Metodologia para determinación de plomo en sangre con espectrofotometría de

absorción atómica acoplada a horno de grafito.

Resumen del método

El principio del método, como se indicó anteriormente, se basa en la absorción de luz por parte
de un elemento en estado atómico. La longitud de onda a la cual la luz es absorbida es
específica de cada elemento (λ = 193,7 nm para el As), siendo la cantidad de radiación
absorbida proporcional a la cantidad de átomos del elemento presentes. Involucra
fundamentalmente 2 procesos: la atomización de la muestra y la absorción de radiación
proveniente de una fuente por los átomos libres. El tratamiento de la muestra hasta la
atomización consta de las siguientes etapas: 1. Secado: la muestra inyectada (2-20 µL) en el
horno de grafito es sometida a una temperatura algo inferior al punto de ebullición del solvente
(80-180 ºC). Aquí se evaporan el solvente y los componentes volátiles de la matriz.
2. Calcinación o incineración: en esta etapa, la temperatura es elevada para eliminar la materia
orgánica (350-1300 ºC).
3. Atomización: en esta etapa, el horno es calentado rápidamente, de manera de pasar al
analito al estado atómico (1800-2800 ºC). Usualmente se agrega una cuarta etapa para
limpieza del horno a alrededor de 3000 ºC. Cuanto mejor sea la separación de elementos
concomitantes del analito antes de la atomización, la determinación estará más libre de
interferencias. La eficiencia de la separación depende de la volatilidad del elemento en
comparación con los concomitantes

Precauciones de seguridad
- Se requieren guantes de látex para el manejo de las muestras, lentes de seguridad y túnicas.
- La manipulación de ácidos concentrados debe realizarse bajo una campana de extracción de
gases, considerando todas las medidas de seguridad para su uso.
- Se debe realizar una buena higiene de manos luego de manipular todas estas soluciones.
Precauciones técnicas
1. Con las soluciones: condiciones de almacenamiento adecuadas y vida útil de las mismas.
2. Con los materiales a emplear:
- Asegurarse de que estén verificados y en buenas condiciones.
- La solución madre de cada metal estándar certificado, disponible comercialmente, debe
usarse dentro de su tiempo de vigencia.
- Buenas prácticas empleadas en la técnica analítica: antes de la realización del análisis se
realiza una verificación del equipo mediante la lectura de blancos y soluciones patrón.
- El material de polipropileno no se reusa.
- El material de vidrio debe descontaminarse con una solución de HNO3 comercial al 10% (vida
útil de 90 días) durante 24 horas y posterior enjuague con agua destilada y luego bidestilada.

Instrumental/materiales
Espectrofotómetro de absorción atómica con horno de grafito, marca Varian, modelo Spectr
AA 55B con corrección de lámpara de deuterio o equivalente.
- Unidad GTA 110.
- Spectra AA versión 4.00
- Tubos de grafito con plataforma
- Lámpara de cátodo hueco de arsénico
- Pipetas aforadas clase A de 10 mL
- Matraces aforados de 50 mL, 100 mL y 500 mL clase A
- Pipetas automáticas de 10 a 100 µL y de 100 a 1000 µL
- Tubos de polipropileno con tapa de 10 mL
- Viales de polipropileno de 1 mL
- Tips de polipropileno de 200 µL y de 1000 µL
- Nitrógeno ultrapuro (pureza > 99,99%)
- Tritón X-100
PREPARACION DE REACTIVOS

Solución de Pirrolidinditiocarbamato de amonio (APDC)

Se preparó una solución de APDC pesando 1,0 g y llevándola a un balón de 100 ml. Se
adicionaron 10 ml de agua tipo1, se llevó a ultrasonido hasta disolución. Se dejó enfriar y se
completó con agua hasta volumen. Esta solución se utiliza en la preparación del modificador
de matriz.

Solución de Tritón X-100 al 0,1% v/v

En un balón aforado de 500 ml se adicionó 0,5 ml de Triton X-100 y se completó a volumen
con agua. Esta solución se utiliza en la preparación del modificador de matriz

Solución modificadora de matriz

Se pesaron 5,0 g de Dihidrógeno fosfato (V) de amonio y se transfirieron a un balón aforado
de 500 ml. Se lleva a disolución con 100 ml de la solución de Triton al 0,1% v/v. Una vez
disuelta se completó a volumen con la solución de Tritón X-100 al 0,1% v/v. Se llevaron 250
ml de la solución anterior a un embudo de decantación de 500 ml, se añadió 0,5 ml de la
solución de APDC (preparada anteriormente) y se agitó vigorosamente. Se añadieron 10 ml
de cloroformo y se agito nuevamente, se dejó decantar y se elimina la fase orgánica. Esta
última etapa con cloroformo se realiza 3 veces.

