos litorales, al presentar éstas comportamientos
potencialmente invasivos, que pueden llegar a competir y desplazar a las especies
autóctonas. Dichos comportamientos generan condiciones de estrés que pueden producir, a
su vez, en cambios en los ecosistemas, llegando incluso a comprometer la integridad de los
mismos. Tan importantes pueden llegar a ser los procesos de invasión de especies exóticas
que han sido clasificados como una amenaza global para la biodiversidad, junto a la pérdida
de hábitat y la fragmentación (Walker y Steffern 1997), pudiendo repercutir negativamente
sobre la economía (Nunnes y Markandia 2008). Las principales fuentes de introducción de
estas especies exóticas tienen su origen en la actividad antropogénica: la acuicultura, el
transporte de especies exóticas, la circulación por canales y, en especial, junto a los barcos y
transportados en todo tipo de actividad portuaria, ya sea de forma local o transnacional, por
lo que estas zonas portuarias serían las más proclives a recibir especies exóticas que se
asentasen en ellas (Nunnes 2014).

Las macroalgas marinas tienen una gran importancia en los ecosistemas marinos al
proporcionar amplios servicios ecológicos: sirven de sustrato para múltiples animales
sésiles, proporcionan hábitat a organismos móviles y constituyen una fuente de alimento
para muchos de esos organismos (Voerman et al. 2013). Así pues, son un elemento relevante
a proteger en los ecosistemas marinos puesto que, al aportar oxígeno al agua, gran parte la
de la comunidad que hay en el hábitat marino depende de ellas (Graham et al 2002).

Un método usual para la identificación de especies exóticas se basa en la caracterización

morfológica y fisiológica de las mismas, seguido de un análisis comparativo de dichos
caracteres. Sin embargo, es muy común que especies exóticas se establezcan en un
ecosistema sin provocar ningún tipo de alarma debido a su naturaleza críptica, al tener una
morfología similar a algunas algas autóctonas o debido a una mala caracterización del
proceso introductor cuando varias especies alóctonas son similares entre sí. En estos casos,
la dificultad de la caracterización morfológica hace necesario utilizar métodos de detección
con base genética, como métodos de barcoding (Mclvor et al. 2001; Saunders 2008), que
suponen una herramienta de identificación muy útil y fiable. Esta técnica consiste en el uso
de diferencias nucleotídicas en un solo gen para investigar diferencias evolutivas,

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especialmente en genes conservados. Los genes plastídicos y mitocondriales son los más
usados, ya que pueden mutar más rápido que los nucleares, pudiendo ser usados de forma
más específica para la identificación de especies al comparar sus diferencias (Moore 1995).
La particularidad del barcoding radica en el uso de una inmensa base de datos, como BOLD o
Genbank, para realizar un screening que pueda identificar la especie, usando genes
previamente descritos, como el COI (citocromo oxidasa I), que es el gen bioidentificador más
usado para animales (Hebert et al. 2003). Esta técnica es muy usada para la detección de
especies crípticas, así como para detectar múltiples invasiones, incluso de especies vegetales
(McIvor et al. 2001).

Las algas, y en especial las algas rojas, pueden ser muy difíciles de identificar debido a la
relativa simplicidad de su morfología y anatomía así como a la convergencia y plasticidad
fenotípica que presentan y la alternancia de generaciones heteromórficas. Por lo tanto, se ha
llegado a depender, en gran medida, de herramientas genéticas para realizar taxonomía
molecular, aunque impera la necesidad de un gen común y fiable para realizar barcoding, en
el caso de las algas se han usado los espacios del cox 2 y 3, rbcL y LCU (variable portions of
the large subunit of the ribosomal cistron).

No obstante, parece que el uso de COI, al igual que en animales, puede ser más útil que
otros genes debido a que éste revela, generalmente, secuencias de mayor divergencia
interespecífica con respecto a rbcL y, por lo tanto, puede proporcionar una mejor evidencia
de la separación de especies estrechamente relacionadas en macroalgas (Yang et al. 2008).
El uso de COI presenta mayores ventajas porque también es usado en el resto de reinos, lo
que lo haría muy útil al encontrar nuevas especies, especialmente en el caso de algas rojas y
pardas, donde se ha sugerido como marcador principal debido a estas y otras características
del gen COI como sus regiones más cortas y la cantidad de primers que existen (Saunders y
McDevit 2012).

El uso de COI como marcador principal para macroalgas es novedoso, al contrario que el
uso de técnicas de barcoding para diferenciar algas, un ejemplo perfecto sería el caso de las
algas rojas foliosas en Europa. Se consideraba que G. lanceola no era más que un sinónimo
taxonómico de G. doryphora, dada la gran variabilidad morfológica que pudieron observar
entre los numerosos especímenes foliosos de G. doryphora. Así, G. doryphora se tomó por
todas las grateloupias foliosas encontradas en las costas atlántica y mediterránea, citándose
en Europa como especie alóctona en 1969, probablemente introducida desde el Océano

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Pacífico (Farnham e Irvine 1973). La utilización de métodos de barcoding con rbcL
permitieron demostrar que los ejemplares de G. doryphora encontrados en la costa atlántica
en el norte de España eran en realidad G. turuturu yamada en 2002.

Los mismos autores cuestionan, por ello, este criterio taxonómico reduccionista,
tendente a reagrupar por su variabilidad morfológica y falta de caracteres diagnósticos
definidos muchas de las especies foliosas descritas en el género Grateloupia, entre ellas G.
lanceola (Bárbara y Cremades 2004). A raíz de esto, podemos considerar que el género
Grateloupia es un género que todavía no ha sido totalmente esclarecido debido a la similitud
y la convergencia morfológica existente entre distintas especies.

1.1. Planteamiento y objetivos

La presencia de algas rojas foliosas en las costas asturianas ya ha sido catalogada

anteriormente (Cires y Moliner 2010). No obstante, este estudio permite llevar a cabo una
nueva aproximación a la identificación de especies y a la comparación de bases de datos
(Genbank y BOLD) en el uso de barcoding mediante COI, un marcador que, aun siendo fiable,
no tiene una gran universalidad para todas las algas, por lo que se utilizarán primers
recomendados por anteriores publicaciones (Saunders y McDevit 2012). En este trabajo se
analizan algas rojas foliosas pues suponen un buen ejemplo para demostrar la efectividad de
métodos de barcoding para detectar especies crípticas difíciles de identificar por otro tipo de
métodos, ya que las características morfológicas no están perfectamente definidas y se ha
demostrado anteriormente la gran variación morfológica que presentan.

Los objetivos que se plantean son:

1. Detección específica de posibles algas invasoras entre la selección de algas

rojas foliosas recogidas en las costas asturianas, la mayoría de ellas
crípticas.

2. Comparación de bases de datos (Genbank y BOLD) para la identificación de

algas mediante el uso de COI como marcador.

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2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Sitio de estudio

Este estudio se basa en la detección de posibles especies crípticas introducidas entre

las algas rojas foliosas presentes en la costa asturiana. Especímenes de algas rojas fueron
recolectadas en los pantalanes del puerto deportivo de Candás y de Gijón, durante la marea
baja, separándolas del sustrato al que estaban fijadas con una pala.

