Analisis Bacteriologico de Agua

LABORATORIO DE
SALUD AMBIENTAL
PROCEDIMIENTO DE ANALISIS DE
COLIFORMES TOTALES, FECALES Y E. coli.
LSA P5.4-MG2345
INDICE
1. OBJETIVO ....................................................................................................... 2
2. ALCANCE ...................................................................................................... 2
3. DOCUMENTOS RELACIONADOS ... ……………………………………….…….……. 2
4. DEFINICIONES……………………………….….………………………………..………... 2
5. RESUMEN……………………………………………………………………………………. 2
6. DESARROLLO……………………………….…………..…….…………………….……… 2
7. REFERENCIAS……………………………………………………………………………… 6
8. ANEXOS …………..………………………………………………………………………. 7
FECHA DE APROBACION: 25 de agosto de 2008

FECHA DE REVISION: 22 de agosto de 2008
REVISION: 02
NOMBRE CARGO FIRMA
Directora del Laboratorio de Salud

APROBO
Blga. Soledad Osorio Alva. Ambiental - DIGESA
Aseguramiento de calidad. Laboratorio

Blga. Edith Villanueva Huamán de Salud Ambiental – DIGESA.
REVISO
Jefa del área de microbiología de
Blga. Ivonne Loayza Ramos. aguas. Laboratorio de Salud Ambiental
– DIGESA.
Analista del area de microbiologia de
ELABORO Blgo. Rafael Huapaya Porras. aguas. Laboratorio de Salud Ambiental
– DIGESA.
Cualquier copia impresa de este documento es una COPIA NO CONTROLADA

Código: LSA P5.4-MA2345
COLIFORMES TOTALES, FECALES Y E. coli. Página : 2 de 11
LABORATORIO DE Fecha : 25/08/2008
SALUD AMBIENTAL Revisión: 001
I OBJETIVO
Describir el método de ensayo para la numeración de Coliformes totales, Fecales y Escherichia

coli - técnica de fermentación de tubos múltiples, de acuerdo a lo indicado en el Standard Méthod
for the Examination of Water and Wastewater, 21th edition, 2005, parte 9221B,E y 9221 F1.
II ALCANCE
Este método se aplica a muestras de aguas residuales, superficiales, mar y agua tratada.
III DOCUMENTOS RELACIONADOS
Instructivo de preparación y esterilización de medios de cultivo.

Procedimiento de aseguramiento de la calidad de los resultados.
IV DEFINICIONES
4.1 Coliformes totales: son bacterias que forman parte del grupo coliformes y son definidas como
bacilos Gram negativos, no esporulados que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas
a 35 ± 0.5 °C dentro de las 48 ± 3 horas.
4.2 Coliformes fecales:: Son bacterias que forman parte del total del grupo coliformes y son
definidas como bacilos Gram negativos, no esporulados que fermentan la lactosa con producción
de ácido y gas a 44.5 ± 0.2 °C dentro de las 24 ± 2 horas. La mayor especie en el grupo de
coliformes fecales es la Escherichia coli y en menor grado las especies de Klebsiella,
Enterobacter y Citrobacter.
4.3 Numero más probable (NMP): es el cálculo de la densidad probable de bacterias coliformes
basadas en la combinación de resultados positivos y negativos obtenidos en cada dilución. La
precisión de cada prueba depende del número de tubos utilizados. Tres diluciones son
necesarias para la obtención del código del NMP. Las tablas de NMP se basan en la hipótesis de
una distribución de Poisson (dispersión aleatoria). La densidad bacteriana se obtiene a través de
de tablas en los que se presenta el límite de confianza de 95% para cada valor determinado y se
expresa como NMP de coliformes/100 mL.
V RESUMEN
La metodología de análisis se basa en 2 etapas:

La prueba presuntiva consiste en colocar volúmenes determinados de muestra de agua en una
serie de tubos conteniendo caldo lauril triptosa que luego son incubados a 35 ± 0.5°C durante
24 – 48 horas.
La prueba confirmativa para la determinación de coliformes totales, consiste en inocular los tubos
positivos de la prueba presuntiva en el caldo verde brillante bilis, incubarlos a 35 ± 0.5 ºC por 48
horas, en el caso de coliformes fecales y Escherichia coli, se siembra en caldo EC con MUG, los
tubos se incuban a 44.5 ± 0.2 ºC por un tiempo de 24 horas.
La formación de gas en los tubos de Durham así como la presencia de fermentación y turbiedad
en los tubos, se considera reacción positiva de coliformes. Los resultados se expresan en
términos de Número Más Probable (NMP) de microorganismos.
VI DESARROLLO
6.1 Medios de cultivo
6.1.1 Caldo lauril triptosa. (CLT).

6.1.2 Caldo verde brillante bilis lactosa (BRILLA)
6.1.3 Caldo EC - MUG

6.1.4 Agua de dilución

6.1.5 Tiosulfato de sodio
6.2 Equipos y Materiales.

Adicionalmente a lo requerido en el Instructivo de preparación y esterilización de medios de
cultivo y reactivos.
6.2.1 Incubadora de aire caliente a 35 ± 0,5 ºC.

6.2.2 Incubadora baño maria a 44,5 ± 0,2 ºC.
6.2.3 Frascos de dilución, capacidad de 100 mL., autoclavables.
6.2.4 Pipetas serológicas de 10 ml, tolerancia de ± 2.5%.
6.2.5 Tubos de ensayos, resistentes al autoclavado, con dimensiones de 18 x 150 mm (para medios
de concentración simple) y 20 x 150 mm (para concentración doble).
6.2.6 Tubos (campanas) Durham.
6.2.7 Probetas, matraces, espátulas, vasos de precipitación, magnetos).
6.2.8 Asas de siembra de níquel-cromo o platino de 3,0 a 3,5 mm de diámetro.
6.3 Dilución de la muestra
6.3.1 Recepcionadas las muestras, proceder a preparar las diluciones respectivas, el número de
diluciones dependerá de si la muestra es de procedencia de agua superficial o residual.
6.3.2 Agitar vigorosamente aproximadamente 25 veces, para asegurar una buena homogenización,
transferir con una pipeta estéril un volumen de 10 mL. de la muestra a un frasco con 90 ± 2 mL.
-1
de agua de dilución. De esta manera se obtiene la primera dilución (10 ).
-1
6.3.3 Homogenizar el frasco que contiene la dilución (10 ), con una nueva pipeta estéril transferir 10
-2
ml. a un nuevo frasco de dilución, teniendo así la segunda dilución (10 ). Continuar con este
proceso hasta realizar todas las diluciones del caso, dependiendo del grado de contaminación de
la muestra.
6.3.4 Ordenar los frascos conteniendo las diluciones, en secuencia decreciente de concentración (de
mayor a menor dilución).
6.4 Prueba presuntiva
6.4.1 Preparar una batería con series de cinco tubos conteniendo 10 mL. de CLT de concentración
doble y series de cinco tubos con 10 mL. de CLT de concentración simple; esta serie dependerá
del número de diluciones que se hallan realizado de la muestra. Colocar los tubos en gradillas y
codificarlos anotando el número asignado a la muestra, y dilución a inocular. Para agua de
consumo humano se utiliza 10 tubos de 10 mL de CLT a doble concentración.
6.4.2 Agitar vigorosamente por unas 25 veces el frasco con la última dilución efectuada y con una
pipeta estéril transferir 1 mL. de la dilución en cada uno de los tubos con CLT de concentración
simple correspondiente a dicha dilución.
6.4.3 Proceder de la misma forma, transfiriendo 1 mL. de la muestra más diluida a la más concentrada,
utilizando para ello la misma pipeta.
6.4.4 Transferir también 1 mL. de la muestra original a cinco tubos con CLT de concentración simple y
10 ml. en cinco tubos con CLT de doble concentración.
6.4.5 Incubar los tubos a 35 ± 0.5 °C. Después de 24 ± 2 horas examinar y separar los tubos con CLT
positivos, aquellos que presentan formación de gas en el tubo Durham (fermentación) y
turbiedad. Anotar los resultados. Todos los tubos positivos deben pasar a la siguiente fase, la
prueba confirmativa.

