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Diagnóstico de laboratorio de las infecciones de transmisión sexual, incluida la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana
Diagnóstico de laboratorio de las

infecciones de transmisión sexual,
incluida la infección por el virus
de la inmunodeficiencia humana
Jefe de redacción
Magnus Unemo
Redactores
Ronald Ballard, Catherine Ison, David Lewis, Francis Ndowa, Rosanna Peeling
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OFICINA REGIONAL PARA LAS
Department of Reproductive Health and Research

World Health Organization
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OFICINA REGIONAL PARA LAS OFICINA REGIONAL PARA LAS
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Jefe de redacción
Magnus Unemo
Redactores
Ronald Ballard
Catherine Ison
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Francis Ndowa
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Catalogación por la Biblioteca de la OMS:
Diagnóstico de laboratorio de las infecciones de transmisión sexual, incluida la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana /
editado por Magnus Unemo ... [et al].
1. Doenças Sexualmente Transmissíveis – diagnóstico. 2. Infecções por HIV – diagnóstico. 3. Técnicas e Procedimentos Diagnósticos.
4. Laboratorios. I. Unemo, Magnus. II. Ballard, Ronald. III .Ison, Catherine. IV. Lewis, David. V. Ndowa, Francis. VI. Peeling, Rosanna
VII. Organización Mundial de la Salud.
ISBN 978 92 4 350584 8

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Las opiniones expresadas en la presente publicación son responsabilidad exclusiva de los autores cuyo nombre se menciona.
Diagnóstico de laboratorio de las infecciones de transmisión sexual, incluida la infección por el virus de la
inmunodeficiencia humana, 2013
Redactor jefe
Magnus Unemo
Centro colaborador de la OMS para la gonorrea y otras ITS
Hospital Universitario de Örebro
Örebro (Suecia)
Redactores
Ronald Ballard
Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades
Atlanta, Georgia (Estados Unidos de América)
Catherine Ison
Public Health England (anteriormente Health Protection Agency)
Londres (Reino Unido)
David Lewis
National Institute for Communicable Diseases
Johannesburgo (Sudáfrica)
Francis Ndowa
Organización Mundial de la Salud
Ginebra (Suiza)
Rosanna Peeling
London School of Hygiene and Tropical Medicine
Londres (Reino Unido)
Índice
Siglas y abreviaturas vii
Prefacio ix
Agradecimientos xi
1 Elección de las pruebas diagnósticas de las infecciones de transmisión sexual
Edward W. Hook III, Francis Ndowa, David Mabey, Manju Bala y Ye Tun 1
2 Gestión de la calidad en los laboratorios
Catherine Ison y Ronald Ballard 9
3 Micoplasmas genitales
Jørgen Skov Jensen y Magnus Unemo 15
4 Gonorrea
Magnus Unemo y Catherine Ison 21
5 Infecciones por clamidias
Barbara Van Der Pol y Magnus Unemo 57
6 Tricomoniasis
Yaw Adu-Sarkodie, Magnus Unemo y Barbara Van Der Pol 79
7 Vaginosis bacteriana
Yaw Adu-Sarkodie y Catherine Ison 89
8 Candidiasis
Yaw Adu-Sarkodie y Catherine Ison 95
9 Infecciones por el virus del herpes simple
Laurent Bélec 99
10 Sífilis
Ronald Ballard y Edward W. Hook III 115
11 Linfogranuloma venéreo
Ronald Ballard 141
12 Chancro blando
David Lewis 143
13 Donovanosis (granuloma inguinal)
David Lewis 151
14 Infecciones por los virus de los papilomas humanos
Suzanne Garland 155
15 Infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana
Bharat S. Parekh, Dennis Ellenberger, Larry Westerman, Chunfu Yang
y John N. Nkengasong 167
Índice v
Anexos
Anexo 1. Microscopia y principios que rigen la tinción
Catherine Ison 181
Anexo 2. Principios que rigen las pruebas diagnósticas rápidas en el punto de atención
Rosanna Peeling 189
Anexo 3. Principios que rigen las pruebas moleculares para el diagnóstico
de las infecciónes de transmisión sexual
Cheng Y. Chen y Magnus Unemo 197
Anexo 4. Medios, reactivos, pruebas diagnósticas y tinciones (recetas de laboratorio)
Stefania Starnino y Jo-Anne R. Dillon 215
Anexo 5. Material de laboratorio
Stefania Starnino y Jo-Anne R. Dillon 235
vi Diagnóstico de laboratorio de las infecciones de transmisión sexual, incluida la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana
Siglas y abreviaturas
ARAS Artritis reactiva adquirida sexualmente FRET Transferencia de energía por resonancia de
ARV Antirretroviral fluorescencia
ATC Agar tripticasa de cisteína FRVIH Farmacorresistencia del VIH
AVAD Año de vida ajustado en función de la FTA-Abs Prueba de absorción de anticuerpos
discapacidad antitreponémicos fluorescentes
BD Becton, Dickinson and Company G Aceleración debida a la gravedad
bDNA DNA ramificado GASP Programa de Vigilancia de la Sensibilidad
BR Tipos de bajo riesgo de los Gonococos a los Antimicrobianos
C2CA Amplificación círculo a círculo GC Garantía de calidad
CC Control de calidad GCMB Medio base de agar para gonococos
CCI Control de calidad interno gG Glicoproteína G
CCUG Culture Collection University of Gothenburg GKNP Solución de glucosa-potasio-sodio-fosfato
(Gotemburgo, Suecia) HPA Ensayo de protección de la hibridación
CDC Centros para el Control y la Prevención de VHS Virus del herpes simple
Enfermedades (Atlanta, Georgia, Estados ICT Prueba inmunocromatográfica
Unidos) IF Inmunofluorescencia
CH/CH2 Captura de híbridos/Captura de híbridos 2 IFA Ensayo de inmunofluorescencia
CIA Ensayo de quimioluminiscencia IgA/IgG/IgM Inmunoglobulina A, G, M
CIM Concentración inhibitoria mínima IGD Infección gonocócica diseminada
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute IMDM-VGA Medio de Dulbecco con modificación de
CO2 Dióxido de carbono Iscove
CSPS Control de sustancias peligrosas para la IP Inmunoperoxidasa
salud ISO Organización Internacional de
Ct Umbral de ciclos Normalización
CdV Coeficiente de variación ITS Infección de transmisión sexual
CV Carga viral KOH Hidróxido de potasio
CVA Cofactores-vitaminas-aminoácidos LCR Líquido cefalorraquídeo
CVV Candidiasis vulvovaginal LGV Linfogranuloma venéreo
DE Desviación estándar LIA Inmunoensayo lineal
DFA Ensayo de inmunofluorescencia directa LIAG Lesión intraepitelial de alto grado
DNA Ácido desoxirribonucleico LIBG Lesión intraepitelial de bajo grado
dsDNA DNA bicatenario LJ Gráficos de Levey-Jennings
DTL Diagnóstico temprano de los lactantes LPMN Leucocitos polimorfonucleares
EA Éster de acridinio LPS Lipopolisacárido
EDL Ensayos desarrollados en el laboratorio MALDI-TOF Desorción/ionización mediante láser
EEC Evaluación externa de la calidad asistida por matriz, acoplada a un
EIA Enzimoinmunoanálisis analizador de tiempo de vuelo
EIC Evaluación interna de la calidad MH Mueller-Hinton
EIP Enfermedad inflamatoria pélvica MIF Microinmunofluorescencia
ELISA Enzimoinmunoanálisis de adsorción MOMP Proteína principal de la membrana externa
EUCAST European Committee on Antimicrobial MS Espectrometría de masas
Susceptibility Testing MTM Medio de Thayer-Martin modificado
EUG Enfermedad ulcerosa genital NASBA Amplificación basada en la secuencia del
FDA Administración de Alimentos y ácido nucleico
Medicamentos de Estados Unidos NCTC National Collection of Type Cultures
FITC Isotiocianato de fluoresceína
Siglas y abreviaturas vii

NHAN Pruebas de hibridación de ácidos nucleicos spp. Especies
sin amplificación SSTF Solución salina tamponada con fosfato
NIBSC National Institute for Biological Standards TAR Tratamiento antirretroviral
and Control TC Captura de dianas
NIC Neoplasia intraepitelial cervicouterina TMA Amplificación mediada por transcripción
nvCT Nueva variante de Chlamydia trachomatis TPHA Prueba de hemaglutinación de Treponema
NYC Agar New York City pallidum
OMS Organización Mundial de la Salud TPPA Prueba de aglutinación pasiva de
ONUSIDA Programa Conjunto de las Naciones Unidas partículas de Treponema pallidum
sobre el VIH/SIDA TRUST Prueba de rojo de toluidina en suero no
PA Punto de atención calentado
PAAN Prueba de amplificación de ácidos TSB Caldo con triptona y soja
nucleicos UE Unión Europea
Pap Papanicolaou UFC Unidades formadoras de colonias
PC Prueba de curación UNG Uretritis no gonocócica
PET Prueba de detección de enzimas UNGNC Uretritis no gonocócica no causada por
preformadas clamidias
PIP Prolil iminopeptidasa VB Vaginosis bacteriana
POE Procedimiento operativo estándar VDRL Prueba serológica luética
PRR Papilomatosis respiratoria recidivante VHB Virus de la hepatitis B
RCA Amplificación mediante círculo rodante VHC Virus de la hepatitis C
RCP Reacción en cadena de la polimerasa VIH Virus de la inmunodeficiencia humana
RCUT Prueba rápida de utilización de VPH Virus de los papilomas humanos
carbohidratos VPN Valor predictivo negativo
RHR Department of Reproductive Health and VPP Valor predictivo positivo
Research WB Inmunoelectrotransferencia (Western blot)
RNA Ácido ribonucleico WHO/TDR Programa Especial de la OMS de
RPR Reagina plasmática rápida Investigación y Capacitación en
RT Retrotranscriptasa Enfermedades Tropicales
RW Reacción de Wasserman
SDA Amplificación por desplazamiento de
cadena
SGC Sistema de gestión de la calidad
sida Síndrome de inmunodeficiencia adquirida
SNEEC Servicio Nacional de Evaluación Externa de
la Calidad del Reino Unido
SNP Polimorfismo de un solo nucleótido
SPG Sacarosa-fosfato-glutamato
viii Diagnóstico de laboratorio de las infecciones de transmisión sexual, incluida la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana
Prefacio
Las infecciones de transmisión sexual (ITS), incluidas las causadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
de tipo 1 y 2, siguen siendo un área prioritaria para la salud pública mundial por la alta morbilidad que se asocia a estas
infecciones, como las secuelas de las infecciones genitales, el cáncer cervicouterino, la sífilis congénita, el embarazo
ectópico y la infertilidad, así como la morbilidad por enfermedades relacionadas con el VIH y la muerte por el síndrome
de inmunodeficiencia adquirida (sida). Las estrategias de salud pública para controlar las ITS consisten en promover un
comportamiento sexual más seguro y proporcionar condones (prevención primaria), así como el tratamiento temprano y
eficaz de los pacientes con ITS por medio de enfoques clínicos sindrómicos o etiológicos.
En el caso del enfoque sindrómico, el tratamiento accesible, asequible y eficaz de las personas que tienen alguna ITS
se basa en el uso de diagramas de flujo (algoritmos) para cada síndrome. Los algoritmos permiten diagnosticar los
síndromes comunes de ITS, proporcionar tratamiento actualizado y apropiado para cada país, brindar orientación sobre
el tratamiento de compañeros sexuales, y poner de relieve la importancia de realizar la prueba de detección del VIH en
la misma consulta. Los algoritmos deben basarse en datos etiológicos y de susceptibilidad antimicrobiana a escala local
recopilados por medio de relevamientos periódicos de los laboratorios. En general, en la mayor parte de los pacientes
con ITS que reciben tratamiento sindrómico no se realizan pruebas de laboratorio. Sin embargo, puede ser necesario
tomar muestras para realizar pruebas de laboratorio en aquellos pacientes que no logran buenos resultados con el
tratamiento de primera línea, a fin de establecer el diagnóstico o de determinar si el fracaso terapéutico se debe a la
resistencia a los antimicrobianos. En los países que pueden costear el enfoque de diagnóstico etiológico, el laboratorio
tiene una función mucho más importante en cuanto a la identificación de microorganismos patógenos específicos de
las ITS y la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos. Además desempeña un papel clave en cuanto a la
vigilancia de las ITS y los programas de investigación tanto en los países de escasos recursos como en los países de
mayor abundancia.
La Organización Mundial de la Salud publicó en 1999 una versión anterior de este manual, denominada Diagnóstico de
laboratorio de las enfermedades de transmisión sexual, con el propósito de brindar una guía integral de procedimientos
normalizados para aislar, detectar y diagnosticar las ITS, dirigida a microbiólogos y auxiliares médicos. Había sido
concebida como un manual práctico de referencia dirigido a las necesidades y las capacidades de los laboratorios a
distintos niveles del sistema de atención de salud. Este manual resultó muy popular tanto en los países como en los
laboratorios.
Desde la publicación del manual de 1999, se ha registrado una serie de importantes adelantos en cuanto a los
procedimientos de diagnóstico, en particular, con respecto a la amplificación de ácidos nucleicos y las pruebas rápidas
en el lugar de atención, así como en relación con la metodología y las recomendaciones sobre el perfil de sensibilidad
a los antimicrobianos. En consecuencia, un grupo de expertos internacionales ha actualizado a fondo los capítulos del
manual de 1999. Además, en esta versión revisada se han incorporado nuevos capítulos sobre diversos temas como
las técnicas de diagnóstico para Mycoplasma genitalium, las pruebas en el lugar de atención para las ITS y la gestión
de la calidad en los laboratorios. A pesar de que esta versión actualizada abarca los microorganismos patógenos más
importantes de las ITS, no debe considerarse exhaustiva, por lo que puede ser necesario que el lector consulte otros
recursos de referencia para obtener más información sobre temas como las políticas nacionales de ITS, las pautas
sobre los antibiogramas, aspectos médico-jurídicos y la realización de las pruebas de detección de ITS en menores de
edad.
En este nuevo manual, Diagnóstico de laboratorio de las infecciones de transmisión sexual, incluida la infección por el
virus de la inmunodeficiencia humana, se proporciona una comprensión básica de los principios que rigen las pruebas
de laboratorio en el contexto de los enfoques de detección y diagnóstico, así como el antibiograma, como componentes
del control de las ITS. Del mismo modo que en el manual de 1999, en el presente manual se aborda cada enfermedad
en un capítulo por separado, en el que se suministra información detallada sobre la obtención y el transporte de
Prefacio ix
muestras, y las pruebas de laboratorio. Al final del manual se incluyen dos anexos útiles en los que se describe el
equipo, las pruebas, los medios, los reactivos y las tinciones.
Se espera que este manual actualizado resulte ilustrativo para los administradores, los directores de programas, el
personal médico y de enfermería, así como para el público destinatario principal que siguen siendo los microbiólogos y
los auxiliares médicos. El manual puede ser útil para ayudar a adquirir las pruebas de diagnóstico más apropiadas para
cada entorno, idealmente por medio de comités consultivos de expertos nacionales o locales. También es un recurso
valioso para aquellos que capacitan a estudiantes y para los propios estudiantes, tanto dentro como fuera del entorno
de laboratorio. Por último, como seguramente en los próximos años el número de productos y métodos de diagnóstico
continuará en aumento, será importante entonces que todos los lectores se mantengan al día con respecto a los
últimos adelantos en este campo.
x Diagnóstico de laboratorio de las infecciones de transmisión sexual, incluida la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana
Agradecimientos
La presente edición de Diagnóstico de laboratorio de las infecciones de transmisión sexual, incluida la infección por el
virus de la inmunodeficiencia humana se actualizó usando la misma estructura que se había empleado y probado en
el manual de 1999 creado por Eddie Van Dyck del Instituto de Medicina Tropical, Amberes (Bélgica); André Z. Meheus
de la Universidad de Amberes (Bélgica); y Peter Piot, Director Ejecutivo del Programa Conjunto de las Naciones Unidas
sobre el VIH/SIDA (ONUSIDA). El Departamento de Salud Reproductiva e Investigación (RHR) de la Organización Mundial
de la Salud (OMS) en Ginebra (Suiza) desea manifestar su reconocimiento y gratitud a todos ellos por su visión, y
agradece además el permiso que otorgaron para que se pudiera actualizar el manual a fin de que mantuviese su
importancia mundial al incorporar las nuevas tecnologías y métodos de diagnóstico.
Algunos expertos con amplia experiencia en diferentes campos de la medicina de diagnóstico actualizaron el
documento para procurar recoger la amplia gama de métodos disponibles para el diagnóstico de las infecciones de
transmisión sexual (ITS) y actualizar la información en la medida de lo posible dado que se trata de un campo de la
medicina en constante y rápido cambio. OMS/RHR quisiera agradecer a algunos de estos expertos y sus instituciones
por su dedicación y entusiasmo, que han garantizado la alta calidad y la perspectiva mundial de este documento con
respecto al diagnóstico de las ITS.
Damos las más sinceras gracias a Yaw Adu-Sarkodie, Manju Bala, Ronald Ballard, Alan Herring, Edward W. Hook
III, Catherine Ison, David Mabey, Rosanna Peeling y Magnus Unemo, quienes examinaron el manual de 1999 y
determinaron las áreas que debían modificarse y actualizarse, además de los nuevos capítulos que debía agregarse.
El grupo también propuso la lista de los posibles autores para revisar los capítulos existentes y preparar los nuevos, e
identificaron posibles revisores de los capítulos.
OMS/RHR quisiera agradecer también a los siguientes autores que examinaron las primeras versiones de los capítulos y
luego siguieron trabajando en sus respectivos capítulos hasta que estuvieron listos: Manju Bala, Ronald Ballard, Laurent
Bélec, Fatim Cham, Jo-Anne Dillon, Suzanne Garland, Edward W. Hook III, Catherine Ison, David Lewis, Bharat Parekh,
Rosanna Peeling, Ye Tun, Magnus Unemo y Barbara Van Der Pol. Los siguientes funcionarios del departamento de la
OMS hicieron aportes y sugerencias para la finalización del manual: Nathalie Broutet, Lori Newman e Igor Toskin; y
Francis Ndowa dirigió el proceso de revisión.
OMS/RHR además reconoce y agradece a los restantes autores: Cheng Y. Chen, Dennis Ellenberger, Jørgen Skov
Jensen, John Nkengasong, Stefania Starnino, Larry Westerman y Chunfu Yang por su gran esfuerzo y por el
considerable tiempo que dedicaron para que los capítulos fueran de la mayor calidad posible.
OMS/RHR agradece a las siguientes personas que examinaron los capítulos relacionados con sus respectivos campos
de especialización: Rajesh Bhatia, Xiang-Sheng Chen, Charlotte Gaydos, Monica Lahra, Jérôme Le Goff, Jeanne
Marrazzo, Allan Ronald y Patricia Totten.
OMS/RHR también quisiera reconocer la dedicación de Fatim Cham, quien comprobó las observaciones de los
revisores, recopiló los capítulos y garantizó la armonía de las distintas secciones y anexos.
OMS/RHR aprecia la asistencia brindada por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de Estados
Unidos de América (CDC), en Atlanta (Georgia) para corregir la versión final del manual, al igual que la asistencia
brindada por el equipo de Green Ink (Reino Unido) por el diseño, la maquetación y la lectura de las pruebas de galera de
la versión en inglés.
La traducción al español fue realizada por la Organización Panamericana de la Salud / Organización Mundial de la
Salud.
Agradecimientos xi
xii Diagnóstico de laboratorio de las infecciones de transmisión sexual, incluida la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana
Capítulo 1
Elección de las pruebas diagnósticas de las infecciones de

transmisión sexual
1.1 Introducción de la sensibilidad a los antibióticos. Algunos de estos

elementos clave se describen a continuación:
El grupo de las infecciones de transmisión sexual (ITS)
debe su nombre a la forma de transmisión de más de • Vigilancia. La vigilancia es la recopilación
30 microorganismos patógenos bacterianos, virales y sistemática, comparación y análisis de datos para
parasitarios. Desde el punto de vista epidemiológico, el determinar la frecuencia de una infección en una
contacto sexual es su principal forma de transmisión, comunidad o población. Es un elemento esencial de la
aunque algunos de ellos se pueden adquirir por otra vía planificación para las iniciativas de control de las ITS.
distinta a la sexual (cuadro 1.1). No se otorgará una prioridad elevada a la inversión
en la vigilancia de las infecciones poco comunes o
Las pruebas de laboratorio y las pruebas diagnósticas
de aquellas con escasa repercusión directa sobre
en el punto de atención contribuyen en gran medida al
la salud pública si los recursos son limitados, si la
manejo y el control de las ITS al facilitar la prevención
infección es poco frecuente (por ejemplo, el chancro
de la transmisión y sus secuelas. La elección de las
blando, en particular en países desarrollados) o si la
pruebas diagnósticas idóneas resulta difícil debido
morbilidad es moderada (por ejemplo, las ladillas).
al gran número de infecciones de transmisión sexual
En general, el tiempo necesario para obtener el
y a la diversidad de pruebas posibles para cada una
resultado de una prueba analítica cuya finalidad sea
de ellas. En este momento, se cuenta con una amplia
la vigilancia no es de gran importancia. En algunos
gama de pruebas existentes que tienen características
casos, las muestras recogidas para la vigilancia
y limitaciones potenciales que podrían influir en cómo
pueden usarse también para el seguimiento de
utilizarlas para mejorar el control de las ITS. Además,
otros factores clínicamente importantes como la
en una época en la que los recursos son limitados,
resistencia a los antibióticos (por ejemplo, en el caso
resulta difícil tomar una decisión acerca de cuántas
de Neisseria gonorrhoeae).
y cuáles de las infecciones de transmisión sexual
merecen que se invierta en mejorar su detección, a • Validación del manejo sindrómico. El diagnóstico
quién se le deben realizar las pruebas diagnósticas y sindrómico es un elemento valioso en las iniciativas
cuáles de entre las múltiples existentes deben utilizarse de control de las ITS, puesto que proporciona una
para ese fin. La selección de las pruebas debe hacerse evaluación diagnóstica rápida para la elección del
conforme a un proceso de asignación de prioridades tratamiento oportuno de las personas con signos
que tenga en cuenta la prevalencia, la repercusión y las y síntomas de infección. En entornos en los que el
complicaciones de las infecciones en las personas y en diagnóstico sindrómico forma parte de las iniciativas
la población, así como las características de desempeño de manejo de las ITS, deben realizarse pruebas
de las pruebas, su costo y el motivo por el que se analíticas periódicas a los pacientes diagnosticados y
realizan. tratados utilizando algoritmos de manejo sindrómico
para asegurar que el diagnóstico sindrómico consigue
Las pruebas de detección de las ITS pueden tener
identificar las infecciones para las que se ha
diferentes finalidades que, a su vez, afectan a la
proyectado una intervención. En aquellas situaciones
elección de la prueba. Entre los diferentes motivos para
en las que el diagnóstico sindrómico no logra que
realizarlas están la vigilancia, la validación de algoritmos
las ITS seleccionadas reciban tratamiento, se debe
de manejo sindrómico, la garantía de la calidad, el
evaluar las razones de dicho fracaso. La información
diagnóstico de las personas con signos y síntomas
obtenida mediante la realización periódica de pruebas
de posible ITS, la detección sistemática o cribado de
de evaluación de la calidad de los servicios clínicos
las personas asintomáticas vulnerables y el estudio
puede ser útil para la retroalimentación y para
Elección de las pruebas diagnósticas de las infecciones de transmisión sexual 1

