DETERMINACIÓN DE CREATININA EN ORINA -

MÉTODO DE DETECCIÓN ULTRAVIOLETA EN

MODO ISOCRÁTICO /
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

MTA / MB – 027/A08
Organismos participantes en el Programa Nacional de Normalización de Métodos
de Toma de Muestra y Análisis:

- Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo

Centro Nacional de Condiciones de Trabajo - Barcelona

Centro Nacional de Medios de Protección - Sevilla

Centro Nacional de Nuevas Tecnologías - Madrid

Centro Nacional de Verificación de Maquinaria - Vizcaya

Coordinación:

Centro Nacional de Verificación de Maquinaria - Vizcaya

Edita:

Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo

C/ Torrelaguna, 73 - 28027 MADRID

NIPO: 792-09-014-2
 MÉTODOS DE
TOMA DE MUESTRAS Y MTA / MB - 027/A08
ANÁLISIS

DETERMINACIÓN DE CREATININA EN 0RINA - MÉTODO DE DETECCIÓN

ULTRAVIOLETA EN MODO ISOCRÁTICO / CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
RESOLUCIÓN

Palabras clave: creatinina, orina, cromatografía líquida con detector ultravioleta-visible

1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN 2. FUNDAMENTO DEL MÉTODO

Este método especifica el procedimiento a seguir y Las muestras de orina se centrifugan y se diluyen
el equipo necesario para la determinación de creatini- 100 veces con una disolución tamponada a pH 3,2. El
na en orina mediante cromatografía líquida de alta análisis se lleva a cabo por cromatografía líquida de
resolución con detección ultravioleta-visible (HPLC- alta resolución de fase reversa con detección ultravio-
UV) en el intervalo de concentración de 0,1 g/l orina a leta a 236 nm.
4,0 g/l orina (9.1.).

El método es aplicable a la determinación de creati- 3. REACTIVOS Y DISOLUCIONES

nina en orina. Este parámetro es utilizado frecuente-
mente para corregir los valores de concentración de los 3.1. Agua ultra pura, calidad 1 de acuerdo con la norma
contaminantes o de sus metabolitos que se excretan en ISO 3696 (9.6.).
orina intentando paliar los fenómenos de dilución o satu-
ración excesivas que pueden ocasionarse en muestras
3.2. Ácido acético, 99-100% para análisis. No CAS
puntuales en la práctica del Control Biológico.
64-19-7.

NOTA: La creatinina es un producto final endógeno del NOTA: SUSTANCIA CORROSIVA. Frases (R) 10-35.
metabolismo humano. Su paso o aclaramiento desde la Frases (S) (1/2-)23-26-45. Real Decreto 363/1995 (9.5).
sangre al túbulo renal se realiza por filtración glomerular,
no se reabsorbe por los túbulos renales y es teórica-
mente proporcional a su concentración en sangre.
3.3. Ácido ortofosfórico No CAS 7664-38-2.
Puesto que la excreción de creatinina permanece relati-
vamente constante para cada sujeto, mientras que el NOTA: SUSTANCIA CORROSIVA. Frases (R) 34.
volumen de excreción urinario puede variar apreciable- Frases (S) (1/2-) 26-45. Real Decreto 363/1995 (9.5).
mente, se utiliza el nivel de creatinina en la orina como
índice al que referir los valores de sustancias y/o sus 3.4. Acetonitrilo, grado HPLC. No CAS 75-05-8.
metabolitos que se eliminan de igual forma a través de
la filtración y no se reabsorben. NOTA: SUSTANCIA TÓXICA E INFLAMABLE. Frases (R):
11, 23-24-25. Frases (S): (1/2-)16-27-45. Real Decreto
Los valores de concentración de los contaminantes o 363/1995 (9.5.).
sus metabolitos se refieren al valor de la creatinina
excretada en la misma muestra de orina, siempre que su 3.5. Sal sódica del ácido 1-octanosulfónico
mecanismo de eliminación urinario sea el que sigue la
creatinina. Para la práctica de esta corrección se recha- 3.6. Creatinina Clinical Standard, Material de referen-
zan orinas cuyo valor de creatinina sea inferior a 0,5 g/l cia certificado NIST.
(4,42 mmol/l) o superior a 3,5 g/l (26,5 mmol/l) (9.2.).
3.7. Disolución patrón de creatinina en agua (1 g/l).
Se considera como interferencia cualquier compues- Se pesan 10 mg de creatinina y se enrasa a 10 ml con
to orgánico que presente el mismo o próximo tiempo de agua en matraz aforado. Se filtra. Esta disolución tendrá
retención cromatográfico en las condiciones de opera- un valor de 1g/l (8,84 mmol/l). Se trasvasa a viales de
ción descritas en este método. 1,5 ml y se guardan en el congelador hasta su uso.

