Manual Bioquimica Clinica (1) Corregido
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Manual Bioquimica Clinica (1) Corregido
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Manual de Practicas
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MANUAL DE LABORATORIO DE
BIOQUIMICA CLINICA
UNIVERSIDAD DE PAMPLONA
FACULTAD DE SALUD
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO
PAMPLONA
DEPARTAMENTO NORTE DE SANTANDER
COLOMBIA
2012
Código FGA-73 v.00
Manual de Practicas
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INDICE DE CONTENIDO
Introducción
Normas de seguridad
Pág.
Practica 1: Bioseguridad 5
INTRODUCCION
En este manual se ha querido recopilar las principales pruebas y las de mayor utilidad
en el campo de la Bioquímica.
Los conocimientos aportados por la Bioquímica Clínica no sólo permiten entender
mejor la manera en la que están estructuradas las células y los tejidos, el
funcionamiento del organismo y cuáles son las fundamentos de la patogénesis
existente, sino que proporcionan las bases para el uso racional de las estrategias
terapéuticas, principalmente en el campo del descubrimiento de fármacos efectivos
con un mínimo de efectos indeseables.
Esperamos que estos ensayos básicos aporten al desarrollo de la Bioquímica Clínica
en nuestro país, pues se han escogido ensayos muy sencillos y de fácil realización en
cualquier laboratorio.
NORMAS DE SEGURIDAD
Normas sobre el manejo de reactivos químicos:
Leer atentamente la etiqueta de identificación del reactivo.
Verificar que se esté empleando la sustancia indicada.
Verificar el grado de peligrosidad.
Conocer como va a reaccionar (al diluir ácidos fuertes, añadir siempre el ácido
al agua, nunca lo contrario, y hacerlo lentamente).
No pipetear con la boca. Usar dispensadores o pipetas automáticas.
Medir solo las cantidades de reactivos necesarios para el trabajo experimental
y depositarlos en material de vidrio limpio y seco.
No dejar los frascos destapados o abandonados sobre las mesas de trabajo.
Una vez utilizados taparlos y guardarlos o dejarlos en el lugar indicado.
No coger los frascos de los reactivos por el cuello.
En general, los productos que no lleven señalización de seguridad no quiere decir que
no sean peligrosos, pregunte a su profesor antes de usarlos.
Niveles De Riesgo:
PRACTICAS:
PRACTICA Nº 1
1. BIOSEGURIDAD
2. Objetivos:
Conocer las medidas preventivas para controlar los factores de riesgo procedentes
de los agentes biológicos, físicos o químicos.
Aplicar el concepto de bioseguridad en el laboratorio.
Identificar las señales y símbolos relacionados con la seguridad en el laboratorio.
Reconocer las medidas generales de seguridad en el laboratorio.
3.Marco Teórico
La Bioseguridad, se define como el conjunto de medidas preventivas, destinadas a
mantener el control de factores de riesgo laborales procedentes de agentes biológicos,
físicos o químicos, logrando la prevención de impactos nocivos, asegurando que el
desarrollo o producto final de dichos procedimientos no atenten contra la salud y
seguridad de trabajadores de la salud, pacientes, visitantes y el medio ambiente.
· Líquido cefalorraquídeo.
· Líquido sinovial.
· Líquido pleural.
· Líquido amniótico.
· Líquido peritoneal.
· Líquido pericárdico.
· Cualquier otro líquido contaminado con sangre.
Las heces, orina, secreción nasal, esputo, vómito y saliva, no se consideran líquidos
potencialmente infectantes, excepto si están visiblemente contaminados con sangre.
Para que la transmisión del VIH pueda ser efectiva es necesario que el virus viable,
procedente de un individuo infectado, atraviese las barreras naturales, la piel o las
mucosas. Esto ocurre cuando las secreciones contaminadas con una cantidad
suficiente de partículas virales libres y de células infectadas, entran en contacto con
los tejidos de una persona a través de una solución de continuidad de la piel (cómo
úlceras, dermatitis, escoriaciones y traumatismos con elementos cortopunzantes) o
contacto directo con las mucosas.
El Virus de la Hepatitis B posee una mayor capacidad de infección que el VIH; se
estima que un contacto con el virus a través de los mecanismos de transmisión
ocupacional, pinchazos con agujas contaminadas con sangre de pacientes portadores,
desarrollan la infección hasta un 30 - 40% de los individuos expuestos, mientras que
con el VIH es menor del 1% el riesgo ocupacional. Sin embargo, el riesgo de adquirir
accidentalmente y desarrollar la enfermedad con el VIH y el VHB existe.1
Bioseguridad en el laboratorio
1
MINISTERIO DE SALUD. Conductas Básicas En Bioseguridad: Manejo Integral. Santa Fe de Bogotá. 1997. P. 8-9.
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Precauciones de importancia
Llevar guantes puestos.
Uso de máscaras antigas.
Señales de salvamento
Se deben colocar en las salidas de emergencia.
Productos que no llevan señalización de seguridad, no quiere decir que no sean
peligrosos.
Normas de seguridad para el personal de laboratorio.
La seguridad como prevención viene definida por una serie de barreras:
4.Materiales
No aplica.
5. Reactivos
No aplica.
6.Procedimiento
1. Organice grupos de trabajo.
2. Lea detenidamente las normas de seguridad escritas en la guía e información
anexa y socialice las normas.
Cuestionario
Dibuje los símbolos que indican peligros, señales de prohibición y precauciones
importantes.
Consulte cuál es la utilidad de las claves R-S.
Consulte los riesgos relativos al manejo de los siguientes equipos:
1. Centrífugas.
2. Espectrofotómetros.
3. Baños serológicos.
4. Campanas extractoras.
5. Balanzas.
7. Nivel de Riesgo:
2
Disponible en Internet: http://www.ecomed.org.ar/notas/articulos/varios/down/articulos_bioseguridad.pdf
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Nivel 1: Riesgo Bajo (Bata de Laboratorio Manga Larga, Zapato Cerrado Bajo,
Pantalón Largo).
Manejo de residuos:
No aplica
8. Bibliografías
MINISTERIO DE SALUD. Conductas Básicas En Bioseguridad: Manejo Integral.
Bogotá D.C. 1997. P. 8-9.
Disponible en Internet:
http://www.ecomed.org.ar/notas/articulos/varios/down/articulos_bioseguridad.pdf
PRACTICA Nº 2
1. SOLUCIONES BUFFER
2.Objetivos
Determinar la capacidad amortiguadora de una solución buffer.
Analizar la importancia de las soluciones buffer en diversos sistemas biológicos
3.Marco Teórico
Tenemos el ejemplo del ácido fosfórico, un ácido débil (H2PO4-) que al disociarse
forma su base conjugada (HPO4-) el pH al cual este ácido comienza a disociarse es de
7.2, es decir este es su pKa, por lo tanto las dos formas ácido débil como base
conjugada se mantienen a concentraciones adecuadas para amortiguar soluciones a
este pH. A valores de pH por debajo del pKa predomina la forma ácida, y a valores de
3
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2000. P.50-53.
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Elaboración de Amortiguadores:
4
CAMPBELL, M. K, Farell, S. O. Bioquímica.4ª Ed .México. Thomson. 2004. P. -53-55.
5
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2000. Pág.:50-53.
6
CAMPBELL, M. K, Farell, S. O. Bioquímica.4ª Ed .México. Thomson. 2004. P. -53-55.
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Selección de amortiguadores
4.Materiales
1 Vidrio de reloj.
1 Espátula.
4 vasos de precipitado de 100 ml.
2 vasos de precipitado de 250 ml.
1 pipeta graduada de 25ml.
1 pipeta graduada de 1ml.
1 Balón aforado de 100 ml.
1 frasco lavador.
1 churrusco.
Equipos
Balanza.
Potenciómetro.
5. Reactivos
K2HPO4.
KH2PO4.
Na2HPO4.
NaH2PO4.
Agua destilada.
HCl 1 M.
NaOH 1M.
6. Procedimiento
7
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2000. P.50-53.
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CAMPBELL, M. K, Farell, S. O. Bioquímica.4ª Ed .México. Thomson. 2004. P. -53-55.
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E. Análisis de Resultados
Compare los resultados de las mediciones y explique brevemente.
Preguntas de consulta
1. Defina solución amortiguadora y sus componentes
2. ¿Qué se entiende por ácido y su base conjugada?
3. Consulte la fórmula química o molecular del sistema amortiguador ácido carbónico
en la célula.
4. Identifique: ¿cuál es el ácido y la base conjugada? Y ¿por qué?
5. Escriba la ecuación de equilibrio para el sistema buffer anterior.
6. ¿Cuál es el pKa de este sistema buffer? Defina que es Pka y qué importancia
tiene.
7. Explique por qué es importante para la célula la existencia de sistemas
amortiguadores.
8. Cite ejemplos en donde se ponga en evidencia la importancia biológica de las
soluciones amortiguadoras a nivel celular.
9. ¿Cómo participan el aparato respiratorio y el riñón en el control del pH sanguíneo?
10. Consulte cuales sistemas amortiguadores comúnmente utilizados en el laboratorio
de bioquímica
7. Nivel de Riesgo:
Manejo de residuos:
Línea 8
8. Bibliografías
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2000. P. 50-53.
