MANUALMICROBIOLOGÍA

UNIVERSIDAD DEL QUINDÍO 1
FACULTAD DE CIENCIAS AGROINDUSTRIALES

PROGRAMA ACADEMICO INGENIERIA DE ALIMENTOS
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
NORMAS DE COMPORTAMIENTO EN EL LABORATORIO 2-3
GUÍA PRÁCTICA No. 1 INSTRUMENTACIÓN 4-6
GUÍA PRÁCTICA No. 2 COLORACIÓN DE GRAM 7-8
ANEXO COLORACIONES 9-45
GUÍA PRÁCTICA No. 3 MEDIOS DE CULTIVO 46-55
GUÍA PRÁCTICA No. 4 MÉTODOS PARA EL CULTIVO Y AISLAMIENTO DE 56-59

BACTERIAS AEROBIAS
GUÍA PRÁCTICA No. 5 RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA 60-68
GUÍA PRÁCTICA No. 6 TÉCNICA DE LOS TUBOS MÚLTIPLES DE

FERMENTACIÓN - PRUEBA NORMALIZADA 69-76
GUÍA PRÁCTICA No. 7 ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO PARA AISLAR Y

DETERMINAR CEPAS BACTERIANAS GRAM-NEGATIVAS 77-79
GUÍA PRÁCTICA No. 8 MICROCULTIVO DE HONGOS 80-84
GUÍA PRÁCTICA No. 9 OBSERVACIÓN DE PROTOZOARIOS Y

MICROORGANISMOS 85-99
GUIA PRACTICA No. 10 GENETICA BACTERIANA 100-101
BIBLIOGRAFIA 102
María Inés Gallego Murillo: Magíster en Microbiología, Especialista En Salud Ocupacional e Higiene del trabajo,
Bioquímica, Diplomados en Inducción Universitaria y Modelos Pedagógicos.
Profesora: María Inés Gallego Murillo
_________________________________________________________________________
“Nunca entregue un trabajo, donde no lleve puesto el corazón”
NORMAS DE COMPORTAMIENTO EN EL LABORATORIO
La causa principal de la mayor parte de los accidentes que ocurren en el laboratorio es sin duda el
miedo del experimentador ante la falta de conocimiento de lo que va a realizar durante la actividad,
razón por la cual no está en capacidad de prever lo que pueda ocurrir en un momento determinado.
En consecuencia, lo primero que debe hacerse para evitar los accidentes en el laboratorio es adquirir
un conocimiento, lo más ampliamente posible, de los pasos a seguir en el proceso experimental,
observar cuidadosamente todas y cada una de las normas de seguridad relacionadas en el texto y las
orientadas por el profesor o el responsable del laboratorio durante la actividad, y no desarrollar
experimentos que nada tengan que ver con los ensayos relacionados con la clase.
A continuación enumeramos las principales normas de seguridad que deben tenerse en cuenta en el
laboratorio.
1. Debes aprender dónde está ubicado y cómo se usa todo el equipo de seguridad: equipo de
primera ayuda, extintor, campana de seguridad, lavados para los ojos, todas las salidas del
laboratorio, etcétera.
1. Lee todas las instrucciones para realizar una actividad antes de comenzar a trabajar y presta
especial atención a las notas que indican precaución. Éstas indican riesgos potenciales.
2. Mantén siempre limpia el área de trabajo en el laboratorio; aleja todos los objetos innecesarios.
3. Usa siempre la blusa de laboratorio, para que protejas tu ropa cuando estés trabajando.
Recógete siempre el pelo, si lo tienes largo.
4. Utiliza permanentemente los anteojos de seguridad; en caso contrario ten el cuidado de no

acercar la cara a ningún recipiente en el que esté efectuándose algún tipo de reacción química.
5. Nunca dirijas hacia ti o hacia tus compañeros la boca del recipiente en el que se efectúa alguna
reacción química.
6. Antes de utilizar un reactivo verifica que es el correcto. Mira la etiqueta, si la tiene, o consulta
al profesor o al responsable del laboratorio. Rotula siempre el contenido de los envases en que
deposité materiales.
7. No realices nunca ningún experimento diferente del experimento regular autorizado. Utiliza la
sustancia que especifica la actividad. Nunca retornes las sustancias empleadas al envase
original. Esto evitará la contaminación. Usa sólo las sustancias indicadas por el responsable de
la actividad.
8. No mires directamente en el interior de los recipientes en los que se realice cualquier cambio
químico o físico.
9. Nunca pruebes ningún reactivo sólido o líquido, excepto si ha sido autorizado por el profesor.
Lávate las manos antes y después de desarrollar cualquier actividad.
10. Cuando sea necesario testificar el olor de una sustancia por medio de un vapor, hazlo llevando
siempre el vapor a la nariz por medio de la mano. Nunca lo inhales directamente del tubo de
ensayo.
11. En ningún caso cojas con la mano los tubos de vidrio cuando éstos han sido calentados por
largo rato. Espera un tiempo prudencial.
12. Siempre que trabajes en la producción de vapores, hazlo en las vitrinas extractoras de gases.
13. No calientes frascos herméticamente cerrados, ni aún estando vacíos. Éstos pueden explotar.
Barre con una escoba los cristales y vidrios rotos. Recoge los pedazos pequeños con una toalla
de papel húmeda y échalos en los envases apropiados.
14. Nunca comas ni bebas ni fumes dentro del laboratorio.
15. No abandones el laboratorio si no ha concluido cualquier reacción o actividad que requiera

atención constante.
16. Toda solución ácida o básica debe colocarse en el vertedero acompañado siempre de mucha
agua para su dilución completa. Nunca eches agua en el ácido.
17. Todo sólido insoluble debe echarse en la caneca de la basura.

18. Cualquier accidente, por pequeño que sea, debe ser reportado de inmediato al profesor o al
responsable del laboratorio.
19. La seguridad en el laboratorio es tu responsabilidad. Por tanto, tienes la obligación de hacer uso
de todos los medios de seguridad suministrados.
20. Todo alumno debe observar las normas de seguridad y responsabilidad que requiere la
ejecución de una práctica. En el laboratorio no se corre, no se juega, ni se bromea.
21. Al extraer líquidos con la pipeta hazlo con la pera de caucho, en caso contrario succiona el
líquido después de verificar que el extremo opuesto esté totalmente sumergido en él. Recoge de
inmediato cualquier sustancia química que se te haya derramado, e informa al responsable del
laboratorio al respecto.
22. Cuando tengas que practicar una disección nunca cortes en dirección hacia tu cuerpo ni cuando
tengas el espécimen en tus manos. Coloca siempre el espécimen en una bandeja de disección.
23. Cuando utilice el microscopio nunca suministres luz solar directamente. Esto le hará daño a tus
ojos.
24. Al terminar la clase asegúrate de dejar todo correctamente; hornillas y mecheros apagados, y
salidas de gases y de aguas bien cerradas.
25. Apréndete los símbolos y las convenciones de seguridad, las cuales te avisan sobre los posibles
riesgos y te advierten para evitar los accidentes
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“Una buena vida es aquella inspirada por el Amor y guiada por la inteligencia”
GUÍA PRÁCTICA No. 1: INSTRUMENTACIÓN
OBJETIVOS:
- Observar el material utilizado en el laboratorio
- Adquirir destrezas en el manejo del material
- Analizar y comparar el material para utilizar el más apto en cada circunstancia.
MATERIAL:
Cajas de petri, tubos de ensayo, pipetas: graduadas, volumétricas y Pasteur, láminas y laminillas,
asas y agujas bacteriológicas, gradillas, mecheros de alcohol, baño serológico, estufa bacteriológica,
nevera, autoclave, microscopio, incubadora.
PROCEDIMIENTO:
1. Esterilización y uso del asa bacteriológica
Coja el asa del extremo del mango con el índice y el pulgar. Con la llama de un mechero de
alcohol, esterilícela llevándola hasta el rojo vivo iniciando por el asa y recorriendo todo el
filamento, sin retirarla de la llama, vuelva a recorrerla hasta el asa. (Figura 1).
Esta operación debe efectuarla cada vez que tome una muestra de un cultivo y después de realizada
la operación.
En la misma forma se maneja la aguja bacteriológica.
2. Manejo de tubos de ensayo con tapón.

Con la mano izquierda tome el tubo con el cultivo. Con la mano derecha debe coger el asa
bacteriológica, como se indicó en (1) y con el meñique, el tapón sin tocar el borde del tubo de
ensayo. Ponga atención a la instrucción que dé su profesor sobre la forma cómo se manejan las dos
manos para facilitar destapar y tapar los tubos sin que el algodón se sople y se contamine el cultivo.
Tan pronto destape el tubo pase la boca de éste por la llama (flamear) igualmente antes de taparlo,
así evita que se contamine con microorganismos del medio externo. (Figura 2, 3 y 4)
3. Manejo de la caja de Petri

Recuerde que todo el material que utiliza en microbiología está estéril y que debe evitarse cualquier
contaminación con microorganismos del medio externo.
Coloque la Caja de Petri sobre la mesa; con la mano izquierda levante la tapa ligeramente de un
lado dejando un espacio para introducir la pipeta o el asa, luego tape la caja. La caja y la tapa deben
formar un ángulo de más o menos 30º. (Figura 5).
4. Manejo de pipetas estériles

Las pipetas utilizadas en Microbiología se usan siempre con algodón en la boquilla para evitar
contaminación del cultivo y de la persona que las maneja. Coja la pipeta en tal forma que utilice el
índice para tapar la boquilla, nunca el pulgar.
5. Preparación de un Frotis a partir de un medio líquido

El Frotis se hace en láminas desengrasadas para poder obtener una capa delgada y homogénea del
cultivo de microorganismos, sólo así puede observarse claramente después de coloreado.
Los pasos para elaborar un Frotis a partir de un medio líquido son:
a. Con lápiz de cera, marque en un extremo la lámina con las especificaciones del cultivo.
b. Esterilice el asa bacteriológica.
c. Destape el tubo de ensayo, flaméelo, introduzca el asa y agítela en el medio, tome una asada del
cultivo.
d. Saque el asa, flamee el tubo y tápelo. Colóquelo en la gradilla.
e. Extienda el material tomado en una lámina de modo que quede parejo y suficientemente
extendido.
f. En posición horizontal, déjelo secar al aire
g. Fíjelo a la llama del mechero. Este paso es indispensable antes de colorearlo, sirve para que los
microorganismos no se desprendan de la lámina con el colorante.
Para fijarlo se pasa 3 ó 4 veces sobre la llama del mechero sosteniendo horizontalmente la
lámina y con el Frotis hacia arriba. Se acostumbra pasar la lámina sobre el dorso de la mano
cada vez que se pasa por la llama para asegurarse que no se ha calentado mucho y que las
estructuras no se van a alterar por exceso de calor.
6. Manejo de los tubos de ensayo con medios de cultivo líquidos

En esta práctica se ejercita en el manejo de tubos de ensayo, pipetas y medios de cultivo para hacer
diluciones de una muestra, en este caso diluciones al décimo (1:10).
Utilizamos colorantes (azul de metileno, violeta de genciana, safranina, etc.) en lugar de una
suspensión de microorganismos, así, macroscópicamente se observarán las variaciones de color
según la dilución sin peligro de contaminarse mientras se adquieren destrezas en el manejo de
microorganismos.
Procedimiento
a. En una gradilla coloque 4 tubos de ensayo y numérelos de 1 a 4
b. Ponga en cada uno 9ml. de agua
c. Al tubo 1 agregue 1ml. de colorante; y mezcle con cuidado.
d. Saque 1ml. del tubo 1 y páselo al tubo 2; continúe la operación hasta el tubo 4. Observe las
variaciones de color en las diferentes diluciones.
Aquí está diluyendo un colorante, en las prácticas de microbiología lo hará con
microorganismos muchos de ellos patógenos, no tienen color por eso no podrá apreciar su
concentración (Figura 6).
Cuestionario
1. Por qué es importante en el laboratorio las pipetas Pasteur?

Consulta los aportes a la ciencia del científico Luis Pasteur.
2. Por qué debe estar estéril el material utilizado en Microbiología?

Consulta sobre los principios de Asepsia y sus correspondientes científicos
3. Cuál es la diferencia entre asa y aguja bacteriológica?

Consulta si pueden ser reemplazadas en la actualidad y cómo?
4. Cómo se coloca el algodón en la boquilla de la pipeta y para qué sirve?

Consulta otros elementos que puedan utilizarse para tapar las boquillas de pipetas y tubos de
laboratorio.
5. Cómo preparas series de 4 diluciones cada una, con concentraciones 1:1, 1:2, 1:3 y 1:4.
Grafique
6. Cuáles son los pasos a seguir para obtener láminas desengrasadas?

Relacione la composición química de una membrana bacterian
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“Hay muchas personas que leen, pero pocas que saben leer”
GUÍA PRÁCTICA No. 2: COLORACIÓN DE GRAM
La coloración de Gram, coloración diferencial, es una de las de más uso en Microbiología, fue
ideada por el histólogo CHRISTIAN GRAM en 1884.
Esta coloración divide a las bacterias en dos grandes grupos:
Bacterias Gram Positivas y Bacterias Gram Negativas

Las bacterias Gram Positivas tienen la propiedad de que al ser teñidas con colorantes de pararrosa-
anilina como el Cristal violeta (Violeta de Genciana, o Violeta de Metilo, etc.) y luego tratadas con
Lugol, retienen el colorante y resisten la decoloración con alcohol.
Las bacterias Gram negativas al contrario, pierden el color por acción del alcohol, se tiñen luego
con un colorante de contraste como la fucsina, safranina, etc. Que dan una tonalidad rosada o
amarilla a los microorganismos.
Objetivos:
- Elaborar correctamente un frotis a partir de un raspado de diente, (se sigue la técnica utilizada
para hacer un frotis a partir de un medio sólido).
- Realizar la coloración de Gram.
- Observar la preparación al microscopio. Reconocer y diferenciar las bacterias Gram positivas
de las Gram negativas clasificándolas al mismo tiempo por la forma y agrupación.
Material:
- Microscopios - Láminas desengrasadas - Palillos para dientes
- Lámpara de alcohol- Aceite de inmersión - Goteros
- Suero fisiológico - Colorantes de Gram.
Procedimiento:
1. Marque una lámina con el número de su carné o nombre por el lado que va a hacer el frotis.
2. Coloque una gota de suero fisiológico o solución salina
3. Con un palillo haga un raspado de diente siguiendo las instrucciones del profesor (cuide de no
herir la encía).
4. Con el producto del raspado haga una emulsión en el suero de la lámina. Debe quedar
homogéneo y suficientemente extendido para obtener un frotis delgado.
5. Déjelo secar al aire y luego fíjelo a la llama.
6. Coloración
6.1 Cubra el frotis con violeta de Genciana por un minuto
6.2 Lave al chorro (agua corriente)
6.3 Cubra con Lugol (mordiente) por un minuto.
6.4 Lave al chorro
6.5 Decolore con alcohol-acetona por unos segundos (15 ó 20). Este tiempo es crítico para
hacer una coloración correcta. Mueva la lámina mientras escurra el alcohol.
6.6 Lave muy bien al chorro.
6.7 Cubra con fucsina de Gram por un minuto
6.8 Lave al chorro
6.9 Seque al aire y observe con inmersión.
Paso 1
Tinción del frotis, previamente fijado al calor,
con cristal violeta durante 1 minuto.
Extensión de una fina capa de la muestra
sobre el porta
Todas las células se tiñen de color azul
púrpura.
Paso 2
Añadir la solución de iodina y dejar que actúe
durante 3 minutos.
Secado al aire
Todas las células siguen del mismo color
(azul púrpura).
Paso 3
Decolorar brevemente con alcohol (alrededor
Fijación del flameado del porta de 20 segundos).
Las células Gram + siguen de color azul

púrpura, mientras que las Gram – se
decoloran.
Adición del colorante, Paso 4

Lavado y secado Tinción de contraste con safranina durante 1 –
2 minutos.
Las células Gram positivas se ven azules

púrpura, y las Gram negativas de color rosa o
rojizas.
Se coloca una gota de aceite de inmersión en el
porta y se observa con el objetivo 100 X.
Cuestionario:
1. Cómo diferencia las bacterias Gram positivas de las Gram negativas?
Consulta la composición química del peptidoglucano
2. Describa y dibuje las formas de bacterias que observó

Consulta la morfología y fisiología de las bacterias
3. Cómo clasifica las bacterias según la forma, agrupación y coloración?

Consulta la taxonomía bacteriana según manual de Bergey.
4. Consulte las posibles causas de que unas bacterias tomen el Gram y otras no. Químicamente
cuál es la causa de esta reacción?
5. Consulta química y molecularmente todos los reactivos de la coloración de Gram, sus usos e
investigadores.
ANEXO COLORACIONES
GENERALIDADES
El principio de las coloraciones se basa en la afinidad particular de ciertos tejidos o estructuras
celulares por una sustancia colorante determinada.
Los colorantes tienen varios usos en la industria, como la textil, la de plásticos, etc. y en biología.
Un colorante biológico se utiliza para hacer los objetos microscópicos más claramente visibles de lo
que ellos serían sin estar coloreados o para resaltar estructuras morfológicas.
Bajo estas premisas, se puede decir que un colorante es toda materia con color que puesta en
contacto con un soporte apropiado se fija sobre el de forma durable y le comunica su color. La
misma noción de color está íntimamente unida a la de absorción selectiva de las radiaciones
luminosas, a groso modo, su tinte es el de las radiaciones no absorbidas.
A pesar que el uso del microscopio y las coloraciones empezó con Antony Leeuwenhoek, hacia
1719, el uso de colorantes para observaciones microscópicas no llegó a ser común sino hasta 1850 y
las anilinas no fueron puestas en el mercado sino hasta 1856.
En Colombia, es de resaltar el uso de los colorantes de origen vegetal, empleados para la

elaboración de las láminas de la Expedición Botánica; la forma de extracción y utilización de estos
colorantes se enseñó por tradición oral y, desafortunadamente, no quedaron registros de estos
procedimientos.
Aun cuando no hay reseñas históricas exactas sobre la aparición, evolución y utilización de los
colorantes, se conoce que Gierke (1884) fue el primero en publicar una revisión, seguido por Conn
(1933,1948); Lewis, en 1942 presentó una revisión más completa del desarrollo de las coloraciones.
Aunque Gerlach es considerado el padre de las coloraciones por algunos autores, Gierke dice que la
técnica de coloración para uso en microscopia fue anterior a él. Gierke cita a Goppert y Cohn,
quienes se cree fueron los primeros en utilizar las coloraciones biológicas, en trabajos más recientes
se le ha adjudicado a Ehrenberg (1838) y, luego, a Hill (1770) sin dejar atrás una carta de
Leeuwenhoek a The Royal Society en 1714 y publicada en 1719 donde menciona que ha coloreado
cortes de fibras musculares con safranina para aumentar la visión de las partículas.
Siguiendo el trabajo de los pioneros hacia los años 1800 hubo un desarrollo rápido especialmente
después que la hematoxilina fuera introducida por Waldeyer (1863) y mejorada por Bohmer (1865).
Luego se hicieron adelantos en el uso de les anilinas como colorantes biológicos que se le atribuyen
a Beneke (1862) y la diferenciación en alcoholes a Rottcher (1869).
Según Gierke, el desarrollo de los colorantes se pueden dividir en tres etapas, cada etapa
comprende una década, aproximadamente. La primera de ellas, la década de los años 50 (1850) se
caracterizó por unos pocos descubrimientos importantes sin relación entre ellos, que terminaron en
el trabajo de Gerlach; en donde cada investigador reportaba observaciones accidentales sobre el
poder tintorial del carmín y otros colorantes bien conocidos para esa época. Después de Gerlach,
durante la década de los 60, el desarrollo fue más rápido y dependió menos del azar en esta década
se implementó el uso de muchos colorantes entre ellos los metálicos.
La tercera década, la delos 70, se caracterizó por el uso de las anilinas. Se sabe que aún en
Nuestros días se siguen implementando y modificando técnicas antiguas o técnicas utilizadas en
industria, principalmente la textil.
Desde el punto de vista biológico, las coloraciones se usaron en sus inicios en la histología
vegetal; sin embargo, las técnicas histológicas tuvieron un mejor desarrollo para colorear material
zoológico.
Aunque en microbiología, el número de técnicas utilizadas comparado a los otros campos es menor,
gran parte del diagnóstico microbiológico está fundamentado en estas actividades.
¿QUE ES UN COLORANTE?
Es comparativamente poco lo que se conoce de la química de los colorantes naturales, pero los
colorantes sintéticos han sido cuidadosamente estudiados. Muchos de estos hallazgos son
usualmente ignorados por las personas que manejan material biológico quienes emplean las
coloraciones como una herramienta para su trabajo con el microscopio. Un breve conocimiento de
los principios generales conlleva a un empleo más apropiado de ellas.
La mayoría de colorantes biológicamente útiles provienen del alquitrán. Son compuestos de la serie
aromática y se pueden considerar derivados del benceno. La importancia del benceno radica en que
puede combinarse de muchas maneras con otros radicales y/o elementos para formar compuestos de
extrema complejidad. Si los elementos se combinan en ciertas formas la sustancia es coloreada. Un
derivado del benceno puede ser coloreado (pigmento) y no necesariamente ser colorante.
Tres productos de monosustitución del benceno son importantes en la estructura del colorante:
Tolueno o metilbenceno
CH3
Fenol o ácido carbólico

OH
Anilina o fenil amina
NH2
De la doble sustitución por dos metilos en cualquiera de sus posiciones (orto, meta, para) tenemos el
xilol y la sustitución por un metilo (-CH3) y un amino (-NH2) tenemos el toluol.
Aunque todavía no se puede dar toda la explicación del color con base en la fórmula estructural, es
bien sabido que ciertos grupos atómicos definidos llamados cromóforos se hallan asociados al color.
Los grupos fundamentalmente involucrados son: C=C, C=O, C=S 1 C=N1 N=N1 N=O1 NO2 La
Intensidad del color es directamente proporcional al número de grupos cromóforos.
Los compuestos del benceno que poseen radicales cromóforos se llaman cromógenos. Un
cromógeno aunque es coloreado no es un colorante porque no posee afinidad por fibras o por
tejidos. Esto es, los pueden cubrir, pero puede ser removido fácilmente por un proceso mecánico,
lo que en otras palabras significaría que no “toma” la sustancia o el compuesto.
¿Qué necesitamos entonces para que una sustancia con color sea colorante?
Para que una sustancia llegue a ser colorante, además del grupo cromóforo debe tener un grupo que
le dé al compuesto propiedades de disociación electrolítica, estos grupos auxiliares se conocen
como auxocromos; pueden alterar la intensidad del color, pero, no son su origen. Un ejemplo
representativo es: el grupo (-NO 2) es un cromóforo, cuando tres de estos grupos desplazan tres
moléculas de hidrógeno en una molécula de benceno se forma el trinitrobenceno el cual se
caracteriza por ser de color amarillo.
Auxocromas – se une a las estructuras
Cromófora – da el color
Trinitrobenceno (color amarillo)
Así, es un cromógeno, si se reemplaza otro hidrógeno H 2 por un OH- se forma un ácido que es
capaz de disociarse electrónicamente y formar sales con los álcalis y este compuesto resultante es el
ácido pícrico que es un colorante amarillo.
Si los grupos .N02 se reducen a grupos -NH2, se elimina el color.
De lo anterior se concluye que un colorante es un compuesto orgánico que tienen grupos

cromóforos y auxocromos unidos a anillo de benceno. El color se le atribuye al cromóforo y la
propiedad colorante a los grupos auxocromos formadores de sales.
CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES:
Las materias colorantes son muy numerosas. Existen actualmente alrededor de 20.000 marcas de
colorantes que responden a 2.000 especies químicas definidas.
Los colorantes se dividen en naturales y artificiales. Los naturales son utilizados desde hace mucho
tiempo en microscopia. La mayor parte son de origen vegetal: la orceina. La hemotoxilina (extracto
de palo azul o palo campeche), el azafrán, el índigo, etc. Uno solo es de origen animal: el carmín.
Aunque dentro de la industria estos colorantes hayan sido desplazados por los colorantes
artificiales, siguen siendo muy utilizados.
Los colorantes artificiales son cuerpos complejos derivados de los productos de destilación de la
hulla. Son muy numerosos y las propiedades tintoriales de muchos de ellos no han sido aún
exploradas en técnicas microscópicas.
Se dividen estos colorantes en básicos (nucleares), ácidos (citoplasmáticos), neutros y/o

indiferentes. Esta distinción no tiene el mismo significado que posee las palabras ácido y básica en
química; esta distinción es importante, ya que sirve para diferenciar las formaciones basófilas de las
estructuras acidófilas.
Como se ha podido establecer la clasificación de los colorantes es algo compleja y confusa, pero
está basado en los grupos cromóforos presentes. En términos amplios los colorantes se designan
como ácidos o básicos, términos que no indican necesariamente sus reacciones de PH en solución,
sino más bien una parte significativa de la molécula es anionica o cationica, es decir que un
colorante es ácido o básico dependiendo del grupo auxocromo que posea.
Desde el punto de vista práctico, los colorantes básicos tiñen estructuras de naturaleza ácida, como
la cromatina nuclear de las células; los colorantes ácidos reaccionan con sustancias básicas, tales
como las estructuras citoplasmáticas.
Los colorantes básicos son sales cuya propiedad tintorial está en relación con el componente básico
de la molécula. Su grupo aminado forma una sal con un ácido cuya única propiedad es la de ser
soluble en el agua. Sus afinidades tintoriales son muy vastas y dependen mucho de la preparación
previa del material a colorear. La fucsina básica, el azul de metileno, el azul de toluidina y el violeta
de metilo son los más usados.
Los colorantes ácidos son también sales cuya propiedad colorante está unida al componente ácido
de su molécula. La eosina, la eritrosina, el verde brillante, el naranja y la fucsina ácida son los
usados con más frecuencia. Estos colorantes son esencialmente citóplasmáticos.
Los colorantes neutros son sales cuyas propiedades tintoriales van unidas a los dos componentes,
ácido y básico, de la molécula: el eosinato de azul de metileno, componente importante del Giemsa.
Se pueden conformar de dos maneras: a: mezclar mecánicamente dos colorantes y si ellos son de
colores diferentes con poderes eléctricos diferentes se puede
Alcanzar doble efecto colorante. b.- alcanzar un colorante nuevo por la unión química de dos
colorantes lo que se llama un colorante compuesto.
Si en una preparación se deben teñir las estructuras nucleares y las citoplasmáticas, se puede
emplear combinaciones de colorantes ácidos y básicos. Un ejemplo común son las tinciones con
hematoxilina (básica) y eosina (ácida) empleada para examinar cortes y tejidos.
Los colorantes indiferentes no poseen grupos capaces de formar sales. Estos colorantes comunican
su color incorporándose a disolventes dentro del tejido que deben teñir el sudán y el escarlata son
colorantes indiferentes.
Los colorantes metacromáticos

Ciertos colorantes tiñen diversos elementos histológicos con un tinte distinto del de la solución
colorante. Por ejemplo el azul de toluidina tiñe distinto en rojo púrpura el moco y la sustancia
fundamental del cartílago, mientras que las estructuras epiteliales y las fibras conjuntivas son
teñidas en azul.
La metacromasia hace un viraje de ciertos materiales colorantes al contacto con elementos

particulares. Las estructuras se tiñen metacromáticamente se llaman cromotropas o metacromáticas.
Esta metacromasia debe ser obtenida con un solo color, la metacromasia está ligada al color de la
base libre. En efecto, las bases de la tionina, del azul de toluidina, violeta de metilo y violeta de
metileno son rojas. Como estas bases reaccionan electrolíticamente en un medio alcalino, se puede
decir que la metacromasia se debe a la alcalinidad de las sustancias cromatropas, porque los ácidos
como el HCL, no modifica la metacromasia. Los colorantes metacromáticos más conocidos y más
usados, son los colorantes básicos azul de toluidina, tionina, azul de cresil brillante y azul B de
metileno.
Todos los colorantes tiológicos poseen una elevada afinidad por el nitrógeno. Cuando todos los
sitios moleculares aceptores de hidrógeno están ocupados, el colorante se halla en su estado
reducido y generalmente es incoloro. En el estado incoloro, se denomina leucompuesto.
Considerando este concepto desde un criterio opuesto, un colorante retiene su color en tanto sus
afinidades por el hidrógeno no estén completamente satisfechas. Dado
que el oxígeno posee generalmente mayor afinidad por el hidrógeno que muchos colorantes, el
color es retenido en presencia del aire. Esto permite que ciertos colorantes, tales corno el azul de
metileno, sean utilizados como indicadores rédox en un medio anaerobio.
MECANISMOS DE LA COLORACIÓN
Teóricamente la coloración en la fábrica de textiles y las estructuras celulares es la misma.
En el mecanismo de coloración están implicados principalmente, fenómenos químicos en algunos
de ellas pretenden haber fenómenos físicos. En una unión química se forma una nueva sustancia
cuyas propiedades posiblemente sean diferentes a los reactantes los cuales no pueden ser
recuperados por medio de solvente simples; pero algunas veces es posible extraer casi todo el color
por el uso de algunos solventes (agua o solventes orgánicos, en este caso están implicados los
factores físicos.
Hay tres factores físicos que juntos o separados pueden explicar el fenómeno de coloración 1-Las
sustancias a colorear son más o menos prosas o sea que por capilaridad ósmosis hay penetración en
el tejido. 2: adsorción. 3: absorción.
Como se ha discutido previamente, el factor químico importante en la reacción de los colorantes es
la unión electrolítica de cationes con partes ácidas o aniones con partes básicas. La talla para
consumir todo el colorante es porque se ha llegado a un punto de equilibrio.
Estos factores son importantes, sólo en el sentido de cómo influyen en la coloración.
PROPIEDADES DE LOS COLORANTES

Ácido pícrico: OH
NO2 NO2
NO2
Es formado por la acción dé ácido nítrico sobre el fenol.