6.4.6 Reincubar los tubos negativos por 24 horas más. Realizar la segunda lectura a las 48 horas.
Nuevamente separar y anotar los resultados de los tubos positivos y pasarlos a la prueba
confirmativa. Los tubos negativos no se toman en cuenta y se descartan.
6.5 Prueba confirmativa
6.5.1 Coliformes totales
6.5.1.1 Colocar en gradillas, los tubos conteniendo el medio BRILLA, atemperarlos previamente durante
30 minutos a temperatura ambiental, codificar cada tubo con el número asignado a la muestra, y
con la dilución inoculada.
6.5.1.2 Agitar los tubos positivos de la prueba presuntiva para una completa homogenización antes de
ser inoculados a los tubos con el caldo BRILLA, evitar tocar la película superficial.
6.5.1.3 Con un asa de siembra estéril, transferir una o mas asadas de un cultivo positivo de CLT a un
tubo con el medio BRILLA. Repetir el mismo procedimiento para todos los tubos presuntivos.
6.5.1.4 Controlar que el tiempo transcurrido entre la inoculación y la incubación no exceda de 30

minutos.
6.5.1.5 Incubar los tubos inoculados a 35 ± 0.5 °C por 24 ± 3 horas.
6.5.1.6 Retirar los tubos de la incubadora luego del periodo de incubación, agitarlos suavemente para
observar la producción de gas y proceder a realizar la lectura, considerando positiva toda
formación de gas en los tubos Durham (Fermentación) y turbiedad en los tubos. Anotar los
resultados. Todos los tubos positivos deben pasar a la esterilización para ser descartados.
Reincubar los tubos negativos por otras 24 ± 3 horas.
6.5.1.7 Realizar la segunda lectura. Nuevamente separar y anotar los resultados de los tubos positivos.
Los tubos negativos no se toman en cuenta.
6.5.1.8 Con los resultados obtenidos de las dos lecturas calcular el NMP de acuerdo a las porciones y
combinaciones empleadas (véase anexo 2 o 3).
6.5.2 Coliformes fecales
6.5.2.1 Colocar en gradillas, los tubos conteniendo el medio EC - MUG, atemperarlos durante 30
minutos a temperatura de 44.5 ± 0.2 °C.
6.5.2.2 Codificar cada tubo con el número asignado a la muestra, y la dilución a inocular.
6.5.2.3 Agitar los tubos positivos de la prueba presuntiva para una completa homogenización antes de
ser inoculados a los tubos con el caldo EC-MUG, evitar tocar la película superficial.
6.5.2.4 Con un asa de siembra estéril, transferir una o dos asadas de los cultivos positivos de CLT a los
tubos con el medio EC - MUG.
6.5.2.5 Controlar que el tiempo transcurrido entre la inoculación y la incubación no exceda de 30

minutos.
6.5.2.6 Incubar los tubos inoculados a 44.5 ± 0.2 °C en Incubadora Baño María por 24 ± 2 horas.
6.5.2.7 Retirar los tubos del baño aaría luego del periodo de incubación, agitarlos suavemente para
observar la producción de gas y proceder a realizar la lectura, considerando positiva toda
formación de gas en los tubos Durham (Fermentación) y turbiedad en los tubos. Anotar los
resultados. Todos los tubos positivos deben pasar a la esterilización para ser descartados. Los
tubos negativos no se toman en cuenta.