El puerto deportivo de Candás, situado en el centro de la costa asturiana, da cobijo a

pequeñas embarcaciones y otro tipo de actividades acuáticas. El puerto en sí se podría
dividir en dos zonas: la zona antigua más cercana al pueblo, donde puede llegar a haber un
calado de 0 metros durante la bajamar; y una zona más exterior en la que eso no ocurre y de
cuyos pantalanes se extrajeron las muestras. En cambio, el puerto deportivo de Gijón es un
puerto deportivo de mayor tamaño, siendo éste uno de los más importantes de la costa
Cantábrica. Es un puerto de construcción relativamente reciente, en el que existe mucho
tráfico marítimo de todo tipo, en especial entre puertos regionales, incluyendo el importante
puerto comercial de Gijón a 2 km de distancia (El Musel) y que cobija pequeñas y medianas
embarcaciones, dependiendo de cuál de sus 4 dársenas se trate.

Figura 1. Imagen del puerto de Candás (A) y Gijón (B), marcado con una flecha roja están los
pantalanes de donde se recogieron las muestras, y un mapa de Asturias (C) con la posición de los
puertos (en la foto A, en Candás estaban los pantalanes cuando se tomó la misma)

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 Por un comunicado personal se nos informó en autoridad portuaria que una dársena
acogía yates y otro tipo de embarcaciones privadas que hacían rutas internacionales, una
zona de interés de la que se extrajeron muestras, junto a los pantalanes de las dársenas
contiguas.

Tabla 1: Especímenes extraídos, lugar de extracción e identificación que se sospechó a priori, junto a
muestras obtenidas del herbario
Identificación a priori Espécimen Lugar Identificación a priori Espécimen Lugar
Kallymenia K?1 Gi jón Delesseriaceae RD Ca ndá s
Nyptophilum NY2 Gi jón Rhodymenia pseudopalmata Rho 1 Ca ndá s
Squizimenia SPI Gi jón Rhodymenia pseudopalmata Rho 2 Ca ndá s
Phylophora P? Gi jón Grateloupia lanceola LAN 3 Ca ndá s
Grateloupia turuturu. GTU Gi jón Dilsea DIL 2 Ca ndá s
Grateloupia lanceola G?2 Gi jón
Grateloupia turuturu. TURU 1 Ca ndá s
Kallymenia KP Gi jón
Phylophora PH1 Ca ndá s
Kallymenia K?2 Gi jón
Phylophora PH2 Ca ndá s
Grateloupia lanceola G?1 Gi jón
Grateloupia lanceola LAN 2 Ca ndá s
Nyptophilum NY 1 Gi jón
Grateloupia turuturu. TURU 3 Ca ndá s
Polyneura PN Gi jón
Grateloupia turuturu. TURU 4 Ca ndá s
Phylophora PY 1 Gi jón
Squizimenia/G turuturu EST Ca ndá s
Phylophora PY 2 Gi jón
Grateloupia turuturu. TURU 2 Ca ndá s
Grateloupia GX? Sa nta nder
Grateloupia turuturu. FCO 2078 Ta pi a , 2010 Dilsea DIL 1 Ca ndá s

Grateloupia filicinia FCO 498 Va l des , 1996 Grateloupia lanceola LAN 1 Ca ndá s
Grateloupia doryphora FCO 1583 La Coruña , 2001 Grateloupia turuturu. FCO 2077 Ca ndá s , 2010
Grateloupia doryphora FCO 1584 La Coruña , 2001 Grateloupia turuturu. FCO 2076 Ca ndá s , 2010
Grateloupia filicina FCO 470 Gozon
Grateloupia turuturu. FCO 2133 Va l dés

2.2. Recolección de muestras

Las algas se recogieron en los pantalanes señalados en las fotos (Fig. 1A) y, siguiendo
criterios morfológicos, solo se tomaron algas rojas foliosas. Las muestras se clasificaron
morfológicamente a priori y se preservaron, a continuación, a -20 °C hasta su extracción.
Además se recolectaron secuencias de COI de otros trabajos para el análisis filogénico.
(Tabla 2)

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 Tabla 2. Especies utilizadas para el análisis genético, incluyendo algas obtenidas del herbario con su taxón
obtenido, a priori, por métodos de identificación morfológica, además de especímenes obtenidos de otras
publicaciones. Se incluyen los autores de la recolección y los códigos de la secuencia.

Lugar de Código genbank/id

Taxón Código Fecha de recogida y colector
recogida secuencia
G. turuturu FCO 2076 J M Rico
G. turuturu FCO 2077 J M Rico
G. turuturu FCO 2078 J M Rico
G. filicinia FCO 496 J M Rico
G. doryphora FCO 1583 La Coruña J M Rico
G. doryphora FCO 1584 La Coruña J M Rico
ABMMC1123 Cheju-do, Gary W. Saunders, Han-Gu Choi, 2010-
Prionitis sp 2jeju 8-10 Sur corea 05-18 HQ919268/
ABMMC1189 Cheju-do, Gary W. Saunders, Han-Gu Choi, 2010-
Prionitis sp 2jeju 7-10 Sur corea 05-19 HQ919283
ABMMC1192 Cheju-do, Gary W. Saunders, Han-Gu Choi, 2010-
Prionitis sp 2jeju 6-10 Sur corea 05-20 HQ919284
Australia
Prionitis sp 2jeju OZSEA952-10 oeste Saunders, K Dixon, 2010-11-13 /4042538
Australia
Prionitis sp 2jeju OZSEA953-10 oeste Saunders, K Dixon, 2010-11-13 /3797516
Australia
Prionitis sp 2jeju OZSEA958-10 oeste Saunders, K Dixon, 2010-11-13 /3797552
ABMMC1172 Cheju-do,
Prionitis sp 3jeju 2-10 Sur corea Saunders, 2010- 05-20
ABMMC1024 Connectic B. Clarkston, D. McDevit, M. Bruce, A.
G. turuturu 6-10 ut Savoie, C. Longtin, 2010-04-15 /4010367
ABMMC1043 New South
G. turuturu 9-10 Gales J. Carey, 2010-03-28 HM915221/3529954
ABMMC1044 New South
G. turuturu 0-10 Gales J. Carey, 2010-03-29 HM915222/3529955
ABMMC1044 New South
G. turuturu 1-10 Gales J. Carey, 2010-03-30 HM915223/3529956
ABMMC1302
G. turuturu 0-10 Tasmania F. Scott, 2010-05-14 HQ919329/3648858
ABMMC1302
G. turuturu 1-10 Tasmania F. Scott, 2010-05-15 HQ919330/3648859
ABMMC1360-
G. turuturu 07 Tasmania Gary Saunders, 2005-01-25 /3002928
ABMMC1477
G. turuturu 7-11 Tasmania F. Scott, 2010-05-17 /3952885
ABMMC1645
G. turuturu 2-11 China M.H. Hommersand, 25-06-1994 /4505067
ABMMC4968-
G. turuturu 09 Tasmania G.W. Saunders, 2002-11-25 HM915909/3427486
ABMMC7808-
G. turuturu 10 Tasmania G.W. Saunders & K. Dixon, 2010 – 01 - 23 HM917916/3488584
Hokkaido,
G. turuturu HOKUP012-10 Japon N.Yotsukura & T.Abe, 2009-11-30 HQ566782/3633036