Cuadro 1.1: Principales microorganismos patógenos de transmisión sexual y enfermedades que causan
Microorganismo patógeno Manifestaciones clínicas y otras enfermedades asociadas
Infecciones bacterianas
GONORREA
Hombres: secreción uretral (uretritis), epididimitis, orquitis, infertilidad.
Neisseria gonorrhoeae Mujeres: cervicitis, endometritis, salpingitis, enfermedad pélvica inflamatoria,
infertilidad, ruptura prematura de membranas, perihepatitis; generalmente
asintomática.
INFECCIÓN POR CLAMIDIAS
Hombres: secreción uretral (uretritis), epididimitis, orquitis, infertilidad.
Mujeres: cervicitis, endometritis, salpingitis, enfermedad pélvica inflamatoria,
Chlamydia trachomatis infertilidad, ruptura prematura de membranas, perihepatitis; generalmente
asintomática.
Ambos sexos: proctitis, faringitis, síndrome de Reiter.
Recién nacidos: conjuntivitis, neumonía.
Chlamydia trachomatis LINFOGRANULOMA VENÉREO
(serotipos L1–L3) Ambos sexos: úlcera, tumefacción inguinal (bubón), proctitis.
SÍFILIS
Ambos sexos: úlcera primaria (chancro) con adenopatía local, erupciones
Treponema pallidum cutáneas, condiloma lata; daños neurológicos, cardiovasculares y esqueléticos.
Mujeres: pérdida de embarazos (aborto, mortinato), parto prematuro. Recién
Nacidos: mortinato, sífilis congénita.
CHANCRO BLANDO
Haemophilus ducreyi
Ambos sexos: úlceras genitales dolorosas; a veces con bubón.
DONOVANOSIS (GRANULOMA INGUINAL)
Ambos sexos: inflamación nodular y lesiones ulcerosas de la zona inguinal y
Klebsiella
anogenital.
(Calymmatobacterium)
Hombres: secreción uretral (uretritis no gonocócica)
granulomatis
Mujeres: cervicitis, endometritis, probablemente enfermedad pélvica
inflamatoria.
Hombres: secreción uretral (uretritis no gonocócica)
Micoplasma genitalium
Mujeres: cervicitis, endometritis, probable enfermedad pélvica inflamatoria.
Infecciones virales
Virus de la inmunodeficiencia SÍNDROME DE INMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA (sida)
humana (VIH) Ambos sexos: Enfermedades relacionadas con el VIH, sida.
Virus del herpes simple de tipo 2 HERPES GENITAL
Virus del herpes simple de tipo 1 Ambos sexos: lesiones vesiculares y ulceraciones anogenitales.
(menos frecuente) Recién Nacidos: herpes neonatal (a menudo mortal).
VERRUGAS GENITALES
Hombres: verrugas peneanas y anales; carcinoma de pene.
Virus de los papilomas humanos Mujeres: verrugas vulvares, anales y cervicouterinas, carcinoma cervicouterino,
carcinoma vulvar, carcinoma anal.
Recién nacidos: papiloma laríngeo.
2 Diagnóstico de laboratorio de las infecciones de transmisión sexual, incluida la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana
Cuadro 1.1: Principales microorganismos patógenos de transmisión sexual y enfermedades que causan
(continuación)
Microorganismo patógeno Manifestaciones clínicas y otras enfermedades asociadas

Infecciones virales (continuación)
HEPATITIS VIRAL
Virus de la hepatitis B
Ambos sexos: hepatitis aguda, cirrosis hepática, cáncer de hígado.
INFECCIÓN POR CITOMEGALOVIRUS
Citomegalovirus Ambos sexos: fiebre subclínica o inespecífica, tumefacción difusa de los
ganglios linfáticos, hepatopatía, etc.
MOLUSCO CONTAGIOSO
Virus del molusco contagioso Ambos sexos: nódulos cutáneos umbilicados, de consistencia firme; situados en
la zona genital o generalizados.
Herpesvirus asociado al sarcoma
SARCOMA DE KAPOSI
de Kaposi
Ambos sexos: cáncer de gran malignidad en personas con inmunodepresión.
(herpesvirus humano de tipo 8)
Infecciones protozoarias
TRICOMONIASIS
Hombres: secreción uretral (uretritis no gonocócica); a menudo asintomática.
Trichomonas vaginalis Mujeres: vaginosis con flujo vaginal profuso y espumoso; parto prematuro, niños
de peso bajo al nacer.
Recién nacidos: peso bajo al nacer.
Infecciones fúngicas
CANDIDIASIS
Hombres: infección superficial del glande
Candida albicans
Mujeres: vulvo-vaginitis con flujo vaginal espeso similar a cuajada, prurito vulvar
o escozor.
Infestaciones parasitarias
Phthirus pubis Sarcoptes scabiei INFESTACIÓN PUBIANA POR LADILLAS ESCABIOSIS o SARNA
adoptar medidas que permitan mejorar la atención al de factores, entre los que destacan el cambio
paciente. de reactivos, el funcionamiento del equipo y la
competencia técnica.
• Garantía y mejora de la calidad. El gran ámbito
de la garantía de la calidad incluye el control de la En consecuencia, se recomienda realizar pruebas
calidad realizado para asegurar que las pruebas periódicas de muestras control para evaluar la
analíticas están resultando tal como se habían competencia del laboratorio y garantizar la exactitud
diseñado y la evaluación de la calidad llevada a analítica esperada. Estas muestras se pueden
cabo para asegurar que las pruebas se emplean de obtener en organizaciones acreditadas o generar en
manera apropiada y que se están llevando a cabo el propio laboratorio. La evaluación de las muestras
correctamente todos los pasos necesarios para control puede poner de manifiesto la necesidad de
que las pruebas sirvan para prestar asistencia a los capacitar de nuevo al personal o de evaluar la calidad
pacientes. La exactitud de las pruebas analíticas de los componentes individuales de las pruebas de
de las ITS puede verse alterada por una serie laboratorio.

• Diagnóstico. Los síntomas de las ITS más • Determinación de la sensibilidad a los
frecuentes no suelen ser específicos y generalmente antibióticos. En el caso de algunas ITS (N.
la variedad de posibles agentes causales exige gonorrhoeae es un ejemplo digno de mención), la
tratamientos diferentes. Por lo tanto, las pruebas continua aparición de resistencia lleva periódicamente
diagnósticas son útiles para obtener un diagnóstico a modificaciones en el tratamiento recomendado.
certero y para orientar el abordaje de la pareja La vigilancia sistemática de la sensibilidad a los
sexual, así como para el control de la calidad de antibióticos o la realización de antibiogramas a
los algoritmos de manejo sindrómico, como se cepas específicas proporciona información que
mencionó anteriormente. La elección de las pruebas, puede servir para ajustar las recomendaciones
cuando se usan para el diagnóstico, debe tener en de tratamiento con antelación, de ser posible antes
cuenta el tiempo necesario para obtener los resultados de que el fracaso del tratamiento se convierta en un
que orientarán el tratamiento, ya que las personas problema. Es mejor determinar la sensibilidad a los
infectadas pueden transmitir la infección, sufrir antibióticos en cepas clínicas de microorganismos
complicaciones debidas a la propia infección o no cultivados y normalmente se usa más para orientar
presentarse al seguimiento en el intervalo entre el tratamiento recomendado para la población que
la prueba y la notificación de los resultados (1, 2). para el de un paciente en particular. En general,
Cuando las pruebas diagnósticas se realizan como la vigilancia de la resistencia a los antibióticos se
parte de los servicios clínicos, suele ser útil hacer realiza en los laboratorios de referencia con muestras
un seguimiento durante el intervalo entre la prueba recogidas en una serie de lugares geográficamente
y el tratamiento de las personas con resultados representativos y poblaciones de interés.
analíticos positivos como una medida de la calidad
asistencial. 1.2 Tipo de pruebas diagnósticas
• Cribado. La detección sistemática es un El progreso científico ha proporcionado una gran
elemento esencial para mejorar el tratamiento variedad de pruebas para la identificación de las ITS.
y las estrategias de control de las ITS que se Estas pruebas varían enormemente en cuanto a su
basa en las aportaciones del manejo sindrómico complejidad (es decir, los requisitos técnicos para
y las pruebas diagnósticas. Todas las ITS pueden la realización óptima de las mismas), los gastos que
presentarse de forma asintomática o pasar supone realizarlas (tanto materiales como de mano de
desapercibidas en las personas infectadas. A pesar obra) y el desempeño. Por tanto, cada tipo de prueba
de la ausencia de síntomas reconocidos, las personas diagnóstica tiene sus ventajas e inconvenientes.
con infecciones asintomáticas pueden correr el En consecuencia, en algunos entornos, la prueba
riesgo de transmitirlas a otros y de presentar las más exacta puede que no sea la mejor si es tan
complicaciones de la infección. En consecuencia, cara que no puede utilizarse para examinar a un
el cribado (es decir, la realización de pruebas a gran número de personas vulnerables o si la prueba
las personas vulnerables sin signos ni síntomas es tan compleja que los resultados no se obtienen a
visibles) detectará a las personas infectadas, por tiempo para guiar tratamiento del paciente. Por último,
lo que disminuirá el riesgo de complicaciones o de en algunos casos, las pruebas de laboratorio de las
transmisión de la infección. Al igual que en el caso ITS se comercializan en una variedad de formatos y
de las pruebas diagnósticas, el intervalo entre la plataformas, que determinan el número de pruebas que
prueba y la aplicación del tratamiento, así como la pueden realizarse en un tiempo dado. Por lo tanto,
proporción de personas que lo reciben, si algunas la producción o capacidad analítica (el número de
no se han presentado al seguimiento, constituyen pruebas realizadas en un tiempo dado) también debe
mediciones útiles de la calidad. La detección tenerse en cuenta a la hora de elegir las pruebas.
sistemática de las ITS será más costoeficiente si En algunos entornos, volúmenes mayores o menores
se dirige a subgrupos de riesgo de la población, lo de pruebas harán que algunas pruebas o sistemas
que suele conseguirse mejor si se usan los datos de analíticos sean preferibles. En general, las pruebas
vigilancia. diagnósticas se agrupan en al menos tres tipos
diferentes. En primer lugar, la detección directa de
los propios microorganismos es el método más obvio
para el diagnóstico de las ITS y se realiza mediante Por el contrario, las otras pruebas de laboratorio,
el examen microscópico de una tinción o el examen como el cultivo o la prueba de amplificación de
en fresco para visualizar los microorganismos ácidos nucleicos, pueden exigir métodos especiales
patógenos. Por otro lado, el cultivo, la detección del para el transporte de las muestras y un equipo y
antígeno o la detección de ácidos nucleicos mediante procedimientos especializados para el desempeño
pruebas de amplificación o no de ácidos nucleicos son óptimo, lo que supone un retraso en la obtención de
a menudo más sensibles que la microscopia, pero las los resultados necesarios para tomar las decisiones de
exigencias técnicas para una realización óptima son tratamiento inmediato.
más complejas y el intervalo entre la realización El segundo tipo de pruebas diagnósticas se centra en
de la prueba y la obtención de los resultados más la detección de la respuesta del huésped a la infección
largo (las pruebas diagnósticas rápidas en el punto (anticuerpos), que en el caso de muchas ITS graves (la
de atención ayudan a superar esta última posible sífilis y el VIH son ejemplos frecuentes) es la prueba
limitación). Cada uno de estos métodos tiene sus diagnóstica preferida. La ventaja de las pruebas
ventajas e inconvenientes. La microscopia, en particular serológicas es que pueden ser útiles no solo para el
cuando se realiza mientras los pacientes están diagnóstico sino también para la vigilancia. Todas
presentes, puede proporcionar resultados inmediatos las pruebas serológicas tienen de vez en cuando
para orientar las decisiones de tratamiento pero, como resultados positivos falsos. El problema de los
las otras pruebas, requiere un equipo especializado positivos falsos a menudo se soluciona analizando con
(microscopio), una conexión eléctrica y procedimientos una segunda prueba serológica de confirmación de las
de tinción especiales, y el resultado depende de la muestras que dieron un resultado positivo en el cribado
capacitación y la experiencia del microscopista. inicial, pero en este caso la prueba estará dirigida
Cuadro 1.2: Efecto de la prevalencia, la especificidad y la sensibilidad analíticas sobre el valor predictivo
positivo, utilizando solo pruebas básicas u otras pruebas complementarias,
Prevalencia en la población = 1%
A B C D E
Sensibilidad/especificidad de las
99%/99% 99%/99,9% 99%/99% 99,5%/99,5% 99,5%/99,5%
pruebas básicas
Sensibilidad/especificidad de
las pruebas complementarias/ SD SD 99%/99% ND 99,5%/99,5%
confirmatorias
Número analizado 1.000 1.000 11 1.000 15
Negativos
Número total 980 989 1 985 5
Negativos verdaderos 980 989 1 985 5
Negativos falsos 0 0 0 0 0
Positivos
Total 20 11 10 15 10
Positivos verdaderos 10 10 10 10 10
Positivos falsos 10 1 0 5 0
Valor predictivo positivo (VPP) 50% 91% 100% 67% 100%
SD: sin determinar.

a un antígeno diferente (el recurso a las pruebas valor predictivo de las pruebas de laboratorio. Por lo
confirmatorias se trata con más detalle en la sección tanto, la vigilancia para determinar la prevalencia de las
de pruebas serológicas de la sífilis y el VIH). Algunas enfermedades locales proporciona datos valiosos a la
pruebas serológicas son capaces de diferenciar hora de elegir las pruebas de las ITS.
las infecciones recientes de las más antiguas o las ya
tratadas mediante la detección de la inmunoglobulina 1.4 Tipos y funciones del laboratorio
M (IgM) presente en las infecciones recientes. Uno Aunque el método tradicional para el diagnóstico de
de los inconvenientes del diagnóstico serológico es las ITS ha consistido en realizar análisis clínicos en
que los anticuerpos frente a los patógenos de las el laboratorio que determinan los agentes causales,
ITS pueden persistir mucho tiempo después de no deben realizarse todas las pruebas en todos los
un tratamiento eficaz. De este modo, las pruebas laboratorios para todos los fines. El diagnóstico por el
serológicas realizadas en la población darán una laboratorio de las ITS suele ser costoso en lo que se
indicación del número total de infecciones acumuladas en refiere al equipo, los reactivos, la infraestructura y el
lugar de indicar el número de infecciones contraídas más mantenimiento. Pero el principal problema, concretamente
recientemente. en entornos con recursos limitados, es que no hay
El tercer tipo está integrado por las pruebas que laboratorios para procesar la mayor parte de las muestras
detectan metabolitos microbianos, como las sustancias de los pacientes con ITS (2). Para adaptarse a situaciones
que alteran el pH de las secreciones genitales y las de este tipo en las que no se dispone de laboratorios, la
aminas biógenas. Estas pruebas son complementos Organización Mundial de la Salud elaboró guías sobre el
útiles para el diagnóstico en algunos entornos. Un manejo sindrómico para el tratamiento de algunas ITS
ejemplo claro es la importancia de las pruebas de pH, y viene recomendando su uso desde mediados de los
del “olor a pescado” o de aminas en el diagnóstico de la años ochenta a raíz de la realización de evaluaciones
vaginosis bacteriana. sobre el terreno de su desempeño (3). Posteriormente,
varios estudios sobre el terreno revelaron que el manejo
1.3 Desempeño analítico sindrómico da resultados satisfactorios en el tratamiento
del hombre sintomático con secreción uretral y en el
En último término, el valor de las pruebas para la
tratamiento del hombre y la mujer con ulceras genitales
detección de las ITS también depende en gran medida
bacterianas (4, 5). No es el caso, sin embargo, en el
de su desempeño (cuadro 1.2). En tanto que medida del
diagnóstico y tratamiento de la infección cervicouterina
desempeño, los cálculos de sensibilidad y especificidad
por N. gonorrhoeae o C. trachomatis, excepto en casos
(3) —siempre que dichos cálculos se realicen con
en los que en el examen se observa mucopús, erosiones
muestras suficientemente grandes—representan
y friabilidad del cuello uterino, así como antecedentes
estimaciones fidedignas del desempeño general de las
de sangrado entre menstruo y durante el coito (6). No
pruebas. Sin embargo, los valores predictivos (tanto
obstante, el tratamiento aplicado tras el diagnóstico
positivos como negativos) de estas pruebas pueden
sindrómico tiene la ventaja de ofrecer asistencia sanitaria
variar sustancialmente de una población a otra en
inmediata en el primer punto de atención al que acude
función de la prevalencia de una determinada infección
el paciente en busca de evaluación y es de bajo costo:
en la comunidad.
ni el paciente ni el proveedor de servicio ni el Estado
Por lo tanto, las pruebas con tasas elevadas de incurren en gastos directos de laboratorio. Recurrir al
resultados positivos falsos para las infecciones manejo sindrómico también facilita la normalización del
relativamente poco frecuentes (es decir, prevalencia diagnóstico, el tratamiento y la notificación en un entorno
baja) tendrán un valor predictivo positivo bajo a pesar o situación particular. Los pacientes con sospecha de ITS
de tener una sensibilidad elevada para la detección de la pueden tratarse en centros como los establecimientos
infección. de atención primaria de salud, los consultorios de
planificación familiar y los consultorios de médicos
En general, la bibliografía arbitrada que se encuentra
particulares, así como en los propios consultorios
publicada proporciona estimaciones fiables de la
especializados en ITS (7). Inevitablemente, puede ocurrir
sensibilidad y especificidad de las pruebas. Sin embargo,
que con el manejo sindrómico se diagnostique y trate
en cualquier entorno específico, la prevalencia de
en exceso a pacientes que no estén infectados por los
enfermedades locales determinará parcialmente el
supuestos microorganismos causales del síndrome en En este manual se describen métodos analíticos que
cuestión (8). van desde los más básicos y de bajo costo a los más
complejos y caros.
Por consiguiente, con objeto de apoyar el enfoque
sindrómico para el diagnóstico, debe alentarse a los Los directores de programas y los analistas de
laboratorios clínicos locales a que realicen las pruebas laboratorio, en colaboración con las instancias
necesarias para facilitar el abordaje clínico de las normativas, deben determinar la factibilidad y la
personas vulnerables y con riesgo de ITS. En algunos utilidad de incorporar pruebas de laboratorio en los
entornos en los que el transporte de muestras no diferentes niveles de los establecimientos de asistencia
es complicado, las economías de escala hacen que el sanitaria. La elección también dependerá de si en estos
procesamiento de muestras en laboratorios centrales sea diferentes niveles se usa el manejo sindrómico (básico
tan oportuno y más eficiente que la tentativa de realizar o modificado), el etiológico o ambos.
los análisis en laboratorios locales.
1.5 Vista de conjunto
No todos los laboratorios necesitan llevar a cabo prácticas
analíticas de un laboratorio de la referencia como el No existe una única prueba óptima para la detección
antibiograma. de los agentes que causan las ITS. Para la toma de
decisiones programática, deben tenerse en cuenta
Los laboratorios pueden clasificarse arbitrariamente en las múltiples ITS y poblaciones afectadas como una
tres niveles basados en el grado de atención y servicios matriz para guiar no solo qué prueba de laboratorio
de tratamiento prestados por cada categoría. Sin es la más adecuada para la comunidad en cuestión,
embargo, debe tenerse presente que la infraestructura sino también qué proporción de los recursos totales
de laboratorio y la capacidad de diagnóstico varían disponibles (presupuesto, personal, etc.) debe
mucho de los países con recursos limitados a asignarse para analizar cada ITS (cuadro 1.3).
los industrializados. Las siguientes categorías se
consideran una orientación general: Las decisiones relativas a la elección de las pruebas
deben tomarse dentro del marco de prevalencia
1. Laboratorios periféricos que dan apoyo a los de la infección en cuestión, su repercusión en la
servicios de atención primaria de salud, tienen poco
Cuadro 1.3: Factores potenciales que influyen en la
material de laboratorio y la capacitación del personal
elección de las pruebas para las ITS
es mínima. Estos laboratorios están diseñados para
proporcionar un diagnóstico rápido en el lugar en el 1. Finalidad de la prueba
que se presta la asistencia sanitaria de las ITS.
• Vigilancia
2. Laboratorios de nivel intermedio que dan apoyo a los • Garantía de la calidad
• Evaluación del diagnóstico sindrómico
laboratorios de los servicios de atención primaria de
• Diagnóstico
salud y a los consultorios y hospitales de atención
• Cribado
intermedia o de distrito. • Antibiograma
3. Laboratorios de nivel central que dan apoyo a los 2. Consideraciones específicas de las pruebas
consultorios de atención terciaria de salud, incluidos • Desempeño (sensibilidad, especificidad, valor
los consultorios especializados de referencia de las predictivo)
ITS así como los laboratorios de los consultorios de • Toma de muestras, transporte y conservación y
atención de salud de nivel inferior y los consultorios. requisitos de transporte
• Prevalencia
Aunque las pruebas diagnósticas rápidas en el punto • Morbilidad asociada
de atención pueden carecer de sensibilidad, las • Recursos
características de especificidad son generalmente • Aspectos financieros
buenas y resultan económicas para el tratamiento de • Personal
algunos síntomas como el flujo vaginal en el nivel de • Infraestructura (servicios públicos, etc.)
atención de salud periférico. • Importancia relativa entre otras prioridades