- Peso molecular de 229,108 gramos
- Colorante ácido
- Soluble a 26°C en: agua al 1,18% y en alcohol al 8,96%
Se usa como colorante citoplasmático general en contraste a los colorantes básicos y diferencia
cortes coloreados por hematoxilina. También tiene aplicaciones como fijador de tejidos y es un
agente descalcificante lento.
Cromotropo 2R
Sinónimos: cromotropo N2R, cromotropo azul 2R, rápida G, fucsina
OH OH
N=N
NaO3S
SO3Na
- Peso molecular de 468,382 gramos.

- Colorante ácido.
- Soluble a 26° C en: agua al 19.3% y en alcohol al 0,17%.
Lillie en 1.940 lo utilizó en la coloración tricrómica.
Rojo de metilo:
COOH
N=N
- Peso molecular 269,294 gramos.

- Colorante ácido débil.
- Principal uso como indicador. Su rango usual de pH es 4,4 a 6,0 y cambia de rojo en soluciones
ácidas a amargo en soluciones básicas.
Azul de Evans:
H2N OH OH NH2
SO3Na
SO3Na N=N N=N
CH3 CH3
SO3Na SO3Na
- Peso molecular: 960,832 gramos.

- Colorante vital.
Azul de metileno:
Es una mezcla de colorantes y de su oxidación se producen el azur A y el Azur B (componentes del
Giemsa, Wright y Field) y azur C.
El azur 1 que está en el Giemsa posee una fórmula exclusiva de la casa productora y se caracteriza
por que predomina el azur B.
El azur II (otro Giemsa) es una mezcla de azur I con una cantidad igual de azul de metileno.
Azur A:
NH3+ (CL-)
(CH3)2N S
N
- Peso molecular: 291,799 gramos.
- Colorante básico
Se usa en la coloración de Kinyoun.
Azur B:
N+ – CH3(CL- )
S
H
N

- Colorante básico.
La coloración obtenida es generalmente muy parecida a la de azur A más azul de metileno.
Azul de metileno:
Sinónimo azul suizo
(CH3)2N N+ – (CH3)2 (CL- )
S
- Solubilidad a 26°C en agua: 3,55% y en alcohol 1,48%.
Se Oxida fácilmente; por eso, es muy difícil obtenerlo en forma pura. Se ha reconocido como una
coloración nuclear simple.
El azul de metileno comercial generalmente es una doble sal de cloruro de zinc y azul de metileno.
La sal de zinc es tóxica; el azul de metileno puro es prescrito para propósitos medicinales.
La doble sal de zinc es menos soluble particularmente en alcohol o sea que para propósitos de
coloración es menos deseable. Para coloraciones es mejor usar compuestos libres de zinc.
Se usa con los siguientes propósitos:
1. Colorante nuclear.
2. Colorante bacteriano, especialmente en trabajos con leches, diagnóstico de difteria porque tiene
una afinidad por el protoplasma bacteriano, es más selectivo que la rosa-anilina y hace una
mejor diferenciación.
3. En coloraciones vitales: cuando falta oxígeno, la célula no toma el color.
4. En combinación con la eosina en preparaciones sanguíneas, por la facilidad que posee de
oxidarse da un efecto policromo.
5. Como indicador de óxido - reducción particularmente en leches.
6. Como indicador en el medo azul de metileno-Eosina de Lewine para diferenciar organismos
erógenos del colon.
Safranina:
Sinónimos: safranina y/o A. Gosipimina, algodón rojo.
CH3 N CH3
N
+
H2N
CL-
- Colorante básico
- Solubilidad a 36ºC en agua: 5,45%, y en alcohol: 3,41%
La safranina comercial son mezclas del dimetril y trimetil fenosafranina. Los resultados difieren de
acuerdo a la proporción de los compuestos, cuando hay mayor proporción de trimetil el rojo es más
profundo.
Verde de malaquita:
Sinónimos: verde victoria B o WB, nuevo extraverde victoria 0, I o II, verde diamante. Verde
sólido, verde suave N.
N (CH3)2
C
= N – (CH3)2 CL-
Es un colorante básico débil.

Utilizado por Schaefler y Fulton (1933) en coloración de esporas bacterianas.
Es empleado para coloraciones vitales, para polisacáridos bacterianos, aunque no es muy sensible
como bacteriostático o amebicida.
Empleado en al medio de Lowestein-Jensen para el cultivo de microbacterias.
Cristal violeta:
Sinónimos: violeta B, C ó 7B, hexametil violeta, metil violeta 10B o violeta de Genciana
N – ( CH3)2
(CH3)2 – N C-
= N+ (CH3)2 CL-

- Soluble a 26°C en agua 1,68% y en alcohol 13,87%.
Colorante empleado para colorear núcleo y cromatina, plaquetas en sangre y en el colorante de
Gram. Es utilizada en medio para hongos y en varios medios bacteriológicos por su acción
bacteriostática selectiva, debido a esta propiedad se ha utilizado para el control de Staphylococcus.
Fast green:
Sinónimos: Verde árido G, extra B.
SO3Na C2H5
SO3Na
N – CH2
HO
C
+
= N – CH2
C2H5
SO3Na
- Colorante ácido
- Solubilidad a 26°C en agua 16,04%, en alcohol 0.35°16.
No colorea los detritos, colorante citoplasmático.
Fucsina básica:
Sinónimos: fucsina RFN, magenta, anilina roja.
El colorante comercial generalmente corresponde a mezclas de pararosanilina, rosanilina y
Magenta II.
Pararosanilina (magenta 0):

Sinónimo: rubina báxica, perafucsina, paramagenta.
CH3
NH2
H2N C
= N+H2 CL-
- Colorante básico
- Solubilidad a 26°C en agua: 0,26% y en alcohol 5,93%
Es el principal componente de la mayoría de muestras de la fucsina básica
Rosanilina (magenta I):

- Solubilidad a 26°C en agua; 0,39% y en alcohol: 8,16%.
No es colorante textil y no se encuentra libre de pararosanililina.
Magenta II
CH3
CH3
NH2
H2N C
= NH2(+) CL (-)
- Colorante básico
- No se encuentra pura
Fucsina ácida
Sinónimo: fucsina S, SN. SS, ST o SIII, magenta ácida, rubina ácida.
Es un derivado sulfonado de la fucsina básica.
Anilina azul
Sinónlmo: azul chino, azul soluble 3M o 2R, azul marino V, azul algodón, agua azul,
Es una mezcla de los trisúlfonados de trifenil pararosanilina.
CH3
NH2
SO3Na SO3Na
H2N NH C
= NH+
- Colorante ácido
Es más bien un grupo de colorantes, se decolora completamente al adicionarle un ácido y
nuevamente se torna azul si la reacción llega a ser ácida.
Fluoresceína
Madre de las eosinas, su sal de sodio se flama URANINA
. Colorante ácido
- Solubilidad a 26°C en agua: 0,03% y en alcohol: 2.21%
De la uranina
- solubilidad a 26ºC en agua 50,02% y en alcohol 7,19%
Es un colorante amarillo de bajo poder tintorial extremadamente fluorescente; esto es más
pronunciado en la luz ultravioleta por lo que se usa para microscopia de fluorescencia.
Eosina Y
Sinónimo: Eosina, agua soluble, Br. ácido J,TS,XL,o XX, bromofluoresceína, Br, bronce ES.
Br Br
O
NaO O
C Br
Br
COONa
Es típicamente tetrabromo fluoresceína
- Colorante ácido
- Solubilidad a 26°C en agua 44,20% y alcohol 2,18%
Cuando hay mayor bromo presente, el colorante es más rojo.
Muestra también fluorescencia verde- amarillenta especialmente en soluciones alcohólicas.
Es interesante que en la seno de derivados del fluorán cuando aumenta la capacidad tintorial
disminuye la fluorescencia.
La eosina amarilla es una de los colorantes conocidos de plasma más valiosos.
Mercurocromo 220
Se llama así un derivado de la fluoresceína, muy relacionado a la eosina: dibromo-hidroximercuri-
fluoreceína.
Br Br
O
NaO O
C Magíster en Microbiología, Especialista En Salud Ocupacional e Higiene del trabajo,

María Inés Gallego Murillo:
HgOH
COONa
- Peso molecular 750, 7

Su uso más amplio ha sido como desinfectante, especial para cáncer de piel. Conklin, lo recomendó
como contrate para esporas en la coloración de verde de malaquita do Nirts.
Amarillo de acridina
Br H Br
|
H2N NH2 + CL-
N+
C CH3
H2N
|
H
- Peso molecular: 273,759

- Colorante básico
- Es un fluorocromo
Naranja de acridina
Sinónimo: naranja básico 3RN, Eucrisina 3RNA
H
|
(CH3)2N N(CH3)2 +CL -
N+1
C
|
H
- Colorante básico
Generalmente se obtiene doble sal de cloruro do Zinc.
Se ha usado para bacterias, células tumorales y Cryptosporidium
Acriflavina
Sinónimo: tripoflavina, flavina.
CH3 CL-
|
H2N N+ NH2 + CL-
- Peso molecular 296,198

- Colorante básico
Usado como desinfectante, también fue usado como agente bacteriostático. su uso más importante
es como fluorocromo
COLORANTES NATURALES
Índigo
Azul índigo, carmín: Sinónimo: Indigotina la.
Es la sal de sodio del ácido disulfúrico índicgo.
- Peso molecular: 466.366
- Colorante ácido
Se usa algunas veces como colorante de plasma.
COLORANTES NEUTROS
Se pueden obtener de dos formas:
1. Mezclar mecánicamente dos colorantes y si oros son de colores diferentes con poderes reactivos
distintos, se puede lograr doble efecto colorante.
2. Elaborar un colorante nuevo por la unión química de dos colorantes, lo que se denomina un
colorante compuesto
FIJACIÓN
La fijación tiene como objetivo inmovilizar las estructuras celulares o tisulares en un estado lo más
próximo posible al estado vivo. Además provoca en el soma bacteriano una modificación de su
composición química y físico-química, de forma que conserve definitivamente a estructura lo más
parecida posible a la que tenía. Una buena fijación provoca la coagulación de las proteínas del
microorganismo y además debe impedir el arrastre de los productos solubles en las operaciones
posteriores de tinción, lavado, etc., a que ha de ser sometida la extensión en las diversas técnicas de
coloración.
Este paso aparentemente simple es muy importante para la observación microscópica. De una
buena fijación depende no solamente el éxito futuro de las coloraciones sino incluso el valor de
interpretación de las observaciones.
Un buen fijador debe tener una penetración rápida y homogénea, no producir retracción, revelar los
organismos intracelulares, evitar la desaparición de las formaciones solubles, tales como el
glucógeno, cuidar la actividad de ciertas enzimas, no crear artefactos. A pesar de muchos esfuerzos
no se ha podido encontrar el fijador ideal; algunos penetran rápidamente pero inmovilizan mal las
estructuras, otros fijan bien pero su capacidad de penetración es muy lenta, ejemplo OsO 4. En efecto
cada técnica, cada investigador tiene su fijador adecuado, su fijador privilegiado.
La fijación debe asegurar una coagulación lo más homogéneamente posible de los geles proteicos
constituyentes de las células y las estructuras extracelulares. En la práctica, hay dos formas de
conseguir la coagulación de las proteínas: el calor, o bien soluciones, ya sea de sustancias químicas
definidas o mezclas de compuestos químicos, los cuales son empleados especialmente para
preparaciones histológicas ejemplo sangre y extendidos de materia fecal y frotis por aposición.
Los fijadores químicos se pueden dividir en dos categorías: 1. Los oxidantes, son ricos en Oxígeno
y fácilmente hacen reacciones químicas con el hidrógeno de los tejidos. Ejs. Ácido ósmico,
crómico, pícrico, bicromatos, etc. 2. los reductores son ricos en hidrógeno y se unen al oxigeno de
los tejidos, entre los líquidos fijadores están el formol, el alcohol.
Principales agentes fijadores:

A Temperatura: el frío no ejerce una acción fijadora; el calor se puede aplicar a objetos húmedos o
secos, sin embargo este medio no es útil para Protozoarios o frotis sanguíneos, ya que alteran la
morfología. B. Químicos el uso de estos depende de la muestra, dentro de estos los más
frecuentemente utilizados son el formol y el alcohol.
Formol: el más utilizado porque fija y conserva al mismo tiempo. Fija y endurece rápidamente los
tejidos, no los deshidrata y por lo tanto no los deforma; en cambio es un fijador citológico
mediocre, porque coagula la albúmina del citoplasma lentamente. Es un buen fijador de espera o sea
que permite algunas post fijaciones (ácido pícrico-bicromato).
Alcohol: es un fijador muy mediocre, empleado en la fijación del glucógeno. Es el elemento

esencial del líquido de Carnoy, que es un buen fijador nuclear.
Generalmente en los laboratorios los fijadores que más se emplean son: el calor o el alcohol
metílico. Después de dejar secar el extendido al aire, protegiéndolo del polvo y otros artefactos,
puede ser fijado por medio de calor pasándolo suavemente sobre la llama del mechero para que las
células se adhieran sobre el portaobjetos. El recalentamiento ocasiona deformaciones y por eso no
se recomienda su uso.
La fijación excesiva con cualquier tipo de fijador debe evitarse. Existe una preferencia para ciertos
procedimientos, por el alcohol metílico de 99° que deja intactos los caracteres citológicos más
delicados. El alcohol en frío deja precipitados pero al flamearlo produce coagulaciones exageradas.
La mejor solución es recubrir los portaobjetos con el líquido de fijación, sobre el mismo soporte
caliente. El alcohol se evapora en algunos minutos.
QUE ES UN MORDIENTE
Son elementos que sirven de intermediarios entre las estructuras a colorear y el colorante. Según
Mann el mordiente provoca una combinación química entre dos elementos que no la podían hacer
por si solos. Su acción se efectúa de dos maneras: sensibiliza al tejido para dar una combinación
estable y produce con el colorante un precipitado fuertemente coloreado e insoluble en agua, o sea
que se forma entre el tejido, el mordiente y el colorante una combinación coloreada, estable para
resistir los agentes decolorantes (ácido, alcohol, etc). Los mordientes no pueden formar complejos
estables con las albúminas.
Una adopta la siguiente clasificación para los mordientes

1. Mordentes metálicos disociables. No se deben emplear en microscopia
2. Mordientes oxidante propiamente dichos. Su papel es reavivar las coloraciones o neutralizar las
influencias reductoras.
3. Alumbres. Tienen la capacidad de formar combinaciones con tejidos cuando están en contacto
con ciertos colorantes (hematoxilina, ácido carmínico) y los dé propiedades electivas.
4. Taninos.
PREPARACIÓN DE FROTIS PARA COLORACIÓN
Antes de que se puedan teñir los organismos, debe prepararse un frotis satisfactorio de un cultivo de
la muestra o de la muestra directamente según sus características. Puede usarse el siguiente método
sencillo:
1. Se coloca una pequeña gota de agua sobre la superficie de un portaobjetos previamente ha sido
lavado y desengrasado.
2. Con una aguja o con una asa estéril, se transfiere suficiente cantidad del cultivo de una colonia
a la gota de agua, lo que producirá una delgada película de los organismos; cuando se hayan
mezclado el cultivo y la gota se hace un extendido sobre una superficie aproximada de 1 cm 2
del portaobjetos, y se deja secar. Cuando se deban examinar cultivos en caldo, se hace el
extendido sobre un área igual a la descrita en el portaobjetos con la cantidad de cultivo que se
pueda tomar con un asa.
3. Déjese secar por si solo el frotis, calentar un frotis húmedo dará por resultado distorsiones
morfológicas do los organismos.
4. Una vez secos, los frotis deben ser fijados. Puede hacerse esto, haciendo pasar lentamente
portaobjetos a través de la porción azul de la llama del mechero, permitiendo que se caliente
hasta que permita colocarse sobre el dorso de la mano.
El sobrecalentamiento producirá también distorsiones morfológicas, o la destrucción completa de

las células. Una fijación adecuada "pegará" a la célula en el portaobjetos produciendo coagulación
de proteínas y preservando así los detalles morfológicos de la célula.
MONTAJE HÚMEDO - TINCIONES DIRECTAS

Los organismos vivientes deben ser examinados en preparaciones húmedas, para mantener su
viabilidad. Los organismos no vivientes pueden ser fijados en un portaobjetos de vidrio y después
teñirse con diferentes coloraciones para hacer resaltar estructuras específicas.
Montaje en solución salina:

Propósito:
Determinar actividad biológica de microorganismos, incluyendo movilidad, reacciones a ciertas
sustancias o reactividad serológica frente a antisueros específicos.
Materiales:
1. Cloruro de sodio, acuoso, 0,85 %
2. Portaobjeto de vidrio, 75x25 mm
3. Cubreobjeto
Técnica:
Sobre un portaobjeto suspender en una gota de solución salina una pequeña cantidad dela muestra.
Colocar un cubreobjeto y examinar al microscopio con un objetivo 40x o 100x de inmersión en
aceite, bajando el condensador para reducir la cantidad de luz transmitida.
Montaje en lodo:
Propósito:
Se emplea habitualmente con el montaje en solución salina al examinar heces u otros materiales
para detectar protozoos intestinales o huevos de helmintos. El lodo tiñe núcleos y organelas
intracitoplasmáticas de modo que se visualicen con más facilidad.
No se puede usar en reemplazo del montaje en solución salina pues el lodo paraliza la movilidad de
bacterias y trofozoítos.
Materiales:
1. Solución de lugol: lodo (cristales)5 g
2. loduro de potasio 10 g
3. agua destilada 100 ml.
Disolver el Kl en agua y añadir el lodo lentamente hasta que este se disuelva. Filtrar y conservar en
frasco con tapa hermética.
Diluir 1:5 con agua antes de usar

4. Portaobjeto 75x25 mm
5. Cubreobjeto
Técnica:
Suspender sobre un portaobjeto, en una gota de la solución lodada, una pequeña cantidad de materia
fecal o el material a examinar. Mezclar bien y colocar un cubreobjetos. Examinar al microscopio.
Montaje de hidróxido de potasio (KOH)
Propósito:
Ayudar a detectar elementos fúngicos en materiales mucoides densos o en muestras que contienen
material queratinoso, tales como costras de piel, uñas o pelos. El KOH disuelve la queratina de
fondo, desenmascarando los elementos fúngicos hasta hacerlos más visibles.
Materiales:
1- Hidróxido de potasio, 10% (acuoso)
2- Portaobjeto 75x25 mm
3- Cubreobjeto.
Técnica:
Suspender en una gota de KOH al 10% costras de piel, uñas o pelos. Colocar un cubreobjetos y
dejar asentar a temperatura ambiente durante aproximadamente media hora. El preparado se puede
calentar suavemente en la llama de un mechero para acelerar el proceso de aclaración. No dejar
hervir. Examinar al microscopio para detectar hifas y esporos.
Técnica de la tinta china:

Propósito
Observación microscópica directa de cápsulas de muchos microorganismos. Los gránulos finos de
tinta china o nigrosina constituyen un fondo semiopaco contra el cual se pueden ver fácilmente las
cápsulas claras. Especialmente útil para visualizar las grandes cápsulas del Cryptococcus
neoformans en el líquido cefalorraquídeo, esputos u otras secreciones.
Materiales:
1. Tinta china o nigrosina
2. Portaobjeto, 75x25 mm
3. Cubreobjeto
Técnica:
Centrifugar ligeramente el líquido cefalorraquídeo o cualquier otra muestra líquida, para
concentrar los microorganismos en el sedimento. Emulsionar sobre un portaobjeto una pequeña
cantidad de sedimento en una gota de tinta china o nigrosina y colocar un cubreobjeto. La emulsión
de contraste no debe ser muy espesa, ya que puede bloquear totalmente la luz transmitida. Evaluar
al microscopio con objetivo 10X para realizar una evaluación preliminar de la población y con
objetivo 40X para confirmar la presencia del microorganismo capsulado sospechosos.
Examen en campo oscuro:

Propósito:
Visualizar ciertos microorganismos delicados, que son invisibles en campo brillante y se
tiñen con gran dificultad. Especialmente útil para detectar espiroquetas en materiales biológicos,
sobre todo en orina sospechosa de contener leptospiras o en chancros sifilíticos en los que se
sospecha la presencia de Treponema pallidum.
Materiales:
1. Microscopio compuesto, equipado con condensador de campo oscuro.
2. Portaobjeto, 75 X 25 mm.
3. Cubreobjeto.
4. Solución fisiológica.
5. Varillas.
Técnica:
La secreción por examinar se obtiene del paciente. En el caso de un chancro. Quitar la costra
superior con un escalpelo y recoger una pequeña cantidad de material seroso sobre un portaobjeto.
Colocar un cubreobjeto sobre la gota de material.
Examinar directamente con un microscopio provisto de condensador de campo oscuro con objetivo
40X o 100X. Las espiroquetas aparecen como “tirabuzones” móviles y brillantes contra un fondo
negro.
COLORANTES UTILIZADOS COMÚNMENTE EN MICROBIOLOGÍA:

Es Importante que todos los colorantes se preparen en el laboratorio siguiendo las instrucciones
específicas del fabricante. Es preciso seguir paso a paso los detalles cuando se preparen mezclas o
compuestos colorantes múltiples, tales como las tinciones tricrómicas o policrómicas. La
coloración de Wright es un ejemplo: está compuesta por azul do metileno y una variedad de
productos de degradación de los azures. El pH del búffer, el periodo y las condiciones de
almacenamiento pueden ser factores críticos para determinar la composición y calidad tintorial de la
solución final. Es esencial utilizar controles de características tintoriales conocidas a fin de probar
cada nuevo lote de colorante para asegurar que la intensidad y finalidad de las reacciones de color
sean las apropiadas.
Coloración de Gram:
Fue elaborada por el danés Hens Christian Gram en 1.884 y permite distinguir entre diferentes
bacterias que pueden mostrar una morfología similar.
Al examen microscópico de un extendido coloreado por el método de Gram que contenga una flora
bacteriana mixta, aparecen las características diferenciales del método. Muchas bacterias conservan
la combinación violeta-yodo y se teñirán de púrpura (grampositivas), otras se colorean de rojo por
la safranina o el colorante que se emplee en la contra coloración (gramnegativos). De esta manera,
con este procedimiento no sólo se hace visible la forma, tamaño y otros detalles estructurales, sino
que pueden agruparse los microorganismos presentes en tipos grampositivos y gramnegativos, por
sus reacciones frente a los colorantes.
Es probable que la diferencia en la reacción de coloración entre las bacterias grampositvas y

gramnegativas se pueda atribuir a su diferente composición química. Las paredes de las células
gramnegativas tiene un contenido lipídico más elevado que las de la célula grampositiva, y aunque
en ambas se forma un complejo cristal violeta-yodo, el alcohol extrae el lípido de las células
gramnegativas y aumenta por lo tanto la permeabilidad celular. Esto da como resultado la pérdida
del complejo de colorantes. El mismo es retenido por las células grampositivas, en las cuales la
deshidratación por el alcohol ocasiona una disminución de la permeabilidad.
Propósito
Coloración diferencial utilizada para demostrar las propiedades tintoriales de todos los tipos de
bacterias
Las bacterias grampositivas retienen el cristal violeta tras la decoloración y se observan de color
violeta
Las bacterias gramnegativas no son capaces de retener el cristal violeta tras la decoloración y se
contracoloran de rojo con safranina o la fucsina.
Las características de la coloración de Gram puedan ser atípicas en cultivos muy jóvenes, viejos,
muertos o en degeneración.
Materiales:
Cristal violeta: 2.0 g
Etanol 95% 20 ml
Oxalato de NH4 0.8 g
Agua destilada 100 ml
Lodo de Gram:
Loduro de potasio 2.0 g
Lodo (cristales) 1.0 g
Decolorante:
Acetona 50 ml
Etanol 95% 100 ml
Contracolor:
Sefranina O 2.5 ml
Etanol 95% 100 ml
Añadir 10 ml de agua destilada
Técnica:
1. Preparar un extendido fino del material en estudio y dejarlo secar al aire.
2. Fijar el material a portaobjetos de modo que no sea arrastrado durante el proceso de tinción,
pasando el portaobjeto 3 ó 4 veces por la llama de un mechero.
3. Colocar el preparado sobre un soporte de lindón y cubrir la superficie con solución de cristal
violeta.
4. Luego de un minuto (con algunas soluciones se pueden abreviar los tiempos) de exposición al
cristal violeta, lavar bien con agua destilada o búffer.
5. Cubrir el preparado con lodo de Gram durante un minuto. Lavar nuevamente con agua.
6. Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con unas gotas del
decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar más colorante violeta. Esto requiere
habitualmente unos 10 segundos o menos.
7. Lavar con agua corriente y colocar nuevamente el portaobjeto sobre el soporto. Cubrir la
superficie con safranina o el colorante que se va a enfriar pera contracolorear, durante 1 minuto.
Lavar con agua corriente.
8. Colocar el preparado en un soporte de tinción en posición vertical, dejando que escurra el
exceso de agua y que se seque el extendido.
9. Examinar el preparado al microscopio con objetivo 100x de inmersión (aceite). Las bacterias
grampositivas se tiñen de púrpura; las bacterias gramnegativas aparecen rojo – rosadas.
Coloración ácido-alcohol resistente