PRACTICA Nº 3
2.Objetivos
Reconocer la importancia de la fuerza iónica como método de separación de
proteínas.
Separar proteínas de una mezcla mediante precipitación diferencial con sulfato de
amonio.
Observar las proteínas totales de la mezcla y de las fracciones mediante método
cualitativo colorimétrico de Biuret.
3.Marco Teórico
Las proteínas biológicamente activas son polímeros formados por aminoácidos que se
eslabonan mediante enlaces peptídicos covalentes.
Proteínas plasmáticas
Dado que una célula contiene miles de proteínas distintas la tares de separarlas y
determinar la estructura de una sola proteína es en extremo difícil pero no imposible. 9
Para separar las moléculas el bioquímico aprovecha las diferencias que existen entre
ellas. Tales diferencias pueden ser solubilidad, tamaño, masa, carga eléctrica o
afinidad por otras moléculas. 10
Para pasar desde los tejidos a un material purificado, solemos utilizar diversas
técnicas distintas de modo secuencial. Una de las formas más antigua, más simple u
aun bastante eficaz para llevar a cabo la separación de una mezcla de proteínas es
utilizar la solubilidad diferente en disoluciones salinas concentradas.
Las proteínas se hacen insolubles en presencia de concentraciones elevadas de sales
y esta solubilidad varía mucho entre una proteína y otra y en disoluciones
concentradas varía rápidamente con la fuerza iónica.
Unas proteínas por ser un anfolito tienen muchos grupos ionizables ácidos y básicos;
las moléculas pueden tener una carga positiva, cero o negativa, dependiendo del pH
de la solución.
Por otro lado, al ser un polieléctrolito tienen múltiples grupos ionizables con una sola
clase de carga. Es decir, al comportarse como un anfólito o polieléctrolito depende del
pH y de la presencia de pequeños iones, que apantallan los macro iones de las otras
cargas. 11
9
CAMPBELL, M. K, Farell, S. O. Bioquímica.4ª Ed .México. Thomson. 2004. P. 116 -119.
10
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2.000. P. 54-57; 166-167.
11
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2.000. P. 54-57; 166-167.
12
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2.000. P. 54-57; 166-167.
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Vs = Vp (S2-S1)
(1-S2)
En donde:
Vs = volumen de la solución saturada de sulfato de amonio
Vp= Volumen de la mezcla de proteínas
S1= Saturación inicial expresada como fracción
S2 = Saturación final expresada como fracción.
O C C O
HN NH
R CH HC R
Cu2+
O C C O
HN NH
R CH HC R
La reacción debe su nombre al biuret, una molécula formada a partir de dos de urea
(H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción, común a
todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus
moléculas.13
4. Materiales
1 vaso de precipitados de 250 ml.
2 vasos de precipitado de 50 ml.
2 tubos de centrífuga plásticos.
8 tubos de ensayo.
3 pipetas de 5 ml.
3 pipetas de 1 ml.
Equipos
Centrífuga.
13
Disponible en Internet:
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/bolarios/BiologiaCCAA/Guiones/Practica1.htm
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5. Reactivos
Solución de proteínas plasmáticas.
Sulfato de amonio saturado al 50%.
Reactivo de Biuret.
Hielo.
6. Procedimiento
B. Precipitación al 40 %:
C. Precipitación al 70 %:
D. Interpretación de resultados
¿Qué porcentaje de proteína se encuentra en el sobrenadante de cada tubo?
¿A que porcentaje de precipitación corresponde cada tubo?
¿Represente con un dibujo como la fuerza iónica esta afectando la solubilidad de las
proteínas en cada tubo?
Cuestionario
1. ¿Cómo se clasifican las proteínas según su solubilidad?
2. ¿Qué se entiende por fuerza iónica? Indique con un dibujo.
3. ¿Qué se entiende por electroforesis?
4. Consulte como se separan electroforéticamente las proteínas del plasma
sanguíneo. Realice un dibujo.
5. Que importancia tiene este examen a nivel clínico.
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7. Nivel de Riesgo:
Manejo de residuos:
Línea 8
8.Bibliografías
CAMPBELL, M. K, Farell, S. O. Bioquímica.4ª Ed .México. Thomson. 2004. P. 116 -
119.
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2.000. P. 54-57; 166-167.
PRACTICA Nº 4
1. REACCIONES ENZIMÁTICAS
2.Objetivos
Reconocer a las enzimas como proteínas que aceleran y controlan las reacciones
químicas en los seres vivos.
Identificar la presencia de diversas clases de enzimas en tejidos animales y
vegetales.
Aplicar los componentes teóricos en las reacciones enzimáticas observadas.
Discutir la presencia de inhibidores enzimáticos que pueden preservar algunos
alimentos.
3.Marco Teórico
Un automóvil obtiene su energía de la oxidación del hidrocarburo gasolina a dióxido de
carbono y agua en una explosión controlada dentro de un motor en el que los gases
pueden alcanzar temperaturas de 2200 ºC. En contraste, la célula viva obtiene energía
oxidando el carbohidrato glucosa a dióxido de carbono y agua a una temperatura (en
el ser humano) de 37ºC.14
14
CAMPBELL, M. K, Farell, S. O. Bioquímica.4ª Ed .México. Thomson. 2004. P. -134-135
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Esta reacción, auque muy favorecida termodinámicamente, es muy lenta, a menos que
sea catalizada. Se puede comprar una botella de una solución de H2O2 (agua
oxigenada) y guardarla en un armario durante muchos meses antes de que se
degrade. Sin embargo, si añadiera un trocito de ión férrico, observaría que la velocidad
de la reacción aumenta unas 1000 veces. La proteína hemoglobina que contienen
hierro, es aun más eficaz para incrementar la velocidad de esta reacción. Si uno aplica
la solución de peróxido de hidrógeno a un corte de un dedo, se observa un burbujeo
inmediato del O2 liberado: la reacción se está produciendo ahora aproximadamente un
millón de veces más rápidamente que el proceso sin catalizar. Pero pueden
alcanzarse velocidades aún. La catalasa una enzima presente en muchas células,
aumenta la velocidad de descomposición del H2O2 sin catalizar aproximadamente
1000 millones de veces. Algunas reacciones celulares producen peróxido de
hidrógeno que es un oxidante peligroso, por lo que la catalasa se ha perfeccionado
para defenderse de él.
Este ejemplo muestra que la velocidad de una reacción favorable depende en gran
medida, de que exista o no un catalizador y de la naturaleza del mismo.15
4. Materiales
Papa.
Cuchillo.
Manzana.
Mortero.
Cuchara o espátula.
Portaobjetos.
Pipeta Pasteur.
1 Vaso de precipitados 50 ml.
5. Reactivos
100 ml de peróxido de hidrógeno o “agua oxigenada” comercial.
1 Pastilla de vitamina C.
6.Procedimiento
A. Presencia de polifenol oxidasa de manzana
1. Moler una pastilla de vitamina C hasta que quede un polvo fino - Cortar una
manzana por la mitad.
2. Colocar en una mitad de la manzana el polvo de la vitamina C, procurando que
quede bien esparcido.
3. Dejar ambas mitades de manzana a temperatura ambiente durante 60 minutos y
observar los cambios de coloración.
C. Interpretación de resultados
15
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2.000. P. 404-405
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Cuestionario
1. Diseñe un experimento para averiguar cómo varía la velocidad de la reacción. Y
así poder determinar que tan veloz y afín es la enzima por su sustrato en el caso de
los experimentos realizados en clase. Realice un esquema.
2. ¿Cómo calculan la velocidad total de cada una de las reacciones realizadas en el
laboratorio?
3. ¿Cuál es el efecto de agregar diferentes cantidades de sustrato sobre la velocidad
de esta reacción? Justifiquen sus conclusiones.
7. Nivel de Riesgo:
Manejo de residuos:
Línea 19
8. Bibliografías
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2.000. P. 404-405
PRACTICA Nº 5
2.Objetivos
Reconocer que las reacciones enzimáticas dependen de factores como:
temperatura, pH y la presencia de sales.
Comprobar que el pH es un factor que altera o modifica la actividad enzimática.
Reconocer que las enzimas son catalizadores orgánicos que sólo se encuentran en
los seres vivos.
3.Marco Teórico
Las enzimas al ser proteínas contienen grupos ionizables, cuyo comportamiento
depende del pH y de las moléculas con carga que se encuentran a su alrededor. Es
bien sabido que la función biológica de las proteínas está directamente relacionada
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con su estructura y si tenemos en cuenta la influencia del medio externo sobre las
proteínas es de pensar que es necesario mantenerlas en un ambiente adecuado para
que su estructura no se modifique y por lo tanto pueden cumplir biológicamente su
función.
Otra variable que influye también sobre la estructura de las proteínas, es la
temperatura. Esta junto con el pH influyen como se describe a continuación:
Influencia de la temperatura:
16
Disponible en Internet:
http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/velocidad%20reaccion%20enzimatica.html
17
Disponible en Internet:
http://www.csgastronomia.edu.mx/profesores/calimentos/quimica2/Capitulo%20VI/enzimas%20siguiente.htm.
18
Disponible en Internet:
http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/velocidad%20reaccion%20enzimatica.html
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4.Materiales
Portaobjetos.
