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Resumen

El presente trabajo práctico tiene como finalidad la determinación de dos

conservantes muy utilizados en la industria alimenticia, nos referimos al ácido
sórbico y ácido benzoico en muestras de mermeladas Wasil.

Pesamos una cierta cantidad de muestra la trasvasijamos a un matraz para

homogeneizarla, luego adicionamos un poco de agua y se calienta a 60ºC durante
30 minutos, enfriamos la preparación y se sonica (ultrasonido, que sirve para
extender la muestra) por 10 minutos, se vuelve a enfriar y se agregan los dos
reactivos de Carrez, se agita y se enraza a 100 ml con agua destilada,
nuevamente agitamos, dejamos en reposo para que decante y posteriormente
filtramos la cantidad suficiente para realizar las mediciones.
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Introducción

La principal causa de deterioro de los alimentos es el ataque por diferentes

tipos de microorganismos (bacterias, levaduras y mohos). El problema del
deterioro microbiano de los alimentos tiene implicaciones económicas evidentes,
tanto para los fabricantes (deterioro de materias primas y productos elaborados
antes de su comercialización, pérdida de la imagen de marca, etc.) como para
distribuidores y consumidores (deterioro de productos después de su adquisición y
antes de su consumo). Se calcula que más del 20% de todos los alimentos
producidos en el mundo se pierden por acción de los microorganismos. Por otra
parte, los alimentos alterados pueden resultar muy perjudiciales para la salud del
consumidor. La toxina botulínica, producida por una bacteria, Clostridium
botulinum, en las conservas mal esterilizadas, embutidos y en otros productos, es
una de las substancias más venenosas que se conocen (miles de veces más
tóxica que el cianuro). Las aflatoxinas, substancias producidas por el crecimiento
de ciertos mohos, son potentes agentes cancerígenos. Existen pues razones
poderosas para evitar la alteración de los alimentos. A los métodos físicos, como
el calentamiento, deshidratación, irradiación o congelación, pueden asociarse
métodos químicos que causen la muerte de los microrganismos o que al menos
eviten su crecimiento. En muchos alimentos existen de forma natural substancias
con actividad antimicrobiana. Muchas frutas contienen diferentes ácidos orgánicos,
como el ácido benzoico o el ácido cítrico. La relativa estabilidad de los yogures
comparados con la leche se debe al ácido láctico producido durante su
fermentación. Los ajos, cebollas y muchas especias contienen potentes agentes
antimicrobianos, o precursores que se transforman en ellos al triturarlos.

Los organismos oficiales correspondientes, a la hora de autorizar el uso de

determinado aditivo tienen en cuenta que éste sea un auxiliar del procesado
correcto de los alimentos y no un agente para enmascarar unas condiciones de
manipulación sanitaria o tecnológicamente deficientes, ni un sistema para
defraudar al consumidor engañándolo respecto a la frescura real de un alimento.

Las condiciones de uso de los conservantes están reglamentadas

estrictamente en todos los países del mundo. Usualmente existen límites a la
cantidad que se puede añadir de un conservante y a la de conservantes totales.
Los conservantes alimentarios con las concentraciones autorizadas, no matan en
general a los microorganismos, sino que solamente evitan su proliferación. Por lo
tanto, solo son útiles con materias primas de buena calidad.

E-200 Acido sórbico

E-201 Sorbato sódico
E-202 Sorbato potásico
E-203 Sorbato cálcilo
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El ácido sórbico es un ácido graso insaturado, presente de forma natural en

algunos vegetales, pero fabricado para su uso como aditivo alimentario por
síntesis química. Tienen las ventajas tecnológicas de ser activos en medios poco
ácidos y de carecer prácticamente de sabor. Su principal inconveniente es que son
comparativamente caros y que se pierden en parte cuando el producto se somete
a ebullición. Son especialmente eficaces contra mohos y levaduras, y menos
contra las bacterias.

Los sorbatos se utilizan en bebidas refrescantes, en repostería, pastelería y

galletas, en derivados cárnicos, quesos, aceitunas en conserva, en postres lácteos
con frutas, en mantequilla, margarina, mermeladas y en otros productos. En la
industria de fabricación de vino encuentra aplicación como inhibidor de la
fermentación secundaria permitiendo reducir los niveles de sulfitos. Cada vez se
usan más en los alimentos los sorbatos en lugar de otros conservantes más
tóxicos como el ácido benzoico.

Los sorbatos son muy poxo tóxicos, menos incluso que la sal común o el
ácido acético (el componente activo del vinagre). Por esta razón su uso está
autorizado en todo el mundo. Metabólicamente se comporta en el organismo como
los demás ácidos grasos, es decir, se absorbe y se utiliza como una fuente de
energía.

