INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería

Campus Zacatecas
“La técnica al servicio de la Patria”

MICROBIOLOGÍA

REPORTE #4
NUTRICIÓN MICROBIANA

INGENIERÍA EN ALIMENTOS

Maestro

Margarita Ivonne Garrido Gutiérrez

Integrantes

Juan Antonio Velásquez Martínez

Carlos González Silva

José Manuel De Avila Herrera

Grupo

2LM1
Equipo

#4
 PRÁCTICA N°4

NUTRICIÓN MICROBIANA

RESUMEN

El presente informe está enfocado en la nutrición microbiana de microbiología que

son las primeras herramientas que se utilizan en el laboratorio. Hay una gran variedad
de técnicas de cultivo, las más relevantes del presente trabajo son las técnicas de
estría cruzada, siembra en tubo por picadura, y siembra por estría simple en un tubo
inclinado. las preparaciones de los medios de cultivo sean preparadas correctamente
porque más adelante nosotros tendremos que preparar ciertos medios para la
observación de crecimiento de microorganismos así también el aislamiento de
colonias en los medios de cultivo, los medios de cultivo deben de estar en una calidad
en donde la siembra de las bacterias u hongos sea posible sin contaminar los medios.
Nos proponemos a realizar preparaciones de medios con los conocimientos teóricos
para la preparación de un mejoramiento de medios de cultivo, el uso de nuevas
herramientas que nos ayuden en nuestra ingeniería en alimentos para el diagnóstico
e identificación de microorganismos que se muestran en la gran variedad de los
alimentos que consumimos a diario. La metodología a utilizar es la preparación de los
medios de cultivo agar nutritivo, EMB, y PDA, glucosa-sales, así como el tiempo,
temperatura necesaria para su incubación de cada una de ellas para el sembrado de
su respectiva bacteria u hongo, y lo más importante el observar nuestros medios de
cultivo luego de cierto lapso de tiempo para de esta manera realizar observaciones
detalladas de crecimiento en los medios que nos ayuden a identificar las
características del crecimiento de los microorganismos, los resultados obtenidos son
muy importantes y las características que tiene cada uno de los medios para el
respectivo microorganismo a obtener, pues nos ayudan a el poder visualizar cómo es
la forma y tamaño del microorganismo, las preparaciones de los medios de cultivo
que se realizaron se logró visualizar que fueron preparadas correctamente según el
manual al momento de observar el crecimiento en los medios, pero con la excepción
de al realizar la técnica de sembrado en punto no se introdujo lo suficiente el asa de
siembra en el tubo de ensaye como para visualizar la observación de movimiento de
flagelos.

Palabras clave: medio de cultivo, observación, proceso.

 INTRODUCCIÓN

Todos los organismos, incluidos los microorganismos, requieren diversos

micronutrientes o elementos traza, además de los macroelementos. La mayoría de
las células necesitan los micronutrientes: manganeso, cinc, cobalto, molibdeno, níquel
y cobre, es por eso que un medio de cultivo requiere de ciertos nutrientes dado a esto,
un medio de cultivo es la combinación sólida o líquida de nutrientes y agua.
Usualmente incluye sales inorgánicas, carbohidratos, vitaminas y aminoácidos. A
menudo se denomina medio basal y puede ser suplementado con algún regulador de
crecimiento y ocasionalmente con otras sustancias.

La clasificación de la (NOM-065) hay dos tipos de medios que se dividen en medio

sintético y complejo. El medio Sintético es aquel que contienen carbono, nitrógeno,
sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca) y estimuladores del crecimiento (eritritol
para Brucella abortus) en concentraciones conocidas. El medio Complejo Dichos
medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro,
extracto de carne, etc., que contienen nutrientes en abundancia, pero sin saber con
exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.

Un microorganismo puede alterar el pH del medio de cultivo debido a sustancias

producidas por él mismo.

• Utilización de carbohidratos >Producción de ácidos orgánicos>Acidificación

•Catabolismo de proteínas>Producción de materiales nitrogenados>Alcalinización

Estos cambios pueden ser tan grandes que inhiban el crecimiento del
microorganismo. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante
sistemas tampón. Uno de los más utilizados en microbiología es la combinación de
KH2PO4 y K2HPO4 tamponado el medio con un pH de aproximadamente 6,8.

