CROMATOGRAFÍA.

La cromatografía es esencialmente un método físico de separación en el que los

componentes a separar se distribuyen en dos fases, una inmóvil (lecho
estacionario), y otra móvil (fase móvil) la cual percola a
través de la primera. El proceso cromatográfico se da como
resultado de repetidos procesos de sorción-desorción
durante el movimiento de los componentes de la mezcla
arrastrados por la fase móvil a lo largo del lecho estacionario
(elución), produciéndose la separación debido a las
diferencias en las constantes de distribución de los
componentes de la mezcla entre la fase estacionaria y la
fase móvil. A la distribución final de los componentes en
función de su posición sobre el lecho estacionario, o del
tiempo que eluyen se le denomina cromatograma.
La cromatografía se aprovecha del movimiento de una
mezcla por un soporte, por ejemplo, papel o tela. Los
elementos de la mezcla se mueven por el soporte a
diferentes velocidades separándose. Unos componentes se
mueven por el soporte más fácilmente y otros se detienen, esto hace que la mezcla
se separe en bandas de diferentes componentes.

Algunos de los ejemplos en los que se usa la cromatografía a diario son:

 Se suele usar para tomar pruebas de la escena de un crimen (el análisis de

muestras de sangre o de telas).

 Verificación de incendios provocados (identificación de las sustancias

químicas responsables de un fuego).

 Análisis de sangre después de la muerte o en vida para determinar los niveles

de alcohol, drogas o sustancias venenosas en el cuerpo.

 Para el estudio de mezclas complejas en cosas tales como alimentos,

perfumes, petroquímica, y producción farmacéutica.
Fases de la Cromatografía:
La Cromatografía es una técnica de separación en la que los componentes de una
muestra se separan en dos fases: una fase estacionaria de gran área superficial, y
una fase móvil.
 Fase estacionaria:
El objetivo de la fase estacionaria es retrasar el paso de los componentes de la
muestra. Cuando los componentes pasan a través del sistema a diferentes
velocidades, estos se separan en determinados tiempos. Cada componente
tiene un tiempo de paso característico a través del sistema, llamado tiempo de
retención. La separación cromatográfica se logra cuando el tiempo de retención
del analito difiere del resto de componentes de la muestra.
 Fase móvil:
Consiste en que un líquido o gas es arrastrado a través de la fase estacionaria.
En la fase móvil se hace mover otra sustancia sobre la mezcla que ya está sobre
el soporte de la fase estática, por ejemplo, un líquido que se mueve por el papel
con la mezcla. En la fase móvil empezará el proceso de separación de los
componentes de la mezcla al moverse a distintas velocidades por el líquido los
distintos componentes de la mezcla sobre el papel.

Conceptos en la Cromatografía.
Concepto Definición
Analito Es la sustancia producto de un proceso
cromatográfico.
Cromatograma Es una representación visual de los
resultados del proceso
cromatográfico. Cada sustancia
corresponde a un cierto pico en el
cromatograma.
Cromatógrafo Instrumento para la realización de la
cromatografía.
Tiempo de retención Tiempo durante el cual el analito pasa a
través del sistema cromatográfico en
ciertas condiciones.
Fase estacionaria Sustancia que se fija a la columna o en
el panel, sobre cuya superficie se
separan las sustancias.
Fase móvil Fase que se está moviendo en una
dirección determinada. Puede ser un
líquido o gas.
EJEMPLO:
Si sobre un mantel blanco se derrama un poco de vino tinto, transcurrido un tiempo
se observa que la mancha no es uniforme, sino que hay una zona con predominio
de tonos azules y otra en que la tonalidad es roja. Eso es porque se ha producido
una separación cromatografía de los pigmentos del vino.
Las tintas de los rotuladores son una mezcla compuesta por algún disolvente (parte
líquida de la mezcla) y diferentes pigmentos. Algunos colores, como el negro, suelen
ser mezcla de dos o tres pigmentos diferentes. Para separar estos pigmentos
podemos realizar una cromatografía.

