Transformacion Bacteriana

Laboratorio de Genética Molecular
Preparación y transformación de bacterias competentes

utilizando el plasmidio pcDNA3.1-GAPDH
Profesora : Marcela Bravo

Alumna : Karen Esteves
Fecha : 05/11/2015
INTRODUCCIÓN
“La transformación es el proceso mediante el cual una bacteria toma ADN directamente del medio
extracelular. Si el ADN adquirido transporta un gen determinado, entonces la bacteria aceptora será
capaz de expresar esta nueva característica y por lo tanto se la denomina transformante”1
Esta transferencia de material genético sólo puede lograrse si la bacteria aceptora se encuentra en
un estado fisiológico particular, denominado “estado de competencia”,en el cual la célula presenta
modificaciones en su pared y membrana, que permiten la entrada del material genético desde el
exterior celular.
En el laboratorio se han normalizado técnicas que inducen el estado de competencia en bacterias

que no lo presentan de forma natural, como es el caso de Escherichia coli. Estas técnicas se basan
en diversos tratamientos químicos o físicos que producen poros en la pared celular. El tratamiento
químicos con cloruro de calcio (CaCl2), Los iones de cloruro de calcio neutralizan la repulsión entre
la carga negativa de las cabezas de los fosfolípidos y la carga negativa de los grupos fosfatos del
DNA, Las células competentes producidas por este método pueden ser almacenadas a -70 ºC..
“La electroporación, este método capitaliza la naturaleza débil de las interacciones hidrofóbicas e
hidrofílicas de la bicapa de fosfolípidos y la capacidad espontánea de la membrana de auto-sellarse
después de un disturbio”2. La célula recibe una corriente eléctrica que altera temporalmente la
estabilidad de ciertas áreas de la membrana plasmática, permitiendo que moléculas polares puedan
atravesar la membrana.
OBJETIVOS:
 Preparar células competentes
 Transformación células competentes con el plasmidio pcDNA3.1-GAPDH
MATERIALES
Reactivos
 CaCl275mM
 LB
 Glicerol
 18 Placas LB-Ampicilina
 Etanol
 Cloro (Clorinda)
 H2Odest.
 E.Coli top10
 Exp1: Ligando
 Control1: Plasmidio circular
 Control2: Vector Cortado + Ligasa
 Control3: Vector Cortado - Ligasa
Materiales
 Centrifuga
 Mechero
 Encendedor
 Tubos Falcon 50mL
 Baño termorregulador
 Pipeta Pasteur
 Termómetro
 Flotador para tubos eppendorf
 2 Vasos precipitados de 1L c/u.
 Micropipetas p0.5 p20 y p1000
 Puntas estériles para micropipetas
 Tubos Eppendorfde 0.5mL
 Hielo
 Cubeta de plumavit
MÉTODOS
Para la preparación de bacterias Top10 (Realizado por la Profesora)
1. Preparación del inoculo en 3mL de LB y dejar creciendo durante la noche.

2. Se adicionó Glicerol a -80C.
3. Se realizó una dilución 1/100 y crecer inoculo a 37C durante 2 horas.
4. Medir absorbancia a 600nm.
Para la bacterias Competentes
1. Se traspasó 50mL del inoculo a un tubo Falcon de 50mL en presencia del mechero
(ambiente estéril) y centrifugó por 10min a 2000rpm a 4C.
2. Se descartó el sobrenadante en un vaso precipitado de 1L. que contiene H2O destilada y
cloro.
3. Se resuspendió el pellet en 25mL de CaCl2 75mM con la ayuda de una micropipeta p1000 y
dejar en hielo en la cubeta de plumavit durante 20min.
4. Se retiró del hielo y centrifugar por 10 min a 2000rpm a 4C.
5. Se descartó el sobrenadante en el vaso precipitado de 1L. que contiene H2Odest y Cloro.
6. Se resuspendió el pellet en 1mL de CaCl2 75mM con la ayuda de una micropipeta p1000.
Para la transformación
1. Se preparó las mezclas de Bacterias competentes + Ligandos en tubos eppendorf de 0.5mL