DESCRIPCIÓN EXPERIMENTAL

SESIÓN l
PREPARAR MEDIOS DE CULTIVO
Medio sintético (glucosa-sales): Se pesó cuidadosamente los componentes del medio
de acuerdo a la formulación de la tabla 2 y se preparó 100 mL de medio, se disolvieron
los componentes en un matraz de 250 mL y se ajustó el pH a 7.0±0.2, se transfirió 50
mL a cada uno de los matraces de 125 mL limpios y se taparon con un tapón de
algodón-gasa y gorro de papel kraft, (todo el material fue etiquetado correctamente),
se esterilizaron los matraces en un autoclave a 121°C y 15 libras de presión por 15
minutos, una vez terminado el proceso de esterilización se dejó enfriar el autoclave,
se sacaron los matraces y se dejaron enfriar a temperatura ambiente.
Medio complejo (agar nutritivo): se pesó la cantidad que indicó la etiqueta del envase
para la preparación de 100 mL de medio, se colocó el medio en un matraz de 250 mL
y se le adicionó agua, se calentó suavemente hasta que se disolvió completamente,
se vació 3 mL en cada uno de los tubos de ensaye de 13X100mm limpios, se taparon
con algodón-gasa y gorro de papel kraft, se tapó el matraz que contenía el medio
restante con un tapón de algodón-gasa y gorro de papel kraft, se etiquetaron los tubos
y el matraz, se esterilizó en el autoclave a la temperatura y tiempo indicada en el
envase a 121°C y 15 libras de presión por 15 minutos, se dejó enfriar el autoclave y
se sacó el material, se dejó enfriar el matraz que contenía el medio nutritivo hasta los
45°C, se encendió el mechero y se transfirió en condiciones asépticas 15-20 mL del
medio a las cajas petri estériles (cuatro cajas) y se esperó el tiempo a que se
solidificaran a una temperatura ambiente, etiquetaron correctamente las cajas petri,
se colocaron los tubos con medio nutritivo en una superficie inclinada y se permitió
que se solidificaran a temperatura ambiente, se etiquetaron cada uno de los tubos
correspondientes, se incubó en una caja petri (en posición invertida) y un tubo a 35°C
durante 24 horas como prueba de esterilidad.
Medio diferencial (Agar Azul de Metileno EMB): se pesó cuidadosamente la cantidad
indicada en la etiqueta del envase para la preparación de 100 mL de medio, se colocó
el medio en un matraz de 250 mL y se adiciona agua, se calentó hasta disolverlo
completamente, se tapó el matraz con un tapón de algodón-gasa y gorro de papel
kraft, se esterilizó en autoclave a la temperatura y tiempo que indicaba la etiqueta del
envase a 121°C y 15 libras de presión por 15 minutos, se dejó enfriar el autoclave y
se secó, se enfrió el matraz hasta los 45°C, se encendió el mechero y se transfirió en
condiciones asépticas 15-20 mL del medio a cajas petri estériles (cuatro cajas) y se
permitió que solidifican a temperatura ambiente, se etiquetó todas las cajas petri
correspondientes y se incubó una caja petri y un tubo a 35°C durante 24 horas como
prueba de esterilidad.
Medio selectivo (Agar Papa Dextrosa PDA): se pesó la cantidad indicada en la
etiqueta del envase para la preparación de 100 mL de medio, se colocó el medio en
un matraz de 250 mL y se le adicionó el agua necesaria, se calentó hasta disolverlo
completamente, se tapó el matraz con un tapón de algodón-gasa y gorro de papel
kraft, se esterilizó en autoclave a la temperatura y tiempo indicado en la etiqueta del
envase a 121°C y 15 libras de presión por 15 minutos, se dejó enfriar el autoclave y
se sacó el material, se enfrió el matraz hasta los 45°C (debajo de esta temperatura
en la cual el medio se solidificará), se encendió el mechero y se agregó al medio 1.8
mL de ácido tartárico al 10% estéril por cada 100 mL de medio preparado y se
homogeneizó, con el mechero encendido se transfirió en condiciones asépticas 15-
10 mL del medio a cajas petri estériles (cuatro cajas) y se permitió que solidificaran a
temperatura ambiente, se etiquetó cada una de las cajas con los datos
correspondientes, se incubó una caja petri y un tubo de ensaye a 35°C durante 3-5
días como prueba de esterilidad.
Medio indicador (Sulfur Indol Motility SIM): se pesó la cantidad indicada en la etiqueta
del envase para la preparación de 25 mL de medio, se colocó el medio en un matraz
de 125 mL y se le adiciona el agua necesaria, se calentó hasta disolverlo
completamente, se vació 3 mL de medio en tubos de ensaye (tres tubos) de 13X100
mm, se etiquetaron los tubos y se colocaron en una gradilla metálica, se esterilizaron
en un autoclave a temperatura y tiempo indicados en la etiqueta del envase a 121°C
y 15 libras de presión por 15 minutos, se dejó enfriar el autoclave y se sacó el material,
se dejó solidificar los tubos a temperatura ambiente en posición vertical.