El ácido alcohol resultante es la capacidad que tiene un material biológico de formar complejos
ácido-estables con colorantes anilmetánicos, lo cual evita que la estructura coloreada no pueda ser
decolorada al exponerla a mezclas de alcohol-ácido.
Los colorantes usados son compuestos aniónicos en soluciones fenoladas. Los gérmenes se ven
como bacilos rojos cuando el colorante que se emplea es la fucsina, violeta púrpura con cristal
violeta y con fluorescencia amarillo-verdosa cuando se emplea auramina O, pero la más empleada,
porque permite una mejor coloración de contraste, es la fucsina.
Las microbacterias poseen una cápsula gruesa y cerosa, resistente a la tinción; sin embargo, una vez
teñida, esta cápsula resiste la decoloración cuando es tratada con potentes solventes orgánicos tales
como el alcohol ácido. Por tal razón, los microorganismos que tienen esta propiedad se llaman
acidorresistentes
A fin de que el colorante primario, la carbofulcsina, penetre a través de las cápsulas cerosas de los
bacilos acidorresistentes, se requiere cierto tipo de tratamiento físico. En la técnica convencional de
Ziehl-Neelsen se utiliza calor. Luego de cubrir con carbolfucsina la superficie de extendido a teñir,
se pasa varias veces a través del portaobjeto la llama de un mechero hasta que se observa
desprendimiento de vapor de la solución colorante Es preciso evitar que se produzca ebullición.
La modificación de Kinyoun de la coloración acidorresistente se denomina “método en frío" debido

a que en lugar de emplear calor para facilitar la tinción, se añade a la carbolfucsina un detergente
tensoactivo, el Tergitol. Cualquiera de estos dos métodos resulta satisfactorio.
Los colorantes fluorocrómicos tales como la auramina y la rodamina, poseen la propiedad de teñir
selectivamente las cápsulas de las micobacterias, fijando el ácido micólico a la pared celular,
produciendo un brillo verde o amarillo verdoso cuando se observan en un microscopio de
fluorescencia. Los colorantes fluorocrómicos hacen que el examen de los extendidos sea mucho
más rápido, pues la técnica utilizada es más sensible y resalta a simple vista los bastoncillos
brillantes contra un fondo oscuro.
Método de Zlehi – Neelsen:

Componentes:
Carbolfucsina:
Fenol (cristales) 2.5 g
Alcohol, 95 % 5.0 ml
Fucsina básica 0.5 g
Alcohol ácido, 3 %:
HCl concentrado 3.0 ml
Alcohol, 70 % 100 ml
Azul de metileno:
Azul de metileno 0.5 g
Acético glacial 0.5 ml
Para la coloración de contraste algunos prefieren una solución acuosa al 0,5% de verde brillante o
una solución saturada de ácido pícrico; este último es pálido y no tiñe selectivamente el material
celular.
1. Preparar un extendido de espesor adecuado, secar y fijar mediante calor.
2. Colocar sobre el extendido una tira de papel de filtro que debe ser algo más pequeña que el
portaobjeto.
3. Bañar el portaobjetos con colorante de carbolfucsina; calentar hasta que desprenda vapor, con
un mechero de llama reducida. No dejar hervir y no permitir que se seque.
4. Dejar reposar 5 minutos sin calentar más; retirar entonces el papel y lavar el portaobjetos con
agua corriente.
5. Decolorar con alcohol-acido hasta tener un color rosado pálido, agitando continuamente el
portaobjetos hasta que no aparezca más colorante en el enjuague (1 minuto, más o menos, para
los extendidos de espesor promedio). Es esencial la perfecta decoloración para evitar la
posibilidad de un resultado falso positivo.
6. Lavar con agua; contracolorear con azul de metileno durante 20 a 30 segundos.
7. Lavar con agua, dejar secar al aire y examinar con lente de inmersión en aceite.
Método de la carbolfucsina de Kinyoun:

Componentes:
Fucsina básica 4g
Fenol 8 ml
Alcohol do 95° 20 ml
Agua desfilada 100 ml
Disolver la fucsina básica en alcohol y agregar lentamente el agua, agitando al mismo tiempo.
Derretir el fenol en un baño de María de 56ºC y agregar 8 ml al colorante, utilizando para ello una
pipeta con bulbo de goma.
Colorear el extendido fijado con calor, durante 3 a 5 minutos (no es necesario calentar), y continuar
como para la coloración de Ziehl-Neelsen.
Se puede acelerar la coloración de los microorganismos acidorresistentes con el agregado de un
detergente o un agente humectante. Se puede utilizar Tergitol N° 7; agregar una gota de éste cada 30
a 40 ml del colorante de carbolfucsina de Kinyoun. Colorear los extendidos durante 1 minuto,
decolorar y contracolorear tal como se describe en el método de Ziehi-Neelsen.
Procedimiento con fluorocromo

Utilizando colorantes fluorescentes, como laauramina y la rodamina, y examinando el extendido por
microscopio de fluorescencia por medio de una fuente de luz ultravioleta, los bacilos
acidorresistentes que pudieran existir aparecen brillantes, con un color amarillo-anaranjado.
Resultan visibles con poca magnificación; de tal modo, se puede examinar un extendido coloreado
en mucho menos tiempo que el necesario para los métodos habituales.
Componentes
Auramina O 1.5 g
Rodamina B 0.75 g
Glicerina 75 ml
Fenol 10 ml
Combinar las soluciones, mezclar bien (usando un aparato de agitación magnética durante 24 horas
o calentando hasta que esté caliente y agitando enérgicamente durante 5 minutos), filtrar a traves de
lana de vidrio, y guardar en frasco con tapón de vidrio, a 4°C. El colorante se mantiene estable
durante varios meses, refrigerado.
1. Fijar por calor sobre un calentador de portaobjetos durante 2 horas a 65°C, o durante toda la
noche.
2. Cubrir el extendido con la solución de auramina y rodamina.
3. Colorear durante 15 minutos a la temperatura del ambiente o a 35°C.
4. Lavar con agua destilada.
5. Decolorar con ácido clorhídrico al 0,5% en alcohol etílico de 70º, durante 2 a 3 mininos, y
enjuagar bien con agua destilada.
6. Inundar el extendido con contracolorante, una solución de permanganato de potasio al 0.5%
(filtrar y guardar en frasco de color caramelo), durante 2 a 4 minutos (la exposición excesiva
daría como resultado la falta de brillo).
7. Enjuagar con agua destilada, secar y examinar.
Coloración de Cápsula
La cápsula de las bacterias no tiene la misma afinidad por los colorantes que otros componentes de
la célula, y por eso exige el empleo de métodos de coloraciones especiales.
Algunos están destinados a colorear la célula y el fondo, pero no la cápsula, de manera que la
envoltura se aprecia por contraste, como en el método de Anthony. Otros procedimientos producen
un efecto colorante diferencial, cuando la cápsula admite un contracoloreante, como en el método
de Muir. Otro procedimiento utiliza el principio de la
Coloración negativa, en el cual se ven las cápsulas como un halo claro contra un fondo oscuro,
corno en el método de la tinta china.
Método de Anthony
1. Preparar un extendido fino y uniforme de un cultivo efectuado en leche desnatada o leche
tornasolada, extendiéndolo con un portaobjeto en ángulo recto. Si no se trata de un cultivo en
leche, se podrá mezclar una parte del material recogida con un asa bacteriológica, con una
cantidad igual de leche desnatada, extendiéndola para obtener una base uniforme.
2. Secar al aire. No fijar por calor
3. Colorear con solución acuosa de cristal violeta al 1%, durante 2 minutos.
4. Lavar con una solución de sulfato de cobre al 20%.
5. Dejar secar al aire en posición vertical y examinar con la lente de inmersión en aceite. La
cápsula aparece sin colorear contra un fondo de color púrpura; las células se tiñen intensamente.
Método de Hiss
Mezclar la cantidad recogida con un asa bacteriológica de una suspensión de crecimiento en
solución fisiológica, con una gota de suero normal sobre un portaobjetos. Dejar secar el extendido
al aire y fijar por calentamiento. Bañarlo con cristal violeta (en solución acuosa al 20%). Pasar el
preparado por vapor suave durante 1 minuto y lavar con solución acuosa de Sulfato de cobre al 2%.
Aparecen las cápsulas en forma de halo do color azul pálido alrededor de las cápsulas que toman un
color azul oscuro a púrpura.
Método de la tinta china

En el método de la tinta china, la cápsula desplaza a las partículas de carbono coliodal de la
Tinta y aparece como un halo claro alrededor del microorganismo. Se recomienda este método
especialmente para poner de manifiesto las cápsulas del Cryptococcus neoformens.
1. Se coloca sobre un portaobjeto limpio una pequeña cantidad, recogida con un asa
bacteriológica, de solución fisiológica, agua o caldo y se le agrega una pequeñísima cantidad de
crecimiento de un cultivo en agar joven, utilizando una aguja de inyecciones.
2. Mezclar bien; agregar luego una pequeña cantidad de tinta china, recogida con una asa, y cubrir
inmediatamente con un cubreobjetos fino. dejando que el líquido se extienda para formar
debajo del mismo una película delgada.
3. Examinar inmediatamente con el objetivo de inmersión en aceite, reduciendo
considerablemente la luz bajando el condensador. Las cápsulas, si existen, se observan como un
halo claro sobre un fondo oscuro.
Método de Muir
Componentes:
Mordiente de Muir
Ácido Tánico, solución acuosa al 20% 2 partes
Solución acuosa saturada de cloruro de mercurio 2 partes
Solución acuosa saturada de alumbre potásico 5 partes
1. Preparar un extendido de bacterias, fino y uniforme; dejar secar al aire.

2. Cubrir con un trozo de papel de filtro, del tamaño del extendido, y bañar el portaobjetos con
carbolfucsina de Ziehi-Neelsen.
3. Calentar sobre un mechero hasta que se desprenda vapor, durante 30 segundos.
4. Enjuagar con alcohol etílico de 95° y después con agua.
5. Agregar el mordiente durante 15 a 30 segundos: lavar bien con agua.
6. decolorar con alcohol etílico hasta lograr un color rasado pálido: lavar con agua.
7. Contracolorear con azul do metileno al 0,3% durante 30 segundos.
8. dejar secar al aire y examinar con el objetivo de inmersión. Las células se colorean de rojo y las
cápsulas de azul.
Coloración de flagelos
Todas las bacterias móviles tienen flagelo, cuya forma, cantidad y ubicación constituyen
características importantes en la diferenciación de género e identificación de especies,
particularmente cuando las reacciones bioquímicas son débiles o dudosas.
Los flagelos son apéndices frágiles, termolábiles y requieren un trato cuidadoso y la coloración por
procedimientos especiales para poder observarlos. El éxito de la coloración depende de la frescura y
la eficacia da mordiente. Como los flagelos se hallan fuera del poder de resolución del microscopio
óptico común, para poder visualizarlo es necesario aumentar su tamaño. Esto se consigue cubriendo
su superficie con un precipitado de una suspensión coloidal inestable (el ordiente). El precipitado
sirve entonces como una capa de material teñible, y cuando se aplica el colorante adecuado aparece
la estructura filamentosa de los flagelos.
Se pueden usar diferentes métodos, pero uno de los más utilizados es el de Gray. West y Col.
propusieron un método simplificado de la coloración argéntica de las placas. Forbes describió una
modificación rápida y simplificada de la coloración de Leifson.
Mordiente
Alumbre potásico, solución acuosa saturada 5 ml
Ácido tánico, solución acuosa al 20 % 2 ml
Cloruro de mercurio, solución acuosa saturada 2 ml
Mezclar y agregar 0,4 ml de una solución alcohólica saturada de fucsina básica. Preparar el
mordiente para uso, todos los días.
Método de Gray
1. Se utiliza un portaobjetos libre de grasa que se haya pasado por la llama y enfriado, y se
extiende sobre el mismo una gota de agua destilada para cubrir un área de 2 cm cuadrados
aproximadamente.
2. De un cultivo de agar joven, seleccionar parte de una colonia, o tomar una pequeña cantidad del
crecimiento en un cultivo en pico de flauta, por medio de una aguja de inyecciones, y tocar
ligeramente la gota de agua, en distintos sitios; hacer girar suavemente el portaobjetos.
3. Dejar secar al aire. No calentar.
4. Agregar el mordiente, y dejar actuar durante 10 minutos.
5. Lavar con cuidado con agua destilada o agua corriente limpia.
6. Agregar carbolfucsina de Ziehl-Neelsen y dejarla de 5 a 10 minutos.
7. Lavar con agua corriente, dejar secar al aire y examinar con objetivo de inmersión.
Coloración argéntica para flagelos

Solución a (mordiente o precolorante)
Solución acuosa saturada de sulfato de alumbre potásico (aproximadamente 14 g/100 ml de agua)
mantener como solución madre) 25 ml
Acido tánico. 10% 50 ml
Solución de cloruro férrico, 5% (mantener como solución madre) 5 ml
Combinar y guardar en un frasco de color ámbar a la temperatura del ambiente. La solución se

mantiene estable durante varios meses.
Solución B (Colorante argéntico)

1. Preparar 100 ml de la solución de nitrato de plata al 5 %.
2. Agregar hidróxido de amonio concentrado (2 a 5 mi), gota a gota, a 90 ml de la solución de
nitrato de plata al 5%, hasta que el precipitado color castaño formado se vuelva a disolver.
3. Agregar a la solución parte del nitrato de plata al 5% restante, gota a gota, hasta que persista
una ligera turbiedad.
4. Guardar la solución en un frasco de color ámbar a la temperatura del ambiente. La solución se
mantiene estable durante varios meses.
Método de coloración
1. Marcar y pasar por la llama portaobjetos adquiridos ya limpios, para quemar todo residuo.
Mientras todavía están calientes, se traza una línea gruesa con lápiz de cera para reducir la
cantidad de colorante necesario (opcional).
2. Utilizando el crecimiento de cultivos de 18 a 24 horas en picos de flauta de agar con infusión de
corazón o tripticasa de soya, incubados a 35°C, preparar una suspensión poco abundante de
microorganismos en 3 ml de agua destilada estéril (no usar otro líquido para la suspensión que
no sea agua destilada o caldo nutritivo). La suspensión debe ser apenas turbia, de acuerdo con
un estándar de Mcfarland de menos de 0.5.
3. Sobre el portaobjetos pasado por la llama, colocar con un asa una cantidad abundante de la
suspensión del cultivo y dejarlo que se extienda hasta los extremos. Secar al aire. No es
necesario fijarlo.
4. Colocar el portaobjetos sobre una gradilla para coloración y bañar con la solución A. dejarla 4
minutos y enjuagar después con agua desfilada.
5. Bañar el portaobjetos con la solución B, y calentar hasta que empiece a desprenderse vapor
pasando un mechero por debajo del portaobjetos mantenido en su soporte. Retirar el mechero,
dejar que el portaobjetos se coloree durante 4 minutos, enjuagar con agua destilada y dejar secar
en posición inclinada.
Coloración para gránulos metacromáticos

Se han elaborado diversos métodos para la coloración de los gránulos metacromáticos, algunas
mejores que otras pero las que han dado óptimos resultados son la coloración de azul de metileno y
la coloración do Albert.
Coloración de azul de metileno

Propósito: Es una coloración simple, directa utilizada para teñir una variedad de microorganismos,
empleada específicamente en la identificación de Corynebacterium diphtheriae, en el cual los
gránulos metacromáficos se tiñen intensamente diferenciándose del citoplasma azul, más claro.
Componentes
Azul de metileno 0.3g
Alcohol etílico de 95° 30 ml
Una vez disuelto, agregar:
Agua destilada 100 ml.
Procedimiento:
Cubrir con la solución de colorante el extendido previamente fijado con calor, y dejar durante un
minuto. Lavar con agua y secar con papel secante.
Los gránulos captan rápidamente el colorante y aparece do color azul intenso. La coloración
excesiva disminuye el contraste.
El colorante de azul de metileno de Loeffier usado antiguamente, se preparaba con el agregado de
álcalis a la solución mencionada. El azul de metileno que se obtiene actualmente no requiere la
adición de éste, El álcalis era empleado por que el colorante de entonces contenía impurezas ácidas.
Método de Albert
El método de Albert es una coloración diferencial, que se recomienda por su sencillez para la
tinción del Corynebacterium diphtheriae.
1. Preparar el extendido y fijarlo por calor.
2. Bañarlo con colorante de Albert durante 3 a 5 minutos.
3. Lavar con agua corriente y escurrir el excedente.
4. Bañar con solución de yodo de Gram. Dejar reaccionar por 1 minuto.
5. Lavar, secar con papel, y examinar.
Los gránulos aparecen de un color azul oscuro las bandas de color azul a azul verdoso y el
citoplasma, verde.
Coloración en esporas:
Las esporas son relativamente resistentes a los agentes físicos y químicos y no se colorean con
facilidad. En los métodos de coloración de rutina como la coloración de Gram, aparecen como
cuerpos refráctiles no coloreados. Por lo general, en los métodos especiales de coloración se
requiere el calor para permitir la penetración del colorante en las esporas.
El método de Dorner o su modificación a dado buenos resultados.
Metodo de Dorner:
Reactivos:
Nigrosina 10 g
Hervir durante 30 minutos, agregar 0.5 ml de formol una vez frío, filtrar con papel y guardar en
volúmenes de 2ml, en tubos estériles tapados con corcho.
1. Preparar una suspensión abundante de los microorganismos en agua destilada, en un tubo de
ensayo, y agregar un volumen igual de carbolfucsina recién filtrada.
2. Colocar el tubo en un baño de Maria hirviendo durante 5 a 10 minutos.
3. Mezclar sobre un portaobjetos limpio la cantidad recogida con un asa de la suspensión anterior,
con el mismo volumen de una suspensión acuosa al 10% de nigrosina hervida y filtrada.
4. Extender y secar rápidamente la película por medio de calor suave.
5. Examinar con aceite de inmersión. Las esporas se colorean de rojo y las células bacterianas
aparecen casi incoloras contra un fondo gris oscuro.
Se puede emplear una modificación del método de Dorner. Se prepara y fija un extendido del
cultivo; se cubre con una tira de papel de filtro; a la que se habrá agregado la carbolfucsina. Se
caliente el colorante hasta que desprenda vapor, durante 5 a 7 minutos sobre un mechero y se retira
el papel de filtro. Lavar con agua, secar con un papel y cubrir con una delgada capa de nigrosina. El
aspecto de las células es el que ya se describió.
Método de Wirtz - Conklin

Bañar todo el portaobjetos con una solución acuosa de verde de malaquita al 5%. Calentar al vapor
durante 3 a 6 minutos y enjuagar con agua corriente. Contracolorear con solución acuosa de
safranina al 0.5% durante 30 segundos. Se observan las esporas en forma de esférulas verdes en los
bastoncillos coloreados de rojo o junto con desechos de color rojo.
Coloración en relieve
Esta coloración no tiñe las células microbianas sino que produce un fondo oscuro contra el cual se
aprecian las células en relieve, como objetos blancos o claros. Imita a la microscopia de campo
oscuro y permite un rápido estudio de la morfología.
Método de Dorner
1. Colocar una cantidad de la suspensión bacteriana recogida con un asa. sobre un portaobjetos
limpio y agregar inmediatamente, también con el asa tomar un pequeño volumen de solución de
niqrosina al 10% hervida y filtrada como se describió anteriormente.
2. Extender para formar una película delgada.
3. Secar al aire o acelerar la desecación por medio de calor suave.
4. Examinar con el objetivo de inmersión.
5. Las células aparecen sin colorear contra un fondo oscuro.
COLORACIÓN DE ESPIROQUETAS
En general las espiroquetas tienen poca afinidad para las coloraciones estándar y requieren
coloraciones especiales, como el método de impregnación argéntica. La coloración de fontana ha
dado buenos resutados
COLORACIÓN DE RICKETTSIAS
Aun cuando las Rickettsias son gramnegativas, no responden bien a la coloración de Gram y se
colorean mejor por el método de Giemsa o de Castañeda.
Colorante de Castañeda
Reactivos:
Solución A:
Fosfato de potasio (KH2PO4 )
(Solución acuosa al 1%) 100 ml
Fosfato de sodio (Na2 HPO4.12 H2O)
(Solución acuosa al 25%) 100 ml
Mezclar y agregar 1 ml de formol.
Solución B:
Alcohol metílico 100 ml
Azul de metileno 1g
Mezclar 20ml de la solución A con 0.15 ml de la solución B y agregar 1 ml de formol
Solución C (contracolorante):
safranjna O
(Solución Acuosa al 0.2%) 25 ml
Ácido acético (0.1%) 75 ml
1. Preparar un extendido homogéneo y secar al aire.

2. Cubrir la película con el colorante (mezcla de las soluciones A y B).
3. Dejar escurrir el colorante. No lavar.
4. Contracolorear con safranina O (solución C) durante 1 a 4 segundos.
5. Lavar con agua corriente. Secar con papel.
6. Examinar con la lente de inmersión en aceite.
7. Las rickettsias se colorean de azul, mientras que los elementos celulares toman el color rojo
Coloración de Giemsa
Se prepara el colorante de Giemsa disolviendo 0,5 g de polvo en 33ml de glicerina a 55°C a 60°C
durante 1 y media a 2 horas. A esto se agregan 32 ml de alcohol metílico absoluto, libre de acetona.
Se mezcla bien la solución y se deja sedimentar; se guarda a la temperatura del ambiente como
solución madre. Para efectuar las diluciones del colorante madre se utiliza agua destilada neutra o
agua amortiguada.
1. Preparar un extendido homogéneo sobre un portaobjeto limpio. Dejar sacar al aire.

2. Bañar con alcohol metílico durante 1 minuto.
3. Escurrir el alcohol y dejar secar.
4. Cubrir la película con el colorante de Giemsa (15 gotas) y dejar que reaccione durante un
minuto.
5. Agregar agua destilada (30 gotas) y continuar la coloración durante 5 minutos- Escurrir.
6. Lavar con agua destilada dejar secar al aire.
7. Examinar con el lente de Inmersión en aceite. Las rickettsias se colorean de un color púrpura
azulado.
COLORACIÓN DE LEVADURAS Y HONGOS

Los extendidos de levaduras fijados se pueden colorear fácilmente con cristal violeta o azul de
metileno, si se aplican estos colorantes durante 30 a 60 segundos o mediante el método de Gram.
El montaje húmedo de levaduras se colorea eficazmente con azul de metileno o la solución yodad
de Gram. Se pueden suspender las células en una gota de cualquiera de estos colorantes, seguido
por la aplicación del cubreobjetos. Como alternativa se pueden colocar en el borde del cubreobjetos
una pequeña gota del colorante, el que se distribuye rápidamente por debajo del mismo al apoyarlo
sobre el cubreobjetos. El lactofeno - azul de Poirrier es excelente para la tinción de los hongos.
COLORANTES UTILIZADOS COMÚNMENTE EN PARASITOLOGÍA

La demostración del parásito en un examen directo es el mejor método para establecer una
infección, las pruebas inmunológicas como ELISA o IFI, son importantes en el diagnóstico de
algunas parasitosis pero no siempre es posible realizarlas.
Para examinar una muestra. Es mejor hacerlo en el menor tiempo posible después de después de
haber sido colectada. El principal factor del cual se debe proteger especialmente es el cambio
extremo de temperatura.
Si el análisis de la materia fecal se demora no se debe mantener tibia por medios artificiales, ya que
este procedimiento puede dañar la estructura de algunas de las formas parasitarias.
Preservantes
Una solución simple no es siempre recomendable como preservante para todas las formas
diagnósticas y proporcionar al mismo tiempo material que puede ser concentrado y coloreado
permanentemente. Para asegurar un material adecuado es necesario proveer más de un preservante.
MIF
a. Ventajas y desventajas
Se recomienda cuando se puede hacer un sólo procedimiento. En este caso se emplea para preservar
quistes, trofosolfos, huevos y larvas. La solución debe adicionarse directamente en el laboratorio.
La mayoría de quistes y/o los trofozoitos pueden ser diagnosticados en montajes frescos.
Reactivos
1. Solución Stock MF (estable)
Formaldehído (USP) 5 ml
Tintura de merthiolate 40 ml
Glicerina 1 ml
Mezclar. Almacenar en botellas oscuras. Se debe preparar cada tres semanas para que se encuentre
fresco al momento de su uso.
Nota: La tintura de merthiolate No. 99, 1:1000 Eli Lily y Co., es la apropiada ya que contiene la
eosina que es elemento colorante.
2. Solución Lugol
Cristales de yodo (en polvo) 5g

Yoduro de potasio 10 g
Disiolver el ioduro de potasio en el agua destilada. Adicionar los cristales de yodo lentamente y
batir hata disolver. Filtrar. Almacenar en una botella oscura. Preperar solución fresca después de
transcurridas tres semanas.
Procedimiento
1. Adicionar 0.15 mil de solución de lugol a 2,35 ml de solución stock MF inmediatamente antes
de usarla. El agregar lugol adicional produce un precipitado denso y el iodo no colorea
aproximadamente los Protozoarios.
2. Mezclar fuertemente una porción de heces más o menos del tamaño de un arveja (0.3 a 1.0 gr)
en la solución MIF (aproximadamente una parte de heces a dos o tres partes de preservante). No
usar mucha materia fecal, si se desea incluir más heces se debe aumentar proporcionalmente el
MIF.
3. El espécimen puede concentrarse o preparaciones directas pueden ser hechas de una gota de las
heces sedimentadas tomadas del extremo superior del sedimento.
Formol como preservante

El formol no es el preservante perfecto, pero es satisfactorio para colectar especimenes para el
posterior examen de huevos, larvas y quistes. Es preferible utilizar formol al 10% ya que los huevos
de Ascaris y trichuris continúan de desarrollándose en concentraciones de 5%.
Reactivos
Formol al 10%
Formol comercial 25 ml
Agua de chorro o destilado 75 ml
Lugol
Tiene la misma concentración del utilizado en el MIF. Pero hay que recordar que es más
concentrado que el de Gram, quince veces. Algunos parasitólogos consideran el ioduro de Gram
muy diluido, pero el lugol es demasiado fuerte.
COLORACIÓN PARA TREMATODOS
Reactivos
AFA
Alcohol etílico 50 ml
Formol 10 ml
Ácido acético 5 ml
Glicerina 10 ml
Carmín ácido láctico de Blanchi