1 papa.
1 hoja de planta.
1 corazón de pollo.
Polvo de levadura.
1 champiñón.
Pinzas.
Vasos desechables.
Limón.
Cuchara.
Mechero.
Malla.
Trípode.
19
Disponible en Internet:
http://www.csgastronomia.edu.mx/profesores/calimentos/quimica2/Capitulo%20VI/enzimas%20siguiente.htm
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Equipos
Baño serológico.
5. Reactivos
100 ml de peróxido de hidrógeno.
HCl concentrado.
Papel de pH.
Azúcar .
Sal.
Limadura de hierro.
Hielo.
6.Procedimiento
A. Factores que afectan la catalasa
En una cuadrícula organiza dos portaobjetos con el material indicado, como se
muestra en el dibujo:
1. Mida el pH de cada material sin agregar HCl con el papel indicador de pH.
2. Adicione una gota de peróxido de hidrógeno a cada material. Observe la presencia
de burbujas.
3. Agregue una gotica de HCl y con el papel indicador vuelva a medir el pH agregue
una gótica de peróxido de hidrógeno.
4. Observe y anote lo que ocurrió en cada uno de los portaobjetos, antes y después
de agregar el peróxido de hidrógeno, marca la reacción a “ojo” de acuerdo al pH=5
y pH=1.
Cuestionario
1. ¿Cómo la temperatura el pH y las sales afectan la estructura química de las
enzimas?
2. ¿Cómo se verán afectados los parámetros cinéticos de las enzimas?
3. ¿Podrían esos factores ser inhibidores enzimáticos?
4. ¿Cuál de los materiales de la práctica se clasifican como vivos y no vivos?
Justifique su respuesta
5. Identifique la o las enzimas con las cuales usted evidenció la reacción en cada
tejido vivo. ¿En cual material de la práctica se encuentran estas enzimas?
6. Cuál es la reacción que efectúa cada enzima.
7. En la reacción bioquímica que describe cada proceso. Identifique sustrato, enzima
producto coenzima.
8. ¿Cuáles factores afectaron el metabolismo de las células de cada tejido? Dé una
explicación química.
9. ¿Qué indica el tiempo durante el cual salen burbujas? Consulte la actividad de una
enzima de la levadura, en otras frutas o verduras.
10. ¿Por qué la limadura de hierro siendo un elemento sin vida se observa la
presencia de burbujas?
7. Nivel de Riesgo:
Manejo de residuos:
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Línea 1
8. Bibliografías
Disponible en Internet:
http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/velocidad%20reaccion%20enzimatica.
html
Disponible en Internet:
http://www.csgastronomia.edu.mx/profesores/calimentos/quimica2/Capitulo%20VI/enzi
mas%20siguiente.htm.
PRACTICA Nº 6
1. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
2.Objetivos
Reconocer el proceso de fermentación como un procesos metabólico realizado por
diversos microorganismos a partir de compuestos orgánicos como los
carbohidratos.
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3.Marco Teórico
La mayoría de los organismos consumimos glucosa y la oxidamos para obtener
energía, un producto de esta oxidación es el piruvato, este tiene números destinos
alternativos en los microorganismos anaerobios. Por ejemplo, las bacterias del ácido
láctico reducen el piruvato a lactato en un solo paso. En cambio, las levaduras
convierten el piruvato en etanol en una ruta de dos pasos. Esta fermentación
alcohólica comienza por la piruvato decarboxilasa. Que va seguida de la reducción
del acetaldehído a etanol, que depende del NADH, catalizada por la enzima alcohol
deshidrogenasa. (Ver figura abajo).20
La primera reacción requiere la presencia como coenzima de pirofosfato de tiamina.
Esta coenzima, procedente de la vitamina B1, interviene en varias reacciones de
transferencia de grupos que implican una porción aldehído activada.
Glucosa
Pi
Gliceraldehído 1, 3 Bifosfoglicerato
ADP
Etanol Acetaldehído
Alcohol deshidrogenasa
Los tejidos animales también tienen alcohol deshidrogenasa, a pesar de que el etanol
no es un producto metabólico importante en los animales.
Algunas de las consecuencias metabólicas importantes de la intoxicación por etanol se
deben a la oxidación del etanol a acetaldehído por esta enzima en el hígado. Primero
se reduce excesivamente el NAD+ a NADH, que agota el flujo que transcurre por la
generación de energía. En segundo lugar, el acetaldehído es bastante tóxico, y
20
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2.000. P. 516-518.
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MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2.000. P. 516-518.
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4.Materiales
1 Erlenmeyer de 250 ml.
6 Tubos de ensayo
1 Balón de 250 ml para destilación.
1 Gradilla.
2 pipetas graduadas de 5 ml.
1 Mechero.
2 Soportes.
2 Pinzas
1 Pera
1 Churrusco
1 Termómetro
2 Perlas de ebullición.
1 Capsula de porcelana.
1 Aro
1 Malla.
2 Mangueras
1 capsula de porcelana
1 Panela.
1 Libra de Azúcar.
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Cáscara de piña.
Uvas
Levadura.
Equipos
Equipo para destilación.
5. Reactivos
Etanol.
2 Propanol.
Terbutanol.
Reactivo de Lucas.
6.Procedimiento
A. Proceso de fermentación
B. Destilación de alcoholes
Decante el producto fermentable y páselo a través de una gasa para filtrar, transfiera
la solución obtenida al balón o erlenmeyer del equipo de destilación y acondicione el
equipo para destilación, tal como se ilustra en la figura.
Ajuste el equipo de destilación simple e inicie el proceso prendiendo la llama en el
mechero. Controle la temperatura para que no sobrecargue los 78ºC. Recoja el
destilado que se produzca en un erlenmeyer.
7. Nivel de Riesgo:
Manejo de residuos:
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Cuestionario
1. ¿En el proceso de destilación para la obtención de etanol? ¿Por qué se agrega
sulfato de amonio?
2. ¿Por qué es necesario realizar un orificio a la tapa del recipiente que contiene la
mezcla fermentadora? ¿Cómo se explica?
3. ¿Por qué es necesario controlar la temperatura en el proceso de destilación? ¿Y
cuál es la razón que sea controlada entre el rango de 75-80 ºC específicamente?
4. Investigue bajo qué procesos metabólicos se puede oxidar los alcoholes y
justifíquelos.
5. Consulte qué otros estilos de destilación se conocen y en qué tipo de separación
deban ser utilizados.
8.Bibliografías
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2.000. P. 516-518.
PRACTICA Nº 7
1. SOLUCIONES Y DILUCIONES
2.Objetivos
Reproducir los conceptos teóricos de soluciones y diluciones en la vida práctica del
laboratorio.
Identificar, seleccionar, y emplear las fórmulas adecuadas para diferentes procesos
de dilución.
Practicar de manera hábil la preparación de soluciones y diluciones.
Mejorar la habilidad y destreza en el manejo de las unidades de concentración
mediante la preparación de soluciones utilizado diluciones en serie.
3.Marco Teórico
Soluciones
Una solución es la mezcla homogénea de dos o más sustancias. Para que dos más
sustancias formen una solución se necesita que estas sean solubles o miscibles. La
solubilidad de un soluto o un solvente, está indicada por la máxima cantidad de soluto
que se disuelve en una determinada cantidad de solvente.
Dilución:
Proceso por el cual una solución concentrada es con vertida en una menos
concentrada (diluida), por la adición de solvente.
Unidades de concentración
Cada sustancia tiene una solubilidad que es la cantidad máxima de soluto que puede
disolverse en una disolución, y depende de condiciones como la temperatura, presión,
y otras substancias disueltas o en suspensión. 23
23
TORRENEGRA, Rubén. Introducción al Análisis Químico Moderno. Bogotá D.C. Publicaciones Universidad
Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana.1990. P. 9-25.
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El término solubilidad se utiliza tanto para designar al fenómeno cualitativo del proceso
de dilución como para expresar cuantitativamente la concentración de las soluciones.
Puede expresarse en moles por litro, en gramos por litro, o en porcentaje de
soluto/disolvente.
Relaciones en peso
Estas son: porcentaje en peso, partes por millón, molalidad, fracción molar. Las dos
primeras son unidades físicas y las dos últimas son relaciones entre unidades
químicas y físicas.
Las unidades físicas utilizadas son: el gramo (g) y sus múltiplos y submúltiplos:
miligramo (mg), nanogramo (ng), kilogramo (Kg), microgramo (µg).
Las unidades denominadas químicas son: la mol-gramo y sus submúltiplos mili y micro
mol (mmol, µmol respectivamente).
Partes por millon (ppm): indica las partes de soluto presentes en un millón de
partes de solución (g por tonelada o mg por Kg).
Para expresar concentraciones muy pequeñas, trazas de una sustancia muy diluida en
otra, es común emplear las relaciones partes por millón (ppm), El millón equivale a 106,
el billón estadounidense, o millardo, a 109 y el trillón estadounidense a 1012.
Partes por millón (abreviado como ppm) unidad empleada usualmente para valorar la
presencia de elementos en pequeñas cantidades (traza) en una mezcla. Generalmente
suele referirse a porcentajes en peso en el caso de sólidos y en volumen en el caso de
gases. Se abrevia como ppm. También se puede definir como "la cantidad de materia
contenida en una parte sobre un total de un millón de partes."
