Recuento de Microorganismos de Una Muestra Viable

MICROBIOLOGÍA
MÉTODO PARA EL RECUENTO TOTAL DE

MICROORGANISMOS VIABLES EN UNA MUESTRA
Angi Andrade1, Lina Escobar1, Darwin Tilano1.
1 estudiantes de biología, facultad de ciencias básicas, universidad del Atlántico Km 7 antigua vía puerto Colombia
RESUMEN
Esta práctica fue llevada a cabo con el fin de conocer los métodos utilizados en el recuento
total de microorganismos viables de una muestra, en este caso se utilizó el método de
disoluciones en serie, se comprobó con la realización de un medio de cultivo, el cual fue
inoculado con una muestra de agua del grifo, dando como resultado un crecimiento
bacteriano nulo.
PALABRAS CLAVES: dilución, bacterias coliformes, conteo en serie, medio E.M.B.
OBEJTIVOS:
 Determinar la posible presencia de bacterias coliformes en el agua procedente del

grifo.
 Utilizar el método de diluciones en serie para el recuento de las bacterias presentes
en la muestra.
 Adquirir destreza en la aplicación del método de diluciones en serie.
INTRODUCCIÓN:
El recuento es un procedimiento que permite conocer el número de microorganismos que

hay en una muestra. Para este propósito, existen diferentes métodos mediante los cuales se
pueden contar microorganismo. A su vez todos los tipos de recuento, se pueden clasificar
en directos e indirectos. Un recuento directo es aquel en el que se encuentran las células por
observación directa al microscopio, y el recuento indirecto es aquel en el que se determina
el numero por crecimiento o alguna propiedad de los organismos. El crecimiento
microbiano puede medirse en términos de concentración celular (número de células por
unidad de volumen de cultivo) o densidad celular (peso seco de las células por unidad de
volumen de cultivo). Estos parámetros no siempre son equivalentes, debido a que el
promedio de peso seco de la célula varía en las distintas etapas de la historia del cultivo1.
Reglamento de la calidad del agua potable: El presente reglamento tiene por objetivo
establecer los niveles máximos que deben tener aquellos componentes o características del
agua que puedan presentar un riesgo para la salud y la comunidad e inconvenientes para la
preservación de los sistemas y abastecimientos de agua en beneficios de la salud pública.
MICROBIOLOGÍA
 Agua potable: Agua tratada que cumple con las disposiciones de valores
recomendables o máximos admisibles estéticos, organolépticos, físicos, químicos,
biológicos y microbiológicos, establecidos y que al ser consumidas por la población
no causa daño a la salud.
 Agua superficial: la que se origina a partir de precipitaciones atmosféricas,
afloración de aguas subterráneas (ríos, manantiales, lagos quebradas).
 Agua tratada: Agua subterránea o superficial cuya calidad ha sido modificada por
medios de procesos de tratamiento que incluyen como mínimo a la desinfección en
el caso de aguas de origen subterráneo.
 Desinfección del agua: Corresponde a un proceso físico químico unitario cuyo
objetivo es garantizar la inactivación o destrucción de los agentes patógenos en el
agua a utilizar para el consumo humano2.
Medio E.M.B: Es un medio diferencial similar al Agar Levine y es utilizado para el

