Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y métodos de siembra

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA VETERINARIA
CATEDRA DE MICROBIOLOGÍA E INMUNOLOGÍA
ASIGNATURA: MICROBIOLOGÍA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL

CULTIVO DE MICROORGANISMOS:
MEDIOS DE CULTIVO Y MÉTODOS DE SIEMBRA.
1.- OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA
a. Reconocer los medios de cultivos, materiales, instrumentos y técnicas
empleadas rutinariamente en los procedimientos de aislamiento primario e
identificación bacteriológica de patógenos de interés veterinario.
b. Conocer la clasificación, preparación, esterilización y distribución de los
medios de cultivo.
c. Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta preparación del
medio de cultivo en la práctica microbiológica.
d. Reconocer la necesidad de evitar la contaminación tanto de los medios de
cultivo como de los demás elementos utilizados en el laboratorio de
microbiología
e. Adquirir conocimientos básicos teóricos y prácticos de la siembra y
aislamiento de bacterias realizando sobre medios de cultivo los diferentes
procedimientos de siembra por extensión, siembra por estría y agotamiento
en placa, siembra en masa por placa vertida y siembra en medios de cultivo
líquidos y sólidos en tubos.
2.- ACTIVIDADES DEL INSTRUCTOR:
a. Explicación sobre medios de cultivo, métodos de siembra y aplicaciones
b. Demostración de las técnicas de preparación, esterilización y distribución de
los medios de cultivo en placas de petri y tubos de ensayo, diferenciando, en
estos últimos las técnicas para los medios líquidos y sólidos.
c. Demostración de técnicas de siembra por agotamiento en placa de agar,
placa vertida, tubos de medios líquidos y sólidos.
3.- ACTIVIDADES DE LOS ALUMNOS:
a- Aplicando técnicas asépticas, siembre el medio de cultivo líquido en tubo que
se le suministra. Emplee el esquema de diseminación del inoculo indicado.
Marque el tubo, incube el tubo en estufa a 37ºC.
b- Aplicando técnicas asépticas, siembre el medio de cultivo sólido en tubo
(medio con bisel) que se le suministra. Emplee el esquema de diseminación
del inoculo indicado. Marque el tubo, incube el tubo en estufa a 37ºC.

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c- Aplicando técnicas asépticas, siembre en la placa de agar nutritivo que se le

suministra, por la técnica de extensión, usando una espátula de Drygalsky
esquemas de diseminación del inoculo. Marque la placa, incube la placa en
posición invertida, en estufa a 37ºC.
d- Aplicando técnicas asépticas, siembre en la placa de agar nutritivo que se le
suministra, por la técnica de agotamiento, usando cualquiera de los esquemas
de diseminación del inoculo. Marque la placa, incube la placa en posición
invertida, en estufa a 37ºC.
e- Aplicando técnicas asépticas, y a partir de un tubo de una dilución seriada de
una muestra bacteriológica, realice la siembra siguiendo la técnica de siembra
en masa por placa vertida.
4.- LOS MEDIOS DE CULTIVO EN MICROBIOLOGÍA
Los microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza,
de modo que podemos encontrarlos prácticamente en cualquier ambiente.
Frecuentemente, se encuentran varias especies microbianas compartiendo un
determinado ambiente; buenos ejemplos de complejas comunidades bióticas lo
constituyen el colon humano o animal, el rumen, las cavidades naturales del hombre y
los animales, el suelo, etc.
Las mezclas de microorganismos es frecuente en los materiales clínicos, sobre
todo en los que proceden de regiones en las que existe una flora microbiana normal
establecida como, por ejemplo, las muestras de lesiones en piel, exudados óticos,
nasales, faríngeos, uretrales, vaginales, heces, etc.
Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos,
razón por la cual es difícil aislarlas. A menudo nuestro interés es caracterizar una
especie bacteriana, para lo cual debemos estar preparados para aislar, cultivar e
identificar a la misma. Si bien el aislamiento es un paso crucial en este camino,
comenzaremos examinando los medios de cultivo, ya que en estos últimos se basan
muchos de los principios del aislamiento.
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos
es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio
de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado
más de 10.000 medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial
debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y
presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.
Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios
y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y
otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los

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microorganismos. Es decir, es cualquier “medio” que proporcione substancias

nutritivas que permitan el desarrollo y reproducción de microorganismos. La
diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de
medios de cultivo también lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado
para todos ellos.
El conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos
es fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado.
Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a
reproducir el ambiente natural en el que se desarrollan.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares
en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de
muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se
añadirán otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de
medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se
solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el
crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que
bastantes bacterias provocan su licuación.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los
hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el
valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los
microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se
añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.
También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por
ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y
no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y
amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el
crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).
5.- LA EVOLUCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Podemos decir que la microbiología empieza su verdadero desarrollo como
ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observación
de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los
medios de cultivo y la utilización del agar como solidificante, marcan dos importantes
puntos de inflexión en su evolución.
La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo
Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos
realizados a base de gelatina.

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Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor
tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado al
cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido.
Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de
patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne
líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio
sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las
colonias microbianas.
En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en
relación con los medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el agar-
agar (polisacárido extraído de algas rojas) como solidificante.
En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de
cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las
clásicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.
Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones
sobre las bacterias quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre todo)
tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de
enriquecimiento. Diseñaron este tipo de medios de tal forma que su especial
composición química favorecía el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos
que, en función de sus procesos metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar para
su desarrollo ciertos nutrientes del medio.
En 1892 Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando
indicadores de pH a la composición de ciertos medios con lo cual se podía observar la
producción de ácidos en la fermentación en ciertos microorganismos.
6.- CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve
afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son
ajenos por completo al propio medio.
a- disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de
contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En
muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del
crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer
de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan
lugar.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones
de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de
estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida de
los factores nutritivos lábiles.