SESIÓN ll
REALIZAR DIFERENTES TÉCNICAS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS
Cultivo en medio sólido en placa (se utilizaron cajas con agar nutritivo, EMB, y PDA):
se tomó el asa de platino y se colocó en la flama del mechero hasta el rojo vivo para
esterilizarla, se destapó el tubo que condujera el microorganismo, se retiró el tapón y
se pasó la boca del tubo por el mechero para esterilizarla, se enfrió el asa en el medio
y se tomó con ella un inóculo, se pasó nuevamente la boca del tubo por el mechero
antes de colocarle el tapón, se destapó la caja petri con agar nutritivo y se sembró el
microorganismo por estría cruzada, se esteriliza el asa cada vez que se hacía una
estría, se procedió a incubar la caja a 35°C durante 24 horas. Cultivo en medio sólido
en tubo (agar nutritivo): se tomó el asa de platino y se colocó en la flama del mechero
hasta el rojo vivo para esterilizarla, se destapó el tubo que condujera el
microorganismo, se retiró el tapón y se pasó la boca del tubo por el mechero para
esterilizarla, se enfrió el asa en el medio y se tomó con ella un inóculo, se pasó
nuevamente la boca del tubo por el mechero antes de colocarle el tapón, se sembró
por estría en S la superficie del medio inclinado de agar nutritivo, se esteriliza el asa
una vez terminada la siembra, se incubó a 35°C durante 24 horas. Cultivo en medio
líquido (matraces de 125 mL con medio glucosa-sales): se tomó el asa de platino y se
colocó en la flama del mechero hasta el rojo vivo para esterilizarla, se destapó el tubo
que condujera el microorganismo, se retiró el tapón y se pasó la boca del tubo por el
mechero para esterilizarla, se enfrió el asa en el medio y se tomó con ella un inóculo,
se pasó nuevamente la boca del tubo por el mechero antes de colocarle el tapón, se
introdujo el asa con el inóculo al matraz con el medio líquido y se descargó agitando
suavemente en la pared del matraz, se esteriliza el asa una vez terminado el proceso
de siembra, se incubó el matraz con bacteria a 35°C durante 24 horas y el matraz con
hongo a 28°C durante 48 horas en agitación a 120 rpm. Cultivo en medio semisólido
(tubos de medio SIM): se tomó el asa de platino recta y se colocó en la flama del
mechero hasta el rojo vivo para esterilizarla, se destapó el tubo que condujera el
microorganismo, se retiró el tapón y se pasó la boca del tubo por el mechero para
esterilizarla, se enfrió el asa en el medio y se tomó con ella un inóculo, se pasó
nuevamente la boca del tubo por el mechero antes de colocarle el tapón, se sembró
por picadura sumergiendo el asa hasta ¾ partes del medio SIM sin tocar el fondo y
se sacó el asa nuevamente verticalmente, se esteriliza el asa una vez terminada la
siembra, se incubaron los tubos a 35°C durante 24 horas.
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Como ya hemos visto en todos los medios de cultivo tiene que contener los nutrientes
necesarios para el crecimiento y síntesis de los microorganismos que se desean
sembrar en ellos. Todos estos medios se pueden clasificar en medios complejos y
simples, la mayoría de los medios son complejos, ya que no se sabe bien las
condiciones de cada componente.

Según la norma (NOM-065 SSA) establece que por su aspecto físico (líquido,
semisólido y sólidos), y su uso se clasifica en medios selectivos de enriquecimiento,
medios diferenciales, medios para cultivar gérmenes anaerobios, medios de cultivo
para medir la potencia de los antibióticos, medios de transporte, medios para filtración
a través de membrana, medios especiales para cultivo de mohos y levaduras.

Al igual que también influye el pH para la proliferación de los microorganismos ya que

a un pH alto las bacterias no podrían crecer.