1
Creatinina en aire MTA / MB - 027/A08

3.8. Disolución tampón, de pH 3,2. Se pesan 2,16 g de 6.1.2. Se introducen 10 µ l de orina centrifugada en via-
sal sódica del ácido 1-octanosulfónico y se disuelve en les para inyector automático, se pesa, se añade 990 µ l
1l de agua para obtener una concentración de 10 mmol/l. de la disolución de fase móvil (3.9.) y se pesa el vial de
El pH se ajusta a 3,2 con ácido ortofosfórico. nuevo.

3.9. Disolución de fase móvil (fm). Se prepara mez- 6.1.3. Se encapsula el vial y se determina la concentra-
clando la disolución tampón pH 3,2 preparada como se ción de creatinina mediante HPLC-UV.
indicó en apartado 3.8. con acetonitrilo en la propor-
ción 95:5.
6.2. Preparación de patrones y curva de calibrado

4. APARATOS Y MATERIAL 6.2.1. Preparación de patrones. Se preparan los

patrones de la recta de calibración a partir de la disolu-
4.1. Frascos de polietileno para el muestreo de orina. ción patrón de creatinina en agua de 1 g/l preparada
según el apartado 3.7, tomando 1; 5; 10; 20 y 40 micro-
4.2. Jeringas Hamilton de10 µ l y 100 µ l. litros de dicha disolución y completando el volumen
hasta 1 ml con la disolución de fase móvil. Los patro-
4.3. Matraces aforados de 10 ml y 1000 ml. nes así preparados corresponden a 1; 5; 10; 20 y 40
mg/l de fase móvil, que son finalmente equivalentes a
4.4. Filtro de 0,45 µ m para filtrar agua y orina. 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 y 4,0 gramos de creatinina por litro de
orina.

NOTA: Todas las disoluciones se preparan llevando a

4.5. Viales de 2 ml para inyector automático y sus tapo-

cabo un control gravimétrico (con balanza de precisión)

nes con septum.

de las mediciones volumétricas. Este control gravimétri-

co mejora la calibración y por ende la calidad de los
4.6. Densímetro para medir la densidad de la orina.

resultados analíticos. Alternativamente las disoluciones

pueden ser preparadas utilizando únicamente microje-
4.7. Pipeta automática de 1-10 ml.

4.8. Micropipeta electrónica 100 - 1000 µ l. ringas y material volumétrico calibrado.

4.9. Agitador ultrasónico 6.2.2. Curva de calibración. Se representa la altura

absoluta de pico obtenida en el análisis de los patrones
4.10. Balanza capaz de pesar 0,01 mg. de calibración frente a sus respectivas concentraciones,
obteniéndose así la curva de calibración.
4.11. Agitador mezclador Mixer 820 de Swelab
Instrument o similar. 6.3. Condiciones cromatográficas

4.12. Columna cromatográfica con precolumna, Para el desarrollo del método se ha utilizado un sis-
Agilent Zorbax SB-Aq 4,6x150 mm 3,5 micras o similar. tema cromatográfico HPLC Agilent serie 1100 con detec-
tor ultravioleta y estación de tratamiento de datos.
4.13. Sistema cromatográfico formado por cromató-
grafo líquido con detector ultravioleta (HPLC-UV) y sis- Las condiciones cromatográficas utilizadas para la
tema de tratamiento de datos. determinación de la creatinina en orina son:

Columna cromatográfica: Agilent Zorbax SB-Aq

5. TOMA DE MUESTRA 4,6x150 mm 3,5 micras

Las muestras de orina se recogen en frascos de Temperatura: 22 oC

polietileno y se mantienen a 4 oC hasta el momento de
su análisis, que debe tener lugar durante las dos sema- Fase móvil: disolución tampón 3,2:
nas siguientes a la toma de muestra (véase tabla 2 del acetonitrilo (95:5)
anexo)
Longitud de onda: 236 nm

10 µ l
6. PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS
Volumen de inyección:
6.1. Preparación de la muestra
Flujo: 1 ml / min
6.1.1. La muestra de orina se lleva a temperatura
ambiente agitándola en un sistema mezclador (4.11.) Tiempo de retención: 11,3 min
durante 30 minutos y posteriormente se centrifuga a 800
r.p.m. durante 5 minutos. Tiempo de análisis: 13 min

2
Creatinina en aire MTA / MB - 027/A08

7. CÁLCULOS niveles de concentración resultó ser aproximadamente

del 100%. El sesgo estimado para el método en base a
7.1. La concentración de creatinina expresada en miligra- este ensayo de recuperación es inferior al 2%.
mos por litro de fase móvil se determina por interpolación
de la altura de pico absoluta del compuesto, obtenida en 8.5. La incertidumbre expandida (k=2) del método esti-
el análisis de las muestras, en la curva de calibrado. mada a partir del ensayo de adiciones conocidas de cre-
atinina a una orina real, teniendo en cuenta también la
7.2. Los resultados pueden expresarse en gramos de cre- incertidumbre que proviene de la cantidad pesada en la
atinina por litro de orina mediante la siguiente expresión: balanza utilizada para el control gravimétrico de mues-

C creatinina (g/l ) = c creatinina (mg/l fm) x 100(FD) x 10 - 3 (g/mg)

tras y patrones, es del 6%.

8.6. En el anexo del método y junto con los detalles de

siendo: la validación efectuada en el laboratorio se recogen los
valores de sesgo, precisión e incertidumbre calculados a
C creatinina (g/l )
partir de los resultados obtenidos en la participación
es la concentración de creatinina en
durante los últimos años (10 muestras) en un programa
gramos por litro de orina
interlaboratorios de control de calidad para la determina-
c creatinina (mg/l fm)
ción de creatinina en orina. Los valores, como cabría
es la concentración de creatinina en
esperar resultan ser ligeramente más altos que los
miligramos por litro de fase móvil (fm)
encontrados a partir de las pruebas intralaboratorio
(véase tabla 3 del anexo).
100(FD) es el factor de dilución (la creatinina
contenida en la orina se diluye
100 veces en la fase móvil)
9. BIBLIOGRAFÍA
7.3. Los resultados pueden expresarse en milimoles de cre-
9.1. Tsikas, D., Wolf, A., Frölich, J.C. Simplified HPLC
atinina por litro de orina mediante la siguiente expresión:
C creatinina (g/l ) x 1000 (mmol/mol)
Method for Urinary and Circulating Creatinine, Clin.

C creatinina (mmol/l ) =
Chem. 50 (1) 201-203, 2004.
113,2 (g/mol)
9.2. Alessio, L., et al. Reliability of urinary creatini-
siendo: ne as a parameter used to adjust values of urinary

C creatinina (mmol/l )
biological indicators, Int Arch Occup Environ Health
es la concentración de creatinina en 55 99-106, 1985.
milimoles por litro de orina

C creatinina (g/l )
9.3. J.C. Miller, J.N. Millar. Estadística para química
es la concentración de creatinina en analítica. Addison-Wesley, Iberoamericana, Wilmington.
gramos por litro de orina 100-103 (1993).

113,2 (g/mol) es el peso molecular de la creatinina 9.4. Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el
Trabajo. Protocolo de validación para determinacio-
nes en muestras biológicas de interés en Higiene
8. PRECISIÓN Industrial. MTA/PV-IV(2)/98.