Ejemplo: Supongamos que tenemos un cubo homogéneo de un metro de arista, cuyo
volumen es un metro cúbico (m³). Si lo dividimos en 'cubitos' de un centímetro de lado,
obtendríamos un millón de 'cubitos' de un centímetro cúbico, (cm³ o cc). Si tomamos
uno de esos 'cubitos', del millón total de 'cubitos', tendríamos una parte por millón.
24
Disponible en Internet: http://es.wikipedia.org/wiki/Concentraci%C3%B3n.
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Fracción molar (X): relaciona las moles de soluto con las moles totales en la
solución (moles totales son las moles del soluto mas las moles del solvente). Por
ejemplo, en una mezcla binaria de 6 moles de etanol y 4 moles de agua, lo que da un
total de 10 moles, la fracción molar del etanol es de 6/10 = 0,6; mientras que la
fracción molar del agua es 4/10 = 0,4. La suma de todas las fracciones molares de una
mezcla da como resultado la unidad.
Xsoluto=nsoluto/ntotal,
Relaciones en volumen
Indica las partes del soluto expresadas en alguna unidad de peso entre el volumen de
la solución.
Gramos por litro (g/l): Se pueden usar también las mismas unidades que para medir
la densidad aunque no conviene confundir ambos conceptos. La densidad de la
mezcla es la masa de la solución entre el volumen de esta mientras que la
concentración en dichas unidades es la masa de soluto entre el volumen de la
disolución. Se suelen usar los gramos por litro (g/l).
Gramos por ciento (%g): Indica el número de gramos de soluto que estén
contenidos en cien mililitros de la solución.
Molaridad (M)
La molaridad (M) es el número de moles de soluto contenidas en un litro de solución.
Por ejemplo, si se disuelven 0,5 moles de soluto en 100 mL de disolución, se tiene una
concentración de ese soluto de 5,0 M (5,0 molar). Para preparar una disolución de
esta concentración normalmente se disuelve primero el soluto en un volumen menor,
por ejemplo 30 mL, y se traslada esa disolución a un matraz, para después rellenarlo
con más disolvente hasta los 100 mL.
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Normalidad (N)
La normalidad (N) es el número de equivalentes (n) de soluto (es la unidad de masa
que representa a la mínima unidad que puede reaccionar) contenidas en un litro de
solución (sc). 25
Diluciones
Una de las soluciones que se diluyen con más frecuencia en un laboratorio clínico es
el plasma o suero o líquidos biológicos en los cuales encontramos todos los analitos a
determinar cuantitativamente, actuando estos como solutos diluidos en el agua celular.
Otras soluciones a diluir son aquellos reactivos utilizados como preservativos de
algunas de estas muestras biológicas, tales como el ácido clorhídrico o nítrico entre
otros pues sus concentraciones elevadas no los hacen aptos para cumplir su función.
Por otra parte, un enfermero(a) cuando maneja sustancias cuyas cantidades
necesarias para ver un efecto son extremadamente pequeñas (por ejemplo un fármaco
para tratar una enfermedad, una hormona para estudiar su efecto en un animal de
experimentación, etc.) y difícilmente se pueden pesar o medir en esas proporciones
tan pequeñas, también tiene que diluir.
En esas situaciones es necesario recurrir a la preparación de una solución de alta
concentración (o solución de stock o solución madre) y hacer diluciones seriadas a
partir de ésta. A continuación, realizamos un esquema que muestra el proceso de
dilución:
Vs Vd = Vs+Vc( 1)
Vc
Vd
Cc Cd
Cc=Concentración de la solución concentrada
25
Disponible en Internet: http://es.wikipedia.org/wiki/Concentraci%C3%B3n
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Cc x Vc = Cd x Vd..............(1)
La anterior ecuación es la base para todos los cálculos que se efectúan para las
diluciones.
Cd = fdCc................(2)
Así que fd = Cd
Cc
Para preparar soluciones muy diluidas se recurre a las diluciones en serie; las cuales
se hacen sacando volúmenes o alícuotas de la solución anterior para preparar la
siguiente.
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Vc
Fd
Vd
Muestra de sangre o
medicamento a diluir
Ejemplo Nº 1
Podemos escoger un factor de dilución de ½ y un volumen final de 5 ml. Aplicamos la
fórmula que nos indica que volumen de la solución concentrada en este caso de la
muestra biológica vamos a medir.
Vc = Vd x fd
Vc= 5ml x ½
Vc= 2.5 ml del suero sanguíneo o medicamento a diluir
En este momento usted puede procesar su muestra y no olvidar que el resultado que
calcule con esta dilución no es el real, es necesario multiplicar por el factor de dilución
así: la muestra diluida arrojó una concentración de 200mg/dl la verdadera
concentración es: 400mg/dl ya que se multiplica por el denominador del factor de
dilución en este caso es 2.
Se pude presentar otra situación en la que aún la muestra sigue muy concentrada y es
necesario seguir realizando diluciones en este caso acudimos a realizar diluciones en
serie.
fd fd fd fd
La muestra del ejemplo Nº 1 que se diluyó debe diluirse más, si seguimos utilizando el
mismo factor de dilución ½ y utilizando un volumen final de 5ml, siempre debemos
medir del tubo anterior 2.5ml y en todos los tubos adicionar 2.5ml del solvente ver
esquema.
Si se requiere conocer las concentraciones de cada tubo se pueden presentar dos
situaciones:
a. Que se conozca la concentración de la solución stock.
b. Desconocer la contracción de la solución stock y sólo conocer la contracción de la
última solución.
Cd= Cc x fd
Para el tubo Nº 1
Cd= *400mg/dl x ½ Cd= 200mg/dl
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Para el tubo Nº 2
Cd = 200mg/dl x ½ Cd= 100mg/dl
Para el tubo Nº 3
Cd = 100mg/dl x ½ Cd = 50mg/dl
Para el tubo Nº 4
Vd= 50mg/dl x ½ Vd = 25mg/dl
Cc = Cd
fd
Cc = 25
½
25 x *2 = 50 mg/dl
Se desea preparar una solución de HCL 5% y se parte de una solución de 10%. Para
este caso es necesario conocer cual es el volumen que necesito medir de la solución
concentrada, debo definir los dos parámetros el factor de dilución y el volumen final, a
diferencia de los otros problemas en el caso experimental el factor de dilución no lo
defino yo, en este caso debe hallarse teniendo en cuanta las dos concentraciones así:
fd = Cd
Cc
fd= 5%
10%
fd=1/2
Teniendo el factor de dilución entonces podemos fijar un volumen final cualquiera por
ejemplo 2 ml, entonces hallamos el volumen de la solución concentrada así:
Vc = Vd x fd
Vc= 2ml x ½
Vc= 1 ml de la solución de HCl al 10%
Y adicionamos 1 ml de solvente para completar el volumen final
Como es el mismo factor de dilución para todos los tubos entonces voy a extraer del
tubo anterior a la siguiente dilución 1 ml. y adiciono 1ml del solvente.
4.Materiales
1 Vaso de precipitado de 50 ml.
1 Balón aforado de 50ml.
1 Vidrio d reloj
1 Espátula.
1 Agitador.
1 Pipeta graduada 5 ml.
1 Pipeta graduada de 1 ml.
1 Pipeta graduada de 10 ml.
6 Tubos de ensayo.
1 Pera.
1 Churrusco.
1 Gradilla.
Equipos
Balanza analítica
5. Reactivos
Agua destilada.
NaOH.
KOH
NaCl.
Glucosa.
Sacarosa.
Azul de metileno.
Procedimiento
A. Preparación de soluciones.
1. Preparar 50ml de una solución de glucosa 0.1 M. Exprese la concentración en
%p/v.
2. Preparar 50ml de una solución de sacarosa 0.5 M. Exprese la concentración en
%p/v.
3. Preparar 50ml de una solución de NaOH 0.25 M. Exprese la concentración en
%p/v.
4. Preparar 50ml de una solución de NaCl 0.2 M. Exprese la concentración en %p/v.
5. Preparar 50ml de una solución de KOH 0.15 M. Exprese la concentración en %p/v.
6. Preparar 50ml de una solución de glucosa 0.5 M. Exprese la concentración en
%p/v.
7. Preparar 50ml de una solución de sacarosa 0.1 M. Exprese la concentración en
%p/v.
8. Preparar 50ml de una solución de NaOH 0.2 M. Exprese la concentración en %p/v.
9. Preparar 50ml de una solución de NaCl 0.15 M. Exprese la concentración en %p/v.
10. Preparar 50ml de una solución de KOH 0.25 M. Exprese la concentración en %p/v.
Una vez realizada la lectura del problema realice un esquema donde se observe paso
a paso la preparación de la solución y los cálculos correspondientes.
Ejercicios de aplicación
Lea atentamente los siguientes ejercicios que se presentan a continuación:
3. Realice una dilución 1/5, 1/8, 1/10 del antibiótico anterior halle las concentraciones
de cada una.
