Objetivos:

● Investigar la cinética de descomposición de urea por ureasa

● Utilizar a la enzima ureasa extraída de soya
● Estudiar el mecanismo de reacción para reacciones biocatalíticas
● Obtener los parámetros cinéticos: constante de Michaelis (Km) y rapidez máxima
(rmáx) mediante la ecuación de Lineweaver-Burk.
● Seguir el avance de reacción por medidas de conductividad
● Investigar el efecto de la temperatura sobre la rapidez de reacción en la catálisis
enzimática.
● Obtener la temperatura de máxima actividad de un biocatalizador (ureasa)
● Determinar la energía de activación de una reacción.
● Calcular energía interna, entalpía, entropía y energía de Gibbs de activación (ΔU≠,
ΔH≠, ΔS≠ y ΔG≠) de hidrólisis biocatalítica de la urea.

Introducción
En general, todas las reacciones metabólicas están reguladas por las enzimas, unas
proteínas globulares que actúan como catalizadores, aumentando la velocidad de aquellas
reacciones que son energéticamente posibles. Las enzimas permiten las reacciones en las
condiciones de temperatura, presión y pH propios del medio intracelular, reduciendo la
energía de activación necesaria para que se produzca la reacción. Las enzimas no
experimentan cambios estructurales al final del proceso químico que catalizan.

Las enzimas actúan sobre sustancias determinadas, conocidas como sustratos , cuya
transformación hacen posible. En muchos casos el sustrato es una sustancia muy compleja
que debe transformarse en otra u otras más simples; la enzima se une al sustrato a través de
numerosas interacciones débiles como son: puentes de hidrógeno, electrostáticos,
hidrófobos, etc., en un lugar específico, el centro activo o centro catalítico. Este centro es una
pequeña porción del enzima constituido por una serie de aminoácidos que interaccionan
específicamente con el sustrato debilitando los enlaces que mantienen unidos a los átomos
que lo forman y haciendo más sencilla su transformación. Normalmente el centro activo del
enzima es como una hendidura, que puede modificarse al unirse con el sustrato.

La ureasa, cuyo nombre sistemático es amidohidrolasa de urea, tiene un peso molecular de

483 000 Dalton. La ureasa consta de 6 subunidades estructurales iguales. Es una enzima
muy específica, que existe en varios tipos de vegetales, por ejemplo, en el frijol de soya. La
ureasa se utiliza mucho como agente catalítico para la medición cuantitativa de urea. El
hidróxido de amonio que se forma puede titularse y puede relacionarse,
estequiométricamente, con la cantidad de urea presente en una muestra. Aunque la ureasa
no es muy común en la naturaleza, esta enzima ha tenido más importancia en el desarrollo
de la enzimología moderna que ninguna otra. Las investigaciones sobre la ureasa han
permitido deducir el principio importante en las reacciones enzimáticas: la función de los
grupos SH (sulfhídrico) en la catálisis. La ureasa posee 3 o 4 grupos activos, es una
representante de un gran número de enzimas cuya actividad depende de la existencia de
grupos SH, intactos, procedentes de cisteínas que forman parte de la cadena polipeptídica
de la enzima.
Material, equipo y reactivos
Procedimiento experimental
Para la extracción de ureasa se trituro 1 g de soya en un mortero, posteriormente se
agregaron 20 ml de una solución previamente preparada de etanol/agua al 30% y finalmente
se colocó durante 15 min. a 2500 r.p.m. en la centrifugadora.

Para la determinación de máxima actividad de la ureasa; se colocaron 20 ml de una solución

de urea 0.02 M previamente preparada en un tubo de ensaye y se colocó en un baño de agua
a 30°C. Al cabo de unos minutos cuando en el baño y en la disolución la temperatura era
uniforme, con ayuda de una jeringa, se añadieron 0.5 ml de extracto de ureasa al tubo de
ensaye de manera ipsofacta se puso en marcha el cronómetro, realizando medidas de
conductividad por cada 10 segundos durante 2 minutos.El procedimiento se repitió para
temperaturas de 40,50 y 60 °C .