Carmín 0.6 g
Ácido láctico al 30% 200 cc
Disolver a ebullición, enfriar y filtrar.
Procedimiento:
Se coloca el tremátodo entre dos láminas sostenidos por bandas de caucho en sus extremos, se
coloca en fijador AFA (alcohol-formol- ácido acético) y dejarlo sumergido un día.
Se coloca luego en una solución Carmín-Ácido láctico de Blenchi. Endurecer por deshidratación en
etanoles de concentración de 70%, 80%, 90% y 100%, luego pasar a aceite de clavo o creosota para
aclarar el espécimen.
Cuando se requiere un diagnóstico rápido de una proglotide se omite el paso de coloración y al

aclarar se logra una buena visualización de las ramificaciones uterinas.
COLORACIÓN TRICRÓMICA
Es un procedimiento rápido y fácil de hacer. Dé muy buenos resultados para propósitos de rutina.
La sobrecoloración y la dfierenciación no dañan los parásitos. Otra ventaja sobre la hemotoxilina
férrica es que no necesita mordiente.
Las características de la coloración son las siguientes:
1. El citoplasma de los organismos propiamente fijados y coloreados es verde azuloso, con un

moteado púrpura. Ocasionalmente, los quistes de Entamoeba coli colorean más púrpura que los
de las otras especies. La cromatina nuclear, los cuerpos cromatoides y los eritrocitos colorean
de rojo o rojo púrpura. Otras partículas ingeridas como levaduras, generalmente colorean de
verde. El material de fondo generalmente colorea de verde, lo que contrasta fácilmente con los
protozoarios.
2. Cuando los quistes no colorean o colorean predominantemente de rojo se asocia usualmente con
una fijación incompleta. Los organismos quo colorean de verde pálido se asocian formas en
proceso de degeneración.
3. Los huevos y larvas colorean de rojo y contrastan fuertemente con el color verde del medio.
Reactivos
La coloración es estable y puede usarse repetidamente. Se reemplaza el volumen perdido
adicionando solución stock. Sin embargo, la coloración se debilita cuando se colorean bastantes
láminas en corto tiempo. Su fortaleza se puede restaurar cuando se deja evaporar al aire por 3 a 8
horas.
Las soluciones utilizadas en el procedimiento de la coloración tricrómica son los siguientes:
A. Coloración Tricrómica
Cromotropo 2R 0.60 g
light Green SF 0.15 g
Fast Green FCF 0.15 g
Ácido fasfotúngstico 0.70 g
Ácido acético (glacial) 100 ml
1. Coloque los colorantes secos en un recipiente limpio

2. Adicione el ácido acético glacial, agite hasta mezclar. Permita que la mezcla repose por
minutos.
3. Adicione el agua destilada. Agite hasta mezclar.
4. La buena coloración es púrpura oscuro casi negro.
Solución de Decoloración (alcohol-ácido)
Ácido acético (glacial) 0.5 ml

Alcohol etílico 90% 100 ml
Agregue 0.5 ml. de ácido acético glacial a cada 100 ml de alcohol etílico de 90% usado hasta llenar
la caja de coloración.
Procedimiento para colorear láminas fijadas con Schaudinn.
1. Realice el extendido y no lo deje secar

2. Transfiera las láminas a alcohol iodado por 5 minutos
3. Páselas luego las láminas en alcohol al 70% por 3 minutos
4. Pase las láminas por un segundo baño de alcohol de 70% por 1 minuto.
5. Coloree las láminas en el tricromo por 2-8 minutos
6. Decolore las láminas en alcohol acidificado, por 10 a 20 segundos o hasta que no salga mas
color de la lámina. Una decoloración prolongada provoca que los organismos no se diferencien
7. Las láminas deben pasarse por dos cambios de alcohol de 95%. Si se decoloran muchas
láminas, cambie el primer alcohol en que se juago frecuentemente para prevenir que las láminas
se decoloren excesivamente.
8. Pase las láminas por la solución de aclaramiento xilol-fenol por 1 minuto
9. transferir a xilol por 1 minuto o hasta que la refracción en la interfase de la lámina y el xilol
termine.
10. Monte con un medio de montaje que se pueda disolver en xilol o toluol.
COLORACION TRICROMICA MODIFICADA PARA LA VISUALIZACIÓN DE

MICROSPORIDIOS
A. Cromatropo Modificado
Cromotropo 2R 6.0 g. (10 veces la concentración del anterior)

Fast grenn 0.15 g
Ácido fosfotúngstico 0.7 g
Se almacenan los reactivos en 3 ml de ácido acético glacial por 30 minutos, depués se agregan 100
ml de agua desfilada.
B. Alcohol ácido
Ácido acético 4.5 ml

Alcohol etílico de 90% 995.5 ml
1. Se preparan láminas para examen microscópico do materia con alícuotas de 10  de una

suspensión sin concentrar de heces en formal (relación 1:3).
2. Fijación en metanol por 5 minutos
3. Coloración por 90 minutos con el cromotropo modificado.
4. Las láminas se decoloran en alochol-ácido por 10 segundos.
5. Enjuague suave en alcohol de 95%.
6. Deshidratación sucesivas en alcohol de 95% por 5 minutos
7. Sumergir las láminas luego en alcohol de 100% por 10 minutos
8. Realice una inmersión de la lámina en Hemo-De (un sustituto del Xilol) por 10 minutos.
COLORACIÓN DE FIELD
AZUL DE METILENO AMORTIGUADO O FOSFATADO

1. Solución amortiguadora de acetato
Solución Madre A
Solución 0.2 M. de ácido acético (11.55 ml, en 1000 ml de agua destilada)
Solución B:
Solución 0.2 M de acetato de sodio (16.0 g de NaC 2H3O2) o 27.2 g de NaC2H3O2 3H2O en 1000 ml
de agua destilada)
pH A B
3.6 46.3 ml 3.7 ml
3.8 44.0 6.0
4.0 41.0 9.0
4.2 36.8 13.2
4.4 30.5 19.5
4.6 25.5 24.5
4.8 20.0 30.0
1. Precoloración
La láminas deben utilizarse lo más frescas posibles
Azul de metileno fosfatado
1. Cloruro de azul de metileno (medicinal) 1.0 g.

2. Ortofosfato disódico anhidro (Na2HPOi) 3.0 g.
3. Ortofosfato monopotásico (KH2HPO4) 1.0 gr
Tinture muy bien las sales en un morero seco hasta lograr una mezcla homogénea. Colocar 1.0 g de
la muestra por cada 250-300 ml. de agua destilada certificada. Filtrar y alicuotar. Guardar a 4°C., se
ha probado buen funcionamiento cuando se le agregan 0.8 g y se disuelver en 200 ml de agua
destilada.
Almacenar en frasco oscuro, para el uso diana tome una alícuota en un frasco oscuro de boca ancha,
tenga el cuidado de filtrar semanalmente y de cambiar la solución de azul de metileno fofatado cada
mes. Se debe lavar bien el frasco antes de envasar la nueva.
2. Coloración
Romanoswsky modificado
Cloruro de azul de metileno medicinal 0.8 g
Azur 1 o azur B (certificado) 0.5 g
Disolver en 250 ml de solución amortiguada
Eosina amarillenta (hidrosoluble) 1.0 g.
Disolver en 250 ml de solución amortiguada
Guardar en frascos ámbar a 4°C. Filtrar kw soluciones cada quince días
Solución amortiguadora
Ortofosfato disódico anhidro (Na2HPO4) 10.0 g
Ortofosfato monopotásico (KH2PO4) 5.0 g
Mezclar bien en un mortero y disolver 1 gr. De la mezcla en un litro de agua destilada certificada.
El pH debe estar en 7.2, para ajustarlo se utiliza la solución amortiguadora apropiada.
Procedimiento
Precoloración
1. Sumergir la gota gruesa en azul de metileno por 1 a 2 segundos, Escurrirlo en una esponja
húmeda, gasa o papel absorbente.
2. Enjuagar con solución amortiguadora hasta que los bordes de la muestra tomen una coloración
ligeramente gris-azulada. No colorear hasta la desaparición del color rojo de toda la gota
gruesa, (5 inmersiones suaves son suficientes). Cambie la solución amortiguadora cuando note
demasiado azul.
3. Deje escurrir las láminas cuando no se puede utilizar el colorante de Field inmediatamente,
seque las láminas con calor suave o al aire para evitar contaminación con hongos; se envuelven
y guardan en un lugar seco (hasta por una semana, antes de colorear).
Coloración
1. Por cada lámina a colorear se agregan 3 ml de solución amortiguada, 1 gotas de solución a, y 1

gota do solución B. en un tubo. Mezcle suavemente por inmersión.
2. Colocar los preparados con la cara hacia la concavidad de la placa y adicionar la solución
colorante evitando la formación de burbujas por 9 minutos (este tiempo puede variar).
3. Lavar por el respaldo, no deje que el agua le caiga a la mezcla porque se le desprende.
4. Escurrir y secar.
COLORACIÓN DE GIEMSA PARA FROTIS DE SANGRE Y MICROFILARIAS SANGUÍNEAS
REACTIVOS
1. Agua amortiguada
a Fosfato de sodio dibásico M/15 (Solución stock A)
Fosfato ale sodio dibésico (Na2HP04) 9.5 gr

Agua destilada 1000.00 ml
En un balón volumétrico de 1000 ml. Disolver el fosfato en una porción del agua destilada y luego
llevar a la marca con el resto del agua destilada.
b. Solución de fosfato monobásico M/15 (solución stock B).
Fosfato do sodio monobásico (NaH2PO4.2H2O) 9.2 gr

Agua destilada 1000. 0 ml
En un balón volumétrico disolver el fosfato en una porción del agua destilada y después diluir hasta
la marca con el agua desfilada restante.
COLORACIÓN DE GIEMSA PARA EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFÉRICA PARA EL

DIAGNOSTICO DE MALARIA
Coloración de Giemsa
Utilizando el Azure B prepare una solución stock, como ya se indicó para las microfiliarias la
solución buffer y el agua tamponada son las ya descritas anteriormente.
Procedimiento
1. Adicione una parte de colorante de Giemsa a 50 partes de agua tamponada, solución de trabajo,
pH 7.2.
2. Fije el extendido delgado solamente por 1 minuto en metanol. No permita que el metanol toque
la gota gruesa.
3. Deje que la lámina se seque y luego coloque la lámina completa en solución colorante por 45
minutos.
4. Remueva y sumerja suavemente la lámina en solución de trabajo pH 7,2.
5. Sumerja la porción gruesa solamente en agua tamponada solución de trabajo pH 7,2 por 3 a 5
minutos.
Los factores que se deben controlar en este paso son: la edad o tiempo de preparación del frotis,
grosor de la lámina y densidad del colorante. Las láminas muy frescas requieren poco lavado, lo
mismo que los frotis delgados. Si una lámina aparece de un azul profundo después de lavar se debe
sumergir rápidamente en agua destilada no tamponada. la cual usualmente es ácida y da una mejor
imagen al microscopio.
6. Remueva la lámina del agua y deje secar al aire, parándola sobre papel absorbente. Nunca
coloque los extendidos sobre este. Un secador de pelo puede facilitarle el trabajo, pero el calor no es
conveniente porque se quedan restos de colorante este puede secarse sobre el frotis y dañar la
visualización.
COLORACIÓN RÁPIDA DE WRIGHT GIEMSA
1. Preparación del colorante
Se disuelven 2 grs de polvo de Giemsa en 100 ml, de glicerina,(si es posible de una botella recién
abierta) se coloca al baño de María a 55º-60ºC, por 2 horas, se mezcla bien con perlas de vidrio a
intervalos. Evite que la mezcla adquiera humedad tapando el recipiente que la contiene, con doble
papel.
A esta mezcla adicione 100 ml, de Wright madurado el cual se prepara adicionando 2 grs, de polvo
de Wright en 1000 ml de alcohol metílico, deje reposar durante un día y agregue 800 ml de la
solución de Wright, filtrar y usar.
Procedimiento
1. Preparar una solución conteniendo una parte de colorante Giemsawright y 9 partes de agua
tamponada de trabajo pH 7.2.
2. Coloque la solución de coloración sobre las láminas en una caja de coloración.
3. Coloree por 10 minutos.
4. vierta agua tamponada pH 7.2 desde la punta de la caja de coloración, remueva las láminas y
lávelas por 1 minuto con agua tamponada.
5. Seque les láminas a temperatura ambiente.
I. COLORACIÓN RÁPIDA DE GIEMSA
Use el colorante de Giemsa, tipo Azure B, como se indicó para la coloración de microfiliarias.
Para preparar la solución de trabajo adicione dos parte de Giemsa a 50 partes de agua tamponada
solución de trabajo pH 7.2. Esta doble coloración de Giemsa funciona mejor en las láminas
delgadas que la coloración regular de Giemsa.
1. Sumerja las láminas en la solución colorante por 20 minutos.
2. Ponga las láminas en agua tamponada solución de trabajo para lavar los frotis. La parte de la
gota gruesa solo se sumerge por 3 a 5 minutos. Las propiedades de edad y grosor de los frotis
mencionados antes influyen en esta coloración.
3. Seque al aire. No le coloque encima nada para secar.
II. COLORACIÓN RÁPIDA DE GIEMSA
Se coloca colorante de Giemsa en una proporción 1:9 en agua tamponada pH 7.2

1. Se colocan las láminas en la caja de coloración en el colorante por 6 a 9 minutos dependiendo
del grosor del extendido. (cuando el extendido es dejado 9 minutos, criando es muy grueso 6 ó
7 minutos es suficiente).
2. Se lavan con agua tamponada
3. Se observan al microscopio con objetivo de inmersión.
MEDIOS DE MONTAJE
Un buen medio de montaje debe unir rápida, eficaz y duraderamente la preparación, o sea el porta y
cubreobjetos, ser químicamente neutro, perfectamente transparente y desprovisto de color no
alterarse con el tiempo y sobre todo poseer un índice de refracción elevado a fin de revelar al
máximo las diferencias de refringencia entre el medo y las estructuras a estudiar. El índice de
refracción varía entre 1,42 y 1,6.
Medios no miscibles con el agua: estos medios son generalmente los más usados, pues su empleo
es fácil, su conservación prácticamente ilimitada y su índice de refracción elevado.
- Bálsamo de Canadá: se deriva de una resina natural extraída de diversas conníferas de

América del norte. Es barato, de uso fácil, necesita en cambio largo tiempo para secar y con el
tiempo se amarilla.
- El Aceite de cedro espeso: posee un índice de refracción elevado (1.510). Conserva bien las
coloraciones, excepto los colorantes de anilina básica pero su desecación exige varias semanas.
- Resinas sintéticas y semiauténticas: entre los más empleados están el euparal, el clarite, el
caedax, el harleco, la resina technicon, el D-P-X-
Estas resinas son químicamente neutras, secan rápidamente y son de uso fácil. Garantizan una
buena conservación a la mayarla de tinciones. Los eosinatos de azul de metileno, y el Van Gieson,
sin embargo, se muestran frágiles en ellos.
Medios Miscibles con el Agua: sólo sirven prácticamente para montar cortes por congelación
conteniendo sustancias y colorantes alcohol-solubles. Entre estos están: la glicerina, el jarabe de
levulosa, el jarabe de apathy y la glicerina gelatinada.
RECOMENDACIONES GENERALES
Resultados deficientes de la coloración pueden explicarse por la presencia (o ausencia de impurezas

en el colorante o en el solvente, o por irregularidades en el procedimiento.
Las impurezas presentes en cualquier colorante o en el solvente, no solo influyen en la solución del
colorante, sino tiene un gran efecto en la intensidad del color. Por ejemplo, una impureza puede
alterar la concentración de iones (pH), mientras que los colorantes ácidos colorean mejor en
soluciones más ácidas, los colorantes básicos, lo hacen en soluciones alcalinas.
La impureza de sales minerales puede alterar la intensidad del color.
Es importante además tener en cuenta un número de parámetros para el manejo de todos los
colorantes en el laboratorio:
Conservar los colorantes en polvo en frasco herméticamente cerrados, al abrigo de la humedad y

apartados de los productas químicos.
Conservar las soluciones colorantes en frasco oscuros, cerrados y protegidos de la luz. Algunos
colorantes como la leucofucsina de Schiff el verde de metil pironina, mejoran estando conservados
en el refrigerador.
Utilizar una cristalería adecuada y lavada con agua destilada.

Cambiar frecuentemente las soluciones colorantes y los medios de diferenciación. Estos se agotan
rápidamente.
Secar cuidadosamente el portaobjetos entre cada baño a fin de evitar la contaminación y la pérdida
rápida de la solución siguiente.
Cuidar y prolongar, salvo contraindicaciones, los lavados, especialmente después del mordiente y
las tinciones.
Si el recipiente de la mezcla se agita con excesivo brío, el colorante precipita con facilidad.
El agua utilizada para la coloración ha de ser de reacción neutra o débilmente alcalina.
Para eliminar el agua del ácido carbónico se aconseja hervir brevemente el agua corriente, la
obtenida de lluvia o, también, la destilada que se utilice.
Las películas de sangre teñidas con cualquiera de los colorantes Romanowsky, que han sido
montadas con Permount u otros medios de montaje resinosos, son susceptibles de sufrir
decoloración de los elementos basófilos y pérdida generalizada de la intensidad del colorante.
Hollander ha recomendado la adición del 1% por volumen de 2,6-di-tert-butil-p-cresol (butilo de
hidroxitolueno) para el medio del montaje.
Sin la adición de este antioxidente, los extendidos coloreados montados se vuelven rosados: los
colorantes protegidos con este compuesto permanecen sin cambiar de color.
Cuando se procesan grandes cantidades de portaobjetos, recuerde que los portaobjetos secos deben
almacenarse en recipientes libres de polvo, antes de su coloración, para proteger los extendidos
frescos de las cucarachas y moscas.
Si los portaobjetos no pueden colorearse durante las 48 horas, las películas finas deberán fijarse en
alcohol metílico y las películas gruesas lavadas en agua destilada antes de su almacenamiento.
Los portaobjetos deberán almacenarse a temperaturas razonablemente bajas (debajo de los 26ºC)
antes de su coloración. Las películas gruesas que no han sido lacadas se fijarán con calor; le
hemoglobina quedará fijada en los glóbulos rojos, y la considerable retención de colorante impedirá
entonces la identificación de los parásitos. Las películas finas también se colorean débilmente
después de la exposición a elevadas temperaturas.
El colorante de uso inmediato deberá prepararse precisamente antes de su empleo. Si una gran
cantidad de películas gruesas se laquean durante le coloración, el colorante deberá ser cambiado
después de pasar por él 50 portaobjetos, debido a la acumulación excesiva de hemoglobina.
Los tiempos de actuación de cada uno de los colorantes que indicamos en las técnicas son teóricos,
ya que dependen de la concentración y maduración de los mismos. El tiempo exacto de actuación
debemos obtenerlo empíricamente para cada colorante; a título de orientación sirven los tiempos
por nosotros Indicados. Como norma general se puede decir que cuanto más concentrado y antiguo
sea el colorante, menor debe ser su tiempo de actuación.
El calentar un frotis húmedo dará por resultado distorsiones morfológicas de los organismos.
El sobrecalentamiento producirá también distorsiones morfológicas, si no es que la destrucción
completa de las células. Una fijación adecuada "pegará" a la célula en el portaobjetos, produciendo
coagulación de proteínas y preservando así los detalles morfológicos de la célula.
Para obtener una buena coloración de protozoarios se debe tener en cuenta las siguientes
recomendaciones:
Una vez recibida la muestra se debe evitar Que esta se seque, fijarla en el menor lapso de tiempo
posible. Se debe hacer una buena homogenización para evitar distorsiones posteriores: cuando los
parásitos no se han fijado bien.
Las muestras demasiado viejas no colorean.
En amibas la E. Coli toma un mayor tiempo de coloración y de fijación. Los quistes inmaduros fijan
más fácilmente que los maduros.
CUIDADOS CON EL MICROSCOPIO

 Siempre que reciba un microscopio nuevo debe hacerse revisar por una persona experimentada.
 Después de trabajar siempre baje la intensidad de luz del microscopio, limpie las lentes de los
objetivos con papel japón, en su defecto utilice papel suave para la limpieza facial y mueva el
revolver de objetivos hasta dejar el objetivo de menor alimento alineado, también verifique que
el carro quede centrado.
 Cuando termine el trabajo desconecte del toma corriente el microscopio. Nunca lo haga
halándolo del cable.
 Antes de trabajar, verifique si el carro mecánico está trabajando adecuadamente, en caso de no
tener movimiento libre lubrique con aceite indicado para este tipo de trabajo.
 No desmontar los objetivos, mecanismo macro y micrométrico, cuerpo binocular, etc.
 En caso dado de que el objetivo de inmersión presente problemas por el exceso de aceite de
inmersión, solamente debe limpiarse con una solución de alcohol éter. Cuando el problema se
presenta en los objetivos secos limpie con agua destilada y finalmente séquelos muy bien.
 Cuando encuentre partículas de polvo en los objetivo, trate de elimínanos con chorros de aire
utilizando una jeringa seca.
 Cuando encuentre huellas digitales en la superficie del microscopio limpie con una solución de
alcohol-agua.
 Cuando desee controlar la intensidad de la luz no desplace el condensador de arriba a abajo,
utilice el dimmer o voltímetro.
 Para cargar el microscopio utilice las dos manos, una colóquela en la base del microscopio y la
otra en el cuerpo del mismo. Durante este procedimiento el microscopio debe estar en posición
vertical.
 EL sitio de trabajo donde ubique el microscopio debe ser un sitio estalle, alejado de los
vertederos, donde no dé directamente la luz solar.
 Evite extremos de temperaturas ya que esto forma condensación de agua en las lentes de los
objetos que posteriormente tesura difícil de quitar.
 No permita a personal no entrenado limpiar o reparar el microscopio.
 Siempre que no esté empleando el microscopio manténgalo cubierto con el forro
correspondiente.
 Cuando necesite quitar los oculares no olvide colocar las tapas correspondientes para entrada de
polvo o insectos.
 No fume al pie del microscopio porque las lentes llegan a cubrirse con una capa de material no
combustible mezclado con residuos de carbón lo que produce decoloración y un campo barroso.
 Nunca limpie los oculares con saliva ya que la mezcla de polvo y saliva forman una película
difícil de remover.
 El maquillaje también ocasiona una película aceitosa en las lentes de los oculares por esta razón
deben ser limpiados cuidadosamente y de manera constante.
 La calidad del microscopio está dada por la calidad de los objetivos. Para evitar los rayones en
sus lentes se debe enfocar primero en menor aumento y luego pasar al de mayor aumento.
 Enfoque siempre de arriba hacia abajo. Nunca deje el objetivo sumergido en aceite sobre la
lámina.
 El microscopio debe limpiarse dos veces por semana, aceitarse una vez al mes y darle servicio
profesional por lo menos una vez al año.
 para evitar la humedad en climas tropicales húmedos guarde el microscopio en un armario con
temperatura estable de 29 a 35°C, controlar la temperatura con un termómetro de máximas y
mínimas para evitar la formación de micelios de hongos.
 No guarde el microscopio diariamente en el estuche original de madera, ya que el polvo que se
desprende se deposita sobre los prismas y en la superficie de los objetivos de inmersión,
perjudicando su poder de resolución.
BIBLIOGRAFÍA
Departaments of the air force, editors. Clinical Laboratory Procedures Parasitology. Washington D.C. 1974.
Conn HJ. Biological stains. The Williams and Wilkins Company, 1961.
Langeron M. Précis de Microscopie. Technique-Experimcntation-Diagnostic. Paris, 1934:1205 pps.
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Lennette EH, Balows A, Hausler WJ, Truant JP: Manual of clinical Microbiology. American Society for
Microbiology. 1980: 1010-1023.
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Gilbert I, Foley K. Diagnostic Bacteriology. St, Louis. 1.947: 489-503
García S, Lynne L. Diagnóstico parasitológico-manual de laboratorio clínico. Editorial Médica Panamericana.

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Nezelof C, Galle P, Hinglais N. Exámenes de laboratorio-Técnicas microscópicas. Editorial Jims 1.975: 14-
85.
Mendoza NM. Diagnóstico en malaria-manual de técnicas y procedimientos. INS. 1.995: 12-14.

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“Es mejor ser feliz que importante”
GUÍA PRÁCTICA No. 3: MEDIOS DE CULTIVO

Para estudiar debidamente los microorganismos es necesario cultivarlos en el laboratorio. Para
lograrlo es preciso conocer cuáles son los nutrientes y las condiciones físicas que requieren.
Mediante investigaciones extensas se han determinado las necesidades nutricionales de las
bacterias; esta información ha sido la causa del desarrollo de numerosos medios de cultivo. Ya que
las necesidades nutricionales de las bacterias varían de manera muy amplia existen diferencias muy
importantes en cuanto a la composición de los medios empleados.
Observación de los medios de cultivo
Comercialmente se encuentran los medios de cultivo deshidratados, en polvo o granulados. Tiene
pocos gérmenes pero en general no están exentos de ellos. Cuando se han abierto para su empleo,
deben cerrarse lo antes posible herméticamente para evitar su hidratación. Una hidratación del
medio supone cambios físicos y químicos aumentados por el metabolismo de microorganismos que
puedan encontrarse en él. La sustancia se torna compacta, dura e inutilizable.
Preparación:
a. Rehidratación
Cada frasco de medio de cultivo lleva en la etiqueta las instrucciones para su preparación. Indica
siempre la cantidad que debe pesarse para un litro de agua destilada.
1. Ponga en un erlenmeyer la mitad del agua destilada para preparar el medio de cultivo.
2. Agregue el polvo y mezcle hasta obtener la disolución casi completa.
3. Agregue el resto del agua y mezcle hasta desprender de las paredes del recipiente el polvo
adherido.
Los que tienen Agar se dejan en reposo unos 10 a 15 minutos a temperatura ambiente para que
se esponje el agar.
4. Caliente a temperatura de ebullición agitando con frecuencia (proteja las manos) para que lo
antes posible de una solubilidad completa sin quemarse. Ajuste el pH que indica la etiqueta del
frasco.
b. Esterilización
- Esterilice en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Los medios que contengan azúcar no
deben calentarse más tiempo.
- El medio puede envasarse en tubos de ensayo, frasquitos o en erlenmeyer grande para distribuir
cuando se requiera en el envase más apropiado.
- Coloque los medios en estufa bacteriológica para prueba de esterilidad, durante 24 horas.
- Páselos a la nevera donde permanecerán hasta el uso.
Cuestionario:
1. Consulte el mayor número de medios de cultivo empleados en microbiología relacionando sus
características.
2. Consulte la fórmula molecular y estructural de cada uno de los medios de cultivo del numeral 1.
3. En un cuadro clasifique los medios de cultivos sólidos, semisólidos y líquidos.
4. Para qué calientas y esterilizas el medio de cultivo antes de envasarlo?.
5. Clasifique ampliamente medios de cultivo naturales.
Anexo: Conceptos Teóricos sobre Medios de cultivo
Los medios de cultivo son sustratos o sustancias que aportan factores de crecimiento a los
microorganismos para su replicación; cuya mayor cantidad de productos es una mezcla compleja de
nutrientes como: nitrógeno, carbono, vitaminas, minerales, iones.
Antiguamente estos medios de cultivo se conocían como "INFUSIONES" porque eran totalmente
líquidos.
Los medios de cultivo deshidratados se fabrican en forma de POLVO o en forma GRANULADA.

