EVALUACIÓN DE LA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES EN SALIVA

HUMANA POR EL MÉTODO DE BIURET, UTILIZANDO COMO PATRÓN GELATINA DE

PATA (MARCA TOÑIN).

1. INTRODUCCIÓN

Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas constituyentes de
los seres vivos (biomoléculas). Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la
presencia o la actividad de este tipo de moléculas (Berg et al, 2008).
Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina
básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se
quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de
enfermedades, así como para muchos otros propósitos.

La saliva es un fluido compuesto de moléculas complejas que protegen a los tejidos blandos,
controla la sequedad y puede influir en la reparación de los tejidos (Medina, Myriam L., Merino
Luis A., et al. 2004). Si bien la cantidad de saliva es importante, también lo es la calidad de la
misma, ya que cada uno de sus componentes desempeña una serie de funciones específicas
(Denny, P and Cols. Age, 2000).
La secreción salival juega un papel importante en la homeostasis bucal, comprendiendo
también la capacidad amortiguadora del pH de la cavidad bucal y la placa dental ; los
mecanismos fisiológicos y la composición molecular de la saliva que contribuyen a los
mecanismos de defensa, es uno de los aspectos más importantes de ella; el flujo salival está
sujeto a una serie de cambios, como son la ingesta de alimentos, el ritmo circadiano, la edad,
el género y las enfermedades bucales (González M, Ledesma C, et al. 1994). La relación
entre la saliva y la salud bucal es ampliamente aceptada pero la naturaleza, magnitud y
dirección de esta relación no ha sido plenamente establecida (Banderas JA, González B, et
al. 1997). La saliva está compuesta por agua en cerca del 99 %, mientras que el 1 % restante
lo constituyen compuestos inorgánicos, carbohidratos, lípidos, células epiteliales
descamadas, bacterias y sus productos, virus y hongos, restos de alimentos, algunas
secreciones bronquiales y componentes del fluido crevicular como células sanguíneas e
inmunoglobulinas. En la composición de este fluido se encuentran diferentes moléculas,
dentro de las cuales se destacan las proteínas, que están involucradas en la mayoría de las
funciones de la saliva. Los investigadores han identificado 309 proteínas en la saliva total.
Más de 95% corresponde a las principales familias de proteínas que incluyen: proteínas ricas
en prolina, alfa-amilasa salival, mucinas, aglutininas, cistatinas, histatinas y estaterinas, y
otras proteínas salivales entre las que se destacan: Inmunoglobulinas, lisozima, peroxidasa
salival y lactoferrina.

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se

basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la
formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos
colorantes (Segal, 2005).

Para la presente práctica se utilizará el método de Biuret que debe su nombre al la reacción
de Biuret (Esta se explicará más adelante en “Aspectos Conceptuales”).
2. OBJETIVOS

● Evaluar el método de Biuret para la cuantificación de proteínas totales en saliva

humana mediante una disolución patrón de proteínas (gelatina de pata marca
Toñin).
● Construir una curva de calibración para la solución patrón, determinando la relación
entre la absorbancia a 540nm y la concentración de proteínas totales.
● Medir la absorbancia promedio para cada una de las series de las disoluciones de
saliva; luego promediar los datos y comparar contra la curva de calibración patrón
calculando el contenido de proteína (%m/m o %m/v) de las muestras.
● Encontrar el porcentaje de error del método de Biuret para cuantificación de
proteínas totales frente a la concentración promedio de proteínas totales en saliva
reportada en literatura y/o por otros métodos de cuantificación de proteínas que
hacen uso de la espectrofotometría.

3. ASPECTOS CONCEPTUALES

3.1 Reacción de Biuret

La reacción de biuret es una reacción coloreada (violeta) debida a la formación de un

complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos que poseen más de un enlace
peptidico, como las proteinas (Cambell et al, 2006):

Figura 1: Reacción de Biuret.

Figura 2. Formación de compuesto coordinado en la determinación de proteínas por el método de Biuret

Un color violeta resulta cuando los iones cúpricos en medio alcalino se complejan con los
electrones no saturados de los átomos de nitrógeno y oxígeno de los enlaces de todas las
proteínas. La cantidad de color producido es proporcional a la concentración de proteínas y
es medida espectrofotométricamente a 550 nm.(Wharton 1972)
Tiene muy pocos agentes interferentes (uno de ellos es el sulfato de amonio). Es un método
menos sensible por lo que requiere mayor cantidad de muestra. El rango adecuado usando
1 ml final es de 0,1 a 1 mg de proteínas.