8.1. El intervalo de trabajo se encuentra comprendido 9.5. Real Decreto 363/1995 de 10 de marzo (BOE.
entre las concentraciones 0,1- 4,0 g/l orina equivalente 5.6.95). Reglamento sobre notificación de sustancias
a 0,88 - 35,34 mmol/l orina. nuevas y clasificación, envasado y etiquetado de
sustancias peligrosas. Modificado el Anexo 1 por la
8.2. El límite de detección para la creatinina en orina, cal- Orden de 13.9.95 (BOE 19.9.95).
culado utilizando una curva de calibración construida con
patrones de baja concentración en el intervalo 0,013- 9.6. ISO 3696:1987, Water for laboratory use -
0,284 g/l orina equivalente a 0,11-2,5 mmol/l orina según Specifications and test methods.
el criterio expuesto en la referencia bibliográfica 9.7. es
de 0,005 g/l orina, equivalente a 0,05 mmol/l de orina. 9.7. CURRIE, L. A., Nomenclature in evaluation of
analytical methods including detection and quanti-
fication capabilities (IUPAC Recommendations
8.3. La precisión del método estimada en términos de
1995), Pure & Appl. Chem., 6, 10, 1995, pp 1699-1723.
desviación estándar relativa resultó estar en torno al 2%
en el intervalo ensayado (véase tabla 1 del anexo).

8.4. La recuperación media encontrada en un ensayo

(véase tabla 1 del anexo) en el que se adicionaron can-
tidades conocidas de creatinina a una orina real, a tres

3
Creatinina en aire MTA / MB - 027/A08

ANEXO

Validación del método

En este anexo se recogen los datos obtenidos durante el proceso de validación del método para la determinación de cre-
atinina en orina, siguiendo los criterios indicados en el “Protocolo de validación para determinaciones en muestras bio-
lógicas de interés en Higiene Industrial” (9.5.).

Para el estudio de precisión y recuperación e incertidumbre se han efectuado adiciones de cantidades conocidas de cre-
atinina sobre una orina real de bajo contenido en creatinina para conseguir tres niveles de concentración que cubren
prácticamente todo el intervalo de trabajo (véase tabla 1).

El ensayo de estabilidad y conservación se ha realizado con dos muestras de orina real a dos niveles diferentes de con-
centración, una orina con concentración alta de creatinina 1,30 g/l orina (11,48 mmol creatinina/l orina) y otra con con-
centración baja 0,58 g/l orina (5,09 mmol creatinina/l orina) (véase tabla 2).

La tabla 3 muestra los resultados obtenidos durante dos años en la participación en el Programa Interlaboratorios de
Control de Calidad para el análisis de creatinina en orina del Instituto FIOH de Finlandia. A partir de dichos resultados se
han calculado los valores de precisión, sesgo e incertidumbre para el método y que se recogen junto a la tabla 3. Estos
valores, como cabría esperar, resultan ser más altos que los calculados en las prueba intralaboratorio.

Tabla 1

Estudio Intralaboratorio

DER
Adición de Concentración Concentración REC
Nº (Desviación Sesgo
Muestra creatinina esperada encontrada Recuperación
Réplicas éstandar relativa) %
g/l orina g/l orina g/l orina %
%

Orina - - 0,45 6 3,38

Nive l 0,50 0,92 0,93 6 1,94 100,26 0,26
Nive lI 1,00 1,40 1,42 6 0,70 101,34 1,34
Nive lII 1,51 1,88 1,87 6 0,68 99,33 0,67

DER Promedio = Σ (DER i ) 2 = 2,01% ; Sesgo

Promedio = Σ (RECi ) 2 = 0,88 %
4 3

u Combinada = u 2 Variabilidad + u 2 Sesgo

u Variabilidad = DER Promedio = Σ (DER i ) 2 = 2,01%

4

u sesgo = Sesgo 2 Promedio + u 2 Adición = 2,29%

donde:

u Adición = u 2 balanza + u 2 variabilidad – pesadas + u 2 pureza = 2,11%

4
Creatinina en aire MTA / MB - 027/A08

u Combinada = u 2 Variabilidad + u 2 Sesgo = 3,04 %

UExpandida = k .u Combinada = 6 % (k = 2)