7. Nivel de Riesgo:
Manejo de residuos:
Línea 8
Línea 4
8. Bibliografías
PRACTICA Nº 8
2. Objetivos
3. Marco Teórico
Preparación de patrones para elaboración de curvas de calibración
fd fd fd fd
La muestra del ejemplo Nº 1 que se diluyó debe diluirse más, si seguimos utilizando el
mismo factor de dilución ½ y utilizando un volumen final de 5ml, siempre debemos
medir del tubo anterior 2.5ml y en todos los tubos adicionar 2.5ml del solvente ver
esquema.
Si se requiere conocer las concentraciones de cada tubo se pueden presentar dos
situaciones:
c. Que se conozca la concentración de la solución stock.
d. Desconocer la contracción de la solución stock y sólo conocer la contracción de la
última solución.
Cd= Cc x fd
Para el tubo Nº 1
Cd= *400mg/dl x ½ Cd= 200mg/dl
Para el tubo Nº 2
Cd = 200mg/dl x ½ Cd= 100mg/dl
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Para el tubo Nº 3
Cd = 100mg/dl x ½ Cd = 50mg/dl
Para el tubo Nº 4
Vd= 50mg/dl x ½ Vd = 25mg/dl
Cc = Cd
fd
Cc = 25
½
25 x *2 = 50 mg/dl
Como es el mismo factor de dilución para todos los tubos entonces voy a extraer del
tubo anterior a la siguiente dilución 1 ml. y adiciono 1ml del solvente.
4.Materiales
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Equipos
Balanza analítica
5. Reactivos
Agua destilada.
NaOH.
NaCl.
HCl.
Glucosa.
Sacarosa.
Azul de metileno.
6. Procedimiento
A. Preparación de soluciones.
1. Preparar 50ml de una solución de glucosa 0.1 M. A partir de la anterior solución
realizar 2 diluciones, factor de dilución (fd) de 1/2, volumen final de 5ml.
2. Preparar 50ml de una solución de sacarosa 0.5 M. A partir de la anterior solución
realizar 2 diluciones, factor de dilución (fd) de 1/3, volumen final de 4ml.
3. Preparar 50ml de una solución de NaOH 0.25 M. A partir de la anterior solución
realizar 2 diluciones, factor de dilución (fd) de 1/5, volumen final de 5ml.
4. Preparar 50ml de una solución de NaCl 0.2 M. A partir de la anterior solución
realizar 2 diluciones, factor de dilución (fd) de 1/4, volumen final de 6ml.
5. Preparar 50ml de una solución de KOH 0.15 M. A partir de la anterior solución
realizar 2 diluciones, factor de dilución (fd) de 1/6, volumen final de 7ml.
6. Preparar 50ml de una solución de glucosa 0.5 M. A partir de la anterior solución
realizar 2 diluciones, factor de dilución (fd) de 1/3, volumen final de 5ml.
7. Preparar 50ml de una solución de sacarosa 0.1 M. A partir de la anterior solución
realizar 2 diluciones, factor de dilución (fd) de 1/2, volumen final de 7ml.
8. Preparar 50ml de una solución de NaOH 0.2 M. A partir de la anterior solución
realizar 2 diluciones, factor de dilución (fd) de 1/5, volumen final de 4ml.
9. Preparar 50ml de una solución de NaCl 0.15 M. A partir de la anterior solución
realizar 2 diluciones, factor de dilución (fd) de 1/4, volumen final de 6ml.
10. Preparar 50ml de una solución de KOH 0.25 M. A partir de la anterior solución
realizar 2 diluciones, factor de dilución (fd) de 1/6, volumen final de 5ml.
7. Nivel de Riesgo:
Manejo de residuos:
Línea 8
Línea 4
8. Bibliografías
PRACTICA Nº 9
1. DILUCIONES NO SERIADAS
2. Objetivos
3. Marco Teórico
Preparación de patrones para elaboración de curvas de calibración
a tomar de la solución stock (Vc) en cada dilución y fijamos un volumen final de 1ml;
aplicamos la fórmula del ejemplo Nº1
4.Materiales
1 Vaso de precipitado de 50 ml.
1 Balón aforado de 50ml.
1 Vidrio d reloj
1 Espátula.
1 Agitador.
1 Pipeta graduada 5 ml.
1 Pipeta graduada de 1 ml.
1 Pipeta graduada de 10 ml.
6 Tubos de ensayo.
1 Pera.
1 Churrusco.
1 Gradilla.
Equipos
Balanza analítica
5. Reactivos
Agua destilada.
NaOH.
NaCl.
HCl.
Glucosa.
Sacarosa.
Azul de metileno.
6. Procedimiento
A. Preparación de soluciones.
1. Preparar 50ml de una solución de glucosa a una concentración de 5 g/l. A partir de
la solución stok realizar 2 diluciones de 1g/l y de 2g/l, volumen final de 5ml.
2. Preparar 50ml de una solución de sacarosa a una concentración de 10 g/l. A partir
de la solución stok realizar 2 diluciones de 2g/l y de 3g/l, volumen final de 5ml.
3. Preparar 50ml de una solución de NaOH a una concentración de 15 g/l. A partir de
la solución stok realizar 2 diluciones de 3g/l y de 4g/l, volumen final de 5ml.
4. Preparar 50ml de una solución de NaCl a una concentración de 20 g/l. A partir de
la solución stok realizar 2 diluciones de 4g/l y de 5g/l, volumen final de 5ml.
5. Preparar 50ml de una solución de KOH a una concentración de 25 g/l. A partir de
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7. Nivel de Riesgo:
Manejo de residuos:
Línea 8
Línea 4
8. Bibliografías
PRACTICA N 10
2. Objetivos
3. Marco Teórico
Las soluciones estándar o patrones de calibración son mezclas de cantidades
conocidas de ciertos componentes usados para comparar con concentraciones
desconocidas en la muestra. Los patrones se utilizan principalmente para control y
aseguramiento de la calidad, para hacer medidas y balances, para el análisis
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Página
Materiales
1 Balón aforado de 50ml.
6 Tubos de ensayo.
1 Pipeta graduada de 1ml.
1 Pipeta graduada de 5ml.
1 Pipeta graduada de 10ml.
1 Vidrio de reloj.
1 Espátula.
1 Agitador.
1 Gradilla.
1 Vaso de precipitado de 100ml.
1 Pipeteador o pera.
1 Churrusco.
Equipos
26
Disponible en Internet:
http://es.wikipedia.org/wiki/Soluci%C3%B3n_Est%C3%A1ndar
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Balanza analítica.
5. Reactivos
Agua destilada.
Metil naranja
Verde de malaquita.
Rojo metilo.
Cristal violeta.
Eosina.
Azul de bromofenol.
Verde de metilo.
Azul de tripan.
Fucsina.
Safranina.
6. Procedimiento
1. Prepare una solución 50ml del colorante asignado a una concentración de 0.1%
P/V.
2. A partir de la solución Stock preparar 5 soluciones patrón de: 0.062 mg/ml, 0.125
mg/ml, 0.250 mg/m, 0.500 mg/ml, 1.0 mg/ml. Con un volumen final de 5 ml. Calcule el
volumen de la solución Stock que va a agregar a cada tubo.
Cuestionario
1. ¿Que se entiende por solución patrón?
2. ¿Porque es importante a nivel biológico realizar soluciones patrón?
3. Dar un ejemplo en cada caso.
7. Nivel de Riesgo:
Manejo de residuos:
Línea 1
8. Bibliografías
Disponible en Internet:
http://es.wikipedia.org/wiki/Soluci%C3%B3n_Est%C3%A1ndar
PRACTICA Nº 11
2. Objetivos
3. Marco Teórico
Espectroscopía
= c
ni = índice de refracción = Co
Ci
Donde i se refiere al medio y o al vacío
Kilómetros (km).
27
TORRENEGRA, Rubén. Introducción al Análisis Químico Moderno. Bogotá D.C. Publicaciones Universidad
Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana.1990. Pág.: 24-64
28
TORRENEGRA, Rubén. Introducción al Análisis Químico Moderno. Bogotá D.C. Publicaciones Universidad
Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana.1990. Pág.: 24-64
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Metros (m).
Centímetros (cm).
Micras ( ). 1 = 0.0001 cm
Milimicras (m) = nanómetros (nm) 1 m = 0.001 = 10-9 m
Amstrongs (Å). 1 Å = 0.1 nm = 10-8 nm
La potencia de una radiación se define como el número de fotones que chocan por
unidad de área y por unidad de tiempo sobre un objeto o la materia en general.
Un rayo de luz puede estar formado por una sola longitud de onda o por un conjunto
de ellas. El primero se denomina monocromático y el segundo policromático.
Cuando un rayo de luz policromático incide sobre un elemento monocromador el rayo
se descompone en sus diferentes longitudes de onda.
La luz blanca está formada por un conjunto de radiaciones monocromáticas, como lo
ha podido observar usted cuando se forma el arco iris en el cielo.
En estos casos los colores que usted ve son la respuesta de su cerebro a los
diferentes rangos de longitudes de onda que forman la luz blanca.
