Extracción de ADN y Electroforesis

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Extracción de ADN y electroforesis

1
Francisco Contreras Altahona; 1Isaac Barrios Torres
1
Universidad de Pamplona, Facultad de Ciencias Básicas, Departamento de Biología. Km 1 Vía
Bucaramanga Ciudad Universitaria, Pamplona, Norte de Santander.

Resumen

La extracción de ADN tiene como objetivo principal obtener la mayor cantidad posible ADN, libre de
proteínas, carbohidratos y otros inhibidores de enzimas. El aislamiento y la cuantificación del ADN
se da por diferentes métodos los cuales tienen como fin primordial de eliminar las sustancias que
se encuentran mezcladas con el ADN, que es la macromolécula a obtener. Actualmente existen kits
comerciales para la extracción de ADN, los cuales reducen el tiempo y a la vez mayor masa de ADN,
el cual se verifico con la técnica de electroforesis que tiene como fin visualizar y cuantificar la
cantidad de ADN que se encuentra en la muestra. Para la obtención del ADN se utilizó el Kit de
extracción de ADN genómico de Invitrogen y para saber la cantidad de ADN se hizo una corrida
electroforética en gel de agarosa. El resultado fue satisfactorio, pues se obtuvo bastante ADN, por
lo el kit utilizado es bastante confiable para los ensayos de obtención de ADN genómico.

Palabras claves

Electroforesis, extracción de ADN, Bromuro de etidio

Introducción isopropanol para eliminar sales por


precipitación aplicable en plásmidos, para
Aislamiento y cuantificación de ADN
agilizar estos procesos existen kits
Para aplicar los métodos de aislamiento y comerciales que automatizan técnicas y
cuantificación del ADN previamente se debe aceleran el progreso de la ciencia principal
conocer que dicha molécula tiene una fuerte ventaja de estos kits es que facilitan la
conformación en su doble hélice, grupos detección de enfermedades congénitas y
fosfato azucares grupos reactivos además permite crear bancos de máquinas de
fuertemente enlazados por puentes de secuenciación génica estos kits básicamente
hidrógeno, todas estas le confiere su alta están basados en la facilidad que tiene el ADN
capacidad de supervivencia permitida que a lo para adsorber sílice o silicato. ( Sambrook &
largo del tiempo el ADN sea secuenciado, sin Green , 2012)
embargo, existen métodos que permiten
La electroforesis es el proceso de movimiento
fragmentar y aislar dicha molécula estos
de moléculas cargadas en una solución al
métodos comienzan con una purificación del
aplicar un campo eléctrico. Debido a que las
ADN a partir de diferentes organismos,
moléculas en un campo eléctrico se mueven
tejidos o fluidos, para dicho proceso se realiza
a una velocidad dependiente de su carga,
una lisis de las células huéspedes y
forma y tamaño, la electroforesis se ha
generalmente se usan detergentes, agentes
desarrollado ampliamente para la separación
caotropicos o alcalinos seguidamente se
de diversas biomoléculas. Debido a que es
realiza la liberación del ADN extracción de las
una herramienta analítica simple y
proteínas e inactivación de nucleasas
relativamente rápida, se utiliza para el
intracelulares, finalmente se usa etanol o
análisis y la purificación de moléculas grandes
como proteínas y ácidos nucleicos o de 3 minutos agregando 70 μl de solución buffer
moléculas pequeñas como azúcares, se llevó nuevamente a centrifugación por
aminoácidos, péptidos y nucleótidos. La 13000 rpm. Finalmente se mezcló 18 μl de
electroforesis de macromoléculas se realiza ADN con 3 μl de buffer de carga colocándolo
normalmente aplicando un volumen en el papel parafilm para homogeneizar la
pequeño de la muestra en una matriz porosa mezcla y se colocó en el pozo del gel de
. Bajo la influencia del voltaje aplicado, las agarosa para electroforesis.
diferentes moléculas presentes en la muestra
Resultados
se moverán a través de la matriz a diferentes
velocidades. Al final se podrá observar la
separación de las moléculas detectadas como
bandas en distintas posiciones dentro de la
matriz. La matriz puede estar compuesta por
diferentes materiales como papel, acetato
de celulosa, agarosa o poliacrilamida (Ausubel
& Kingston, 2002.).

En la unidad de electroforesis, el gel se


encuentra colocado entre dos cámaras que
contienen buffer. La conexión eléctrica ente
las dos cámaras es a través del gel. Debido a
que los ácidos nucleicos tienen carga
negativa, los pozos para muestras deben Figura 1. Patrón de electroforesis de las
colocarse del lado del electrodo negativo para muestras de ADN en gel de agarosa al 0.9%
que estos migren hacia el lado positivo obtenidos por el método de extracción
(Boyer, 2006). invitrogen.