Página | 6
 Hokkaido,
G. turuturu HOKUP013-10 Japon N.Yotsukura & T.Abe, 2009-11-31 HQ566783/3633037
Hokkaido,
G. turuturu HOKUP014-10 Japon N.Yotsukura & T.Abe, 2009-11-32 HQ566784/3633038
Bretaña, Line Le Gall, Jose Maria Utge, Florence
G. turuturu REDEU342-11 Francia Rousseau, L-E Hochart , 2008-07-16 /3878161
Bretaña, Line Le Gall, Florence Rousseau, L-E
Grateloupia sp 2LLG REDEU254-11 Francia Hochart , 2008-07-07 LLG1462/3878154
Bretaña, Line Le Gall, Jose Maria Utge, Florence
Grateloupia sp 2LLG REDEU296-11 Francia Rousseau, L-E Hochart , 2008-07-15 LLG158/3878252
Bretaña, Line Le Gall, Jose Maria Utge, Florence
Grateloupia sp 2LLG REDEU343-11 Francia Rousseau, L-E Hochart , 2008-07-16 LLG1774/3878209
Grateloupia Sherwood,A.R., Kurihara,A., Conklin,K.Y.,
phuquocensis ARS02442 Hawaii Sauvage,T. Presting,G.G., (2010)
Columbia
Grateloupia ABMMC114- britanica,
californica 06 Canada Bamfield, Dixon I., 2004-06-22
Columbia
Grateloupia britanica,
americana Canada Gary Saunders, 19-09-2005
ABMMC1199 British G.W. Saunders, K. Hind & B. Clarkston,
Prionitis Stenbergi 9-9 Columbia 2011-05-05 /4050604
ABMMC1199
Prionitis Stenbergi 9-10 California B. Clarkston, K. Hind, 2010-05-18 /3617871
Rhodymenia North
pseudopalmata MANC001-12 Carolina DW Freshwater, B Deagan, 2009-06-24 KC567671/4894426
Rhodymenia North
pseudopalmata MANC002-12 Carolina DW Freshwater, B Deagan, 2009-06-24 KC567674/4894427
Rhodymenia ABMMC1568- Texas, EE
pseudopalmata 07 UU R. Withall, 2007-02-17 HM033146/2641584
Rhodymenia ABMMC1569- Texas, EE
pseudopalmata 07 UU R. Withall, 2007-02-17 HM033147/2641585
Rhodymenia North
pseudopalmata MANC009-12 Carolina DW Freshwater, B Deagan, 2009-06-24 KC567677/4894434
Rhodymenia North
pseudopalmata MANC028-13 Carolina DW Freshwater, 2013-02-18 KF367754/5123891
Rhodymenia North DW Freshwater, K. D. Turner, 2013-10-
pseudopalmata MANC062-12 Carolina 05 KJ202084/5815410
New
Phyllophora ABMMC1580- Broomstic GWS, D. Saunders, L. LeGall & D.
pseudoceranoides 07 k, Canada McDevit, 2006-12-03 GQ380364/2816953
Rhode
Phyllophora ABMMC1585- Island, EE GWS, B. Clarkston, D. McDevit, S.
pseudoceranoides 07 UU Clayden & S. Hamsher, 2007-04-23 GQ380362/2816954
Nueva
Phyllophora ABMMC194- Escocia,
pseudoceranoides 06 Canada Gary W. Saunders, 2004-9-01 GQ380363/2816957
Prince
Edward
Phyllophora ABMMC3117- Island, B. Clarkston, K. Dixon & K. Roy, 2007-08-
pseudoceranoides 08 Canada 19 GQ380370/2816950
Phyllophora ABMMC620- Maine, EE Gary Saunders, L. LeGall, D. McDevit, S. GQ380367/2816955

Página | 7
 pseudoceranoides 06 UU Clayden & C. Lane, 2006-04-25
Helmintocladia Finisterre, Line Le Gall, Jose-Maria Utge, Yannis
hudsonii CNEM003-10 Francia Turpin, 2009-08-12 HQ603219/3710091
Sherwood,A.R., Kurihara,A., Conklin,K.Y.,
Sauvage,T. and Presting,G.G., 2010-10-
Grateoupia filicinia HQ422590 Hawaii 19 HQ422590 /
Jeju, Corea Yang,M.Y., Han,E.G. and Kim,M.S., 2012-
Grateloupia eliptica G014 del Sur 8-10 JX475023/
Jeju, Corea Yang,M.Y., Han,E.G. and Kim,M.S., 2012-
Grateloupia eliptica G122 del Sur 8-10 JX475021/
Jeju, Corea Yang,M.Y., Han,E.G. and Kim,M.S., 2012-
Grateloupia eliptica GM03 del Sur 8-10 JX475015/
Grateloupia Jeju, Corea Yang,M.Y., Han,E.G. and Kim,M.S., 2012-
lanceolata G021 del Sur 8-10 JX475005/
Grateloupia Jeju, Corea Yang,M.Y., Han,E.G. and Kim,M.S., 2012-
lanceolata G122 del Sur 8-10 JX475010/
Grateloupia Jeju, Corea Yang,M.Y., Han,E.G. and Kim,M.S., 2012-
lanceolata MI06 del Sur 8-10 JX475007/
Grateloupia Jeju, Corea Yang,M.Y., Han,E.G. and Kim,M.S., 2012-
lanceolata JH100130 del Sur 8-1O JX475008
Sherwood,A.R., Kurihara,A., Conklin,K.Y.,
Sauvage,T. and Presting,G.G., 2010-10-
Grateloupia catena ARS02443 Hawaii 19 HQ422588
Sherwood,A.R., Kurihara,A., Conklin,K.Y.,
Sauvage,T. and Presting,G.G., 2010-10-
Grateloupia catena ARS02444 Hawaii 20 HQ422589
Verbruggen,H., Maggs,C.A.,
British Saunders,G.W., Le Gall,L., Yoon,H.S. and
Grateloupia sp GWS003281 Columbia De Clerck,O., 2009-7-31 GQ497308
Cheju-do,
ABMMC1172 Corea del Gary W. Saunders, Han-Gu Choi, 2010-
Grateloupia angusta 5-10 Sur 05-20 /3618705
Cheju-do,
ABMMC1174 Corea del Gary W. Saunders, Han-Gu Choi, 2010-
Grateloupia angusta 2-10 Sur 05-20 3618717
Texas,
Rhodymenia South Saunders,G.W. and McDonald,B., 2010-
pseudopalmata RDW502 Jetty 05-25 HM033145
Sherwood,A.R., Kurihara,A., Conklin,K.Y.,
Grateloupia Sauvage,T. and Presting,G.G. 2010-10-
hawaiiana ARS02004 Hawaii 19 HQ422635

Página | 8
2.3. Análisis molecular

2.3.1. Extracción de ADN.

Se extrajeron entre 20 mg y 70 mg de muestra tanto de las procedentes de

herbario como de las muestras frescas obtenidas en el puerto. La cantidad óptima de
tejido para la extracción de ADN varió dependiendo de la muestra, su estado de
conservación y el tejido en cuestión. Se trituró el tejido en mortero utilizando nitrógeno
líquido y, a continuación, se transfirió el material pulverizado a un eppendorf de 1,5 ml
para la extracción de ADN que se realizó siguiendo el protocolo indicado en el kit de
extracción de ADN de EURX. El ADN extraído se conservó a -20 °C.