 Los medios de cultivo desecados, en forma de polvo, se obtienen principalmente por
trituración de las correspondientes sustancias (materias primas) obteniendo una mezcla
homogénea finamente pulverizada.
 Los medios de cultivo desecados, en forma granulada, son sometidos adicionalmente a una
granulación, éste procedimiento se consigue con una deshidratación extrema. Se utiliza en
aquellos medios de cultivo que contienen sustancias higroscópicas (Que absorbe agua) y que
necesitan por lo tanto, una desecación muy intensa. El polvo del medio de cultivo tratado, se
aglomera en pequeños gránulos.
La forma granular de los medios de cultivo desecados ofrece como ventajas:

- Mejor conservabilidad, particularmente en ambientes húmedos (clima tropical).
- Distribución más homogénea de los ingredientes, particularmente aquellas sustancias activas
que se encuentren presentes en pequeña cantidad.
- Número de gérmenes disminuidos.
- El pesaje es más fácil.
- Ausencia notable de polvo durante la manipulación, evitando así manifestaciones alérgicas o la
inhalación de sustancias tóxicas.
CLASIFICACIÓN
1. Consistencia
A. Medios líquidos:
Medio de cultivo fluido, libre de agar, que contiene productos cárnicos o protéicos (peptonas,
extractos).
Son llamados los "CALDOS DE ENRIQUECIMIENTO". Una ventaja es que permiten la rápida
recuperación y viabilidad del germen. Los microorganismos se dan en forma aislada, cultivos
mixtos y se evidencia por turbidez.
B. Medios Sólidos
Son medios para verter en cajas, con un contenido de agar del 1% o más. Los microorganismos se
agrupan y forman colonias, en cultivos puros para ser identificables. Antiguamente se usó gelatina
pero sin ningún beneficio, hasta que en el laboratorio de Robert Kock (Frau Hesse), descubrieron
los beneficios de una sustancia inerte extraída de las algas llamada AGAR – AGAR.
C. Medios Semisólidos;
Son medios con un contenido en agar de menos del 1%. Su utilización se basa para identificación
bioquímica del microorganismo o estudios de movilidad.
2. ORIGEN
En el cultivo de los microorganismos se emplean varios tipos de sustratos nutritivos:
Para los sustratos nutritivos rige la condición previa necesaria que contenga las sustancias precisas
para el desarrollo normal de los organismos a cultivar, como el carbono, nitrógeno, vitaminas,
sustancias minerales y probióticos.
A. Sintéticos:
Compuestos químicos disueltos en agua. Su utilización es más que todo para estudio del
metabolismo bacteriano. LOS SUSTRATOS NUTRITIVOS ARTIFICIALES se caracterizan por
estar formados por sustancias cuya composición química resulta conocida.
B. Naturales
Compuestos de origen animal o vegetal como: carne, arroz, leche, papa y otros. Considerados como
sustratos naturales sólidos.
l. Los Sustratos Naturales
Están caracterizados porque no se conoce totalmente su composición química. Los sustratos
líquidos naturales, que generalmente hallan su aplicación en la fisiología FERMENTATIVA, son los
siguientes:
Mosto de cerveza: se utiliza como mosto dulce (sin lupular) o como mosto lupulado. Sirve para el
cultivo de levaduras y hongos filamentosos.
Cerveza: se utiliza como cultivos de bacterias que se encuentran en las cerveceras, como
Pediococos y bacterias acéticas.
Agua de levaduras: formada por una decocción acuosa de levadura, se emplea en el cultivo de
bacterias.
Jugos de frutas: jugo de varias frutas por ejemplo: uvas, ciruelas y cerezas, excelente para hongos
filamentos y levaduras, porque contiene muchos probióticos. El jugo de manzana se utiliza como
sustrato de hongos filamentosos y de levaduras sobre todo de aquellas especies que prefieren el
hidrato de carbono, la fructosa.
Caldo de carne: Se complementa mediante la cocción de carne de ternera, de vaca o de caballo,

hígado, cerebro, etc. se emplea en el cultivo de bacterias.
La leche para cultivo de bacterias, tanto de bacterias acidógenas como de las bacterias capaces de
peptonizar la caseína.
Sustrato de gelatina nutritiva: se obtiene mediante la adición de un 10-15% de gelatina a los

diversos sustratos líquidos.
Los sustratos nutritivos de agar se obtiene añadiendo en 1.5 – 2.5% de agar – agar a los sustratos
nutritivos líquidos.
Otros sustratos son:

Pan: para el cultivo de hongos filamentosos
Patatas: Se emplea en el estudio de formación de esporas de levaduras y bacterias.
Tierra estéril.
C. SEMISINTÉTICOS
Son los que tienen parte de composición química conocida y parte desconocida.
3. Composición
A. Común
Solamente posee compuestos básicos. Su utilización solamente para el crecimiento de gérmenes no
estrictos o que no necesitan casi nutrientes. Por ejemplo: caldo y/o agar nutritivo.
B. Enriquecido
Es un medio común al que se le adiciona algún producto que lo enriquece. Su utilización para
microorganismos de crecimiento exigente. Por ejemplo: sangre, yema de huevo y otros.
4. Utilización
A. Medios de enriquecimiento
Sustancias nutritivas + aditivos = agar sangre, chocolate, agua peptonada.
B. Selectivos
Son medios sólidos, posee 2 parámetros.
 Físicos: pH, temperatura, presión osmótica
 Químicos: antisépticos: Sales biliares, Cristal violeta, Verde bilis.
Antibióticos: Gentamicina, Vancomicina, Mistatina, Cloramfenicol
C. Especiales
Son medios altamente selectivos, su uso se basa en aislar microorganismos específicos.
D. Identificación
Para el crecimiento de microorganismos especiales.
Poseen sustancias indicadoras, azúcares, especialmente para resultados bioquímicos. Pueden ser:
 Únicos o Simples
Se observa una reacción bioquímica, se produce un cambio de color. Por ejemplo: agar Citrato
simons, prueba de Indol (Agua de Triptona).
 Múltiples o Combinados:
Se observa varias reacciones bioquímicas a la vez. Por ejemplo:
T.S.I. (Triple Azúcar hierro, contiene bases azufradas, dando por lo tanto ennegrecimiento
( H2S), además producción de gas.
S.I.M. ( H2S, Indol, Movilidad).
D. Microsistemas
Son estuches comerciales. Micro: pequeñas cantidades. Por ejemplo Micro ID: Oxifer Tubo. API
20/50. BBL crystal.
CONSERVACIÓN
Los medios de cultivos deshidratados son pobres en gérmenes y en general están libres de formas
microbianas termoresistentes. Son más o menos higroscópicos, por éste motivo los frascos que los
contiene con tapón de rosca hermético, sólo deben abrirse en ambiente seco. El ingreso de agua
desde el exterior o la liberación de agua en el interior, motivada por oscilaciones grandes de
temperatura, dan lugar al desarrollo de gérmenes en el material, lo que por otra parte, puede
ocasionar consumo de sustancias nutritivas, variaciones en el valor de pH y alteraciones de color.
Los medios de cultivo deshidratados deben conservarse siempre en ambiente seco, fresco y
protegidos de la luz directa. Los frascos de tapón de rosca, provistos de cierre hermético, deben ser
cerrados de nuevo inmediatamente después de empezados y de cada empleo. La conservación es
limitada. Hablando en términos generales y tras estudios de investigación de estabilidad, puede
considerarse que bajo condiciones irreprochables de conservación, la conservabilidad es de 1 año
por lo menos para los medios de cultivo desecados en forma de polvo y de 3-5 años por lo menos
para los medios de cultivo desecados en forma granulada. El material muy alterado exteriormente,
como ocurre en casos de granulado no desintegrable o de apelmazamiento de polvo, debe
considerarse como regla general deteriorado o inservible.
PREPARACIÓN
El tipo y modo de preparación de los medios de cultivo listos para su uso, es de gran importancia
para obtener una solución clara, transparencia y un alto grado de rendimiento, para conseguir una
calidad elevada, es esencial que el material quede completamente disuelto que sea sometido lo
menos posible al calor.
Los medios que contengan azúcares no se deben esterilizar en la autoclave. Los azúcares deben ser
preparados químicamente puros.
RECOMENDACIONES
Para la preparación de medios de cultivo debe emplearse agua recién destilada o desmineralizada,
de reacción neutra y dentro de lo posible, pobre en gérmenes. A una cantidad de agua
aproximadamente igual a la mitad de la necesaria, se añade la cantidad prescrita de medio de cultivo
desecado, se hace una suspensión homogénea agitando lentamente, añadiendo a continuación la
cantidad restante de agua. al mismo tiempo deben arrastrarse e incorporarse las partes del material
que pudieran haber quedado adheridas a las paredes del recipiente. Los medios de cultivo que
contiene agar se dejan a continuación en reposo, a temperatura ambiente, durante algún tiempo (10
a 15 minutos) para que pueda hidratarse el agar. Para conseguir una solución completa de los
medios de cultivo que contiene agar o gelatina es ineludible su calentamiento, sin embargo, debe
evitarse todo calentamiento innecesariamente prolongado.
En la actualidad los medios de cultivo deshidratados se fabrican de tal manera que si se siguen
exactamente las normas de preparación, no necesitan clasificarse por filtración, ni corregir su pH
después de su esterilización. Para evitarse la formación de agua de condensación no deben verterse
demasiado caliente los medios de cultivo en las cajas, sino después de enfriado a temperaturas entre
45 – 50 ºC.
ESTERILIZACIÓN
No es necesaria en general una duración de esterilización mayor de 15 minutos a 121ºC en
autoclave.
En especial los medios de cultivo que contienen azúcares no deben ser calentados por mucho
tiempo, ya que éstos pueden descomponerse (caramelización). Se recomienda sacar de la autoclave
los medios de cultivo esterilizados y enfriarlos en agua fría para evitar toda sobrecarga térmica
inútil.
ALMACENAMIENTO
Los medios de cultivo listos para el uso solo son utilizables por tiempo limitado,(8 días) por lo tanto
si no se prevee su empleo inmediato, deben ser almacenados bajo condiciones adecuadas. Para la
mayoría de los medios de cultivo lo más conveniente es su almacenamiento a bajas temperaturas
(refrigeración), otros como los medios de cultivo que contienen tioglicolato, se conservan mejor a
temperatura ambiente. Siempre deben ser conservados, además protegidos contra la luz. Algunas
horas antes de su empleo, deben sacarse los medios de cultivo del refrigerador y calentarse en el
baño maría o en la incubadora (37ºC)
CONTROL DE CALIDAD
Según el medio de cultivo deshidratado, se indican las cepas de ensayo respectivas y sus reacciones,
a través de ellas están definidas las propiedades microbiológicas del medio de cultivo
correspondiente.
DIAGNOSTICO MICROBIOLÓGICO
El curso y la extensión de una investigación microbiológica depende del material objeto de

Investigación y su flora microbiana, así como del planteamiento del problema por parte del
Investigador o de la exactitud y riqueza en detalles que se exijan.
Si se sospecha la escasa presencia de tipos de gérmenes buscados en el material objeto de
investigación, se cultivará éste último en medios de cultivo de enriquecimiento, estos medios son
fluidos o semifluidos, en ellos pueden reproducirse los gérmenes deseados más o menos
libremente, casi siempre bajo simultánea represión del crecimiento de la flora acompañante
indeseable.
A partir de los medios de enriquecimiento o directamente del material objeto de investigación, se

inoculan medios de cultivo selectivos, estos medios impiden el crecimiento de la flora acompañante
indeseable por medio de sustancias inhibidoras selectivas o bien permiten el crecimiento de varias
especies microbianas y el reconocimiento simultáneo de las colonias sospechosas o interesantes.
Para una serie de problemas microbiológicos, la investigación queda terminada en éste punto, no
obstante, sí se requiere un diagnóstico más exacto, se utilizarán para éste fin (tras obtención de un
cultivo puro del germen en cuestión), los medios de cultivo de diferenciación.
Una faceta importante de la investigación microbiológica consiste en la comprobación del número

de gérmenes, es decir, del número de elementos vivos, capaces de reproducirse existentes en una
cantidad determinada de gramos o mililitros del material objeto de investigación, para cuya
determinación se destinan medios de cultivo con el espectro más amplio posibles de sustancias
nutritivas.
MANUAL DE MEDIOS DE CULTIVOS MERCK 1994 – 1999
Control de calidad: Requisito primordial de Merck

Merck ha actuado siempre con gran cuidado para asegurarse de que sus productos sean de alta
calidad. A mediados del siglo pasado el fundador de la empresa, Heinrich Emanuel Merck, escribió
a un cliente: “Garantizo siempre la pureza de mis preparados y me responsabilizo de cualquier
inconveniente que proceda de un preparado impurificado.” Los productos microbiológicos;
solamente pueden prepararse en forma estandardizada si el fabricante tiene en cuenta criterios
importantes en el control de calidad.
Debido al carácter biológico de muchos componentes de los medios de cultivo es muy difícil
obtener materias primas en calidad constante de lote a lote. Completos ensayos físicos, químicos y
biológicos de las materias primas de los productos acabados garantizan que se suministran y llegan
al cliente productos fiables de alta calidad.
Gracias a sus numerosos laboratorios en la investigación farmacéutica, química, analítica y de

productos para diagnóstico, así como por su centro de control de calidad, se pude decir que Merck
está predestinado para realizar medidas óptimas para el control de calidad de productos
microbiológicos.
Se pone un cuidado especial en los siguientes sectores de los problemas al realizar la fabricación:
 Selección de las materias primas
 Estandardización de los productos
 Control final de los productos
Si lo desea el cliente se puede suministrar un certificado analítico que documenta las características
típicas del cualquier producto.
Merck pone atención no solamente a la calidad de sus productos, sino que Merck realiza todo lo que
sea necesario para satisfacer las necesidades de sus clientes. Hay calidad significativa para Merck
igualmente un rápido suministro, un buen asesoramiento técnico, información a su justo tiempo,
seguridad, buen trato del consumidor, consideración de los problemas medio ambientales, etc, etc.
en una palabra “Servicio completo”
Todos los colaboradores de Merck están entrenados para practicar calidad en su puesto de trabajo
para el bien del cliente.
Todo lo que hacemos se puede resumir con el lema:
Merck produce calidad.
Nos regimos por sus necesidades.
Posibles defectos en la preparación y manipulación

Apelmazamiento de los Medios de cultivo deshidratados
 Conservación en atmósfera excesivamente húmeda.
 El envase ha permanecido abierto demasiado tiempo
 El envase no quedó suficientemente bien cerrado después de su uso
 El medio de cultivo deshidratado está muy pasado de fecha (viejo)
Desviación del valor de pH

 Agua no neutra.
 Envase no suficiente bien cerrado
 Medio de cultivo sobrecalentado durante su preparación
 Medio de cultivo deshidratado muy pasado de fecha (viejo)
Turbidez, precipitación
Una turbidez en el medio de cultivo preparado hay que considerarla como defecto, si en los
recipientes (placas Petri, tubos, etc) provocan observaciones deficientes. Una turbidez que aparezca
como consecuencia de un mayor espesor de capa del medio de cultivo, no hay que considerarla
como defecto.
Las precipitaciones que forman posos hay que considerarlas, por el contrario, como defectos de
preparación.
 Excepciones medios de cultivo inevitablemente turbios.
 Agua insuficientemente desionizada.
 Los recipientes en los que se hizo la preparación no estaban suficientemente limpios.
 pH incorrecto o desajustado (véase desviación del valor de pH)
 Sobrecalentamiento del medio de cultivo durante su preparación.
 Si los medios de cultivo han sido confeccionados por el usuario la(s) sustancia(s) empleada(s)
contiene(n) impurezas formadoras de precipitado.
 Ocasionado por el material de muestra
 Pérdida de agua por evaporación en el medio de cultivo preparado.
Punto de solidificación demasiado elevado

De importancia sobre todo, cuando hay que mezclar material de ensayo o sustancias en el medio de
cultivo todavía líquido
 Excesiva proporción de medio de cultivo deshidratado.
 Agar - Agar no adecuado.
Escasa estabilidad del gel

 Proporción demasiado pequeña de medio de cultivo deshidratado
 Medio de cultivo deshidratado no disuelto completamente
 Medio de cultivo sobrecalentado durante su preparación; eventualmente, en los casos de pH
demasiado bajo (véase desviación del valor de pH).
 El medio de cultivo no se agitó, o lo fue insuficientemente, en su recipiente de preparación,
cuando fue vertido en las placas.
 En el caso de medios de cultivo confeccionados por el propio usuario Agar-agar demasiado
escaso o inadecuado.
 Medios de cultivo ácidos (véase medios de cultivo ácidos) preparados sin suficiente cuidado.
Desviación del color

 Valor erróneo del pH, en el caso de medios de cultivo que contengan indicador de pH (véase
desviación del valor de pH).
 Sobrecalentamiento del medio de cultivo durante su preparación, lo que da lugar a: medio de
cultivo oscuro, pigmentos alterados, azúcar caramelizado.
 El recipiente en que se hizo la preparación no estaba suficientemente limpio.
Medios de cultivo (listos para el uso) contaminados

 Esterilización insuficiente
 Contaminación accidental ulterior a la esterilización. Por ejemplo impericia en el vertido en
placas; placas de Petri no estériles o contaminadas
Crecimiento demasiado pobre en gérmenes

Residuos de sustancias inhibidoras del crecimiento:
 En los recipientes de preparación o cultivo (por ejemplo, detergentes), en el agua de preparación
en el material de ensayo
 Gérmenes ya alterados en el material de ensayo.
 pH incorrecto
 En el caso de medios de cultivo basales: aditivos defectuosamente dosificados.

 Medio de cultivo sobrecalentado durante su preparación.
 En el caso de medios de cultivo mezclados: adición de la muestra efectuada a temperatura
demasiado elevada.
Crecimiento demasiado intenso de gérmenes

 Medios de cultivos sobrecalentados durante su preparación, con la consiguiente destrucción de
sustancias inhibidoras selectivas.
 En el caso de medios de cultivo basales: aditivos defectuosamente dosificados.
 Medios de cultivo sembrado con demasiado material de ensayo
Colonias inconcretas o desleídas.

 Superficie del medio de cultivo demasiado húmedo.
 Superficie del medio de cultivo sembrada con demasiado material de ensayo.
 Medio de cultivo sobrecalentado durante su preparación, con la consiguiente destrucción de
sustancias inhibidoras.
Crecimiento atípico
 Medio de cultivo erróneo, o defectuosamente preparado.
 Medio de cultivo deshidratado muy pasado de fecha (Viejo).
 El medio de cultivo utilizado ha permanecido almacenado durante tiempo excesivo,
envejeciendo o deteriorándose.
 Condiciones de cultivo no conformes con las normas.
 Residuos de sustancias extrañas: en los recipientes de preparación o de cultivo (por ejemplo,
detergentes), en el agua o en el material de ensayo.
CONSERVACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS PREPARADOS, LISTOS PARA EL USO
Los medios de cultivos preparados listos para el uso, tienen sólo un tiempo limitado de
conservación. Cuando no se indique otra cosa y bajo condiciones adecuadas de conservación, es de
varios meses.
Para periodos de tiempo más prolongado, se recomienda su almacenamiento a unos 12 – 15 ºC. Los
medios de cultivo con Agar no deben guardarse por dejado de 0ºC pues, de lo contrario, se altera la
estructura del gel. Por lo general, es posible su conservación durante 1-2 semanas a temperatura
ambiente. En cualquiera de los casos, deberán protegerse siempre de la luz.
Si las placas de Petri, preparadas con el medio de cultivo, han de ser conservadas durante cierto
tiempo, deberán protegerse además para evitar la deshidratación del medio de cultivo que contiene
protegiendo con cinta adhesiva su borde lateral para impedir fugas entre el cuerpo de la placa y la
tapa, o guardándolas empaquetadas en varias bolsas de plástico impermeable al aire. Los medios de
cultivo líquidos envasados en tubos o matraces, deben cerrarse así mismo con capuchones
impermeables al aire.
La pérdida de agua puede provocar precipitados a hacer que cristalicen ciertas sustancias del medio
de cultivo, así como originar grietas en las placas que contengan medio de cultivo.
Para los medios de cultivo que contengan aditivos, es aconsejable almacenar el medio de cultivo
basal preparado y según necesidades añadir los aditivos en forma estéril.
Destrucción inócula de cultivos

Sobre la desinfección de cultivos microbiológicos, así como sobre la limpieza y destrucción del
material contaminado con microorganismos, especialmente si está demostrada la presencia de
microorganismos patógenos., puede consultarse la Norma DIN 58956 apartado 4’ y las
recomendaciones del Departamento de Salud Pública de la República Federal de Alemania, en
virtud de las cuales hay que desinfectar, preferentemente en forma térmica, el material antes de su
limpieza o destrucción. Una desinfección química debe realizarse solamente en casos
excepcionales.
Una desinfección térmica de cultivos en recipientes de un solo uso, especialmente los de plástico,
puede también llevarse a cabo sometiéndolos al autoclave (121ºC, aproximadamente 30 minutos)
dentro de bolsas de plástico de alto punto de fusión. A continuación tirar a la basura las bolsas con
el contenido.
Si existen instalaciones incineradoras adecuadas, la muerte y eliminación de los cultivos también

puede llevarse a cabo incinerándolos.
Los cultivos depositados en recipientes de vidrio (por ejemplo: matraces, tubos de cultivo) pueden
desinfectarse autoclavándolas a 121ºC durante aproximadamente 30 minutos. También los
recipientes de vidrio o aparatos resistentes al calor contaminados se desinfectan en autoclaves a
134ºC durante 20 minutos o en estufas de aire caliente a 180ºC durante 30 minutos, sólo entonces se
procederá a la limpieza de los recipientes o aparatos y eventualmente a una esterilización, que se
realizaría igualmente en autoclaves o estufas de aire caliente.
Una desinfección química se lleva a cabo mediante desinfectantes adecuados. Las sustancias activas
en ellas contenidas son eficaces casi siempre sólo contra microorganismos vegetativos y no contra
esporas.
Algunas bacterias, y virus son más resistentes frente a ciertas sustancias que el resto de gérmenes.
En la desinfección química, todos los objetos tienen que estar totalmente en contacto con el
desinfectante. Por tanto, hay que eliminar las posibles burbujas de aire existentes.
Para cubrir la superficie en una placa Petri de 9 cm. de diámetro se necesitan aproximadamente 10
ml. de desinfectante, siendo necesario dejarlo actuar durante 6 horas como mínimo, mejor durante
toda una noche, para la destrucción segura de los microorganismos.
Es recomendable el empleo de agentes desinfectantes que hayan sido comprobados de acuerdo con
el epígrafe 10 de la Ley Federal Alemana sobre Epidemias, del 18 de Diciembre de 1979, del
Departamento de Salud Pública, de la República Federal de Alemania o que figuren en la Relación
de agentes desinfectantes comprobados y aceptados por la Sociedad Alemana para la Higiene y
Microbiología.
Bibliografía
1. DIN Deutsches Institut Normung V. Laboratorios médicos microbiológicos. Requisitos para la
destrucción – DIN 58956 Teil 4.
2. Bundesgesundheritsamt: Realización de la esterilización – BundesgesundheitsblaMt 22,193 – 200 (1979).

Bundesgensundheitsamt: Realización de la desinfección – BundesgesundheitsblaM 23, 356 – 364 (1980)
Bundesgensundheitsamt: Requisitos de higiene para la destrucción de basuras - BundesgesundheitsblaM
26-24-25 (1983).
3. Bolsas especiales para la eliminación de cultivos (Spezial/einichtungshertel) de la firma C. A. Greiner

und Söchne 7440 Nurthingen.
4. Relación de agentes desinfectantes y procedimientos de desinfección comprobados y aprobados por el

Departamento Federal de Salud 10º Edición – bundesgesundehitsblaM 30, 279 – 290 (1987) de venta en
el Departamento Federal de la Salud. Robert Koch Institut. A. Verv, 1000 Berlin 65 Nordufer 20.
5. VI Relación de agentes desinfectantes comprobados en cuanto a sus propiedades bactericidas según los
Richilinien Fur die Prufung chenmischer Desinfektionsmitel y aceptadas por la sociedad Alemana de
Higiene y Microbiología. Stan 317. 1981 Mhp Verlag GMBH Wilhemstrosse 42,6200 Wiesbaden.