Finalmente en otro tubo de ensaye se adicionaron 10 ml de disolución de urea 0.004M, de

igual manera se colocó en un baño de agua a la temperatura de máxima actividad, fijando el
tubo al soporte universal. En el momento en el que el baño adquirió la temperatura idónea,
se agregó 0.5 ml de extracto de ureasa al tubo de ensaye, dando marcha al cronómetro e
introduciendo la celda en el tubo de manera inmediata. Se hicieron las medidas de
conductividad por cada 10 segundos durante 2 minutos y se repitieron los pasos anteriores
para concentraciones de 0.008, 0.012,0.016 y 0.02M

Resultados
Tabla 1. Resultados de conductividad en función del tiempo.
 Tiempo (s) Temperatura (°C)

Ambiente 40 50 60

10 100.0 124.3 130.6 162.0

20 100.9 118.8 125.5 155.1

30 101.7 118.2 125.7 155.5

40 103.4 118.5 125.7 159.0

50 103.7 119.7 126.0 161.7

60 104.5 120.1 127.5 164.6

70 105.5 122.0 130.1 199.9

80 106.3 121.9 130.4 199.9

90 107.0 124.0 131.9 199.9

100 107.9 124.5 133.3 199.9

110 108.5 125.5 134.5 191.0

120 109.2 126.9 136.3 192.0

Tabla 2. Resultados de conductividad a 40°C

Tiempo (s) Conductividad

0.004M 0.008M 0.012M 0.016M 0.02M

10 326 377 349 231 124.3

20 317 373 352 241 118.8

30 318 376 356 250 118.2

40 323 381 363 260 118.5

50 327 387 370 268 119.7

60 330 393 379 276 120.1

70 336 398 386 282 122.0

80 343 408 393 292 121.9

90 345 415 402 300 124.0

100 353 422 409 317 124.5

110 359 427 4117 320 125.5

 120 364 434 426 323 126.9

Análisis de resultados

Se elaboró un gráfico comparativo de la conductividad Vs tiempo a las temperaturas de

trabajo, se le aplicó regresión lineal a cada conjunto de datos para determinar 𝑟 0 para cada
temperatura, obteniéndose el gráfico 1 y la tabla 3

Gráfico 1. Conductividad VS tiempo a diferentes temperaturas

Tabla 3. Valores de 𝑟 0 para cada temperatura de trabajo

Temperatura 𝒓 𝟎 (Unidade
(°C) s)

28 0.0838

40 0.0591

50 0.0852

60 0.4609

A partir de la tabla 3, se realizó el gráfico 2 para determinar la temperatura de máxima

actividad catalítica, obteniéndose un temperatura óptima de 40°C , que fue la temperatura de
trabajo en la actividad experimental.

Gráfico 3. 𝑟 0 VS Temperatura
Para determinar 𝑟 0 a diferentes concentraciones, fue necesario realizar un gráfico con los
datos obtenidos de conductividad a cada tiempo de reacción de las soluciones a distintas
concentraciones, obteniéndose el gráfico 4 y la tabla 4

Gráfico 4. Conductividad VS tiempo a diferentes concentraciones.

Tabla 4. Valores de 𝑟 0 para cada concentración de trabajo

Concentración (M) 𝒓 𝟎 (unida
des)

0.004 0.4213
 0.008 0.585

0.012 0.7085

0.016 0.8636

0.02 0.0591

Gráfico 6. 𝑟 0 VS Concentración

4. Perfile el gráfico de (ro) vs [S]o, con base en lo obtenido, en qué región se encuentran
sus resultados(cinética de orden uno, fraccionario o cero).
Perfilando el gráfico de ro vs concentración se concluye que los resultados se encuentran
dentro de la región de orden cero.

5. Mediante la ecuación de Lineweaver-Burck, determine rapidez máxima (rmáx) y la

KM
La ecuación de Lineweaver-Burk es:

Concentración r0 1/(M) 1/ro

(M)
 0.004 0.4213 250 2.37360551

0.008 0.585 125 1.70940171

0.012 0.7085 83.3333333 1.4114326

0.016 0.8636 62.5 1.15794349

0.02 0.0591 50 16.9204738

Según la ecuación lineal:

1 1
𝑉𝑚𝑎𝑥
= 0.8577 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 0.8577 = 1.1659
𝐾𝑚
= 0.0062 𝐾𝑚 = 0.0062(1.1659) = 0.00722
𝑉𝑚𝑎𝑥

6. Determine la constante de rapidez a cada temperatura experimental. No considere

los resultados posteriores a la temperatura de máxima actividad catalítica.