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Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios

es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de
nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar
directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y
otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade
a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente
pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio,
magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento,
generalmente de naturaleza vitamínica.
Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como
indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer
de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.
b- consistencia adecuada del medio
Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo
productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado
semisólido o sólido.
Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que
muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores
al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y
comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está
ampliamente extendido en el laboratorio.
c- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de
oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados
sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán
adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los
microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas
parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida y concentraciones
elevadas de CO2 – 5-8%), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo
capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
d- condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los
cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufa
s de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la
humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el
medio.

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e- Luz ambiental
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que
en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los
microorganismos fotosintéticos.
f- pH
La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de
los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH
neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe
olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el
crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos
metabólicos normales. En general el rango óptimo de pH para la mayoría de las
bacterias oscila entre 6,6 y 7,8 con pH óptimo de 7,4.
g- Temperatura
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre
15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a
temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos
humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y
los saprofítos tienen rangos más amplios.
h- Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la
aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el
crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos
medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave de
Chamberland, el cual utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante. (15
libras de presión a 121ºC, durante 15 a 20 minutos)
i.- Presión osmótica y fuerza iónica
Aunque en menor grado, a veces, puede ser necesario controlar las
condiciones de salinidad y presión osmótica del medio de cultivo
7.- CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo son una mezcla equilibrada de nutrientes que en
concentraciones adecuadas y con condiciones físicas óptimas permiten un buen
crecimiento de los microorganismos. Contienen una base mineral; fuente de carbono,
nitrógeno y azufre; atmósfera adecuada y los factores de crecimiento necesarios.
Ellos pueden clasificarse en función a:
7.1.- SEGÚN SU ORIGEN
Los medios de cultivos pueden clasificarse en:
a.- Naturales:

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Son aquellos que existen como tales en la naturaleza, por ejemplo, agua,
suero, papa, huevos, leche, sangre, tierra, etc.
b.- Artificiales:
Están compuestos de sustancias que son manipuladas por el hombre en el
laboratorio. A los medios artificiales a su vez se los puede dividir en
sintéticos y complejos.
Sintético o químicamente definido: Medio del cual se conoce
exactamente su composición química y las cantidades precisas de sus
componentes; puede ser una simple solución de sales con una fuente de
carbono o puede contener muchos compuestos orgánicos.
Medio no sintético o complejo: es aquel del que se desconoce su
composición química exacta; se trata básicamente de extractos de tejidos
vegetales, animales o microbianos, cuya concentración no se conoce con
exactitud y que proveen todos los nutrientes necesarios, como por ejemplo
el caldo nutritivo.

7.2.- ATENDIENDO A SU ESTADO FÍSICO O CONSISTENCIA:

Líquidos:
Semisólidos: Se preparan agregando a un medio líquido sustancias
solidificantes, tales como la gelatina y el agar; este último es el más usado
por tratarse de un polisacárido complejo, formado por moléculas de
galactosa, que muy pocas bacterias son capaces de degradar. Los medios
semisólidos se preparan agregando 2,5 a 3 gramos de agar por litro y son
ampliamente utilizados para estudiar motilidad bacteriana.
Sólidos: Se preparan agregando 13 a 15 gramos de agar por litro de medio
7.3.- ATENDIENDO A SU UTILIDAD PRÁCTICA:
a.- Medios Básicos Ordinarios o medios simples:
En esta clase tenemos los medios como el caldo y el agar nutritivo,
capaces de soportar el crecimiento de microorganismos que no ostentan
requerimientos de cultivos especiales. Se utilizan con frecuencia para
mantener cepas de laboratorio, como base para preparar medios más ricos
o complejos, para el sub-cultivo de microorganismos a partir de colonias
aisladas, etc.
b.- Medios Enriquecidos:
Aunque muchas bacterias desarrollan bien en medios de cultivos simples u
ordinarios, algunas tienen requerimientos especiales, no siempre bien
conocidos, que no son cubiertos por los medios ordinarios y, por ello, no
desarrollan en esos medios. Se recurre entonces al uso de los llamados

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“medios enriquecidos”, que son básicamente, medios de cultivo simples u