comunidad, los recursos existentes para los análisis 3. Kuypers J, Gaydos CA, Peeling RW. Principles of
y el tratamiento, y la asignación de prioridad a esa laboratory diagnosis of STIs. In: Holmes KK et al., eds.
Sexually transmitted diseases, 4th ed. New York, McGraw-
infección en el contexto de otras ITS. Hill Medical, 2008:937–958.
Además, al elegir las pruebas diagnósticas, es también 4. Adler MW et al. Sexual health and care: sexually
fundamental la consideración de algunos factores transmitted infections: guidelines for prevention and
treatment. [Occasional paper]. Londres, ODA, 1996.
como la complejidad, el tiempo para obtener los
resultados y el costo. Se ha demostrado claramente con 5. Management of patients with sexually transmitted
modelos matemáticos que, en situaciones y entornos diseases. Ginebra, Organización Mundial de la Salud, 1991
(OMS, Serie de Informes Técnicos, No. 810).
en los que se dispone de los resultados en el momento
de la evaluación inicial del paciente y en los que 6. Alary M et al. Evaluation of clinical algorithms for the
puede haber una demora para que el paciente reciba diagnosis of gonococcal and chlamydial infections
among men with urethral discharge or dysuria and
el tratamiento si no se le da en el momento de la women with vaginal discharge in Benin. Sexually
evaluación, las pruebas menos sensibles proporcionadas Transmitted Infections, 1998, 74(Suppl. 1):S44–49.
inmediatamente pueden, en realidad, aumentar el número
7. Moherdaui F et al. Validation of national algorithms for
de personas tratadas y reducir las complicaciones de the diagnosis of sexually transmitted diseases in Brazil:
la infección en comparación con las pruebas más results from a multicentre study. Sexually Transmitted
sensibles que requieren más tiempo para la obtención Infections, 1998, 74(Suppl. 1):S38–43.
de los resultados (2). 8. Vuylsteke B. Current status of syndromic management
of sexually transmitted infections in developing
1.6 Referencias countries. Sexually Transmitted Infections, 2004,
80(5):333–334.
1. Geisler WM et al. The natural history of untreated
Chlamydia trachomatis infection in the interval between
screening and returning for treatment. Sexually
Transmitted Diseases, 2008, 35(2):119–123.
2. Gift TL et al. The rapid test paradox: when fewer cases

detected lead to more cases treated: a decision
analysis of tests for Chlamydia trachomatis. Sexually
Capítulo 2
Gestión de la calidad en los laboratorios
2.1 Introducción
La finalidad de un sistema de calidad es procurar que A fin de facilitar la comprensión, en el cuadro 2.1 se
todos los informes producidos por el laboratorio que definen los términos que se utilizan en este capítulo.
orientarán el tratamiento de los pacientes sean de alta
La acreditación es un procedimiento lento y costoso que
calidad. A fin de mantener un servicio de alta calidad,
muchos laboratorios no logran llevar a buen puerto,
los laboratorios deben tener un programa de mejora de
aunque todos los laboratorios deberían intentar mejorar
la calidad y estar acreditados por un organismo
los procedimientos que afectan la exactitud de la
nacional o internacional apropiado, como la
información que guía el tratamiento de los pacientes. En
Organización Internacional de Normalización (www.iso.
muchas partes del mundo, se han puesto en marcha
org). La acreditación consiste en una auditoría externa
sistemas para fortalecer los laboratorios por medio de
de la capacidad de prestar un servicio de alta calidad al
la ejecución gradual de mejoras sobre la base de una
establecer una norma definida de práctica confirmada
lista de verificación (1–5).
por medio del arbitraje. Sin embargo, no incluye evaluar
la idoneidad de la prueba elegida para el diagnóstico de
la infección específica o para la población que se
someterá a la prueba (véase el capítulo 1).
Cuadro 2.1: Definición de los términos principales que se emplean en el capítulo sobre gestión de la calidad
Auditoría externa de los procedimientos de laboratorio que contribuye a que los informes
Acreditación
sean de buena calidad.
Control de calidad interno Se usa para detectar problemas o fallas en uno o varios reactivos mediante una prueba.
Procedimientos Operativos
Normas sobre el control de sustancias peligrosas para la salud.
Estándares
Proceso amplio y sistemático en el que se comparan diferentes sistemas concebidos para
Evaluación de pruebas
cumplir la misma función o funciones similares.
Evaluación externa de la Permite introducir muestras de una fuente independiente cuyo contenido se conoce, pero
calidad no se divulga, en el procedimiento de prueba ordinario de un laboratorio.
Consiste en someter nuevamente a prueba diversas muestras clínicas anónimas
Evaluación interna de la
y seleccionadas aleatoriamente dentro del mismo laboratorio para asegurar la
calidad
reproducibilidad de los resultados.
Proceso sistemático a fin de garantizar el cumplimiento de los requisitos de calidad con
Garantía de la calidad
respecto a un producto o servicio.
Documento en el que se describe en detalle el procedimiento específico para cada
Procedimiento normalizado protocolo o prueba que se utiliza en el laboratorio. La finalidad de estos procedimientos
de trabajo es garantizar que las operaciones se realicen correctamente y siempre de la misma
manera, y deben estar disponibles en el laboratorio en todo momento.
Sistema de gestión de la Marco para adoptar un enfoque sistemático de gestión de la calidad en los
calidad procedimientos de laboratorio.
Sirve para examinar el proceso completo que se está usando a fin de verificar que los
Validación de pruebas
resultados sean correctos.
Gestión de la calidad en los laboratorios 9

2.2 Gestión de la calidad de seis a ocho veces al año— a fin de tratar todos
los asuntos pertinentes, como las finanzas, la
El sistema de garantía de la calidad debe establecerse
administración, la dotación de personal, el equipo,
en un manual que describa el sistema de gestión del
la evaluación interna y externa de la calidad, la
laboratorio. Este manual sirve para informar a la propia
acreditación y cualquier otro asunto que afecte
dirección y al personal del laboratorio, y para suministrar
la prestación del servicio de laboratorio. Deben
información a los clientes de los servicios de laboratorio,
redactarse actas de estas reuniones en las que se
además de los organismos de acreditación.
incluyan las medidas a tomarse, que luego deben
examinarse en reuniones posteriores.
Organización y gestión
El laboratorio debe contar con una estructura orgánica • Reuniones de todo el personal: deben asistir todas
en la que se definan claramente las funciones y las las categorías de personal del laboratorio. Este grupo
responsabilidades de cada persona. Generalmente se debe reunirse al menos ocho veces al año para
utiliza una estructura jerárquica encabezada por un tratar los asuntos pertinentes, como las finanzas,
director o jefe de departamento, con jefes de sección o la administración, la dotación de personal, la
de unidad, un gerente de laboratorio y un conjunto de bioseguridad, la acreditación y cualquier otro asunto
técnicos especializados en las diferentes áreas. Debe que se plantee. Deben redactarse actas de estas
haber un responsable de la calidad, que puede ser una reuniones con medidas a tomarse, que luego deben
función de tiempo completo o parte de una descripción examinarse en reuniones posteriores.
de puesto más amplia. El manual de calidad debe incluir
• Reuniones de gestión de la bioseguridad: deben
un organigrama de las funciones de las personas y la
contar con la presencia del director o el jefe del
línea jerárquica de la que dependen, al igual que una
laboratorio, el gerente del laboratorio, el funcionario
descripción de sus responsabilidades. Cada miembro del
responsable de la seguridad del laboratorio, el
personal debe tener una descripción de puesto detallada,
funcionario adjunto a cargo de la seguridad, los jefes
que debe examinarse anualmente.
de sección, un representante del personal, y el asesor
de salud y seguridad (de haberlo). Este grupo debe
Capacitación y matriculación del personal
reunirse cada seis meses o según sea necesario. Las
• Todo el personal del laboratorio debe capacitarse actas de estas reuniones deben ser de libre acceso
apropiadamente y matricularse, donde sea posible, y deben colocarse en la cartelera de anuncios y
en un organismo nacional; además debe recibir noticias del laboratorio.
capacitación con respecto a todos los métodos que
empleará en su trabajo diario y debe verificarse su • Reuniones anuales de gestión: deben celebrarse
competencia de manera sistemática. Debe llevarse reuniones anuales de gestión y deben prepararse
un registro de capacitación para cada funcionario. informes para examinar todos los aspectos del
El personal también debe capacitarse de manera desempeño del laboratorio y el servicio que
constante para mantener su pericia y competencia. proporciona a sus clientes.
La auditoría de los procedimientos que se emplean
en el laboratorio debe formar parte de un sistema que Procedimientos normalizados de trabajo
garantice una buena calidad y, además, es necesaria All procedures used within the laboratory should be
para la acreditación. Las funciones individuales deben documented as SOPs and are critical in reducing
contar con el apoyo de las siguientes reuniones de errors in variation in testing. The principle details of the
distintos grupos dentro del laboratorio: reagents and methodology, including internal controls
and interpretative criteria, should be included. SOPs
• Reuniones de la gerencia o de los funcionarios
should be written by individuals performing the method/
superiores: deben contar con la presencia del director
test and authorized by a senior member of staff. SOPs
o el jefe del laboratorio, el gerente de laboratorio,
should cross-reference to risk assessments and safety
los jefes de sección, el gerente de garantía de la
information (chemical and biological COSHH) and
calidad, el funcionario responsable de la bioseguridad
should be reviewed and updated. No procedure should
del laboratorio y el asistente del director. Este grupo
be undertaken in the laboratory without SOPs being
debe reunirse de manera periódica —habitualmente
in place and readily accessible in the laboratory for Por ejemplo, las evaluaciones en el campo de la
daily use. SOPs should be reviewed regularly, checked microbiología incluyen la comparación de distintos
and authorized by senior technical staff as part of the métodos diseñados para detectar el mismo marcador
laboratory QMS. In some countries, local SOPs can be o diana, la comparación de diferentes medios
informed by national SOPs. de cultivo para aislar el mismo organismo o la
comparación de distintos instrumentos con la misma
Todos los procedimientos empleados en el laboratorio
función. Los resultados de la evaluación deben
deben estar documentados como procedimientos
transmitirse a las partes interesadas, por ejemplo,
normalizados de trabajo, fundamentales para reducir
mediante la publicación. En caso de que dos estuches
los errores y las variaciones en las pruebas. Debe
tengan características de desempeño equivalentes,
incluirse la información principal sobre los reactivos y
podría preferirse el que sea más fácil de usar, más
la metodología, incluidos los controles internos y los
barato, más rápido o que requiera una muestra que
criterios de interpretación. Estos procedimientos deben
sea más fácil de obtener.
ser redactados por las personas que emplean el método
o realizan la prueba, y aprobados por un funcionario • La validación se usa para examinar el proceso
superior. Los procedimientos deben remitir a las completo que se está usando a fin de verificar que
evaluaciones del riesgo y la información de bioseguridad los resultados sean correctos. Cada laboratorio
(normas sobre el control de sustancias peligrosas para debe validar su capacidad de lograr resultados
la salud de tipo químico y biológico), y deben examinarse aceptables con el método o sistema en cuestión.
y actualizarse regularmente. No debe emprenderse Para documentar esa capacidad, cada laboratorio
ningún procedimiento en el laboratorio sin que los debe crear un archivo de validación de cada método o
procedimientos estén en su sitio, fácilmente accesibles sistema. Ese archivo debe incluir una serie de datos y
para su uso diario. Estos procedimientos deben ser tener un énfasis distinto si el laboratorio está usando
examinados, comprobados y autorizados por los técnicos un sistema comercial o ha desarrollado un sistema
superiores de manera periódica como parte del sistema internamente. Normalmente, el archivo incluiría
de gestión de la calidad del laboratorio. En algunos secciones como los datos de evaluación, las pruebas
países, los procedimientos normalizados de trabajo en muestras conocidas, vademécums, publicaciones
a nivel local pueden basarse en los procedimientos pertinentes, datos de control de calidad en curso, los
establecidos a nivel nacional. procedimientos normalizados de trabajo pertinentes,
los logaritmos de error y las quejas de clientes.
La evaluación y validación de las pruebas es esencial
en todo laboratorio a fin de proporcionar una valoración El propósito de la validación es aportar
basada en la evidencia de la capacidad de desempeño documentación que indique que una prueba
de una prueba antes de que se la incorpore en el servicio diagnóstica o un aparato están funcionando de
que se ofrece. acuerdo con las especificaciones del fabricante. Esto
puede incluir los resultados de experimentos para
• La evaluación es un proceso sistemático y amplio en
determinar su exactitud, sensibilidad, fiabilidad y
el que se comparan diferentes sistemas concebidos
reproducibilidad. Una validación puede ser amplia (por
para cumplir la misma función o funciones similares.
ejemplo, para validar un método interno recién
desarrollado) o de un alcance más reducido (por
Evaluación de la calidad Control de la calidad
Evaluación Evaluación Evaluación y Control interno Evaluación y

interna externa validación de de la calidad seguimiento del
de la calidad de la calidad pruebas equipo
Figura 2.1
Distintos elementos que contribuyen a la garantía de calidad

ejemplo, para validar un método comercial que ya control del aislamiento de ácidos nucleicos, un control
está en uso y ha tenido modificaciones menores). de amplificación, un control de contaminación y un
control de inhibiciones. Esto evitará que las reacciones
En el caso de los métodos que ya se encuentran en
en cadena de la polimerasa arrojen resultados negativos
uso, pero para los cuales no se cuenta con ninguna
falsos al detectar la falla de uno o varios reactivos, de la
validación específica, es importante proporcionar
amplificación, del ciclado térmico o de la inhibición de la
pruebas documentadas que justifiquen su uso.
amplificación.
Generalmente basta con preparar un archivo basado
en datos históricos, como resultados de En el caso de las pruebas serológicas, deben hacerse a
comparaciones u otros estudios realizados, copia de diario pruebas de las muestras de control de la calidad
estudios publicados, evaluaciones internas y externas e incluir tanto el control interno de calidad suministrado
de la calidad, resultados del control interno de con el estuche como muestras externas de control de
calidad, etc. De ser apropiado, se puede hacer la calidad, donde estén disponibles, y deben hacerse
referencia a los registros de trabajo en el informe de las pruebas con ellas de la misma manera que con las
validación. muestras que provienen de pacientes. Debe establecerse
el rango de estas muestras de control de la calidad
Garantía de la calidad para cada laboratorio usando al menos 20 mediciones
La garantía de la calidad es un aspecto fundamental a lo largo de un período; luego deben calcularse los
para la labor del laboratorio, para mantener la calidad valores medios, la desviación estándar y el coeficiente
del servicio y para procurar que los resultados sean de variación. Debe prepararse un diagrama de Levey-
exactos y reproducibles. La exactitud es la cercanía Jennings para cada control y compararse los resultados
entre el valor medio obtenido a partir de una serie de de control de calidad de cada serie. Las comparaciones
resultados de pruebas y un valor aceptado de referencia, deben estar dentro de las dos desviaciones estándares y
y la reproducibilidad es la capacidad de producir no deben informarse los resultados si el valor de control
esencialmente el mismo resultado de diagnóstico de la calidad es superior a tres desviaciones estándares.
independientemente de variaciones en cuanto al técnico, Estos diagramas deben examinarse regularmente para
el lote de prueba, el laboratorio o el equipo auxiliar comprobar que no se estén registrando resultados o
validado. tendencias anormales. Se debe establecer un nuevo rango
para cada nuevo lote de reactivo de control de calidad.
La garantía de la calidad está compuesta por dos
elementos principales: la evaluación de la calidad,
Evaluación y seguimiento del equipo
tanto interna como externa, y el control de la calidad,
que abarca la evaluación y validación de pruebas, el En todos los laboratorios es fundamental controlar
control interno de calidad y la evaluación del equipo y su el funcionamiento del equipo en forma sistemática
seguimiento (fig. 2.1). y registrar los datos obtenidos (6). Para ello se debe
mantener un inventario del equipo, que se debe
Control de la calidad examinar regularmente. Se deben controlar los gabinetes
de seguridad microbiológica y se debe registrar
El control interno de la calidad sirve para detectar
semanalmente el flujo de aire; además se debe registrar
problemas o fallas en uno o varios reactivos mediante
a diario la temperatura de todas las incubadoras, los
una prueba. Por ejemplo, en el caso de los sistemas de
baños de agua, los refrigeradores y congeladores.
cultivo, puede usarse una o varias cepas de referencia
Cualquier falla debe ponerse en conocimiento del gerente
comprobadas para asegurar que los medios sirven de
soporte para el crecimiento del organismo deseado y, de laboratorio.
si se trata de un medio selectivo, que además inhiben
el crecimiento de los organismos innecesarios. Esto Evaluación de la calidad
permitirá detectar la ausencia o la concentración Evaluación interna de la calidad
inadecuada de un factor de crecimiento o agente selectiv
La evaluación interna de la calidad se realiza al someter
En el caso del análisis molecular, el control interno nuevamente a prueba una serie de muestras clínicas
de la calidad debe incluir un muestreo de control, un anónimas seleccionadas al azar dentro del mismo
laboratorio a fin de garantizar la reproducibilidad de La evaluación externa de la calidad proporciona varios
los resultados. Todas las muestras sometidas para beneficios al laboratorio:
evaluar internamente la calidad deben pasar por el
• brinda al personal una apreciación del desempeño del
procedimiento habitual y no deben recibir ningún tipo
laboratorio;
de tratamiento especial. Para que suministre tanto
información útil como pertinente, la evaluación interna • compara el desempeño del laboratorio con el de otros
de la calidad se realiza regularmente para todos los laboratorios en el ámbito nacional o internacional;
tipos de muestras. Las muestras son seleccionadas
por un miembro capacitado del personal, que no debe • mejora la norma de los exámenes;
ser la misma persona que hará la prueba. La selección
• determina posibles áreas problemáticas;
debe ser aleatoria para prevenir el sesgo y deben
reintroducirse en el sistema de laboratorio de la misma • demuestra a los clientes, los colegas y los
manera que las muestras normales. organismos de acreditación que hay un compromiso
con la calidad;
El número de muestras y la frecuencia de las pruebas
dependerán del número total de muestras que se • educa al personal al proporcionar una mejor
reciban, pero se sugiere que aproximadamente 1% de comprensión de la repercusión de los resultados
las muestras sean sometidas nuevamente a las pruebas incorrectos.
de manera mensual.
Procesamiento de las muestras:
Los resultados deben ser compilados y comparados por
una persona independiente; toda discrepancia debe ser 1. Las muestras deben ser reconstituidas lo antes
investigada y, de ser necesario, debe repetirse la prueba. posible. Esto debe realizarse en un gabinete de
bioseguridad microbiológica de clase 1 dado que
Evaluación externa de la calidad posiblemente se desconozca el riesgo.
La evaluación externa de la calidad se realiza por medio 2. La prueba o el procedimiento solicitado debe
de baterías de pruebas de competencia de proveedores realizarse según los procedimientos normalizados
como el Servicio Nacional de Evaluación Externa de de trabajo.
la Calidad del Reino Unido (http://www.ukneqas.org.
uk), Quality Assessment International (http://qasidirect. 3. Toda muestra residual debe almacenarse hasta que
COM), el Colegio de Patólogos Estadounidenses (org se conozcan los resultados para que se pueda
http://www.cap.) o el programa australiano de garantía repetir la prueba en caso de que haya alguna
de la calidad (http://www.rcpaqap.com.au), o por medio discrepancia.
del intercambio de muestras entre laboratorios de 4. Cuando se reciben los resultados del proveedor
referencia a fin de evaluar una amplia gama de técnicas externo (evaluador externo), deben registrarse y
y análisis realizados en el laboratorio clínico. documentarse para conocer el desempeño del
La evaluación externa de la calidad debe estar a laboratorio.
cargo de personal especializado con la capacitación 5. Toda falla o discrepancia debe investigarse
correspondiente y en ella se debe seguir, en la medida repitiendo la prueba.
de lo posible, las prácticas habituales del laboratorio.
Como generalmente las muestras de la evaluación 6. Los resultados deben ser examinados por un
externa de la calidad son fácilmente reconocibles, existe funcionario técnico con experiencia y deben ser
la posibilidad de que se las manipule de una manera que transmitidos al personal de laboratorio, incluidos los
exceda los procedimientos normales de laboratorio, por éxitos y los fracasos, para permitir un análisis
ejemplo, haciendo que sean manipuladas por miembros cabal.
del personal superior, repitiendo la prueba, etc., por
lo que deben adoptarse medidas para evitar que esto
suceda.