aislamiento de Enterobacterias. El uso de Eosina y Azul de Metileno permite la
diferenciación de microorganismos fermentadores y no fermentadores de lactosa. La
sacarosa se le añade además de la lactosa como carbohidrato fermentable, para detectar
coliformes que fermentan sacarosa más rápido que lactosa. La Eosina y Azul de Metileno
son inhibidores parciales de bacterias Gram positivas e indicadores de pH3.
La fórmula original de este medio de cultivo, fue modificada por Levine, quien eliminó la
sacarosa e incremento la concentración de lactosa, logrando así una mejor diferenciación de
cepas de Escherita coli. Los microorganismos fermentadores de lactosa, originan colonias
de color azulado-negro, con brillo metalice o mucosas. Las colonias producidas por
microorganismos no fermentadores de lactosa son incoloras. También pueden crecer
especies de Candida y se observan como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en
profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp.
Crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que
Acinetobacter spp. Y otras bacterias oxidativas se observan como colonias de color azul
lavanda; esto puede ocurrir aunque algunas cepas no sean capaces de acidificar a partir de
lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En
este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella4.
METODOLOGIA:
Para realizar éste laboratorio primero se fundió el agar (eosina azul de metileno) en los
tubos de ensayo, manteniéndolos a 45°C en baño de María. Luego, se procedió a tomar 1
mL de agua del grifo con una pipeta y se agregó en un tubo de ensayo con 9 mL de agua
peptonada al 0,1 %, después se tomó 1 mL de esta solución y se agregó en otro tubo de
ensayo con 9 mL de agua peptonada, para proceder a hacer lo mismo con esta segunda
solución al tomar nuevamente 1 mL de dicha solución con 9 mL de agua peptonada para
proceder a agregarlos en otro tubo de ensayo. Una vez se tuvo estas tres disoluciones se
MICROBIOLOGÍA
procedió a hacer con cada una un cultivo en una caja de Petri, tomando el agar fundido
anteriormente y agregándole 1 mL de la dilución preparada agitándola 20 veces a la
derecha y 20 hacia la izquierda. De manera que se tienen tres cultivos de diluciones
diferentes (10-1, 10-2 y 10-3), por último se procedió a cultivarlos a 37°C por 24 horas.
Además, en otra caja Petri se hizo otro cultivo con agar fundido a 45°C y 1 mL de una
dilución preparada con 1mL de agua del filtro y 9 mL de agua peptonada agitándola de la
manera anterior e incubándola a 37°C.
Materiales
 Tubos con 20 mL de agar nutritivo

 Tubos con 9 mL solución salina peptona (SSP) estéril para diluciones.
 Cajas de Petri estériles
 Baño María con termostasto
 Termómetro
 Gradillas
 Mecheros
 Pipetas estériles de 1 mL
 Propipeteador
 Solución desinfectante
 Marcador
 Cultivo de 24-48 horas de E. coli en caldo nutritivo.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
Luego de pasadas las 24 horas, se procedió a revisar los cultivos y no se encontró ninguna
clase de desarrollo aparente, es decir, no presentó ningún desarrollo bacteriano, de manera
que el agua del grifo y del filtro utilizadas en esta prueba se consideran libres de bacterias
coliformes, considerándose como agua potable apta para el consumo humano.
Ahora bien, en Colombia existe un reglamento con ciertas normas y parámetros que vigila a
las entidades operadoras del servicio de agua, con el fin de que el agua suministrada a la
comunidad sea apta para el consumo humano y no suponga riesgo alguno para la salud,
mediante el establecimiento de ciertos niveles de control de calidad del agua, utilizando
estudios como el realizado en el laboratorio para la determinación de la presencia de
coliformes en el agua. Cuya presencia de bacterias cataloga al agua como no apta para el
consumo. A continuación se presenta una tabla con los parámetros de calidad esperados
para que el agua se considere apta para el consumo:
MICROBIOLOGÍA
Parámetro Unidad Valor Valor máximo

recomendado admisible
Coliforme fecal UFC/100 mL Ausente Ausente
E. coli UFC/100 mL Ausente Ausente
Olor ---- Debe ser aceptable Debe ser aceptable
Sabor ---- Debe ser aceptable Debe ser aceptable
pH Valor pH 6,5 8,5
Dureza total mg/ L CaCO3 400 500
Cloruro mg/L 25 250
Fluoruro mg/L ---- 0,7 a 1,5
Nitrato mg/L 25 50
Sulfato mg/L 25 250
Aluminio mg/L 0,2 ----
Calcio mg/L 100 ----
Magnesio mg/L 30 50
Sodio mg/L 25 200
Potasio mg/L ---- 10
Hierro mg/L ---- 0,3
Manganeso mg/L 0,1 0,5
Zinc mg/L ---- 3,0
Cobre mg/L 1,0 2,0
Plomo mg/L ---- 0,01
Tabla 1. Algunos parámetros tenidos en cuenta por el Ministerio de Salud en la calidad del
agua.
Sin embargo, para mayor seguridad se procedió a comprobar si el medio utilizado para el
cultivo estaba en buenas condiciones, de manera que se prepararon dos cultivos con dicho
medio inoculándolo con un frotis del epitelio bucal y otro de la piel del cuello de una
compañera, y luego de 24 horas se presentó un desarrollo de pequeñas colonias
puntiformes, lo que indica que el medio utilizado se encontraba en perfectas condiciones,
cabe destacar además, que el medio utilizado para esta prueba fue el EMB o también
conocido como eosina azul de metileno que es un medio utilizado para el aislamiento
selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales,
de manera que inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas y permite diferenciar entre
bacterias fermentadoras de lactosa de un color azulado- negro con cierto brillo metálico y
bacterias no fermentadoras incoloras. Ahora bien, teniendo en cuenta que la flora bacteriana
de la piel es generalmente Gram positiva se esperaba que el cultivo no presentara
demasiado desarrollo bacteriano.
MICROBIOLOGÍA
CONCLUSIÓN:
En microbiología es importante conocer el número de microorganismos que sea encuentran