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“El saber es la parte más considerable de la felicidad”
GUÍA PRÁCTICA No. 4: MÉTODOS PARA EL CULTIVO Y AISLAMIENTO DE

BACTERIAS AEROBIAS
En el traspaso de bacterias de los cultivos a placas de agar, han de tenerse ciertas precauciones para
evitar contaminaciones con gérmenes extraños, que pueden encontrarse en el aire, polvo, muebles y
objetos. Al mismo tiempo debe cuidarse que en la manipulación de los cultivos se escapen los
gérmenes del medio; pueden ser patógenos.
Pasteur hacía el traslado de bacterias de los cultivos a medios recientes, utilizando una pipeta
terminada en capilar muy fino y que ahora se conoce con el nombre de “pipeta de Pasteur”.
Desde los tiempos de Koch se emplea más comúnmente la aguja o asa bacteriológica de metal; se
fabrican generalmente de platino o níquel – cromado, con mango metálico.
Existen asas bacteriológicas con mango de Kolle para aguja de platino; otras con mango de
Rosemberger y Greenman. Los mangos de vidrio no son recomendados por su fragilidad.
Siembras:
La transferencia de las bacterias desde los productos patológicos a un medio de cultivo se denomina
siembra; la transferencia de un cultivo a otro: subcultivo o comúnmente repique.
Las siembras se practican por medio de un escobillón, de asa de alambre delgado, o de pipetas.
1. Tipos de siembra
a. Siembra en caja de petri por agotamiento
Un buen método es el sugerido a continuación.
Se toma la caja de petri en la palma de la mano izquierda ligeramente inclinada; con la mano
derecha se maneja el esa previamente esterilizada y con ella se recoge el material de cultivo o
en el caso de usar escobillón se inocula en una pequeña área de la caja y se trazan estrías
paralelas hasta la mitad o tercera parte de la caja; se quema el asa; se hace girar la caja y se
hacen estrías en la misma forma hasta la mitad de la superficie libre; se quema nuevamente el
asa y se hace girar la caja; se trazan estrías perpendiculares a las anteriormente practicadas en
el cuadrante libre.
Se esteriliza el asa antes de descartarla (Ver figura No.1)
Inoculación en placas de Agar

La estría en placa es usada en primer lugar para aislar cultivos puros de los cultivos mixtos.
Se usa también para estudiar la morfología y propiedades hemolíticas de colonias aisladas,
característica de gran valor en la identificación de bacterias.
Materiales
Agares, Cajas de petri, Erlenmeyer, Agitador de vidrio, Mechero, Autoclave, Canasta de alambre
Siembras
La superficie del agar debe ser lisa y húmeda, pero no en demasía
1. Esterilice el asa bacteriológica.
2. Usando el dedo pequeño de la mano derecha, quite el tapón de algodón o la tapa de rosca del
tubo que contiene la muestra (espécimen)
3. Con el aro del asa, tome una capa o película delgada de la muestra que va a sembrar.
4. Tape nuevamente el tubo de cultivo utilizado, flameando la boca del tubo antes de poner el
tapón. Coloque el tubo en la gradilla.
5. Con la mano izquierda levante la tapa de la caja de petri. Pase el asa haciendo estrías en la
forma indicada hasta la mitad de la placa; tape la caja. (Ver figura 2)
6. Esterilice el asa bacteriológica a la llama y déjela enfriar.
7. Rote ¼ la caja de petri y con el mismo material que hay sembrado haga estrías.
8. Esterilice el asa y déjela enfriar
9. Rote nuevamente la caja de petri. Como en el caso anterior, con el material de caja haga estrías
en el área restante. Tape la caja de petri. Esterilice el asa y deje enfriar.
10. Rotule la tapa de la caja de petri con los datos necesarios, marque bien la caja para evitar
confusiones.
11. Incube colocando las cajas invertidas, es decir, que la caja de agar quede hacia arriba.
Figura No. 2
b. Siembra en tubos o frascos bacteriológicos

La siembra en medios contenidos en tubos requiere mayor cuidado ya que un solo organismo
contaminante del aire puede superar en crecimiento al organismo patógeno. Por tanto se deben
tener las siguientes precauciones:
- Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir de modo que los
microorganismos del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en la boca.
- Los tapones de los tubos deben mantenerse en la mano derecha sostenidas entre el meñique
y el anular y entre el anular y el dedo del corazón. Nunca deben colocarse sobre la mesa de
trabajo o algún otro lugar. Deben prepararse de algodón no absorbente.
Procedimiento
1. Esterilice el asa según instrucciones
2. Quite la tapa rosca del tubo
3. Flamear la boca del tubo
4. Sumergir el asa en el medio sin tocar las paredes del tubo.
5. Enfriar el asa en una parte del medio
6. Tomar el inóculo con el asa (el aro lleno).
7. Después de practicar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca del tubo.
Colocar los tapones.
8. Transferir el material al otro tubo.
Figura No. 3
Teniendo en cuenta la clase de siembra en tubo, se procede así; si el medio es sólido:

- Siembre con asa en estrías
Se realiza en un tubo con medio sólido inclinado en bisel, deslizando el asa sobre le superficie y
marcando surcos o estrías. (Ver figura No. 3a).
- Siembra con aguja en picadura central

Se designa con este nombre a la siembra que se realiza con asa recta en tubos de medios sólidos
o semisólidos generalmente sin inclinar; se introduce el asa cargada con la bacteria al medio de
cultivo por el centro de la superficie al fondo. (Ver figura 3c).
Si el medio es semisólido:
- Siembra mixta
Igualmente se realizan siembras mixtas en picadura central en el fondo del tubo y luego se
desliza el asa por la superficie en bisel marcando estrías. (Ver figura 3b)
SIEMBRA MIXTA SIEMBRA POR PICADURA CENTRAL

SIEMBRA EN ESTRÍAS
a) b) c)
d. Siembra en medio liquido

Para transferir un producto contenido en un medio liquido o sólido a otros medios líquidos se puede
usar pipetas estériles o asa; si se hace con pipeta, unas pocas gotas (2-3) son suficientes para el
desarrollo bacteriano, si se practica con asa una o dos asadas.
Procurando que todo el material tomado quede en el nuevo medio.
Nota:
- En toda siembra se debe anotar en forma clara la fecha y número de registro.
- Las cajas de petri se incuban invertidas para impedir que el agua de condensación que se
deposita en la tapa caiga sobre el medio y disperse las colonias.
- Al manipular con los tubos que contienen los microorganismos, aquellos han de ser sostenidas
de modo que queden casi paralelos a la superficie de la mesa para evitar la contaminación con
el aire.
- Cuando se trata de hacer extensiones en lámina o placas, se colocan los tapones en su sitio de
esparcir el material sobre el portaobjetos.
Cuestionario:
1. Por qué debe ser lisa la superficie del agar?
Consulta diferentes tipos de agares que se utilizan en Microbiología.
2. Según su experiencia qué precauciones debe tener para obtener una superficie lisa en el agar?.
3. Por qué no debe ser demasiado húmeda la superficie del agar?

Consulta los aportes de Koch a los medios de cultivo
4. Por qué al destapar el tubo de cultivo no deja el tapón sobre la mesa de trabajo?
5. Para qué debe flamear la boca del tubo de cultivo antes de taparlo?
Consulta los aportes de Robert Lister.
6. Qué precauciones debe tomar al destapar la caja de petri. ¿Por qué?
7. Cuál cree que sea el objeto de esterilizar el asa bacteriológica en los pasos 6, 8 y 9?
8. Por qué no puede destapar los dos tubos al tiempo?
9. Qué ventajas tiene el cultivo en frasco bacteriológico?

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“Ten miedo cada vez que no digas la verdad”
GUÍA PRÁCTICA No. 5: RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA
CONCEPTOS GENERALES.
Se efectúan cuentas de colonias después de haber sembrado en placa cantidades alícuotas de la
muestra. La cuenta estándar en placa no se recomienda para el caso del agua porque la que contiene
pocas bacterias patógenas obviamente es más peligrosa que la que contiene muchas saprofitas. Sin
embargo, lo usual es que el agua de buena calidad tenga cuentas bajas, menos de loo por mililitro.
Las cuentas en placa son útiles para determinar la eficiencia de las operaciones para eliminar
microorganismos, como la sedimentación, filtración y floración. Las cuentas se deben hacer antes y
después del tratamiento específico. Los resultados indicarán la medida en que ha sido reducida la
población microbiana.
El recuento estándar en placa es un método empírico y relativamente poco preciso, ya que trata de
enumerar todas las bacterias presentes en el agua, con base en el número de colonias que logren
desarrollarse en el medio de cultivo. Parte de la base teórica, que una colonia se origina a partir de
una sola célula bacteriana, lo cual no es regularmente seguro, ya que las bacterias se pueden
presentar en pares, cadenas, grupos o paquetes.
Ningún medio de cultivo, ni condiciones físicas o químicas pueden satisfacer los requerimientos
fisiológicos de todos los tipos de bacterias presentes en una muestra de agua.
A través de un suministro de agua, pueden adquirirse infecciones entéricas si la causa que ocasiona
el problema no es descubierta, inmediatamente después que el microorganismo entérico contamine
el sistema de suministro de agua.
La distribución de la muestra sobre el medio, el tiempo de incubación, la temperatura, el pH, el

nivel de oxigeno, la antibiosis, la predación y en fin la competencia entre células bacterianas
impedirán el logro de un recuento real o exacto de todos los tipos de bacterias presentes en la
muestra.
Este procedimiento no permite a las bacterias aerobias exigentes o a las anaerobias obligadas,
desarrollarse. Además algunas bacterias de importancia en el agua, tales como Crenothrix,
Sphaerotilus, Actinomyces no se desarrollarían dentro del período de incubación, especificado de
rutina para esta prueba.
Los grumos de bacterias en la muestra de agua que no llegan a romperse por la agitación de ésta
provocarán la producción de densidades bacterianas menores, o sea, subestimación de resultados,
pues cada agregado de bacterias dará origen a una sola colonia.
Técnica de Diluciones
1 ml sin diluir (2 cajas)
-1
1 ml de la dilución 10 (2 cajas)
1 ml de la dilución 10 -2 (2 cajas)
1 ml de la dilución 10 –3 (2 cajas)
1 ml del agua del diluyente que se usara como control. Colocarlo en el tubo No. 6
NOTA: El método empleado para hacer las diluciones está indicado en la figura 1. Debe usarse una
pipeta diferente para cada dilución.
Añada 10 – 15 ml de Agar fundido y enfriado a 44 – 46ºC.
Figura 1. Ilustración del método de dilución y siembra para recuento estándar en placa.
Técnica de filtración por membrana
Figura 2, muestra la técnica de filtración por membrana para el examen bacteriológico del agua.
Se observa colonias de coliformes de una muestra de agua que se desarrollaron en un filtro de
membrana con medio de MF – Endo en el que adquieren un brillo metálico verde fácilmente
distinguible y presenta coloración que varía de rosa a rojo rosado.
La técnica de filtración por membranas consiste en los siguientes pasos:

1. Disco filtrante estéril se pone en la unidad de filtración.
2. Se hace pasar un volumen de agua por el disco filtrante, las bacterias serán detenidas en la
superficie de la membrana.
3. Se quita el disco filtrante y se pone sobre una almohadilla absorbente que previamente se ha
saturado con el medio de cultivo apropiado. Las almohadillas absorbentes con los discos
filtrantes se acomodan en cajas de Petri de tamaño especial, las cuales se incuban.
4. Después de la incubación, se desarrollarán colonias sobre el disco filtrante en cualquier lugar
donde hayan quedado bacterias atrapadas durante el proceso de filtración (véase Fig. 2).
Esta técnica tiene muchas aplicaciones útiles, algunas de las cuales son:
1. Se pueden examinar grandes volúmenes de agua; teóricamente casi cualquier volumen de agua
se puede filtrar a través del disco y los microorganismos de cualquier volumen quedarán en el
disco.
2. La membrana se puede pasar de un medio a otro con el propósito de seleccionar y diferenciar
los microorganismos.
3. Se obtienen resultados más rápidos que con los métodos convencionales.
4. Se logran estimaciones cuantitativas de ciertos tipos de bacterias, como coliformes, cuando se
usan los medios apropiados.
Esta técnica, con algunas modificaciones, ha sido adoptada para muchos procedimientos
microbiológicos diferentes de los del examen del agua.
Hay que ser consiente que la técnica de filtro de membranas, aunque no se presenta como una
panacea, ya que tiene ciertas limitación en su aplicabilidad, si ofrece por lo menos una alternativa
bastante rápida y viable sobre todo en caso de una emergencia. El procedimiento de filtración
consiste en pasar con ayuda del vacío la muestra de agua a través de una membrana de celulosa de
0.45 micrómetros. Luego incubar la membrana en el medio adecuado, según el objetivo del
análisis.
Materiales.
 Membranas de esteres de celulosa de 0.45 micrómetros.
 Cojinetes de filtración.
 Embudo de filtración.
 Matraz.
 Unidad de filtración.
 Incubadora.
 Bomba de vacío.
 Pinzas estériles.
 Medios de cultivo.
- Caldo lauril triptosa.
- Caldo Endo o Agar endo (M)
- Caldo M-FC o el M-FC Agar.
-
Procedimiento.
Todo el equipo utilizado en la prueba debe esterilizarse previamente..
Determinación de números de coliformes totales.

 Sujete el porta filtro al tapón de goma. Fíjelo al frasco de vacío y conéctelo a la bomba. Figura
3
 Usando pinzas estériles coloque un disco filtrante (membrana filtrante). Esterilizada sobre la
placa porosa de la unidad de filtración con la retícula hacia arriba.
 Vierta la muestra a filtrar (usualmente 100 ml) sobre el embudo, haciendo la filtración a través
de la membrana por medio de una bomba de vacío.
 Lave el embudo con agua destilada estéril (volumen 30 ml).
 Añada 1.8 – 2 ml de medio de enriquecimiento (caldo lauril triptosa). Para saturar la

almohadilla colocada en la caja de Petri.
 Separe la membrana filtrante del aparato de filtración y colóquela sobre la almohadilla

saturada del medio, de tal manera que no exista burbujas de aire entre ambas.
 Incube la membrana en el medio de enriquecimiento durante 1.5 – 2 h. a 35 ± 0.5ºC en una

atmósfera de humedad no menor del 90%.
 Traslade la almohadilla absorbente y la membrana filtrante a la tapa de una caja de Petri,

quintando con una pipeta el exceso del medio de enriquecimiento.
 Ponga otra almohadilla absorbente estéril en una placa Petri y pipetee sobre 1.8 – 2.0 ml de
medio de Endo modificado.
 Transfiera la membrana filtrante a la superficie de esta segunda almohadilla, con unas pinzas
estériles, teniendo cuidado de excluir el aire entre ambas superficies.
 Incube a 35  0.5ºC durante 20 – 22 horas.
 Al final del período de incubación cuente las colonias coliformes; aparecen de un color rojizo
oscuro con brillo metálico verdoso.
NOTA: Otra manera de efectuar el procedimiento es colocar la membrana filtrante enriquecida

sobre una caja de Petri con medio básico de Agar evitando que quede aire entre las dos superficies.
La almohadilla puede en este caso, ser transferida al Agar para ayudar a mantener la humedad.
Figura No. 3 Aparato con filtro de membrana.
Se añade el medio no estéril
Embudo
Pinza de sujeción
Filtro de membrana
Plataforma de vidrio
Base Al vacío
Goma
Medio
estéril
Figura No. 4 Separación del filtro a partir del aparato de filtración. (Tomado de Seeley H.W. Jr., y
Vandemark P.j., Microbios en acción, 1973).
Figura No. 5 Colocación del filtro sobre una almohadilla en una caja de petri. (Tomado de Seeley
H.W. Jr., y Vandemark P.j., Microbios en acción, 1973).
Tipos de Filtros
Hay tres tipos principales de filtros, Uno de los filtros más antiguos usados es el filtro de
profundidad. Un filtro de profundidad es una hoja fibrosa o una capa hecha por el amontonamiento
al azar de papel, asbestos o fibras de vidrio. El filtro de profundidad atrapa partículas en los
tortuosos pasos creados a través de la profundidad de su estructura. Como son bastante porosos, los
filtros de profundidad se suelen utilizar frecuentemente como prefiltros para eliminar las partículas
más grandes de una solución, con el fin de que no se produzcan atascos al final del proceso de
filtración. También se utilizan para la esterilización por filtración del aire, en procesos industriales.
El tipo de filtro más común en el campo de la microbiología es el filtro de membrana. El filtro de

membrana es un disco duro, generalmente compuesto de acetato de acetato de celulosa o de nitrato
de celulosa, que está fabricado de tal manera que contiene un gran número de diminutos agujeros.
El filtro de membrana difiere del filtro de profundidad en que el filtro de membrana funciona más
como una criba, atrapando muchas de las partículas sobre la superficie del filtro. Las membranas
son estructuras abiertas, con el 80 -85% aproximadamente ocupado por espacios. Esta apertura
proporciona una tasa de flujo del fluido relativamente elevada.
El tercer tipo de filtro de uso común es el filtro «Nucleopore». Estos filtros se crean al tratar
películas muy finas de policarbonato (10 micrómetros de grosor) con radiación nuclear y tratando
luego la película con un producto químico. La radiación provoca daños localizados en la película y
el tratamiento químico agranda estos puntos dañados convirtiéndolos en agujeros. El tamaño de los
agujeros puede controlarse con precisión mediante el tipo de la solución para el tratamiento y el
tiempo del mismo. Un filtro Nucleopore típico tiene orificios muy uniformes; dispuestos casi
verticalmente a través de una fina película. Los filtros Nucleopore se utilizan mucho para la
microscopia electrónica de barrido de los microorganismos. Por filtración se puede recoger
fácilmente de un líquido un organismo de interés, quedando las partículas dispuestas sobre un plano
uniforme en la parle superior del filtro, en donde pueden ser fácilmente estudiadas al microscopio.
Cálculo de la Densidad de Coliformes Totales.
La densidad de coliformes totales se expresa:
Densidad de coliformes totales/100 = colonias coliformes T . contadas

x100
ml.de muestra filtrada
Determinación del Número de Coliformes Fecales.

Para la determinación del número de coliformes fecales usando la técnica del filtro de membrana se
sigue el procedimiento utilizado en el punto de la determinación de coliformes totales teniendo en
cuenta las siguientes variaciones.
 Utilice un medio enriquecido con lactosa denominado medio M – F.C.

 Incube a 44.5  0.2ºC durante 24  2 h.
 Se usa comúnmente un baño de maría teniendo cuidado de colocar las cajas en bolsas de
plástico a prueba de agua.
 Las colonias de coliformes fecales aparecerán de un color azul.
Cálculo de la Densidad de Coliformes Fecales.
La densidad de coliformes fecales se expresa:

colonia coliformes F contadas
Densidad de coliformes fecales/100 ml  x100
ml de muestra filtrada
MÉTODO DE DILUCIÓN Y SIEMBRA PARA RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA
Con este procedimiento se pueden contar colonias viables, utilizando diluciones seriadas de la
muestra. El diluyente puede ser simplemente agua. El factor de dilución, es el recíproco de la
dilución.
MONTAJE MICROSCÓPICO DIRECTO UTILIZANDO LA CÁMARA

PETROFF-HAUSSER
MÉTODO PARA REALIZAR UN CONTAJE DE VIABLES (CONTAJE EN PLACA) EN

CUALQUIER CASO LA MUESTRA DEBE SER PREVIAMENTE DILUIDA

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“La obra humana mas bella es la ser útil al prójimo”
GUÍA PRÁCTICA No. 6: TÉCNICA DE LOS TUBOS MÚLTIPLES DE FERMENTACIÓN

PRUEBA NORMALIZADA
CONCEPTOS GENERALES.
El agua puede ser perfectamente clara, libre de olores y sabores indeseables y sin embargo, estar
contaminada. Esta contaminación puede ser por microorganismos patógenos o dañinos que llegan
al agua y que en un momento dado la hacen peligrosa para consumo humano o animal. La
potabilidad de un agua se puede determinar por pruebas de laboratorio tanto fisicoquímicas como
bacteriológicas.
Podría pensarse que la manera más adecuada de determinar si un agua está contaminada por
microorganismos patógenos sería el aislamiento de dichas bacterias, sin embargo, esto no es lo
recomendado debido a varias causas:
 Se necesita varios días para obtener los resultados de los exámenes de laboratorio que
determinen con exactitud la presencia de un microorganismo patógeno específico.
 Muchas personas podrían haber tomado agua antes de conocerse los resultados y así haberse
expuesto a la infección.
 Los organismos patógenos llegan al agua en forma esporádica y no sobreviven mucho tiempo,
por tanto, pueden no estar o no detectarse en una muestra que se envíe al laboratorio.
 Por el contrario es más sencillo y rápido determinar la presencia o no, de otros
microorganismos no patógenos que comparten algunas veces el mismo hábitat con los
patógenos. Por consiguiente el hallazgo de los saprofitos indicaría la posible presencia de un
patógeno.
Se sabe que los microorganismos patógenos llegan al agua procedente de las descargas intestinales
de los humanos y los animales. Ciertos tipos de bacteria tales como Escherichia coli y varios
microorganismos afines denominados Coliformes(además de los Estreptococos fecales, etc) son
habitantes normales del intestino y en consecuencia siempre están en las materias fecales: de tal
manera que la presencia de estos coliformes, indica que el agua está contaminada con materia fecal,
existiendo por tanto la probabilidad que cualquier patógeno haya llegado a ella.
Se ha usado por mucho tiempo el grupo de bacterias coliformes como indicadores de la
contaminación del agua con excretas, éstos gozan de algunas ventajas al compararlos con otros
indicadores.
Los microorganismos coliformes particularmente la Escherichia coli se encuentran en número muy
grande en el intestino y generalmente sobreviven en el agua durante más tiempo que los patógenos.
Por lo regular una persona sana no elimina microorganismos patógenos; pero puede desarrollar una
infección intestinal y esos microorganismos aparecerán en materia fecal.
Así, la presencia de coliformes en el agua, se toma como señal de alarma, pues, ha sido
contaminada peligrosamente.
El grupo coliforme comprende todas las bacterias en forma de bacilos GRAM NEGATIVAS, que
son aeróbicas o anaeróbicas facultativas, no formadoras de esporas y fermentadoras de la lactosa en
un tiempo de 24 – 48 horas a temperatura de 35ºC. Para bacteriología de aguas y en relación con la
familia ENTEROBACTERIACEAE este grupo comprende los siguientes géneros: ESCHERICHIA
– CITROBACTER, ENTEROBACTER y KLEBSIELLA.
Varias investigaciones hechas en el campo de la microbiología acuática han demostrado que los
organismos coliformes presentes en el tracto intestinal y por tanto en las heces de animales de
sangre caliente, generalmente incluyen organismos capaces de producir gas a partir de lactosa en un
medio de cultivo apropiado a temperatura de 44.5ºC  0.2ºC. Organismos coliformes procedentes
de otras fuentes (suelo, vegetación) no puede producir gas bajo las anteriores condiciones.
Esto lleva a concluir que podemos hablar de dos tipos de origen para organismos coliformes; los de
origen fecal, es decir provenientes de materia fecal; y los de origen no fecal (a partir del suelo y la
vegetación).
La suma de los coliformes de origen fecal más los de origen no fecal constituye los denominados
Coliformes totales.
2. RECOLECCIÓN PRESERVACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA.

La recolección, preservación y almacenamiento de la muestra son muy importantes, a tal punto que
los resultados de los análisis dependen en gran parte de la forma correcta como se tome la muestra.
Un muestreo debe ser programado de tal forma que satisfaga los objetivos del estudio, claro está
teniendo en cuenta limitaciones de mano de obra, tiempo y costo.
Deben utilizarse frascos de vidrio preferiblemente de borosilicato de sodio que sea resistentes a las
condiciones de esterilización. Estos frascos deben ser de boca ancha, con tapa de rosca o tapón
esmerilado; o también pueden usarse botellas de plástico, resistentes al calor y que no produzcan
sustancias tóxicas.
Los frascos deben lavarse y enjuagarse varias veces con agua destilada antes de la esterilización. Si
la muestra de agua que se va a tomar es tratada con cloro u otros halógenos deben agregarse al
frasco un agente reductor tal como el tiosulfato de sodio. Este debe añadirse al frasco, antes de la
esterilización.
A un frasco de 120 ml, añada 0.1 ml de una solución al 10% de tiosulfato de sodio (esta neutralizará
una muestra que contenga cerca de 15 mg/litro de cloro residual).
En el momento de la toma de muestras deben tenerse en cuenta las siguientes recomendaciones:
 Mantener el frasco cerrado hasta el momento de tomar la muestra.

 Al llenar el frasco dejar un espacio suficiente de aire (2.5 cm aproximadamente) para facilitar
la mezcla por agitación, antes de proceder a la siembra.
 Remover con cuidado la tapa sin tocar el cuello del frasco y los alrededores, con los dedos y
protegerse de la contaminación.
 Una vez tomada la muestra se debe proceder a tapar el frasco inmediatamente, y trasladarlo al
laboratorio con la identificación respectiva anotando la fecha, hora, sitio de recolección,
localidad y persona responsable del muestreo.
 Si la muestra no se procesa dentro de una hora después de la toma, debe utilizarse transporte
refrigerado por debajo de 10ºC durante un máximo tiempo de 6 horas.
 Una vez recibidas en el laboratorio pueden refrigerarse hasta por dos horas, antes de su
procesamiento. Si las condiciones locales obligan a retraso mayor de 6 horas, debe
considerarse la posibilidad de hacer un examen de laboratorio, en el sitio de toma de la
muestra, utilizando equipo de campo especial o usar procedimientos de incubación retardada.
 En ningún caso el tiempo, entre la recolección y el examen debe exceder de 30 horas. Es
necesario anotar en los registros, el tiempo y la temperatura del transporte y del
almacenamiento como información importante para la interpretación de los resultados.
3. MATERIALES.
Medios de cultivo así:
Tubos de 175 x 22 m.m. - Caldo lauril triptosa.
Tubos de 150 x 16 mm. - Caldo lactosado bilis verde
Tubos de Durham. brillante.
Pipetas de 10 ml y 1 ml. - EMB (eosina azul de metileno).
Gradillas. - Caldo Escherichia coli
Mechero. - Agar nutritivo.
Incubadora a 35.5ºC.
Baño de maría a 44.5ºC.
Asas de inoculación.
Colorantes para la coloración de Gram.
Microscopio.
Láminas portaobjetos.
4. PROCEDIMIENTO.
4.1. Método para determinar el número más probable de Coliformes totales, este método consta de
tres partes (ver figura 4-5).
4.1.1. Prueba Presuntiva.
Consiste en sembrar diferentes volúmenes de muestra en escala de múltiplos y submúltiplos de 1 ml
(10, 1, 0.1, 0.01 ml etc). Es necesario sembrar 5 tubos por cada volumen de muestra.
La escogencia de los volúmenes depende de la muestra que se va a procesar. Como guía para lo
anterior se puede recomendar los siguientes.
Si se trata de aguas potables debe sembrarse 10, 1 y 0.1 ml (5 replicas de cada una).
Para aguas relativamente no poluídas los volúmenes de muestra deben ser 1, 0.1 y 0.01 ml.
Para aguas poluídas desconocidas los volúmenes deben ser 0.1, 0.01, 0.001 ml. etc.
 Agitar los tubos vigorosamente alrededor de unas 25 veces e incubar a 35  0.5ºC por 24 –
48  3 h.
 Al cabo de 24 horas de incubación, examinar la presencia de gas y turbiedad.
 En caso negativo, reincubar por un período adicional de 24 horas.
 Reexaminar. Si no hay cambios, reportar la prueba presuntiva como negativa.
 En caso contrario todos los tubos positivos de la prueba presuntiva debe someterse a la prueba
confirmativa.
4.1.2. Prueba confirmativa.

Consiste en inocular a partir de cada uno de los tubos positivos de la prueba presuntiva, por medio
de un asa bacteriológica o un aplicador, un tubo con caldo lactosado bilis verde brillante.
 Agitar los tubos cuidadosamente e incubar a 35  0.5ºC durante 24 – 48  3 h.
 Después de 24  2 h, examinar la presencia de gas y turbiedad.
 En caso negativo reincubar por un período adicional de 24  3 h.
 Reexaminar. Si no hay cambio, la prueba confirmativa se reporta como negativa.
 En caso contrario, o sea si hay presencia de gas y turbiedad (prueba positiva), se procederá a
efectuar la prueba completa con cada uno de los tubos.
 En análisis de rutina la mayoría de las muestras se procesan hasta la prueba confirmativa. Sin
embargo, estos datos deben verificarse llevando a cabo la prueba completa en el 5% de las
muestras, con un mínimo de 1 muestra con prueba completa.
4.1.3. Prueba completa.

Consiste en sembrar a partir de cada uno de los positivos de la prueba confirmativa una caja de Petri
que contenga Agar EAM (eosina azul de metileno), también llamado EMB.
 Sembrar el inóculo (1 asada) por el método de agotamiento en superficie (método de estría).

