PRACTICA #12 ELISA Por Bloqueo

UNIVERSIDAD CATOLICA SANTA MARIA
PROGRAMA DE INGENIERIA BIOTECNOLOGICA

CURSO : BIOTECNOLOGIA ANIMAL
PRACTICA N° 12
DIAGNOSTICO INMUNOLOGICO MEDIANTE LA PRUEBA DE ELISA
PRINCIPIO:
ELISA (Enzyme-Limked Immnoabsorbend Assay). (Análisis inmunoabsorbente ligado a

Enzimas), A uno de los componentes de la reacción antigeno(Ag)-anticuerpo(Ac) se le
adhiere una enzima que suele ser una peroxidasa o fosfatasa alcalina. Al tener lugar la
reacción Ag-Ac, la enzima se pone en contacto con un sustrato adecuado y da una reacción
que origina una coloración especial que puede medirse fotometricamente. De todos los
inmunoensayos es el mas preciso y permite medir concentraciones muy bajas de un Ag,
Esta prueba consiste en recubrir una superficie de poliestireno de PH elevado con antígeno ó con
anticuerpo.
En éstas condiciones las proteínas se adhieren a la superficie de orificios en una placa preparada
para ello, al reaccionar éstas se forma un complejo antígeno – anticuerpo., luego se aplica la
antiinmunoglobulina ó inmunoglobulina específica del antígeno que ha sido unida a una enzima
como peroxidasa ó fosfatasa alcalina, éste se fijará al complejo antígeno- anticuerpo. Con el
objeto de hacer visible ésta unión se agrega un substrato de la enzima, la que hará que el producto
sea teñido, el color formado se mide en un espectofotómetro,
La intensidad de color es proporcional a la cantidad de enzima presente y por lo tanto proporcional

a la cantidad de antígeno anticuerpo.
PRUEBA DE ELISA POR BLOQUEO
DIAGNOSTICO PARA LA ENFERMEDAD DE NEOSPORA BOVINA
La prueba de ELISA por Bloqueo para Neospora caninum detecta anticuerpos en suero de vacas
y cabras.
PRINCIPIO:
El principio de la prueba se refiere a la interrupción de la reacción entre la proteína recombinante,

con el antígeno adsorbido a la placa ELISA, y el anticuerpo monoclonal conjugado específico.
Los anticuerpos del suero problema bloquean la reacción entre el antígeno que cubre cada pocillo
de la placa de ELISA y el anticuerpo monoclonal de Neospora caninum del conjugado unido a la
enzima HRP (Horseradish peroxidasa) , lo que se materializa en una reducción del color, el que es
detectado por la adición de la enzima sustrato.
El desarrollo de un color fuerte indica que no hay bloqueo ó que existe un pequeño bloqueo del
anticuerpo monoclonal unido a la enzima HRP en el conjugado lo que indicará la ausencia de
anticuerpos Neospora caninum en la muestra de suero analizada.
No desarrollo de color o un color débil desarrollado indica que hubo inhibición de la unión entre el
anticuerpo monoclonal en el conjugado y el antígeno adherido a la placa. Lo cuál indica que está
presente el anticuerpo contra Neospora caninum en la muestra de suero problema.
MATERIALES:
- Kit de ELISA
Contenido del kit:
- Placas de Elisa cubiertas con antígeno para Neospora
- Control positivo
- Control Negativo
- Conjugado anticuerpo unido a enzima HRP (Horseradish peroxidasa)
- Buffer para la dilución del conjugado
- Solución concentrada de lavado
- Solución Sustrato
- Solución de parada (Stop)
- Materiales no incluidos en el Kit
- Pipetas simples
- Pipetas multicanal
- Tubos de prueba ó placas de transferencia vacías
- Papel toalla
- Botella de lavado automático
- Reloj
PROCEDIMIENTO
PREPARACIÒN DEL MATERIAL
1. Dejar el kit, con todos los reactivos y sueros a temperatura ambiente antes de empezar la
prueba.
2. Preparar las placas con la respectiva identificación
3. Preparar el conjugado: Se diluye una parte de conjugado por 99 partes de Buffer para
dilución de conjugado.
4. Preparar la solución de lavado: Diluir una parte de la dilución de lavado con 9 parted de
agua destilada o agua desionizada.
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA:
1. En la placa preparada depositar 50 µl de los controles positivo y negativo en cada pocillo.

2. Depositar las 50 µl de los sueros problema en los siguientes pocillos de la placa de ELISA.
3. Incubar la placa por por 40 minutos a T° ambiente (21 a 25°C ) sin cubrir la placa.
4. Descartar el contenido y lavar la placa con la solución de lavado preparado (tres veces).
5. Adicionar 50 µl de Conjugado a cada pocillo.
6. Incubar por 20 minutos a temperatura ambiente.
7. Descartar el contenido y lavar nuevamente (tres veces)
8. Adicionar el sustrato e incubar a temperatura ambiente por 20 minutos.
9. Sin descartar el contenido adicionar inmediatamente, la solución de frenado (solución
stop).
10. Leer la Densidad Optica (D.O.), en un espectofotómetro ó lector de placas con un filtro
de 620, 630 ó 650 nm.
RESULTADOS
Para calcular el porcentaje de Inhibición (%I):
%I = 100 - [( (D.O.Muestra x 100)/D.O. Control Negativo) ]
INTERPRETACION DE RESULTADOS:
Si la muestra ≥ 30% Inhibición Este es positivo.
Si la muestra < 30% inhibición es Negativa.
CUESTIONARIO
1. Explique sobre la diferencia entre la Prueba de ELISA DIRECTA y la INDIRECTA