Preparación de soluciones estándar

1. Solución patrón de plomo con certificado de análisis [1000 µg/ml]
De acuerdo a las instrucciones de dilución del fabricante obtener una solución patrón
de 1000 µg/ml en ácido nítrico ultrapuro al 5%. La vigencia de esta solución es de un año.
2. Solución intermedia de plomo [10 µg/ml]
En un matraz volumétrico de 100 ml poner 1 ml de solución patrón de plomo [1000 µg/ml]y
5 ml de ácido nítrico y aforar con agua. La vigencia de esta solución es de un mes.
3. Soluciones de trabajo
Preparar cada semana los estándares de trabajo de 50, 100, 250, 500 y 750 µg/l (5, 10,
25, 50 y 75 µg/dl) de la siguiente manera:
De la solución intermedia de plomo [10 µg/ml] tomar las siguientes alícuotas, y colocarlas
en matraces volumétricos de 10 ml.

Solución HNO Aforo con Concentración de

3 agua
intermedia de las soluciones de
µl
plomo [10 µl/ml] trabajo
µl
50 500 50 g/l o 5 g/dl
100 500 100 g/l o 10 g/dl
250 500 250 g/l o 25 g/dl
500 500 500 g/l o 50 g/dl
750 500 750g/l o 75 g/dl

NOTA: Se podrán preparar soluciones de trabajo cuyas concentraciones se encuentren

dentro del intervalo de linearidad del método (desde el límite de
cuantificación hasta 80g/dl de concentración
Preparación de estándares de calibración y de las muestras:
Preparar los estándares de calibración en las copas de muestreo.
4. Con modificador de matriz.
Preparar los estándares de calibración y las muestras como se describe en el cuadro
número 1, cumpliendo con el intervalo de concentración del cuadro.

Preparar los estándares de calibración y las muestras como se describe en el cuadro

número 2. Usar como sangre base una muestra previamente preparada y analizada según
el punto 3.5 y cuyo contenido de plomo sea < 10.0 µg/dl.
Homogeneizar la muestra de sangre con agitación suave y adicionar la alícuota como se
señala en el cuadro 2, enjuagar y mezclar mediante bombeo repetido con la micropipeta,
utilizando la punta como agitador para eliminar de ésta toda traza de sangre.
CUADRO No. 2
MODIF. AGUA SOLUCIONES DE TRABAJO SANGRE MUESTRAS CC
MATRIZ
(µl)
800 50 100 250 500 750 BASE µl µl
BLANCO (µl) [µg/l] [µg/l] [µg/l] [µg/l] [µg/l]
REACTIVO 100 - - - - - 100 - -
ESTANDAR

5 µg/dl 800
- 100µ1 - - - - 100 - -
ESTANDAR
10 µg/dl 800
- - 100µ1 - - - 100 - -
ESTANDAR
25 µg/dl 800
- - - 100µ1 - - 100 - -
ESTANDAR
50 µg/dl 800
- - - - 100µ1 - 100 - -
ESTANDAR
75 µg/dl 800
- - - - - 100µ1 100 - -
MUESTRAS
900 - - - - - - 100 -
- - - - - - - - 100
*CC 900
*CC (Control de plomo en sangre con certificado de análisis
 3.5 Procedimiento

1. El área de preparación y análisis de las muestras debe ser aislada, estar

limpia y libre de polvo.
2. Los parámetros instrumentales son
los siguientes:
Longitud de onda: 283.3 nm.
Tipo de señal: absorbancia
integrada.
Medición de la señal: área del
pico.
Ancho de banda: de acuerdo a las especificaciones de cada
instrumento.
Los parámetros como las temperaturas y los tiempos de: secado, calcinado
y atomizado del horno de grafito se establecen a partir de las especificaciones
de operación y se optimizan en cada laboratorio.
3. Curva de calibración
Elaborar una curva de absorbancia integrada vs concentración con estándares
acuosos de plomo o una curva de calibración con adición de estándar, debiendo
obtener un coeficiente de correlación r > 0.995.
Analizar los controles de plomo en sangre con certificado de análisis, en
caso de que algún valor esté fuera del intervalo certificado volver a preparar
la curva de calibración.
4. Análisis de la muestra
Analizar las muestras, usando la longitud de onda de 283.3 nm
y corrector de fondo. El análisis se realiza por duplicado,