6.5.2.8 Con los resultados obtenidos calcular el NMP de acuerdo a las porciones y combinaciones
empleadas (véase anexo 2 o 3).
6.5.3 Escherichia coli
6.5.3.1 Los tubos positivos del caldo EC – MUG, se exponen a una lámpara de luz UV de 365 nm, la
presencia de una fluorescencia azul se considera como una reacción positiva para E. coli. Anotar
los resultados.
6.5.3.2 A fin de interpretar los resultados y evitar confusiones de una débil fluorescencia del medio como
una reacción positiva deben utilizarse controles positivos consistente de una cepa conocida de
E.coli (MUG positiva), un control negativo consistente de una cepa termotolerante de Klebsiella
pneumoniae (MUG negativa) y un medio de cultivo sin inocular.
6.5.3.3 Anotar los resultados obtenidos y calcular el NMP de acuerdo a las porciones y combinaciones
empleadas (véase anexo 2 o 3).
6.5.4 Determinación del Número Mas probable (NMP)
6.5.4.1 El cálculo de la densidad probable de bacterias Coliformes totales, fecales y E. coli está basado
en la combinación de los resultados positivos y negativos obtenidos en cada dilución. La
densidad de coliformes se expresa como NMP de coliformes por 100 ml y se obtiene a través de
tablas en las que se presenta el límite de confianza de 95% para cada valor de NMP
determinado.
6.5.4.2 Los valores de NMP, para una variedad de combinaciones de tubos positivos y negativos se dan
en las tablas 1 y 2. El volumen de muestra indicado en la tabla 1 se usan para examinar aguas
de consumo humano.
6.5.4.3 Los valores de NMP presentados en la tabla 2 se refieren específicamente a la combinación de

resultados positivos obtenidos cuando son inoculados series de 5 tubos con volúmenes de 10
mL, 1 mL, 0,1 mL de muestra. Si los volúmenes de muestra inoculados se encuentran en las
tablas reportar el valor correspondiente al número de tubos positivos como NMP/100 mL.
6.5.4.4 Cuando se inoculan más de tres series de diluciones decimales, se deben seleccionar las tres
diluciones mas apropiadas y luego referirse a la tabla 2. Se ilustran algunos ejemplos a
continuación (ver cuadro 1 )
a) Como primer número del código se seleccionará la mayor dilución en la que todos los tubos
resultaran positivos y las dos diluciones subsiguientes para completar el código. (Pruebas 1 y 2).
b) Si menos de tres diluciones tienen resultados positivos, se seleccionarán las tres mayores
diluciones que incluyen los tubos positivos para completar el código. (Prueba 3).
c) Si resultarán tubos positivos en diluciones mayores que en aquellas seleccionadas para el

código los resultados positivos se desplazan hacia las diluciones seleccionadas a fin de
incrementar los tubos positivos en la última dilución seleccionada. (Prueba 4)
d) Si resultaran tubos negativos en volúmenes de muestra que los escogidos para el código, el
primer número del código será el de la mayor dilución en la cual todos los tubos resultaran
positivos, con las siguientes diluciones más altas para completar el código. (Prueba 5)
e) Si todos los tubos resultaran positivos, seleccionar para el código, aquellas tres diluciones
mayores. (Prueba 6)
f) Si todos los tubos resultaran negativos, seleccionar para el código aquellas tres diluciones
menores. (Prueba 7)

g) Si no resultaran tubos positivos en una dilución intermedia, escoger para el código la serie de
menor dilución y otra de mayor dilución para el código. (Prueba 9).
h) Si solamente la dilución intermedia resultara positiva, escoger para el código la serie de menor
dilución y otra de mayor dilución para el código. (Prueba 9)
Tabla N° 1 Valores para la selección del código
Pruebas Tubos positivos / ml y volumen de muestra

Código
10 1 0.1 0.01 0.001
1 5 2 0 0 0 5-2-0
2 5 5 2 1 0 5-2-1
3 3 1 0 0 3-1-0
4 5 5 3 1 1 5-3-2
5 4 5 4 0 0 5-4-0
6 5 5 5 5 5-5-5
7 0 0 0 0 0-0-0
8 4 0 1 0 4-0-1
9 0 1 0 0 0-1-0
6.5.4.5 Calcular el valor de NMP de acuerdo a la siguiente formula
NMP/ 100 mL = (Valor NMP/100mL tabla) x 10/v(*)