Nota: Para el cálculo de la incertidumbre se han tenido en cuenta, además de las componentes de sesgo y precisión,
las correspondientes a la balanza (existe un control gravimétrico de las medidas volumétricas) y de la pureza del mate-
rial de referencia utilizado, habiéndose considerado, por el contrario, despreciables las componentes relacionadas con
el almacenamiento de las muestras, la calibración y la deriva del cromatógrafo.

Tabla 2

Estudio de estabilidad y conservación de las muestras

DER
Tiempo del análisis Concentración
Nº de (Desviación Diferencia
Muestra Temperatura de creatinina
réplicas estándar relativa) %
almacenamiento g/l
%

M-1 Inmediato 0,58 6 1,8 -

M-2 Inmediato 1,30 6 2,0 -
M-1 3 días 0,58 6 0,4 -
a
M-2 T ambiente 1,24 6 2,6 + 0,4
M-1 3 días 0,58 6 0,4 -
o
M-2 4 C 1,28 6 0,4 - 1,6
M-1 3 días 0,59 6 0,6 + 1,7
M-2 - 20 oC 1,30 6 0,8 - 0,2
M-1 15 días 0,58 6 1,8 -
o
M-2 4 C 1,25 6 1,0 + 4,1
M-1 15 días 0,59 6 1,1 + 1,7
o
M-2 - 20 C 1,27 6 0,5 - 2,2

M-1 y M-2 son las muestras de orina seleccionadas correspondientes a dos niveles considerados alto
bajo, en cuanto a su concentración de creatinina.

Diferencia es la diferencia en porcentaje entre la concentración media obtenida en las muestras

analizadas al cabo de t días y las analizadas de forma inmediata tras la toma de muestra.

5
Creatinina en aire MTA / MB - 027/A08

Tabla 3

Resultados obtenidos en la participación de un PICC

Valor Valor de DER

Valor
Referencia Obtenido Referencia Interlaboratorio Nº Sesgo
Normalizado
Muestra ( V O) ( V R) laboratorios {1-V N }
% V N = ( V O/ V R)
mmol/l mmol/l

crea-0503 8,3 7,7 8,5 21 1,08 0,08

crea-0504 11,4 10,9 7,8 21 1,05 0,05
crea-0505 11,4 11,4 14,0 18 1,00 0,00
crea-0506 17,9 16,7 10,0 18 1,07 0,07
crea-0601 8,2 8,0 7,1 19 1,02 0,02
crea-0602 13,5 13,2 8,6 19 1,02 0,02
crea-0603 9,8 10,0 9,6 18 0,98 0,02
crea-0604 8,0 8,0 9,3 18 1,00 0,00
crea-0605 6,3 6,3 5,5 17 1,00 0,00
crea-0606 16,5 16,0 6,2 17 1,03 0,03

u Combinada = u 2 Var + u 2 Sesgo

u Var = DERVN = 3,15

u sesgo = Sesgo 2 Promedio + u 2 Ref = 4,49

donde:

Sesgo Σ (Sesgoi ) 2
Promedio =
10
= 3,98 %

SR
URef =
8,95
N Lab
= = 2,07
18,6

SR = Σ (DER Interlaboratorios) 2 = 8,95 %

10

u Combinada = u 2 Var + u 2 Sesgo = 5,48 %

UExpandida = k u Combinada = 11% (k = 2)

6
Creatinina en aire MTA / MB - 027/A08

Figura 1

Cromatograma de creatinina en orina en las condiciones indicadas en este método

DAD1 A, Sig=236,4 Ref=360,100 (140606 \CR86C.D)

mAU 2.706

17.5

15

12.5

10 7.274

7.5
creatinina
5 3.782
11.018
1.302 2.156
2.5

0 2 4 6 8 10 12 min