Este documento presenta los detalles de la Práctica N° 5 de laboratorio de bioquímica sobre métodos espectrofotométricos. Se midió el espectro de absorción del Azul de Bromofenol y el Naranja de Metilo para determinar su longitud de onda óptima. Se construyeron curvas de calibración de concentración vs absorbancia para ambas sustancias y se analizaron muestras desconocidas. El documento concluye que el espectrofotómetro proporciona mediciones precisas y que la absorb
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Este documento presenta los detalles de la Práctica N° 5 de laboratorio de bioquímica sobre métodos espectrofotométricos. Se midió el espectro de absorción del Azul de Bromofenol y el Naranja de Metilo para determinar su longitud de onda óptima. Se construyeron curvas de calibración de concentración vs absorbancia para ambas sustancias y se analizaron muestras desconocidas. El documento concluye que el espectrofotómetro proporciona mediciones precisas y que la absorb
Este documento presenta los detalles de la Práctica N° 5 de laboratorio de bioquímica sobre métodos espectrofotométricos. Se midió el espectro de absorción del Azul de Bromofenol y el Naranja de Metilo para determinar su longitud de onda óptima. Se construyeron curvas de calibración de concentración vs absorbancia para ambas sustancias y se analizaron muestras desconocidas. El documento concluye que el espectrofotómetro proporciona mediciones precisas y que la absorb
Este documento presenta los detalles de la Práctica N° 5 de laboratorio de bioquímica sobre métodos espectrofotométricos. Se midió el espectro de absorción del Azul de Bromofenol y el Naranja de Metilo para determinar su longitud de onda óptima. Se construyeron curvas de calibración de concentración vs absorbancia para ambas sustancias y se analizaron muestras desconocidas. El documento concluye que el espectrofotómetro proporciona mediciones precisas y que la absorb
2018 MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS I) INTRODUCCIÓN: Desde hace muchos años se ha usado el color como ayuda para reconocer las sustancias químicas; al reemplazar el ojo humano por otros detectores de radiación se puede estudiar la absorción de sustancias, no solamente en la zona del espectro visible, sino también en ultravioleta e infrarrojo. Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación, y a las mediciones a una determinada longitud de onda. Los espectrofotómetros poseen sensores que miden la cantidad de luz que atravesó la solución, comparando la cantidad entrante y la lectura de la cantidad absorbida. Se realiza una serie de soluciones de concentraciones conocidas de la sustancia química en estudio y se mide la absorbancia para cada concentración, así se obtiene una gráfica de absorbancia respecto a concentración. Por extrapolación de la absorbancia en la gráfica se puede encontrar el valor de la concentración desconocida de la muestra.
II) RESULTADOS:
Espectro de absorción del Azul de Bromofenol:
520 nm 560 nm 580 nm 600 nm
%T 57.94% 25.40% 11.32% 11.85% A 0.237 0.595 0.946 0.926
Para el azul Bromofenol el lambda óptimo es 580 nm.
- Según (C. Harris, 2006) denominamos espectro de una sustancia a la
representación de absorbancia (A) en función de longitud de onda (λ) en una gráfica presenta ondulaciones con máximos y mínimos. El cual es característico para cada compuesto. - Según la Ley Lambert-Beer se expresa la relación entre la absorbancia de una solución y su concentración y estas son directamente proporcionales.
IV) CONCLUSIONES:
- El conocer el adecuado uso del espectrofotómetro permitió obtener
en el laboratorio resultado con alta calidad analítica en las mediciones que so n emitidas por este. - Se determinó la longitud de onda óptima de las 2 soluciones del azul de Bromofenol (ABF) y naranja de metilo (NM). - La relación entre %T y A, es inversa, ya que la primera es una medida del porcentaje de radiación que atraviesa la muestra, ya la segunda indica la cantidad absorbida por la misma. - La absorbancia es proporcional a la concentración de cada sustancia. - Se identificó que el equipo presenta una adecuada precisión y exactitud determinando que las mediciones realizadas en este pueden ser confiables.