2.3 Indicadores de la calidad 2.4 Referencias
Los laboratorios deben considerar la posibilidad de 1. Dobbs T et al. A comprehensive evaluation of the
proficiency testing program for the HIV-1 BED
establecer indicadores que reflejen la calidad de sus
incidence assay. Journal of Clinical Microbiology, 2011,
resultados. Las metas con respecto al tiempo de las 49(10):3470–3473.
pruebas pueden usarse para intentar reducir al mínimo el
2. Alemnji GA et al. Strengthening national laboratory
plazo desde que se toma una muestra hasta que el health systems in the Caribbean Region. Global Public
paciente recibe los resultados. Health, 2012, 7(6):648–660.
3. Nkengasong JN et al. Laboratory systems and

• Un sistema de control de la calidad es crucial services are critical in global health: time to end the
neglect? American Journal of Clinical Pathology, 2010,
para mejorar y mantener la exactitud y la 134(3):368–373.
reproducibilidad de los resultados producidos
por un laboratorio. 4. Yao K et al. Improving quality management systems
of laboratories in developing countries: an innovative
• Todos los laboratorios deben esforzarse training approach to accelerate laboratory accreditation.
por mejorar calidad y trabajar para lograr la American Journal of Clinical Pathology, 2010,
acreditación. 134(3):401–409.
• Se debe contar con una estructura orgánica y 5. Westerman LE et al. A quality management systems
approach to CD4 testing in resource-poor settings.
reuniones ordinarias de diferentes niveles del
American Journal of Clinical Pathology, 2010,
personal para examinar el sistema de calidad 134(4):556–567.
del laboratorio.
6. Fonjungo PN et al. Laboratory equipment maintenance:
• La evaluación y validación de pruebas es A critical bottleneck for strengthening health systems
esencial para aportar una base de datos in sub-Saharan Africa. Journal of Public Health Policy,
probatorios antes de que las pruebas se usen 2012, 33:34–45.
en el laboratorio.
• La garantía de la calidad abarca el control y la
evaluación de la calidad.
• Los laboratorios deben usar indicadores para
vigilar la calidad de sus pruebas de laboratorio.
Capítulo 3
Micoplasmas genitales
3.1 Introducción
“Micoplasmas” es el nombre común con que se En consecuencia, los ureaplasmas y M. hominis se
designa a las bacterias de la clase Mollicutes. Los deben considerar principalmente como comensales
micoplasmas son bacterias de vida independiente y cuando se detectan en el tracto genital inferior. Sin
tamaño muy pequeño, generalmente entre 0,3 y 0,5 embargo, estos micoplasmas se consideran como una
mµ. Carecen de la pared celular rígida presente en causa de enfermedades extragenitales en pacientes con
otras bacterias, característica que los hace resistentes deficiencias de células B (hipo y agammaglobulinemia) y
a las penicilinas y otros antibióticos relacionados. en lactantes prematuros (5).
M. genitalium y M. hominis, y las dos especies de
ureaplasmas U. urealyticum (previamente conocido como M. genitalium se ha asociado de manera estrecha y
U. urealyticum, biovariedad 2) y U. parvum (previamente uniforme con uretritis no gonocócica (UNG) en más
conocido como U. urealyticum, biovariedad 1) se de 30 estudios, y se ha detectado en la uretra de
encuentran generalmente en el aparato genitourinario 15% a 25% de los hombres con UNG sintomática
humano. Es importante señalar que antes de que en comparación con aproximadamente 5% a 10%
U. urealyticum y U. parvum fueran reconocidos como de los que no tienen esta enfermedad (1). En aquellos
especies distintas, se les designaba a ambos como estudios que evaluaron la asociación con la UNG no
U. urealyticum, lo que dificulta la interpretación de los causada por clamidias (UNGNC), la asociación fue en
resultados de estudios anteriores. En el cuadro 3.1 se general más estrecha, lo que indica que M. genitalium
muestran las asociaciones mórbidas. y C. trachomatis actúan como causas separadas
de UNG. En varios estudios, M. genitalium se ha
En los estudios poblacionales, M. genitalium se
encontrado en más de un tercio de los hombres
observa en 1% a 3% de los hombres y mujeres
con UNGNC (1). En las poblaciones que acuden a los
sexualmente activos. Los ureaplasmas se pueden
consultorios por infecciones de transmisión sexual (ITS),
encontrar en el cuello uterino o la vagina de
aproximadamente 90% de los hombres infectados por
40% a 80% de las mujeres sexualmente activas y
M. genitalium tienen signos microscópicos de uretritis
asintomáticas, y M. hominis en 20% a 50% (1–4).
y casi tres de cada cuatro refieren síntomas (6, 7 ).
Cuadro 3.1: Asociaciones mórbidas de los micoplasmas urogenitales
Asociaciones mórbidasa
Vaginosis Endometritis Infertilidad Transmisión

Especies Uretritis Cervicitis bacteriana o EIP Prematuridad (mujeres) del VIH
M. genitalium ++++ +++ – +++ +/– + +

M. hominis – – ++++ +/– +/– – SD
Ureaplasmas
(sin distinción +/– – +++ SD + +/– SD
de especie)
U. urealyticum + SD SD SD SD SD SD
U. parvum – SD SD SD SD SD SD
SD: sin determinar; EIP: enfermedad inflamatoria pélvica.

a ++++ asociación constante; +++ asociación en la mayor parte de los estudios; + asociación solo en unos pocos estudios; +/– resultados
dispares.
Micoplasmas genitales 15
Varios estudios clínicos han indicado una gran significativamente con la infección por M. genitalium en
correlación entre M. genitalium y la UNG persistente las mujeres (1).
o recurrente, probablemente como consecuencia
de la poca eficacia microbiológica del tratamiento Se ha detectado M. genitalium en el endometrio de 60%
con tetraciclinas. M. genitalium generalmente se de las mujeres con determinaciones positivas en cuello
erradica en menos de un tercera parte de los pacientes uterino, y su presencia en las biopsias de endometrio
infectados tras un tratamiento con dosis habituales de se ha asociado estrechamente con endometritis
histológica y con enfermedad inflamatoria pélvica (EIP)
tetraciclinas (8).
recurrente (13, 14). La presencia de cicatrices tubáricas
M. genitalium se ha encontrado en hasta 41% de los se ha vinculado indirectamente con la infección por
hombres con uretritis persistente o recurrente tras el M. genitalium, ya que se ha observado una proporción
tratamiento con doxiciclina (9, 10). significativamente mayor de mujeres con infertilidad
por causa tubárica que presentan anticuerpos contra la
Más recientemente, se notificó el fracaso del bacteria en comparación con las mujeres con infertilidad
tratamiento tras una dosis única de 1 g de azitromicina por otras causas (15). Se ha detectado M. genitalium en
en 28% de los hombres con UNG por M. genitalium el líquido sinovial de una paciente con artritis reactiva
y este fracaso se correlacionó con la resistencia a los adquirida sexualmente (ARAS) (16) y la experiencia
macrólidos aparecida durante el tratamiento con una clínica indica que es frecuente detectar ARAS después
dosis única en la mayor parte de los pacientes (11). de una UNG por M. genitalium. No obstante, no se
han presentado estudios sistemáticos al respecto ni
En contraposición a la sistematización con la que los
tampoco se ha demostrado nuevamente la presencia de
estudios asocian M. genitalium con la UNG, la influencia
M. genitalium en el líquido sinovial. Se ha comprobado
de los ureaplasmas en esta enfermedad ha sido objeto
que las mujeres infectadas por el VIH y con mayores
de debate y no hay indicios que apoyen el papel de M.
cargas de organismos de M. genitalium tenían
hominis como causa de uretritis (5). Claramente, la
mayores probabilidades de excretar VIH (17 ), pero solo
demostración de la presencia de ureaplasmas en un
recientemente se ha demostrado que la infección por
hombre con UNG no indica necesariamente que este M. genitalium predispone a la adquisición del VIH (18).
organismo sea la causa de la enfermedad si se tiene en No existen indicios de que M. hominis o los ureaplasmas
cuenta la elevada tasa de colonización. Este es también puedan desempeñar una función similar.
el caso aunque se emplee un método de cultivo
cuantitativo. Por lo tanto, se desconoce la proporción
• M. genitalium es una causa común de uretritis
exacta de los casos en que los ureaplasmas son
en hombres y mujeres, y causa cervicitis
responsables de la uretritis. La división de los
e infecciones del tracto genital superior en
ureaplasmas humanos en dos especies, U. urealyticum
mujeres.
y U. parvum, condujo a estudios que sugieren que U.
• M. hominis y los ureaplasmas se detectan
urealyticum se puede asociar con UNG en hombres
generalmente en personas sanas. Su asociación
más jóvenes con un menor número de parejas sexuales
con infecciones urogenitales en hombres o
(12) o cuando se detectan valores altos. Por lo tanto,
mujeres aún no se ha demostrado de una
los cultivos corrientes que no distinguen entre especies
manera concluyente.
parecen tener un valor limitado.
Se ha asociado M. genitalium con la cervicitis, pero

esta asociación es más débil que la observada entre 3.2 Descripción de los métodos de
M. genitalium y la uretritis masculina, posiblemente diagnóstico de M. genitalium disponibles
como consecuencia de la dificultad y los diferentes A efectos prácticos, el diagnóstico de M. genitalium se
criterios utilizados en el diagnóstico de la cervicitis limita a la prueba de amplificación de ácidos nucleicos
en mujeres (1). Sin embargo, en algunos estudios, la (PAAN), ya que el cultivo resulta extremadamente lento
asociación ha sido tan estrecha como la observada (varios meses), difícil y poco sensible (19). Hasta la
con C. trachomatis (7 ). En estudios en los que se fecha, ningún análisis serológico, análisis de detección
han notificado signos de uretritis, esta se ha asociado de antígenos o pruebas realizadas en el lugar de
atención han resultado útiles para el diagnóstico de las Aunque en el cebador directo se puede observar un
infecciones urogenitales por M. genitalium. desajuste sencillo en varias de sus posiciones con
algunas cepas, la prueba de detección en tiempo real de
• La PAAN es el único método práctico para el la MgPa mediante sondas TaqMan, descrita por Jensen
diagnóstico de M. genitalium. et al. (23), se ha utilizado ampliamente a escala mundial
con buenos resultados. Además, la RCP convencional
de la MgPa, descrita como una de las primeras RCP
3.3 Recogida, transporte y condiciones de de M. genitalium (24), y sus modificaciones (25) han
almacenamiento de las muestras demostrado ser muy reproducibles y tienen la ventaja
La obtención de muestras debe llevarse a cabo como de que el fragmento amplificado puede ser secuenciado
se describe en el capítulo 5 para la detección de C. para un buen análisis de tipificación. El gen rRNA 16S
trachomatis. Los hisopos y el medio de transporte también se usa como diana de la RCP de M. genitalium;
no deben contener sustancias que inhiban las PAAN. sin embargo, como consecuencia de la homología entre
También resulta apropiado utilizar un medio de M. genitalium y M. pneumoniae, es relativamente difícil
transporte que sea compatible con el análisis de diseñar cebadores y sondas que sean específicos y
detección de C. trachomatis, ya que las pruebas de sensibles.
detección de este organismo deben recibir la más En algunas pruebas de RCP del gen rRNA 16S, la
alta prioridad. Sin embargo, es preciso señalar que la detección de M. genitalium se basa en la amplificación
carga de organismos de M. genitalium es cien veces mediante cebadores universales de Mollicutes
inferior a la de C. trachomatis (20), de manera que (micoplasmas y ureaplasmas) y la posterior hibridación
se deben evitar los medios de transporte que diluyan con sondas específicas de especie. Aunque este método
innecesariamente la muestra. Lamentablemente, no se permite la detección de varias especies de micoplasmas
puede proporcionar ninguna guía clara en cuanto al tipo a partir de la misma reacción primaria de amplificación,
de muestra óptima para la detección de M. genitalium, la competencia con la amplificación de las secuencias
ya que los dispositivos de recolección, los métodos del gen rRNA 16S de ureaplasmas en particular dará
de preparación de las muestras y los sistemas de lugar a una sensibilidad deficiente para la detección
detección varían en los diferentes estudios. Cuando del DNA de M. genitalium, que puede ser significativa
solo se analiza una muestra de cada paciente, parece incluso cuando se encuentra en pequeñas cantidades
ser que la primera orina del día en los hombres y los (21, 23).
hisopados vaginales en las mujeres contienen las cargas
más altas de bacterias. Se han elaborado diversas técnicas de RCP en tiempo
real de M. genitalium (21). Aunque las técnicas de
3.4 Detección de M. genitalium mediante RCP convencionales bien optimizadas pueden tener
la prueba de amplificación de ácidos la misma sensibilidad que las pruebas en tiempo real
nucleicos (PAAN) bien optimizadas, estas últimas son menos propensas
a la contaminación. Por lo tanto, la combinación de
El único método factible de detección de M.
sensibilidad, especificidad y robustez elevadas, y el
genitalium es la PAAN, pero no existe ninguna prueba
riesgo reducido de contaminación por amplicones,
comercializada que haya recibido la aprobación de
característicos de este formato de RCP, indican que
la Administración de Alimentos y Medicamentos de
la RCP en tiempo real debe ser el principal método de
los Estados Unidos y la mayor parte de las pruebas
diagnóstico de M. genitalium. La cuantificación del DNA
actualmente disponibles han sido objeto de una
de M. genitalium no parece ser válida como medio de
evaluación muy limitada en las publicaciones. La mayor
diagnóstico habitual.
parte de las pruebas de reacción en cadena de la
polimerasa (RCP) se basan en la detección del gen de Como alternativa a la RCP, se dispone de una prueba
la adhesina MgPa de M. genitalium (21). Sin embargo, de amplificación mediada por transcripción (TMA)
algunas partes del gen MgPa son muy variables y los cuya diana es el rRNA 16S para uso exclusivo en
cebadores dirigidos a estas regiones no funcionarán investigación (Gen-Probe, San Diego, CA, EUA). La
satisfactoriamente con las muestras clínicas (21, 22). ventaja de este método es la presencia de múltiples
copias de moléculas de rRNA 16S por célula, con en caldo con un inóculo corriente se utiliza como
lo que se logra una sensibilidad de detección método de referencia, pero también ha resultado
potencialmente mayor en comparación con la exitosa la determinación de la CIM de M. genitalium
sensibilidad de las pruebas de RCP dirigidas a genes en crecimiento únicamente en cultivo de células
de copia única. Esta prueba de TMA ha demostrado (27 ). Los fracasos en el tratamiento de las infecciones
ser sensible, específica y de alto rendimiento para la por M. genitalium han llevado a que se preste mayor
detección de M. genitalium, pero no se han realizado atención a la resistencia en esta especie. Sin embargo,
suficientes estudios para determinar si es superior a dado que M. genitalium solo se puede cultivar en
otras PAAN (26). algunos laboratorios del mundo, y como su crecimiento
es demasiado lento para proporcionar resultados
A falta de PAAN comercializadas y plenamente significativos en el paciente individual, se ha empleado
validadas, es de suma importancia que los laboratorios el análisis molecular de las mutaciones que median la
que realicen procedimientos de diagnóstico de M. resistencia en un número cada vez mayor de estudios y
genitalium validen cuidadosamente y garanticen la en la práctica clínica diaria de algunos países.
calidad de sus análisis internos (véanse los capítulos
1 y 2, y el anexo 3, con respecto a las PAAN y su Varios estudios clínicos han indicado que las tetraciclinas
garantía de calidad, y la validación de las PAAN no son inferiores a la azitromicina en la erradicación
aprobadas). En general, la mayor parte de los análisis de M. genitalium (8) y, aunque las CIM in vitro
múltiples conllevan alguna falta de sensibilidad en el indicarían que esta especie debería ser sensible
diagnóstico de M. genitalium ya que este organismo a a las tetraciclinas, la experiencia clínica muestra
menudo se halla presente en niveles muy bajos, incluso lo contrario. No se han llevado a cabo análisis
en pacientes sintomáticos (20, 23). moleculares para detectar la resistencia a las tetraciclinas.
Se ha demostrado la resistencia a los macrólidos
mediante el aislamiento de cepas de M. genitalium
• La preparación de las muestras y la sensibilidad
en pacientes en los que fracasa el tratamiento con
de la prueba deben ser óptimas para
azitromicina (28) y las principales mutaciones que
poder detectar M. genitalium, ya que este
median la resistencia se han observado en la región V
microorganismo patógeno se halla presente en
del gen rRNA 23S, principalmente A2058G y A2059G
concentraciones cien veces inferiores a las de
(numeración de E. coli), pero se ha detectado una
C. trachomatis. La mayor parte de las pruebas variedad de otras combinaciones en las muestras de
múltiples muestran una sensibilidad algo inferior pacientes en los que ha fracasado el tratamiento con
que las pruebas con una única diana. azitromicina.
• Las PAAN dirigidas al gen MgPa de M.
Estas mutaciones se pueden detectar directamente en
genitalium deben diseñarse cuidadosamente con
las muestras clínicas mediante la secuenciación de los
objeto de evitar las regiones variables del gen.
amplicones de la RCP, lo que permite obtener
información clínicamente útil a falta de cultivo. Se ha
En consecuencia, es preciso tratar de optimizar la demostrado que el tratamiento con azitromicina en
fase de preparación de las muestras mediante la dosis única de 1 g conduce a la aparición de
centrifugación a gran velocidad con el objeto de resistencia o a la selección de variantes resistentes
concentrar la muestra y evitar la pérdida de DNA preexistentes (28, 29), y los datos preliminares sugieren
durante la extracción. que el nivel de resistencia de M. genitalium a los
macrólidos en la comunidad depende en gran medida
del empleo de una dosis única de 1 g en el tratamiento
3.5 Pruebas de resistencia y sensibilidad de
de la infección de C. trachomatis. Así lo ponen de
M. genitalium a los antibióticos manifiesto la baja prevalencia de la resistencia en los
La obtención del antibiograma de M. genitalium es países que emplean la doxiciclina como fármaco
muy complicada y solo resulta factible en laboratorios primario para tratar las UNG y la alta tasa de resistencia
de referencia especializados. La determinación de la de hasta un 100% en Groenlandia, donde se utiliza la
concentración inhibitoria mínima (CIM) mediante dilución azitromicina para el tratamiento de las UNG y donde la
prevalencia de infecciones por C. trachomatis es transmitted diseases, 4ª ed. New York, McGraw-Hill
extremadamente alta (30). El moxifloxacino se ha Medical, 2008:709–736.
mostrado como un tratamiento eficaz de segunda línea 6. Falk L, Fredlund H, Jensen JS. Symptomatic urethritis
(31), pero algunos informes procedentes de Japón is more prevalent in men infected with Mycoplasma
indican que pueden aparecer resistencia a una genitalium than with Chlamydia trachomatis. Sexually
fluoroquinolona relacionada, la gatifloxacina (32), y se han Transmitted Infections, 2004, 80(4):289–293.
aislado cepas con un alto grado de resistencia 7. Anagrius C, Loré B, Jensen JS. Mycoplasma genitalium:
combinada a la quinolonas y los macrólidos (J.S. Jensen, prevalence, clinical significance, and transmission.
datos inéditos de abril del 2013). Aunque se han Sexually Transmitted Infections, 2005, 81(6):458–462.
encontrado mutaciones en las regiones que determinan
8. Manhart LE, Broad JM, Golden MR. Mycoplasma
la resistencia a las quinolonas (32), no se han genitalium: should we treat and how? Clinical Infectious
determinado sus correlatos clínicos. Diseases, 2011, 53(Supl. 3):S129–S142.
9. Horner P et al. Role of Mycoplasma genitalium

• La resistencia de M. genitalium a los and Ureaplasma urealyticum in acute and chronic
macrólidos es muy frecuente en los pacientes nongonococcal urethritis. Clinical Infectious Diseases,
2001, 32(7):995–1003.
en los que fracasa el tratamiento con
azitromicina y moxifloxacina es el fármaco 10. Wikström A, Jensen JS. Mycoplasma genitalium:
usado con mayor frecuencia en el tratamiento a common cause of persistent urethritis among
men treated with doxycycline. Sexually Transmitted
de segunda línea.
Infections, 2006, 82(4):276–279.
• La resistencia de M. genitalium a los
macrólidos, mediada por mutaciones 11. Bradshaw CS et al. Azithromycin failure in Mycoplasma
genitalium urethritis. Emerging Infectious Diseases,
específicas en el gen rRNA 23S, puede
2006, 12(7):1149–1152.
detectarse mediante la amplificación por RCP y
la secuenciación de este gen directamente de 12. Wetmore CM et al. Ureaplasma urealyticum is
associated with nongonococcal urethritis among
las muestras clínicas.
men with fewer lifetime sexual partners: a case-
• Se han encontrado mutaciones en las regiones control study. Journal of Infectious Diseases, 2011,
de M. genitalium que determinan la resistencia 204(8):1274–1282.
a las quinolonas en pacientes en los que ha
13. Cohen CR et al. Association between Mycoplasma
fracasado el tratamiento con quinolonas, pero genitalium and acute endometritis. The Lancet, 2002,
no se han determinado sus correlatos clínicos. 359(9308):765–766.
14. Haggerty CL et al. Failure of cefoxitin and doxycycline

to eradicate endometrial Mycoplasma genitalium and
3.6 Bibliografía the consequence for clinical cure of pelvic inflammatory
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87(Supl. 1):A302
Capítulo 4
Gonorrea
4.1 Introducción
La gonorrea es una enfermedad antigua causada por de las infecciones del aparato genitourinario inferior:
Neisseria gonorrhoeae (gonococo) que se transmite uretritis en los hombres y cervicitis en las mujeres.
casi exclusivamente por contacto sexual. Según las Produce infección urogenital asintomática en una
estimaciones de la Organización Mundial de la Salud minoría de hombres, no obstante, es más común (al
(OMS), en el 2008 hubo 106 millones de casos nuevos menos 50%) en las mujeres. La infección del recto
de gonorrea en adultos en todo el mundo. Estas cifras (proctitis) y la faringe, generalmente asintomática,
indican que la gonorrea es la infección de transmisión puede producirse en ambos sexos dependiendo
sexual (ITS) bacteriana de mayor prevalencia junto de los hábitos sexuales, pero es más frecuente en
con la producida por Chlamydia trachomatis (también los hombres que mantienen relaciones sexuales
106 millones de casos nuevos) (1). En consecuencia, con otros hombres. Si pasa desapercibida y no se
la gonorrea, sin olvidar sus complicaciones graves, la trata o si se la trata de forma inadecuada, la
produce una gran morbilidad, acarrea costos infección puede ascender al aparato genital superior
económicos sustanciales y sigue siendo una de y producir una infección gonocócica complicada
las principales preocupaciones de salud pública en (por ejemplo, enfermedad pélvica inflamatoria [EPI]
el mundo. Es extremadamente preocupante que la y secuelas relacionadas como el embarazo ectópico
bacteria haya desarrollado resistencia frente a casi y la infertilidad) en mujeres y edema peneano
todos los antibióticos existentes para su tratamiento, y epididimitis en hombres. Se puede producir
y se teme que la gonorrea pueda llegar a no tener conjuntivitis en los adultos, pero la infección
cura en determinadas circunstancias (2, 3). ocular se presenta, con mayor frecuencia, como
oftalmía neonatal en el recién nacido. La infección
Dentro del género Neisseria hay dos especies gonocócica diseminada (IGD), que es una entidad
particularmente patógenas para el ser humano, N. morbosa diferente y no una verdadera complicación,
gonorrhoeae y N. meningitidis, y aproximadamente puede producirse en ambos sexos aunque es
30 especies que no suelen serlo como N. lactamica, poco frecuente. En el cuadro 4.1 se resumen las
N. sicca, N. cinerea, N. flavescens, N. subflava y N. manifestaciones clínicas de la infección gonocócica.
mucosa. Estas bacterias colonizan de preferencia las
vías respiratorias superiores como comensales, pero
raramente se encuentran en el aparato genitourinario • N. gonorrhoeae causa las ITS bacterianas
inferior. Los gonococos son cocos gramnegativos, más frecuentes en el mundo (en el 2008,
aerobios, capnofílicos (prefieren concentraciones exactamente igual de frecuentes que la
aumentadas [3% a 7%] de dióxido de carbono [CO 2 ]), infección por clamidias), que incluyen una
carecen de flagelos y de esporas y son productores serie de enfermedades de distinta localización:
de oxidasa y catalasa, normalmente se presentan urogenital, faríngea, rectal y conjuntival.
en parejas (diplococos) con lados adyacentes
cóncavos, es decir, en microscopia presentan una • Las complicaciones y secuelas asociadas a las
forma característica de riñón o grano de café. La infecciones por N. gonorrhoeae sin tratar son,
N. gonorrhoeae es delicada y para su crecimiento entre otras, la enfermedad pélvica inflamatoria,
in vitro se necesitan medios de cultivo complejos el embarazo ectópico, la infertilidad, el
enriquecidos con nutrientes. edema peneano, la epididimitis y la infección
gonocócica diseminada.
N. gonorrhoeae solo infecta a los seres humanos,
coloniza superficies mucosas y es el agente causal
Gonorrea 21
Cuadro 4.1: Manifestaciones clínicas de la infección gonocócicaa
Gonorrea sin complicacionesa Gonorrea con complicacionesb