¿Por qué se separan los componentes?

Dejamos que se mueva la mezcla por un soporte y los componentes se separan
por que se mueven a diferentes velocidades debido a las diferentes fuerzas de
adsorción que ejerce el soporte sobre cada elemento.
La adsorción, que puede confundirse con absorción, pero no es lo mismo ya que:
La absorción es cuando una sustancia se introduce en la estructura de otra.
Ejemplo: una esponja absorbe agua, entonces si cortamos la esponja en pedazos
vamos a encontrar agua en todas partes de la estructura de la esponja.
La adsorción es un fenómeno superficial, la sustancia adsorbida no se introduce en
el volumen del cuerpo, sino solo se adhiere a su superficie.
La cromatografía química es una separación física de los componentes de una
mezcla basado en la adsorción selectiva de los componentes de la mezcla al
moverse por un soporte.

TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
La cromatografía puede ser preparativa y analítica.
La cromatografía preparativa: Se refiere a la separación de los componentes de
una mezcla para su posterior procesamiento, y se puede considerar un método de
purificación.
En la cromatografía analítica: Generalmente se hace con una pequeña muestra
permitiendo para cuantificar la proporción relativa de los componentes en la mezcla.

Existen diferentes criterios de clasificación de la cromatografía:

Por la naturaleza de sus fases:

 Cromatografía líquido – líquido

 Cromatografía gas – líquido

 Cromatografía líquido -. Sólido

 Cromatografía gas – sólido

Atendiendo al proceso químico-físico que va a protagonizar el proceso de

separación: siendo este el criterio más coherente de clasificación:

 Cromatografía de Adsorción (líquido - sólido o cromatografía de fases

normales)
 Cromatografía de Reparto (o líquido - líquido), se basa en las características
de solubilidad relativa de los solutos entre la fase móvil y una fase
estacionaria de un líquido no polar. La fase líquida se impregna a un soporte
inerte de sílice o, en el caso de cromatografía de fase invertida, se une
químicamente.
 Cromatografía de Intercambio iónico.
 Cromatografía de Exclusión.
Con base en la naturaleza del soporte en el que se aloja la fase estacionaria:

Cromatografía plana:
 Cromatografía en papel
 Cromatografía en capa fina (TLC)
Cromatografía en columna:
 Cromatografía de gases (GC)
 Cromatografía líquida (LC)

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Todas las cromatografías denominadas en columna se caracterizan por tener una
fase estacionaria que se encuentra dentro de una columna de vidrio de 5 a 30 mm
de diámetro por la que se hace pasar una fase móvil líquida o gaseosa que estará
en permanente movimiento. Según la afinidad de las moléculas por la fase móvil o
la estacionaria, éstas se separarán.
Después de cada cromatografía se puede obtener información del cromatograma
tanto cualitativa (para identificar los distintos compuestos de la mezcla) como
cuantitativa (para poder obtener la cantidad y composición de las sustancias
separadas).
Existen distintos tipos de cromatografía en columna:
Cromatografía de intercambio iónico: Se basa en la afinidad de los iones en
solución por los sitios de polaridad opuesta que se encuentran en la fase
estacionaria.
Cromatografía de exclusión: Se basa en la habilidad de materiales de porosidad
controlada para separar los componentes de una mezcla de acuerdo al tamaño y
forma de las moléculas.
Cromatografía de afinidad: Se fundamenta en la especificidad de algunas
macromoléculas biológicas. Éstas se unen específicamente a la fase estacionaria y
para separar dicha macromolécula, bastará con variar el pH una vez que la columna
este limpia y sólo se encuentre de interés.
Cromatografía de adsorción: Se basa principalmente en las diferencias en la
afinidad relativa de los compuestos por el sólido utilizado como fase estacionaria.
Las separaciones obtenidas se determinan casi exclusivamente por interacciones
polares, siendo la fase estacionaria más polar que la fase móvil.
Cromatografía de partición: La fase estacionaria es un líquido soportado en un
sólido inerte. Otra vez, la fase móvil puede ser un líquido (cromatografía de partición
líquido-líquido) o un gas (cromatografía de partición gas-líquido, GLC). La
cromatografía en papel es un tipo de cromatografía de partición en la cual la fase
estacionaria es una capa de agua adsorbida en una hoja de papel. La cromatografía
de gases (GC) y de alta resolución (HPLC) son técnicas de partición ampliamente
empleadas.

