CARACTERIZACION MOLECULAR MEDIANTE ITS DEL BIOCONTROLADOR

Paecilomyces sp. DEL BANCO DE CEPAS DE LA UNIVERSIDAD FRANCISCO DE

PAULA SANTANDER, SEDE CAMPOS ELISEOS – LOS PATIOS

LILIANA YANETH SUÁREZ CONTRERAS1

WENDY LORENA PEÑA BARRERA 2
1
MSc. en Biología énfasis Genética. Facultad de Ciencias Agrarias y del Ambiente,
Universidad Francisco de Paula Santander. [email protected]
2
Estudiante de pregrado en Ingeniería Biotecnológica. Facultad de Ciencias Agrarias y del
Ambiente, Universidad Francisco de Paula Santander. [email protected] .

RESUMEN

Con el fin de caracterizar molecularmente 14 cepas aisladas de diferentes

municipios de Norte de Santander de Paecilomyces sp. conservadas en el
Banco de Cepas de la Facultad de Ciencias Agrarias y del Ambiente, se
estandarizó un protocolo para su identificación molecular mediante ITS para
hongos, utilizando el siguiente programa en el termociclador: 94 ºC por 5
minutos para la desnaturalización inicial, seguido de 35 ciclos de 30 segundos
a 94 ºC para la desnaturalización, 58 ºC por 1 minuto para el anillamiento y 72
ºC por 1 minuto para la extensión; finalizando con una elongación de 72ºC por
10 minutos. La reacción se llevó a cabo con un volumen final de 25 µL que
contenía: 1 µL de ADN, 16,65 µL de agua nanopura, 0,75 µL de MgCl2 (1,5
mM), 2.5 µL de Buffer (1X), 1.25 µL de ITS 4(0.5 mM), 1.25 µL de ITS 5(0.5
mM), 0.1 µL de Taq polimerasa, y 0.5 µL de DNTP`s (0.2 mM). El producto de
los amplicones obtenidos fue verificado en electroforesis en gel de agarosa al
1%, teñidos con bromuro de etidio y comparados con el marcador molecular
de 1 Kb. Los fragmentos ITS generados fueron enviados al laboratorio
Corpogen para ser secuenciados y los resultados fueron comparados con las
secuencias reportadas en el banco de genes (NCBI) utilizando BLAST y RDP
sequence match donde se identificó a GIAV3, HC002 y HZ002 como
pertenecientes al género y especie Purpureocillium lilacinus, GIAV12 a
Penicillium copticola y GIAV 14 a Penicillium paxilli.

Palabras claves: Paecilomyces, PCR, ITS, Caracterización molecular, control biológico.

1. INTRODUCCIÓN la bibliografía para identificar

correspondencia con un determinado
El banco de cepas de la UFPS, sede género. La finalidad de este proyecto es
Campos Elíseos, cuenta hasta ahora con la caracterización molecular de las cepas
75 cepas de hongos, las cuales se han pertenecientes al género Paecilomyces
clasificado macroscópica y sp presentes en el banco de cepas de la
microscópicamente comparándolas con UFPS para ser utilizadas con certeza en

137
los proyectos de investigación como en pertenecientes al género Paecilomyces
docencia. El hongo Paecilomyces es un sp , dichas cepas fueron aisladas en dos
entomopatógeno que causa la proyectos anteriores sobre control
enfermedad y posterior muerte en biológico[2][3]. .Para la conservación Se
nematodos, por lo tanto es utilizado siguió el protocolo de desinfección
como un bionematicida. También es descrito por Suárez (2004) [4], y se
considerado un excelente biocontrolador sembró en cajas de Petri con Agar
por su papel antagonista en los ensayos Patata Dextrosa (PDA) Composición: 200
preliminares in vitro para control biológico g de infusión de papa, 20 g de glucosa y
de la moniliasis, enfermedad producida 15 g de Agar-agar; se incubaron a 28°C
por el fitopatógeno Moniliopthora roreri bajo un monitoreo diario durante siete
que ataca el cacao, y produce pérdidas días; se hicieron repiques en este agar
superiores al 50% de las cosechas al hasta obtener cultivos puros para la
sector cacaotero, [1] por esta razón es posterior siembra en Caldo Papa
muy importante su estudio. Dextrosa (PDB).