Uretra • Secreción copiosa y purulenta Complicaciones • Edema peneano
• Secreción escasa y clara en el hombre • Absceso de las glándulas de
• Disuria Tyson
Cuello uterino • Orificio cervical externo rojo y • Absceso de las glándulas de
friable Cowper
• Exudado purulento en el orificio • Vesiculitis seminal
• Disuria • Epididimitis
• Salpingitis • Infertilidad (raro)
• Dolor a la palpación, bilateral o Complicaciones • Endometritis
unilateral, en el abdomen inferior. en la mujer • Salpingitis
Recto • Secreción copiosa y purulenta • Absceso de la glándula Bartholin
• Ardor o escozor • Linfangitis
• Tenesmo • Absceso tuboovárico
• Sangre en heces • Embarazo ectópico
• Infertilidad
Faringe • Faringitis leve
• Dolor de garganta leve Infección • Bacteriemia
• Eritema gonocócica • Fiebre
diseminada (IGD) • Dermatitis (lesiones cutáneas:
Conjuntiva • Secreción copiosa y purulenta
macular, eritematosa, pustulosa,
• Queratitis y ulceración corneal;
necrótica, hemorrágica)
perforación, extrusión del
• Tenosinovitis
cristalino.
• Articulaciones; artritis séptica.
• Cicatrización; opacificación del
• Endocarditis
cristalino.
• Meningitis
• Ceguera
a
Como se ha señalado, la infección gonocócica puede ser asintomática, en particular en las mujeres y en la localización faríngea o rectal.
b
Los estudios epidemiológicos y biológicos aportan pruebas fehacientes de que la gonorrea favorece significativamente la transmisión del VIH.
4.2 Aspectos generales de los métodos de Una tinción de Gram del frotis bien hecha seguida
diagnóstico existentes del examen microscópico en busca de diplococos
intracelulares gramnegativos en los leucocitos
La gonorrea suele ser asintomática, especialmente
polimorfonucleares (LPMN) es sensible (95%) y
en las mujeres, y en la localización faríngea y rectal
específica (97%) para el diagnóstico de la gonorrea
si hay síntomas, pueden ser inespecíficos (véase el
en los hombres sintomáticos con secreción uretral.
cuadro 4.1). En consecuencia, se necesitan técnicas
En las mujeres, sin embargo, el examen del frotis de
de laboratorio para el diagnóstico, la identificación
la secreción cervicouterina solo detecta 40% a 60%
de casos y comprobar la curación. El diagnóstico de
de las muestras con cultivo positivo, lo que podría ser
la gonorrea se establece mediante la detección de N.
una indicación del menor número de gonococos en las
gonorrhoeae en las secreciones
mujeres. Además, pueden presentarse resultados
En el cuadro 4.2 se resumen los métodos recomendados positivos falsos y la especificidad (80% a 95%)
para el diagnóstico de la gonorrea, el desempeño y otras dependerá de la experiencia del microscopista. El
características de estos métodos. examen microscópico directo no se recomienda para
el diagnóstico de las infecciones rectales y faríngeas
Cuadro 4.2: Pruebas diagnósticas de rutina (a junio del 2012) para la detección de N. gonorrhoeae
Microscopiaa Cultivo PAAN

Tipos de muestras
Hisopado endocervical Sía Sí Sí
Hisopado vaginal No Síb Sí (algunas pruebas)
Orina
Hombre No No Síc
Mujer No No Sí
Hisopado uretral Sía Sí Sí
Hisopado rectal No Sí Nod
Hisopado orofaríngeo No Sí Nod
Hisopado conjuntival Sí Sí Nod
Desempeño
Sensibilidade Baja–altaa Moderada–alta Muy alta
Especificidade Moderada–altaa Muy alta Moderada–muy alta
Otras consideraciones
Costo Bajo Moderado Alto–muy alto
Instrumental o equipo Microscopio Microbiología corriente Gran superficie para los aparatos
Capacidad Moderada-nula Moderate/no Alta-posible
analítica-automatización
Complejidad técnica Baja Moderada-nula Alta
Tipo de laboratorio Periférico Periférico–intermedio Intermedio–central
Varios patógenos en una No No C. trachomatis, T. vaginalis, y VPH en
muestra algunas plataformas.
Otras observaciones • Las condiciones estric- • Las PAAN tienen en general mayor sen-
tas de recogida, trans- sibilidad que el cultivo, especialmente
porte y conservación en muestras faríngeas y rectales. Sin
de la muestra son embargo, la especificidad puede ser
clave para mantener la insuficiente y es necesaria la confir-
viabilidad mación con otra prueba de amplifi-
• Es el único método que cación de ácidos nucleicos.
posibilita la realización
del antibiograma.
VPH: virus de los papilomas humanos; PAAN: prueba de amplificación de ácidos nucleicos.
a
La microscopia tiene una sensibilidad y especificidad altas en los varones sintomáticos (con uretritis), sensibilidad baja en los asintomáticos y en
las infecciones endocervicales y no se recomienda para las muestras vaginales, de orina, rectales o faríngeas.
b
No es una muestra recomendada, suele utilizarse en el caso de niñas impúberes o mujeres con histerectomía.
c
La orina no es la muestra ideal por presentar una sensibilidad insuficiente para la detección de N. gonorrhoeae en la mujer.
d
No hay ninguna prueba de amplificación de ácidos nucleicos autorizada internacionalmente para usar con muestras extragenitales, pero hay cada
vez más indicios de que las PAAN son más sensibles que el cultivo en estas localizaciones. Se recomienda que una PAAN positiva en muestras
rectales y faríngeas sea confirmada por otra prueba complementaria (PAAN con otra secuencia diana) para evitar resultados positivos falsos.
e
Los porcentajes de sensibilidad y especificidad dependen en gran medida de la diferente sensibilidad y especificidad de las pruebas efectuadas
con la misma metodología y de las utilizadas como referencia.
Gonorrea 23
debido a la gran concentración de otros microorganismos y especificidad para el diagnóstico de la gonorrea sin
en la muestra y a la escasa sensibilidad. Tampoco se complicaciones o con ellas.
recomienda el cribado de personas asintomáticas
mediante el examen microscópico. Para que las características de desempeño de todos
los métodos de diagnóstico sean adecuadas, es
Durante decenios, el cultivo de N. gonorrhoeae se fundamental seguir rigurosamente los procedimientos
ha considerado el método de referencia para el normalizados de trabajo en la realización, así como las
diagnóstico tanto de la gonorrea genital como de recomendaciones del fabricante relativas a la toma,
la extragenital. El cultivo es sensible y sumamente el transporte y la conservación de las muestras y su
específico en circunstancias optimizadas, tiene bajo análisis, sin olvidar el control de la calidad (CC) de la
costo y, lo que es más importante, permite la realización prueba en cuestión.
del antibiograma. La resistencia de los gonococos
a los antibióticos es un problema grave en todo el
mundo; dado que el cultivo es el único método para • La microscopia es sensible y específica en los
hombres sintomáticos con secreción uretral.
realizar el antibiograma, es esencial mantener y, cuando
sea necesario, fortalecer la capacidad de realizar • El cultivo es sensible y sumamente específico
cultivos en todos los países. en circunstancias optimizadas, es de bajo costo
y posibilita la realización del antibiograma.
A lo largo de los dos últimos decenios, se han
desarrollado e introducido las pruebas de amplificación • Las PAAN tienen en general mayor sensibilidad
de ácidos nucleicos (PAAN) para la detección específica que el cultivo, especialmente para las
de DNA o RNA de N. gonorrhoeae. Estas determinaciones muestras faríngeas y rectales. Sin embargo,
la especificidad de varias de las PAAN
son, en general, más sensibles que el cultivo para el
gonocócicas es insuficiente para el diagnóstico
diagnóstico de la gonorrea, especialmente en el caso de
en las muestras urogenitales y, en particular,
las muestras faríngeas y rectales (4–6).
en las extragenitales, lo que da lugar a un valor
Sin embargo, no se ha comercializado todavía una predictivo positivo bajo en poblaciones con
prueba de amplificación de ácidos nucleicos autorizada prevalencia baja.
por la Administración de Alimentos y Medicamentos
de los Estados Unidos de América (FDA) para 4.3 Recogida, transporte y conservación de
las muestras faríngeas o rectales. Además, la las muestras
especificidad de varias de las PAAN gonocócicas ha
El sitio anatómico idóneo de recogida de la muestra
resultado insuficiente para el diagnóstico en el caso
depende del sexo, la edad y el comportamiento sexual
de las muestras urogenitales y, en particular, en las
de la persona; de las manifestaciones clínicas de la
extragenitales, lo que da lugar a un valor predictivo
infección y del método de la prueba diagnóstica,
positivo bajo, concretamente, en poblaciones en las que
además de las características de desempeño
la enfermedad no es frecuente.
(sensibilidad y especificidad) de dicha prueba. En la
Hasta la fecha no hay ninguna prueba de mujer, la principal localización a fin de recoger muestras
inmunofluorescencia directa o de enzimoinmunoanálisis, para el cultivo y la microscopia es el conducto
ni ninguna prueba diagnóstica rápida en el punto endocervical; para las pruebas de amplificación de
de atención para la detección de antígenos con ácidos nucleicos, es el conducto endocervical o la
características de desempeño (sensibilidad y vagina. Otras localizaciones secundarias son la uretra, el
especificidad) adecuadas disponible para el diagnóstico recto y la orofaringe. En los hombres heterosexuales,
de la gonorrea sin complicaciones o con ellas. las muestras para el cultivo y la microscopia deben
Además, no hay ningún método comercial aprobado recogerse de la uretra, y para la PAAN, una muestra de
internacionalmente para la detección serológica de orina. En los hombres que tienen relaciones sexuales
anticuerpos gonocócicos, y estos métodos no pueden con otros hombres y en las mujeres y hombres con
diferenciar las infecciones en curso de las pasadas. signos clínicos indicativos o que practican el sexo
Por otro lado, no deben usarse estos métodos en oral o anal deben tomarse muestras, además, en el
pacientes aislados debido a la insuficiente sensibilidad recto y la orofaringe. Las PAAN tienen más sensibilidad
para detectar estas infecciones que el cultivo y Vagina (solo para la PAAN): El hisopo debe rotarse
pueden aumentar la identificación de casos (4–6 ), contra las paredes vaginales posteriores durante 5
aunque, como se ha señalado, no hay ningún equipo segundos. Las muestras vaginales pueden ser tomadas
comercializado que esté autorizado para la realización tanto por la paciente como por el médico y el resultado
de estas. En el cultivo, como se requieren organismos será el mismo (7, 8).
vivos, la muestra debe proceder de localizaciones con
células epiteliales cilíndricas o cúbicas y debe utilizarse, Primera porción (recolección) de orina (solo para la
de ser posible, un hisopo estéril de rayón o dacrón PAAN): Sin limpiar la zona genital del paciente, recoger
recubierto con partículas de carbón vegetal (si el medio 10 a 20 ml de la primera parte de la micción en un
de transporte no nutritivo carece de estas partículas). recipiente estéril al menos 1 hora después de que el
Siempre que se utilicen las PAAN en el diagnóstico, se paciente haya orinado.
deben seguir al pie de la letra las instrucciones del Recto: Introducir un hisopo de 2 a 3 cm en el
fabricante relativas a la recogida, el transporte y la recto y rotarlo contra las paredes rectales durante
conservación de las muestras. Se evitará el uso de 10 segundos. Si se produce contaminación fecal,
antisépticos, analgésicos y lubricantes cuando se recoja desechar ese hisopo y usar otro para obtener la muestra.
la muestra ya que estos pueden inhibir los gonococos. En
En los pacientes sintomáticos, las muestras anorrectales
cualquier caso, la recogida de la muestra debe realizarse
deberían obtenerse, a ser posible, insertando un
antes de iniciar el tratamiento antibiótico.
proctoscopio que proporcione visión directa.
Endocérvix: Introducir el hisopo de 2 a 3 cm en el
Orofaringe: Frotar la región posterior de la faringe por
orificio cervical externo y rotar suavemente durante 5 a 10
encima del borde inferior del paladar blando y las criptas
segundos. No deben tomarse muestras endocervicales
amigdalinas.
de niñas impúberes ni de mujeres con histerectomía; en
su lugar, se tomarán del vestíbulo de la vagina y también Conjuntiva: Retirar el párpado inferior y desplazar un
se recogerá una muestra de orina (para el diagnóstico hisopo delgado por la superficie de la conjuntiva palpebral
mediante PAAN). inferior hacia el ángulo medio del ojo.
Uretra: Tomar las muestras uretrales al menos 1 hora

4.4 Diagnóstico provisional: microscopia
después de que haya orinado el paciente. Recoger la
secreción directamente en un hisopo. 4.4.1 Preparación de los portaobjetos para la
tinción
• Las condiciones de recogida, transporte y Preparar el frotis según se describe en el anexo 1
conservación de las muestras varían según el (Microscopia). Fijar la extensión seca calentándola
método analítico y pueden tener una influencia en una placa eléctrica o pasando rápidamente el
significativa en la sensibilidad de la prueba. portaobjetos tres veces sobre la llama, con la precaución
• La elección de la muestra y de la prueba de mantener el lado de la extensión hacia arriba.
de detección adecuadas es crucial para un Evitar el calentamiento excesivo para que las células
diagnóstico eficaz. no se deformen. Al tocar el dorso de la mano con el
portaobjetos, solo debe sentirse caliente.
Si no hay secreción, en los hombres se presiona la uretra La observación al microscopio de la tinción con azul de
hacia el orificio para tratar de evacuarla (maniobra de metileno (fig. 4.1) es sencilla y rápida, y es un método
ordeño). Si no se obtiene ninguna secreción, introducir fiable para el diagnóstico de la gonorrea en hombres
un hisopo delgado 2 o 3 cm en la uretra y rotar con uretritis purulenta, (9) pero no permite distinguir
suavemente durante 5 a 10 segundos. En las mujeres, los cocos gramnegativos y, por consiguiente, carece de
hacer un masaje de la uretra contra la sínfisis pubiana la especificidad deseada. La tinción de Gram permite
y usar la misma técnica que en los hombres. El detectar diplococos gramnegativos intracelulares
cultivo de una muestra del endocérvix y una de la uretra dentro de los leucocitos polimorfonucleares y es el
simultáneamente puede aumentar la detección de casos método de elección para el diagnóstico provisional de N.
en las mujeres. gonorrhoeae (fig. 4.2). Se pueden observar organismos
Gonorrea 25
extracelulares, pero esto solo no basta para el frotis. Es mejor sujetar el portaobjetos con la mano,
diagnóstico, aunque se usa a veces en combinación con protegida con guantes, cerca del agua corriente. El
los síntomas clínicos. tiempo de decoloración dependerá del decolorante
químico utilizado y del espesor del frotis —será
más corto (normalmente solo unos segundos) con
acetona y más largo (hasta un minuto) con etanol.
Debe evitarse la decoloración excesiva para que
las bacterias grampositivas no se confundan con
las gramnegativas. Hacer caso omiso de las partes
gruesas que puedan teñirse de azul en un frotis que
no esté bien extendido y nivelado.
4. Lavar rápidamente con agua corriente para detener

la decoloración y escurrir el exceso de agua.
Figura 4.1 5. Cubrir con el colorante de contraste, safranina o

Microscopia de una tinción de azul de metileno de un fucsina, durante 1 minuto.
exudado uretral masculino que presenta diplococos
intracelulares dentro de los LPMN (1000×) 6. Lavar con agua corriente y secar suavemente el
Fuente: Reproducido de Morse SA et al., eds. Atlas portaobjetos con papel de filtro.
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4ª ed.
Edimburgo, Saunders/Elsevier, 2010. 4.4.3 Procedimiento de la tinción de azul de
metileno
1. Cubrir el frotis con azul de metileno durante unos
30 a 60 segundos.
2. Enjuagar con agua corriente y secar suavemente el

portaobjetos con papel de filtro.
4.4.4 Lectura del frotis e interpretación

Usar un microscopio con buena iluminación y aceite de
inmersión de buena calidad, y examinar el frotis con
Figura 4.2 el objetivo de 100X (ocular de 10X). Los gonococos
Microscopia de una tinción de Gram de un exudado aparecen como diplococos gramnegativos dentro de
uretral masculino que presenta diplococos los LPMN. Describir exactamente lo que se vea en el
intracelulares gramnegativos dentro de los LPMN frotis: células epiteliales, LPMN, morfotipos de bacterias
(1000×) y su ubicación intracelular o extracelular. El examen
Fuente: Reproducido de Morse SA et al., eds. Atlas
microscópico del portaobjetos debe durar al menos
Edimburgo, Saunders/Elsevier, 2010. 2 minutos antes de concluir que no contiene ningún
diplococo intracelular gramnegativo.
4.4.2 Procedimiento para la tinción de Gram
1. Cubrir con cristal violeta durante 30 segundos una 4.4.5 Control de la calidad de la microscopia
extensión fijada con calor. Lavar suavemente con usando frotis teñidos con la tinción de
agua fría del grifo. Gram
2. Inundar el portaobjetos con solución de yodo El control de la calidad debe realizarse a intervalos
durante 30 segundos. Lavar suavemente con agua regulares usando una serie de bacterias que reaccionan
fría del grifo. (se tiñen) de forma diferente frente al Gram o empleando
muestras de control. En todo caso, siempre debe
3. Decolorar con acetona, etanol-acetona o solo realizarse cuando se empieza un nuevo lote de reactivos.
etanol hasta que deje de salir colorante violeta del
Amies, inoculados (véase el anexo 4) se conservan en
• La sensibilidad y la especificidad de la el refrigerador entre 2 y 8° C antes de transportarlos
microscopia en hombres sintomáticos con al laboratorio. Estos medios retrasan el crecimiento
secreción uretral es buena.
de los gonococos y se evita así la pérdida de viabilidad.
• Sin embargo, la microscopia tiene menor Por el contrario, la máxima supervivencia a partir de
sensibilidad en hombres asintomáticos y en las los medios de transporte (crecimiento) nutritivos
infecciones endocervicales, y no proporciona se obtiene cuando las muestras se preincuban en el
un diagnóstico de certeza para estas medio de transporte a 36 ± 1° C hasta el día siguiente
infecciones. antes de enviarlas al laboratorio; se obtienen resultados
aceptables si el tiempo de transporte no excede los 2
• No se recomienda la microscopia para el
diagnóstico de infecciones rectales y faríngeas. días (11 ).
La fiabilidad de un cultivo para el diagnóstico de la

gonorrea está condicionada por una serie de factores:
4.5 Cultivo e identificación de N. gonorrhoeae
(de sospecha y de certeza) • número de sitios en los que se toma la muestra,
4.5.1 Transporte y cultivo • técnica e hisopos usados para la recogida de las

El cultivo sigue siendo esencial para realizar el muestras,
antibiograma (véase la sección 4.8). Los gonococos
• condiciones y duración del transporte,
son muy sensibles a las condiciones ambientales
(temperatura, desecación, oxidación y sustancias • composición y calidad del medio de cultivo,
tóxicas), por lo que el transporte de las muestras
desde el consultorio al laboratorio (cuadro 4.3) reducirá • inoculación y condiciones de incubación,
la viabilidad de estas bacterias. La inoculación directa
de las muestras en un medio de cultivo nutritivo y • reactivos y técnicas empleadas para la identificación
selectivo (ver más adelante) en la propia consulta es el de N. gonorrhoeae.
método óptimo, pero si esto no fuera factible, el hisopo
se insertará en un medio de transporte no nutritivo El número de cepas gonocócicas sensibles a
como el medio de Stuart o el Amies (véase el anexo la concentración de antibióticos que se usa
4), o se inoculará en un medio de transporte nutritivo generalmente en los medios de cultivo selectivos con
(medio de crecimiento) como el Transgrow (10, 11), el agar es insignificante en la mayoría de los países. En
Jembec (11, 12 ), el Gono-Pak o el sistema InTray GC. consecuencia, se recomienda el empleo de medios
Cuando se emplea un medio de transporte no nutritivo, de cultivo selectivos nutritivos como el Thayer–Martin
el porcentaje de aislamiento después de transportar (13), el Agar Thayer–Martin modificado (MTM;
las muestras a temperatura ambiente (20–25° C) es véase el anexo 4) y el Agar New York City (NYC) (14)
prácticamente del 100% en las 6 primeras horas y más para el diagnóstico habitual de la gonorrea. Si los
del 90% si se alarga hasta 12 horas. recursos son suficientes, en el caso de las muestras
urogenitales lo ideal sería utilizar también una placa
Al cabo de 48 horas, sin embargo, el número de de cultivo no selectivo para cada muestra. En algunas
gonococos disminuye y ya no es posible el aislamiento, zonas geográficas, hasta un 5% de los gonococos
especialmente en las muestras de pacientes pueden ser sensibles a concentraciones de 3 a 4 mg/l
asintomáticos que contienen una cantidad menor de de vancomicina presentes en los medios de cultivo
estas bacterias. Cuando se prevé un tiempo de tránsito selectivos (15 ); por consiguiente, se recomiendan
superior a 48 horas, lo ideal es emplear sistemas de suplementos selectivos con una concentración menor
transporte (crecimiento) nutritivos que incorporan un de vancomicina (2 mg/l) o con lincomicina (1 mg/l),
medio de cultivo y proporcionan una atmósfera rica que inhibe menos las bacterias contaminantes que
en CO2. La máxima supervivencia y recuperación de los la vancomicina. Si se examinan muestras rectales y
gonococos a partir de un medio de transporte no faríngeas sistemáticamente, es aconsejable que el medio
nutritivo se consigue cuando estos medios, Stuart o contenga la concentración de vancomicina más alta.
Gonorrea 27
Cuadro 4.3: Obtención, transporte y conservación de las muestras
Localización Dispositivo de Procedimiento

anatómica recogida de muestreo Microscopia Cultivo PAAN
Endocérvix Hisopo plásticoa Usar un Extender en un Debe realizarse la siembra alColocar en el
(o cepillo espéculo portaobjetos pie del enfermo en un medio dispositivo de
endocervical o vaginal y (una capa selectivo para gonococos recolección
estuche para limpiar el fina) y secar al e incubarse de inmediato. del fabricante.
la recolección exocérvix. aire (véase el Si no se hace así, se debe Transportar y
específico de las Introducir el anexo 1). emplear un medio de conservar según
PAAN) hisopo 2 a La sensibilidad transporte no nutritivo para las instrucciones de
3 cm y rotar para las gonococos o un medio de fabricante.
durante 5 a 10 muestras transporte nutritivo.b Si el fabricante
segundos. endocervicales no ha previsto
Una vez en el laboratorio se
es insuficiente. un medio de
deben sembrar las muestras
transporte, utilizar
del medio de transporte
uno apropiado
no nutritivo cuanto antes
que estabilice el
o, como máximo, antes
ácido nucleico, por
de transcurridas 48 horas
ejemplo, tubos de
(véase también la sección
GeneLock.
4.5).
Uretra Hisopo de Recoger la Extender en un Transporte y conservación, Transporte y
(recogida aluminioc secreción portaobjetos igual que la muestra conservación, igual
≥ 1 hora (o estuche para directamente (una capa endocervical para el cultivo. que la muestra
después la recolección con un hisopo. fina) y secar al endocervical para
de haber específico de las Introducir el aire (véase el la PAAN.
orinado) PAAN) hisopo 2 a 3 cm anexo 1).
en la uretra y
rotar durante 5
a 10 segundos.
V agina Hisopo - La muestra NP Se realiza en el caso de Transporte y
plásticoa (o puede ser niñas impúberes o de conservación, igual
estuche para recogida por mujeres a las que se que la muestra
la recolección el personal les ha practicado una endocervical para
específico de las médico o la histerectomía. la PAAN.d
PAAN) propia paciente.
Transporte y conservación,
Rotar el
igual que la muestra
hisopo contra
endocervical para el cultivo.
las paredes
vaginales
posteriores
durante 5
segundos.
Cuadro 4.3: Obtención de muestras, transporte y almacenamiento (continuación)
Localización Dispositivo de Procedimiento

anatómica recogida de muestreo Microscopia Cultivo PAAN
Orina Recipiente Sin limpiar la NP NP Transporte y
(recogida estéril de orina zona genital conservación, igual
≥ 1 hora del paciente. que la muestra
después Recoger la endocervical para
de haber primera porción la PAAN.
orinado) de orina (menos
de 25 ml en
general).
Recto Hisopo plásticoa Introducir el NP Transporte y conservación, Transporte y
(o estuche para hisopo en el igual que la muestra conservación, igual
la recolección recto 2 a 3 cm endocervical para el cultivo. que la muestra
específico de las y rotarlo contra endocervical para
PAAN) las paredes la PAAN.d
durante 10
segundos.
Orofaringe Hisopo plásticoa Frotar con NP Transporte y conservación, Transporte y
(o estuche para el hisopo igual que la muestra conservación, igual
la recolección la faringe endocervical para el cultivo. que la muestra
específico de las posterior y endocervical para
PAAN) las criptas la PAAN.d
amigdalinas.
Conjuntiva Hisopo de Debe limpiarse Extender en un Transporte y conservación, Transporte y
aluminioc la secreción portaobjetos igual que la muestra conservación, igual
(o estuche para purulenta con (una capa endocervical para el cultivo. que la muestra
la recolección un hisopo. fina) y secar al endocervical para
específico de las Retirar el aire (véase el la PAAN.d
PAAN) párpado anexo 1).
inferior. Frotar Principalmente
la superficie de para los recién
la conjuntiva nacidos.
palpebral
inferior.
NP: no procede; PAAN: prueba de amplificación de ácidos nucleicos.