El Espectro Electromagnético
109
1015
Corriente Alterna
Rango Visible
El rango de radiaciones con longitudes de onda entre 400 y 700 nm conforma el
denominado rango visible humano. Como se dijo anteriormente, el ojo humano detecta
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las radiaciones (longitudes de onda) y el cerebro las registra como colores. Estas
sensaciones de color son producidas por las regiones de longitudes de onda del rango
visible, como se indica en el cuadro siguiente:
Violeta 400-440
Azul 440-470nm
Verde
470-565nm
Amarillo 565-590nm
Naranja 590-615nm
Rojo 615-700nm
El color es una sensación, una respuesta del cerebro al estímulo eléctrico producido
por una radiación luminosa o un conjunto de ellas. El color es subjetivo, depende de la
persona, sólo se ven las radiaciones del rango visible que llega a nuestro ojo.
La luz blanca es una mezcla de las longitudes de onda indicada en el cuadro anterior.
Si un objeto se ilumina con luz blanca y lo observamos coloreado es porque parte de
los rangos que producen el color han sido absorbidos y se está transmitiendo o
reflejando el color que vemos.
Los objetos transparentes son aquellos que transmiten las radiaciones que inciden
sobre ellos, si algunas longitudes de onda se transmiten con mayor potencia el objeto
será transparente coloreado; por ejemplo, una solución de sangre.
Los objetos opacos son aquellos que se ven por la luz reflejada en ellos. Si se reflejan
todas las radiaciones de 400- 700 nm se verán blancos y si sólo se reflejan unas de
este rango, el objeto se verá coloreado.
Hay que considerar que se ha absorbido parcial o totalmente el otro u otros colores y
que el color que se ve es el que se transmite o refleja con mayor intensidad. De aquí
se deduce que para que un objeto sea coloreado, debe absorber parte de las
longitudes de onda del rango visible. Si la absorción del rango visible fuera total, el
objeto se vería oscuro (negro). Un objeto transparente es aquel que transmite la luz
blanca parcial (coloreado) o totalmente (incoloro) ejemplo sangre diluida y agua pura,
respectivamente.
Una solución de una sustancia presenta color porque al incidir sobre ella la luz blanca,
algunas longitudes de onda son absorbidas más intensamente que otras y las menos
absorbidas que se transmiten con más potencia producen la sensación de color al
incidir sobre el ojo del sujeto que las observa.
Las soluciones coloreadas absorben las radiaciones del color complementario al de
ellas; así, las soluciones que se ven rojas deben absorber radiaciones del rango verde:
El cuadro siguiente se da una lista de los colores de las soluciones y el de radiaciones
que se deben absorber
Este rango del espectro electromagnético, está formado por todas las radiaciones
comprendidas entre las que tienen longitudes de onda desde 10nm hasta 400nm y se
divide en dos zonas, la del vacío (10nm -200nm) y la del cuarzo (100nm-400nm). El
rango U.V de vacío se denomina así, ya que los estudios con éstas radiaciones deben
hacerse en ausencia de aire, puesto que el oxígeno, dióxido de carbono y agua
absorben en esta región, en el análisis poco se usan estas radiaciones U.V de vacío.
El rango de 200-400 nm se denomina del cuarzo, puesto que este material no absorbe
éstas longitudes de onda. En la práctica es el rango que se usa para el análisis
químico ultravioleta, cuali o cuantitativo.
Al incidir una radiación sobre una sustancia el fotón puede ser absorbido y producir
una excitación en la molécula.
Las excitaciones que puede sufrir una molécula de una sustancia, son tres tipos:
En el análisis clínico de rutina, los procesos de excitación que se tienen en cuenta son
del tipo electrónico, principalmente.
1. Electrónica: se refiere a la Energía de excitación una molécula donde intervienen
principalmente los electrones de enlace, que pasan los electrones de zonas
energéticas bajas a zonas energéticas mayores en la molécula. Las radiaciones que
producen estas excitaciones están comprendidas entre 150nm y 1500nm. La energía
requerida es de 80-800 k.j mol -1.
En partículas monoatómicas, se produce la absorción de unas pocas frecuencias bien
definidas debido al pequeño número de posibles estados energéticos de las partículas
absorbentes. La excitación solo puede producirse mediante este proceso en el que
uno o varios electrones del átomo se promocionan a un nivel de energía más alto.
Si sobre la sustancia incide una radiación que lleve fotones con energía igual a la
energía de transición, entonces esa radiación (longitud de onda) es absorbida mas
intensamente o longitud de onda de máxima absorción.
Para muchas moléculas la diferencia o delta () de E no es la misma puesto que cada
molécula tiene diferente energía, algo mayor o algo menor que la E promedio, por esto
en la absorción de una solución de una sustancia, donde hay muchas moléculas.
En una molécula pueden ocurrir diferentes excitaciones, dependiendo de las
radiaciones que se absorban. La representación gráfica de las absorciones de una
sustancia a diferentes longitudes de onda se denomina espectro de absorción o
curva espectral.
Es decir, si se tiene una solución por ejemplo una solución de sangre y se incide sobre
ella un rayo de luz la transmitancia es igual a la relación entre la potencia transmitida
y la incidente así:
Pt
T
Po
Pt
Ó si lo queremos expresar en %. %T x100
Po
La transmitancia se expresa con relación a1 ó a 100. Se ha definido una variable de
mucha utilidad que se denomina absorbancia (A)
(A) Absorbancia: "Mide" la cantidad de luz absorbida por la solución absorbente.
También se le denomina densidad óptica (D) ó extinción (E). Es una variable y no
tiene unidades.
A - Log T ó A = 2 - Log %T
T = 10 -A o %T = 100 x (10-A)
A
a
bc
Las unidades de la absortividad dependerán de las unidades de b y c. Sus unidades
generalmente utilizadas para b son centímetros y para c son gramos por litros. Si b
tiene como unidad centímetros y c tiene como unidades moles por litro, entonces se
denomina absortividad molar o coeficiente de extinción molar.
"Al incidir un rayo de luz monocromática (de una sola longitud de onda) sobre un
medio absorbente de radiación (solución), la absorbancia por el medio será
directamente proporcional a la concentración de la sustancia responsable de la
absorción, al mantenerse constante la intensidad del rayo incidente (Po), la distancia
recorrida por el rayo (b) y la longitud de onda de esta".
A=abc
1. La ley de B.B.L se aplica a las soluciones que contengan uno o mas clases de
especies absorbentes.
2. La ley de B.B.L solo describe bien el comportamiento de la absorción en
soluciones diluidas.
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Están provistos de detectores eléctricos como foto celdas y filtros que seleccionan
haces de luz de un color determinado. La foto celdas generalmente producen
corrientes altas que mueven al registrador o sea al galvanómetro, directamente a
través de una resistencia. Pueden tener sistemas de detección y registro mas
complicados sobre todo los foto colorímetros modernos. Si para un método, la pureza
espectral no es importante, entonces los análisis cuantitativos se pueden realizar con
gran exactitud en este tipo de instrumento.
Comercialmente podemos encontrar fotómetros para el rango VIS, UV.
B. Espectrofotómetros
Funcionamiento
Al encender el instrumento, se prende la lámpara , la cual produce la luz, que es
enfocada por el lente, hacia el elemento monocromador, aquí la luz es descompuesta
en sus diferentes longitudes de onda; y de ellas solo una o un angosto rango de
longitudes de onda coincidirán con la rendija de selección de longitud de onda y de allí
esa longitud de onda seleccionada pasara por el compartimiento de la muestra antes
de llegar al detector, donde se desprenden electrones que generan una pequeña
corriente eléctrica es proporcional a la intensidad de la radiación y que llega al
registrador, y allí la corriente eléctrica, produce el desplazamiento de una aguja sobre
una escala graduada. Este desplazamiento producido es proporcional a la intensidad
de la corriente que llega.
Fuentes de Radiación.
Los Monocromadores.
Además de separar las longitudes de ondas, permiten variar de forma continua y en un
amplio intervalo la longitud de onda de la radiación.
Prismas de Refracción
Son poliedros, generalmente con dos caras triangulares y tres rectangulares. Estos
prismas separan las radiaciones, que forman un haz incidente en una de sus caras
rectangulares, basado en el cambio del índice de refracción para cada longitud de
onda. El material de que están construidos los prismas depende de la región del
espectro que se tenga que estudiar. Para la región del U.V vacío suele emplearse
prisma construidos con fluorita. Los prismas construidos cuarzo o sílice fundida suelen
emplearse para las zonas U.V - VIS - I.R cercano. En la región I.R donde el vidrio y el
cuarzo no son transparentes, se emplean prismas construidos de NaCl. Fli, CaF2 ó
KBr.
1 2 3 4 5 6
. de Prisma. de refracción .
Fig.2: Monocromador . . .
1. Rayo policromático. 2. Rendija de entrada. 3. Lente de colimación. 4. Prisma de
refracción. 5. Lente de enfoque. 6. Rendija de salida 7. Rayo monocromático
El ángulo de desviación de un rayo es función del índice de refracción del material del
que esta hecho el prisma. De acuerdo a lo anterior cada radiación con longitud de
onda diferente será desviada en un ángulo distinto, puesto que, a diferente longitud de
onda, diferente índice de refracción. Por lo tanto, un rayo policromático puede ser
separado por el prisma en un conjunto de rayos monocromáticos que luego pueden
ser seleccionados a través de una rendija.
Monocromadores de Red.
Rejillas de Reflexión.
