Lab2 - Coello Fernández Solís

UNIVERSIDAD DE LAS
FUERZAS ARMADAS -
ESPE
LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR II
INTEGRANTES: NRC: 4858

Coello Bryan FECHA: 14-06-19
Fernández Eduardo
Solís Alejandra
OBJETIVO GENERAL
• Identificar la función de cada uno de los reactivos utilizados

en la preparación de los buffers para los geles en la
electroforesis.
INTRODUCCIÓN
PROTEÍNA
PROTEOMA
• Células animales y vegetales
• 50% del peso seco de la
célula.
• Dos tipos: estructural y
funcional
Característica
• Contenido total de proteínas en una célula. • Ligero cambio de pH,

temperatura o disolventes
Célula vegetal
 Proteínas solubles
 Poco contenido de proteínas
 Gran cantidad de fenoles, terpenos, pigmentos, ácidos
orgánicos, carbohidratos -> extraer proteínas
EXTRACCIÓN DE
PROTEÍNAS
LISIS CELULAR
Métodos Mecánicos
TÉCNICAS PRINCIPIO EJEMPLO

Homogeneizador Células son rotas Rompimiento
de cuchillos en un mezclador tejidos y células
animales
Homogeneizador Células pasa por un
alta presión pequeño orificio,
haciendo que se
rompan por
esfuerzo de corte
Ultrasonificación Células son Rompimiento de
quebradas en una células en pequeña
cavidad ultrasónica escala
Molinos de bolas Células son Células de plantas
trituradas con bolas
de acero o vidrio
Métodos No Mecánicos
TÉCNICAS PRINCIPIO CARACTERISTICAS
Tratamiento Enzimas que - Método suave Células de las plantas- celulosa

enzimático hidrolizan la - Costo de la enzima y peptidasas ->rompen capa de
membrana celular de lo hace difícil celulosa
microorganismos
Se colocan en
Shock Osmótico volúmenes de agua 2
veces mayor que el
volumen de la célula,
se hinchan y revientan
Solubilización Solubilización de los Detergente

lípido de la pared Aniónico: SDS
celular Catiónico: Bromuro de
Catiltrimetil Amonio
No-iónico: Triton X-100
Nitrógeno líquido
 Macerar la muestra con nitrógeno líquido en un

mortero de porcelana -> polvo fino
 Evitando que se formen cristales en el interior
de la célula que rompen la estructura celular e
inicie proceso de degradación
Soluciones Buffers- Tampones

Buffer fosfato salino
TRIS HCL (PBS)
• Mantiene pH estable.
• C4H12NO3Cl
• amortiguador que se Β-Mercaptoetanol
encargan de
mantener el pH en la • agente reductor de enlaces
solución disulfuro
ELECTROFORESIS
Separar moléculas por Transporte de

su peso molecular o partículas en un campo
tamaño eléctrico
Partícula cargada Proteínas son

negativamente migra compuestos anfóteros,
hacia el ánodo (+), se comportan como
cargas positivas migran ácidos o bases
hacia el electrodo dependiendo del
negativo (cátodo) medio en el que estén.
Electroforesis en gel de poliacrilamida PAGE
Poliacrilamida
Separación de proteínas,
a través de un gel ->corrida
ácidos nucleicos
Geles de agarosa
Proteínas se mezcla con SDS Rompe interacciones no
(dodecil sulfato de sodio) covalentes, se agrega con Reducir puentes de
mercaptoetanol disulfuro ->
desnaturalizar la proteína
-> cargándose
Colorante que permite observar de frente la corrida negativamente
-Resolución - Concentración Unidos -> fase de
Sistema discontinuos - Composición separación visible
-Empaquetamiento
- pH al trasluz
BUFFER DE CARGA
• Fundamento teórico
Los tampones de carga sirven para 4 propósitos:
Reducir complejos de proteínas.

Están
compuestos en
su mayoría
Disociación de proteínas para permitirles correr a
través del gel. Bromofenol
DTT
Aumentar la densidad de la muestra para que caiga Sacarosa
uniformemente en los pocillos del gel de
empaquetamiento.
SDS
Tris-Hcl
Adición de un tinte a la muestra.
BUFFER DE ELECTROFORESIS PH 8,3
Tiene una función Conduce la
amortiguadora electricidad.
Tris
base
Glicina
SDS
METODOLOGÍA PARA LA PREPARACIÓN DE LOS
REACTIVOS PARA EL GEL EN ELECTROFORESIS
Buffer de carga (10 mL; ph=6,8) Buffer de electroforesis (1 L; ph=8,8; 1x)
Tris – HCl 2,5 mL 0,5 M
SDS 4 mL 10% Tris – base 3,03 g
Glicina 14,4 g
Azul - bromofenol 0,5 mL 1%
Glicerol 2 mL SDS 1g
Agua destilada 1 mL
Stacking Gel Resolving Gel
1,25 M de Tris HCl 1,5 M de Tris base

25 mL 25 mL
pH=6,8 pH=8,8
pH=6,38 pH=9
4,93 g 4,54 g
SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE AZUL DE
COOMASSIE 1X
Azul de
Etanol coomassie
R-250
Ácido Agua
acético destilada
CÁLCULOS DE
SOLUCIÓN DE
TINCIÓN
Volumen total 250 mL
250*40%= 100 mL de etanol.

250*10%=25 mL ácido acético.
0,3125 g de azul de coomassie.
Y se ajustó con 125 mL de agua destilada.

Cálculos de
solución de
destinción
Volumen final= 250 mL
250*5% = 12,5 mL de etanol

250*7.5%=18,75 mL de ácido acético
Y se ajustó con 218,75 mL de agua destilada.

CONCLUSIONES
• Se identificó y se preparó cada uno de los reactivos

utilizados en la preparación de los buffers para los
geles en la electroforesis..

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INTEGRANTES: NRC: 4858

• Identificar la función de cada uno de los reactivos utilizados

• Contenido total de proteínas en una célula. • Ligero cambio de pH,

TÉCNICAS PRINCIPIO EJEMPLO

Tratamiento Enzimas que - Método suave Células de las plantas- celulosa

Solubilización Solubilización de los Detergente

 Macerar la muestra con nitrógeno líquido en un

Soluciones Buffers- Tampones

Separar moléculas por Transporte de

Partícula cargada Proteínas son

Los tampones de carga sirven para 4 propósitos:

Reducir complejos de proteínas.

Stacking Gel Resolving Gel

1,25 M de Tris HCl 1,5 M de Tris base

250*40%= 100 mL de etanol.

Y se ajustó con 125 mL de agua destilada.

250*5% = 12,5 mL de etanol

Y se ajustó con 218,75 mL de agua destilada.

• Se identificó y se preparó cada uno de los reactivos

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