V) BIBLIOGRAFÍA:
- Métodos modernos de análisis químicos, por, Robert L. Pecsok y
L. Donal Shields, Editorial limusa, 1983 - D. Harris, Análisis Químico Cuantitativo, Editorial Reverte,2006, pag. 427.
PROBLEMAS ENCARGADOS
1) Hallar la concentración de un metabolito en una muestra de suero si su
absorbancia es de 0,280 y las absorbancias del estándar son:
Observamos que la pendiente es 1, por lo que al extrapolar la absorbancia, la
concentración del metabolito también será 0,280 mg/mL. 2) El coeficiente de extinción molar del NADH es 6220 cm-1M-1 ¿Cuál será la concentración de una muestra que tiene una absorbancia de 0.720 diluida la mitad y puesta en una cubeta de 1 cm de espesor? A= abc 0,72= 6220x1xc C=1,58x 10-4 M 3) Una solución que contiene 2 g/L de una sustancia que absorbe en una cubeta de 1 cm de trasmite el 75% de luz incide. Calcular la transmitancia de una solución que contiene a) 4g/L b) 1g/L d) 5.4 g/L e) si el peso molecular de compuesto es 250. Calcule el coeficiente de extinción molar. Solución = 2g/L Hallamos la concentración molar de la solución: Peso Molecular = 250 g/mol M = 2g/250g mol^-1 x 1 L = 8 mmol/ L
Transmitancia = 75 % Hallamos la Absorbancia:
A = 2 – Log T % A = 2 – Log 75 A= 0.125 Hallamos el coeficiente de extinción molar: A=cxbxE 0.125= 8 mmol/L x 1cm x E E = 0.016 mM ^-1 x cm. ^-1
A.- Cuando la solución tenga 4g/ L Hallar la Transmitancia en %
-Primero hallamos la absorbancia: A = 16 mmol/ L x 1cm x 0.016 mM ^-1 x cm. ^-1 A= 0.256 -Segundo hallamos transmitancia: 0.256 =2 – Log T % T = 55.5 %
B.- Cuando la solución tenga 1g/L Hallas Transmitancia en %:
-Primero hallamos la absorbancia: A = 4 mmol/ L x 1cm x 0.016 mM ^-1 x cm. ^-1 A= 0.016 -Segundo hallamos transmitancia: 0.016 =2 – Log T % T = 96.4 %
C.- Cuando la solución tenga 5.4 g/ L Hallar la Transmitancia en %
-Primero hallamos la absorbancia: A = 21.6 mmol/ L x 1cm x 0.016 mM ^-1 x cm. ^-1 A= 0.3456 -Segundo hallamos transmitancia: 0.3456 =2 – Log T % T = 45.12 %
4) Una solución 10^-5 de ATP tiene una transmitancia de 0.702 (70.2%) a
260mm en una cubeta de 1cm. Calcular:
a) La transmitancia de la solución en una cubeta de 3cm.
Transmitancia: 2.7x10^-8
b) La absorbancia de una solución en cubeta de 1cm o 3cm
Absorbancia con cubeta de 3cm es de 8.1x10^-8
c) La absorbancia de una solución 5x10^-5M
Absorbancia con 5x10^-5M es igual a 1.35x10^-7
5) Con los siguientes datos graficar en un solo papel milimetrado las tres curvas de absorción de la Hb en sus diferentes estados, indicando cada curva con diferente color o marca. Grafique en sistema (XY) longitud de onda D.O. respectivamente, identificar para cada curva el o los puntos de máxima absorción.
1 0.78 0.8 0.8 Absorbancia
0.6
0.4 0.54
0.2
0 400 450 500 550 600 650 Longitud de Onda
Hb HbO2 HbCN
a) ¿Qué importancia tiene la longitud de onda?
Mucha debido a que estos rangos se encuentran en la región visible (400nm a 850nm) Lo cual permite utilizar métodos espectrofotométricos para cuantificar la cantidad de luz en una respectiva longitud de onda que absorberá la solución. b) ¿Por qué las gráficas no coinciden los puntos de máxima absorción a pesar de pertenecer las tres graficas a la Hb? Porque estructuralmente esos tipos de hemoglobina varían, es por ello que la espectrofotometría es aplicable ya que nos permite diferenciar unidades estructurales específicas. ( L. Pecsok, 1983) 6) A partir de una solución stock de sulfato de cobre de 10g% se preparó la siguiente batería: Tubo N°1 N°2 N°3 N°4 Sol stock 0.25 0.5 2.0 4.0 CuSO4(mL) H2O 9.75 9.5 8.0 6.0 destilada(mL) ppm 2.5x10-3 5x10-3 2x10-2 4x10-2 mg% 2.5x10-4 5x10-4 2x10-3 4x10-3