2.3.2. PCR

Se llevó a cabo una PCR dirigida a la amplificación del gen mitocondrial COI
(citocromo oxidasa I) del ADN extraído en el apartado anterior. Los primers utilizados en
la PCR fueron Gaz F1 (TCAACAAATCATAAAGATATTGG) y Gaz R4
(AAAATCAAAATAAATGCTG) descritos en Saunders (2012) bajo estas condiciones: 3 mM
de MgCl2; 1x de Buffer PCR; 2,4 mM de dNTPs; 0,3 µM de ambos primers y 1u de Taq
Polimerasa en un volumen de 20 µl, 2 de ellos son extracto.
La PCR se realizó perfil de amplificación descrito en Saunders y Moore (2013): 2’ a
94 °C, 5 ciclos de 30’’ a 94 °C, 30’’ de 42 °C para anneling y 1’ a 72 °C para la extensión;
seguido de 35 ciclos de 30’’ a 94 °C, 30’’ a 46,5 °C para anneling y 1’ a 72 °C para
extensión; y, a continuación, una extensión final a 72 °C durante 7’.

2.3.3. Secuenciación.

Tras completarse la PCR se cortó la banda observada para aislarla y fue sometida a
una extracción de banda en agarosa, siguiendo el protocolo marcado por el kit de
extracción de agarosa de EURX. A continuación se procedió al cálculo aproximado de la
cantidad de ADN puro obtenido, mediante el uso de un marcador y se envió a Macrogen
para su secuenciación.

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 2.3.4. Barcodingen BOLD y Genbank.

Las secuencias de COI obtenidas en el apartado anterior se procesaron en el

programa Bioedit. Se eliminaron aquellas secuencias poco fiables y se utilizaron
únicamente las partes de la lectura que no tenían ningún tipo de interferencia. Una vez
hecho esto se procedió a la comparación de cada una de las secuencias con las bases de
datos de Ncbi y de BOLD, la identificación de especímenes se obtuvo por similitud entre
las secuencias mayor al 97 %.

2.3.5. Análisis filogenético.

Usando el software Bioedit se alinearon mediante clustalW y se eliminaron gaps de

todas las secuencias de COI, que no contenían delecciones, inserciones o sin sentidos, pero
presentaba variaciones en el tamaño de la secuencia fiable dependiendo de la muestra. Se
usaron las muestras extraídas del puerto junto a las que aparecen en la Tabla 1, entre las
que se encuentran aquellas a las que el Barcode en BOLD y Genbank otorgó máxima
similitud. Tras esto, se utilizó el software MEGA v6 para realizar el análisis filogenético. Se
consideró que el mejor método posible para realizar este análisis era el de Tanamura Nei
con el uso de la distribución Gamma y asumiendo sitios invariables (TN93+G+I), se
combinó este método con un bootstrap de 1000 réplicas.

3. RESULTADOS
En este estudio se realizó un análisis de barcoding, comparando el resultado de cada
secuenciación de COI con dos bases de datos: Genbank y BOLD. Ésta última es la que más
posibilidades de proporcionar identificaciones tiene (similitud >97 %) ya que cuenta con
mayor número de aportaciones de secuencias COI extraídas de algas rojas, ya que apostaban
activamente que el marcador principal para algas rojas debía ser COI (Saunders 2005;
Saunders 2008; Freshwater et al. 2010).

De 38 muestras analizadas, 36 muestras fueron identificadas (gracias a BOLD en 36

casos y a Genbank en 4 casos) mediante el uso de secuencias de 600 pb de la región COI,
aproximadamente en todos los casos, cortadas mediante el programa Bioedit.

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 Esas secuencias se usaron junto a las mostradas en la Tabla 2 para crear un árbol
filogenético, con la intención de aclarar las relaciones entre las especies recolectadas (Fig. 6).
Usando el programa MEGA v6 se eliminaron los gaps para poder alinear todas las secuencias,
utilizando 530 pb para el árbol filogenético.

Se puede observar que la mayor cantidad de identificaciones positivas se corresponde

con la base de datos de BOLD (Tabla 2), mientras que usando Genbank las identificaciones
positivas son menos frecuentes, solo para Grateloupia hawaiina ocurren 2 positivos, pero
aun así la correlación es mayor con BOLD para Prionitis sp 2jeju. En general la media de
identificaciones positivas de BOLD es muy superior a la de Genbank usando el gen COI como
marcador molecular. En base a esto se puede concluir que BOLD es mejor herramienta para
el barcoding.

Se puede observar como una gran cantidad de muestras son Prionitis sp 3jeju (Tabla
2), un alga descrita por Saunders en Cheju-do (una provincia de Corea del Sur), seguida en
abundancia se encuentra Prionitis sp 2jeju encontrado en el oeste de Australia y en Cheju-do.
Por otra parte, Rhodymenia pseudopalmata tiene una similitud de 99,6 % o superior con las
muestras PH1, PH2 y Rho, esta especie ya ha sido descrita en Europa, una especie autóctona.
También se encontró Grateloupia sp 2LLG con una similitud del 100 % en Valdés, especie que
corresponde a la muestra FCO 498; Helmintocladia hudsonii, en Santander, con una similitud
del 99,8 % corresponde a la muestra Gx; y Delesseriaceae sp. MAR1 en Candás,
correspondiendo a las muestras RD, y en Gijón con NY2, NY1, con unas similitudes del 99,2
% en Candás y del 100 % en Gijón. Todas estas especies al ser reportadas en Europa, y ser
muy probablemente alóctonas no son de interés, a diferencia de las Grateloupias y Prionitis,
de origen asiático.

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Tabla 2. Resultados de los análisis genéticos mediante técnicas de barcoding utilizando el marcador COI,
comparando el uso de las bases de datos de BOLD y Genbank, del ncbi. Se muestran en color grisáceo aquellas que
no consiguieron suficiente similitud como para ser identificadas.

Lugar Espécimen Identificación BOLD Pct(%) Máxima similitud en Ncbi Pct.(%)

(Genbank)
Ca ndá s RD Delesseriaceae sp. MAR1 100 Glaphyrymenia sp. 1WA 86
Gi jón NY2 Delesseriaceae sp. MAR1 100 Glaphyrymenia sp. 1WA 86
Va l des , 1996 FCO 498 Grateloupia sp. 2LLG 100 Grateloupia angusta 90
Ca ndá s Rho1 Rhodymenia pseudopalmata 100 Rhodymenia pseudopalmata 93
Gi jón P? Prionitis sp. 2Jeju 99,8 Grateloupia hawaiiana voucher ARS02004 99
Sa nta nder GX? Helminthocladia hudsonii 99,8 Helminthocladia hudsonii voucher 99
LLG3000
Ca ndá s LAN 1 Prionitis sp. 3Jeju 99,7 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 96
Ca ndá s Rho 2 Rhodymenia pseudopalmata 99,7 Rhodymenia pseudopalmata voucher 94
NCWeed-065
Ca ndá s LAN 3 Prionitis sp. 3Jeju 99,7 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 96
Ca ndá s DIL 2 Prionitis sp. 3Jeju 99,7 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 96
Ta pi a , 2010 FCO 2078 Prionitis sp. 3Jeju 99,7 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 95
Gi jón GTU Prionitis sp. 3Jeju 99,7 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 95
Ca ndá s , 2010 FCO 2076 Prionitis sp. 3Jeju 99,7 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 95
Gi jón G?2 Prionitis sp. 3Jeju 99,7 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 95
Ca ndá s TURU 1 Prionitis sp. 3Jeju 99,7 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 95
Gi jón SPI Prionitis sp. 3Jeju 99,7 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 95