El ácido benzoico es uno de los conservantes más empleados en todo el

mundo. Aunque el producto utilizado en la industria se obtiene por síntesis
química, el ácido benzoico se encuentra presente en forma natural en algunos
vegetales, como la canela o las ciruelas por ejemplo.

El ácido benzoico es especialmente eficaz en alimentos ácidos, y es un

conservante barato, útil contra levaduras, bacterias (menos) y mohos. Sus
principales inconvenientes son el que tiene un cierto sabor astringente poco
agradable y su toxicidad, que aunque relativamente baja, es mayor que la de otros
conservantes. En España se utiliza como conservante en bebidas refrescantes,
zumos para uso industrial, algunos productos lácteos, en repostería y galletas, en
algunas conservas vegetales, como el tomate o el pimiento envasados en grandes
recipientes para uso de colectividades, mermeladas, crustáceos frescos o
congelados, margarinas, salsas y otros productos.

La OMS considera como aceptable una ingestión de hasta 5 mg por Kg de

peso corporal al día. Con la actual legislación española esté límite se puede
superar, especialmente en el caso de los niños. Otras legislaciones europeas son
más restrictivas. En Francia solo se autoriza su uso en derivados de pescado,
mientras que en Italia y Portugal está prohibido su uso en refrescos. La tendencia
actual es no obstante a utilizarlo cada vez menos substituyéndolo por otros
conservantes de sabor neutro y menos tóxico, como los sorbatos. El ácido
benzoico no tiene efectos acumulativos, ni es mutagénico o carcinógeno.
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Para determinar la presencia de los conservantes mencionados

previamente utilizaremos la técnica de Cromatografía líquida de alta eficacia o
High performance liquid chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en
columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica.

El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una

mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las
sustancias analizadas y la columna cromatográfica, la muestra que se analizará en
el presente práctico es mermelada Wasil de ciruela, de la cual determinaremos la
presencia de estos componentes.
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Objetivos

• Determinación de dos compuestos que se utilizan como conservantes,

ácido sórbico y ácido benzoico mediante la técnica HPLC.

• Comparar los resultados obtenidos en la sesión práctica con las

concentraciones estipuladas en el reglamento sanitario.
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Materiales

• Detector HPLC.
• Matraz aforado de 100ml.
• Baño de agua a 60ºC/30min.
• Pesa analítica.
• Pipetas graduadas 10ml y 1ml.
• Papel Filtro whatman.
• Baso precipitado.
• 2 muestras de mermeladas Wasil de 250g (ciruela y Tuti Fruti).

Reactivos

• El reactivo Carrez I se prepara disolviendo 24 g de acetato de zinc

Zn(CH3COO)2*2H20 y 3 g de ácido acético glacial en 50 ml de agua (calidad
HPLC) y enrasado a 100 ml con agua (calidad HPLC).

• El reactivo Carrez II se prepara disolviendo 10.6 g ferrocianuro potásico

Fe(CN)6K4*3H20 en 50 ml de agua (calidad HPLC) y enrasado a 100 ml con
agua (calidad HPLC).
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Método

Preparación de las muestras:

Pesar 2.52 g de muestra homogeneizada, se traslada a un matraz aforado

de 50 ml, se adicionan 10 ml de agua y se calienta a 60ºC /30 min. Luego se
enfría y se sonica por 10 minutos, se enfría nuevamente y se agregan 5 ml de
Carrez 1 y 5 ml de Carrez 2, se agita y se enraza a 100 ml con agua, se deja
decantar, y se filtra la cantidad suficiente para realizar las determinaciones por
HPLC.

Determinación:

Condiciones de detección HPLC.

Columna LiChrospher 100 RP-18

Columna largo 119.00 mm
Diametro Interno 4.00 mm
Tamaño de muestra 20 ul
Flujo 1 ml/min
Fase movil 10% Metanol ; 90% 0.01 M KOH / HAc buffer pH 5.00
Detección 235 nm

Tiempo de retención

Tiempo de Retención (min)

Ácido benzoico 2.97
Ácido sórbico 4.47

Curva de calibración

Concentraciones [mg/l ]
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Ácido benzoico 0.1; 0.5; 1.0; 5.0; 10.0; 20.0

Ácido sórbico 0.1; 0.5; 1.0; 5.0; 10.0; 20.0

Los datos obtenidos para las muestras de mermelada fueron los siguientes:

MUESTRA 1:

Acido
Concentración tiempo Benzoico
0.1 11,18 408,966
0.5 11,183 707,088
1 11,213 550,255
5 10,967 708,138
5 11,177 749,736
10 11,227 583,128
20 11,187 540,076

MUESTRA 2:

Concentración tiempo Ácido Sorbico

0.1 5,373 43,797
0.5 4,867 446,673
1 5,037 1008,903
5 4,673 488,166
5 4,487 904,432
10 5,4 63,165
20 5,397 56,759
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Los datos obtenidos en la curva de calibración para el ácido benzoico son los
siguientes:

Acido Benzoico:

Concentración (mg/l) área(mV.s)

0,1 2,416
0,5 6,540
1 10,267
5 54,581
5 54,841
10 85,742
20 217,866

Gráfico 1:

Utilizando regresión lineal para la muestra de Ácido Benzoico:

Y= a + bx

Y = -0.93144 + 10.5474X

r^2 = 0.993522172

Reemplazando Area en Y
Y = -0.93144 + 10.5474X
 P á g i n a | 12

Area = Y a bX
408,966 0,931 10,547
707,088 0,931 10,547
550,255 0,931 10,547
708,138 0,931 10,547
749,736 0,931 10,547
583,128 0,931 10,547
540,076 0,931 10,547

Los Valores obtenidos despejando X son:

X= 38,86388926 mg/l
X= 67,12993647 mg/l
X= 52,26002086 mg/l
X= 67,22949085 mg/l
X= 71,17355077 mg/l
X= 55,37683133 mg/l
X= 51,2949123 mg/l

Sumando los valores de la presente tabla obtendremos la concentración final de

ácido benzoico presente en las muestras de mermeladas.

Xfinal = 403.3286318 mg/l

Para expresar el resultado en mg/g reemplazamos los valores en la siguiente

fórmula:

X * Vol (l) = 403.3286318 mg/l * 0.05 l = 7202.3 mg

g 0.0028 g g
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Ácido Sórbico:

Concentración (mg/l) área(mV.s)

0,1 25,463
1 4,708
5 47,447
10 229,508
20 473,347

Gráfico 2:

Usando regresión lineal para la muestra de Ácido Sórbico:

Y= a + bx

Y = -17.2578 + 24.0100X

r^2 = 0.984529031

Reemplazando Area en Y

Y = -17.2578 + 24.0100X
 P á g i n a | 14

Area = Y a bX
43,797 17,258 24,010
446,673 17,258 24,010
1008,903 17,258 24,010
488,166 17,258 24,010
904,432 17,258 24,010
63,165 17,258 24,010
56,759 17,258 24,010

Los Valores obtenidos despejando X

son:

X= 2,542890462 mg/l
X= 19,322399 mg/l
X= 42,73889213 mg/l
X= 21,05055394 mg/l
X= 38,38774677 mg/l
X= 3,349554352 mg/l
X= 3,082748855 mg/l

Xfinal = 130.4747855 mg/l

Para expresar el resultado en mg/g reemplazamos los valores en la siguiente

fórmula:

X * Vol (l) = 130.4747855 mg/l * 0.05 l = 2174.6 mg

g 0.003 g g
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Discusión Y Resultados

Según el Reglamento Sanitario de los alimentos, Artículo 154,- Se permite utilizar

como preservantes químicos sólo los que se indican en este artículo y en
concentraciones no mayores, en productos terminando, que las que se señalan en
forma específica para cada aditivo:
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La concentración de ácido Benzoico es 7202.3 mg/g y la de ácido Sórbico 2174.6

mg/g. Comparando nuestros resultados con los datos que indica el reglamento
sanitario de los alimentos las muestras analizadas sobrepasan las
concentraciones permitidas de ácido sórbico y benzoico, esto se puede deber a un
desempeño deficiente en nuestra actividad práctica, ya que el resultado del primer
ácido supera con creces a la cantidad permitida.
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Conclusión

Ácido sórbico y ácido benzoico son conservantes que impiden el crecimiento de la

mayoría de los microorganismos que atacan a los alimentos causando su
deterioro. El sórbico inhibe el crecimiento de mohos y levaduras y el benzoico se
emplea como antibacteriano y antifúngico. La presencia de ambos es habitual en
salsas, quesos,mermeladas, bebidas, embutidos y derivados del huevo, y su uso
se permite en salsas emulsionadas con una proporción de grasa superior al 60%,
en cantidades de hasta 1.000 ppm si utiliza sólo sórbico, de hasta 500 ppm si
contiene sólo benzoico y de hasta 1.000 ppm si se combinan ambos.

Para las salsas con menos del 60% de grasa, los máximos son de 2.000 ppm si
emplea sólo sórbico, de 1.000 ppm si tiene sólo benzoico y de 2.000 ppm si usa
los dos aditivos a la vez. En las salsas no emulsionadas y en la mostaza se
permiten hasta 1.000 ppm para la suma de benzoico y sórbico.

Según el RSA nuestras muestras de mermeladas no se encuentran dentro del

límite permitido, ya que se supera 1000 ppm de Ácido Benzoico y 2000 ppm en
Ácido Sórbico, por lo cual estas mermeladas no cumplirían con lo establecido en el
Reglamento Sanitario de los Alimentos.
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Bibliografía

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• Guía de Laboratorio, Análisis de Alimentos II, ITCL 244