Los marcadores moleculares utilizados 2.2 Caracterización microscópica de

para la identificación de estas cepas son los aislamientos de Paecilomyces
ITS (espaciadores internos de Se preparó el cultivo de hongo en
transcritos), correspondientes al ADNr, cámara húmeda utilizado en el
los cuales permiten estudiar las regiones Laboratorio de Sanidad vegetal,
de ADNr polimórficas, pues son únicas UFPS [5], que consiste en introducir
para cada especie, lo que permitirá en una caja Petri, un disco de papel
determinar si las cepas almacenadas en filtro y una varilla en forma de “V”, que
el Banco de Cepas corresponden con soporta un portaobjetos que
certeza al género asignado y así conocer contiene un trozo de medio de cultivo
su especie. A partir de los resultados estéril muy delgado (PDA) en el cual se
obtenidos se logrará caracterizar e inocula el hongo por punción, luego
identificar molecularmente el hongo el papel filtro se humedece con 3 ml de
Paecilomyces sp. e igualmente permitirá agua estéril conservando la asepsia. La
estandarizar un protocolo de placa es incubada a 28°C durante ocho
identificación molecular para aplicar días. Después de este tiempo, se cubre
estas técnicas a los otros géneros de la muestra con azul de lactofenol y se
hongos conservados en el banco de sitúa el cubreobjetos para observar al
cepas de la Facultad de ciencias agrarias microscopio
y del Ambiente de la UFPS.
2.3 Extracción del ADN de
2. MATERIALES Y METODOS Paecilomyces sp.
Se siguió el protocolo de extracción de
2.1 Obtención y conservación de ADN de Moniliophthora roreri propuesto
Paecilomyces sp por Suárez (2005) [6].Se tomó el micelio
El estudio se desarrolló en el Laboratorio crecido previamente (0,5-0,75 g) en
Biotecnología Molecular de la caldo papa dextrosa en un microtubo de
Universidad Francisco de Paula 2ml y se le adicionó un volumen de 500
Santander e inicialmente se tomaron las ml de buffer de extracción (50mM Tris-
veintidos (22) cepas existentes, HCl pH= 7,5; 50 mM EDTA; 2% de SDS
rotuladas con diferentes códigos e y 1% de Na2SO3). Se procedió a
identificadas según los mismos como macerar la muestra con ayuda del rotor