Cromatografía de fase reversa: El mecanismo de separación depende de

interacciones hidrofóbicas entre las moléculas de soluto en la fase móvil y el ligando
hidrofóbico inmovilizado en la fase estacionaria. La naturaleza actual de las
interacciones de unión hidrofóbica asume que la interacción de unión es el resultado
de un efecto entrópico favorable. Las condiciones iniciales de unión de la fase móvil
usadas en la cromatografía de fase reversa son acuosas lo cual indica un grado alto
de estructuras de agua organizadas alrededor de las moléculas de soluto y el
ligando inmovilizado. A medida que el soluto se une al ligando hidrofóbico
inmovilizado disminuye el área hidrofóbica expuesta hacia el disolvente. Así, el
grado de organización de la estructura de agua disminuye con un favorable aumento
de entropía en el sistema.

CROMATOGRAFÍA PLANA:
La mayoría de los principios que se aplican para la cromatografía en columna se
aplican también a la cromatografía en superficie plana.

Cromatografía en capa fina (TLC):

Para la cromatografía en capa fina (TLC), la fase estacionaria es una capa de
partículas de unos milímetros de espesor, fijadas sobre un soporte sólido
generalmente de aluminio, plástico o vidrio. Después de aplicar el analito cerca de
la parte inferior de la placa seca, el disolvente empieza a producir la separación.
La ventaja principal de la TLC es que se analizan simultáneamente la muestra y el
patrón, mientras que en la cromatografía en columna las muestras se analizan
individualmente. Además, las muestras que son difíciles de separar, se pueden
resolver utilizando dos disolventes diferentes por desarrollo de la placa en
direcciones perpendiculares.
La mancha en una placa de TLC se caracteriza por la distancia que recorre con
relación a la distancia recorrida por la fase móvil. El grado de retención en
cromatografía plana de superficie se expresa como el factor de retardación, o índice
de retención Rf:
 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑝𝑙𝑎𝑧𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
𝑅𝑓 =
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑝𝑙𝑎𝑧𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒
El “frente” del disolvente es el límite alcanzado por la fase móvil, en éste se mide la
distancia en que se ha desplazado éste. El valor de Rf depende de las mismas
condiciones experimentales que el valor de K de la cromatografía en columna: la
composición de la fase móvil, el tipo de fase estacionaria, la temperatura y el tipo
de compuestos separados.
También se puede definir el coeficiente de distribución, K, en términos de la
concentración del soluto en la fase móvil, Cm, y en la fase estacionaria, Cs:
𝐶𝑠
𝐾=
𝐶𝑚
La detección y localización de las manchas en la placa de TLC se hace observando
los cambios en la fluorescencia, o absorción en el U.V., de un indicador que se
incorporó a la fase estacionaria. Toda la placa fluórese bajo luz UV cuando no hay
solutos presentes. Los lugares en los que reside el soluto aparecen como manchas
oscuras. También podemos observar el color de los compuestos después de
reaccionar con reactivos específicos para grupos o metales, rociados sobre la placa,
como la fluorescamina para aminas. Existen instrumentos para determinar
directamente la fluorescencia y/o color de las manchas en la placa. Los instrumentos
deben ser capaces de cuantificar la medida sobre el área total de la mancha.
Cromatografía en papel:
En este caso, el soporte y fase estacionaria es papel. El papel que normalmente se
utiliza es de celulosa. La celulosa es muy polar en el agua y se vuelve
electronegativa. El papel tiene propiedades de intercambio iónico débiles, así como
de adsorción.
La mayoría de las propiedades varían de papel a papel, lo que provoca variaciones
en el Rf. Actualmente existen papeles modificados con resinas cambiadores de
iones, alúmina, etc. El aparato que se usa consta de un soporte para el papel, un
recipiente para el disolvente y una cámara hermética para desarrollar el
cromatograma.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