Son láminas de material óptico con un determinado número de rayas, separadas una
distancia (d). A mayor numero de rayas por mm, mayor separación de longitudes de
onda, ósea mayor resolución.
Rejillas de Difracción.
Son implementos ópticos a la que se le han hecho surcos o estrías de forma que tiene
caras bastantes anchas en la que se produce la reflexión y caras estrechas no
utilizadas. Esta geometría proporciona una difracción muy eficiente de la radiación.
Rendijas.
Las rendijas de un monocromador son unos bordes agudos que se forman mediante
un cuidadoso proceso mecánico a partir de dos piezas de metal. Sus bordes son
exactamente paralelos uno con respecto al otro y se encuentran en un mismo plano.
Filtros.
Algunos instrumentos utilizan filtros, los cuales solo transmiten un color, y de la una
longitud de onda más intensamente. Estos filtros separan rangos más o menos
amplios de longitudes de onda, pero no monocroman la radiación, los filtros son vidrios
o plásticos coloreados.
Dos tipos de filtros se emplean para la selección de la longitud de onda, los de
interferencia y los de absorción.
Filtros de Interferencia
Luz blanca
Banda estrecha e
radiación
Placa de
vidrioPelícula capa del
metálica dieléctrico
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1 2 3
. .
Tipos de celdas.
1. Rectangular 2. Cilíndrica 3. Celda de flujo continúo
Detectores de Radiación.
Detector o receptor es el dispositivo que recibe la radiación y produce una señal. Estos
dispositivos de detección se han sustituido en gran parte por transductores que
convierten la energía radiante en señal eléctrica.
Detectores de Fotones.
Celdas Fotovoltaicas
La celda fotovoltaica se usa principalmente para detectar y medir la radiación de la
región visible comprendida entre 350 y 750nm. Consiste en un electrodo plano de
cobre o hierro en el que se deposita una capa de material semiconductor como
selenio. La superficie externa del semiconductor se recubre con una fina película
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metálica transparente de oro o plata que sirve como electrodo colector. Todo el
conjunto se protege con una envoltura transparente.
Cuando a este semiconductor le llega una radiación de suficiente energía, se rompen
los enlaces covalentes y se forman electrones y agujeros conductores. Los electrones
migran hacia la película metálica y los agujeros hacia la base en la que se depositó el
semiconductor. Los electrones liberados migran libremente a través del circuito
externo para interaccionar con estos agujeros. El resultado es una corriente eléctrica
cuya magnitud es proporcional al número de fotones que inciden sobre la superficie
del semiconductor.
Tubos Fotomultiplicadores
Los tubos fotomultiplicadores son muy sensibles a las radiaciones U.V y VIS, además
tienen tiempos de respuestas extremadamente rápidos, se limitan a medir radiaciones
de baja potencia pues la luz intensa causa daños irreversibles a la superficie
fotoeléctrica. En estos tubos, la superficie catódica es de composición similar a la de
los fototubos descritos anteriormente. Además contiene unos electrodos adicionales
(nueve en total) llamados dinodos.
Para poder determinar si la solución cumple la ley de B.B.L, lo primero que se debe
hacer es:
1. Averiguar la LONGITUD DE ONDA DE MÁXIMA ABSORCIÓN - CURVA
ESPECTRAL. Es decir, la longitud de onda a la cual la solución presenta la
máxima absorbancia o la mínima transmitancia. Para determinar lo anterior se lee,
la transmitancia o absorbancia que presenta la solución coloreada y de
concentración constante a diferentes longitudes de onda.
Posteriormente se puede determinar por observación de los datos o realizando una
curva entre absorbancia ó porcentaje de transmitancia y longitud de onda, la cual
se denomina CURVA ESPECTRAL.
Si la gráfica resulta una línea recta, se dice que el sistema o la solución coloreada,
cumple la ley de Beer- Bouguer-Lambert., en ese rango de concentraciones.
Teniendo esta curva, a cualquier solución de esta sustancia, se le puede
determinar su concentración por interpolación.
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Cm =Cp/ Ap x Am
Donde:
Cm : Concentración de la muestra
Cp : Concentración del patrón
Am : Absorbancia de la muestra
Ap : Absorbancia del patrón
Materiales
1 Balón aforado de 50ml.
6 Tubos de ensayo.
1 Pipeta graduada de 1ml.
1 Pipeta graduada de 5ml.
1 Pipeta graduada de 10ml.
1 Vidrio de reloj.
1 Espátula.
1 Agitador.
1 Gradilla.
1 Vaso de precipitado de 100ml.
1 Pipeteador o pera.
1 Churrusco.
Equipos
Balanza analítica.
Espectrofotómetro.
5. Reactivos
Agua destilada.
Metil naranja
Verde de malaquita.
Rojo metilo.
Cristal violeta.
Eosina.
Azul de bromofenol.
Verde de metilo.
Azul de tripan.
Fucsina.
Safranina.
6. Procedimiento
29
TORRENEGRA, Rubén. Introducción al Análisis Químico Moderno. Bogotá D.C. Publicaciones Universidad
Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana.1990. Pág.: 24-64.
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3. Prepare una solución 50ml del colorante asignado a una concentración de 0.1%
P/V.
4. A partir de la solución Stock preparar 5 soluciones patrón de: 0.062 mg/ml, 0.125
mg/ml, 0.250 mg/m, 0.500 mg/ml, 1.0 mg/ml. Con un volumen final de10 ml. Calcule el
volumen de la solución Stock que va a agregar a cada tubo.
5. Con el tubo número 3 que contiene la solución de concentración 0.250 mg/ml
realice los siguientes pasos:
1. Encender el espectrofotómetro y dejar calentar por 15 minutos.
2. Ubique 400nm con el selector de la longitud de onda.
3. Utilizar como blanco 5 ml de agua destilada para llevar el equipo al 100%
de transmitancia.
4. Sacar el tubo del blanco, colocar en el compartimiento 5 ml de la solución
coloreada y leer en la escala como porcentaje de transmitancia.
5. Varíe la longitud de onda con intervalos de 20 en 20nm hasta 700nm.
6. Cada vez que varíe la longitud de onda se hace la misma operación de los
pasos 3, 4, 5.
7. Anotar en la tabla los valores de % de transmitancia y absorbancia dados
en escala.
Solución coloreada de:
LECTURA DE % T LECTURA (A) (A) TEORICA= 2-Log %t
7. Nivel de Riesgo:
Manejo de residuos:
Línea 7
8. Bibliografía
PRACTICA Nº 12
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2. Objetivo
Determinar las absorbancias de diferentes patrones de concentración conocida a
una longitud de onda determinada para la elaboración de una curva de calibración.
Determinar la concentración de una muestra desconocida mediante la utilización
de una curva de calibración.
Conocer la utilidad de la espectrofotometría como herramienta en el análisis
cuantitativo del laboratorio.
3. Marco Teórico
Curva de calibración
Con un ejemplo trataremos de realizar una curva de calibración llevando a cabo los
pasos anteriores.
30
Disponible en Internet:
http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/calibracion/calibracion.htm
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En este caso como estamos determinando proteínas, se utiliza un reactivo que puede
reaccionar con las proteínas en este caso puede ser Biuret, el cual al reaccionar con
las proteínas da un color violeta a mayor concentración de proteínas mayor el color
visualizado. (Como se observa en la figura anterior). Se puede buscar cualquier
reactivo depende del analito o sustancia a analizar.
En conclusión simplemente se adiciona un reactivo que reaccione con el analito a
determinar y que pueda dar color.
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Hay que advertir que una respuesta lineal no se obtiene en todo el rango de
concentraciones posibles sino dentro de un conjunto de valores que dependen de
numerosos factores dependientes del método de medición. Por otra parte, este tipo de
curvas no se limita solamente a la determinación de un elemento o compuesto químico
sino que tiene múltiples aplicaciones.
32
Disponible en Internet:
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0.25
0.36mg/dl
Los datos de absorbancia que se obtienen de los patrones que se preparan para una
curva de calibración, llevan asociados errores del analista los cuales hacen que éstos
datos no produzcan una línea recta, con el fin de ajustar estos datos a una línea recta
se ha ideado el siguiente procedimiento:33
Los datos de absorbancia obtenidos para los respectivos patrones se multiplican por la
concentración de estos (AxC), la concentración de cada patrón se eleva al cuadrado
(C2), se obtienen las sumatorias y se dividen A.C por C2 para obtener un factor de
corrección (W) el cual se multiplica por cada concentración para obtener la
absorbancia corregida. (A)*, Así:
C A AC C2 A *= W.C
C1 A1 A1 C1 C12 A1*
C2 A2 A2 C2 C2 2 A2*
2
C3 A3 A3 C3 C3 A3*
. . .
. . .
. . .
Cn An An Cn C2n An*
A.C C2
A.C
W=
C2
Se deben tener en cuanta los valores límites del rango óptimo, para eliminar datos
muy dispersos.
Este factor W se usa para calcular la concentración de una muestra a partir de su
absorbancia. (2).
Cx = 1 x Ax
w
ó Cx = f. Ax
Donde f = 1
w
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TORRENEGRA, Rubén. Introducción al Análisis Químico Moderno. Bogotá D.C. Publicaciones Universidad
Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana.1990. P. 63-65.