a
Hisopos de dracón o rayón con mango de plástico.
b
Debe utilizarse un medio de transporte no nutritivo para N. gonorrhoeae como el Amies o el Stuart (conservado a 4 °C antes del transporte) o un
medio de transporte nutritivo (medio de crecimiento) como el Jembec, el Transgrow, el Gono-Pak o el sistema InTray GC (conservado a 36 ± 1 °C
antes del transporte).
c
Hisopos de dacrón o de rayón con mango de aluminio.
d
La Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos de América aún no ha autorizado ninguna PAAN para la detección de
gonococos que utilice muestras extragenitales; sin embargo, las PAAN realizadas con muestras rectales y orofaríngeas han resultado ser más
sensibles que el cultivo (4–6) y podrían utilizarse si se contara con datos de validación adecuados.
Gonorrea 29
4.5.2 Control de la calidad de los medios de
cultivo
En cada lote de medio de cultivo debe controlarse la
esterilidad, la capacidad de mantener el crecimiento
de los gonococos y la capacidad de inhibir otros
microorganismos contaminantes. Para la evaluación de
la capacidad de crecimiento y el control de la calidad de
todos los métodos de diagnóstico, se pueden obtener
cepas de referencia de N. gonorrhoeae de la OMS del
2008 (16) de centros colaboradores de la OMS (véase
la sección 4.8.3.3). Para controlar la inhibición del
crecimiento de microorganismos no gonocócicos pueden
usarse cepas de referencia, por ejemplo, Escherichia coli
(ATCC 25922), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228),
N. sicca (ATCC 9913) y Candida albicans (ATCC 14053).
4.5.3 Siembra e incubación del cultivo

Rodar el hisopo que contiene la muestra sobre
Figura 4.3
aproximadamente un cuarto de la superficie de la
Jarra de anaerobiosis con vela para la incubación
placa, de preferencia placas de Petri de 90 mm de
de placas de cultivo de N. gonorrhoeae
diámetro. Extender el inóculo sobre la parte restante
del medio para garantizar el crecimiento de colonias
aisladas con un asa de siembra bacteriológica estéril.
Otra posibilidad es sembrar la muestra sobre toda
la superficie de la placa dibujando una “Z” y luego
hacer estrías; de este modo se obtienen colonias
que quedan más aisladas. Incubar de inmediato
las placas sembradas a una temperatura de 36 ±
1° C en una atmósfera húmeda (aproximadamente
70% a 80% de humedad) que contiene 5±1% de CO2
(jarra de anaerobiosis con vela, con una torunda de
algodón hidrófilo humedecido o toallas [fig. 4.3], jarra
de anaerobiosis con sobres generadores de CO2 o
incubadora de CO 2 con cámara de agua u otro artilugio Figura 4.4
para aumentar la humedad). Examinar las placas al cabo Colonias características de N. gonorrhoeae en medio
de 18 a 24 horas y, si no hay crecimiento, de nuevo a de cultivo selectivo para gonococos (izquierda: MTM)
las 48 horas. Tras 24 horas de incubación, el diámetro y en medio no selectivo (derecha: MTM sin añadir
de las colonias típicas puede variar de 0,5 a 1 mm y el antibióticos). Se observa una ligera inhibición del
aspecto varía de gris a blanco, de transparente a opaco crecimiento debido a los antibióticos selectivos.
y de convexas a aplanadas (dependiendo de la cepa
gonocócica y del medio de cultivo; fig. 4.4). Después
Edimburgo, Saunders/Elsevier, 2010.
de una incubación más larga, pueden alcanzar 3 mm
de diámetro y se hacen más rugosas. Con frecuencia,
aparece una mezcla de diferentes tipos de colonias en 4.5.4 Identificación de sospecha de N.
una misma placa. gonorrhoeae tras el cultivo
La identificación de sospecha de las colonias con
apariencia similar a las de gonococo en medios
selectivos puede hacerse mediante la tinción de Gram
(véase la sección 4.4.2) y la prueba de la oxidasa.
Esta prueba detecta la presencia de citocromo-c- Es aconsejable confirmar siempre la identificación de
oxidasa; la mejor forma de realizarla es frotando las colonias gramnegativas, oxidasa positiva de las
directamente algunas colonias sobre una tira de papel de muestras de localizaciones extragenitales, dado que la
filtro humedecida con el reactivo (solución acuosa al probabilidad de aislar especies de Neisseria diferentes
1% de dihidrocloruro de tetrametil-p-fenilendiamina) de N. gonorrhoeae en estos sitios es mayor, en particular
preparado en el laboratorio o comercializado en la faringe. Se debe confirmar la identificación de
(por ejemplo, BACTIDROP oxidasa). En una prueba toda colonia gonocócica aislada a la que se le van a
positiva se observa el cambio de incoloro a violeta determinar otras características, por ejemplo, mediante
en pocos segundos (30 como máximo) (fig. 4.5). un antibiograma (véase la sección 4.8), un fenotipado o
Otra posibilidad es realizar la prueba de la oxidasa un genotipado.
colocando una gota de reactivo de oxidasa sobre algunas
colonias representativas de un cultivo. Se debe tener 4.5.5 Control de la calidad de los reactivos de
precaución dado que el reactivo es tóxico para las la prueba de la oxidasa
bacterias y, si solo hay unas pocas colonias, deberán
El control de la calidad debe realizarse a intervalos
subcultivarse antes de hacer la prueba (fig. 4.5). La
regulares y siempre que se empiece un nuevo lote de
observación de diplococos gramnegativos, oxidasa
reactivos. Pueden usarse cepas de referencia oxidasa
positiva, con colonias de morfología característica que
positiva, como N. gonorrhoeae (cepa de referencia
crecen en medios selectivos sembrados a partir de
de la OMS del 2008; 16), y oxidasa negativa, como S.
muestras genitales ofrece una identificación suficiente
epidermidis (ATCC 12228) o E. coli (ATCC 25922).
y fiable de N. gonorrhoeae en el diagnóstico provisional
y es sumamente predictivo de N. gonorrhoeae si
la muestra proviene de una paciente con riesgo
4.5.6 Confirmación de la identificación de
elevado y crece en agar selectivo para gonococos. N. gonorrhoeae después del cultivo
En situaciones con recursos limitados, esto será La confirmación puede enfocarse de tres formas:
suficiente para iniciar el tratamiento. Sin embargo, para utilizar pruebas bioquímicas que diferencian especies de
proporcionar un diagnóstico definitivo de gonorrea, Neisseria distintas de otras estrechamente relacionadas
es necesario confirmar la identificación de N. y llegan a una identificación completa de la especie,
gonorrhoeae y descartar las especies estrechamente utilizar reactivos inmunológicos o utilizar la detección
relacionadas, como N. meningitidis, N. lactamica y molecular que es específica para N. gonorrhoeae pero
N. cinerea, que también pueden crecer en los medios solo confirma la identificación de N. gonorrhoeae y
principales selectivos de aislamiento para gonococos. no sirve para identificar las colonias aisladas que
Figura 4.5
Colonias oxidasa positiva de color violeta de N. gonorrhoeae en una placa de cultivo (foto de la izquierda,
placa de agar a la derecha) y en papel de filtro (derecha, que también presenta una reacción negativa
que permanece amarilla), después de la reacción con una solución acuosa al 1% de dihidrocloruro de
tetrametil-p-fenilendiamina.
Gonorrea 31
dan reacciones negativas. La elección de uno u otro
de estos enfoques dependerá del número de colonias
aisladas que se van a analizar, de los conocimientos
y experiencia y del costo. En los laboratorios que no
se identifican colonias gonocócicas con frecuencia,
es aconsejable usar un estuche comercializado
que proporciona la identificación completa. En los
laboratorios que se identifican muchas colonias, la
identificación de N. gonorrhoeae se suele confirmar
usando un reactivo específico y luego, si alguna es
de improviso negativa, se le realizan otras pruebas
bioquímicas. Ninguna prueba tiene una sensibilidad
Figura 4.6
y especificidad del 100%, por lo tanto si se cuenta
Producción de ácido a partir de los hidratos de
con recursos, se recomienda actualmente que las cepas carbono del medio agar tripticasa de cisteína (ATC).
clínicas de N. gonorrhoeae se confirmen usando una Los tubos empezando por la izquierda contienen
combinación de pruebas bioquímicas e inmunológicas medio ATC sin ningún hidrato de carbono, medio ATC
(o pruebas moleculares cuando se disponga de ellas). con solución de glucosa al 1% y medio de ATC con
Este enfoque se recomienda especialmente para los maltosa al 1%. La cepa bacteriana inoculada es N.
laboratorios de referencia. gonorrhoeae.
4.5.6.1 Pruebas para diferenciar las especies de of sexually transmitted diseases and AIDS, 4ª ed.
Neisseria Edimburgo, Saunders/Elsevier 2010.
Tradicionalmente, el principal método de identificación

debe tomarse de un medio no selectivo), pero no es
ha sido la capacidad de N. gonorrhoeae de producir
necesario incubar hasta el día siguiente y proporciona los
ácido en un medio que contiene glucosa; la
resultados antes. En todas estas pruebas es importante
disminución del pH se detecta por el cambio de color
seguir estrictamente las instrucciones del fabricante.
de un indicador de pH, a diferencia de, por ejemplo,
Básicamente estas pruebas detectan diferentes enzimas
N. meningitidis, que además utiliza maltosa (cuadro
de la ruta de la aminopeptidasa y, entre otras, se incluye
4.4). Este patrón excepcional de utilización de los
Gonochek-II (Laboratorios E-Y) (17, 19) y la prueba de
hidratos de carbono se observa al inocular cultivos
detección de enzimas preformadas de Neisseria (Neisseria
puros en agar tripticasa de cisteína (ATC) que contienen
PET; Key Scientific) (17). La prueba Gonochek-II se usa
glucosa, maltosa y sacarosa, respectivamente, con una
para diferenciar las especies de Neisseria mediante
concentración final de 1% a 2% e incubarlos durante 24
la detección de tres enzimas preformadas (prolil
horas (fig. 4.6; 17 ). iminopeptidasa [PIP], γ -glutamil-aminopeptidasa y
Es fundamental realizar esta prueba empleando un β-galactosidasa).
cultivo puro; para ello se requiere hacer al menos El cambio de color a azul indica hidrolisis del 5-bromo-4-
un subcultivo, lo que alargará el tiempo de obtención cloro-3-indolil- β-galactosidasa por la β-galactosidasa,
del resultado analítico para confirmar la identificación que es indicativo de N. lactamica. Un cambio de color a
respecto a otras pruebas más rápidas descritas a amarillo indica hidrolisis del γ-glutamil-p-nitroanilida por
continuación. la γ-glutamilaminopeptidasa, que es una característica de
También es eficaz la prueba rápida de utilización de N. meningitidis. Si no se produce cambio de color, se quita
la primera tapa y se reemplaza por una segunda, que
los hidratos de carbono (18, 19), que depende de las
tiene un colorante diazo (revelador de color) incorporado
enzimas preformadas y no del crecimiento, y usa
y se invierte el tubo. Si se observa un color rojo, indica
medios líquidos inoculados con un cultivo puro y denso.
hidrólisis de L-prolina 4-metoxinaftilamida y la presencia
Los resultados se obtienen en 4 horas.
de prolil iminopeptidasa, que da una identificación de
La detección rápida de enzimas preformadas sospecha de N. gonorrhoeae. El principio de la prueba
también requiere un cultivo puro (que siempre de detección de enzimas preformadas de Neisseria es
similar con alguna que otra variación. Tras incubar a colonias a identificar; se observa el color de la reacción
37 °C durante 30 minutos, se produce un cambio de color tras 2 a 4 horas de incubación a 37 °C. Se obtiene un
como se describe en la prueba Gonochek-II. Si no aparece número de perfil que revela la identificación cuando se
ningún color después de 30 minutos, se agrega una compara con una base de datos (en papel o en línea). El
gota de reactivo de la prueba de detección de enzimas API-NH tiene 10 pocillos (y se obtienen 13 pruebas de
preformadas y se observa el color al cabo de otros 2 identificación), que incluyen una prueba de β-lactamasa,
minutos. 4 pruebas de utilización de los hidratos de carbono y
8 pruebas bioquímicas correspondientes a diferentes
Debe tenerse en cuenta que algunas especies saprofíticas
reacciones de sustrato enzimático (fig. 4.7). El estuche
de Neisseria, como la N. cinerea, N. polysaccharea y
RapID NH consta de 2 cavidades para los hidratos de
N. subflava, crecen en medio para gonococos después
carbono y 11 pocillos bioquímicos para diferentes
de 24 a 48 horas de incubación; estas especies poseen
reacciones de sustrato enzimático (las reacciones
la prolil iminopeptidasa y, por consiguiente, pueden
principales para distinguir las especies de Neisseria se
dar resultados positivos falsos engañosos cuando se
indican en el cuadro 4.4).
utilizan los estuches de Gonochek-II y Neisseria PET.
También se producen resultados negativos falsos con las
4.5.6.2 Control de la calidad de las pruebas
cepas de N. gonorrhoeae que carecen de actividad prolil
bioquímicas de confirmación de las especies
iminopeptidasa; y ha habido una difusión mundial de un
Se debe controlar la calidad de cada nuevo lote de
clon gonocócico PIP negativo (20). Algunas cepas de N.
pruebas comercializadas o de reactivos internos
meningitidis procedentes de localizaciones urogenitales
(preparados en el laboratorio) utilizando cepas de
no poseen γ-glutamilaminopeptidasa.
referencia de especies bacterianas adecuadas, como
No se recomienda la confirmación de las especies usando N. gonorrhoeae (cepa de referencia de la OMS de 2008
únicamente pruebas de enzimas preformadas. Sin (16)), N. meningitidis (ATCC BAA-335), N. lactamica
embargo, una combinación de la prueba de utilización (ATCC 23970), N. sicca (ATCC 9913) y N. cinerea. (ATCC
de los hidratos de carbono y de la prueba de detección 14685). Además, cada vez que se realiza la prueba de
de enzimas preformadas, que está comercializada en confirmación de las especies, se incluirán las mismas
estuches rápidos, da una identificación más fiable. cepas de referencia como controles.
En estas pruebas es esencial seguir estrictamente las Recientemente, la espectrometría de masas acoplada
instrucciones del fabricante. Dos ejemplos de esos al sistema de desorción/ionización mediante láser
sistemas son el API-NH (bioMerieux) y el RapID NH asistida por una matriz con un analizador de tiempo
(Remel) (17), que lamentablemente resultan demasiado de vuelo (MALDI-TOF, por sus siglas en inglés) ha
costosos para entornos más desfavorecidos. Los dos comenzado a introducirse en los laboratorios bien
contienen sustratos deshidratados en una serie de abastecidos para la confirmación de la mayoría de
cúpulas o pocillos, que se llenan de una suspensión de las las especies bacterianas, incluidas las de Neisseria
Figura 4.7
Estuche de identificación API- NH, muestra el perfil de N. gonorrhoeae
Gonorrea 33
Table 4.4: Carbohydrate (sugar) utilization and enzyme activity of different Neisseria species and other
oxidase-positive species such as Moraxella catarrhalis and Kingella denitrificans
Actividad bioquímica
Sacarosa Fructosa
Species Glucosa Maltosa Lactosa (sacarosa) (levulosa) ONPGa GGTb PIPc
N. gonorrhoeae + − − − − − − + (−)
N. meningitidis + + − − − − + (−) − (+)
N. lactamicad + + + − − + − +
N. polysaccharead + + − +/− − − − +
N. cineread − (+) − − − − − − +
N. subflavad, e + + − +/− +/− − − +
N. sicca + + − + + − − +
N. mucosa + + − + + − − +
N. flavescens − − − − − − − +
M. catarrhalis − − − − − − − − (+)
K. denitrificans + − − − − − − +
a
ONPG, o-nitrofenil- β-galactosidasa.
b
GGT, γ-glutamilaminopeptidasa (transferasa).
c
PIP, prolil iminopeptidasa (hidroxiprolina aminopeptidasa; HPA; prolina arilamidasa; PRO).
d
N. lactamica crece generalmente en medio selectivo gonocócico, pero también pueden aparecer otras especies de Neisseria saprofitas que no son
patógenas.
e
Incluye las biovariedades subflava, flava y perflava, que difieren en su actividad frente a la sacarosa y a la fructosa.
+/–, no coherente para la especie; + (–), cepas principalmente positivas pero las hay negativas; – (+), cepas principalmente negativas pero las hay
positivas.
(21). El equipo necesario para este método complejo identificarse como mínimo 24 horas antes de lo que se
es costoso. Sin embargo, el costo por especie aislada consigue mediante las pruebas enzima-sustrato o las
comprobada es bajo y el método es fácil de realizar y pruebas rápidas de utilización de hidratos de carbono.
muy rápido. La espectrometría de masas acoplada al
El más corriente de los estuches que se comercializan es
sistema MALDI-TOF parece distinguir eficazmente entre
el de la prueba Phadebact Monoclonal GC (Boule) (17, 19),
especies comensales y patógenas de Neisseria, así como
que contiene una mezcla de anticuerpos monoclonales
también distingue N. meningitidis de N. gonorrhoeae. Sin
dirigidos a la proteína principal de la membrana externa
embargo, es necesario hacer otras determinaciones.
porina PorB (Por). Estos anticuerpos se absorben por
Cuando se usa la espectrometría de masas acoplada
el segmento Fc sobre la proteína A de Staphylococcus
al sistema MALDI-TOF para la confirmación de las
aureus y cuando se mezclan con el antígeno
especies de N. gonorrhoeae, es importante cumplir las
gonocócico, se produce la aglutinación.
instrucciones del fabricante al pie de la letra.
La prueba se realiza con una suspensión poco
4.5.6.3 Pruebas específicas para N. gonorrhoeae concentrada de la bacteria investigada (equivalente a
Las pruebas de confirmación específicas de N. una turbidez estándar aproximada de 0,5 de la escala de
gonorrhoeae pueden ser inmunológicas o moleculares, McFarland; véase el anexo 4) hecha en el amortiguador
y son particularmente útiles en los laboratorios que de pH del fabricante o en una solución salina estéril
procesan un gran número de colonias aisladas para al 0,9% amortiguada con fosfato (PBS), que luego
su identificación y que pueden costearse estas se calienta a ebullición durante 10 minutos y se deja
pruebas relativamente caras. Estas pruebas pueden enfriar antes de su uso. La suspensión debe llevarse
realizarse directamente con las colonias de una placa de a ebullición inmediatamente después de preparada,
cultivo selectivo y no es necesario utilizar un subcultivo ya que si se deja se producirá la lisis de las bacterias
puro. Por consiguiente, una colonia aislada puede y la liberación del DNA bacteriano, que puede causar
autoaglutinación y dificulta la lectura de la prueba. Se membrana exterior de la bacteria se separa, liberando
mezcla durante 2 minutos una gota de la suspensión el contenido de complejos PorB a la solución. Estos
con cada uno de los dos reactivos, que permite la complejos PorB liberados son entonces captados por el
clasificación en serogrupos WI (IA; PorB1a) y WII/ anticuerpo-partículas coloidales metálicas. Se filtra
III (IB; PorB1b) además de la identificación (fig. 4.8). a continuación la mezcla muestra-reactivo a través
El reactivo es de color azul para facilitar la lectura de del dispositivo de matriz especial; los complejos PorB
la reacción de aglutinación. Esta prueba tiene una anticuerpo-partículas coloidales metálicas quedan
sensibilidad y especificidad elevadas, pero es una retenidos por la matriz y dan lugar a una punto rojo. El
mezcla de anticuerpos específicos en lugar de un anticuerpo-partículas coloidales metálicas que no se
único anticuerpo frente a un antígeno conservado. Los han unido a PorB pasarán a través de la matriz y darán
resultados negativos falsos son raros, pero pueden un resultado negativo (un anillo entre blanco y rosa
producirse. pálido).
4.5.6.4 Control de la calidad de las pruebas

inmunológicas de identificación
Se debe controlar la calidad de cada nuevo lote de
pruebas comercializadas o de reactivos internos
utilizando cepas de referencia de N. gonorrhoeae
(controles positivos para ambos serogrupos WI (IA,
Figura 4.8 PorB1a; por ejemplo, cepa G de referencia de la OMS,
Reacción de dos cepas de N. gonorrhoeae (A, 2008; 16) y WII/III (IB, PorB1b; por ejemplo, cepa K de
pocillos 1 y 2 y B, pocillos 5 y 6) con los reactivos de referencia de la OMS, 2008; 16) así como una cepa
coaglutinación WI (pocillos 1 y 5) y WII/III (pocillos 2
de referencia negativa de otra especie estrechamente
y 6) de Phadebact.
Fuente: Reproducido de Morse SA et al., eds. Atlas relacionada, por ejemplo, N. lactamica (ATCC 23970).
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4º ed. Además, deben incluirse cepas de referencia idénticas
Edimburgo, Saunders/Elsevier, 2010. cada vez que se realice la técnica.
La confirmación molecular de la identidad puede

