Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Facultad de Farmacia y Bioquímica

Escuela Academico Profesional de Farmacia y Bioquímica

INFORME N° 7

CROMATOGRAFIA

GRUPO: jueves de 12am- 4pm

INTEGRANTES:

CASTILLO YACHAPA, Dennis paul

APAZA CHAMPI, Luis
SAAVEDRA MENDOZA ,Jean
GAONA LÓPEZ ,Michael rodolfo

DOCENTE:
Prof . Americo

Año
2016
 I. Introducción

La cromatografía, es la técnica de análisis químico

utilizada para separar sustancias puras de mezclas complejas.
Esta técnica depende del principio de adsorción selectiva.
La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso, de origen italiano,
Mijaíl Tswett en 1906,
pero su uso no se generalizó hasta la década de 1930.
Tswett separó los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo
extracto de hojas verdes en éter de petróleo sobre una columna
de carbonato de calcio
en polvo en el interior de una probeta.
A medida que la disolución va filtrándose por la columna,
cada componente de la mezcla precipita a diferente velocidad,
quedando la columna marcada por bandas horizontales de colores,
denominadas cromatogramas.
Cada banda corresponde a un pigmento diferente.
El uso de la cromatografía está ampliamente extendido
en el análisis de alimentos, medicinas, sangre, productos petrolíferos
y de fisión radiactiva.
II. Marco teórico

La cromatografía es un método físico de preparación para la caracterización de mezclas

complejas, en el que se aplican técnicas basadas en el principio de retención selectiva,
cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo
identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.
Existen muchos tipos de técnicas para esta pero en todas ellas hay una fase móvil que
consiste en Loa métodos cromatograficos que practicaremos son:
 Cromatografía en columna: La fase estacionaria solida se sitúa dentro de una
columna. Según el fluido empleado como fase móvil liquida.

 Cromatografía en papel: es un proceso muy utilizado en los laboratorios para

realizar análisis cualitativos ya que pese a no ser una técnica muy potente no
requiere de ningún tipo de equipamiento.

La fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de filtro.
La muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la solución y
evaporando el disolvente. Luego el un fluido que arrastra a la muestra a través
de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un
sólido.

disolvente empleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. Esto es,
se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro
de un recipiente que contiene fase móvil en el fondo.

 Cromatografía en capa delgada o en capa fina: La fase estacionaria es una capa

uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de
vidrio, aluminio u otro soporte. Los requisitos son un absorbente( por ejemplo
silica gel)), placas , un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión,
otro para aplicar la capa de absorbente, y una cámara en la que se desarrollen las
placas cubiertas .

La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase

estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos
polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen
con mayor velocidad serán los menos polares.
 III. Objetivos:

 Medir la distancia recorrida por el absorbente en el papel y por la lámina.

 Calcular los RF para cada una de las sustancias separadas.
 Separar e identificar los componentes de una mezcla.

IV. Parte experimental:

1. Cromatografía en papel:
La mezcla de los tres colorantes y los tres colorantes por separado (cristal
violeta, azul de metileno y fluoresceína) se siembran a 1 cm en la parte inferior
del papel luego se sumerge en la fase móvil contenida en la cubeta, el solvente
asciende por capilaridad y los componentes se van separando por la
interacción de la fase fija y fase móvil de acuerdo a su solubilidad, completado
el desarrollo se retira, se seca y se revela el cromatograma, finalmente se
determina el Rf de cada sustancia con fines de caracterización.

Fig 1. Cromatografía en papel filtro

Para hallar la constante de distribución (Rf) se divide la distancia que recorre el

colorante entre la distancia en la cual llega el disolvente, llamado frente de
disolvente.

SUSTANCIAS Rf de los Rf de los estándares Fase estacionaria Fase móvil

COLOREADAS colorantes

Azul de metileno 0.61 0.69 Sílica gel Benceno y

Acetato de etilo

Cristal violeta 0.88 0.87

Fluoresceina 0.94 0.93

 2. Cromatografía en capa fina:

La CCF analítica se utiliza para detectar el tipo y número de manchas

correspondientes a una mezcla. CCF preparativa por lo general de 20x20 cm
para aislar experimentalmente las manchas y luego proceder a su elucidación
estructural.
Se prepara las cromatoplacas con el adsorbente adecuado silicagel 60-G para
cromatografía en capa fina, luego la mezcla problema se siembra a 1cm del
borde inferior, ya seco se sumerge en la fase móvil contenida en la cubeta, el
solvente asciende por capilaridad y los componentes se van separando por la
interacción entre la fase fija y fase móvil de acuerdo a su solubilidad,
completado el desarrollo se retira, se seca y se revela el cromatograma,
finalmente se determina el Rf de cada sustancia con fines de caracterización.