(*) Volumen de muestra inoculada en la primera dilución seleccionada.
6.6 Formularios y registros

Registro de resultados de Coliformes
6.7 Control de calidad

6.7.1 Se lleva un control de los medios de cultivo preparados, se incuba un tubo sin ser inoculado,
para cerciorarnos que los medios no estén contaminados se anotan los resultados en el registro.
6.7.2 Los medios estériles deben examinarse para asegurar que los tubos Durham no tengan burbujas
de aire y estén al menos la mitad a dos tercios cubiertos después de agregada la muestra.
6.7.3 Ver Procedimiento de aseguramiento de la calidad de los resultados.
VII REFERENCIAS
th
7.1 Standard Methods for the Examination of water and wastewater, 21 Edition 2005, parte 9221B,
E y 9221 F1.
VIII ANEXOS
N ° ANEXO TITULO
1 Diagrama de flujo del procedimiento
2 Índice de NMP al 95% de confianza para resultados de combinaciones de tubos
positivos y negativos cuando se usan 10 tubos inoculados con 10 mL de muestra.
3 Índice de NMP al 95% de confianza para varias combinaciones de resultados
positivos cuando se usan 5 tubos por dilución (10mL, 1,0mL, 0,1 mL).
4 Composición y preparación de los medios de cultivos y reactivos.

ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento
10 mL
10 mL 10 mL
90 mL
AD
P 10-n lauryl Triptosa
10-1 10-2 10-3
R 10 mL 1 mL
E 1 mL 1 mL 1 mL
S
U 10 mL
N x tubo
T
I 10 (2X) 1 -1 -2 X -3 -n
V
A
Incubar a 35ºC x 24 – 48 hrs.
Verificar la formación de gas

Pasar a la prueba confirmativa
C
O
N
F
Caldo EC con Mug Caldo Lactosado Verde Brillante
I Bilis 2%
R
M Incubar a 44.5ºC
A 24 hrs. Incubar a 35ºC
24 – 48 hrs.
T
I
V
A
24 hrs.
Gas (+) Gas (-)

Col. Fecal ausencia Gas (+) Gas (-)
Col. Fecal Col. Total ausencia
24- 28 hrs. Col. Total
UV 24 -28 hrs.
Fluorescencia (+)
E. coli
Tabla
NMP
Tabla
NMP

ANEXO II: Índice de NMP al 95% de confianza para resultados de combinaciones de tubos
positivos y negativos cuando se usan 10 tubos inoculados con 10 mL de muestra.
Nº de tubos positivos Límite de confianza al 95%

de 10 tubos Índice de NMP/100 mL
(volumen de 10 mL c/u) Bajo Alto
0 < 1,1 ---- 3,4
1 1,1 0,051 5,9
2 2,2 0,37 8,2
3 3,6 0,91 9,7
4 5,1 1,6 13
5 6,9 2,5 15
6 9,2 3,3 19
7 12 4,8 24
8 16 5,8 34
9 23 8,1 53
10 > 23 13 ----

