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    Taller HPLC

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    Mauricio Muñoz
    La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una técnica analítica que separa, identifica y cuantifica compuestos en una mezcla. La HPLC utiliza una bomba de alta presión, un inyector, una columna empaquetada con pequeñas partículas y un detector. Existen varios tipos de HPLC según el mecanismo de separación como la cromatografía de reparto, adsorción, intercambio iónico y exclusión molecular.

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    La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una técnica analítica que separa, identifica y cuantifica compuestos en una mezcla. La HPLC utiliza una bomba de alta presión, un inyector, una columna empaquetada con pequeñas partículas y un detector. Existen varios tipos de HPLC según el mecanismo de separación como la cromatografía de reparto, adsorción, intercambio iónico y exclusión molecular.

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    La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una técnica analítica que separa, identifica y cuantifica compuestos en una mezcla. La HPLC utiliza una bomba de alta presión, un inyector, una columna empaquetada con pequeñas partículas y un detector. Existen varios tipos de HPLC según el mecanismo de separación como la cromatografía de reparto, adsorción, intercambio iónico y exclusión molecular.

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    CENTRO DE GESTIÓN INDUSTRIAL – SENA

    ASEGURAR LA CALIDAD DE LOS ENSAYOS DESARROLLADOS EN EL LABORATORIO


    TALLER DE QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL

    CROMATOGRAFIA LÍQUIDA HPLC

    1. Defina cromatografía en general.


    2. Cuáles son los métodos cromatográficos, defina cada uno de ellos.
    3. Defina elución y eluyente.
    4. Que es un cromatograma para que se usa en cromatografía, dibuje uno y explique
    cómo interpretarlo.
    5. Defina: Tiempo muerto, Tiempo de retención.
    6. Defina velocidad de flujo volumétrico y velocidad lineal, como las relaciono en
    cromatografía.
    7. Que es y cómo se calcula el factor de retención.
    8. Que es y cómo se calcula el factor de selectividad.
    9. Describa la relación entre el ensanchamiento de banda y la eficiencia de una columna.
    10. Como se determina de manera cuantitativa la eficiencia de la columna.
    11. Como se determina el número de platos teóricos?
    12. Que variables afectan la eficiencia de la columna? Explique como la afecta y en que
    unidades se expresan esas variables.
    13. Que es y cómo se determina la resolución de una columna.
    14. Defina cromatografía líquida
    15. Como se clasifica los tipos de cromatografía líquida de alta resolución según el
    mecanismo de separación o el tipo de fase estacionaria.
    16. Consulte el diagrama de bloques de los componentes de un equipo HPLC, identifique
    cada una de sus partes.

    17. Consulte las aplicaciones de la HPLC según el peso molecular y la polaridad del
    analito.
    Campos de Aplicación de HPLC
     Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos
     Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
     Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
     Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores,
    colorantes
     Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
     Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos
     Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos.
    Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa
     Separación y purificación de metabolitos
     Separación y purificación de los metabolitos de las drogas procedentes de muestras de
    orina
     Purificación y separación de enantiómeros
     Purificación de compuestos naturales
     Purificación y caracterización de enzimas y proteínas

    18. Que detectores existen en HPLC, que aplicaciones tiene cada uno de ellos.

    ULTRAVIOLETA (UV)
    Detectores (UV) ultravioletas son rentables y populares y son ampliamente utilizados en
    industria. Este tipo de detector responde a las sustancias que absorben la luz. El detector UV
    se utiliza principalmente en Ciencias Biomédicas y farmacéuticas para separar e identificar los
    componentes activos principales de una mezcla. Detectores de UV son las más versátiles, tiene
    la mejor sensibilidad y linealidad. Detectores de UV no pueden utilizarse para las pruebas de
    sustancias que son bajas en cromóforos (incoloros o prácticamente incoloros) como no
    absorben la luz en la gama baja.

    Fluorescencia
    La fluorescencia es el más sensible detector HPLC, usado casi exclusivamente en la
    cromatografía líquida (LC). Se trata de un detector específico que detecta solamente las
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    sustancias que emiten luz. Este detector es popular para análisis de trazas en ciencias
    ambientales. Ya que es muy sensible, su respuesta solo es lineal en un rango de concentración
    relativamente limitada. Como no hay muchos elementos que fluorescencia (someterse a
    fluorescencia o ser fluorescente), los científicos necesitan sintetizar las muestras para hacerlas
    detectables.

    Espectrometría de masas
    El detector de espectrometría de masas acompañado con HPLC se llama HPLC-MS y forma
    uno de los mejores tandems analíticas. HPLC-MS es el detector más de gran alcance,
    particularmente relevante para la ciencia médica y ampliamente utilizado en laboratorios
    farmacéuticos de investigación y desarrollo. El principal beneficio de HPLC-MS es que es
    capaz de analizar y proporcionar identidad molecular de una amplia gama de componentes.

    Detección del índice de refracción (RI)


    El detector de índice de refracción (RI) utiliza un monocromador y es uno de los menos
    sensibles detectores de LC. Este detector es extremadamente útil para la detección de estos
    compuestos no iónicos, no absorben la luz ultravioleta y fluorescencia no.Las muestras
    examinadas con este detector son azúcar, alcohol, ácidos y polímeros .

    19. Para los siguientes tipos de cromatografía HPLC: Reparto (Fase Normal, Fase
    Reversa), Adsorción, Intercambio iónico, Exclusión Molecular, Afinidad y quiral. Realice:
    a. Definición
    b. Qué tipo de empaquetamiento tienen las columnas.
    c. Que fase móvil y estacionario se usa.
    d. Aplicaciones de este tipo de cromatografía.

    CROMATOGRAFÍA DE REPARTO
    la cromatografía de reparto, en la cual la fase estacionaria es un líquido retenido sobre un
    soporte sólido y la separación se debe a la diferente distribución del analito entre la fase móvil y
    la fase estacionaria:

    Cromatografía de reparto en fase normal: la fase móvil es un disolvente apolar o poco polar
    (como el hexano o el isopropiléter) y la fase estacionaria presenta elevada polaridad (el grupo
    R es polar).
    Cromatografía de reparto en fase inversa: la fase móvil es un disolvente relativamente polar
    (disoluciones acuosas con etanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano) y la fase estacionaria es
    apolar (el grupo R es un n-octilo, C8, o n-octadecilo, C18). La longitud de la cadena del grupo
    alquilo influye en la eficacia de la separación, pues a mayor longitud mayores serán el tiempo
    de retención y el tamaño de partícula capaz de retener.

    Cromatografía quiral

    Usada para separar compuestos quirales. Para esta se requieren fases estacionarias quirales o
    aditivos quirales de fase móvil. El agente de resolución quiral (fase estacionaria o aditivo) forma
    complejos de manera preferente con uno de los enantiómeros.
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    Cromatografía de afinidad (AFC)

    De entre todas las técnicas cromatográficas, la Cromatografía de Afinidad (AFC) ofrece


    la mayor especificidad y selectividad para el aislamiento y purificación de
    biomoléculas. Esta técnica se basa en interacciones bioespecíficas gracias a las cuales la
    columna de AFC absorbe únicamente de la muestra los componentes que presentan
    afinidad con los ligandos acoplados al soporte cromatográfico. Cuando el compuesto
    retenido es eluido, se consiguen niveles de pureza extraordinarios, gracias a la elevada
    selectividad de estas interacciones de afinidad

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