ordinarios a los cuales se agrega sangre, suero, líquido ascítico, extracto
de levadura o cualquier otro producto biológico, con el fin de aportar los
factores de crecimiento requeridos por esos microorganismos llamados
“exigentes”. Ejemplos de este tipo de medio son: el agar sangre, el agar
chocolate, el caldo cerebro corazón más suero, etc. Cuando se trata de
medios líquidos no existe dificultad para agregar al medio estéril las
sustancias enriquecedoras necesarias, en las proporciones deseadas.
Tratándose de medios de cultivo sólido se requiere fundir el medio base a
100ºC, esperar a que su temperatura descienda a 46-50ºC,
aproximadamente, y luego, añadir la sustancia enriquecedora estéril,
respetando rigurosas condiciones de asepsia.
c.- Medios Selectivos:
Son medios de cultivo que, por su composición, permiten el desarrollo de
determinado microorganismo e inhibe el crecimiento de otros. Ejemplos de
estos medios de cultivo selectivo son:
Medio de Chapman, utilizado en el aislamiento y caracterización de
miembros del género Staphylococcus y especialmente de la especie
patógena Staphylococcus aureus. El poder selectivo de este medio reside
en su alta (7,5%) concentración de cloruro de sodio, con relación a la de los
medios ordinarios (0,5%), lo cual impide el desarrollo de la mayoría de las
bacterias, pero permite el desarrollo de los Staphylococcus; de esa manera
se facilita grandemente su aislamiento a partir de muestras poliinfectadas.
Medio de Edwards, es un medio usado para aislamiento de miembros del
género Streptococcus; este medio es, básicamente, un agar sangre, pero
contiene cristal violeta que impide el desarrollo de los microorganismos
Gram negativos y sales de talio, que inhibe el desarrollo de ciertas
bacterias Gram positivas como los Staphylococcus.
Medio de MacConkey, es un medio que contiene sales biliares, lactosa,
rojo neutro y cristal violeta, además de las sustancias usuales. Las sales
biliares impiden el desarrollo de la mayoría de las bacterias Gram positivas
y el cristal violeta evita el desarrollo de ciertos gérmenes Gram negativos.
El medio es recomendable para el aislamiento de enterobacterias
patógenas. La presencia de lactosa en el medio y del rojo neutro como
indicador de pH, permiten además una diferenciación inicial entre bacterias
fermentadoras de la lactosa (E. coli y otras bacterias coliformes) y no
fermentadoras de la lactosa (Salmonella sp., Shigella sp.)
d.- Medios Diferenciales:
Son medios de cultivo diseñados para estudiar características bioquímicas
o enzimáticas, que nos permiten la identificación de las bacterias aisladas.

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Existen muchos medios de cultivo diferenciales de uso frecuente; p. ej. El

medio Kliger, medio citratado de Simmon, caldo nitratado, medios
hidrocarbonados, caldo urea, medios de Clark y Lubs MR-VP (para
pruebas de Rojo Metilo y Voges-Proskauer), etc.
e.- Medios Especiales:
Se trata de medios desarrollados con una finalidad específica, por ejemplo
tenemos los medios de Lowestein-Jensen y Petragnani, diseñados para el
aislamiento de bacilo tuberculoso humano o bovino.
f.- Medios de Enriquecimiento:
La mayoría de estos medios están basados en el mismo principio señalado
para los medios selectivos; sin embargo, los medios de enriquecimiento no
siempre permiten el aislamiento del microorganismo investigado en un solo
paso, Ejemplos de este tipo de medio son el Caldo Selenito, el Caldo
Tetrationato para enriquecimiento de Salmonella sp., a partir de muestras
de heces y el agua peptonada alcalina para Vibrio cholerae. En ocasiones,
el enriquecimiento de un determinado microorganismo se logra por
incorporación de una determinada fuente de carbono usada
preferentemente por el agente investigado, con lo cual se logra su
multiplicación rápida y prevalencia en la población microbiana inoculada en
el medio.
g.- Medios de transporte:
Se trata de medios diseñados especialmente para el transporte de
muestras clínicas. Generalmente, son medios químicamente definidos,
formulados para lograr que la población microbiana presente en una
muestra que sufra pocas modificaciones, durante períodos que varían
dependiendo del medio de transporte. Estos medios se caracterizan por no
aportar materiales nutritivos, por lo que no se produce multiplicación
microbiana, con lo cual la proporción de bacterias presentes en la muestra
no se altera. Además, son medios tamponados, por lo que el pH se
mantiene cercano a la neutralidad y, algunos, vienen incorporados con
carbón, que absorbe sustancias tóxicas. Generalmente, son semisólidos y
de bajo potencial de óxido reducción, por lo que pueden usarse también en
caso de sospecharse microorganismos anaerobios. Ejemplos de estos
medios son el medio de Stuart, el medio de Cary y Blair y el medio de
Amies. En el mercado existen medios de transporte como el Transcult y el
Culturette.

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8.- CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los elementos citados a continuación, son los más frecuentemente usados en la
preparación de los medios de cultivo, aunque pueden no ser los únicos e incluso
alguno de ellos puede estar ausente de la preparación.

a.- Agua destilada o desionizada. Libre de inhibidores del crecimiento.

b.- Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de
cultivo. El componente dominante en el agar es un polisacárido, al que
acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Existe
en rama o en polvo, se solubiliza en agua a ebullición (funde hacia los 98°C) y al
enfriarse forma un gel inodoro e insípido (se gelifica alrededor de los 42°C),
dependiendo de su grado de pureza, por lo que tiene la ventaja de ser sólido a la
temperatura de incubación. Con la excepción de algunos microorganismos
marinos, el agar no es empleado como nutriente. Para preparar un medio sólido
se le agrega agar al 12-18 %. Si se desea visualizar movilidad se usa agar
blando se le agrega agar al 3 %.

c.- Extractos. Para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o vegetales

(por ejemplo carne, hígado, semillas, etc.) son extraídos con agua y calor, y
posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos
preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confección de
medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En el
caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas,
minerales y vitaminas, mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas
del grupo B, nitrógeno y carbono.

d.- Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y

sales minerales que carecen de identidad química definida; se obtienen por
digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja, carne,
gelatina, caseína, etc.). Las peptonas son muy ricas en péptidos y aminoácidos,
pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen
proteosas, peptonas, polipéptidos y aminoácidos.

e.- Fluidos Corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero

sanguíneo son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo
de algunos patógenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser
obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano. Los fluidos
corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino también
con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.

f.- Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de

cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano.