según la siguiente tabla (4 tubos en total):
Tubos Bacterias Competentes Ligando

uL uL
Exp1 50 5
Control1 50 5
Control2 50 5
Control3 50 5
2. Se colocó los tubos en hielo durante 30min.
3. Adicionar agua semi-caliente (45C) del baño termorregulador a un vaso precipitado de 1L. y
regular la temperatura con agua fría a exactamente 42C. Utilizar termometro para confirmar
la temperatura.
4. Colocar los tubos en el flotador y ponerlos en el vaso precipitado con agua a 42C durante
50s.
5. Adicionar 450uL de Lb estérila cada tubo e incubar durante 45min en Estufa a 37C.
Plaquear
1. Tomar una pipeta Pasteur y colocarla en la llama del mechero con el fin de crear un
“rastrillo”.
2. Tomar 100uL de cada tubo y depositarlo en su respectiva placa, con la ayuda del “rastrillo”
repartir la gota por las placas (Cada vez que se cambia de placa esterilizar con la ayuda del
mechero).
3. Tomar 100uL de bacterias competentes y depositarlo en su respectiva placa, con la ayuda
del “rastrillo” repartir la gota por la placa.
4. Rotular las placas y colocarlas en la estufa y dejarlas crecer durante la noche.
RESULTADOS
Absorbancia
DO: 05
Placas
Bacteria Competentes
Placa con 100uL de bacterias competentes

(Sin transformar).
No se aprecian colonias.
Placa Experimental 1
Placa con 100uL de bacterias transformadas con el

ligando (Vector + Gen de interés)
Se aprecian incontables colonias.
Placa Control 1
Placa con 100uL de bacterias transformada
con plasmidio circular.
Se aprecian incontables colonias alrededor

del halo
Placa Control 2
Placa con 100uL de bacterias transformada

con plasmidio cortado + ligasa.
Se aprecian incontables colonias.
Placa Control 3
Placa con 100uL de bacterias transformadas con

plasmidio corta – ligasa.
Apreciación de incontables colonias.

DISCUCIÓN
El método de transformación mediante choque térmico de células competentes con cationes

divalentes es muy rutinario dada la facilidad de realización del mismo y la no necesidad de utilizar
aparatos sofisticados, a diferencia de la electroporación o la biobalística.
CUESTIONARIO:
1.-¿Qué son las colonias satélites y porque se producen?
Son colonias que presentan un retraso en el crecimiento y siempre aparecen alrededor de colonia
bien formada,además presentan un halo que no posea la bacteria transformante con el plásmido.
2.-¿Cual es el mecanismo que confiere resistencia a ampicilina?
Como todos los antibióticos betalactámicos, la ampicilina es capaz de penetrar bacterias gram
positivas, algunasgram negativas y aerobias. Interfiere con la síntesis de la pared celular durante
la replicación celular. Esto se debe a su efecto inhibidor de la síntesis de la pared celular de la
bacteria en sus últimas dos etapas (3 y 4), uniéndose a las PBP (proteínas fijadoras de penicilinas),
lo que lleva a la destrucción de la pared y la consiguiente lisis celular.6 La ampicilina inhibe la
formación de puentes en la capa de peptidoglicano (la que proporciona rigidez a la pared celular).
La mayor efectividad ocurre en la fase logarítmica de crecimiento, cuando se están formando los
puentes de péptidoglicano, y tiene menor efecto en células en la fase estacionaria de crecimiento
Betalactamasas: enzimas que se caracterizan por hidrolizar el enlace amida del núcleo
betalactámico, inactivando de esta manera el antibiótico
Uno de los principales mecanismos de resistencia hacia beta-lactámicos es la hidrólisis enzimática,

que es debida a la presencia de enzimas llamadas “beta-lactamasas” que se caracterizan por
hidrolizar el enlace amida del núcleo beta-lactámico, inactivando de esta manera el antibiótico antes
de que genere cualquier efecto.
4.-Describa la diferencia entre pared celular bacteriana y membrana plasmática
Pared Celular
Mantiene la forma de la bacteria y protege de la lisis osmótica
 Su capa es más externa

