Cromatografias Invertasa

Paso 5.
Cromatografía de intercambio aniónico
La DEAE-celulosa (Carl Schleicher y Schjill) (La dietilaminoetilcelulosa es una resina cargada

positivamente que se utiliza en la cromatografía de intercambio iónico, un tipo de cromatografía en
columna, para la separación y purificación de proteínas y ácidos nucleicos) se equilibró con un
tampón de fosfato de 0-025M, pH 6,8 (el tampón de partida). La suspensión se vertió en una
columna (1-7 cm x 35 cm.) Y se dejó sedimentar por gravedad. Se aplicó efluente de fosfato de calcio
(el contenido combinado de los tubos 152-196 de la columna de fosfato de calcio; ver Fig. La) a la
columna. La elución se realizó principalmente con el tampón de inicio y luego con un gradiente de
NaCl mediante la introducción de 0-4m-NaCl en el mismo tampón, a través de 500 ml. Cámara de
mezcla que contiene el tampón de partida. La velocidad de flujo se ajustó a 200-250 ml./hr. y 8ml.
Se recogieron fracciones. Cada segundo tubo se analizó para determinar el contenido de proteínas,
y cada tercer tubo para la actividad amilolítica. Se ensayaron las posibles actividades de
acompañamiento en el pico que contenía amilasa. El eluato correspondiente al pico con la mayor
parte de la actividad amilolítica se denominó "efluente de celulosa DEAE".
Un gradiente de la sal se utiliza para enjuagar las proteínas separadas. En las concentraciones poco
saladas, las proteínas que tienen pocos grupos cargados se enjuagan y en concentraciones más altas
de la sal, las proteínas con varios grupos cargados se enjuagan. Para incrementar la fuerza ionica
1.Se emplea generalmente un intercambiador de aniones para la retención de los solutos. Para ello,
el intercambiador se equilibra a un pH relativamente superior a los pI de los solutos a separar.
2. Una vez retenidos éstos, se comienza a eluir con un tampón de pH inferior al valor de sus pI.
Tanto el tampón de equilibrado, como la muestra y tampón de elución, han de tener una baja
fuerza iónica, para evitar interferencias en la elución.
3. Conforme va fluyendo el tampón de elución, se genera un gradiente de pH a lo largo de la

columna, debido a las capacidades amortiguadoras, tanto del tampón de elución como del
propio intercambiador.
4. avance del tampón de elución hace que la muestra depositada sobre la columna sufra una
disminución progresiva del pH.
5. Cuando el pH se aproxima al pI de un determinado soluto, su carga negativa disminuye.
6. Cuando el pH es menor o igual que el punto isoeléctrico, deja de tener carga negativa, y eluyen.
Paso 6: desalinización por filtración en gel
Efluente de celulosa DEAE (los contenidos combinados de los tubos 115-133 de la columna
DEAEcellulose; ver Fig. 1b) se aplicaron a una columna Sephadex G-25 (AB Pharmacia, Uppsala,
Suecia) (4 cm. X 35 cm.), Lavada previamente con agua. La elución se realizó con agua y 8 ml. Se
recogieron fracciones. El contenido de NaCl de las fracciones del efluente se determinó mediante
titulación con AgNO3, con K2CrO4 como indicador.
El gel de dextrano (polímero ramificado de glucosa, entrecruzado y formado en pequeñas bolitas)

se comercializa con el nombre de SEPHADEX. Existen distintos tipos, según el tamaño de poro,
proporcionando límites de exclusión comprendidos entre 1 y 200 000 daltons
Pequeño espacio del poro
Paso 7: cromatografía de intercambio catiónico
La celulosa CM (carboximetilcelulosa) (Cellex-CM; California Corp. para Biochemical Research, Los

Ángeles, California, EE. UU.) Se equilibró con tampón de citrato de fosfato 0-01MF, pH 4-2 (tampón
de inicio) y luego se vertió en una columna (1,7 cm). diam.) hasta la altura de 13cm. El efluente
desalado de la columna Sephadex (contenido de los tubos 27-41; ver Fig. Ic) se llevó al pH y la fuerza
iónica del tampón de partida ajustando el efluente con tampón de fosfato de citrato 0-4M, pH 4-2 (
compuesto de 0 4m-Na2HPO4 y 02m-ácido cítrico), y con 0 2M-ácido cítrico a pH 4-2. La solución se
aplicó a la columna de CM-celulosa y la elución se realizó con el tampón de inicio hasta que la
extinción del eluato comenzó a volver al valor de la línea de base. Cuando esto ocurrió, se inició un
gradiente con respecto a la concentración de tampón mediante la introducción de tampón citrato
de fosfato 0-4M, pH 4-2, a través de 300 ml. Cámara de mezcla que contiene el tampón de partida.
El caudal se ajustó a 100-120ml./hr. y 8ml. Se recogieron fracciones. Cada tubo se analizó para
determinar el contenido de proteínas y cada tercer tubo para determinar la actividad amilolítica. El
eluato correspondiente al pico con la mayor parte de la actividad de la amilasa (contenido de los
tubos 45-55; ver Fig. 1d) se desalificó en una columna de Sephadex G-25, como se describe en el
paso 6. El efluente desalado se designó como 'CM-celulosa efluente'.
La purificación lograda por estas operaciones se resume en la Tabla 1.
La solución de enzima pura finalmente se concentró aplicando el efluente de celulosa CM a una