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Los microorganismos más comunes son neutrófilos (el pH óptimo para su

crecimiento está próximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisódicos o
bipotásicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviación del pH.

g.- Indicadores de pH. Indicadores ácido- base se añaden a menudo a los medios
de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH.

h.- Agentes reductores. Cisteína, tioglicolato y otros son agentes reductores que
se añaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el
desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios.

i.- Agentes selectivos. La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo

puede convertirlo en selectivo (ver más adelante, clasificación de los medios de
cultivo). Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sódica, telurito potásico,
antibióticos, etc., a la concentración adecuada, actúan como agentes selectivos
frente a determinados microorganismos.

9.- P REPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran

comercializados, normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso re-hidratar.
En general, la preparación de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la
cantidad deseada del mismo y disolverla en agua destilada, siguiendo las
instrucciones del fabricante y luego esterilizarlo.

En caso que el medio de cultivo debamos hacerlo nosotros, la preparación de

un medio de cultivo comienza por hacer un estudio de la fórmula que constituye una
receta que deberá respetarse estrictamente.

Primero se agrega agua destilada o desionizada a un recipiente, luego se van

incorporando todos los ingredientes de la lista en el orden en el que se encuentran.
Generalmente figura en primer término el compuesto que actúa como tampón, como
puede ser el PO4H2K, que además provee fósforo y potasio.

Es conveniente añadir todos los ingredientes en el orden indicado y disolverlos

de a uno antes de agregar el siguiente.

Al finalizar la preparación y una vez que ésta se enfríe, se debe verificar que el
pH sea el adecuado. En caso de ser necesario se ajusta con CO3Na2 (1N) o HCl (1N).

9.1.- EJEMPLOS DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

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MATERIALES:
- Erlenmeyer
- Pipetas de 10 ml
- Tubos de ensayo con sus tapones
- Gradillas
- Tiras de pH o pHmetro
- Reactivos correspondientes a cada fórmula
- Balanza
- Autoclave

A.- CALDO NUTRITIVO (CALDO CARNE)

Es el medio complejo más común para el cultivo de microorganismos.
Fórmula:
Peptona.................... 5g
Extracto de carne..... 3g
Agua c.s.p................. 1000 ml
pH............................... 7,2

Preparación:
1) Colocar un volumen medido de agua destilada en un recipiente.
2) Disolver los ingredientes de a uno y por orden.
3) Llevar a ebullición agitando periódicamente con una varilla de
vidrio.
4) Completar el volumen hasta 1000 ml.
5) Dejar enfriar y medir pH. Si hace falta corregir con HONa 1M.
6) Colocar 10 ml del caldo en tubos de ensayo y volúmenes
apropiados en frascos.
7) Tapar, colocar capuchón de papel y esterilizar en autoclave 15
minutos a 1 atm.

B.- AGAR NUTRITIVO

Fórmula:
Agar........................... 20 g
Caldo nutritivo........ 1000 ml

Preparación:
1) Colocar 1000 ml de caldo en un recipiente.
2) Agregar el agar calentando a baño maría agitando hasta disolución
total.
3) Ajustar pH hasta 7,2.
4) Llevar 10 ml a tubos de ensayo.
5) Esterilizar.

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La preparación de agar nutritivo no requiere usar caldo estéril, la esterilización

se lleva a cabo una vez que se ha envasado el caldo agarizado.

Para la preparación de tubos con agar inclinado o en pico de flauta (slant),

se colocan 5 ml del agar en los tubos de ensayo, se tapan y esterilizan. Una vez fuera
del autoclave, cuando están aún líquidos, se apoyan sobre la mesada con un cierto
ángulo hasta que solidifiquen.

Para la preparación de tubos con agar para punción, se colocan 5 ml del agar
en los tubos de ensayo, se tapan y esterilizan En este caso, una vez que los tubos
fueron retirados del autoclave se dejan solidificar en posición vertical.

Para la preparación de capsulas de Petri con agar nutritivo se puede utilizar

medio de cultivo recién esterilizado y todavía líquido, o bien medio solidificado y
fundido a ebullición en Baño María. Se deja enfriar el agar hasta 45 ºC, luego se lo
vuelca asépticamente en caja de Petri estéril, teniendo la precaución de flamear
previamente la boca del tubo o recipiente a la llama del mechero. Se deja solidificar
en posición horizontal y posteriormente se invierten las placas para almacenarlas en
nevera.
10.- SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO
En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o
menos complejas. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los
mismos que dependerán del tipo de microorganismo y del período de tiempo de
conservación que se requiera. Para ello existen técnicas de siembra, conservación y
mantenimiento de los cultivos microbianos.

Una técnica esencial en Microbiología es la de obtención de cultivos puros, a partir de

los cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos.
Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Para poder
obtenerlo es necesario concurrir a las técnicas conocidas como aislamiento.

10.1.- SIEMBRA

Sembrar una bacteria es colocarla en un medio de cultivo, elegido de acuerdo a

las exigencias vitales del microorganismo, lo que permite su desarrollo y
multiplicación, si se incuba en condiciones adecuadas y en un tiempo conveniente.
Para ello una pequeña porción de cultivo o muestra, que se denomina inóculo se
transfiere al medio con precauciones especiales de asepsia a fin de evitar la
introducción de otros microorganismos ajenos al inóculo.

El conjunto de pasos a efectuar para lograr una siembra correcta, se conoce como
técnica aséptica.