 Rigida
 Compuesta por pepditoglucano o mureína
Membrana Plasmática
Sintetiza la pared celular ,posee actividad respiratoria.
De naturaleza lipoproteica
ATPasa
5.-Busque otro métodos para hacer competentes las bacterias
• El método de electroporación fue desarrollado originalmente para transformar células

eucariotas.
• Desde el 1988 se esta utilizando para transformar E. coli y otras bacterias.
• Este método capitaliza la naturaleza débil de las interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas de

la bicapa de fosfolípidos y la capacidad espontánea de la membrana de auto-sellarse
después de un disturbio.
• La célula recibe una corriente eléctrica que altera temporalmente la estabilidad de ciertas
áreas de la membrana plasmática, permitiendo que moléculas polares puedan atravesar la
membrana.
• La electroporación produce una transformación más eficiente que los métodos químicos.
• La eficiencia de este procedimiento depende de la fuerza del campo eléctrico, el largo del
pulso eléctrico y la concentración del DNA.
BIBLIOGRAFIA
1. Depix, María soledad. Fundamentos Y Aplicaciones De Técnicas De Biología Molecular En El

Laboratorio. Primera edición. Santiago: Universidad Santo Tomás, 2012.
2. Dora Fonseca Mendoza, Heidi Mateus Arbelaez, Nora Contreras Bravo. Practicas de Laboratorio de
Biologia Molecular: Su Aplicación en Genética Básica. Bogotá: Universidad del Rosario, 2010.
3. Germán Giraldo Giraldo, Nelsy Loango Chamorro,Clara Mejía Dorial. Labratorio de Bioquímica: Una
Visión Práctica. Colombia: Universidad Quindio, 2010.
4. Mora, Silvia Quesada. Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica. Costa Rica:
Universidad Estatal a distancia, 2007.

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Preparación y transformación de bacterias competentes

Profesora : Marcela Bravo

En el laboratorio se han normalizado técnicas que inducen el estado de competencia en bacterias

 Preparar células competentes

 Transformación células competentes con el plasmidio pcDNA3.1-GAPDH

Para la preparación de bacterias Top10 (Realizado por la Profesora)

1. Preparación del inoculo en 3mL de LB y dejar creciendo durante la noche.

Para la bacterias Competentes

1. Se preparó las mezclas de Bacterias competentes + Ligandos en tubos eppendorf de 0.5mL

Tubos Bacterias Competentes Ligando

Placa con 100uL de bacterias competentes

Placa con 100uL de bacterias transformadas con el

Se aprecian incontables colonias.

Se aprecian incontables colonias alrededor

Placa con 100uL de bacterias transformada

Placa con 100uL de bacterias transformadas con

Apreciación de incontables colonias.

El método de transformación mediante choque térmico de células competentes con cationes

1.-¿Qué son las colonias satélites y porque se producen?

2.-¿Cual es el mecanismo que confiere resistencia a ampicilina?

Uno de los principales mecanismos de resistencia hacia beta-lactámicos es la hidrólisis enzimática,

4.-Describa la diferencia entre pared celular bacteriana y membrana plasmática

Mantiene la forma de la bacteria y protege de la lisis osmótica

 Su capa es más externa

Sintetiza la pared celular ,posee actividad respiratoria.

• El método de electroporación fue desarrollado originalmente para transformar células

• Desde el 1988 se esta utilizando para transformar E. coli y otras bacterias.

• Este método capitaliza la naturaleza débil de las interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas de

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