 Incubar durante 24  2 horas a 35  0.5ºC.
 En general pueden desarrollarse varios tipos de colonias. Las típicas del grupo coliforme
(positivas), son nucleadas, con o sin brillo metálico. Las atípicas son pocas, no nucleadas,
mucoides, rosadas. Las negativas son transparentes.
 Escoger tres colonias (dos típicas y una atípica y sembrar cada una de ellas en un tubo con un
caldo Lauril Triptosa y otra con Agar nutritivo inclinado).
 Incubar el caldo Lauril Triptosa durante 24 – 48  3 h. y el Agar nutritivo inclinado durante
24  2 horas ambas a 35  0.5ºC.
 Examinar los tubos de caldo lauril triptosa después de la incubación para determinar
producción de gas con la consiguiente turbiedad.
 Hacer extendidos y colorear con Gram, a partir de las colonias crecidas con el agar nutritivo
inclinado que correspondan a los tubos de caldo lauril triptosa que hayan revelado presencia de
gas a partir de las colonias del EMB.
NOTA: La coloración de Gram puede omitirse de la prueba completa que se haga, solamente para
aguas potables.
4.1.4. Cálculo de los resultados.

El cálculo de la densidad probable de coliformes totales en una determinada muestra esta basado en
la combinación de los resultados de los tubos positivos y negativos obtenidos en cada dilución o
volumen sembrado.
Esta densidad se expresa como NMP (Número Más Probable) de coliformes totales por 100 ml.
El NMP se obtiene a partir de la comparación de los resultados obtenidos de la muestra, con las
tablas especialmente diseñadas, las cuales tienen límite de confianza del 95%.
Es indispensable disponer de tres series de diluciones o volúmenes de muestras (múltiplos y

submúltiplos de 1), para obtener el código con el cual se debe buscar el número correspondiente al
NMP en la tabla.
Ejemplo: Si hemos sembrado cinco porciones o replicas de 10 ml, 5 de 1 ml. y 5 de 0.1 ml, de los
cuales resultaron positivos 5 de 10 ml, 2 de 1 ml y 1 de 0.1 ml. El código resultante será 5 – 2 – 1.
Al buscar en la tabla este código corresponde a un índice de 70/100 ml con un límite inferior de 23
y superior de 170.
Aunque la tabla, se refiere específicamente a la combinación de resultados positivos obtenidos,

cuando son inoculados volúmenes de 10, 1 y 0.1 ml de muestra, esta puede ser usada cuando se
siembran volúmenes mayores o menores de muestra.
En este caso se busca el número de la tabla correspondiente al código, teniendo cuidado de aplicar
la siguiente fórmula:
10
Valor del NMP de la tabla x  NMP/100ml
mayor volumen sembrado
Ejemplo:
Si hemos sembrado 5 porciones o réplicas de 0.01 ml 5 de 0.001 ml y 5 de 0.0001 ml, de las cuales
resultaron positivas 5 de 0.01 ml, 2 de 0.001 ml y 0 de 0.0001 ml, el código será 5 – 2 – 0.
Al buscar en la tabla, este código corresponde a un índice de 49/100 ml.

Aplicando la formula tendremos.
49 x10
NMP   49.000 / 100ml
0.001
Cuando se inoculan más de tres diluciones o volúmenes de muestra, se debe determinar las tres
diluciones significativas, de acuerdo con las siguientes reglas:
 Solamente deben usarse tres diluciones en el código, para calcular el valor del NMP.
 Como primer número del código, seleccionar los volúmenes de muestra más pequeños en los
cuales todos los tubos resultaron positivos (5) y los dos volúmenes o diluciones menores que le
sucedan. (ver tabla 19, pruebas 1 y 2).
 Si menos de tres diluciones muestran tubos con resultados positivos, se seleccionarán los tres
mayores volúmenes de muestra incluyendo las diluciones con los tubos positivos (tabla
prueba 3).
 Si resultaran tubos positivos en diluciones más altas o mayores que en aquellas escogidas para
el código, dichos positivos se suman a la dilución más alta de las tres seleccionadas en la
primera ocasión (tabla 19, prueba 4).
 No debe haber resultados negativos en volúmenes de muestra superiores a aquellos escogidos.

Sin embargo, si aparecen tubos negativos. Ejemplo: 4/5, 3/5, y 0/5. debe usarse el mayor
volumen de muestra con todos los tubos positivos, junto con los dos siguientes volúmenes de
muestra más bajos (tabla 19, prueba 5).
 Si todos los tubos son positivos se escogen las tres diluciones más altas (tabla 19, prueba 6).
 Si todos los tubos son negativos, escoger para el código, las tres diluciones más bajas (tabla
19, prueba 7).
 Si no resultaran tubos positivos en una dilución intermedia, seleccionar para el código, la

dilución más alta con tubos positivos y las dos diluciones más bajas (tabla 19, prueba 8).
 Si solamente la dilución intermedia es positiva. Escoger para el código ésta dilución, la

siguiente más alta y la anterior más baja (tabla 19, prueba 9).
TABLA 19. SELECCIÓN DE CÓDIGO DE RESULTADOS. SERIE DE CINCO TUBOS.

PRUEBA 10 1.0 0.1 0.01 0.001 0.0001 CÓDIGO
1 5 3 0 0 0 0 5–3–0
2 5 5 4 0 0 0 5–4–0
3 - 4 1 0 0 0 4–1–0
4 5 5 4 1 1 0 5–4–2
5 4 5 3 0 0 - 5–3–0
6 - 5 5 5 5 5 5–5–5
7 - 0 0 0 0 0 0–0–0
8 - 4 0 2 0 0 4–0–2
9 - 0 1 0 0 0 0–1-0
4.1.5 Reporte de los resultados.

El reporte del valor del NMP (Número Más Probable) de coliformes totales en las muestras
de agua, se expresa con base en 100 ml de muestras: NMP de coliformes totales/100 ml.
Método para determinar el número más probable de Coliformes Fecales.

La prueba para determinar el NMP (Número Más Probable) de coliformes fecales es aplicable a
investigaciones de fuentes de agua cruda, corrientes de agua poluída, sistemas de tratamiento para
aguas residuales, aguas recreacionales, aguas marinas.
Este procedimiento no es recomendado como un sustituto para la prueba de coliformes en el

examen de agua potable, ya que no se tolera ningún tipo de coliformes en aguas tratadas.
 Esta prueba consiste en transferir inóculo a partir de los tubos positivos del caldo lauril triptosa
de la prueba presuntiva para coliformes, a tubos con caldo E.C. (ver figura 5).
 Incubar a 44.5  0.2ºC durante 24  2 horas en baño maría, teniendo cuidado que el tiempo
transcurrido entre la siembra y la colocación en baño maría no exceda de 30 minutos.
 El nivel del agua en el baño maría debe mantenerse por encima del nivel del medio de cultivo.
 Cualquier cantidad de gas en el tubo Durham, del medio de cultivo constituye una prueba
positiva para coliformes fecales.
4.2.1. Cálculo de los resultados.

El cálculo de la densidad probable de coliformes fecales se obtienen con base en la
combinación de los resultados positivos y negativos obtenidos en los tubos con medio E.C.
de acuerdo con la tabla de NMP utilizadas para coliformes totales, teniendo en cuenta las
reglas señaladas allí la densidad de coliformes fecales se expresan como: NMP de
coliformes fecales/100 ml.
4.2.2. Reporte de los resultados.
El reporte del valor del NMP (Número Más Probable) de coliformes fecales en las muestras
de agua, se expresa con base en 100 ml de muestra: NMP de coliformes fecales/1
UNIVERSIDAD DEL QUINDÍO
75
MUESTRA
CALDO LAURIL TRIPTOSA

Incubar a 35  0.5ºC
GAS + 24 h GAS 24 - h
Reincubar 24 h
GAS + /48 h
PRUEBA POSITIVA GAS - /24 h
Coliforme Presente Prueba negativa
CALDO VERDE BRILLANTE BILIS

35  0.5ºC
GAS - 24 h
GAS +24 h
Reincubar 24 h
GAS +/48 h
Prueba positiva Coliformes presente GAS -/48 h
Prueba negativa
AGAR EOSINA AZUL DE METILENO

24 h 35  0.5ºC
Figura No. 4 Coliforme total

Coliforme total Presente
Colonias típicas y atípicas de coliforme
Presente Colonias ausentes
DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA

Agar nutritivo 24 h Caldo Lauril Triptosa PRUEBA DE NMP DE COLIFORMES
35  0.5ºC 24-48 h 35  MUESTRA
0.5ºC TOTALES (TOMADO DE
OPES/OMS/CEPIS. MÉTODOS
SIMPLIFICADOS DE ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICOS DE AGUAS
RESIDUALES. BORRADOR PARA
Gram + Bacilos Gram – Bacilos no REVISIÓN PREPARADO POR
esporulados esporulados GAS + GAS -
Caldo Lauril Triptosa CARMEN VARGAS DE MAYO 1983)
Incubar a 35  0.5ºC
GAS + 24 h GAS 24 - h
GAS + 48 h Reincubar 24 h
Prueba dePrueba
temperatura
positivaelevada
Coliforme fecal presente
Medio
GAS +24 h Escherichia Prueba negativa
Presente a 44  0.2ºC
Coliforme Incubar
coli
GAS -
GAS - 24 h Prueba negativa
76
FIGURA No. 5: DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA PRUEBA DE NMP DE COLIFORMES FECALES

(TOMADO DE OPS/OMS/CEPIS. MÉTODOS SIMPLIFICADOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS
DE AGUAS RESIDUALES. BORRADOR PARA REVISIÓN PREPARADO POR CARMEN VARGAS DE
MAYO 1983).

_________________________________________________________________________
“El hombre con pereza, es un reloj sin cuerda”
GUÍA PRÁCTICA No. 7: ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO PARA AISLAR Y DETERMINAR CEPAS

BACTERIANAS GRAM NEGATIVAS
Tomado del trabajo de investigación realizado en la curtiembre Sierra Pérez, sector La María
Municipio de Calarcá – Quindío a cargo de la Magíster María Inés Gallego Murillo.
I. OBJETIVOS
Aislar cepas de enterobacterias (Gram-negativas), a través de análisis bacteriológico para
determinar su procedencia, requerimientos nutricionales y condiciones ambientales en el cual se
desarrollan.
Conocer y aplicar las pruebas bioquímicas para aislar e identificar cepas Gram-negativas (por
ejemplo Echerichia coli).
II. MATERIALES, REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVOS NECESARIOS.
Agar MacConkey Asa bacteriológicas

Lurian Bertani Mecheros
Tinción de Gram Parafina líquida
77
Tira de oxidasa Asa recta
Medio oxidación – fermentación Tubos de ensayo
Medio fluorescencia lactosa – nitrato Goteros
Agar triple azúcar hierro Aguas con estiércol
Agar de hierro lisina Pipetas
Agar citrato simmons Microscopio
Caldo Triptona (indol) Aceite de inmersión
Agar urea Láminas portaobjetos
Agar sulfuro indol motilidad Laminillas cubreobjetos
Caldo voges-proskauer Fuente de luz ultravioleta
Perióxido de hidrógeno al 30% Reactivo de Kovacs
Tubos de rosca Solución  -naftol 5%
Cajas de petri Solución KOH al 40%
III. PROCEDIMIENTO
Con anterioridad a la práctica de laboratorio se han preparado los medios de cultivos necesarios, las
diluciones (de 1 a 5) de las cepas bacterianas que se desean trabajar, la siembra primaria en Agar
MacConkey a 30ºC por 24 horas y la siembra selectiva en medio Lurian Bertani a 30ºC por 24
horas, para aislar las cepas bacterianas que se deseen identificar.
a. Identificación de cepas Gram-negativas

Tome una muestra de la siembra realizada en Lurian Bertani y proceda a realizar la tinción de
Gram. Observe la coloración que toman las bacterias. Tome muestras y observe al microscopio.
b. Pruebas bioquímicas de las colonias sospechosas.

1. Oxidasa: Tome con el asa bacteriológica una muestra de la colonia que desea investigar y
colóquela sobre una tira de oxidasa.
Si toma una coloración azul intenso se considera como positiva y si no hay cambio de color
como negativa.
Esta prueba determina la presencia de la enzima oxidasa, microorganismos Gram-
negativos de crecimiento exigente, o fermentadores.
2. Oxidación – Fermentación (OF)

Agregue en dos tubos de ensayo con rosca 3 – 4 ml de medio OF, en posición vertical hasta
solidificarse. Observe y apunte la coloración del medio de cultivo. Proceda a inocular los tubos
con el medio OF por el procedimiento de picadura hasta el fondo con una asa recta e
impregnada con abundantes colonias frescas de microorganismo en estudio, cubra uno de los
dos tubos inoculados con 0.5 – 1.0 ml. de parafina líquida. Ponga a incubar a 37ºC por 2 – 4
días, observando diariamente los tubos.
El viraje de color verde a amarillo indica producción de ácido. Cuando ocurre en los dos
tubos la reacción es fermentativo; si solo ocurre en el tubo que no contiene la parafina
indica una reacción oxidativa; y si no hay producción de ácido en ninguno de los dos tubos
indicará una reacción negativa por vía oxidativa o fermentativa.
Esta prueba determina la identificación de bacilos Gram-negativos de tipo no
fermentados.
3. Fluorescencia Desnitrificación (FLN)

Agregue 4 ml. de medio Fluorescencia – Lactosa – Nitrato en un tubo con rosca y deje
solidificar en posición inclinada. Inocule el medio por punción con una suspensión abundante
78
del microorganismo en estudio, estirando luego el pico, incube a 37ºC durante 24 – 48 horas.
Posteriormente, con una fuente de luz ultravioleta examine el tubo para detectar fluorescencia.
Una luminiscencia de color amarillo verdoso brillante indica prueba positiva. La
presencia de burbujas de gas en el fondo del medio indica la producción de nitrógeno por
desnitrificación y, un pico amarillo indica la producción de ácido por utilización de
lactosa.
Esta prueba permite diferenciar bacilos no fermentadores.
4. Agar Triple Azúcar Hierro (TSI)

Inocule en el medio de cultivo TSI, con una asa recta, por picadura hasta el fondo y por estría
en la superficie con colonias jóvenes y aisladas del microorganismo en estudio. Incube a 37ºC
por 24 – 48 horas.
El viraje de color del indicador de rojo a amarillo indica una fermentación o producción
de ácido positivo, ya sea en el fondo o en la parte superior del tubo k/k no hay
fermentación; A/k hay producción de ácido en el medio básico. El tubo de TSI debe
leerse siempre superficie y fondo.
Esta prueba determina la capacidad de un organismo de utilizar los hidratos de carbono,
con producción o no de gas, y la posible producción H 2S para bacilos Gram-negativos y
Enterobacterias.
5. Agar de hierro Lisina (LIA)

Inocule con un asa recta colonias jóvenes y aisladas del microorganismo por doble picadura
hasta el fondo del tubo con medio LIA y por estría en la superficie. Incube a 37ºC por 24 – 48
horas. Observe si ocurre un viraje.
6. Agar Citrato Simmons

Inocule con asa recta por estria en la parte inclinada del agar citrato Simmons con colonias
jóvenes y asiladas del microorganismo en estudio. Incube a 37ºC por 24-48 horas.
El viraje de color verde a azul intenso en el pico de flauta, además del crecimiento es
prueba positiva.
Esta prueba se utiliza para bacilos Gram-negativos y enterobacterias, además determina
si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono para su
metabolismo.
7. Caldo Triptona (Indol)

Tome una muestra de cultivo joven y puro del microorganismo en estudio y deposítela en un
tubo con caldo triptona. Incube a 37ºC por 24-48 horas. Después del tiempo de incubación
agregue 0.5 ml del reactivo de Kovacs sobre el caldo de cultivo.
Es prueba positiva cuando hay moléculas de indol libre y se produce un anillo de color
rojo en la superficie del medio de cultivo.
Esta prueba determina la capacidad de un microorganismo de desdoblar el indol de la
molécula triptófano.
8. Agar Urea
Inocule en la superficie y por estría en el medio agar urea con varias colonias aisladas del
microorganismo desconocido. Incube a 37ºC durante 24-48 horas.
El viraje de color inicial del indicador por la alcalinización del medio de amarillo a rosado
intenso es prueba positiva.
79
Esta prueba determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea, formando dos
moléculas de amoniaco.
9. Agar Sulfuro Indol Motilidad (SIM)

Con un asa recta inocule hasta media pulgada por debajo de la superficie del medio agar SIM
con colonias frescas que se desean estudiar. Incube por 18 – 24 horas a 37ºC. Observe luego la
motilidad positiva o negativa alrededor del crecimiento bacteriano.
Esta prueba se utiliza para ver la presencia o ausencia de flagelos en microorganismo no
fermentadores.
10. Caldo Voges – Proskauer

Inocule con un asa bacteriológica en el caldo Voges – Proskauer un cultivo joven del
microorganismo aislado. Incube a 37ºC por 24-48 horas. Al término del tiempo de incubación
agregue 0.5 ml de solución -naftol 5% y 1 ml de solución de KOH al 40%. Mezcle
perfectamente y deje reposar por 20 minutos.
Cuando se presente un viraje a rojo del color inicial en la superficie del caldo, se considera
la reacción positiva.
Esta prueba determina la capacidad de algunos organismos de producir acetoína a partir
de la fermentación de la glucosa.
11. Catalasa
Coloque una muestra de colonia del microorganismo en una caja de petri, agregue de 4 a 8
gotas de perióxido de hidrógeno al 30%. Observe el fenómeno que se presenta.
La formación de burbujas se considera como una reacción positiva de catalasa.
Esta prueba determina la producción de peroxidades en organismos aerobios y
microaerofíl
_________________________________________________________________________
“Las palabras que no van seguidas de los hechos, no cuentan para nada”
GUÍA PRÁCTICA No. 8: MICROCULTIVO DE HONGO
La citología de los microorganismos no se limita a estudiar las bacterias, incluye también los demás
protistas.
Los mohos son relativamente grandes y es fácil estudiar su morfología. La observación de muchas
de sus estructuras (con ciertas excepciones, como los núcleos) no requiere tinción alguna, basta con
montarlos en un portaobjetos y observarlos directamente al microscopio. Siempre existe el riesgo
de desbaratar o desorganizar, algunas de las delicadas estructuras de los mohos durante el proceso
de recolección y preparación del espécimen. Esto se evita por medio de la técnica del microcultivo.
OBJETIVOS.
1. Aislar hongos saprofitos a partir de frutas, van por medio de cultivo en lámina.
2. Saber identificar correctamente, mediante cultivo, hongos filamentosos, levaduras, etc.
MATERIALES
- Portaobjetos
- Cubreobjetos
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- Aplicadores
- Parafina
- Caja de Petri estéril con papel de filtro humedecido
- Asa o aguja. bacteriológica
- Tubos estériles
- Pipetas Pasteur
- Agar de Saboraud fundido
- Agua estéril
- Azul de lactofenol
PROCEDIMIENTO
1. Se toma un portaobjetos limpio se marca con lápiz vidiograf tres lados de un cuadrado del
tamaño de un cubreobjetos o un poco inferior, con el aplicador.
2. Siguiendo estas líneas colocar la parafina después de calentar un poco el portaobjetos. La altura
de la parafina deberá ser de 1-2 mm.
3. Colocar haciendo leve presión sobre ella el cubreobjetos caliente con el fin de que se fije
firmemente.
4. Se funde el medio de cultivo (agar de saboraud) y en el tubo estéril colocar aproximadamente 5
ml. Se deja enfriar a 50ºC se siembran con las esporas o material que se supone las contiene
utilizando para ello asa o aguja bacteriológica.
5. Después de mezclar se deja que el medio ya inoculado penetre por el lado abierto de la cámara
de cultivo hasta que ésta llene ¾ partes.
6. El portaobjeto así preparado se pone en una caja de petri estéril que tiene papel filtro húmedo
en el fondo.
7. Incubar a temperatura ambiente por 5 – 7 días. Hacer observaciones al microscopio, sin alterar
las estructuras del hongo.
Las observaciones se deben realizar cada 24 horas cuando haya ya suficiente crecimiento,
identifique con sus nombre las diferentes estructuras.
Los dibujos deberán mostrar las hifas y las esporas hasta llegar a la identificación del hongo que se
aisló.
EXAMEN MICROSCÓPICO DE HONGOS: Tomar en el portaobjeto una porción pequeña de

hongo y fragmentarlo en múltiples pedazos. Adicionar colorante azul de lactofenol y colocar
láminas cubreobjeto. Observar al microscopio.
Absidia species Rhizopus species
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Mucor species Aspergillus fumigates
Aspergillus flavus Aspergillus niger
Aspergillus terreus Curvularia species
82
Syncephalatrum species Nigrospora species
Chrysosporium species
Penisillium species
Scopulariopsis species Paecilomyces species
Fusarium cladosporium species
83
Bipolaris especies Acremonium especies
Cephalosporium Trichoderma species
Fusarium species
Cunninghamella species
84
Alternaria species Rhizopus species
Penicillium notatum

_________________________________________________________________________
“Sé fuerte, justo y alegre”
GUÍA PRÁCTICA No. 09 : OBSERVACIÓN DE PROTOZOARIOS Y MICROORGANISMOS
1. OBJETIVOS
a. Identificar algunos protozoarios a nivel de vida libre.
b. Desarrollar habilidades y destrezas en la observación de protozoarios
c. Identificar la gran variedad de protozoarios existentes en aguas de diversos lugares
d. Adquirir destrezas en la clasificación de los protozoarios observados.
e. Reconocer patrones de comportamiento de los microorganismos.
f. Diferenciar la estructura externa de los microorganismos.
g. Clasificar los microorganismos observados en la práctica.
h. Describir la importancia de los medios de cultivo.
2. MATERIALES
Muestra de aguas estancadas Solución salina
Alimentos y frutas en descomposición Azul de metileno
Algas Safranina
Microscopios Mecheros de alcohol
Láminas cubre y portaobjetos Pinzas de madera
Goteros Palillos para dientes
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Caja de Petri Asas
Aceite de inmersión Xilol
Estereoscopios Solución de levadura
PROTOZOARIOS DE VIDA LIBRE

Los protozoarios son organismos unicelulares, generalmente microscópicos y ampliamente
distribuidos en la naturaleza. La clasificación más elemental para todos ellos se hace con base en la
presencia de ciertas estructuras de locomoción: ciliados (presentan cilios), flagelados (presentan
flagelos), sarcodarios (presentan seudópodos) y esporozoos (carentes de estructuras locomotrices en
su forma adulta).
GENERALIDADES
Los protozoarios son organismos unicelulares que se presentan aislados o en colonias. Cada
protozoario es una unidad compleja y completa, que puede llevar a cabo las funciones fisiológicas
que en los organismos superiores dependen de muchas células especializadas. En su mayor parte
los protozoarios llevan vida libre, pero algunos son parásitos y se han adaptado a una existencia
especial dentro del huésped.
Las funciones vitales de los protozoarios corren a cargo del protoplasma, sustancias con organelos y
gránulos finos y gruesos; se divide en nucleoplasma y citoplasma, quien está formado por un
endoplasma y un delgado ectoplasma con funciones de movimiento, ingestión de alimentos,
excreción, respiración y protección. Los órganos de locomoción son prolongaciones del ectoplasma
ya sea seudopodos, cilios, flagelos o membranas ondulantes.
La colecta de protozoarios es relativamente fácil ya que habitan cualquier tipo de agua. Se requiere
sin embargo, el conocimiento del hábitat y hábitos para la búsqueda de un determinado grupo o
especie. Por ejemplo los paramecios se encuentran en aguas estancadas con materia en
descomposición; las euglenas en la superficie de las aguas tranquilas y a profundidades de 20 a 30
centímetros.
RECURSOS
 Frascos ámbar grandes, medianos y pequeños
 Aguas de diversos lugares (de charca, estanque, lago, quebrada, entre otras)
 Porta y cubreobjetos
 Gráficos
 Sustancias (biocloruro de metilo, verde de metilo acetificado)
 Microscopios
 Pipetas
 Estereoscopios
 Rótulos
RECONOCIENDO ORGANISMOS DE VIDA LIBRE

 Tome una gota del medio de cultivo en un portaobjetos y coloque el cubreobjetos
correspondiente. Proceda a realizar observaciones al microscopio. Realice el mismo
procedimiento con los otros medios de cultivo.
 Ayudado(a) de gráficos y características realice la descripción de cada organismo observado,
tanto a menor como a mayor aumento.
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 Como es el movimiento de los diferentes especímenes observados y la forma de cada uno.
 Denote las estructuras internas de cada espécimen y las funciones correspondientes.
 Mediante la forma o estructuras de desplazamiento, rapidez del movimiento y estructuras
internas, establezca grupos afine.
 Teniendo como base las fotocopias de los dibujos de los diversos protozoarios, comparar e
identificar con los encontrados en los cultivos estudiados.
 Realice la clasificación taxonómica de los diferentes organismos observados
 Mediante observaciones de cultivo de paramecios, describa el proceso de reproducción.
Nota: Debido a la velocidad de desplazamiento de los organismos es necesario que de acuerdo a las
circunstancias y para facilitar la observación agregue a la placa del cultivo que ha preparado una
gota de solución de bicloruro de mercurio. Agregue luego una gota de verde de metilo acetificado.
Observe a menor y mayor aumento. Describa las características observadas en estos especímenes
con estas condiciones.
CUESTIONARIO
- Qué características presentan el ectoplasma y endoplasma de las células (organismos observados).
- Realice un cuadro o describa la forma como inciden los estímulos como luz, calor sustancias químicas,
sustrato sobre los protozoarios observados.
- En que consiste el mecanismo de la gelación – solación en la amiba
- Dependiendo de los estímulos a que son sometidos los protozoarios (paramecio, euglena, etc.) que tipo
de reacción se presenta y como se denomina el proceso en cada caso.
- Diferenciados los conceptos de organismos sésiles y organismos de vida libre, realice un listado de
aquellos que pertenecen a cada uno de estos grupos.
CULTIVOS
Para el estudio de la estructura, fisiológica y ecología de protozoarios, se requiere un número
considerable; la utilidad de estos depende de ciertas condiciones propias del cultivo como son:
a. la provisión suficiente de alimentos. Por ejemplo, varias especies de paramecios viven casi
exclusivamente de bacterias.
b. La temperatura y constituyentes químicos deben ser suministrados en forma adecuada. Por
norma general se observa que las temperaturas bajas son más favorables que las altas.
c. Se debe evitar la depredación, eliminando especies capaces de terminar a los de menor defensa.
Ejemplo, el Didinium frente a paramecios.
PREPARACIÓN MEDIOS DE CULTIVO

Una vez traído el material (aguas de diferentes lugares, registrando el medio natural) al laboratorio,
es necesario colocar los protozoarios, en un volumen de agua menor para concentrarlos. Para ello el
agua puede parcialmente ser filtrada a través de una tela o gasa, y el residuo vertirlo con cuidado a
un recipiente adecuado, antes de que la filtración sea completa
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1. Astasia 11. Mallomas 21. Vovox 30. Arecella