La toma del inoculo es simple, pero se requiere tener en cuenta lo siguiente:

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a. La siembra siempre debe realizarse al abrigo de las corrientes de aire (cerrar

bien puertas y ventanas), con movimientos pausados, poco amplios, sin
brusquedad y sin hablar.
b. Coloque frente a usted el mechero y la preparación o muestra que contiene
los microorganismos, así como el resto del material necesario (portaobjetos,
tubos, placas). Todo ello ha de ser alcanzado con facilidad y sin tropiezos.
c. Se debe trabajar a una distancia no mayor de 15 cm. de la llama de un
mechero.
d. El asa o aguja de siembra se esteriliza por llameado directo (flaméelo hasta
que alcance un rojo incandescente) y antes de retirar el inóculo debe
facilitarse su enfriamiento, a fin de evitar el deterioro del material a sembrar
(enfríelo en la proximidad de la llama unos 10 segundos).
e. Una vez realizada la siembra se esteriliza nuevamente el asa o aguja a la
llama del mechero antes de depositarla sobre la mesada de trabajo.
b- Nunca debe depositarse un tapón sobre la mesada o gradilla, pues estos
elementos están cargados de microorganismos.
c- Cuando esté destapado, mantener el tubo en la forma más horizontal posible
para evitar que los microorganismos del ambiente, en su caída, tengan
acceso al interior.
a. Las bocas de los tubos de donde se toman los cultivos y la de aquellos a
donde serán transferidos, deben pasarse ligeramente sobre la llama
inmediatamente antes de que el asa o aguja sea introducida. También se
debe flamear la boca del tubo antes de taparlo. Este procedimiento fija al
vidrio los microorganismos que pueden estar en dicha boca y tiende a crear
corrientes hacia afuera (el aire tiende a salir), disminuyendo así el riesgo de
contaminación.
b. Para retirar el inoculo o sembrar medios de cultivos en capsulas de Petri,
coloque la placa invertida sobre la mesada de trabajo y levante la parte que
contiene el medio de cultivo con los microorganismos. Llévela a la proximidad
de la llama del mechero y tome el inoculo con el asa de siembra. Otro método
permitido consiste en retirar el inoculo o sembrar, levantando la tapa solo lo
suficiente para permitir la introducción del asa o aguja, para evitar que los
microorganismos ambientales se depositen en la superficie del medio.
c. Si la siembra se realiza con pipeta, ésta debe estar convenientemente
preparada y esterilizada hasta el momento de su empleo. Una vez utilizada se
descarta introduciéndola en una solución antiséptica.
d. Transfiera el inoculo a otro medio de cultivo estéril, tomando las mismas
precauciones en su manejo (flameando bocas de tubos, trabajando en la
proximidad de la llama, etc.)

La finalidad de una siembra puede ser la de realizar una transferencia o un

aislamiento. La primera se efectúa con cultivos puros (una sola especie bacteriana),
ya sea con el objeto de renovar el medio de cultivo para perpetuar la especie, o bien

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 Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y métodos de siembra

para conocer alguna de sus propiedades culturales o bioquímicas. El aislamiento, en

cambio, se realiza a partir de un material que contiene una mezcla de especies
bacterianas y su objeto es separarlas para obtener cultivos puros.

10.2.- TOMA DEL INÓCULO

Si la muestra proviene de un medio líquido, el inoculo se toma agitando el

suavemente el asa dentro del mismo, quedando la muestra adherida por tensión
superficial en el extremo del filamento del asa de siembra.

Si el medio es sólido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar

(capsula de Petri), tome una pequeña porción de cultivo mediante un ligero roce con
el asa de siembra. Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con
agar en pico de flauta), hunda el filamento dentro del medio hasta tomar una pequeña
porción de la misma. Flamee la boca del tubo antes de taparlo y colóquelo en el
soporte necesario.

10.3.- TRANSFERENCIA

La técnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo
de recipiente que los contiene.

Se pueden presentar los siguientes casos:

a. Siembra de medio líquido a medio líquido: El procedimiento se puede

realizar con asa en anillo, aguja o pipeta y en tubos de ensayo, matraces
o frascos.
b. Siembra de medio sólido a medio líquido: El procedimiento se puede
realizar con asa en anillo o aguja y en tubo de ensayo, matraces o
frascos.
c. Siembra de medio sólido a medio sólido: El procedimiento se puede
realizar con asa o aguja y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en
profundidad o en capsula de Petri, en superficie.
d. Siembra de medio líquido a medio sólido: El procedimiento se puede
realizar con asa en anillo, aguja o pipeta y en tubo de ensayo, ya sea en
superficie o en profundidad o en capsula de Petri, ya sea en superficie o
por homogenización.

TÉCNICA DE TRANSFERENCIA EN TUBOS DE ENSAYO.

TÉCNICA PARA MEDIO LÍQUIDO.

Los dos tubos, el que contiene el medio de cultivo sin sembrar y el que
contiene los microorganismos a transferir, se toman con una mano, con las
bocas colocadas a la misma altura.

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 Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y métodos de siembra

Se sostienen con los dedos índice, medio y anular apoyándolos en el dedo

meñique, y se los sujeta con el dedo pulgar muy cerca de la base para
permitir la visualización de toda la superficie del cultivo.

Con los dedos: pulgar e índice (como un lápiz) de la otra mano, se toma la
pipeta estéril o el mango de Koll con su aguja o asa en anillo y se esteriliza.

Se destapan los tubos con los dedos libres de la mano que sujeta el asa,
de la siguiente manera: el tapón del tubo más alejado del operador (que es
el que contiene la muestra) entre el dedo meñique y la palma de la mano;
el tapón del tubo más cercano al operador (que contiene el medio de cultivo
estéril) entre el meñique y el anular.

Se flamean las bocas de los tubos, se toma el inoculo; se siembra; se

flamean nuevamente las bocas de los mismos y se tapan respetando la
procedencia de los tapones y se quema el asa.

Como el inoculo procede de un medio líquido, antes de realizar la

transferencia se debe agitar el tubo para poner en suspensión a los
microorganismos que pudieran estar depositados. Si la siembra se realiza
en medio líquido, se agita el tubo sembrado para distribuir
homogéneamente el inoculo.