Tabla 1. crecimiento de Escherichia coli en medio agar nutritivo

Medio Condiciones Aspecto final del medio Características del

de de (después de la crecimiento
cultivo esterilización incubación)

Consistencia dura,
Agar 121°C por 15 tiene aspecto seco, se
nutritivo minutos, 15 muestra un aislamiento
lb/pul
de colonias, se puede
ver claramente que es
convexa y de borde
entero

En la tabla 1 muestra el crecimiento de Escherichia coli en el medio de cultivo de agar

nutritivo, el cual el método de siembra empleado fue estría cruzada el cual fue
incubado en el horno a 35°C por 24 hrs. Lo que se quiso lograr con el método de
siembra era el aislar colonias para poder observar la morfología de la colonia y así
poder identificar las colonias de la Escherichia coli, al momento de verificar el
crecimiento de las colonias notamos que efectivamente logramos el aislamiento de
las colonias.
Tabla 2. crecimiento de Escherichia coli en medio (eosina azul de metileno) EMB

Medio de Condiciones de Aspecto final del medio Características

cultivo esterilización del crecimiento

La colonia presenta
(Eosina azul 121°C, 15 un color verde-
de metileno) minutos, 15 lb/in² amarilloso brillante
EMB metálico, con un
borde redondeado y
elevación plana.

En la tabla 2, es un crecimiento del microorganismo Escherichia coli, no se logra

visualizar bien pero de cerca se logra visualizar aislamiento de colonias en la tercer
estría cruzada, sin embargo es demasiada la muestra por lo que paso cada estría y
el motivo de que se encuentra un acumulo de las estrías.

Dada la información de la literatura la comparación existente con el microorganismo

de Escherichia coli respecto al medio de EMB refuta que en planas de 2-4 mm de
diámetro de color violeta oscuro y centro negro con un brillo metálico amarilloso de
color verdoso con luz reflejada Escherichia coli y sin brillo metálico y de color rosado
con el centro azul oscuro, con colonias convexas de 4-6 mm de diámetro muy
mucosas Enterobacter y Klebsiella. Los microorganismos no fermentadores de
lactosa producen colonias incoloras. En nuestras muestras si se logra apreciar la
misma forma de las colonias, negras con un tono verde metálico tornasol, esto quiere
decir que si se fermenta la lactosa al ser Escherichia coli.

Tabla 3. Crecimiento de Penicillium sp en medio (Agar Papa Dextrosa) PDA

Medio de Condiciones de Aspecto final del Característica

cultivo esterilización medio s del
crecimiento

La colonia
(Agar Papa 121°C por 15 forma
Dextrosa) minutos a 15 filamentos, con
PDA lb/in² una
elevación
convexa,
algodonosa y
de color blanco
Dando énfasis a cierta norma NOM-111-SSA1-1994 las duraciones de nuestras
placas no duraron los suficientes días para observar cierto crecimiento la técnica de
cultivo que utilizamos fue por siembra por picadura, en la tabla 3 se muestra la
siembra por picadura, sin embargo en vaciado en placa es aplicable cierta norma, el
microorganismo Pencillium sp muestra un crecimiento, la norma NOM-111-SSA1-
1994 establece que se deben contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5
días de incubación. Después de 5 días hay que seleccionar aquellas placas que
contengan entre 10 y 150 colonias.

Tabla 4. Crecimiento de Escherichia coli en agar nutritivo (medio inclinado)

Medio de Condiciones Aspecto del medio Características del

cultivo de final (después de la crecimiento
incubación incubación)

Agar nutritivo 35°C por 24 Color blanquecino, con

en tubo de horas
un borde entero, y
ensaye
elevación convexa, se
logra visualizar que hay
movimiento del
microrganismo a través
del medio sólido.

En la tabla 4 se muestra el crecimiento de Escherichia coli en el medio de cultivo de

agar nutritivo inclinado o de flauta en el cual se observa en l base un acumulado del
microorganismo, debido a que al momento de cultivar la muestra contenía agua
condensada, lo cual afectó a la estría esparciendo parte de la inoculación. Pero
también se puede observar en la parte superior que el agua no afectó la estría, por lo
cual se puede ver bien definida a comparación de la base
 Tabla 5. crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en glucosas-sales.
Medio de Condiciones Aspecto del medio final Características del
cultivo de (después de la incubación) crecimiento
incubación

Color blanquecino,
SIM 28°C por 48 no se observa
en tubo de horas desplazamiento de
ensaye hifas dado que es
una levadura y esta
es unicelular

En la tabla 5 se puede observar el cultivo de Saccharomyces cerevisiae en medio

SIM, con la técnica de cultivo de por punto al cual como se puede ver no presenta
ningún tipo de desplazamiento, aunque sea un hongo. a esto se le debe que el
microorganismo Saccharomyces cerevisiae en sí es una levadura, y como ya
sabemos las levaduras son microorganismos unicelulares y no presenta flagelos
como lo es Escherichia coli, por lo cual no veremos desplazamiento de hifas.