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Con este factor se pueden elaborar tablas de absorbancia, concentración, que facilitan
la determinación de la concentración de una muestra, por localización de la
absorbancia de la muestra en la tabla y la lectura de la concentración.
Materiales
1 Balón aforado de 50ml.
6 Tubos de ensayo.
1 Pipeta graduada de 1ml.
1 Pipeta graduada de 5ml.
1 Pipeta graduada de 10ml.
1 Vidrio de reloj.
1 Espátula.
1 Agitador.
1 Gradilla.
1 Vaso de precipitado de 100ml.
1 Pipeteador o pera.
1 Churrusco.
Equipos
Balanza analítica.
Espectrofotómetro.
5. Reactivos
Agua destilada.
Metil naranja
Verde de malaquita.
Rojo metilo.
Cristal violeta.
Eosina.
Azul de bromofenol.
Verde de metilo.
Azul de tripan.
Fucsina.
Safranina.
6. Procedimiento
3. Utilizar como blanco un tubo con 5 ml de agua destilada para llevar el equipo
al 100% de transmitancia.
4. Sacar el tubo del blanco, colocar en el compartimiento un tubo con 5 ml de la
solución coloreada de más baja concentración y leer en la escala como
porcentaje de transmitancia y la absorbancia.
5. Luego continuar colocando los tubos con la solución coloreada el ultimo será
el de mayor concentración y después de cada lectura se hace la misma
operación de los pasos 3 y 4.
6. Anotar en la tabla valores obtenidos:
A.C C2
7. Utilizar como blanco un tubo con 5 ml de agua destilada para llevar el equipo
al 100% de transmitancia.
8. Colocar en un tubo 5 ml de la solución coloreada de concentración
desconocida en la celda (suministrada por el docente) y leer % de transmitancia
y la absorbancia.
9. Anotar en la tabla valores obtenidos.
Donde f = 1
w
13. Compare las dos concentraciones, la obtenida con la grafica y con el factor
de corrección W.
14. Concluya.
7. Nivel de Riesgo:
Nivel 2: Riesgo Medio (Bata de Laboratorio, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato
Cerrado Bajo, Pantalón Largo).
Manejo de residuos:
Línea 7
8. Bibliografía
Disponible en Internet:
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PRACTICA Nº 12
1. UROANALISIS
2.Objetivos
Reconocer la importancia del examen de la orina como herramienta diagnostica.
Estudiar las características, físicas, químicas y microscópicas de la orina.
Correlacionar los resultados con las diferentes patologías.
3. Marco Teórico
El examen general de orina es una de las pruebas más solicitadas dentro del
laboratorio de análisis clínicos e incluye el análisis físico, químico y análisis
microscópico. En este último, se analiza el sedimento urinario en búsqueda de
distintos elementos formes (leucocitos, cilindros, etc.) con diferente utilidad
diagnostica. El análisis de sedimento urinario se puede valorar mediante métodos
manuales y automatizados.
Nos da idea también de procesos bacterianos, gracias al urocultivo; y, también, a
través de su sedimento podemos distinguir células, cristales, y ver si existen procesos
inflamatorios.
El empleo rutinario del análisis de orina sirve para detectar determinados componentes
no presentes en individuos sanos.
Podemos obtener una información valiosa para la detección, diagnóstico y valoración
de enfermedades nefrourológicas, incluso pudiendo revelar enfermedades
asintomáticas o silenciosas.
La recolección de la muestra es muy importante, determina la fidelidad de los
resultados y su correcta interpretación. Se debe realizar en un recipiente limpio (de
vidrio o plástico), que no contenga restos de detergentes, grasas o agua oxigenada.
No es necesario que sea estéril. Es recomendable una exhaustiva higiene y enjuague
de las manos y genitales. Se debe desechar los primeros mililitros de orina y recoger
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1) EL EXAMEN FISICO: comprende la descripción del color, aspecto y olor, así como
la determinación de volumen, densidad y pH.
• Aspecto, color y olor: se realiza por observación directa de la orina en un tubo limpio
de vidrio transparente. Normalmente, la orina posee:
Aspecto: límpido
Color: amarillo ámbar
Olor: sui generis
Espuma: blanca, no persistente
Pueden presentarse anomalías:
Aspecto turbio: debido a proteinuria, bacteriuria, precipitación de sales (fosfatos
Amónicos en orinas alcalinas o uratos en orinas ácidas.
Color:
- Rojizo: por hematuria, hemoglobinuria, mioglobinuria, ingesta de remolacha.
presencia de cristales de uratos amorfos (no patológico)
- Amarillo intenso, verde oscuro hasta amarronado: bilirrubina
- Caoba: pigmentos biliares o porfirias
- Pardo oscuro, negruzco: alcaptonuria
- Anaranjado: estado febril, tratamiento con rifampicina
- Aspecto opalescente y color blanco amarillento: pus, infección urinaria
Olor: dulce, a frutas o cetónico: cuerpos cetónicos, glucosuria
Espuma persistente: proteinuria, resto de detergente en el frasco de muestra o el
tubo.
• pH: el riñón es uno de los órganos que junto con el pulmón interviene en la
regulación de la concentración de H+ en el líquido extracelular y lo hace
fundamentalmente regulando la concentración de HCO3 plasmático. Esta función se
ejerce a través de la recuperación de bicarbonato filtrado, producción de nuevo
bicarbonato, excreción de NH4+, H2PO4.
− pH: la tirilla contiene una mezcla de indicadores de pH que en contacto con la orina
dan una nítida graduación de colores, desde el naranja (pH 5) al azul (pH 9).
Resultado normal: 5-6 en orina fresca.
− Leucocitos: los granulocitos (un tipo de leucocitos) poseen la enzima esterasa, que
reacciona con los reactivos de la tirilla dando un producto de color violeta.
Resultado normal: negativo (no existe límite definido entre la excreción fisiológica y
patológicamente elevada de leucocitos. Mayormente se indica 10 a 20 leucocitos/ul
como síntoma sospechoso y más de 20 como hallazgo patológico).
− Nitritos: se utiliza una amina que en medio ácido reacciona con dando una sal de
diazonio, que reacciona con un cromógeno para formar color rosado.
Resultado normal: negativo.
− Proteínas: la tirilla contiene un indicador que en presencia de proteínas vira del
amarillo al verde.
Resultado normal: negativo (hasta 30 mg% en orina matinal, la tirilla no detecta esta
cantidad).
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La excreción de proteínas por orina debe ser menor a 150 mg/día. Este valor da una
reacción negativa con los métodos usuales de determinación cualitativa. Si la reacción
da positiva, se debe determinar la concentración en una muestra de orina de 24 hs con
un método químico.
La proteinuria suele deberse a las siguientes causas:
- Aumento de proteínas plasmáticas normales y anormales.
- Aumento de permeabilidad glomerular
- Disminución de la reabsorción de polipéptidos y proteínas de bajo PM que
normalmente filtran por el glomérulo.
- Alteraciones hemodinámicas, entre las que cabe destacar el ejercicio, cambios de
posición de decúbito a erecta, fiebre, etc.
La proteinuria no siempre se acompaña de lesiones en el parénquima renal. Sin
embargo, la proteinuria persistente que supera los 750 mg/24 hs es un indicador de
lesión en el parénquima renal.
− Bilirrubina: la bilirrubina reacciona con una sal de diazonio en medio ácido, dando
un compuesto rosa violáceo.
Resultado normal: negativo.
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• Ácido úrico: producto final del catabolismo de las bases púricas, excretado por
orina.
Debido a que el pKa del N9 es 5.5 y el del N1 es 10.3, a pH plasmático fisiológico se
encuentra en forma de urato monosódico. En orina, el estado iónico dependerá del pH:
si el pH urinario es menor que 5.75, se encontrará predominantemente como ácido
úrico y si es mayor en forma de urato. El ácido es soluble hasta concentraciones de 6-
7 mg%, precipitando en concentraciones mayores. En esa situación se puede
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Equipos
Centrifuga
Microscopio
5. Reactivos
Tiras reactivas
6. Procedimiento
A. Examen físico:
- Tome la orina y deposítela en un tubo para centrifuga, observe el color y anótelo en
la tabla de resultados.
B. Examen Químico
C. Examen microscópico
- Posteriormente rotulamos el tubo de ensayo y lo colocamos en la centrifugadora
durante 10minutos a 3000 revoluciones/minuto.
- Pasados los 10 minutos, vaciamos la orina en el grifo, y el sedimento que queda en
el fondo del tubo, lo depositamos en una lámina, cubrimos con una laminilla y queda
listo para el análisis directo al microscopio. Observe en objetivo de 10X y luego pase a
40X, para observar mejor las estructuras.
D. Interpretación de Resultados
Cuestionario
1. ¿Qué patologías se pueden asociar al análisis de orina?
2. ¿Cómo puede correlacionar con los resultados una infección renal?
3. ¿Qué biomarcadores se pueden obtener de la orina como una opción alterna a la
biopsia renal?
7. Nivel de Riesgo:
Manejo de residuos:
Línea 19
8. Bibliografías
Laso Maria del Carmen. Interpretación del análisis de orina. Pediatria práctica.
2002. Arch.argent.pediatr ; 100(2) / 179.