Indique las ventajas y desventajas de cada una de ellas.
2. A que se llama ELISA de Competencia. Ventajas y desventajas.
3. En que consiste la prueba de ELISA de Captura y en que la Prueba de ELISA

SANDWICH. Cuáles son sus ventajas y desventajas.
4. Definir que es el sustrato.
5. Definir que es el Conjugado.

CLASIFICACION DE LOS ANALISIS DE ELISA:
1. ELISA DIRECTA.
- Antigeno adherido a la placa
- Suero problema
- Se adiciona el Conjugado (Enzima etiquetada al anticuerpo)
- Se adiciona el sustrato para desarrollar el color.
Ventaja:
- Es simple.
Desventaja:
- Para cada microorganismo (virus, parásito, etc.) debe de hacerse su propio conjugado
(enzima estiqueta al anticuerpo).
2. ELISA INDIRECTA
- Antigeno está adherido a la placa
- Lavar
- Suero es adicionado conteniendo anticuerpos
- Lavar
- Conjugado
- Lavar y el color desarrollara
Ventajas
- Simple y útil ara detectar anticuerpos
- Para virus se necesita un conjugado para cada uno.
- Los aantígenos son a menudo fáciles y económicos de hacer.
3. ELISA DE CAPTURA
- Anticuerpo adherido a la placa
- Se adiciona antígeno
- Se adiciona la enzyma adherida al anticuerpo (detector)
Ventajas:
- Es un método barato para detectar antígeno,
- Resultados en menos de 8 horas.
Desventajas:
- El anticuerpo etector debe de ser conjugado

- Un conjugado separado se necesita para cada virus.
4. ELISA DE COMPETENCIA
SE usa para detectar anticuerpos.
- Antígeno adicionado a la placa
- Suero y Conjugado se adiciona juntos
- El color desarrolla
- Si tiene anticuerpos no desarrolla color
Ventajas:
- Es más específico que la ELISA indirecta
- Anticuerpos en ratones pueden ser útiles.
- Requiere conjugado simple
Desventajas:
- Es más complicado estandarizar que la ELISA indirecta.
MATERIALES
- placas cubiertas con antígeno ó asnticuerpo
- Control positivo
- Control Negativo
- Sustrato
- Diluyentes
MATERIALES DE LABORATORIO:
- Tubos de ensayo de vidrio
- Pipetas automáticas de 2-20μl, 20-200 μl, 200-1000 μl
- Puntas descartables de diferente medida
- Cubetas e plástico
- Lector de ELISA
- Dispositivo para lavado de placas de ELISA
- Homogenizador de placas de ELISA
- Homogemnizador de tubos de ensayo (vortex)
- Agua destilada y desionizada
PROCEDIMIENTO:
1. Anotar LA Posición de las muestras en la hoja de trabajo acorde con la placa de ELISA
2. Adicionar 100 μl, de control negativo a los pozos A1 y A2
3. Adicionar 100 μl de control positivo a los pozos A3 y A4
4. Adicionar 100 μl de muestra en cada hoyo
5. Incubar la placa pòr 30 minutos a temperatura ambiente
6. Lavar de 3 a 5 veces con con agua destilada y desionizada.
7. Adicionar 100 μl de conjugado
8. Incubar la placa durante 15 minutos a temperatura ambiente
9. Vierta 100 μl, de solución frenado en cada pozo para detener la reacción.
10. Calibrar el lector de ELISA y medir
11. Mida y anote los valores de absorbancia.
RESULTADOS
De acuerdo a lo que indique el kit y de acuerdo a la enfermedad.

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ELISA (Enzyme-Limked Immnoabsorbend Assay). (Análisis inmunoabsorbente ligado a

La intensidad de color es proporcional a la cantidad de enzima presente y por lo tanto proporcional

PRUEBA DE ELISA POR BLOQUEO

DIAGNOSTICO PARA LA ENFERMEDAD DE NEOSPORA BOVINA

El principio de la prueba se refiere a la interrupción de la reacción entre la proteína recombinante,

1. En la placa preparada depositar 50 µl de los controles positivo y negativo en cada pocillo.

Para calcular el porcentaje de Inhibición (%I):

%I = 100 - [( (D.O.Muestra x 100)/D.O. Control Negativo) ]

Si la muestra ≥ 30% Inhibición Este es positivo.

Si la muestra < 30% inhibición es Negativa.

1. Explique sobre la diferencia entre la Prueba de ELISA DIRECTA y la INDIRECTA

2. A que se llama ELISA de Competencia. Ventajas y desventajas.

3. En que consiste la prueba de ELISA de Captura y en que la Prueba de ELISA

4. Definir que es el sustrato.

5. Definir que es el Conjugado.

- El anticuerpo etector debe de ser conjugado

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