Para sembrar se coloca encima

Se prepara la cromatoplaca, la de la cromatoplaca los tubos Se siembra las mezclas a 1cm
cual está formada por un capilares los cuales deben de del borde inferior, y se deja
soporte de vidrio, la silicagel y el haber sido partidos a la mitad y secar.
aglutinante. Esta se encuentra deben de tener un pequeño  Azul de metilo (azul)
en fase acuosa para lo cual se agujero del cual van a salir las  Cristal de violeta
lleva a la estufa a 100°C para sustancias. (violeta)
que se quede en la lámina. Delicadamente se toca la  Fluoresceína (amarillo)
cromatoplaca para poder
sembrar.
Se prepara la fase móvil en la Se colocan las cromatoplacas ya Para la acetanilida, se sembró
cubeta, la cual contiene Etanol. sembradas, verticalmente en la de la misma manera, se sembró
Luego de colocar la sustancia cubeta. primero la acetanilida que
se tapa la cubeta y se sacude, Observación: se debe de colocar obtuvimos en la práctica anterior
después se destapa. correctamente debido a que si se y a lado la acetanilida pura.
Observación: se realiza en la colocan de una forma incorrecta, Debido a que son sustancias
campana extractora debido a el recorrido de las sustancias no incoloras solamente podremos
que la sustancia es tóxica. va a ser lo esperado, ya que no observar su separación
se va a poder observar mediante mediante un revelador físico, en
la luz ultravioleta los este caso usamos la luz
componentes de estas. ultravioleta que ilumina la
fluoresceína del sílica gel.

3. Cromatografía en columna:

Mientras tanto la
En una pera de mezcla de colorantes se
decantación se coloca el coloca en la bureta. Al Como se observa en la Finalmente se procede
disolvente comformado haber contacto con el imagen primero se separó a titular en tubos de
por acido acético y disolvente se podra la fluorescencia luego el ensayo por separado
etanol. Se apertura la observar que la mezcla cristal violeta y por último cada pigmento, como
pera dejando caer gota a se separa y se puede el azul de metilo. se observa en la figura.
gota el contenido. identificar los
colorantes orgánicos.
  Cromatografía en capa fina de una mezcla de
sustancias coloreadas

SUSTANCIAS Rf Rf de los Fase Fase

estandares estacionaria movil
COLOREADAS
Azul de Sílica gel Benceno y
metileno Acetato de
etilo

Cristal
violeta

Fluoresceina

V. CUESTIONARIO
1. ¿cuál es su concepto sobre la cromatografía?

Significa “escribir en colores” y consta de la separación de componentes químicos que se

encuentran en una muestra, está compuesta por dos fases: fase móvil (soluto) y la fase
estacionaria (solvente).

2. ¿Por qué la cromatografía en capa fina es una cromatografía de adsorción?

Porque la fase estacionaria no se dispone en forma de columna, sino que está constituida por
papel filtro, el sustrato a analizar se debe colocar cerca del borde del papel, luego se debe
sumergir el papel en el disolvente, el disolvente asciende por el papel, arrastrando consigo el
sustrato.2 Este proceso, claramente, describe una adsorción, ya que en este caso la “superficie
porosa” sería el papel de filtro.

3. ¿Cuál es la diferencia entre adsorción y absorción?

Adsorción: Proceso exotérmico mediante el cual un sólido con una superficie porosa es capaz
de retener partículas de un fluido en su superficie al entrar en contacto con él.
Absorción: Proceso mediante el cual se captura ciertos componentes de una corriente de gas
mediante un absorbente líquido.3

4. ¿Por qué la cromatografía en papel es una cromatografía de reparto o partición?

La cromatografía de reparto se basa en la diferente solubilidad de los componentes de la

muestra en la fase estacionaria (caso de la cromatografía de gases), o diferentes solubilidades
de los componentes en las fases móvil y estacionaria (caso de la cromatografía líquida).

Como la cromatografía plana, la F.E. es el agua o disolvente asociados a la celulosa (papel) o al

soporte sólido que forma la capa fina.

En la que las interacciones del soluto con el papel hacen que los compuestos se desplacen a
velocidades diferentes. Una pequeña mancha de disolución que contiene la muestra se aplica
sobre una tira de papel cromatográfico a una distancia aproximada de un centímetro de la
base. La muestra es adsorbida en el papel. Esto significa que la muestra entra en contacto con
el papel y puede establecer interacciones. El papel es sumergido en un disolvente adecuado
(etanol o agua) e introducido en un contenedor cerrado. A medida que el disolvente asciende
por el papel, encuentra la muestra que empieza a viajar por el papel con el disolvente. Los
diferentes compuestos de la muestra recorren distancias diferentes dependiendo de la fuerza
de sus interacciones químicas con el papel. La cromatografía en papel requiere algún tiempo,
habitualmente se necesitan varias horas para completarse.