Para realizar la agitación se toma el tubo cerca del extremo superior con
los dedos índice y pulgar y se golpea suavemente la base del mismo sobre
el dedo índice de la otra mano con una amplitud de 5 cm. Otra forma
consiste en hacer rotar los tubos entre las palmas de las manos.

TÉCNICAS PARA MEDIO SÓLIDO.

Cuando el medio de cultivo a sembrar es sólido, se puede sembrar en

superficie, en profundidad o en profundidad y superficie.

a.- En superficie:

Por estría: Introducir el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado

hasta el fondo diluyendo el inoculo en el agua de condensación que se
acumula en esa parte, luego mover el ansa suavemente sobre la
superficie del agar con un movimiento en zig-zag ascendiendo desde el
fondo hasta la parte superior del medio.

Por trazo: Introducir el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado

y trazar una línea de siembra desde la base del pico de flauta hasta el
extremo superior, sin ejercer presión para que no se rompa el medio.

b.- En profundidad:

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 Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y métodos de siembra

Por punción: El medio de cultivo que se emplea está solidificado en

tubo en forma vertical y la siembra se realiza con aguja, la que se
introduce con el inoculo rápidamente en el seno del medio y se retira de
la misma forma. La punción se realiza en el centro del medio o
excéntricamente.

c.- En profundidad y superficie:

Por punción y estría: Se utilizan para la siembra tubos con agar

inclinado pero con mucho fondo. Se introduce la aguja en el tubo de agar
inclinado, se punza el fondo, se retira y se realiza un trazo o estría en el
pico de flauta.

TÉCNICA DE TRANSFERENCIA EN CAJA DE PETRI.

La siembra en capsula de Petri, puede hacerse:

a.- En superficie.

Por estría central: Se levanta la tapa lo suficiente como para permitir la

introducción del asa con la carga de microorganismos, iniciándose la
estría en el borde del medio más alejado del operador y se la extiende
hasta llegar al centro de la placa, luego se gira ésta 180 º y se continúa
realizando otra estría de la misma manera. Esta división evita el
obstáculo del borde de la placa

Por estría en cuadrantes: Se divide la caja en cuatro sectores y se

siembra en estría cada uno de ellos, partiendo del borde de la caja hacia
el centro. El cuadrante a sembrar debe ser el más alejado del operador y
el inoculo en cada caso puede ser el mismo (la misma especie) o distinto
(diferente especie) para cada cuadrante.

Por diseminación con espátula de Drigalsky: Se deposita sobre el

medio sólido contenido en la placa, una asada o una gota con pipeta del
material a sembrar, que luego se extenderá por toda la superficie del
medio con una espátula de DRIGALSKY.

La espátula se introduce inmediatamente después de su uso en un

recipiente para su esterilización en autoclave o en formaldehído al 5 %.

Por diseminación con hisopo: Se sumerge en el caldo de cultivo, se

escurre el exceso de líquido sobre la pared interior del tubo y se estrían
ambas mitades de la capsula de Petri, partiendo de los bordes hacia el

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 Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y métodos de siembra

centro, luego se gira 90º y se estrían nuevamente ambas mitades,

finalmente se gira 45º y se estrían ambas mitades.

b.- Por homogeneización:

Técnica de la siembra en tubo para volcar en placa: El inoculo se

introduce con el ansa o pipeta en un tubo con el medio de cultivo fundido
y enfriado a 45 ºC en cantidad suficiente para cubrir la placa de Petri. Se
homogeniza por rotación y se vuelca en la placa previo flameado de la
boca del tubo.

Técnica del agar volcado: Se deposita el inoculo con pipeta en el

centro de la caja de Petri y luego se vuelca sobre el mismo el medio de
cultivo fundido y enfriado a 45ºC. Se homogeneiza por rotación para lo
cual se le imprime a la caja movimientos circulares, en sentido horario y
en sentido antihorario y movimientos rectilíneos, horizontales y
verticales.

Se debe tener en cuenta que de las cajas de Petri preparadas con medio
de cultivo para sembrar, debe eliminarse el agua de sinéresis
(condensación) antes de efectuar dicha operación. Para tal fin es
aconsejable preparar las placas con 24 hs. de anticipación y dejarlas
invertidas a temperatura ambiente.

10.4.- AISLAMIENTO

El objeto es obtener cultivos en estado puro, operación imprescindible y

previa al estudio e identificación de una especie bacteriana. Se pueden
realizar aislamientos por métodos generales y por métodos especiales.

MÉTODOS GENERALES DE AISLAMIENTO.

Estos métodos utilizan medios de cultivos sólidos en caja de Petri.

Por diluciones sucesivas: Se homogeniza la muestra y se carga el asa por

única vez. Luego se pasa el asa de un tubo a otro. Estos tubos contienen agar
a 45 ºC. De esta manera el primer tubo contendrá mayor concentración de
microorganismos que el último. Luego se pasa el contenido de los tubos a las
cajas de Petri y de allí a los tubos con agar en pico de flauta.

Por agotamiento en superficie en una sola caja: Es el método más

utilizado. Se prepara una caja de Petri con el medio de cultivo a la que se le
elimina el exceso de humedad según se indicó anteriormente.