Tabla 6. Crecimiento de Penicillium sp en glucosas-sales.

Medio de cultivo Condiciones Aspecto final del medio Características

de incubación del crecimiento

Gran cantidad de
biomasa en
Glucosa-sales 28°C por 48 forma de hifas.
(medio sintético) horas
Resultó biomasa
sin agitación
esparcida gracias a
que no tuvo
agitación.

Se logra visualizar
Glucosa-sales 28°C por 48 pellets en forma de
(medio sintético) horas hifas (redondos).
en agitación
Resultó biomasa
constante
gracias a
La literatura menciona que el medio Sintético es aquel que contienen carbono,
nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca) y estimuladores del crecimiento
(eritritol para Brucella abortus) en concentraciones conocidas, de tal forma que lo
realizado fue el medio de glucosa-sales porque sabemos la concentración exacta
cuantitativamente de los nutrientes que colocamos en el medio. En la tabla 5 se
muestra una comparación del microorganismo Penicillium sp con y sin agitación de
esta manera respectivamente el medio glucosa sales formó pellets blancos y el medio
de glucosa sales sin agitación presenta una concentración de biomasa.
El motivo de un cultivo en medio líquido es usualmente utilizado para obtener grandes
cantidades de biomasa, así como el metabolito de interés respecto al microorganismo
que fue cultivado y el crecimiento de algún microorganismo. Los dos cultivos
realizados en glucosa sales presentaron resultados positivos ya que el crecimiento de
Penicillium sp mediante el uso de agitación y el que no tuvo agitación de igual manera
el crecimiento del hongo filamentoso en un medio líquido sin agitación también
presentó los resultados esperados, la generación de esporas pero está dispersa en
todo el medio a comparación de los pellets que están agrupados.

Dado a que este medio se utiliza el PDA y las dudas en la discusión la cantidad y
concentración de ácido tartárico que se utiliza para acidificar el PDA es seguir
instrucciones del fabricante y después de esterilizar enfriar en baño de agua a 45 ± 1
°C, acidificar a un pH de 3,5 ± 0,1 con ácido tartárico estéril al 10% (aproximadamente
1,4 ml de ácido tartárico por 100 ml de medio). Después de adicionar la solución,
mezclar y medir el pH con potenciómetro.

CONCLUSIONES

Se comprobó que Escherichia coli es una bacteria móvil; por la presencia de flagelos
y debido a que presentó movimiento en medio SIM.
Se pudo demostrar que el crecimiento de Escherichia coli en agar nutritivo por la
técnica de estría simple no presenta aislamiento de colonias ya que solo se utiliza
para la conservación de un cultivo puro

Las condiciones de agitación de un medio líquido favorecen que el Penicillium sp

forme pellets y sin agitación presente un crecimiento más disperso.
Se pudo comprobar que la técnica de estría cruzada es la mejor técnica para el
estudio de colonias y su aislamiento.

Un medio que contenga celulosa como única fuente de carbono y energía es bastante
eficaz para aislar bacterias que digieren celulosa. En definitiva, las posibilidades de
diseño de un medio selectivo son innumerables, y existen en el mercado docenas de
medios selectivos especiales.

Las Normas tiene por objeto determinar las especificaciones mínimas que deben
tener los medios de cultivo para microorganismos en general, por lo que se pudo
comprobar que tienen un campo de aplicación demasiado amplio en nuestra carrera
dicha Norma es de observancia obligatoria en todas las industrias, laboratorios y
establecimientos dedicados al proceso de estos productos en el territorio nacional
 BIBLIOGRAFÍA
1. Holt-Harris, J.E. y a.A. Teague (1916) “A new culture medium for the isolation of
Bacillus tvpbosus from stools” J. Infect Dis 18:596-600.
2. PRESCOTT, L. M. (2004). Microbiologia. Madrid: McGRAW-HILL-
INTERAMERICANA DE ESPAÑA, S. A. U.
3. Jenkins B. (1986) Genética. 15 de abril del 2019, de SWARTHMORE COLLAGE sitio
web: https.//books.google.com.mx/books?id=TX4UDZaKIUsC&pg=PA555&DG