138
durante 1 minuto; luego se agitó en nanopura, 0,75 µL de MgCl2 (1,5 mM),
vortex por un minuto y posteriormente se 2.5 µL de Buffer (1X), 1.25 µL de ITS
centrifugó a 6000 x g, por diez minutos; 4(0.5 mM), 1.25 µL de ITS 5(0.5 mM), 0.1
el sobrenadante se incubó a 70 °C µL de Taq polimerasa, 0.5 µL de DNTP’s
durante quince minutos. Después, se (0.2 mM). La reacción se llevó a cabo en
adicionó un volumen fenol/cloroformo de un termociclador
(1:1) a cada muestra y se centrifugó a (CFX96™ TOUCH REAL-TIME PCR,)
10.000 x g, por diez minutos. Se transfirió utilizando el siguiente programa: 94ºC
la fase acuosa a otro microtubo y se le por 5 minutos para la desnaturalización
agregó un volumen de isopropanol. Se inicial, seguido de 35 ciclos de 30
dejó en frío (congelación) 10 minutos, segundos 94 ºC para la
nuevamente se centrifugó a 10.000 x g, desnaturalización, 58 ºC por 1 minuto
durante diez minutos, el precipitado se para el anillamiento y 72 ºC por 1 minuto
secó a 37°C, se resuspendió en 50ml de para la extensión; finalizando con una
TE 1X pH=8 y se adicionó 1 ul de RNAsa elongación de 72ºC por 10 minutos. Los
a cada extracción. amplicones fueron analizados por
electroforesis en gel de agarosa al 1 % y
2.4 Purificación y verificación del ADN se tiñó con bromuro de etidio.
de Paecilomyces sp
Para la purificación de las extracciones 2.6 Secuenciación de los fragmentos
del ADN se utilizó etanol y fueron ITS y comparación de secuencias con
verificadas mediante electroforesis de bases de datos
acuerdo a Suárez (2005) en un gel de Los amplicones ITS generados fueron
agarosa al 1% en solución de Buffer TBE enviados al laboratorio de Corpogen y
1X (Tris base PM 121.14, ácido bórico Los resultados de la secuenciación de
PM 61,84 y EDTA 0,5 M, pH 8,0).Para la cada aislamiento se compararon con las
preparación de la muestra, se tomó 8 ul reportadas en el NCBI utilizando BLAST
del ADN extraído en un microtubo de 1ml y RDP sequence match
y se agregó 2 ul de buffer de carga (programas informáticos de alineamiento
(compuesto por azul de bromofenol y de secuencias). Comparando la
xilencianol) para chequear la migración secuencia problema con una gran
del ADN extraído en el gel de agarosa cantidad de secuencias que se
(Figura 6b) . Se mantuvo voltaje de 100 encuentren en la base de datos
V durante 20 minutos durante la indicando el género de la especie a la
electroforesis, luego el gel se visualizó en que pertenece cada cepa.
el transiluminador de UV verificando la
correcta extracción del ADN. 3. RESULTADOS

2.5 Reacción en Cadena de la 3.1 Obtención y conservación de

Polimerasa (PCR) mediante Paecilomyces sp
iniciadores universales ITS 4 e ITS 5. De 22 cepas de Paecilomyces sp. 14 se
Se amplificó la región ITS mediante utilizaron en esta investigación (Tabla 1),
iniciadores universales, se utilizó el 8 cepas no se lograron reactivar debido a
protocolo propuesto por Suárez (2013) [7] la escases de medio PDA en el que
como sigue: La reacción de PCR fue estaban.
llevada a cabo en tubos de 0,5 mL con
un volumen final de 25 µL que contenían:
1 µL de ADN , 16,65 µL de agua

139
Tabla 1. Lista de cepas de Paecilomyces 3.2 Caracterización microscópica de
procedentes del Banco de Cepas, UFPS. los aislamientos de Paecilomyces sp.
Cepas de Paecilomyces sp. Obtenidas de la El hongo Paecilomyces sp. presentó en
UFPS su morfología (Figura 2), conidióforos
NUMERO CODIGO CODIGO
tabicados de paredes lisas y ramificados
ANTIGUO NUEVO
1 HA010 GIAV2 en sus extremos, con metulas cortas y
2 HA011 GIAV3 fialides con el ápice puntiagudo, de
3 HA012 GIAV8 donde nacen los conidios lisos o
4 HA013 GIAV9 equinulados, tal como lo indican Arias E
5 HA014 GIAV12
6 HA015 GIAV13
y Piñeros P, (2008) [8] formando largas
7 HA016 GIAV14 cadenas, sin ramificar, con aspecto
característico de pincel, según Barnett,
8 HS021 HS021
H.L., and Hunter, B.B. (1999). [9].
9 HS022 HS022
10 HC002 HC002 Figura 2. Morfología microscópica de los
aislamientos de Paecilomyces sp.
11 HC003 HC003
microscopio 40X.
12 HC004 HC004
13 HC006 HC006
14 HZ002 HZ002

Algunas cepas tenían dos códigos: un

código antiguo y uno nuevo, en estos
casos se estableció un solo código Tabla 2. Clasificacion macroscopica de
(código nuevo) para ambas cepas. Paecilomyces según su morfologia.
Una vez purificadas las cepas en PDA,
presentaron diferencias morfológicas
desde el color hasta la textura (Figura 1),
categorizándolas en 2 grupos, con color
rosa-grisáceo típico el grupo A y el
verde- grisáceo propio del grupo B (Tabla
2).