5. Señale los pasos a seguir para preparar una cromatografía en columna

 Preparación de la columna: se mezcla el adsorbente con el disolvente y se vierten

en el interior de la columna. Antes se coloca en el extremo interior de la columna
un trozo de algodón o lana de vidrio (para evitar que el adsorbente se escape por
el extremo de la columna).
 Siembra: La muestra disuelta en el disolvente, se introduce por la parte superior
de la columna y se deposita sobre la superficie del adsorbente.
 Análisis, cuantificación o revelado: consiste en analizar el eluato por cromatografía
en capa delgada con los reveladores adecuados.
 Regeneración de la fase estacionaria

Consideraciones:

o Las diferencias en las velocidades de desplazamiento a través del medio sólido se

corresponden con diferencias en los tiempos de elución por la parte inferior de la
columna para cada uno de los componentes de la muestra original (que se
recogerán en fracciones diferentes).
o La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los diferentes
componentes de la mezcla se mueven en la columna.
o Los disolventes polares compiten más eficientemente con las moléculas polares de
una mezcla por los lugares polares del adsorbente. Por eso, un disolvente polar
desplazará las moléculas (incluyendo las más polares) rápidamente a través de la
columna.
o Si el disolvente es muy polar la elución será muy rápida y generalmente habrá
poca separación de los componentes de la mezcla. Y si el disolvente es muy apolar,
no eluirán los compuestos de la columna.
 o la elección del eluyente es fundamental para el éxito de la cromatografía en
columna.
o A menudo se utiliza un gradiente creciente de polaridad para la elución. La CCF se
utiliza para determinar y elegir el sistema solvente adecuado para cada
separación.

6. ¿Existe alguna relación entre la cromatografía en columna y la cromatografía en escala

preparativa?

La cromatografía en columna se emplea para separar mezclas y purificar sustancias a escala

preparativa, tienen relación intrínseca.

7. ¿El vapor de yodo es un revelador físico o químico? ¿Cómo actúa frente a las sustancias
incoloras?

El vapor de yodo es un revelador químico gaseoso. En la cromatografía en capa fina las

manchas incoloras pueden revelarse mediante la introducción de la placa en vapores de yodo.

8. ¿La luz ultravioleta 254 nm es un revelador físico o químico? ¿Cómo actúa frente a las
sustancias incoloras?

La luz ultravioleta 254 nm es un revelador físico. La gran parte de las placas cromatográficas
contienen un producto indicador fluorescente que permite la visualización de los compuestos
que son activos a la luz ultravioleta, concretamente a 254 nm. El indicador absorbe la luz UV, y
emite luz visible, por lo general de color verde.

Cuando se deben hacer visualizaciones de placas con luz UV, a 254 nm o 366 nm, se puede
utilizar una lámpara de Wood o cabinas de visualización por placas TLC.

9. ¿Qué función cumplen los adsorbentes y reveladores en un sistema cromatográfico?

Gracias a los adsorbentes podemos realizar la técnica de cromatografía de adsorción

(mecanismo de separación de los componentes entre las fases). La separación depende de los
equilibrios de adsorción de los componentes de la mezcla, entre la fase estacionaria sólida y la
fase móvil liquida o gaseosa. La fuerza con que es adsorbido un componente depende de la
polaridad de este, de la actividad del adsorbente y de la polaridad de la fase móvil. En general,
cuanto más polar es un compuesto más fácilmente será adsorbido.

El revelador es una sustancia capaz de reaccionar químicamente con los compuestos

cromatografiados, dando productos de reacción que adsorben en la zona visible, y por lo tanto
presentan color, o en la zona UV, siendo semillas observables con lámparas de Wood. Este
paso es aconsejable hacerlo en cabinas de extracción de gases y con elementos de protección
personal.

10. ¿Qué es el Rf y en qué tipo de cromatografía se utiliza?

Rf es el registro, es una relación de distancias, y se define como:

 (a) distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicación
Rf =
(b) distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente

La distancia que recorre el compuesto se suele medir desde el centro de la mancha, por lo cual
se suelen hacer unas marcas en la placa, si dichas manchas son extremadamente grandes, el
valor del Rf será erróneo.

El factor de retardación o índice de retención (Rf) se utiliza en la cromatografía en capa fina.