3.2 Espectrofotometría
La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección
específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a
moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc.) y estado de agregación
(sólido, líquido, gas) (Sánchez, D. 1995). La espectrofotometría comprende un conjunto de
técnicas analíticas cuali y cuantitativas. Se basa en la interacción de las moléculas con las
radiaciones electromagnéticas. La cantidad de luz absorbida por una sustancia a distintas l
es como una huella digital y se llama espectro de absorción. Para descubrir la capacidad de
absorción de una sustancia a distintas longitudes de onda, se hace un barrido espectral. Cada
sustancia tiene su espectro característico, lo que permite identificar una sustancia en una
solución cuya composición se desconoce (Borfost R. y Scholz, M.1964).

3.3 Curva patrón

La curva de patrón es un método de química analítica empleado para medir la concentración

de una sustancia en una muestra por comparación con una serie de elementos de
concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en principio lineal entre un
carácter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometría) y la
variable a determinar (la concentración). Para ello, se efectúan diluciones de unas muestras
de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una
función matemática que relacione ambas; después, se lee el mismo carácter en la muestra
problema y, mediante la sustitución de la variable independiente de esa función, se obtiene
la concentración de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y,
empleando la curva patrón, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta
encontrar la concentración (Harris, 2003).

3.4 Otros aspectos importantes sobre la saliva

Líquido incoloro, opaco, cuyo pH oscila entre 6,2 a 7,4 y está compuesta en un 94% de
agua y en un 0,5% de sólidos orgánicos e inorgánicos.En un litro de saliva hay
aproximadamente 994g de H2O, 1g de solidos suspendidos y 5g de sustancias disueltas de
las cuales: 2g son compuestos inorgánicos y 3g compuestos orgánicos. También se
encuentran sólidos suspendidos: Células exfoliadas del epitelio, leucocitos desintegrados,
bacterias bucales, levaduras y protozoos. Posee una densidad promedio de 1.002-1.020
g/mL, un punto de congelación entre -0.2°C y -0.7°C.
1/3 del potasio presente en el suero es lo que hay en la saliva; el cloruro en la saliva es 1/7
del plasma sanguíneo. Los iones fosfato y calcio mantienen la solubilidad baja del esmalte y
el fosfato inorgánico es el 90% del fósforo total. Además, las GS secretan tiocionato como
agente antibacteriano. El hierro es el que le da el tono pardo a los dientes.
La reacción de la saliva depende principalmente de las concentraciones relativas de CO2
libre y combinado, esto es, de la relación CO3H2/CO3HNa.La concentración de
hidrogeniones de la saliva varía en relación directa del CO2 de la sangre. Una persona sana
puede generar de 1 a 2 litros diarios de saliva. La producción de saliva es de 0,5 mililitros
por minuto en estado de reposo y se eleva hasta 5 ml/minuto durante las comidas.

3.2 Muestreo de saliva

A las personas voluntarias para la muestra de saliva se les recogerá en condición de ayuno
y sin higiene bucal previa, entre las 8 y las 10 am. Serán dos sesiones en las cuales los
voluntarios dejarán fluir libremente la saliva para recolectar 20,00 mL de esta en un tubo de
propileno desechable, estéril, con tapa enroscable de 15,00 mL.

4. MATERIALES

Instrumentación

1 vaso de precipitados de 100 mL, vidrio de reloj, balón aforado de 100,0 mL,1 bureta de 25
mL, 1 pipeta aforada de 5,00 mL, 1 pipeta graduada de 10,0 mL, 1 frasco lavador, una taza
plástica para recoger los residuos, 1 gradilla, 12 tubos de ensayo, 1 espectrofotómetro

Reactivos

NaOH,sulfato de cobre pentahidratado,tartrato de sodio y potasio

5. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

5.1 Curva de calibración para la determinación de proteínas totales por método de

Biuret
a- Preparación de las siguientes disoluciones:

● Disolución de tartrato alcalino

Diluir en 100,0 mL de una disolución de NaOH (6M) 9,0 g de tartrato de sodio y potasio y
5,0 g de yoduro y potasio. Luego diluir todo con agua destilada, llenando a volumen hasta
completar 1 L.
● Reactivo de Biuret
Diluir en 100,0 mL de una disolución de NaOH (6M) 9,0 g de tartrato de sodio y potasio, 5,0
g de yoduro y potasio y 3,0 g de sulfato de cobre pentahidratado. Luego diluir todo con agua
destilada, llenando a volumen hasta completar 1 L.