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 Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y métodos de siembra

a. Se marca la parte exterior de la contratapa de acuerdo al esquema.

b. Se carga el asa con la muestra
c. Se deposita en un punto de la superficie del sector (I) cercano al
borde, y se extiende en el mismo con estrías próximas y paralelas. A
continuación se quema el asa y se deja enfriar.
d. Se gira la caja 90 º, se pasa el asa una vez sobre la última estría de
la región ya inoculada y se arrastra al sector (II) efectuando sobre él
la siembra sin superponer las estrías con las realizadas antes.
e. Se quema nuevamente el asa y de la misma manera se estría el
sector (III).
f. Luego de quemar el asa, en el sector (IV) se realizan estrías con el
material que se arrastra de (III), más amplias y que terminan en el
centro de la caja.
Cualquiera sea el método empleado, si se realiza correctamente, podrán
obtenerse colonias aisladas. Estas pueden pertenecer a distintas especies
bacterianas, las que generalmente se diferencian macroscópicamente.

En general cada colonia se considera formada a partir de una célula

bacteriana, aunque esto no es del todo cierto pues puede darse el caso de
que dos o más células den origen a una colonia. Si todas pertenecen a una
misma especie, la colonia resultante será pura. Caso contrario, la finalidad del
trabajo no se habrá cumplido, no lográndose el aislamiento.

MÉTODOS ESPECIALES DE AISLAMIENTO.

Métodos derivados de las propiedades de las bacterias: Consisten en

hacer desarrollar la mezcla bacteriana, en un medio de cultivo especial, donde
una especie puede dar lugar a colonias de un color que la identifiquen (ya sea
por cambios de pH o por precipitación de elementos del medio). Un ejemplo,
es el aislamiento en el llamado agar- lactosa- verde- brillante- bilis, donde las
bacterias coliformes dan colonias color rojo intenso en el centro con un halo
rosado que destacan del fondo azul del medio.

Métodos biofísicos: Se basan en el empleo de condiciones físicas

determinadas que afectan a ciertos microorganismos y no a otros.

a) Empleo de temperaturas disgenésicas: La mayoría de las bacterias

desarrollan bien a 37ªC. Sin embargo hay especies que lo hacen hasta
40 ºC -42ªC y aún más, otras por debajo de 35 ªC. Estas características
se pueden usar para la separación de especies.

b) Termorresistencia de las bacterias esporuladas: Los esporos de las

bacterias son formas de resistencia que toleran temperaturas que

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 Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y métodos de siembra

resultan letales para las formas vegetativas. Este comportamiento se

aprovecha para la separación de las especies que tienen la capacidad
de esporular.

c) Movilidad del microorganismo: Las bacterias móviles desarrollan en

gran parte de la superficie del medio, mientras que las inmóviles lo
hacen solo en el punto de siembra.

Métodos biológicos: Estos métodos utilizan la propiedad que tienen ciertos

animales de laboratorio de ser receptivos a algunos microorganismos.

CARACTERÍSTICAS DE CULTIVO:
OBSERVACIÓN, DESCRIPICIÓN E INTERPRETACIÓN
DE LOS CULTIVOS

MORFOLOGÍA COLONIAL Y CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS

DE LOS MICROORGANISMOS

I. OBJETIVO

1. Definir la morfología colonial de los microorganismos cultivados por sus

características de tamaño, forma, color, producción de pigmento y de hemólisis
mediante examen visual.
2. Describir los medios de cultivo rutinarios utilizados en el diagnostico
microbiológico de muestras clínicas. (Agar sangre, Agar McConkey y Agar
manitol salado).
3. Describir las características de crecimiento de los microorganismos en Agar
Sangre, Agar McConkey y Agar Manitol Salado).
4. Reconocer como separar una mezcla de microorganismos por la técnica de
siembra de dilución por estría en placa de agar para obtener un cultivo axénico
o puro.

II. INTRODUCCIÓN

La evaluación de las características macroscópicas de las colonias se lleva a

cabo con el examen visual del desarrollo en la superficie de las placas de agar.

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 Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y métodos de siembra

La inspección de los cultivos se realiza sosteniendo la placa con una mano y

observando la superficie del agar para comprobar la presencia de desarrollo
bacteriano. Se debe estudiar con cuidado cada placa debido a que las bacterias
aisladas inicialmente a partir de muestras, constituyen a menudo cultivos mixtos y
puede haber una gran variedad de colonias de diversos tipos.

Si se toma un asa bacteriológica cargada con una muestra que contenga

bacterias y se van haciendo estrías de ésta sobre una placa de agar nutritivo de tal
manera que el material se vaya “diluyendo” sobre la superficie (Fig. 12.1), llegará un
momento en que las bacterias depositadas en la estría estén bien separadas unas de
otras, reproduciéndose cada una en progresión geométrica (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64,
etc.).

Dependiendo del tiempo de generación, que varía según la especie bacteriana,

después de cierto tiempo, cada una se habrá multiplicado muchas veces, formando
sobre la superficie del medio un pequeño promontorio constituido por células
bacterianas llamado Colonia, que se obtiene generalmente en unas 24-48 horas.

Las colonias puntiformes constituidas por bacterias de desarrollo lento, pueden

pasar inadvertidas entre las de mayor tamaño, principalmente si hay una tendencia a
la dispersión del desarrollo por toda la superficie de la placa.

Durante el examen las placas se deben inclinar en distintas direcciones con

iluminación brillante directa, de modo que la luz sea reflejada desde diversos ángulos.

En algunos casos, se utiliza una lupa o un microscopio de disección para la

mejor detección de colonias minúsculas o inmaduras y así observar mejor sus
características en el agar.