tomando 20 L de muestra.
5. Control de calidad
Analizar el control de plomo en sangre con certificado de análisis cada 20
muestras leídas, para comprobar la calidad de los resultados.
En caso de que la lectura del control de plomo en sangre esté fuera del intervalo
certificado, recalibrar y repetir las lecturas del último lote de muestras.
Cuando alguna muestra exceda el intervalo lineal definido con esta curva, se
analizará nuevamente, realizando una dilución 1:20 de la siguiente manera: 100 µl
de sangre más 1900 µl de modificador de matriz.
 6. Expresión de los resultados
Para calcular la concentración de plomo de muestras, se interpola el valor de
absorbancia integrada en la gráfica de la curva de calibración.
Para muestras que se han diluido considerar el factor de dilución.
La concentración de plomo en las muestras se reporta en µg/dl, con una cifra
decimal.
7. Límite de detección
Límite de detección 1.5 µg de plomo/dl de sangre.
8. Linearidad
Desde el límite de cuantificación establecido para las condiciones específicas
de operación hasta 80.0 µg de plomo/dl de sangre.

DETERMINACION DE ARSENICO

Instrumental/materiales
Espectrofotómetro de absorción atómica con horno de grafito, marca Varian, modelo Spectr
AA 55B con corrección de lámpara de deuterio o equivalente.
- Unidad GTA 110.
- Spectra AA versión 4.00
- Tubos de grafito con plataforma
- Lámpara de cátodo hueco de arsénico
- Pipetas aforadas clase A de 10 mL
- Matraces aforados de 50 mL, 100 mL y 500 mL clase A
- Pipetas automáticas de 10 a 100 µL y de 100 a 1000 µL
- Tubos de polipropileno con tapa de 10 mL
- Viales de polipropileno de 1 mL
- Tips de polipropileno de 200 µL y de 1000 µL
- Nitrógeno ultrapuro (pureza > 99,99%) 5.7.7.
Reactivos
Tipos de reactivos
- Estándar certificado de arsénico 1000 mg/L
- Modificador: PdCl2 2000 mg /L
- Agente reductor: ácido ascórbico (ppa o ACS)
- HCl Suprapur
- Agua Ultrapuro tipo I (ASTM) o agua destilada libre de As
- Tritón X-100.

Almacenamiento de reactivos, soluciones y otros: Se conservan a temperatura ambiente,

excepto el PdCl2 que se almacena a 4 ºC. 5.7.8.

Calibración del equipo: Debe ser llevada a cabo por el servicio técnico de mantenimiento
de acuerdo a lo establecido en el programa de calibración correspondiente.
Calibración del método: La calibración del método se logra por adiciones estándares sobre
la muestra en la posición 1 del muestreador automático. Las concentraciones y cantidades
de reactivos se indican en la Tabla 1:
Muestreo y preservación: Para las muestras de agua se utilizan recipientes de polipropileno
o polietileno, acidificadas (pH < 2) con HCl 0,2%. Deben ser refrigeradas hasta el momento
del análisis a 4 ºC.