La separación en la cromatografía de intercambio iónico depende la adsorción
reversible de moléculas de soluto cargadas, a una resina con grupos iónicos de
carga opuesta. El mecanismo de separación se basa en un equilibrio de intercambio
iónico. Muchos de los experimentos de intercambio iónico se llevan a cabo en cinco
etapas.
La primera etapa es un equilibrio en el cual el intercambiador iónico se encuentra
en las condiciones apropiadas de pH y fuerza iónica, lo que permitirá la unión de las
moléculas de soluto. En este estado inicial, los grupos que se intercambiarán están
asociados con sus respectivos contra-iones (usualmente aniones o cationes
simples, como cloruro o sodio).
En una segunda etapa se encuentra la aplicación de la muestra y su adsorción, en
la cual las moléculas del soluto llevan a cabo el apropiado desplazamiento de carga
de los contra-iones y se unen reversiblemente al gel. Las substancias que no se
unen son eluídas de la cama del intercambiador usando el buffer inicial.
En la tercera etapa, se lleva a cabo la desorción de la muestra cambiando las
condiciones de elusión, al desfavorecer la formación del enlace iónico de las
moléculas de la muestra y la cama del intercambiador. Esto normalmente se logra
aumentando la fuerza iónica del buffer de elusión o cambiando su pH.
En las cuarta y quinta etapas corresponden a la remoción de sustancia no eluídas
bajo las condiciones experimentales previas y regresar al equilibrio de las
condiciones iniciales para la siguiente purificación.
La separación de diferentes sustancias se lleva a cabo porque éstas tienen
diferentes grados interacción con el intercambiador iónico debido a diferencias en
sus cargas, densidades de carga y distribuciones de carga en su superficie. Estas
interacciones pueden ser controladas variando condiciones como la fuerza iónica y
el pH. Las diferencias en propiedades de carga de compuestos biológicos son a
menudo considerables, y tomando en cuenta que la cromatografía de intercambio
iónico es capaz de separar especies con propiedades poco diferentes.
La matriz. Un intercambiador iónico consiste de una matriz sólida insoluble a la cual
se unen de forma covalente grupos cargados. Los grupos cargados se asocian a
contra-iones móviles. Estos contra-iones pueden intercambiarse reversiblemente a
otros iones de la misma carga sin alterar la matriz.
La matriz puede tener carga positiva o negativa y los contra-iones también. Los
intercambiadores cargados positivamente tienen contra-iones cargados
negativamente (aniones) disponibles para ser intercambiados por lo que son
llamados intercambiadores aniónicos. Intercambiadores cargados negativamente
tienen contraiones cargados positivamente (cationes) y se les conoce como
intercambiadores catiónicos.
La matriz puede estar hecha de compuestos inorgánicos, resinas sintéticas o
polisacáridos. Las características de la matriz determinan sus propiedades
cromatográficas tales como su eficiencia, capacidad y recuperación, así como su
estabilidad química, fuerza mecánica y fluidez. La naturaleza de la matriz afectará
su comportamiento hacia sustancias biológicas y el mantenimiento de la actividad
biológica.
 CROMATOGRAFÍA

ANDRÉS MEDRANO
KEVIN CASTAÑO
ORLANDO HERNANDEZ
CARLOS SALAZAR
OSWALDO DORIA

AMIRA CECILIA PADILLA JIMENEZ

21/07/2017

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRICOLAS
PROGRAMA: ING. AGRONÓMICA

MONTERÍA – CÓRDOBA
2017