ANEXO III: Índice de NMP al 95% de confianza para varias combinaciones de resultados
positivos cuando se usan 5 tubos por dilución (10mL, 1,0mL, 0,1 mL).
Combinación NMP / Límite de Confiabilidad Combinación NMP / Límite de Confiabilidad
de positivos 100 mL Bajo Alto de positivos 100 mL Bajo Alto
000 < 1.8 6.8 403 25 9.8 70
001 1.8 0.09 6.8 410 17 6 40
010 1.8 0.09 6.9 411 21 6.8 42
011 3.6 0.7 10 412 26 9.8 70
020 3.7 0.7 10 413 31 10 70
021 5.5 1.8 15 420 22 6.8 50
030 5.6 1.8 15 421 26 9.8 70
100 2 0.1 10 422 32 10 70
101 4 0.7 10 423 38 14 100
102 6 1.8 15 430 27 9.9 70
110 4 0.71 12 431 33 10 70
111 6.1 1.8 15 432 39 14 100
112 8.1 3.4 22 440 34 14 100
120 6.1 1.8 15 441 40 14 100
121 8.2 3.4 22 442 47 15 120
130 8.3 3.4 22 450 41 14 100
131 10 3.5 22 451 48 15 120
140 10 3.5 22 500 23 6.8 70
200 4.5 0.79 15 501 31 10 70
201 6.8 1.8 15 502 43 14 100
202 9.1 3.4 22 503 58 22 150
210 6.8 1.8 17 510 33 10 100
211 9.2 3.4 22 511 46 14 120
212 12 4.1 26 512 63 22 150
220 9.3 3.4 22 513 84 34 220
221 12 4.1 26 520 49 15 150
222 14 5.9 36 521 70 22 170
230 12 4.1 26 522 94 34 230
231 14 5.9 36 523 120 36 250
240 15 5.9 36 524 150 58 400
300 7.8 2.1 22 530 79 22 220
301 11 3.5 23 531 110 34 250
302 13 5.6 35 532 140 52 400
310 11 3.5 26 533 170 70 400
311 14 5.6 36 534 210 70 400
312 17 6 36 540 130 36 400
320 14 5.7 36 541 170 58 400
321 17 6.8 40 542 220 70 440
322 20 6.8 40 543 280 100 710
330 17 6.8 40 544 350 100 710
331 21 6.8 40 545 430 150 1100
332 24 9.8 70 550 240 70 710
340 21 6.8 40 551 350 100 1100
341 24 9.8 70 552 540 150 1700
350 25 9.8 70 553 920 220 2600
400 13 4.1 35 554 1600 400 4600
401 17 5.9 36 555 >1600 700
402 21 6.8 40

ANEXO IV: Composición y preparación de los medios de cultivos y reactivos.
Caldo lauril triptosa.

Composición:
Tryptosa 20.0 g
Lactosa 5,0 g
Dipotasio hidrogeno fosfato K2HPO4 2,75 g
Potasio dihidrogeno fosfato, KH2PO4 2,75g
Cloruro de sodio 5,0 g
Lauril sulfato de sodio 0,1 g
Agua destilada 1L
Preparación:
Disolver 35.6 g del medio deshidratado por litro de agua destilada (caldo simple). Ajustar el pH a 6.8 ±
0.2 y distribuir 10 ml. del medio en tubos de ensayo de 18 mm x 150 mm provisto en su interior con un
tubo de fermentación invertido (Durham), tapar y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Para caldo de
doble concentración, (véase el cuadro 1) disolver 71.2 g del medio deshidratado por litro de agua
destilada. Ajustar el pH a 6.8 ± 0.2 Distribuir 10 ml. Del medio en tubos de ensayo de 20 x 150 mm
provistos también en su interior con tubos Durham y proceder como en el caso anterior.
Tabla 1: Concentración de caldo lauril triptosa en función al volumen de muestra adecuado
Tubos con Volumen de Concentración del CLT

CLT
Muestra ml. Medio g/l
ml.
10 0.1 a 1.0 1 x (simple) 35.6
10
10 2 x (doble) 71.2
Caldo Verde brillante bilis lactosa (BRILLA):

Composición:
Peptona 10,0 g
Lactosa 10,0 g
Oxgall 20,0 g
Verde brillante 1 L.
Preparación:
Disolver 40 g de medio BRILLA en un litro de agua destilada. Distribuir 10 ml. En tubos de ensayo
provisto con tubos Durham invertidos. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 °C.
Caldo EC - MUG.
Composición:
Triptosa o tripticasa 20,0 g
Lactosa 5,0 g
Mezcla de sales biliares Nº 3 1,5 g
Dipotasio hidrogeno fosfato K2HPO4 2,75 g
Potasio dihidrogeno fosfato, KH2PO4 2,75g
Cloruro de sodio 5,0 g
4-metylumberiferil-β-D-glucoronido (MUG) 0,05 g
Agua destilada 1L
Preparación:

Disolver 37 g de medio EC - MUG en un litro de agua destilada. Distribuir 10 ml. En tubos de ensayo
provisto con tubos Durham invertidos. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 °C.
Agua de dilución
Para el agua de dilución, es necesaria la preparación de soluciones Stock A y B.
Solución Stock A: Disolver 34 g de fosfato monopotásico (KH2PO4) en 500ml. De agua destilada, al

ajustar el pH a 7.2 ± 0.5 con hidróxido de sodio (NaOH 1N), y completar el volumen a un litro con agua
destilada. Autoclavar por 15 minutos a 121°C.
Solución Stock B: Disolver 81.1 g de cloruro de magnesio (MgCl26H2O) en un litro de agua destilada.
Autoclavar por 15 minutos a 121°C.
Agregar 1.25 ml. De la dilución Stock A y 5 ml. de la solución Stock B a un litro de agua destilada.
Distribuir en frascos en cantidades que aseguren, luego de llevarlo a la autoclave por 15 minutos a
121°C, un volumen de 90 ± 2 ml.
Tiosulfato de sodio
Disolver 3 g de tiosulfato de sodio en 100 mL de agua destilada para obtener una concentración del 3%.
Para agua clorada, colocar en los frascos de muestreo 0,1 mL de esta solución (antes de su
esterilización), por cada 100 mL de capacidad del frasco.

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Describir el método de ensayo para la numeración de Coliformes totales, Fecales y Escherichia

III DOCUMENTOS RELACIONADOS

Instructivo de preparación y esterilización de medios de cultivo.

La metodología de análisis se basa en 2 etapas:

6.1 Medios de cultivo

6.1.1 Caldo lauril triptosa. (CLT).

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6.1.4 Agua de dilución

6.2 Equipos y Materiales.

6.2.1 Incubadora de aire caliente a 35 ± 0,5 ºC.

6.3 Dilución de la muestra

6.4 Prueba presuntiva

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6.5 Prueba confirmativa

6.5.1 Coliformes totales

6.5.1.4 Controlar que el tiempo transcurrido entre la inoculación y la incubación no exceda de 30

6.5.1.5 Incubar los tubos inoculados a 35 ± 0.5 °C por 24 ± 3 horas.

6.5.2 Coliformes fecales

6.5.2.5 Controlar que el tiempo transcurrido entre la inoculación y la incubación no exceda de 30

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6.5.3 Escherichia coli

6.5.4 Determinación del Número Mas probable (NMP)

6.5.4.3 Los valores de NMP presentados en la tabla 2 se refieren específicamente a la combinación de

c) Si resultarán tubos positivos en diluciones mayores que en aquellas seleccionadas para el

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Tabla N° 1 Valores para la selección del código

Pruebas Tubos positivos / ml y volumen de muestra

6.5.4.5 Calcular el valor de NMP de acuerdo a la siguiente formula

NMP/ 100 mL = (Valor NMP/100mL tabla) x 10/v(*)

6.6 Formularios y registros

6.7 Control de calidad

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ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento

Incubar a 35ºC x 24 – 48 hrs.

Verificar la formación de gas

Gas (+) Gas (-)

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Nº de tubos positivos Límite de confianza al 95%

1 1,1 0,051 5,9

2 2,2 0,37 8,2

3 3,6 0,91 9,7

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ANEXO IV: Composición y preparación de los medios de cultivos y reactivos.

Caldo lauril triptosa.

Tabla 1: Concentración de caldo lauril triptosa en función al volumen de muestra adecuado

Tubos con Volumen de Concentración del CLT

Caldo Verde brillante bilis lactosa (BRILLA):

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Para el agua de dilución, es necesaria la preparación de soluciones Stock A y B.

Solución Stock A: Disolver 34 g de fosfato monopotásico (KH2PO4) en 500ml. De agua destilada, al