Las colonias de cada especie bacteriana son diferentes ya sea en tamaño,

color, consistencia etc., y pueden ser diferenciadas sobre estas bases.
Cada colonia aislada está constituida de un solo tipo de bacterias, ya que se
supone que es la descendencia de una sola célula y por tanto, un cultivo puro.
Para estudiar las características físicas, químicas, fisiológicas, etc., de una
bacteria, se necesita que ésta sea aislada en cultivo puro y el aislamiento en cápsula
de Petri es el primer paso para ello, siendo el segundo paso la siembra de una
porción de una colonia en un medio de cultivo en tubo, verificando su pureza después
de la incubación apropiada, mediante observación al microscopio.

III. MORFOLOGÍA COLONIAL

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 Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y métodos de siembra

La morfología de las colonias es importante por lo anteriormente expuesto y

debe familiarizarse el alumno con ella. La terminología mencionada a continuación
sobre algunas de las características más constantes de una colonia bacteriana es
muy útil:

FORMA: Punt iforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa,

rizoide, etc.
TAMAÑO: Estimar el diámetro en mm.
SUPERFICIE: Lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concéntricos, etc.
SUPERFICIE (LUZ REFLEJADA): Brillante, mate, etc.
ELEVACION: Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umblicada,
etc.
BORDE O MARGEN: Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado,
filamentoso, rizado, aserrado, etc.
ESTRUCTURA INTERNA: Amorfa o granulosa.
COLOR: Según sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida,
puede ser de color blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc.
DENSIDAD: Transparente, opaca, translucida, etc.
CONSISTENCIA: Dura, viscosa, butirosa, membranosa, gelatinosa, mucosa,
quebradiza, etc. Usar el asa bacteriológica para determinar la
consistencia.

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Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y métodos de siembra

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Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y métodos de siembra

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 Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y métodos de siembra

IV. RE ACCIONES EN MEDIOS DE AGAR, USADOS EN LA IDENTIFICACIÓN DE

BACTERIAS
1.- Hemólisis en agar sangre (se pueden distinguir tres tipos de hemólisis):
• Alfa: aclaramiento parcial de la sangre alrededor de las colonias, con
coloración verde del medio.
• Beta: zona de aclaramiento completa de la sangre alrededor de las
colonias, debida a la lisis de los eritrocitos.
• Gamma: no hay cambio en el medio que rodea a la colonia, no hay lisis de
los eritrocitos.
• Doble zona: halo de lisis completa inmediatamente alrededor de las
colonias, con una segunda zona de hemólisis parcial ubicada en la periferia.

2.- Producción de pigmentos en medios de agar:

• Pigmentos hidrosolubles que colorean el medio.
• Piocianinas.
• Pigmentos fluorocrómicos (fluoresceína).
• Pigmentos no difusibles, confinados a las colonias.

3.- Cambios en medios diferenciales: en los medios diferenciales se incluyen

diversos colorantes, indicadores de pH y otros componentes, que actúan
como indicadores de las actividades enzimáticas y ayudan a identificar las
bacterias aisladas, por ejemplo, Agar McConkey y Manitol Sal Agar,

4.- Olor: Si bien son difíciles de describir específicamente los olores producidos
por acción de ciertas bacterias, tanto en medios sólidos como líquidos, éstos
pueden ser útiles para la identificación tentativa de los microorganismos,
ejemplos:

 Pseudomonas spp. Zumo de uvas

 Proteus spp. Chocolate quemado
 Streptomyces spp. Sótano enmohecido
 Clostridium spp. Fétido, nauseabundo

Evaluando las características descritas de las colonias y la acción sobre los

medios, se puede realizar una identificación preliminar de las bacterias aisladas por
cultivo primario. Dichas características son útiles en la selección de otros medios y
pruebas diferenciales apropiadas para completar la identificación de los aislamientos
una vez obtenidos los cultivos puros o axénicos.

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 Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y métodos de siembra

MEDIOS PARA AISLAMIENTO PRIMARIO

Agar McConkey
Es un medio diferencial utilizado para la detección, aislamiento y enumeración
de bacterias coliformes y patógenas intestinales en agua, productos lácteos y
muestras biológicas. Su acción diferencial radica en que las bacterias con la
capacidad de fermentar la lactosa provocan un descenso de pH, junto con una
absorción del indicador de pH (colorante), surgiendo en la colonia el color rojo. Las
colonias de bacterias que no fermentan la lactosa quedan incoloras.
En cuanto a su composición por litro observamos 17 g de pancreático digestivo
de gelatina; 1.5 g de pancreático digestivo de caseína, 1.5 de peptona de tejido
animal; 10 g de lactosa; 1.5 g de sales biliares; 5 g de cloruro Sódico; 0.03 g de rojo
Neutro; 0.001g de cristal Violeta; 13.5 g de agar; y un pH de 7.1 (+ - 0.2º a 25º)

Agar Nutritivo

Es un medio con fines generales para la siembra y el crecimiento de la

mayoría de los microorganismos poco exigentes. Su composición esta a base de 3 g
de extracto de Carne de buey, 5 g de peptona trípsica de gelatina, 15 g de agar, y
cloruro sódico, glucosa y agua destilada hasta 1000 ml

Agar Manitol Sal

Es un medio elegido para la detección de Staphylococcus patógenos en
muestras de alimentos y muestras clínicas. En su composición observamos extracto
de carne de 1g, peptona trípsica de caseína de 5g, peptona de carne de 5g, cloruro
sódico de 75g, D-manitol de 15g, rojo fenol de 25g y agar de 15g.

Agar Sangre
Medio de cultivo con fines generales para una gran cantidad de
microorganismos circunscribiendo los exigentes. Con el añadido de sangre, viene bien
en el empleo de las reacciones hemolíticas. Este medio está libre de azucares
reductores. En su composición por litro se le observa 15 g de digestivo pancreático, 5
g de peptona de soja, 5 de cloruro sódico y 15 g de agar

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Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y métodos de siembra

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