b- Preparación de la disolución patrón de proteína (20,00 mg/mL)

● Tomar aproximadamente 18 g de gelatina de pata (Una unidad del paquete) y lavarla

para eliminar el polvo y azúcar que tiene espolvoreado.
● Medir en la balanza analítica la masa de el vidrio reloj, seguidamente pesar el
conjunto de vidrio reloj y gelatina de pata. Realizar la sustracción respectiva y
determinar la masa exacta de la gelatina de pata a utilizar (Esta masa debe ser muy
cercana a los 18,0 g, si no es así volver a pesar hasta alcanzar la susodicha masa).
● Disolver los 18,0 g de gelatina de pata (2,0 g de proteína) con agitación constante en
aproximadamente 20,0 mL de disolución de tartrato alcalino previamente preparado.
Diluir luego esta solución, hasta llenar a volumen en un balón aforado de 100,0 mL
con la misma disolución de tartrato alcalino.

c- Utilizando 12 tubos de ensayo (si es posible con tapa) proceder a medir (por duplicado)
con la bureta graduada y las pipetas aforadas adecuadas los volúmenes de cada disolución
indicados en la tabla 1. Tapar y agitar el contenido de cada tubo de ensayo.
Nota: No olvidar rotular los tubos de ensayo.

d- Calibrar el espectrofotómetro, haciendo uso del blanco (tubos de ensayo que no tienen la
disolución patrón de proteína, mirar tabla 1). Medir la absorbancia de cada una de las
disoluciones preparadas anteriormente, a una longitud de onda de 540nm y registrar en la
tabla x (Ir al apartado “Resultados y análisis de resultados”).

e- Construir una curva de calibración: Absorbancia (A) en función de concentración de

proteína (mg/mL). Interpolar los puntos y encontrar la función de recta que describe el
comportamiento de la relación. Y sacar el coeficiente de determinación (R2), que debe
oscilar entre 0 y 1. Cuanto más cerca de 1 se sitúe su valor, mayor será el ajuste del modelo
a la variable que estamos intentando explicar y por tanto, indicando mayor fiabilidad en el
análisis de regresión lineal.

5.2 Preparación y cuantificación del contenido de proteína total en las muestras por el
método de Biuret

a- Preparación de las muestras de saliva:

Tomar una alícuota de entre 4,9900- 4,9020 mL de saliva de la primera serie de alguna de
las muestras. Este volumen corresponde a aproximadamente 5,0 g de masa de saliva (ρ
 [𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜] = 1,002 - 1,020 g/mL). Diluir con la disolución de tartrato alcalino previamente
preparada en un balón de 100,0 mL. Agitar hasta obtener una disolución homogénea.
Realizar lo mismo para la segunda y tercera serie de la primera muestra; y para las tres
series de la segunda muestra.

b- Tomar alícuotas (por duplicado) de 1,00 mL de las disoluciones anteriores y colocarlas en

tubos de ensayo (si es posible con tapa). Agregar a cada tubo de ensayo 4,00 mL de la
disolución de tartrato alcalino y 5,0 mL del reactivo de Biuret. Agitar el contenido de cada
tubo.

c- Medir la absorbancia de cada una de las disoluciones a una longitud de onda de 540 nm.
Calcular la absorbancia promedio de cada serie.

d- Tomar la curva de calibración realizada previamente con la solución patrón de gelatina de

pata y calcular el contenido de proteínas totales (% m/m y/o % m/v) en la muestra.
Nota: No olvidar considerar los diversos factores de dilución realizados.

e- Observar lo reportado en literatura y calcular el porcentaje de error del método evaluado,

tomando como valor real lo reportado por literatura.

6. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

6.1 Tablas de resultados

Tabla 1.

Disolución Disolución Reactivo de Concentración Absorbancia (A) Promedio

patrón de tartrato Biuret (mL) de proteína absorbancia
proteína (mL) alcalino (mL) (mg/mL) (A)
Serie 1 Serie 2

0,00 5,00 5,00

0,25 4,75 5,00

0,50 4,50 5,00

1,00 4,00 5,00

1,50 3,50 5,00

2,00 3,00 5,00

Datos para la curva de calibración de determinación de proteínas totales por el método de Biuret

Tabla 2.

# de Serie Absorbancia
 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4

S1

S2

S3

Promedio series
x muestra

Concentración de
proteína en el
Prom. series x
muestra (mg/mL)
Tabla de absorbancia de las diferentes muestras y sus series. Y concentración de proteínas totales del promedio de cada
muestra.

7. BIBLIOGRAFÍA

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