Ca ndá s TURU 2 Prionitis sp. 3Jeju 99,7 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 95
Gi jón KP Prionitis sp. 3Jeju 99,7 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 96
Ca ndá s DIL 1 Prionitis sp. 3Jeju 99,7 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 96
Ca ndá s PH1 Rhodymenia pseudopalmata 99,7 Rhodymenia pseudopalmata voucher 93
NCWeed-065
Ca ndá s PH2 Rhodymenia pseudopalmata 99,6 Rhodymenia pseudopalmata voucher 93
NCWeed-065
Ca ndá s LAN 2 Prionitis sp. 3Jeju 99,6 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 95
Gi jón K?1 Prionitis sp. 3Jeju 99,6 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 96
Gi jón K?2 Prionitis sp. 3Jeju 99,5 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 96
Ca ndá s TURU 3 Prionitis sp. 3Jeju 99,5 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 95
Ca ndá s TURU 4 Prionitis sp. 3Jeju 99,5 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 95
Gi jón G?1 Prionitis sp. 3Jeju 99,5 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 95
Ca ndá s , 2010 FCO 2077 Prionitis sp. 3Jeju 99,5 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 95
La Coruña , 2001 FCO 1584 Prionitis sp. 3Jeju 99,5 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 95
Gi jón NY 1 Delesseriaceae sp. MAR1 99,2 Glaphyrymenia sp. 1WA 86
Ca ndá s EST Prionitis sp. 3Jeju 99 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 95
Gi jón PY 1 Prionitis sp. 2Jeju 99,8 Grateloupia hawaiiana voucher ARS02004 99
Gi jón PY 2 Prionitis sp. 2Jeju 100 Grateloupia hawaiiana voucher ARS02004 99
La Coruña , 2001 FCO 1583 Grateloupia Turuturu. 100 Grateloupia phuquocensis voucher 93
ARS02441
Va l dés FCO 2133 Prionitis sp 3jeju 99,7 Grateloupia lanceolata voucher HAL036 96
Gozon FCO 470 No match Phycodrys rubens voucher GWS013862 92
Gi jón PN No match Phycodrys rubens voucher GWS013863 92

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 3.1. Prionitis sp 3jeju

Prionitis sp. 3jeju es un espécimen aislado en Corea del Sur, siendo la única
identificación posible en el Barcoding por BOLD (alcanzando un 99% de correlación o
incluso más con la gran mayoría de los especímenes encontrados en Gijón y Candás). En las
imágenes se puede observar una cierta variabilidad morfológica, pero todas compartían
elementos morfológicos comunes, como las láminas largas lanceoladas, de textura lubricosa,
un color rojo o amarronado, lo cual concuerda con la descripción hecha por Okamura en
1935, que afirmaba que G. lanceolata era un alga con hojas superiores de entre 10 y 70 cm,
de un color rosáceo, rojo o marrón y con una textura lubricosa y con forma lanceolada, de 3 a
15 cm de ancho, lo cual es una descripción parecida a la de Prionitis sp 3jeju.

Figura 3. A) FCO 2077, recogida en Candás, identificada a priori como Grateloupia turuturu. B)
FCO 2078: recogida en Candás e identificada como G. turuturu. C) TURU, muestra extraída en
Candás, D) FCO 1584 y recogida en La Coruña, identificada como G. doryphora. E) FCO 2078.
Identificada como G.turturu. F) Prionitis sp 3jeju extraída por Saunders, foto extraída de BOLD.

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 3.2. Prionitis sp 2jeju

Prionitis sp 2jeju es un alga ramificada dicotómicamente, de color rojizo, y con unas

láminas relativamente gruesas que se unen en un centro cilíndrico; más allá de esta
descripción, se pueden observar claramente parecidos entre la morfología de G hawaiiana y
Prionitis sp 2jeju, ya que Dawson en 1958 describía a G. hawaiiana como un alga con talos de
16 cm de altura y de entre 7 - 25 mm de ancho, una mata redondeada de hojas planas,
dicotómicamente ramificadas, cuneadas en la base de una muy delgada, cilíndrica estípite de
5-6 mm (Fig. 4).

Figura 4. A) Muestra P, recogida en Gijón. B) Prionitis sp 2 jeju, identificada por Saunders,

imagen recogida de BOLD. C) PY1 recogida en Gijón. D) Grateloupia Hawaiiana, imagen
recogida de Algae Base.

3.3. Grateloupia turuturu

Según Yamada (1941) es un alga cuyas hojas superiores miden de 10 a 70 cm, de

color que varía del rosa al rojo oscuro, tienen una forma lanceolada y son simples o están
irregularmente divididas en un plano (Fig. 5).

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Figura 5. A) FCO 1583, recogida en La Coruña, identificada como G. doryphora. B) Grateloupia
turuturu; Imagen extraída de BOLD.

Originalmente comentada como Grateloupia doryphora, esta alga tenía unas

características morfológicas muy variadas, pero aquí se pueden apreciar claras similitudes,
pues tanto G. lanceola como G. turuturu y G. doryphora presentan caracteres muy generales
que pueden llevar a confusión, como mínimo, en la caracterización de morfología externa.

3.4. Relaciones filogenéticas

En el esquema filogenético (figura 6) se distinguen claramente 3 bloques. Uno

distinguiendo G. turuturu y algunas Grateloupias; otro distingue a G. lanceolata y Prionitis sp
3jeju y, paralelo a esos 2 grupos, se distingue el tercer grupo que representa G. hawaiiana o
Prionitis sp 2jeju, lo que sugiere que pudiesen tener un ancestro común que divergió en G.
turuturu y luego otro que dio lugar a Prionitis sp 2jeju y G. lanceolata y Prionitis sp 3jeju.
También se incluyeron Rhodymenias pseudopalmata, Philophoras sp. y Helmintocladia sp.
como grupos externos para poder enraizar el árbol.

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Figura 6: Árbol filogenético tipo Neighbour-Joining mediante el uso de COI de 530 pb, y un modelo
Tamura nei asumiendo distribución gamma y sitios invariables. Se muestra el árbol consenso, tras aplicar
1000 réplicas de bootstrap
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4. DISCUSIÓN
El uso de técnicas de barcoding con COI para la identificación de algas rojas es, tal y
como se ha demostrado en este estudio, muy eficiente, llegando a detectarse hasta 7 especies
distintas, la gran mayoría muy diferentes a lo que se pensó que era a priori, con excepción de
Rhodymenia.

Genbank vs bold

De todas las especies identificadas, tres son, con cierta seguridad, introducciones. Una
de ellas, G. turuturu, ya fue descrita anteriormente en Galicia como especie introducida
(Bárbara et al. 2002) siendo recolectado también en Galicia, a su vez, el espécimen que
hemos identificado en este trabajo. En la costa asturiana, no obstante, se han detectado dos
especies que no han sido reportadas en Europa anteriormente. Se trata de las algas Prionitis
sp 3jeju y Prionitis sp 2jeju. Rhodymenia pseudopalmata es, en cambio, una alga común en
Golfo de Vizcaya y fue descrita anteriormente en las costas españolas (Miranda et al. 1936).
Helmintocladia hudsoni, fue descrita en Francia por Le Gall y Saunders (2010) y cuyo género
ha sido reportado en Asturias al menos una vez. Grateloupia sp 2LLG que ha sido recolectada
en las costas atlánticas de Francia; y Delesseriaceae sp. MAR1, detectada también en las
costas europeas. La identificación de estos especímenes, a pesar de ayudarnos a demostrar
la gran eficacia del barcoding con COI como método de identificación fiable de algas marinas,
no son de especial interés al no tratarse de especies introducidas o no reportadas
previamente.