pequeña columna (0-8 cm x 4 cm) de celulosa DEAE, equilibrada con tampón fosfato 0 025 M, pH 6-
8, y eluyendo la enzima con 0 4 m -NaCl en el mismo buffer. A continuación, el efluente se desaló
mediante cromatografía de exclusión en una columna Sephadex G-25 (1-7cm. x 20 cm.) y se
mantuvo como una solución en presencia de (NH4) 2SO4 (66% de saturación) o como un preparado
liofilizado.
El mismo procedimiento de purificación, a lo largo de los pasos 1-7, se repitió en presencia de

mercaptoetanol (1 mm). No se notaron diferencias de rendimiento o actividad entre las dos
preparaciones, pero las propiedades electroforéticas de la proteína se vieron ligeramente alteradas
(ver Fig. 3).
Caracterización de la enzima pura (efluente de celulosa CM)

Contenido de nitrógeno. El total de N se determinó mediante el procedimiento microKjeldahl. (En
esta técnica se digieren las proteínas y otros compuestos orgánicos de los alimentos en una mezcla
con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. El nitrógeno orgánico total se convierte en sulfato
de amonio mediante la digestión. La mezcla resultante se neutraliza con una base y se destila. El
destilado se recoge en una solución de ácido bórico. Los aniones de borato así formado se titulan
con HCL estandarizado para determinar el nitrógeno contenido en la muestra.)
Extinción específica. El%. Se determinó a 280mIA.
Analisis uliracentrifugado8e8.
Las mediciones de la velocidad de sedimentación se realizaron a los cinco 8 min. Intervalos en una
ultracentrífuga modelo SpincoE, equipada con sistema de placa de placa de fase, 12 mm. Celda,
operativa a 59780vrev./min. a 230ºC. El disolvente empleado fue una solución de 0-1 M-NaCl en
tampón de fosfato 0-Olm, pH 6-8. Se examinaron tres concentraciones diferentes de la enzima (0-
15, 0-3 y 0.6%). Las mediciones de la difusión se realizaron en la misma ultracentrífuga Spinco
modelo E con soluciones que contenían 0-6, 0-3 y 0-15g. de enzima / 100ml. del disolvente
empleado para las mediciones de sedimentación.
Electroforesis de papel 8 8.
Las muestras de amilasa se sometieron a electroforesis en papel Whatman 3MM en un tampón de

acetato de colidina 0-07m (8-9 ml de colidina, 3 ml de ácido acético y agua para completar el
volumen 11.), pH 6-9, con gradiente potencial de 11 v / cm. para 18hr. en 5B.
Electroforesis en gel de poliacrilamida.
Las muestras (30, 60 y 10Oeg.) Se sometieron a electroforesis de disco en geles de poliacrilamida

(Ornstein y Davis, 1961; Reisfeld, Lewis y Williams, 1962). Se usaron 0,35-a, acetato de f-alanina, pH
4-5 o 0-37 µg de glicina-tris, pH 8-9 como tampones y se llevó a cabo una electroforesis durante 90-
180 minutos. a aprox. 100v con una corriente de 3.5mA / tubo (7cm.x 0 5cm.). Los geles se tiñeron
luego con Amido Black LOB.
Punto Isoelectrisco.
El punto isoeléctrico se determinó a partir de las movilidades electroforéticas de la enzima en

función del pH. La electroforesis en papel se realizó en papel Whatman 3MM en un tampón de
acetato de colidina 0-07M, pH 5-2, 6-4, 6-9, 7-2 y 8-2, en un gradiente de potencial de 11 v / cm.
para 18hr. a las 5.
Análisis de aminoácidos.
Una muestra de 5 mg. La enzima liofilizada pura se hidrolizó en un tubo evacuado sellado con 0-5
ml. de 5-7N-HCI a 1100 durante 22 h. Los hidrolizados se analizaron según el método de Spackman,
Stein y Moore (1958) en un analizador de aminoácidos Beckman. El triptófano se determinó
espectrofotométricamente (Beaven & Holiday, 1952) y también por el 'procedimiento L' descrito
por Spies & Chambers (1949).
Grupo final análisis
Se realizó un examen de los extremos N y C mediante el método del 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno

(marca los grupos aminos en un medio alcalino reacciona con el alfa aminoácido generando un colo
amarillo) (Sanger, 1945; Levy, 1954) y mediante la hidrazinólisis (Akabori, Ohno & Narita, 1952; Niu
y Fraenkel-Conrat, 1955)
Determinación del grupo tiol 8.
Los grupos de tiol libres se determinaron mediante dos métodos de titulación espectrofotométrica
diferentes. El método de Boyer (1954), con p-cloromercuribenzoato (Estas sustancias tienen la
particularidad de reaccionar específicamente con grupos sulfhidrilos de las proteinas, aportados
por los grupos laterales correspondientes a los residuos de cisteína el primer lo hace formando
un complejo reversible (mercaptida)), según lo descrito por Benesch & Benesch (1962), se empleó
en la solución de enzima en 0 02 Mphosphate buffer, pH 6-8. El segundo método fue el de Ellman
(1959), con 5,5'-ditiobis- (ácido 2-nitrobenzoico), es decir, bis-3-carboxi-4-nitrofenil disulfuro, como
agente de valoración.
Efecto del pH sobre la actividad enzimática.
La actividad de la f3-amilasa se determinó en el rango pH3-9 utilizando un tampón de citrato de

fosfato 0-1 M para pH3-0-7-0 y un tampón de fosfato 0-1 M para pH7-0-9-0. Para estudiar el efecto
del pH sobre la estabilidad de la enzima, las muestras de la enzima se mantuvieron en solución a pH
3-9, a 370, durante diferentes momentos antes de la reacción enzimática.
Fig. 1. Procedimiento de purificación de soja, -amilasa mediante cromatografías en columna
sucesivas. (a) Cromatografía de 230ml. de extracto no difusible en tampón fosfato 0-004M, pH 6-8,
en una columna de fosfato de calcio (3-6 cm x 18 cm).
La elución se realizó sucesivamente con: A, 700ml. de tampón fosfato 0-004mr, pH 6-8; B, 800ml.
de 0-028 M-tampón fosfato, pH 6-8; C, 500ml. de tampón fosfato 0-06M, pH 6-8; D, 500ml. de 0-5
m de tampón fosfato, pH 6-8. La tasa de flujo fue de 300-500ml./hr. y 8ml. Se recogieron fracciones.
(b) Cromatografía de efluente de fosfato de calcio, el área sombreada del procedimiento (a), en una
columna de celulosa DEAE (1-7 cm x 35 cm.) equilibrada con tampón de fosfato O-025M, pH 6-8 (el
tampón de partida).
La elución se realizó primero con el tampón de inicio y luego con un gradiente de concentración de
NaCl (E) introduciendo 0-4 m-NaCl en el mismo tampón a través de 500 ml. matraz de mezcla que
contiene el tampón de partida. La velocidad de flujo fue 200-250ml./hr. y 8ml. Se recogieron
fracciones. (c) Desalinización del efluente de celulosa DEAE, el área sombreada de (b), en una
columna Sephadex G-25 (4 cm. x 35 cm.).
La elución se realizó con agua y 8 ml. Se recogieron fracciones. (d) Cromatografía del efluente
desalado, el área sombreada de (c), en una columna de celulosa CM (1-7 cm. x 13 cm.) equilibrada
con tampón de fosfato-citrato O-Ol, pH 4.2 (el tampón de partida). La elución se realizó primero con
el tampón de inicio y luego con un gradiente de concentración de tampón (F) introduciendo un
tampón de citrato de fosfato de 0-4 m, pH 4-2, a través de 300 ml. matraz de mezcla que contiene
el tampón de partida. La tasa de flujo fue de 100-120ml./hr. y 8ml. Se recogieron fracciones.

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Cromatografía de intercambio aniónico

La DEAE-celulosa (Carl Schleicher y Schjill) (La dietilaminoetilcelulosa es una resina cargada

3. Conforme va fluyendo el tampón de elución, se genera un gradiente de pH a lo largo de la

5. Cuando el pH se aproxima al pI de un determinado soluto, su carga negativa disminuye.

Paso 6: desalinización por filtración en gel

El gel de dextrano (polímero ramificado de glucosa, entrecruzado y formado en pequeñas bolitas)

Pequeño espacio del poro

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La celulosa CM (carboximetilcelulosa) (Cellex-CM; California Corp. para Biochemical Research, Los

La purificación lograda por estas operaciones se resume en la Tabla 1.

La solución de enzima pura finalmente se concentró aplicando el efluente de celulosa CM a una

El mismo procedimiento de purificación, a lo largo de los pasos 1-7, se repitió en presencia de

Caracterización de la enzima pura (efluente de celulosa CM)

Extinción específica. El%. Se determinó a 280mIA.

Las muestras de amilasa se sometieron a electroforesis en papel Whatman 3MM en un tampón de

Electroforesis en gel de poliacrilamida.

Las muestras (30, 60 y 10Oeg.) Se sometieron a electroforesis de disco en geles de poliacrilamida

El punto isoeléctrico se determinó a partir de las movilidades electroforéticas de la enzima en

Se realizó un examen de los extremos N y C mediante el método del 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno

Determinación del grupo tiol 8.

Efecto del pH sobre la actividad enzimática.

La actividad de la f3-amilasa se determinó en el rango pH3-9 utilizando un tampón de citrato de

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