Figura 1. Morfología macroscópica de

los grupos de Paecilomyces sp. en PDA.

3.3 Extracción del ADN de

Paecilomyces sp
Se sembró el hongo en caldo PDB, para
obtener el micelio (Figura 3), y se
procedió a la extracción del ADN. Se
obtuvo aproximadamente entre 1 a 2
µg/µl de ADN a partir de esta extracción,

140
se escogieron las extracciones que Tabla 3. Cantidades y concentración de
presentaban mejor calidad y cantidad del reactivos para PCR de Paecilomyces sp.
ADN.

Figura 3.Micelio de Paecilomyces sp. en

caldo PDB luego de 10 días de siembra.
Izq. Micelio grupo A; Der. Micelio grupo
B.

3.4 Purificación y verificación del ADN

de Paecilomyces sp
Una vez corrida la electroforesis de las
extracciones de ADN, se pudo visualizar
una buena cantidad de ADN de las cepas Se inició con un ciclo de denaturación a
a identificar, suficientes para realizar 94°C por un minuto, 35 ciclos de 94°C
PCR (Figura 4). por un minuto, el anillamiento 52°C por
45 segundos, la extensión 72 °C por 1
Figura 4. Verificación de calidad de minuto y un ciclo final de 72°C por 7
ADN, mediante electroforesis en gel de minutos. En estos ensayos iniciales, no
agarosa al 1% de las extracciones de se obtuvieron amplicones para
ADN. Paecilomyces, solo para Moniliopthora
roreri (control positivo).Sin embargo, se
variaron algunas temperaturas y tiempos
de ciclos del termociclador para la PCR
de acuerdo al protocolo de Martin (2013)
[10], primero un ciclo de denaturación a
94°C por cinco minuto ,35 ciclos de 94°C
por un minuto, el anillamiento 55°C por
3.5 Reacción en Cadena de la un minuto, la extensión 72 °C por 1
Polimerasa (PCR) mediante minuto y un ciclo final de 72°C por 10
iniciadores universales ITS 4 e ITS 5. minutos, y se obtuvieron amplicones para
GIAV 14; posteriormente se modificó el
Una vez seleccionadas las 14 protocolo utilizando la temperatura de
extracciones de ADN de Paecilomyces anillamiento de 58°C propuesta por
sp., se llevaron a cabo diferentes Perdomo H et al. (2011) [11], obteniendo
ensayos en el termociclador para obtener los amplicones para HC002, HC003,
los amplicones. Inicialmente se probó HS021, HZ002, GIAV2, GIAV3, GIAV8,
con el protocolo propuesto por Suárez GIAV9, GIAV 12, GIAV13,GIAV 14 y el
(2013). Teniendo como volumen final de control positivo (Moniliopthora roreri).
cada muestra 25 µl como se muestra (Figura 5).
en la (Tabla 3).