Se sabe que la ecuación de rapidez inicial tiene la forma:

𝑘𝑐𝑎𝑡 [𝐸]0 [𝑆]0
𝑟0 =
𝐾𝑀 + [𝑆]0

Y debido a que anteriormente se ha demostrado que la cinética de la reacción sigue una

ecuación de orden cero, por lo tanto 𝐾𝑀 será despreciable frente a [𝑆]0 por lo tanto la ecuación
de rapidez inicial quedará:
 𝑘𝑐𝑎𝑡 [𝐸]0 [𝑆]0
𝑟0 = = 𝑘𝑐𝑎𝑡 [𝐸]0 = 𝑟𝑚á𝑥 = 𝑘
[𝑆]0

Por lo que la constante de rapidez será constante a todas las temperaturas y su valor será
igual al de la rapidez máxima.
𝑟𝑚á𝑥 = 𝑘 = 0.8577

7. Por medio de la ecuación de Arrhenius, calcule la energía de activación de la reacción

y el factor de frecuencia.
La forma linealizada de la ecuación de Arrhenius es:

T (K) 1/T K InK

301.15 0.00332 0.8577 -0.1535 Commented [1]: Si se supone que sea la misma en
todas las temperaturas?
313.15 0.00319 0.8577 -0.1535 Commented [2]: Si es de orden cero, si; pero aún
tengo duda en este
323.15 0.00309 0.8577 -0.1535
Commented [3]: Aparte Ea da negativa :/
333.15 0.003 0.8577 -0.1535 Commented [4]: Si se supone que sea la misma en
todas las temperaturas?
Commented [5]: Si es de orden cero, si; pero aún
tengo duda en este
Commented [6]: Aparte Ea da negativa :/
Commented [7]: Si se supone que sea la misma en
todas las temperaturas?
Commented [8]: Si es de orden cero, si; pero aún
tengo duda en este
Commented [9]: Aparte Ea da negativa :/

𝐸𝑎
= 3.83 × 10−12 𝐸𝑎 = 3.83 × 10−12 (8.314 𝐽/𝑚𝑜𝑙 𝐾) = 3.18𝑥10−11 𝐽
𝑅
𝑰𝒏𝑨 = 𝟎. 𝟏𝟓𝟒 𝑨 = 𝒆𝟎.𝟏𝟓𝟒 = 𝟏. 𝟏𝟔𝟔𝟓

8. Determine los parámetros de activación: ΔH≠, ΔS≠ y ΔG≠. (Utilizar la ecuación de Eyring), a
cada temperatura de experimentación.

La ecuación de Eyring tiene la forma:

En donde: 𝛥𝐺 = 𝐸𝑛𝑒𝑟𝑔í𝑎 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑎𝑐𝑖ó𝑛
ℎ = 𝑐𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑃𝑙𝑎𝑛𝑘
𝑘𝐵 = 𝑐𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝐵𝑜𝑙𝑡𝑧𝑚𝑎𝑛𝑛
Despejando 𝛥𝐺 obtenemos:
𝑘⋅ℎ
𝑙𝑛
≠ 𝐾𝐵 𝑇
𝛥𝐺 = −
𝑅𝑇

Obteniendo el 𝛥𝐺 para cada temperatura:

Temperatura [°C] ≠
𝛥𝑮 [J/mlo]

25 1305378.852

40 829994.68

50 669363.642

60 561457.946

Para obtener 𝛥𝐻≠ se utiliza la ecuación:

𝛥𝐻 ≠ = 𝐸𝑎 − 𝑚𝑅𝑇

Sabiendo que m=n y que la reacción es de orden 0:

𝛥𝐻≠ = 𝐸𝑎
Por tanto: 𝛥𝐻≠ = 3.18 × 10−11

Entonces para el cálculo de 𝛥𝑆 ≠ se emplea la ecuación:

Despejando se obtiene la ecuación:

≠ 𝑘⋅ℎ
𝛥𝑆 = 𝑅𝑙𝑛
𝐾𝐵 𝑇𝑒−𝛥𝐻/𝑅𝑇
Entonces para cada T:

Temperatura [°C] ≠
𝛥𝑺 [J/mol]

25 -225.5743

40 -229.4819

50 -231.3371

60 -232.8529
Conclusiones
-Se determinó la temperatura de máxima actividad de la ureasa
-Las reacciones catalizadas por una enzima tienen mayor efecto a favor de la cinética y por
lo tanto en las propiedades termodinámicas de la misma, como por ejemplo la disminución
de la energia de activacion.
-Se aplicó y aprendió el procedimiento para extracción de una enzima
-Se observó el efecto de la temperatura sobre la rapidez de reacción en la catálisis enzimática

Referencias
-Vargas, M. & Obaya A. (2005). Cálculo de parámetros de rapidez en cinética Química y
enzimática. (1ª Ed.) Universidad Nacional Autónoma de México, México
-Chang, R. (2000) Fisicoquímica para las ciencias químicas y biológicas, Mc Graw Hill. 3ª Ed,
México.