en una muestra, hay diversos métodos para realizar estos conteos, en este laboratorio se
realizó el método de diluciones en serie para el recuento de las bacterias presentes en la
muestra el cual estaba en buenas condiciones, dando como resultado el crecimiento nulo
bacteriano en el agua que la universidad le suministra a los estudiantes, debido a que no se
encontró la presencia de coliformes.
PREGUNTAS:
1. ¿Cuál es la mayor desventaja de los métodos de conteo de microorganismos a

excepción del método empleado en este laboratorio?
R// las desventajas de los métodos empleados en el conteo de microorganismos son:
en cuanto al conteo directo al microscopio, tiene como desventaja que en dicho
conteo se incluyen células vivas como muertas debido a que no se pueden
diferenciar con la cámara de Petroff-Hauser empleada; con el contador electrónico
de células se tiene la desventaja de que en el flujo conductor que pasa por el orificio
pequeño no se pueden diferenciar células vivas de células muertas como tampoco de
las partículas inertes que pasan a través de dicho canal; y el método químico tiene
como desventaja que solo se puede usar con muestras de suspensiones de células de
más de 10 millones de éstas.
2. Diferencie entre dilución y factor de dilución
R// La diferencia es que una dilución es la reducción de la concentración de una
sustancia química en una disolución, de manera que se reduce la cantidad de soluto
por unidad de volumen de dilución y el factor de dilución es una razón constante
entre el volumen de la solución original y el volumen del solvente utilizado en la
disolución.
3. ¿Cuáles son las ventajas y las desventajas del método empleado en este laboratorio?
R// Las ventajas del conteo en serie son de es más preciso que los métodos
discutidos anteriormente de manera que se puede estimar el tamaño y la densidad
poblacional de un cultivo de microorganismos presentes en una muestra, además
esta técnica sirve para la determinación de organismos vivos, y sus desventajas seria
que no se puede utilizar este método en muestras con colonias menores a 30 ni
mayores a 300.
4. Si 0,1 mL de una disolución 1x 10-6 produce en una caja de Petri 56 colonias,
calcule el número de células por mL en el cultivo original.
R// Se puede calcular con la siguiente formula
UFC= = = 56 x 107 células/mL
MICROBIOLOGÍA
BIBLIOGRAFIA:
 Recuentro bacteriano y análisis de agua. [en línea]

http://www.ramos.utfsm.cl/doc/530/sc/LABORATORIO_3.pdf. [consulta: 12 nov.
2015]1.
 Decretos N°32327-S. EL PRESIDENTE DE LA REPUBLICA Y MINISTERIO
DE SALUD. [en línea]. http://www.CAS_reglamento_calidad_agua_potable.pdf.
[consulta 12 nov. 2015]2.
 Laboratorio conda, S.A. Agar Eosina y Azul de Metileno (Agar E.M.B). [en línea]
http://www.condalab.com/uploads/media/1039_AGAR_Y_AZUL_DEMETILENO
_AGAR_E.M.B_REv_0_Abril_2010_01.pdf . [consulta 12 nov. 2015]3.
 Laboratorios Britania S.A. Levine E.M.B. Agar (con Eosina y Azul de Metileno).
[en línea]. http://www.britanialab.com/productos/hoja/tecnica/es.pdf. [consulta:12
nov. 2015]4.

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