141
Figura 5. Electroforesis en gel de de anillamiento de 58°C.Y así se
agarosa de productos de amplificación identificaron molecularmente cinco de las
con iniciadores universales a partir de cepas, como Purpureocillium lilacinum
ADN de Paecilomyces sp. (HC002, HZ002, GIAV3), Penicillium
copticola (GIAV12) y Penicillium paxilli
(GIAV14).
Los resultados obtenidos son relevantes,
ya que Purpureocillium lilacinum es
considerado de gran interés para el
control biológico de enfermedades de
acuerdo a los ensayos de antagonismo in
vitro con M. roreri.
3.6 Secuenciación de los fragmentos
ITS y comparación de secuencias con REFERENCIAS
las bases de datos
Los resultados del análisis taxonómico [1] GRISALES, S.; y AFANADOR, L.
de estas secuencias fue de Análisis de la variabilidad genética en
aproximadamente 500 pb para HC002, Moniliophthora roreri con AP-PCR y
HZ002, GIAV3. Según la base de datos RADP En Antioquia, Colombia.
del NCBI, indican que las secuencias Revista Colombiana de
tiene un 100% de identidad en el 100% Biotecnologia.9 (2):15 - 32. 2007.
de su longitud con secuencias de ITS [2] SUÁREZ, L. Y RANGEL A.
pertenecientes a las especies Aislamiento de microorganismos para
Purpureocillium lilacinum. De acuerdo control biológico de Moniliophthora
con la literatura, Purpureocillium lilacinum roreri. Acta Agronómica. 2013.
se denominaba anteriormente [3] FIGUEROA, Wilmer; RAMIREZ,
Paecilomyces lilacinus, pero después de Jesús; SIGARROA, Alina.Efecto de
una revisión taxonómica se clasificó en las cepas nativas Paecilomyces sp.
un nuevo género llamado Purpureocillium (Bainier) y Lecanicillium sp. (Zimm)
debido a varias diferencias fenotípicas en el control de Carmenta foraseminis
con especies del género Paecilomyces Eichlin (Lepidoptera: Sesiidae) en
según Luangsa-ard JJ, et al. (2011) [12]; cultivos de cacao (Theobroma cacao
por otra parte el resultado del análisis de L.).Acta Agronomica, Palmira, vol.62,
la secuencia de GIAV12 identificó esta No.3, Jul. 2013.
cepa como Penicillium copticola; en [4] SUÁREZ, L. Aislamiento e
cuanto a GIAV14 fue caracterizada identificación del hongo
molecularmente como Penicillium paxilli. Moniliophthora roreri a partir de
cultivos de cacao ubicados en Norte
4. CONCLUSIONES Y de Santander- Colombia. Universidad
RECOMENDACIONES Pablo de Olavide. Tesina. Sevilla,
España. 2004.
En este trabajo se purificaron y [5] Manual de Laboratorio de Sanidad
reactivaron 14 cepas de hongos aislados Vegetal. Preparación de cámara
de diferentes municipios de Norte de humedad para hongos. UFPS. 2000.
Santander, conservadas en el Banco de [6] SUÁREZ, L. Extracción y purificación
Cepas de la UFPS-Patios. Se del ADN de Moniliophthora roreri
estandarizó la PCR utilizando los hongo que ataca el cacao, en Norte
cebadores ITS4 y 5, con una temperatura

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de Santander. Respuestas. Año 10, No.
2, Diciembre de 2005, p. 3-7.
[7] SUÁREZ, L. Y RANGEL A.
Aislamiento de microorganismos para
control biológico de Moniliophthora
roreri. Acta Agronómica vol. 62, No.
4, Octubre-Diciembre, 2013, p. 370-
378.
[8] ARIAS E, PIÑEROS P. Aislamiento e
identificación de hongos filamentosos
demuestras de suelo de los Páramos
de Guasca y Cruz Verde (Tesis de
pregrado). Bogotá: Pontificia
Universidad Javeriana; 2008. 204 p.
[9] BARNETT, H.L., y HUNTER,
B.B.1999. Illustrated Genera of
Imperfect Fungi. Second edition.
American Phytopathological
SocietyPress. St. Paul, Minnesota,
USA. 218 p.
[10] MARTIN L. Caracterización
molecular, fenotípica, patogénica y
medios de control de
Phaeoacremonioum aleophilum y
otros hongos asociados a los
decaimientos de la vid en Castilla y
León. 2013
[11] PERDOMO Ziems y HAYBRIG
Mercedes. Caracterización fenotípica
y molecular de hongos filamentosos
oportunistas: Scedosporium,
acremonium, phialemonium,
lecythophora y Paecilomyces. 2011.
[12] Luangsa-Ard J, J Houbraken, van
Doorn T, Hong SB, Borman AM,
Hywel-Jones NL, Samson AR.
Purpureocillium, un nuevo género de
la importancia médica
lilacinus Paecilomyces". FEMS
Microbiology Letters. (2011).

143