Durante este estudio comparamos dos bases de datos, BOLD y Genbank, en la

identificación por barcoding. A la vista de los resultados obtenidos podemos afirmar que la
base de datos más fiable para la identificación de algas rojas (usando el marcador COI) es
BOLD, pues dio identificación positiva en todas las búsquedas y se demostró, a su vez, que
COI es un marcador molecular con numerosas ventajas, ya que la reducida universalidad de
los primers para realizar amplificaciones se compensa con la existencia de una gran cantidad
de primers disponibles que se usan en todos los reinos (por ejemplo, el primer Gaz F1 que
utilizamos se usa, normalmente, en animales). Además, destaca la amplia fiabilidad que
ofrece el uso de COI en el barcoding en sí (reportada previamente por varios autores,
Saunders 2005; Freshwater et al. 2010), así como su mayor conveniencia al ser mucho más
corto que el otro gran gen utilizado en barcoding, el rbcL (que mide 1200 pb en comparación

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con 600 de COI), por lo que es más fácil de secuenciar (probablemente más barato también),
siendo especialmente útil para estudios en los que se necesite una rápida identificación de
algas rojas. No obstante, ya se comentó anteriormente que COI es un mejor marcador para
distinguir especies dentro del mismo género y especies muy correlacionadas, lo cual lo hace
más útil para detectar especies crípticas, pero puede dar problemas entre géneros distintos
al intentar hacer grandes filogenias (Sherwood et al. 2010).

En lo que respecta a la calidad de las bases de datos de Genbank y BOLD, cabe

mencionar que en solo 4 casos, con Grateloupia hawaiiana el Genbank consiguió una
identificación al 99 % para 3 muestras, a pesar de ser aun así superada por la BOLD con
Prionitis sp 2jeju en los 3 casos y con Helmintocladia hudsonii con la que BOLD y Genbank
coincidieron en la identificación. Pero la inequidad de poder identificador entre BOLD y
Genbank para comparar algas rodófitas foliosas, queda patente al pasar secuencias de COI
extraídas de Genbank (con el propósito de realizar el árbol filogenético) por el sistema
BOLD, pues en el caso de Grateloupia americana y Grateloupia sp. el BOLD les otorga un
100% de similitud con Prionitis lanceolata, además para si observamos el esquema
filogenetico, vemos como ambas, G. americana , Prionitis lanceolata, Grateoupia sp,y Prionitis
stembergensis (obtenido de Globalmirror) anidan juntos en el esquema.

Tras esto parece razonable concluir que BOLD es mejor base de datos para uso de
barcoding, al menos en lo que respecta a halymeniales, y que es posible que Genbank no esté
tan actualizado como BOLD.

Análisis filogenético

Este análisis nos permite ver la distribución filogenética de las especies. Se vislumbra
tras el mismo que la mayoría de las especies analizadas están emparentadas de forma
cercana con el orden Halymeniales y al género Grateloupia, para ser más concretos, estas
además están más emparentadas con algas analizadas en costas asiáticas, así que podría
decir con bastante seguridad que Prionitis sp 3jeju y Prionitis sp 2jeju son especies
introducidas, descritas en costas asiáticas principalmente y solo en zonas del Pacífico, no en
costas Europeas.

Por otra parte se ve en la distribución del cuadro que las muestras de Prionitis están
anidadas dentro de las grateloupias, lo cual es extraño debido a que al ser un género distinto

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esto no debería ocurrir así, en teoría debería enraizar fuera, tal y como ocurre con G. catena
y G. elíptica.

Esto no es una hipótesis exclusiva de este estudio, puesto que ya ha sido

documentado anteriormente que el género Prionitis y Grateloupia comparten características
morfológicas y anatómicas y, aunque estos géneros pertenecen a subclados distintos dentro
del gran clado Grateloupia/Prionitis, la mayoría de estos subclados son, en realidad, una
mezcla de ambos géneros, por lo que ya se ha propuesto que todas las especies que forman
Grateloupia y Prionitis sean asignadas a un solo género (Wang et al. 2001) y, a pesar de que
el gen COI de problemas para distinguir géneros en grandes filogenias, sigue siendo fiable
para distinguir tanto especies distintas como géneros distintos (Sherwood et al. 2010)

Prionitis sp 3jeju

En lo que respecta a la detección de Prionitis sp 3jeju, el hecho de que se identificase

en la muestra de Grateloupia doryphora de Galicia de 1996 sugiere que esta introducción no
es muy reciente, probablemente. Llama la atención que solo haya sido descrita en Corea del
Sur, pero observando el esquema filogenético, a priori, no sería muy ambicioso decir que es
en realidad G. lanceolata o, como mínimo, un pariente muy cercano o una especiación de G.
lanceolata quizás. Grateloupia lanceolata es un alga roja descrita por primera vez por
Okurama (1935) en las costas del Pacífico (Japón) y que ha llegado a ser descrita en Norte
América, China y en la costa mediterránea de Francia como una especie alóctona (Verlaque
et al. 2005) y que, como se observó anteriormente, presenta una morfología similar a la
Prionitis sp. 3jeju.

No obstante, cuando pasamos las secuencias Genbank de G. lanceolata por el BOLD se

puede observar una identidad del 99 % o más con todas las Grateloupias lanceolata
presentes en BOLD, seguido de Prionitis sp 3jeju con un 95 % de identidad. Esto parece
indicar cierta similitud, pero no que sean la misma especie, ya que compartiendo la misma
área de distribución (Corea del Sur) tendrían que tener una mayor similitud.

Si miramos, en cambio, el esquema filogenético que se nos presenta en BOLD (Fig. 7)

al usar un código cualquiera de los recolectados se nos revela que, a pesar de estar cercano a
la G. lanceolata, hay una clara separación entre ellas, lo que revela que muy probablemente
sea una especie distinta, pero con un ancestro común cercano.

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Figura 7: Esquema filogenético extraído de BOLD para la un espécimen identificado como Prionitis
sp 3jeju, y usando datos privados a los que no se pueden acceder. Se usó el modelo Kimura 2
parameter, asumiendo que no hay codones no codificantes y usando secuencias de más de 200 pb.

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Prionitis sp 2jeju

En el caso de las identificaciones positivas de Prionitis sp 2jeju, únicamente ha sido

detectada en Gijón. Éstas están más emparentadas, según el esquema filogenético, a las algas
detectadas en Australia pero, por otro lado, dos de esas Prionitis sp 2jeju también fueron
identificadas como Grateloupia hawaiiana y, en el esquema filogenético, G. hawaiiana está
muy emparentada con Prionitis sp 2jeju de Corea, por lo que no sería muy desproporcionado
decir que G. hawaiiana es en realidad Prionitis sp 2jeju y viceversa. Es más, si se realiza un
BOLD a la secuencia COI de Genbank de G. hawaiiana, éste le otorga un 99,87 % de similitud,
por lo que se puede decir casi con total seguridad que G. hawaiiana ha sido introducida en
Europa.

Si hacemos una examen más intensivo del esquema filogenético (Figura 6) se pueden
ver 2 grupos claros: uno en el que está la Grateloupia hawaiiana y otro en el que están
Grateloupia turuturu, Prionitis sp 3jeju y Grateloupia lanceolata. Esto daría a entender la
existencia de un ancestro común a partir del cual se separararon ambos grupos. Esto tiene
bastante sentido dado que tanto G. turuturu, G. lanceolata y Prionitis sp 3jeju comparten
prácticamente su área de distribución, mientras que G. hawaiiana está parcialmente
restringida a Hawái posiblemente, aunque ya se ha descubierto también en Corea y en
Australia, por lo que puede que esta hipótesis no sea del todo definitiva.