El reactivo inmunofluorescente de la prueba de realizarse con las PAAN descritas en la sección 4.6,
confirmación del cultivo de N. gonorrhoeae MicroTrak aunque es probable que esto se aplique mejor a los
(Trinity Biotech) (17, 19) emplea una mezcla similar de laboratorios de referencia.
anticuerpos monoclonales contra PorB, pero está unido
a fluoresceína. Se prepara un frotis delgado con
cuatro o cinco colonias emulsionadas en agua destilada
sobre un portaobjetos, se fija y se cubre con el reactivo.
• El cultivo es sensible y muy específico en
Tras incubar a 37 °C en una cámara húmeda, se lava el
circunstancias optimizadas, es relativamente
portaobjetos y se deja secar; posteriormente se examina
barato y proporciona una bacteria viable para el
en busca de diplococos verdes fluorescentes utilizando
antibiograma.
un microscopio de fluorescencia con un objetivo de
100X y aceite de inmersión. Esta prueba también • Debido a la gran resistencia desarrollada por
era sumamente sensible y específica, y podía usarse los gonococos en todo el mundo, es esencial
directamente en los medios de aislamiento primario, mantener y, en varios entornos, reforzar la
pero lamentablemente ha dejado de comercializarse de técnica de cultivo para facilitar la vigilancia de
manera reciente. la resistencia a los antibióticos.
• Para que el cultivo sea sensible y específico,
GonoGen II (17, 19) también emplea un panel similar la toma de muestras, el transporte, la
de anticuerpos, pero en esta prueba los anticuerpos conservación y la técnica de cultivo deben
monoclonales están adsorbidos sobre partículas optimizarse y estar sometidos al control de la
coloidales metálicas en suspensión. Cuando el calidad.
cultivo se emulsiona en el tampón solubilizador, la
Gonorrea 35
Actualmente, se usan principalmente las pruebas de
• Las PAAN presentan generalmente la sensibilidad amplificación de ácidos nucleicos para la detección
más alta, en especial para las muestras faríngeas de N. gonorrhoeae. Estas pruebas gonocócicas
y rectales (a pesar de no estar autorizadas), detectan una región del DNA o del rRNA específico
son normalmente muy específicas y se pueden
de N. gonorrhoeae, y la región difiere de un estuche
realizar con muestras obtenidas de forma
a otro (véase el cuadro 4.5). Se amplifica la secuencia
incruenta.
diana usando diferentes métodos (cuadro 4.5) que
• Las pruebas moleculares toleran mejor las
producen múltiples copias que se pueden detectar
deficiencias en la recogida, transporte y
condiciones de conservación de las muestras, y fácilmente. La información básica relativa a las pruebas
son objetivas. de hibridación de ácidos nucleicos sin amplificación y
las diferentes técnicas de las pruebas de amplificación
• La especificidad de varias de las PAAN
gonocócicas es insuficiente (véanse las de ácidos nucleicos se encuentra en el anexo 3 y el
secciones 4.6.2 a 4.6.4), lo que da lugar a valores capítulo 5 (C. trachomatis). Las PAAN gonocócicas son
predictivos positivos bajos en poblaciones en sumamente sensibles y específicas (pero la especificidad
las que la enfermedad no es frecuente; para la difiere sustancialmente de unas a otras) y pueden usarse
confirmación será necesario realizar otras PAAN con muestras obtenidas de forma incruenta (por ejemplo,
con otra secuencia diana. orina en hombres e hisopos vaginales en mujeres).
• Si no pueden usarse PAAN autorizadas Esto facilita que se pueda ver un mayor número de
internacionalmente, es muy recomendable pacientes en un consultorio o centro de atención
validar la eficacia de la PAAN propuesta en los primaria y también proporciona los requisitos previos
entornos locales, antes de su uso, y someterla al para un cribado eficaz. Generalmente, las PAAN
control de la calidad frente al menos una prueba pueden realizarse en un día de trabajo, por lo que la
de amplificación de ácidos nucleicos autorizada
obtención de los resultados analíticos es más rápida
internacionalmente.
que con el cultivo (mínimo 2 a 3 días) y a menudo
están automatizadas, lo que permite una capacidad
analítica más rápida. Con frecuencia se señala que la
sensibilidad de las PAAN es mayor que la del cultivo,
4.6 Detección molecular lo que refleja la mayor tolerancia de las deficiencias
en el proceso de recogida, transporte y conservación
4.6.1 Introducción y pruebas moleculares de las muestras. Entre las desventajas de usar las
La detección molecular de secuencias específicas de PAAN en la detección de N. gonorrhoeae se encuentran
ácidos nucleicos (DNA o RNA) de N. gonorrhoeae se el costo del equipo y los reactivos, la ausencia actual
realiza casi siempre con estuches comercializados que de una PAAN comercializada que esté autorizada para
detectan N. gonorrhoeae y C. trachomatis en el mismo las muestras extragenitales, la imposibilidad de realizar
estuche y, con frecuencia, simultáneamente sin que el antibiogramas y la insuficiente especificidad de algunos
costo sea mucho mayor o incluso por el mismo precio. análisis con PAAN (véanse las secciones 4.6.2 a 4.6.4).
Los primeros ensayos moleculares desarrollados A pesar de estas desventajas, debe promoverse el
fueron las pruebas de hibridación de ácidos nucleicos uso de las PAAN idóneas además del cultivo (para
sin amplificación (PHSA) como el PACE 2 (Gen-Probe) y el antibiograma) incluso en los entornos con recursos
la captura de híbridos de segunda generación (CH2) CT/ limitados. Una forma de facilitar dicho uso es mediante
NG (Digene Corporation). Los ensayos de hibridación la creación y el apoyo a los laboratorios de referencia
de ácidos nucleicos sin amplificación se basan en la regionales que prestan servicios de diagnóstico
unión de sondas de ácidos nucleicos complementarias usando estos métodos. Estos laboratorios de referencia
específicas y posterior amplificación de la señal para regionales ofrecen muchas ventajas ya que analizan
detectar la unión. No obstante, las pruebas de hibridación volúmenes más grandes, cumplen rigurosamente las
de ácidos nucleicos sin amplificación son sustancialmente prácticas correctas de laboratorio y disponen de
menos sensibles que las pruebas de amplificación de mejores conocimientos técnicos especializados. El
ácidos nucleicos y no deben usarse si existen pruebas recurso a los laboratorios regionales puede reducir
de amplificación y son asequibles. los costos al tiempo que se emplean métodos analíticos
Cuadro 4.5: Pruebas de amplificación de ácidos nucleicos autorizadas por la FDA para la detección de N.
gonorrhoeae (junio del 2012)
APTIMA Cobas Probetec GC CT/NG en

Prueba Combo 2 (AC2) Amplicor Cobas 4800 Probetec ET Qx tiempo real
Fabricante Gen-Probe Roche Roche Becton, Becton, Abbott
Dickinson Dickinson
Diana 16S rRNA Gen Región 9 de PivNg (gen Pilin Genes Opa
DNA-citosina repetición de la proteína (diferente
metiltransferasa directa homóloga de región a la
(DR9) las invertasas de Probetec
de la pilina) ET)
Tecnología Amplificación Reacción en RCP en Amplificación Amplificación RCP en
mediada por cadena de la tiempo real por por tiempo real
transcripción polimerasa desplazamiento desplazamiento
(TMA) (RCP) de la cadena de la cadena
Prueba Sí (otra región No No No No No
complementaria diferente a 16S
disponible rRNA)
de sensibilidad más alta que finalmente conducen a la sensibilidad (22). Es muy importante cumplir las
obtención de resultados en menos tiempo. instrucciones del fabricante, en especial en lo que
se refiere a las muestras autorizadas; la recogida, el
Están apareciendo rápidamente nuevas técnicas
transporte y la conservación de las muestras; así como a
analíticas de amplificación de ácidos nucleicos que no
la realización de la PAAN.
pueden anticiparse en este documento. Es importante
examinar la bibliografía pertinente continuamente en No hay ninguna PAAN autorizada que pueda realizarse
busca de información sobre evaluaciones de calidad con las muestras extragenitales, rectales y faríngeas,
de los nuevos ensayos, con el fin de determinar el más apto pero hay cada vez más indicios de que las PAAN son
para cada laboratorio. más sensibles que el cultivo para estas localizaciones
(4–6). Existen datos validados que apoyan su uso, no
4.6.2 Tipos de muestras utilizadas para las obstante, se recomienda la confirmación de las pruebas
PAAN de N. gonorrhoeae positivas (de cualquiera de estas muestras) con pruebas
Se puede usar toda una gama de diferentes tipos de complementarias (PAAN con otra secuencia diana)
muestras con las PAAN, desde las tomadas de forma para evitar resultados positivos falsos (23, 24). Por
cruenta como las muestras para el Papanicolaou (Pap) otro lado, la opción de usar PAAN para las muestras
en base líquida, los hisopos cervicouterinos y los faríngeas debe hacerse con cautela para evitar aquellas
hisopos uretrales (hombres) hasta las tomadas de forma que se sabe de antemano que presentan reacciones
incruenta como las muestras vaginales con hisopo y las cruzadas con las especies de Neisseria comensales o
de orina (hombres y mujeres). con N. meningitidis.
No obstante, distintos fabricantes sacan al mercado

4.6.3 Especificidad de las pruebas de
PAAN que se autorizan para diferentes tipos de
muestras, de manera que es esencial comprobar
amplificación de ácidos nucleicos para
las instrucciones del fabricante o llevar a cabo una N. gonorrhoeae
validación interna exhaustiva. Hay que señalar que la Desde siempre, ha habido problemas con la
orina no es la muestra óptima para la detección de especificidad de la diana elegida, ya que las especies
N. gonorrhoeae en las mujeres debido a su escasa del género Neisseria están muy relacionadas
Gonorrea 37
genéticamente y se encuentra un gran número 4.6.5 Pruebas de amplificación de ácidos
especies comensales de Neisseria en la faringe, el recto nucleicos no autorizadas por la
y, a veces, en el aparato genital inferior. La identificación Administración de Alimentos y
de una secuencia diana específica de N. gonorrhoeae ha Medicamentos de los Estados Unidos de
sido uno de los principales obstáculos y se ha informado América
la aparición de reacciones cruzadas con muchas
Se han descrito PAAN internas que se dirigen, por
especies de Neisseria no gonocócicas al usar algunos
ejemplo, al gen cppB, al DNA-citosina metiltransferasa,
estuches, entre otras N. meningitidis, N. cinerea,
a los opa y al seudogén porA (24, 29 –32) y se usan
N. flavescens, N. lactamica, N. sicca y N. subflava
ampliamente en algunos países. Las que tienen
(22–28). La última generación de estuches que está
mayor acogida son las que se dirigen al seudogén
actualmente en el mercado ha mejorado de manera
porA y a los genes opa ya sea por separado o en
notable en este aspecto, pero sigue siendo un factor
combinación. El seudogén porA no está presente
de consideración a la hora de seleccionar el estuche
en las especies comensales de Neisseria (y el
apropiado para el tipo de muestra que se va analizar
gen porA de N. meningitidis es suficientemente
porque no todas las PAAN utilizadas en la detección de
distinto) y, en consecuencia, esta diana ha resultado
gonococia son iguales en esto (26, 28).
ser sumamente específica para N. gonorrhoeae. No
obstante, varios países han informado recientemente
4.6.4 Sensibilidad, especificidad y prevalencia:
casos de cepas de N. gonorrhoeae raras que contienen
efecto sobre el valor predictivo positivo
un porA meningocócico en vez de un seudogén porA
Debe tenerse en cuenta la prevalencia de la gonorrea gonocócico, lo que da lugar a resultados negativos
en las poblaciones analizadas, además de la falsos de la PAAN (33 –36). Las PAAN que se dirigen al
sensibilidad y la especificidad de la PAAN usada, ya gen cppB pueden variar en cuanto a la sensibilidad y la
que esto afectará el valor predictivo positivo (VPP) de especificidad, ya que algunas cepas de N. gonorrhoeae
la prueba y, en consecuencia, el número de positivos no tienen este gen y, al contrario, algunas cepas de N.
falsos obtenidos (véase el cuadro 4.6). Se propone un meningitidis sí lo tienen y dan reacciones cruzadas.
valor predictivo positivo >90% como mínimo (utilizando Además, las PAAN que se dirigen el gen DNA-citosina
una única PAAN o una PAAN de cribado más otra PAAN metiltransferasa pueden dar reacciones cruzadas con
con una diana diferente) cuando se usen PAAN para especies comensales de Neisseria. En consecuencia, no
detectar N. gonorrhoeae. se recomiendan las pruebas de amplificación de ácidos
Debe tenerse en cuenta que, aun cuando la sensibilidad nucleicos dirigidas al gen cppB ni al gen DNA-citosina
y especificidad de una PAAN esté por encima de metiltransferasa.
95%, el valor predictivo positivo en una población Las PAAN internas pueden requerir más conocimientos
con prevalencia de 1% y de 5% es para la mayoría
técnicos especializados; sin embargo, estas pruebas
de las PAAN aún menor de 90% mientras que, si la
pueden tener una sensibilidad y especificidad altas y
prevalencia es de 10%, el valor predictivo positivo de
pueden resultar una opción eficaz y menos costosa,
la mayoría (pero no todas) de las PAAN es superior a
en particular para un número reducido de muestras.
90%. Esto es particularmente importante para las
También se han desarrollado ensayos basados en
PAAN dobles que detectan tanto N. gonorrhoeae
la reacción en cadena de la polimerasa de detección
como C. trachomatis porque la prevalencia de
múltiple, por ejemplo, N. gonorrhoeae, C. trachomatis,
estas dos infecciones puede diferir notablemente.
Micoplasma genitalium y Trichomonasis vaginalis; sin
En muchos países, la infección por clamidias es
embargo, estos necesitan evaluaciones más exhaustivas
mucho más frecuente que la infección por gonococos,
de sus características de desempeño.
y el algoritmo para el análisis de ambas infecciones
simultáneamente puede que no necesite una prueba En consecuencia, a nivel mundial se utilizan
complementaria para la detección de C. trachomatis, sin muchas pruebas de ampliación de ácidos nucleicos
embargo sí habrá que analizar los positivos de gonorrea comercializadas o incluso elaboradas en el propio
con una segunda PAAN (otra secuencia diana) para obtener laboratorio para N. gonorrhoeae. En el caso de que se
valores predictivos positivos aceptables. utilicen PAAN no autorizadas por la FDA, deben existir
Cuadro 4.6: Efecto de la prevalencia sobre el valor 4.7 Pruebas diagnósticas en el punto de
predictivo positivo en las pruebas sencillas atención (“pruebas rápidas”)
Pruebas A B C No existe ninguna prueba para el diagnóstico analítico
inmediato (“pruebas rápidas” o pruebas diagnósticas
Sensibilidad 97,8% 96,4% 98,0% en el punto de atención) de detección de antígenos con
Especificidad 99,2% 97,9% 99,7% características idóneas de desempeño, por ejemplo
sensibilidad y especificidad; por consiguiente, no puede
VPP prevalencia de 10% 93% 84% 97%
recomendarse ninguna para el diagnóstico de la gonorrea
prevalencia de 5% 87% 73% 95% sin complicaciones ni para la gonorrea complicada. No
prevalencia de 1% 55% 35% 77% obstante, se están poniendo a punto algunas pruebas
rápidas nuevas basadas en los últimos adelantos
procedimientos normativos internacionales —como tecnológicos que, con las características idóneas de
los de la Unión Europea— u otros procedimientos desempeño, serían muy valiosas para el diagnóstico
normativos nacionales que garanticen la calidad y el rápido en el lugar en el que se presta la asistencia
desempeño de las PAAN. Se recomienda claramente sanitaria, ya sea en el consultorio o sobre el terreno.
que solo se usen las PAAN autorizadas a nivel Se podría aceptar una disminución de la sensibilidad
internacional. Si esto no es posible, es fundamental que a cambio de poder diagnosticar y tratar al paciente
la PAAN propuesta haya sido estrictamente validada, mientras está presente, especialmente en poblaciones
antes de utilizarla, conforme a los requisitos locales con recursos limitados y muy vulnerables (37, 38).
frente al menos una PAAN autorizada internacionalmente y
cuando se use posteriormente se añadan los controles Las pruebas diagnósticas en el punto de atención
positivo, negativo y de inhibición adecuados. Por otra podrían también usarse en dichos entornos para
parte, es muy recomendable la participación en un aumentar la especificidad de los algoritmos de manejo
sistema de evaluación externa de la calidad apropiado. sindrómico, lo que reduciría el tratamiento excesivo
y detectaría muchas infecciones asintomáticas,
4.6.6 Control de la calidad y garantía de la especialmente en las mujeres. El examen microscópico
calidad de las pruebas de amplificación de la tinción Gram es un tipo de prueba rápida para el
de ácidos nucleicos diagnóstico de la gonorrea en hombres; sin embargo, este
método carece de la sensibilidad adecuada en la mujer.
En cada serie analítica deben incluirse controles
internos de la calidad. La evaluación interna de la
calidad debe realizarse regularmente volviendo • No existe ninguna prueba diagnóstica rápida
a analizar muestras cuyo resultado original se ha en el punto de atención con la sensibilidad
ocultado. El número y frecuencia de estas evaluaciones necesaria; por consiguiente, ninguna puede
internas dependerá del número total de pruebas recomendarse para el diagnóstico de la
realizadas; por ejemplo 1% a 5% del total analizado gonorrea.
cada mes. • No obstante, se están poniendo a punto
algunas pruebas rápidas nuevas basadas en
La evaluación externa de la calidad puede realizarse
los últimos adelantos tecnológicos, que con las
usando paneles de muestras de los proveedores
características idóneas de desempeño, serían
adecuados de la evaluación externa de la calidad,
muy valiosas para el diagnóstico rápido y el
como el Servicio Nacional de Evaluación Externa de
tratamiento inmediato del paciente.
la Calidad del Reino (NEQAS de Reino Unido; www.
ukneqas.org.uk), el Quality Control of Molecular
Diagnostics (programa europeo de calidad en
diagnóstico molecular) (QCMD; www.qcmd.org) que
sirve a muchos países o mediante un intercambio más
informal de muestras entre los laboratorios.
Gonorrea 39
4.8 Antibiograma pruebas de sensibilidad ordinarias, especialmente
si se analiza un número reducido de cepas. Por
4.8.1 Introducción consiguiente, se usa con más frecuencia el método
Las cepas de N. gonorrhoeae han desarrollado normalizado y con garantía de la calidad Etest,
resistencia a todos los antibióticos de primera línea estrechamente correlacionado con el método de
utilizados anteriormente para el tratamiento de la dilución en agar. La sensibilidad a los antibióticos se
gonorrea, por ejemplo, a las penicilinas, la tetraciclina puede determinar cualitativamente mediante la prueba
y las fluoroquinolonas, dejando las cefalosporinas de de difusión en disco. Se usan también varios métodos
espectro ampliado (ceftriaxona y cefixima) como los de difusión en disco; sin embargo, estos requieren
únicos antibióticos recomendados para el tratamiento de una gran estandarización y un control de la calidad
infecciones gonocócicas en muchos países (2). Durante idóneo para lograr un alto nivel de reproducibilidad y
el último decenio, la sensibilidad a las cefalosporinas una interpretación correcta que refleje adecuadamente
de espectro ampliado también ha disminuido en muchas los valores de CIM de los diferentes antibióticos. Los
regiones del mundo y se ha comprobado el fracaso métodos de difusión en disco son de bajo costo pero
solo se recomienda su uso cuando la determinación
terapéutico con la cefixima en varios países (39 –44).
de la CIM no pueda realizarse, debido a la escasez
Recientemente, se ha comprobado la existencia de
de recursos u otras razones. Si se usa un método de
las primeras cepas gonocócicas extremadamente
difusión en disco, se recomienda que cualquier tipo de
farmacorresistentes (2) con resistencia de alto grado
resistencia nueva o rara que aparezca sea confirmada
incluso a la ceftriaxona (la última opción que quedaba
por la determinación de la CIM. La producción de
para el tratamiento de elección empírico) (3, 43). Si
β-lactamasa suele determinarse mediante la prueba
las cepas resistentes a la ceftriaxona se propagan
de la cefalosporina cromogénica, con discos de nitrocefina
a nivel mundial, la gonorrea no podrá tratarse con
o solución de nitrocefina.
pautas terapéuticas de un único antibiótico en ciertas
circunstancias y especialmente en algunos entornos
(2). En consecuencia, es crucial vigilar la sensibilidad
• Es fundamental vigilar la sensibilidad de N.
de N. gonorrhoeae a los antibióticos a escala local,
gonorrhoeae a los antibióticos debido a la
regional y mundial. La OMS ha revisado de nuevo y
elevada resistencia de los gonococos a los
actualizado el Programa de Vigilancia de la Sensibilidad
antibióticos en todo el mundo y al temor de
de los Gonococos a los Antimicrobianos (GASP,
que no pueda tratarse la gonorrea en ciertas
por sus siglas en inglés). Para más información
circunstancias y, especialmente, en algunos
acerca de la vigilancia de la resistencia esencial a los
entornos.
antibióticos en todo el mundo y el programa mundial
• La determinación de la CIM se realiza por el
GASP de la OMS, véanse las normas de vigilancia de la
método de dilución en agar o Etest.
resistencia gonocócica a los antibióticos de la OMS,
apéndice 4. En junio del 2012, la OMS también lanzó el • La determinación cualitativa de la sensibilidad
WHO global action plan to control the spread and impact a los antibióticos se realiza con el método de
of antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae difusión en disco.
[plan de acción mundial de la OMS para controlar la • Los métodos de difusión en disco exigen
propagación y la repercusión de la resistencia de estandarización y control de la calidad idóneos
Neisseria gonorrhoeae a los antibióticos] (se puede y, lo que es más importante, no miden sino solo
consultar en: http://www.who.int/reproductivehealth/ reflejan la CIM. Únicamente se recurrirá a estos
publications/rtis/9789241503501/en/index.html). métodos cuando la determinación de la CIM
no pueda realizarse debido a, por ejemplo, la
El método de dilución en agar es el método de escasez de recursos.
referencia recomendado para realizar el antibiograma • En todo antibiograma es esencial seguir el
o determinación de la concentración inhibitoria mínima método propuesto con precisión, que deberá
(CIM; en mg/l o µg/ml) de las cepas gonocócicas estar adecuadamente estandarizado, validado y
frente a los antibióticos. Sin embargo, este método sometido a la garantía de la calidad.
puede ser laborioso y poco adecuado para las
Todos los métodos para determinar la sensibilidad a los 4.8.3.2 Criterios de interpretación
antibióticos deben realizarse a partir de cultivos puros y En el cuadro 4.7 se describen los criterios de
frescos (18 a 24 horas) de N. gonorrhoeae que han crecido interpretación recomendados para la sensibilidad, la
en medios no selectivos. Las cepas aisladas también se sensibilidad moderada (disminuida) y la resistencia
habrán sometido a las pruebas necesarias de confirmación cuando se usa la determinación de la CIM. Estos
de la especie y se habrán subcultivado por lo menos una criterios son los del CLSI (45 ), excepto los
vez. En el antibiograma, es importante seguir los pasos del recomendados para la azitromicina (el CLSI (45) no
método propuesto con toda precisión, incluido la selección ha enunciado ningún criterio) que son los criterios del
y uso del medio de agar, los reactivos (antibiótico en polvo, Comité Europeo de Antibiogramas (EUCAST; www.
tiras de Etest, discos y amortiguadores del pH), la siembra, eucast.org). EUCAST es otra organización que enuncia
la incubación y la interpretación. criterios de interpretación para el antibiograma; en el
caso de N. gonorrhoeae, en general, sus valores críticos
4.8.2 Elección de los antibióticos del son algo inferiores a los recomendados por el CLSI.
antibiograma
La lista de antibióticos que se probarán debe incluir 4.8.3.3 Control de la calidad de la determinación de la
aquellos recomendados a escala regional o nacional CIM (dilución en agar y Etest)
y empleados para el tratamiento de las infecciones Lo ideal es incluir una selección adecuada de las cepas
gonocócicas, así como los recomendados por el de referencia de N. gonorrhoeae de la OMS del 2008
programa local de vigilancia de la sensibilidad a los (16) con cada lote de antibiograma y siempre que se
antibióticos. Sin embargo, pueden probarse otros, use un nuevo lote de polvo antibiótico, de medio de agar
especialmente en los laboratorios de referencia, o de tiras Etest.
como, por ejemplo, los antibióticos recomendados para
La CIM de cada antibiótico y la cepa de referencia
el tratamiento en otros entornos, los antibióticos que
deben estar registradas en un gráfico de control de
puedan incluirse en tratamientos en el futuro y aquellos
la calidad. Los valores aceptables para la CIM de
que sean útiles para estudios de cohortes o estudios
diferentes antibióticos en el control de la calidad se
longitudinales locales de N. gonorrhoeae.
indican en el cuadro 4.8. Las cepas de referencia de
N. gonorrhoeae de la OMS del 2008 (16) se pueden
4.8.3 Determinación de la concentración obtener también de la National Collection of Type
inhibitoria mínima (dilución en agar y Cultures del Reino Unido (NCTC; www.hpacultures.
Etest) org.uk/collections/nctc.jsp), denominadas NCTC
13477–13484; y de la Culture Collection University of
4.8.3.1 Medio de agar recomendado
Gothenburg (Gotemburgo, Suecia) (CCUG; www.ccug.
El medio recomendado para determinar la CIM de se), denominadas CCUG 57595–57602. Las cepas de
diferentes antibióticos, usando el método de dilución referencia de N. gonorrhoeae de la OMS del 2008 (16)
en agar o Etest, para cepas de N. gonorrhoeae es también pueden usarse para el control de la calidad de
una base de agar para gonococos (GC), como Difco GC otras pruebas de laboratorio fenotípicas y genéticas de
Medium Base, enriquecida con 1% de suplemento de N. gonorrhoeae así como para la evaluación externa de
crecimiento* o 1% IsovitaleX-Vitox. Como ejemplo, véase la calidad. En las normas de vigilancia de la resistencia
el medio GCVIT descrito en el anexo 4. de gonococos a los antimicrobianos de la OMS, apéndice
4, se describe detalladamente las aplicaciones de las
* De conformidad con el Instituto de Estándares Clínicos y cepas de referencia de N. gonorrhoeae (16) de la OMS
de Laboratorio (CLSI por su sigla en inglés; 45): 1,1 g de del 2008 y las instrucciones para su uso. Sin embargo,
L-cisteína, 0,03 g de guanina HCl, 3 mg de tiamina HCl, no es necesario usar las ocho cepas de referencia
13 mg ácido p-aminobenzoico (PABA), 0,01 g de vitamina de N. gonorrhoeae de la OMS del 2008 (16) para el
B12, 0,1 g cocarboxilasa, 0,25 g NAD, 1 g adenina, 10 g control de la calidad del antibiograma. Muchos centros
L-glutamina, 100 g glucosa y 0,02 g nitrato férrico (en 1 litro utilizan principalmente las cepas G, K, M, O y P de la
de agua). En el caso de las pruebas de dilución en agar con OMS. El panel de cepas de N. gonorrhoeae de la OMS
carbapenemes y clavulanato se requiere un suplemento de del 2008, el panel original (cepas A–E) y otras cepas
crecimiento sin cisteína.
Gonorrea 41
Cuadro 4.7: Criterios de interpretación de la CIM para la clasificación de N. gonorrhoeae en categorías de
sensibilidad según el CLSI, con excepción de azitromicina que se hace según el EUCAST
MIC (mg/l)
Respuesta intermedia
Antibiótico Sensible (S) (I) Resistente (R)
Ceftriaxona ≤0,25 PDDa PDDa
Cefotaxima ≤0,5 PDDa PDDa
Cefixima ≤0,25 PDDa PDDa
Cefpodoxima ≤0,5 PDDa PDDa
Bencilpenicilina ≤0,06 0,12–1 ≥2
Ciprofloxacina ≤0,06 0,12–0,5 ≥1
Ofloxacina ≤0,25 0,5–1 ≥2
Espectinomicina ≤32 64 ≥128
Azitromicinab ≤0,25 0,5 ≥1c
CIM, concentración inhibitoria mínima.