Metodología

Para el aislamiento del ADN se utilizó la


técnica del kit de invitrogen, se tomó 200 μl
de sangre depositándolo en un ependorf,
luego se tomó 20 μl de proteinasa k para la
degradación de las enzimas, se le adiciono 20
μl de Rnasa, posteriormente se le adiciono
100 μl de buffer de lisis genómico y se llevó a
la incubadora por 10 minutos, se agregó 200
μl de etanol y se llevó al vortex para la
eliminación de burbujas. Se le adiciono 600 μl
de la mezcla a la columna y se centrifugo a 10
rpm, se descartó el sobrenadante, se le
añadió 2OO μl de buffer de lavado a la Figura 2. El resultado de la electroforesis
columna adicionándole 300 μl de prelavado y también depende del operario, como se
se centrifuga a 10000 rpm por un minuto, se observa al colocar la muestra en el pozo se
realizó un segundo lavado en el cual se debe tener mucho cuidado de depositarlo
adiciono 500 μl se centrifugo a 13000 rpm por donde no corresponda.
banda del marcador ( Zárate Segura, Jiménez
Sierra, Badillo Corona, Garibay Orijel, & Oliver
Salvador, 2009).

En el gel de agarosa la visualización del ADN


se detectó utilizando bromuro de etidio, un
compuesto químico que es un agente
intercalante del ADN. Cuando el bromuro de
etidio se une al ADN y se expone a la luz
ultravioleta tiene la propiedad de emitir luz
que se acrecienta en presencia de ADN, es
decir, que el bromuro de etidio solo no tiene
la misma intensidad de emisión de luz
estando solo. Aunque cabe aclarar que el
bromuro de etidio puede afectar el
movimiento del ADN en la electroforesis en
Figura 3. Se realizó un aislamiento de ADN el gel de agarosa (Janie & Lyndon , 1996).
mediante Kit de extracción Invitrogen, con el
que se alcanzaron excelentes resultados, pues En la literatura cuando se comparan las
fue posible obtener un ADN genómico de técnicas de extracción de ADN, por lo general
calidad y homogeneidad. los kits tienen una tendencia a presentar
menor contaminación del ADN, esto último es
Análisis de resultados debido a que los kits son fabricados para la
La cantidad de ADN que se consiguió utilizando obtención rápida de ADN, así tienen un
el método de PureLink Genomic Kits de control de calidad que los hace eficientes a la
Invitrogen, para la purificación de ADN fue hora de utilizarlo. Sin embargo, cabe resaltar
mayor a la descrita por el marcador o el patrón, que las otras técnicas también son buenas ya
pues la banda que resulto de la muestra de ADN que dependen de otros factores, como la
extraído en la sangre está arriba de la primera calidad de los reactivos y la destreza o la
banda del patrón; por lo tanto, podríamos decir experiencia del estudiante o investigador al
que la cantidad de ADN presente en la corrida realizar la extracción de ADN (Chacon-Cortes,
electroforética de la muestra a analizar fue Haupt, & Lea, 2012). Un ejemplo típico, que
mayor a 10 Kb y también mayor a 25 ng/μl, una tiene que ver mucho con la experiencia, es a
cantidad siempre considerable para realizar la hora de depositar la muestra en el pozo,
ciertos experimentos que precisan de ADN donde a veces el operario no coloca la
genómico. muestra donde corresponde, por lo que esto
determinara que la electroforesis no se
En el patrón electroforético se observa el realice efectivamente (Figura 2). Es así, como
marcador de peso molecular con las bandas de un error puede afectar los resultados de un
las muestras (Figura 1); donde se evidencia que experimento (Kurien & Scofield , 2019).
todas las muestras no tuvieron mayor
movimiento o una corrida electroforética poco Conclusión
considerable, esto se debe a que las hebras o En conclusión, tomando como referencia el
los fragmentos de ADN de las muestras son resultado satisfactorio de la electroforesis en
bastante grandes en tamaño o la cantidad de gel de agarosa, se puede inferir que el Kit de
ADN en pares de bases supera a la primera
extracción de ADN es bastante confiable a la Ausubel, F., & Kingston, R. (2002.). Short
hora de utilizarlo en la extracción de ADN Protocols in Molecular Biology. USA: Wiley.
genómico de leucocitos; aunque hay que
Boyer , R. (2006). Biochemistry Laboratory:
tener en cuenta las recomendaciones de la
Modern Theory and Techniques. USA:
casa comercial y además que el investigador
Prentice Hall.
tenga experiencia en el manejo de reactivos y
de los instrumentos de laboratorio. Chacon-Cortes, D., Haupt, L., & Lea, R. (2012).
Comparison of genomic DNA extraction
Referencias
techniques from whole blood samples: a time,
Sambrook, J., & Green , M. (2012). Molecular cost and quality evaluation study. Mol Biol
Cloning: A Laboratory. New York U S A: Cold Rep, 5961–5966.
Spring Harbor Laboratory Press.
J., G. M. (2012 ). Molecular Cloning: A
Zárate Segura, P., Jiménez Sierra, C., Badillo Laboratory Manual. New York U S A: Cold
Corona, J., Garibay Orijel, C., & Oliver Spring Harbor Laboratory Press.
Salvador, M. (2009). MANUAL DEL
Janie, S., & Lyndon , L. (1996). The effect of
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA
ethidium bromide on mobility of DNA
MOLECULAR. México D. F: Instituto
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Politécnico Nacional.
Electrophoresis , 1524-1521 .

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