11. Presente las figuras correspondientes de los tipos de cromatografía realizadas en el

laboratorio:

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL:
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA:

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA:

12. Presente en serie eluotrópica de solventes y adsorbentes utilizados en el análisis de

cromatografía en capa fina y en columna:

SOLVENTES
+ Cromatografia en capa fina Cromatografía en columna
Ácido acético Agua
Serie eluotrópica

Metanol Metanol
Etanol Etanol
Iso propanol Acetato de etilo
Acetona Acetona
Acetato de etilo Diclorometano
Cloroformo Cloroformo
n- hexano Tolueno
éter de petróleo Hexano
-
ADSORBENTES
+ Cromatografía en capa fina Cromatografía en columna
Serie eluotrópica

alúmina (Al2O3) alúmina (Al2O3)

gel de sílice (SiO2) gel de sílice (SiO2)
Celulosa (Nativa o micro-cristalina)

13. ¿En qué consiste la cromatografía de intercambio iónico y que aplicaciones tiene?

La Cromatografía Iónica es una variante de la Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC). Es

un método eficaz para la separación y determinación de iones, basado en el uso de resinas de
intercambio iónico.

Este método se centra en la separación y determinación de iones (y moléculas polares),

basándose en el uso de columnas de intercambio iónico. Estas columnas retienen en mayor o
menor grado a los analitos en función de sus interacciones iónicas (polaridades). La superficie
de la fase estacionaria presenta grupos funcionales de carácter iónico que interaccionan con
los iones de carga opuesta presentes en la disolución. Cada analito es eluido de la columna con
diferente tiempo de retención, parámetro que permite su identificación cualitativa. Existe una
amplia gama de detectores (conductimétrico, amperométrico, UV, etc) donde se registra la
señal obtenida respecto al tiempo. El resultado es un cromatograma donde la posición de los
máximos indica el ión presente (análisis cualitativo) y el área corresponde a su concentración
en la disolución (análisis cuantitativo).

Este tipo de cromatografía se subdivide en cromatografía de intercambio catiónico y

cromatografía de intercambio aniónico, siendo esta última la que presenta mayores
aplicaciones.

APLICACIONES:

- Análisis de aguas.
- Medio ambiente.
- Control de calidad de productos químicos.
- Industria alimentaria.
- Industria farmacéutica.
- Industria energética.
14. Explique en que se fundamenta la cromatografía liquida de alta eficacia: High Performance
Liquid Chromatography, HPLC.

La separación cromatográfica en HPLC es el resultado de las interacciones específicas entre

las moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y estacionaria
A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento
(HPLC, de High Performance Liquid Chromatography) no está limitada por la volatilidad o la
estabilidad térmica de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles,
materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso
molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra disponible
para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama
de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación.

15. ¿En qué consiste la cromatografía bidimensional?

Procedimiento en el que parte o todos los componentes de la muestra se someten, una vez
separados, a etapas adicionales de separación. Esto se puede hacer, por ejemplo,
conduciendo a una fracción en particular que eluye de la columna hacia otra columna (o
sistema) que tenga diferentes características de separación. Cuando se combina con etapas
de separación adicionales, se puede hablar de cromatografía multidimensional. En la
cromatografía plana, cromatografía bidimensional se refiere al proceso cromatográfico que
hace que los componentes migren primero en una dirección y luego en otra perpendicular a
ella; las dos eluciones se llevan a cabo con eluyentes diferentes.
16. ¿En qué consiste la electroforesis?
La electrolisis es un método de laboratorio en el que se utiliza corriente eléctrica que se
encuentra controlada cuya finalidad es la de separar biomoléculas según su tamaño y carga
eléctrica; el movimiento de las moléculas cargadas se hace a través de una matriz porosa o
gel, que está inmersa en un medio acuoso.
Bajo el campo electico aplicado, las diferentes moléculas de una muestra se mueven a través
de la matriz a diferentes velocidades, de manera que al final de la electroforesis las distintas
moléculas se pueden diferenciar como bandas separadas a distintas posiciones en la matriz.
Dichas bandas se detectan mediante tinción o autor radiografía o pueden transferirse a una
superficie membranosa.

VI. Conclusiones:

 Se pudo medir la distancia recorrida por el absorbente en el papel y por la

lámina.
 En la experiencia calculamos los RF para cada una de las sustancias separadas.
 Se logró separar e identificar los componentes de una mezcla.
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Gennaro, R. Remington Farmacia. 20 ed. Buenos Aires: Médica panamericana;
2003. Pp 686
2. Walton, H. Análisis químico e instrumental moderno. Barcelona: Reverté;
2005. Pp pp 323
3. Acedo, J. Instrumentación y control avanzado de procesos. Madrid: Edigrafos;
2006. Pp 559
4. Lamarque, A. Fundamentos teóricos-prácticos de Química Orgánica. Buenos
Aires: Encuentro; 2008. Pp 62
5. Operaciones básicas en el laboratorio de Química: http://www.ub.edu
6. Bioquímica y biología celular: http://biomodel.uah.es