Grateloupia turuturu

Respecto a la detección de Grateloupia turuturu, se puede argumentar que los análisis

morfológicos han resultado ser más bien poco fiables en lo que se puede comparar con lo
que se había identificado previamente en el herbario. De todas formas ya se sabía que la
identificación de las especies de algas rojas foliosas era algo complicada. Se puede observar
una abundancia de Prionitis sp 3jeju en las muestras de herbario identificadas como G.
turuturu, y también como la FCO 1583 obtenida en Galicia, que se la identifico como G.
doryphora ha acabado siendo G. turuturu.

Estos resultados encajan con estudios anteriores que ponían de manifiesto la

dificultad de distinguir G. doryphora de G. turuturu detectadas en Galicia (Gavio y Frederick
2002), donde ya se avisaba junto a Bárbara y Cremades (2004) de la dificultad que supone
usar criterios morfológicos para identificar estas dos especies en particular y de todas las
Grateloupias foliosas en general.

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 En 2002 se recolectaron conjuntamente G. lanceola y G. turuturu en Cala Bens,
localidad situada a 1 km al oeste de Isla Redonda. Hacia el este se encontró G. turuturu en
Punta Liseiro (2001) y San Amaro (2003), dos localidades situadas a 3 y 6 km de Punta
Redonda, respectivamente, y en las cuales había registros de G. lanceola previos a la
introducción de G. turuturu, poniendo en evidencia una introducción críptica que los
métodos morfológicos no fueron capaces de detectar.

Transcurridos cinco años desde la primera recolección de G. turuturu, se ha podido

verificar que las dos especies conviven en la localidad donde fue observada por primera vez
al desarrollarse en entornos ligeramente distintos G. lanceola. Por lo que parece no se preveé
que ejerza un desplazamiento de las grateloupias nativas y, por tanto, sería difícil de tomar
como especie invasiva, aunque si introducida.

Gracias a las técnicas de barcoding, hemos podido detectar en Asturias la

introducción de Prionitis sp 3jeju y Grateloupia hawaiiana, siendo Prionitis sp 3jeju una
invasión críptica ya que, comparando los resultados con el herbario, se puede observar la
identificación morfológica como G. doryphora tanto de una G. turuturu como Prionitis sp
3jeju. En la costa asturiana solo se tenía registro de G. dichotoma y G. filicinia (Cires y Moliner
2010), pero en este estudio ninguna de ellas fue encontrada, aunque eso puede deberse a
que el muestreo se realizó en puertos, es decir zonas muy degradadas y por lo tanto distintas
a los ecosistemas en los que G. filicinia y G. dichotoma se suelen distribuir habitualmente y en
donde hay una alta competencia con estas algas introducidas.

En lo que se refiere a la naturaleza de las Prionitis, ya hemos discutido que Prionitis sp

2jeju es G. hawaiiana, no obstante Prionitis sp 3jeju a pesar de no ser G. lanceolata sí que sería
razonable afirmar que pertenece al género de las grateloupias, por lo que se han detectado 3
introducciones, dos de ellas novedosas, de Grateloupia en Europa.

Generalmente, las algas marítimas exóticas son introducidas por medio de los
crustáceos, más específicamente los crustáceos que se pegan a cascos de barcos, en el agua
de lastre, mediante el intercambio de acuarios o bien en redes de caza para peces a los que
las algas se quedan adheridos (Verlaque 2005). El comercio de ostras, comparado con los
otros vectores, es por mucha diferencia el mayor vector de introducción de macroalgas en el
Atlántico Norte (Verlaque et al. 2007). Las esporas y propágalos de macroaglas se adhieren a
los caparazones de los moluscos y bivalvos provocando el 44% de las introducciones de

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macroalgas, tanto dentro de Europa como entre el Atlántico y el Pacifico (Wallentinus,
2002).

Posiblemente estas algas de muy probable origen asiático debieron llegar a las costas
europeas mediante transporte marítimo transnacional, probablemente de ámbito comercial,
luego probablemente se ha extendido a estos pequeños puertos deportivos mediante tráfico
marítimo regional.

Figura 8. Orígenes y rutas principales de las especies exóticas marinas. Estos patrones
están asociados a las rutas marítimas más (Hugo Ahlenius, UNEP/GRID-Arendal:
http://www.grida.no/graphicslib/detail/major-pathways-and-origins-of-invasive-
species-infestations-in-themarine-environment_7eb0)

Como se puede observar la principal ruta hasta Europa de las costas asiáticas pasa
obligatoriamente por el Canal de Suez o por el Canal de Panamá. Teniendo en cuenta que
estas algas, como G. turuturu se encuentran en las costas atlánticas, es más probable que
pasasen a través del Canal de Panamá hasta llegar aquí.

El hecho de que Grateloupia hawaiiana se encontrase en Gijón y no en el puerto de

Candás nos hace pensar que existe un vector de introducción más cercano a Gijón que a
Candás, y teniendo en cuenta la información proporcionada por autoridad portuaria del
puerto de Gijón sobre pantalanes en los que había yates privados con rutas transnacionales
de Gran Bretaña, Francia y muchos otros países, planteamos la posibilidad de que estas algas
ya estén establecidas en otros puertos europeos y que han llegado aquí desde esos puertos
mediante el transporte comercial hasta el puerto comercial de Gijón y de ahí al deportivo, o
directamente al deportivo, usando los susodichos yates privados como vector, o ambas

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posibilidades a la vez. También existe la posibilidad que haya llegado a Asturias a través de
las introducciones iniciales de 1996 en Galicia.

Una introducción de esta naturaleza debería ser motivo de cierta alarma, a pesar de
que se esperaba encontrar una especie introducida, en lugares antropizados, deteriorados y
con mucho movimiento como son los puertos, no deja de ser preocupante, puesto que la
costa del norte de España es una importante zona geográfica donde chocan corrientes
oceánicas frías y calientes (García et al. 2011), lo que convierte a Asturias en una zona de
alta diversidad de algas y de amplia riqueza. Estas poblaciones algareas ya se han visto
comprometidas debido a un aumento de la temperatura media del mar en 1 grado
centígrado, lo que ha causado un declive en las poblaciones de algas marinas y de los
bosques de algas en Asturias (Voerman et al. 2013), este declive aumenta el peligro de un
posible establecimiento de algas invasoras que puedan producir aún más daños en el
ecosistema marino y en este estudio se ha determinado su naturaleza exótica pero no se
puede demostrar si se trata de especies invasoras o no.

Estas particularidades hacen que la detección de especies exóticas sea algo más
primordial de lo que ya es de por sí, pues ya múltiples veces se ha puesto de manifiesto la
necesidad de necesita un programa para la vigilancia de introducciones de especies exóticas,
detectar los vectores y actuar rápidamente contra las especies detectadas (Lodge et al. 2006)

Muchos autores ya han hecho hincapié en lo necesarias que son las medidas de
vigilancia para la detección temprana de especies introducidas. Un estudio con más puertos,
uno comercial y una zona control, para averiguar de dónde salen los vectores de introducción
y actuar erradicando las poblaciones que se establezcan. (Vander Zanden et al. 2009)

5. CONCLUSIONES
En base a lo expuesto anteriormente se puede concluir lo siguiente:

1. Se ha detectado 2 especies introducidas no detectadas en Europa anteriormente,

siendo la Prionitis sp 3jeju mas probablemente la invasora criptica debido a que se
encontró en Galicia en el 96, confundida con una G.turuturu
2. Se ha demostrado que COI es una eficiente herramienta para hacer barcoding,
especialmente usando la base de datos BOLD, mucho más actualizados que Genbank.