Procedimiento de análisis:
Llevar las muestras a ser analizadas a temperatura ambiente.
Preparar HCl 2% como solución de enjuague utilizado por el sistema de inyección del
equipo. Vida útil: 1 mes almacenada a temperatura ambiente.
Abrir el tanque de N2 .
1. Encender el equipo de absorción atómica de acuerdo al instructivo del Sistema de
Gestión de Calidad (SGC).
2. Colocar en el equipo la solución de enjuague HCl 2%.
3. Preparar la solución blanco (HCl 0,5%). Vida útil: 1 mes almacenada a temperatura
ambiente.
4. 5.7.11.7. Preparar 10 mL de estándar de As de 10 mg L-1 en HCl 0,5% en tubo de
polipropileno (100 µg L-1 de estándar certificado de As 1000 mg L-1 en 10,00 mL
de HCl 0,5%). Vida útil: 1 mes almacenada a temperatura ambiente.
5. 5.7.11.8. Cada vez que se procesan muestras, se preparan 20 mL de una solución
estándar de As 100 µg L-1 en HCl 0,5% en tubos de polipropileno (se toman 100 µL
de la solución de As 10mg L-1 y se lleva a volumen con HCl 0,5%).
6. 5.7.11.9. controles internos Preparación de (muestras fortificadas en 20 µg As L-1):
se realizan fortificaciones de las muestras utilizando el estándar de As de 100 µg L-
1 (se toman 200 µL de la muestra + 200 µL de estándar de As de 100 µL + 800 µL
de modificador de matriz).
7. 5.7.11.10. Registrar la preparación de soluciones en el cuaderno de laboratorio,
indicando la trazabilidad de la misma (fecha de preparación, fecha de vencimiento,
analista, concentración).
8. 5.7.11.11. Abrir una hoja nueva de trabajo del Programa Spectr AA con la fecha
correspondiente al día de trabajo.
9. 5.7.11.12. Registrar las muestras a analizar en el cuaderno de laboratorio y pasar
los datos a la hoja de trabajo abierta.
10. 5.7.11.13. Preparar modificador de matriz (ácido ascórbico – Tritón X-100): 1 mL de
 Tritón X-100 + 5 mL de solución de ácido ascórbico al 5%. Llevar a volumen con
agua destilada en matraz aforado de 100 mL.
11. 5.7.11.14. Colocar las muestras en los viales diluidas 1/5 con modificador de la
matriz (200 µL de muestra + 800 µL de modificador) y éstos en su correspondientes
posiciones. Homogeneizar la solución, cargando y descargando con la pipeta
automática dentro del vial 5 veces.
12. 5.7.11.15. blanco de reactivos (colocando en un Al iniciar el lote de análisis colocar
un vial modificador de matriz). Cada 10 muestras se debe incluir un control interno
y el duplicado de una muestra al azar como control de repetibilidad (ver más
adelante).
13. 5.7.11.16. En el muestreador se colocan en distintos recipientes: 20 mL de estándar
de As 100 µg L-1, 20 mL de blanco reactivo (HCl 0,5%) y 20 mL de la solución de
PdCl2 50 mg L-1 . 5.7.11.17. Antes del inicio del análisis realizar un chequeo del
equipo:
- Purga del inyector
- Acondicionamiento del tubo de grafito
- Alineación de la posición del capilar
- Alineación de la lámpara de cátodo hueco
- Optimizar el porcentaje de ganancia de las lámparas (cátodo hueco y deuterio)

14. 5.7.11.18. Verificar las condiciones instrumentales del equipo:

- Longitud de onda: 193,7 nm
- Ancho de rendija: 1,0 nm
- Gas: nitrógeno - Ganancia: 45%
- Intensidad de Corriente: 11,0 mA
15. Ejecutar la corrida de acuerdo al instructivo del laboratorio del SGC, sometiendo las
muestras al programa de temperatura según indica la Tabla 2:

16. Para cada una de las adiciones estándares y las muestras se realizan 3 inyecciones.
Para cada muestra se obtiene la desviación estándar relativa (RSD) correspondiente.
17. Imprimir el informe, seleccionando el menú “Informes”. El reporte se archiva en la
carpeta correspondiente.
18. Cerrar la llave del tanque de N2 .
Procedimiento de análisis
Cálculos: 1. Preparar una curva de calibración en agua por el método de adiciones estándar
en el rango comprendido entre 5 - 40 µg /L.
2. Realizar un ajuste “lineal” para la curva de calibración.
3. El programa realiza automáticamente los cálculos correspondientes, determinando la
concentración de arsénico presente en las muestras, el RSD y la concentración
característica (C) de la corrida.
4. Se deben calcular los porcentajes de recuperación para los controles internos (%R) y la
repetibilidad del ensayo, de acuerdo a:
%R = [concentración encontrada / concentración fortificada] × 100 (5.2)

Repetibilidad = [(valor abs(concentración muestra – concentración muestra duplicado)) ×

100]/promedio de las concentraciones duplicadas (5.3)

Expresión de los resultados: Los resultados deben ser expresados con una cifra decimal
después de la coma.
Para los valores cuya concentración sea menor a 1,0 µg /L, se informa “no detectable”.
Para las concentraciones entre 1,0 µg L-1 y 5,0 µg L-1 se informa “< 5,0 µg L-1” (límite de
cuantificación).
Controles: El analista considera aprobada la corrida de análisis cuando:
- La curva de calibración presenta un R2 > 0,995.
- La concentración del blanco de reactivos es < a 1 µg L-1 .
- El resultado obtenido en el control interno (muestra fortificada) debe encontrarse en un
porcentaje de recuperación entre 85 - 105%.
- El RSD de cada muestra es < a 5%.