2. Ceratium 12. Monas 22. Codosiga 31. Difflugia
3. Chlamydomonas 13. Pandorina 23. Oikomonas 32. Euglypa
4. Chilomonas 14. Paranema 24. Bodo 33. Centropyxis
5. Dinobryon 15. Peridinium 25. Naegleria 34. Trinema
6. Entosiphon 16. Pahcus 26. Hartmanella 35. Actinophys
7. Eudorina 17. Pleodorina 27. Amoeba 36. Actinosphaerium
8. Fudorina 18. Polytoma 28. Thecamoeba 37. Acanthocystis
9. Euglena 19. Synura 29. Mayorella 38. Vampyrella
10. Gonium 20. Uroglena
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1. Vamprylla lateritia (ward and whipple). 22. Euglena viridis

2. Amoeba proteus 23. Trachelomonas
3. Amoeba radiosa (Ward) 24. Peridinium
4. Entomoeba dysenteriae, varios estados (Pizon) 25. Chlamydomonas steinii (Deflandre)
5. Pelomyxa palustris 26. Noctiluca scintillans (Kühn)
6. Arcella discoides 27. Trichomonas homini
7. Difflugia 28. Streblomastix strix (kidder)
8. Lagena 29. Monosiga ovata (Defl.)
9. Actinophrys sol 30. Peranema
10. Acanthometra 31. Trypanosoma gambiense
11. Gregarina 32. Mastigamoeba áspera (Schulxe)
12. Eimeria stiedae (storer) 33. Opalina ranarum
13. Plasmodium vivax, Estados (Deflandre) 34. Paramaecium
14. Sarcocystits tenella (Baraban) 35. Spiristomun
15. Nesema, varios estados (Ruiz) 36. Stentor polymorphus
16. Dinobryon sertularia (Klebs) 37. Halteria grandinella (Defl.)
17. Syracosphaera mediterránea (Kühn) 38. Tintinnidium transluscens (Defl.)
18. Distephan speculum (Küuhn) 39. Stylonychia (Defl.)
19. Volvox 40. Vorticella
20. Eudorina 41. Spaherophrya
21. Cryptomonas ovata (Pascher)
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Especies de euglena (Johnson).

a. Euglena pisciformis, 855 x; i. E. tripteris, con sección óptica del cuerpo 345x.
b. E. viridis, 400x j. E. ehrenbergi, 145 x
c. E. acus, 555 x k. E. terrícola, 345 x
d. E. spirigyra, 460 x l. E.sociabilis, 320 x
e. E. oxyuris, 200 x m. Dos individuos de e. klebri, 335 x
f. E. sanguínea, 400 x n. Dos individuos de e. rubra, 355 x
g. E. deses, 315 x
h. E. gracilis, 865 x
Dibujos semidagramáticos de nueve especies de Parmecium vistos por la superficie oral,

mostrando características distintivas, tomados de especímenes frescos y teñidos, 230 x
(varios autores)
a. P. caudatum f. P. calkinis
b. Pl aurelia g. P. trichium
c. P. multimicronucleatum h. P. polycryum
d. P bursaria i. Uroodruffi
e. Pl putrinum
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a. Pleuronema crassum, 240x h. C. media, 400x (Kahl)

b. P. anodontae, 290x i. Ctedoctema acanthocripta, 840x (Kahl)
c. P. setigerum, 540x j. Calyptotricha pleuromemoides, 180x (kahl)
d. P. coronatum, 540x k. Histiobalantium matans, 420x (Kahl)
e. P. marinum, 400 X (Noland) l. Semisetatum, 270x (Noland)
f. Cyclidium litomesum, 300x (sokes) m. Pleurocoptes hydractiniae, 470x (Wallengren).
g. Cristigera phoenis, 500x (pernard).
a. Bursaria truncatella, 60x (kahl) f. M. fuscus 150x (Kahl)

b. Thylacidium truncatum, 440x (Schewiakoff) g. M. circumlabens, 370x (Powers)
c. Bursaridium difficile, 210x (Kahl) h. Sprirorhynchus verrucosus, 360x (Kirby)
d. Metopus es, 260x i. Caenomorpha medusula, 200x (blochmann)
e. M. striatus, 220x
a-c, Chlamydomonae monadina, 470x i. Brachimonae westina, 960x (West)

a. Organismo típico j. Lobomonas rostrada, 1335x (Hazen)
b. Anisogamia k. Diplostarom pentagorium, 1110 x (Hazen)
c. Etapa de palmella) l. Gigantochloris permaxima, 370x (Pascher)
91
d. C. epiphytica, 1030x (Smith) m. Gloeomonas ovalis, 330x (Pascher)
e. C. globosa, 2000x (snow) n. Scourfieldia complanata, 1540x (West)
f. Gracilis, 770x (Snow) o. Trhorakomonas sabulosa, 670x
g. Haematococcus pluvialis, 500x (Reichenow) (korschikoff).
h. Sphaerollopsis fluviatilis, 490x
(Korschikoff)
a. Carteria cordiformis, 600x (Dill) i. Polyblepharides singularis, 870x (Dangeard)

b. Pyramimonas tetrarhynchus, 400x (Dill) J,k Pocillomonas flos aquae, 920x (steinechke)
c. d. Polytomella agilis, 1000x (Doflein) l. m. Phacotus lenticularis, 430 x (Stein
d. (un quiste) n. Pteromonas angulosa, 670x (West)
e. Sprirogaonium chlorogoniodes, 670x o,p. Dysmorphococcus variabilis, 1000x (Bold)
(Pascher)
f. Tetrablepharis multifilis, 670x (Stein)
g. Spermatozopsis exultans, 1630x (Pascher)
h. Chloraster gyrans, 670x (Stein)
a. Phacodintum metschnicoffi, 270x

b. Pseudoblepharisma tenuis, 310x
c. Parablepharisma pellitum, 340x (Kahl)
d. Condylostoma vorticella, 120x (Pernard)
92
e,f. Nyctotherus ovalis, 340x (kudo)
h. N. cordiformis, 170x (stein)
a-c, Vorticella campanula (a, 400x) (f,g, 400x 840x

b. Parte del tallo, 800x j. telotroco, 400x; j–p Formación del telotroco,
c. Telotroco, 200x) in vitro, 270x )
d, e, V. convallaria (d, 400x; e, 800x) q,r, V picta (q, 400x; r, 800x)
f-p, V. mictrostoma (f, g, 400x s,t, V. Monilata (s, 400x, t, 800x) (Noland and
Finley)
a. Carchesium polypinium, 200x (Stein).

b. C. granulatum, 220x (kellicott)
c. Zoothamnium arbuscula, 200x (Stein
d. Z. Adamsi, 150x (S
93
a. Stylonychia mytilus, 200x (Stein)

b. S. pustulata, 400x (roux)
c. S. putrina 200x (Stokes)
d. S. notopjora, 200x (Stokes)
e. Onychodromus grandis, 230x (Stein).
f. Onychodromopsis flexilis, 240x (Stokes)
g. Eupltes patella, 420x (Pierson)
h. E. eurystomus, 330x (pierson)
i. E. woodruffi, 310x (Pierson)
j. E. aediculatus
k. , 290x (Pierson)
Especies de Phacus (Allegre and Jahn)

a. Phacus pleuronectes, y una vista desde un e. P. momilata, 800x
extremo, 800x. f. P. torta, y una vista desde un extremo, 800x
b. P. longicauda, 500x g. P. oscillans, 1400x.
c. P. pyrum y una vista desde un extremo, 800x
d. P. acuminata y una vista desde un extremo,
1300x
94
a. Biscosoec socialis, 560x (lauterborn) d. Poteriodendron petiolatum, 440x (Stein)

b. Salpingoeca fusiformis, 400x (Lemmerann . e. Codonoeca inclinata, 540x (Kent)
c. Diplosigopsis affinis, 590 x (Francé) f. Lagenoeca ovata, 400x (Lemmermann)
d. Histiona zachariasi, 440x (Lemmermann).
a. Tetramitus rostratus, 620x (Lemmermann) j. Dos individuos adheridos al integumento del

b. T. pyriformis, 670x (Klebs) húesped, 500x (Kudo)
c. T. salinus, 1630x (Kirby) l. Enteromonas hominis, 1730x (Wenyon and
d. Colladictyon triciliatum, 400x (Carter) O’Connor)
e,j. costia necatrix (e, f, 800x (Weltner) m. Copromastix prowazeki (Aragao)
95
a. Coccomonas orbicularis, 500x (Stein) g. Hyalogonium klebsi, 470x (Klebs)
b. Chlorogonium euchlorum, 430x (Printiz) h. Polytoma uvella, 670x (dangeard)
c. Phyllomonas phacoides, 200x (Korschikoff) i. Parapolytoma satura, 1600x (Jameson)
d. Sphaenochloris printzi, 600x (Printiz) j. Trichloris paradoxa, 990x (Pascher)
e. Korschikoffia guttula, 1670x (Pascher)
f. Furcilla lobosa, 670x (Stokes)
a. Spirostomum ambiguum, 65x

b. S. minus, 140x
c. S loxodees, 240x (Stokes)
d. S. intermedium
e. S. teres, 200x 8Kahl)
f. S. filum, 190x
g. Gruberia calkinsi, 140x (Beltrán)
h. Blepharisma lateritium, 160x
i. B. steini, 340x (Pernard).
j. Protocruzia pigerrima, 390x (Faria, da cunha y Pinto)
96
a. Stentor coeruleus, algo contraido, 70x e. S. igneus, 160x (Kahal)

(Roux) f. S. amethystinus, 100x (Kahal)
b. S. polymorphus, 60x (Roux) g. Climacostomum vireus, 100x (Stein)
c. S. m+lleri 50x (Kahl)
d. S roeseli, 75x (roux(
Especies de volvux (Smith)

a, b, Volvox globator (a, una colonia femeninas, g. Una colonia masculina madura, 370x
150x. h. Un cigoto, 370x)
e. Un cigoto, 370x) i. Un cigoto de V. weismnnia, 370x
c-e V. Aureus (c, una colonia joven J, k, V. perglobator (j. una colonia masculina,
partenogenética 150x
d. una colonia masculina madura, k. un cigotos, 370x
e. Un cigoto, 370x )
f-h, V. spermatosphaera (f, una colonia
partenogenética, 185x.
97
a. Phalansterium digitatum, 540x (Stein) g. Protospongia haeckeli, 400x (Lemmermann)

b. Codosiga utriculus, 1340x (Stokes) h. Un individuo de Sphaeroeca volvox, 890x
c. C. disjuncta. 400x (Kent) (Lemmermann).
d. Monosiga ovata, 800x (kent) i. Diplosiga a francei, 400x (Lemmermann).
e. Em. Robusta, 770x (St0kes) j. D. socialis, 670x (Francé)
f. Desmorella moniliformis, 800x (Kent).
Clase MASTIGÓFOROS. Flagelados de agua dulce de vida libre; todos aumentados

aproximadamente a la misma escala
Estructura de Parameciun caudatum, ciliado de agua dulce (clase CILIADOS)

98
A. El animal entero. Las líneas de puntos indican las series de cilios existentes en su superficie.
Aumentado. Las flechas muestran el camino de las vacuolas alimenticias por el endoplasma.
B. Esquema aumentado, de algunos cilios, donde se ve cómo se mueven, según ondas coordinadas
que impelen al paramecium hacia delante (a la izauierda)
C. Contorno de la forma del cuerpo (sección trnasversal) en distintas posiciones, a lo largo del
mismo
Clase CILIADOS. Ciliados comunes de agua dulce; todos aumentados aproximadamente a la

misma escala. Macronúcleo, punteado grueso; vacuola contáctil en blanco.
PROCEDIMIENTO:
Tome en un frasco limpio una muestra de agua del fondo y de la parte superior de un lago, charco o
quebrada. Con un gotero deposito una gota de la muestra en un portaobjeto limpio. Coloque
cuidadosamente el cubreobjeto. Observe su preparación con el objetivo de menor aumento 10x y
luego con 40x y 100x (utilice para éste último aceite de inmersión). Observe el movimiento de los
microorganismos e identifique sus estructuras. Dibújelos.
Tome otra gota de agua estancada, agregue una gota de colorante (azul de metileno ó safranina).
Observe al microscopio y compare con las observaciones anteriores. Saque conclusiones y dibuje.
ALGAS
Las algas son los únicos seres fotosintetizadores que viven en el mar, y son de vital importancia en
el ecosistema marino, pues son grandes productores de materia orgánica. Se clasifican según el
color producido por un pigmento que se destaca mucho más que el color verde de la clorofila:
verdes o clorofíceas (lechuga de mar), pardas o feofíceas (fucus o sargasso) y rosas o rodofíceas
(gelidium).
Procedimiento:
Seleccione una hoja joven del extremo de un alga y póngala en un portaobjetos. Cúbrala con una
laminilla y obsérvela al microscopio. Trate de diferenciar la pared celular y los cuerpos ovales
verdes llamados cloroplastos. Dibuje.
99
El material de la célula se mueve y cambia de posición, por lo tanto efectúe los siguientes pasos
para observar mejor. Pase varias veces lentamente el fondo de la preparación por una llama
moderada del mechero, hasta calentarlo pero no mucho. Vuelva a observar al microscopio, dibuje.
BACTERIAS
Constituyen el grupo más abundante en cualquier medio. Algunas pueden causar enfermedades, ser
benéficas o simplemente inocuas al ser humano. Según su forma, las bacterias se clasifican en:
cocos (estreptococos, colonias agrupadas en cadena y estafilococos, colonias agrupadas en
racimos), bacilos (forma de bastón) y espirales (bastones retorcidos).
Procedimiento:
Tome con un asa metálica una pequeña muestra del cultivo de bacterias. Colóquelo en una lámina
portaobjetos, de tal manera que quede en forma de una película delgada. Cubra con laminilla.
Observe con los diferentes objetivos. Dibuje.
Tome otra muestra, caliente suavemente la lámina portaobjetos. Aplique un colorante, cubra con
laminilla y vuelva a observar al microscopio. Compare con lo observado anteriormente y dibuje.
HONGOS
Los hongos son organismos heterótrofos, requieren compuestos orgánicos para su nutrición.
Pueden ser beneficiosos para el ser humano, pero también pueden ser dañinos cuando pudren la
madera, tejidos, alimentos y otros materiales. La clasificación de los hongos se basa en las
características de las esporas sexuales y de los cuerpos fructíferos: imperfectos (sin estado sexual
conocido) y perfectos (phycomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes y Deuteromycetes).
Procedimiento:
Tome una muestra de los hongos de frutas, madera o alimentos en descomposición en una caja de
petri. Observe en el estereoscopio la forma, color, contextura. Trate de observar su cuerpo
fructífero. Dibuje.
“Siempre valdrá la pena observar a un hombre, que piensa las cosas dos veces”
100
GUÍA PRÁCTICA No. 10: GENETICA BACTERIANA.
Introducción.
Una mutación es un cambio en la secuencia nucleótida del DNA con lo cual se modifica la
información contenida en la molécula y da por resultado la formación de una proteína alterada.
Como el DNA es una molécula relativamente estable, las mutaciones son sucesos raros. Las
mutaciones bacterianas espontáneas que ocurren en condiciones normales de desarrollo son poco
frecuentes, se presentan en proporción de 10 -6 a 10-10 por bacteria, por generación, lo cual significa
que sólo una bacteria por millón sufre una mutación, pero la intensa proliferación bacteriana supone
que todo cultivo tenga probabilidad de variaciones.
Algunas variaciones ocurren por acción de la luz ultravioleta o de los rayos X; como estos son parte
ineludible del ambiente, explican muchas mutaciones espontáneas.
Algunos organismos desarrollan resistencia a ciertos antibióticos lo cual es de gran importancia en

el tratamiento de una enfermedad, pues los antibióticos originalmente muy eficaces para el control
de una infección bacteriana se vuelven menos eficaces o ineficaces cuando aparecen mutantes
resistentes a los antibióticos.
La mayoría de mutaciones son desventajosas y por lo tanto la mayoría de cepas mutantes tienden a
desaparecer, pero en cambio en las variaciones del medio ambiente podría favorecer su
proliferación. Un cambio drástico podría matarlas y dejar solo una forma mutante que se
propagaría sola en el medio. Esto es lo que sucede cuando los antibióticos pierden su efectividad
después de haber tomado grandes dosis de él.
Objetivos.
- Demostrar que los rayos ultravioletas producen mutaciones en la Escherchia Coli.
- Observar la relación entre la intensidad de mutaciones y el tiempo de exposición a las
radiaciones.
- Demostrar que la penicilina produce mutaciones en las bacterias.
- Analizar la mutación observada macroscópicamente.
- Investigar las aplicaciones prácticas de los efectos de los antibióticos.
- Investigar las aplicaciones prácticas de los efectos de las radiaciones.
Material.
Cajas de Petri estériles, baño maría, lámpara de ultravioletas, asas bacteriológicas, mecheros de
alcohol, gradillas, endo-agar, penicilina, cultivo de Escherichia Coli.
Acción de los rayos ultravioletas.
1. Prepare una caja de Petri con Endo-agar.
2. Con lápiz de cera, divida la caja Petri en cuatro cuadrantes y márquelos así: 180- 120- 60-
CONTROL.
3. Siembre en estrías el bacilo coli en el cuadrante marcado 180.
4. Destape la caja y expóngala a la acción de la luz ultravioleta durante 60 segundos.
5. Tape la caja retírela y repita los pasos 3 y 4 en los cuadrantes 120 y 60 respectivamente.
6. Siembre el cuadrante “CONTROL”, tape la caja e incube a 36°C durante 24 horas o más.
7. Observe periódicamente las colonias en los diferentes cuadrantes y anote las variaciones.
Acción de los antibióticos.

101
1. Coloque al baño maría 2 tubos con Endo-agar y licúelos.

2. En una caja de Petri vierta el contenido de un tubo de ensayo e inclínela para obtener una capa
de agar inclinado. Déjelo solidificar.
3. Agregue a la caja de Petri, en posición horizontal, agar con penicilina. El antibiótico
establecerá un gradiente de concentración lineal difundiéndose en el Endo-agar que se
encuentra debajo.
4. Lleve la caja a la estufa y abra un poquito la tapa para que seque la superficie y la tapa.
5. Marque con una flecha el gradiente de concentración de mayor a menor.
6. Inocule en estrías la Escherichia Coli siguiendo el gradiente de concentración.
7. Incube a 36°C.
8. Observe periódicamente después de 24 horas y anote las variaciones de color de las colonias.
NOTA. Los estudiantes deben trabajar en grupos. Para evitar confusiones, marquen muy bien las
cajas por ambos lados con el número del grupo. Individualmente hagan los diagramas completos y
anoten las observaciones de las lecturas periódicas
CUESTIONARIO.
I. Observe la caja expuesta a rayos ultravioletas y diga.

1. ¿Qué observa a primera vista en la placa?
2. ¿Qué relación hay entre el tiempo de exposición y las colonias de cada cuadrante?
3. ¿Para qué se pone un control? ¿Cómo lo observa en este caso?
4. ¿Macroscópicamente cual ha sido el efecto de los rayos ultravioletas sobre la

Escherichia Coli?
5. ¿Qué otro efecto pueden tener?
II. Observe la caja con antibiótico.

¿Analice las características de las colonias en la caja con antibiótico?
¿Cómo es el crecimiento de las colonias según el gradiente de concentración?
¿Qué efectos produce el antibiótico en la Escherichia Coli?
¿Explique otras consecuencias de acuerdo a sus conocimientos?
¿Con un ejemplo explique la inefectividad de los antibióticos con el uso excesivo de éstos?
BIBLIOGRAFÍA:
Textos guía:
102
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International, Inc., New Jersey. 909 p.
- Pelczar, M,J., Reid, R.D. y E.C.S. Chan. 1995 2ª ed. MICROBIOLOGÍA. McGraw-Hill, México. 826
p.
- Tortora, G.J., Funke, B.R. Y C.L. Case. 1993. INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA. Ed.
Acribia, S.A., Zaragoza. 792 p.
Textos de Consulta:
- Brock, T.D. y M.T. Madigan. 1993. 6ª ed. MICROBIOLOGÍA. Prentice-Hall Hispanoamericana S.A.,
México. 956p.
- Carpenter, P.L. 1969 2ª MICROBIOLOGÍA. Ed. Interamericano, México. 421p.
- Frosbisher, M. y R. Fuerst. 1976. MICROBIOLOGÍA. Ed. Interamericano, México. 554 p.
- Gebhart, L. P. 1972 4ª ed. MICROBIOLOGÍA. Ed. Interamericana, México
- Gutiérrez-Vásquez, J.M. 1968 MICROORGANISMOS. OEA, Dpto. de Asuntos Científicos

Serie de Biología, Monografía No. 6, Washington, D.C. 79p.
- Laskin, A.I. y H. A. Lechevalier (eds) 1977. 2nd ed. Vol. I BACTERIA; 1979. Vol. II FUNGI,
ALGAE, PROTOZOA and VIRUSES. Handbook of Microbiology. CRC Press.
- Pelczar, M.J. y E.C.S. Chan. 1991. ELEMENTOS DE MICROBIOLOGÍA. McGraw- Hill,

México. 826 p.
- Piatkin, K. 1968. MICROBIOLOGÍA. Ed. Mir, Moscú. 682 P.
- Sales, W. B. et al. 1963 MICROBIOLOGÍA GENERAL Y APLICADA. Salvat edit., S.A.,

Barcelona. 541 p.
- Vicent, J.A. 1960. LA ADAPTACIÓN EN LOS MICROORGANISMOS. Biblioteca Ibys de

Ciencias Biológicas, Madrid. 468 p.
- Walter, W.G. y R. H. Macbee. 1972 2ª ed. MICROBIOLOGÍA GENERAL. Compañía

Editorial Continental, S.A., México. 470 p.
Textos de laboratorio sobre temas específicos:
- Bradshaw, L.J. MICROBIOLOGIA DE LABORATORIO. El Manual Moderno, México. 231p.
- Botero, D. y M. Restrepo. 1992. 2ª ed. PARASITOSIS HUMANAS. Corporación para Investigaciones
biológicas. Medellín. 418 p.
- Board, R.G. 1988. INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA MODERNA DE LOS ALIMENTOS.

Ed. Acribia, Zaragoza. 271 p.
- Burges, A. 1960. INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA DEL SUELO . Ed. Acribia, Zaragoza.

199 p.
- Burges, A. y F. Raw (eds.) 1971. BIOLOGÍA DEL SUELO. Ed. Omega, S.A., Barcelona. 396 p.
103
- Frazier, W.C. 1981. MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS. Ed. Acribia, Zaragoza. 512 p.
- Mûller, Gunther. 1981. MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS VEGETALES. Ed. Acribia,

Zaragoza. 291 p.
- Ramírez, M Y. 1986. MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL. MANUAL DE LABORATORIO. Dpto.

Procesos Químicos y biológicos, Univ. del Valle, Cali 210 p.
- Rheinheimer, G. 1987. MICROBIOLOGÍA DE LAS AGUAS. Ed. Acribia, Zaragoza. 299 p.
- Seely, H. W. y P. J. Van Demark. 1973. MICROBIOS EN ACCIÓN. MANUAL DE

LABORATORIO PARA MICROBIOLOGÍA. Ed. Blume, Barcelona. 362 p.

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UNIVERSIDAD DEL QUINDÍO 1

FACULTAD DE CIENCIAS AGROINDUSTRIALES

GUÍA PRÁCTICA No. 1 INSTRUMENTACIÓN 4-6

GUÍA PRÁCTICA No. 2 COLORACIÓN DE GRAM 7-8

ANEXO COLORACIONES 9-45

GUÍA PRÁCTICA No. 3 MEDIOS DE CULTIVO 46-55

GUÍA PRÁCTICA No. 4 MÉTODOS PARA EL CULTIVO Y AISLAMIENTO DE 56-59

GUÍA PRÁCTICA No. 5 RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA 60-68

GUÍA PRÁCTICA No. 6 TÉCNICA DE LOS TUBOS MÚLTIPLES DE

GUÍA PRÁCTICA No. 7 ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO PARA AISLAR Y

GUÍA PRÁCTICA No. 8 MICROCULTIVO DE HONGOS 80-84

GUÍA PRÁCTICA No. 9 OBSERVACIÓN DE PROTOZOARIOS Y

GUIA PRACTICA No. 10 GENETICA BACTERIANA 100-101

NORMAS DE COMPORTAMIENTO EN EL LABORATORIO

4. Utiliza permanentemente los anteojos de seguridad; en caso contrario ten el cuidado de no

14. Nunca comas ni bebas ni fumes dentro del laboratorio.

15. No abandones el laboratorio si no ha concluido cualquier reacción o actividad que requiera

17. Todo sólido insoluble debe echarse en la caneca de la basura.

GUÍA PRÁCTICA No. 1: INSTRUMENTACIÓN

2. Manejo de tubos de ensayo con tapón.

3. Manejo de la caja de Petri

4. Manejo de pipetas estériles

5. Preparación de un Frotis a partir de un medio líquido

6. Manejo de los tubos de ensayo con medios de cultivo líquidos

1. Por qué es importante en el laboratorio las pipetas Pasteur?

2. Por qué debe estar estéril el material utilizado en Microbiología?

3. Cuál es la diferencia entre asa y aguja bacteriológica?

4. Cómo se coloca el algodón en la boquilla de la pipeta y para qué sirve?

6. Cuáles son los pasos a seguir para obtener láminas desengrasadas?

Profesora: María Inés Gallego Murillo

GUÍA PRÁCTICA No. 2: COLORACIÓN DE GRAM

Bacterias Gram Positivas y Bacterias Gram Negativas

Las células Gram + siguen de color azul

Adición del colorante, Paso 4

Las células Gram positivas se ven azules

2. Describa y dibuje las formas de bacterias que observó

3. Cómo clasifica las bacterias según la forma, agrupación y coloración?

En Colombia, es de resaltar el uso de los colorantes de origen vegetal, empleados para la

Fenol o ácido carbólico

Anilina o fenil amina

Trinitrobenceno (color amarillo)

Si los grupos .N02 se reducen a grupos -NH2, se elimina el color.

De lo anterior se concluye que un colorante es un compuesto orgánico que tienen grupos

CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES:

Se dividen estos colorantes en básicos (nucleares), ácidos (citoplasmáticos), neutros y/o

Los colorantes metacromáticos

La metacromasia hace un viraje de ciertos materiales colorantes al contacto con elementos

PROPIEDADES DE LOS COLORANTES

Es formado por la acción dé ácido nítrico sobre el fenol.

- Peso molecular de 468,382 gramos.

- Peso molecular 269,294 gramos.

- Peso molecular: 960,832 gramos.

- Peso molecular 305,825 gramos.

Es un colorante básico débil.

- Peso molecular 407,971 gramos.

Pararosanilina (magenta 0):

Es el principal componente de la mayoría de muestras de la fucsina básica

Rosanilina (magenta I):

Es típicamente tetrabromo fluoresceína