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6. BIBLIOGRAFIA
Bárbara I., Cremades J. (1997) Grateloupia lanceola versus Grateloupia doryphora
(Gigartinales, Rhodophyta) en las costas de la Península Ibérica. XII Simposio de
Botánica Criptogámica, Valencia, España pp. 53-54.

Bridgette E. Clarkston and Gary W. Saunders.(2010) A comparison of two DNA barcode

markers for species discrimination in the red algal family Kallymeniaceae (Gigartinales,
Florideophyceae), with a description of Euthora timburtonii sp. nov.Botany Vol. 88,

Cabioch J ,Castric-Fey A., L'Hardy-Halos M.T. & Rio A.(1997).Grateloupia doryphora et

Grateloupia licinavar.luxurians (Rhodophyta, Halymeniaceae) sur les cotes de la
Bretagne. Cryptogamie Algol., 18: 117±137

Cires R.E., Moliner C.C. (2010). Checklist of benthic algae from the Asturias coast (North of
Spain). Bol. Cien. Nat. R.I.D.E.A. 51: 135-212.

Dawson E. Y. (1958). A new gjgartinoid Grateloupia (red alga) from Hawaii. Pacific
Naturalist. Vol 1 No 1.

Farnham W.F., Irvine L.M. (1973) The addition of a foliose species of Grateloupia to the
British marine flora. British Phycological Journal 8: 208-209.

Freshwater D.W., Tudor K., O’Shaugnessy K., Wysor B. (2010) DNA barcoding in the red
algal order Gelidiales: comparison of COI with rbcL and verification of the “barcoding
gap”. Cryptogamie Algologie 31:435-449.

Gavio B., Fredericq S. (2002). Grateloupia turuturu (Halymeniaceae, Rhodophyta) is the

correct neme of the non-native species in the Atlantic known as Grateloupia doryphora.
European Journal of Phycology 37: 349-359.

Hebert P.D.N., Cywinska A., Ball S.L., deWaard J.R. (2003) Biological identifications through
DNA barcodes. Proc R Soc Lond B Biol Sci 270: 313–321.

ICES (1992). Report of the Working Group on Introductions and Transfers of Marine
Organisms.

ManghisI A, Morabito M, Bertuccio C, Le Gall l, Couloux A, Cruaud C & Genovese G (2010)

Is routine DNA barcoding an efficient tool to reveal introductions of alien macroalgae?
A case study of Agardhiella subulata (Solieriaceae, Rhodophyta) in Cape Peloro
lagoon (Sicily, Italy). Cryptogamie, Algologie, 31 (4): 423-433

Página | 25
McIvor L., Maggs C.A., Provan J., Stanhope M.J. (2001) rbcL sequences reveal multiple
cryptic introductions of the Japanese red alga Polysiphonia harveyi. Molecular Ecology
10: 911-919.

Mi Yeon Yang , Eun Gyu Han, Myung Sook Kim. (2013). Molecular identification of
Grateloupia elliptica and G. lanceolata (Rhodophyta) inferred from plastid rbcL and
mitochondrial COI genes sequence data. Genes Genom ,35 :239–246

Moore WS (1995) Inferring phylogenies from mtDNA variation: Mitochondrial-gene trees

versus nuclear-gene trees. Evolution 49: 718-726.

Nunes A.L. Katsanevakis S., Zenetos A., Cardoso A.C. (2014) Gateways to alien invasions
in the European seas. Aquatic Invasions 9: 133–144.

Nunes, P. A. L. D., and Markandya, A. (2008). Economic value of damage caused by marine
bio-invasions: lessons from two European case studies. – ICES Journal of Marine
Science, 65: 775–780.

Nunnes P.A.L.D, Markandya A. (2008). Economic value of damage caused by marine bio-
invasions: lessons from two European case studies. ICES Journal of Marine Science,
65: 775–780

Okamura K. (1935).Icones of Japanese algae. Vol. VII (5),pp. 39–48 (English), 35–43
(Japanese), pls 321–325. Kazamashobo Publisher, Tokyo, Japan

Pérez-Cirera J.L., Cremades, J., Bárbara I. (1989). Grateloupia lanceola (Cryptonemiales,

Rhodophyta) en las costas de la Península Ibérica: estudio morfológico y anatómico.
Lazaroa 11: 123-134.

Saunders G.W . (2008) A DNA barcode examination of the red algal family Dumontiaceae in
Canadian waters reveals substantial cryptic species diversity. 1. The folioseDilsea–
Neodilsea complex and Weeksia. Botany 86: 773-789.

Saunders G.W. (2005) Applying DNA barcoding to red macroalgae: a preliminary appraisal
holds promise for future applications. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.3601879-
1888.

Saunders G.W. and Moore T.E. (2013) Refinements for the amplification and sequencing of
red algal DNA barcode and RedToL phylogenetic makers: a summary of current
primers, profiles and strategies. Algae 28: 31–43.

Página | 26
Saunders G.W., Mcdevit D.C. (2012) Methods for DNA barcoding photosynthetic protists
emphasizing the macroalgae and diatoms. Methods Mol Biol 858: 207-22.

Verlaque M., Boudouresque C.F., Mineur F, (2007) Oyster transfers as a vector for marine
species introductions: arealistic approach based on macrophytes. In: Briand F. &
Moschella P. (eds), Impact of mariculture on coastal ecosystems. Lisboa, CIESM
Workshop Monographs 32: 39-47

Verlaque M., Brannock P.M.,.Komatsu T .Villalard-Bohnsack M and Marston M .(2005). The

genus Grateloupia C. Agardh (Halymeniaceae, Rhodophyta) in the Thau Lagoon
(France, Mediterranean): a case study of marine pluri specific introductions. Phycologia
44: 477–496.

Voerman S E, Llera E, Rico J M (2013) Climate driven changes in subtidal kelp forest
communities in NW Spain. Marine Environmental Research 90 119-127

Walker, B., and Steffen W. (1997). An overview of the implications of global change for
natural and managed terrestrial ecosystems. Conservation Ecology [online]1(2): 2.
Available from the Internet. URL: http://www.consecol.org/vol1/iss2/art2

Wallentinus I., (2002). Introduced marine algae and vascular plants in European aquatic
environments. In: Leppäkoski E., Gollasch S. & Olenin S. (eds), Invasive Aquatic
Species of Europe –Distribution, Impacts and Management. Dordrecht, Kluwer
Academic Publishers, pp. 27-52.

Wang H W, Kawaguchi S, Horiguch T and Masuda M (2001). A morphological and molecular

assessment of the genus Prionitis S.Agardh (Halymeniaceae,Rhodophyta).
Phycological Research ; 49: 251-26

Yamada Y. (1941). Notes on some Japanese algae IX. Scientific Papers of the Institute of
Algological Research Faculty of Science Hokkaido University2: 195–234.

Yang E.C., Kim M.S., Geraldino P.J.L., Sahoo D., Shin J.A., Boo S.M. (2008) Mitochondrial
cox1 and plastid rbcL genes of Gracilaria vermiculophylla (Gracilariaceae,Rhodophyta).
Journal of applied phycology 20: 161-168.

Página | 27