a
PDD, pendiente de determinar. Los valores críticos aún no han podido determinarse debido al número insuficiente de cepas resistentes y a la
demostrada falta de correlación entre la CIM de las cepas aisladas y el resultado del tratamiento.
b
CLSI (45) no ha recomendado valores críticos para la azitromicina y, en consecuencia, se dan los valores críticos del Comité Europeo de Pruebas
de Sensibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST; www.eucast.org).
c
En América del Norte y del Sur, se usa con frecuencia un valor crítico de resistencia igual o superior a 2 mg/l, que ha sido recomendado por los
Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos de América (ETS/www.cdc.gov/GISP2007/).
de referencia de N. gonorrhoeae de la OMS que se estéril (o equivalente). A continuación, se inoculan

obtienen también de fuentes de la OMS, como el Centro aproximadamente 104 unidades formadoras de colonias
Colaborador de la OMS para ETS y VIH, Sydney (Australia) (UFC) en la superficie de los medios que contienen
y el Centro Colaborador de la OMS para Gonorrea y otras antibióticos y en dos placas con medio sin antibióticos
ITS, Örebro (Suecia). con un replicador automático de Steer, inoculador
de puntas múltiples, o un asa de siembra calibrada.
4.8.4 Determinación de la CIM por el método de Las placas se incuban luego hasta el día siguiente y
posteriormente se examina el crecimiento. La CIM de
dilución en agar
un antibiótico es la concentración más baja capaz
4.8.4.1 Introducción de inhibir el crecimiento de una cepa aislada. Una
La dilución en agar es el método de referencia modificación del método de dilución en agar para
recomendado para el antibiograma cuantitativo o determinar todas las CIM es la técnica de los puntos
determinación de la CIM de las cepas gonocócicas de corte por dilución en agar, que es un método
frente a los antibióticos. Los antibióticos se incorporan similar pero el medio de agar solo contiene una o
a una base de agar para GC suplementado con una dos concentraciones de antibiótico, que sirven para
solución que contiene 1% de factores de crecimiento clasificar las cepas aisladas como resistentes (usando
definidos o 1% de IsovitaleX o Vitox (véase la sección una placa de agar con una concentración de antibiótico
4.8.3.1) en diluciones duplicadas sucesivas. coincidente con el punto de corte que resulta como
resistencia) o moderadamente sensibles (usando una
Las cepas de N. gonorrhoeae que se van a probar placa de agar con una concentración coincidente con
se dejan crecer hasta el día siguiente en el medio no el punto de corte que produce sensibilidad intermedia).
selectivo de agar para gonococos y luego se suspenden Esta técnica del punto de corte es útil para el cribado de
en caldo de Mueller–Hinton (MH) o solución salina un gran número de cepas.
Cuadro 4.8: Límites aceptables de la CIM y clasificación según categorías de sensibilidad a los antibióticos
(modificación a partir de la referencia 16) y algunas características de tipificación de las cepas de referencia
de N. gonorrhoeae de la OMS del 2008 recomendadas en el control de la calidad. También se indican los
límites aceptables de la CIM para N. gonorrhoeae ATCC 49226 recomendada por el CLSI.
Cepas de referencia de la OMS

OMS OMS OMS OMS OMS OMS OMS OMS ATCC
Antibiótico (mg/L) F G K L M N O P 49226a
0,016– 0,25–1,0 1,0–4,0 1,0–4,0 4,0–16,0 4,0–16,0 >32 (R) 0,125–0,5 0,25–1,0
Penicillina G 0,064 (S) (I) (R) (R) (R) (R) (I)
<0,016 <0,016 0,25–1,0 0,125–0,5 <0,016 <0,016 <0,016– <0,016 0,004–

Cefixima (S) (S) (DS)b (DS)b (S) (S) 0,032 (S) (S) 0,032
<0,002 0,004– 0,032– 0,064– 0,008– 0,002– 0,016– 0,002– 0,004–

Ceftriaxona (S) 0,016 0,125 0,25 0,032 0,008 0,064 0,008 0,016
(S) (DS)b (DS)b (S) (S) (S) (S)
0,25– 0,5– 0,5– 1,0– 0,5– 0,25–1,0 0,5– 2,0– 1,0–

Eritromicina 1,0 (S) 2,0 (I) 2,0 (I) 4,0 (I) 2,0 (I) (S) 2,0 (I) 8,0 (R) 2,0c
0,064– 0,125–0,5 0,125– 0,25– 0,125–0,5 0,064– 0,125–0,5 1,0– 0,5–

Azitromicina 0,25 (S) (S) 0,5 (S) 1,0 (I) (S) 0,25 (S) (S) 4,0 (R) 1,0c
0,002– 0,064– >32 (R) >32 (R) 1,0–4,0 2,0–8,0 0,004– 0,002– 0,001–
Ciprofloxacina 0,008 (S) 0,25 (I) (R) (R) 0,016 (S) 0,008 (S) 0,008
Espectinomycina 16–64 (S) 8–32 (S) 8–32 (S) 8–32 (S) 8–32 (S) 8–32 (S) >1024 (R) 8–32 (S) 8,0–32,0
Producción de
No No No No Sí Sí Sí No No
ß-lactamasa
Serotipo Arst Arst Bpyust Brpyust Bpyust Arst Boys Bopt
TSMA-NGd ST3303 ST621 ST1424 ST1422 ST3304 ST556 ST495 ST3305
Prolilminopeptidasa- No Sí No No No Sí No No
negativae
Téngase en cuenta que la exactitud de las CIM indicadas deben utilizarse e interpretarse con precaución porque se han obtenido usando solo
un método Etest específico y, en consecuencia, pueden variar al usar otros métodos. Sin embargo, los fenotipos de resistencia identificados
(clasificación SIR) deben concordar entre los diferentes métodos.
a
Límites aceptables de las CIM (CLSI; 45).
b
SD, sensibilidad disminuida porque las cepas con estas CIM tienen los determinantes principales de la resistencia a las cefalosporinas de
espectro ampliado.
c
Límite establecido por el Laboratorio Nacional de Microbiología de Canadá.
d
Tipificación de las secuencias multiantígeno de N. gonorrhoeae.
e
No produce la enzima prolil-iminopeptidasa (PIP), que puede dar lugar a una identificación dudosa o negativa falsa de especies de N.
gonorrhoeae en caso de usar pruebas bioquímicas u otras basadas en la reacción entre una enzima y un sustrato (17, 20).
4.8.4.2 Preparación de las soluciones antibióticas la concentración añadida a las placas de agar debe
Deben obtenerse polvos antibióticos o comprimidos para calcularse teniendo en cuenta la actividad o potencia
disolver directamente de las empresas farmacéuticas (principio activo por mg) del antibiótico, según las
u otros proveedores homologados. Dado que la mayoría especificaciones del fabricante. Además, deben
de los antibióticos no tienen una pureza del 100%, seguirse estrictamente las indicaciones relativas a la
Gonorrea 43
disolución del polvo antibiótico, la fecha de caducidad 4.8.4.3 Preparación de las placas para el método de
y las instrucciones de conservación. Los antibióticos dilución en agar
se deben incorporar al medio de agar en diluciones Para cada antibiótico y concentración antibiótica que se
duplicadas, por ejemplo, utilizando un esquema en quiera probar, se prepara un volumen de, por ejemplo,
el que se agrega 1 parte de disolución antibiótica a 9 89 ml de una base de agar para GC adecuada, como
partes de agar (véase la sección 4.8.4.3). Difco GC Medium Base (3,6 g de base de agar para GC
y 89 ml de agua destilada) en un frasco de vidrio, que
Por ejemplo, preparar soluciones madre disolviendo
será suficiente para la preparación de cuatro placas.
128 mg o un peso equivalente a 128 mg de principio
Agar plates without antimicrobials incorporated to be
activo en una cantidad mínima de disolvente
used as negative control should also be prepared.
(generalmente 5 a 10 ml, seguir al pie de la letra las
instrucciones del fabricante) y seguir diluyendo con Cuadro 4.9: Disolventes utilizados en la preparación
agua destilada (u otro disolvente recomendado) hasta de las soluciones antibióticas para la determinación
un volumen exacto de 25 ml. Estas soluciones madre de la CIM por el método de dilución en agara
contienen antibiótico en una concentración de 5120 mg/l,
que es adecuada para preparar las soluciones de Antibiótico Disolvente
trabajo. Si no hay otra recomendación del fabricante, Ceftriaxona Agua destilada
pueden usarse los disolventes indicados en el cuadro
Cefixima Tampón fosfato 0,1 mol/l, pH 7,0
4.9 para preparar las soluciones madre. A continuación,
las soluciones se esterilizan pasándolas a través de una Bencilpenicilina Agua destilada
membrana filtrante (filtro de 0,22 mµ). Se preparan Ciprofloxacina Agua o HCl 0,1 mol/l
alícuotas en frascos cerrados herméticamente que se
conservan a –20 °C o, de preferencia, a –70 °C durante Etanol al 95% o ácido acético
Azitromicina
glacialb
6 meses. Una vez descongeladas, las soluciones
tienen que usarse de inmediato y no deben congelarse Etanol al s95% o ácido acético
Eritromicina
nuevamente para un uso posterior. glacialb
El paso siguiente consiste en preparar una serie de Espectinomicina Agua destilada

diluciones de trabajo duplicadas de cada antibiótico Gentamicina Agua destilada
que contengan concentraciones 10 veces superiores
Kanamicina Agua destilada
a las concentraciones finales de antibiótico que
deben obtenerse en el agar. Un ejemplo de protocolo Tetraciclina Agua destilada
estandarizado para preparar estas diluciones de trabajo Cloranfenicol Etanol al 95%
se muestra en el cuadro 4.10.
a
Si el fabricante indica el disolvente y el procedimiento para la
El intervalo de concentraciones usadas en el disolución del polvo antibiótico, se deben seguir sus instrucciones al
pie de la letra.
antibiograma debe adaptarse a cada antibiótico y a b
En caso de utilizar ácido acético glacial, usar la mitad del volumen
los niveles de resistencia del país o la región. Muchos de agua destilada, a continuación agregar ácido acético glacial gota
antibióticos presentan grandes diferencias en los a gota hasta la disolución total, sin exceder 2,5 µl/ml.
patrones de sensibilidad de las cepas gonocócicas de

diferentes países. Con objeto de disminuir el número de Esterilizar en autoclave el medio de agar que está en
concentraciones que tienen que probarse, debe tenerse el frasco, luego dejar que se enfríe en un baño de agua
una aproximación de la variación de la sensibilidad a los a 50 °C antes de agregar asépticamente los suplementos
antibióticos examinados en esa zona. Si se desconoce, estériles (1 ml de enriquecimiento, IsoVitalex o Vitox)
puede obtenerse determinando los límites inferior y y 10 ml de solución de trabajo antibiótica, es decir, la
superior del intervalo de sensibilidad de cada uno de concentración a probar (véase el cuadro 4.10). Mezclar
los antibióticos con un número reducido de cepas. En de inmediato suavemente invirtiendo el frasco 3 veces,
general, es más pertinente e importante conocer el retirar la tapa del frasco, flamear la boca del frasco
valor del límite superior que el del límite inferior de la y verter aproximadamente 20 a 25 ml de medio en
CIM. las placas (diámetro 90 mm), se formará una capa
de aproximadamente 3,5 a 4,5 mm. Asegurarse de 4.8.4.4 Procedimiento para la determinación de la CIM
que se eliminan las burbujas agitando suavemente las por dilución en agar
placas o flameando rápidamente la superficie del agar, Preparación del inóculo bacteriano: Usar un asa de
por ejemplo, con un mechero de Bunsen. Una vez que siembra estéril o un hisopo para recoger las colonias de
el agar se ha solidificado a la temperatura ambiente, N. gonorrhoeae de un cultivo puro de 18 a 24 horas en
conservar a 4 °C las placas invertidas dentro de bolsas medio de agar para gonococos no selectivo y preparar
de plástico cerradas hasta su uso. En estas condiciones, una suspensión bacteriana homogénea (turbidez
la actividad antibiótica se mantiene prácticamente sin equivalente al estándar 0,5 de la escala de McFarland,
pérdidas hasta 2 semanas. Sin embargo, se recomienda aproximadamente 10 8 UFC por ml) en 1 ml de caldo de
que las placas que contienen penicilina, por ser menos Mueller–Hinton o solución salina estéril (la suspensión
estable, se usen en el plazo de una semana. También debe usarse antes de transcurridos 15 minutos).
deben prepararse las placas de agar sin antibiótico que
se usarán como control negativo. Preparar una dilución 1:10 de la suspensión con el caldo
de Mueller–Hinton o con la solución salina estéril de
forma que se obtenga una concentración de 107 UFC/ml.
Cuadro 4.10: Preparación de las diluciones de los antibióticos para la determinación de la CIM por el método
de dilución en agar
Solución antibiótica Concentración Concentración

Volumen (mg/l) de la final (mg/l) a la
Concentración Volumen (ml) agua dilución de dilución 1:10 en
Etapa (mg/l) Fuente (ml) + destilada = trabajo agar
1 5120 Madre 1
2 5120 Madre 1 1 2560 256
3 5120 Madre 1 3 1280 128
4 5120 Madre 1 7 640 64
5 640 Etapa 4 1 1 320 32
6 640 Etapa 4 1 3 160 16
7 640 Etapa 4 1 7 80 8
8 80 Etapa 7 1 1 40 4
9 80 Etapa 7 1 3 20 2
10 80 Etapa 7 1 7 10 1
11 10 Etapa 10 1 1 5 0,5

12 10 Etapa 10 1 3 0,25
2,5
13 10 Etapa 10 1 7 1,25 0,125
14 1.25 Etapa 13 1 1 0,625 0,06
15 1.25 Etapa 13 1 3 0,3125 0,03
16 1.25 Etapa 13 1 7 0,156 0,016
17 0.156 Etapa 16 1 1 0,08 0,008
18 0.156 Etapa 16 1 3 0,04 0,004
19 0.156 Etapa 16 1 7 0,02 0,002
Gonorrea 45
Figura 4.9
Resultados de la determinación de la CIM para N. gonorrhoeae usando el método de dilución en agar. El
medio que contenía 0,5 mg/l de penicilina (placa izquierda) presenta inhibición de varias cepas gonocócicas,
mientras que todas las cepas crecen bien en el medio de control (placa derecha).
Transferir cuidadosamente 0,5 ml de cada suspensión al las placas invertidas durante 20 a 24 horas a 36 ± 1 °C
pocillo correspondiente de un replicador o inoculador de en una atmósfera enriquecida con 5 ±1% de CO2 y una
puntas múltiples. humedad alta (70% a 80%). Esterilizar las puntas de
las pipetas y los pocillos envueltos en papel de aluminio
Inoculación de las placas: Las placas de agar deben
en el autoclave, en una estufa caliente a 160 °C durante
secarse antes de la inoculación, es decir, colocarse
2 horas o sumergiéndolos en etanol al 70% y posterior
en una incubadora en posición invertida con la tapa
entreabierta. Con el replicador o inoculador de flameado.
puntas múltiples se transferirá aproximadamente Lectura de los resultados: Los resultados de las cepas
de 1 a 2 µL de cada suspensión a la superficie del de referencia de la OMS de 2008 (véase el cuadro 4.8
agar en áreas circulares de 5 a 7 mm de diámetro, de sobre las CIM aceptables de diferentes antibióticos) y
forma que se obtenga un inóculo bacteriano final de las placas de control negativo (debe haber crecimiento
aproximadamente 10 4 UFC por punto de aplicación. puro confluente de gonococos en ambas placas) deben
Si el replicador o el inoculador de puntas múltiples examinarse y aprobarse antes de leer los otros resultados.
transfiere un volumen más pequeño o más gran Si no se aprueban, localizar el problema y repetir la
de suspensión, la dilución del inóculo tiene que prueba. En el caso de las cepas probadas, se anota la
ajustarse, es decir, conseguir que el inóculo final sea CIM como la mínima concentración de antibiótico que
de aproximadamente 10 4 UFC por punto de aplicación. inhibe completamente el crecimiento (fig. 4.9).
Cuando se pruebe un número reducido de cepas,
Interpretación de los resultados: Interpretar los
puede usarse un asa de siembra de plástico estéril de 1
resultados de las cepas probadas de acuerdo con la
µL. Sembrar primero una placa con el control negativo
categoría de sensibilidad (cuadro 4.7).
(que no contenga ningún antibiótico), y a continuación
la serie de placas que contienen las diferentes
4.8.5 Determinación de la CIM por el método
concentraciones del antibiótico, comenzando con la
Etest
concentración más baja de cada antibiótico.
Por último, sembrar una segunda placa con el 4.8.5.1 Introducción
control negativo para asegurarse de que no ha habido Etest es una técnica cuantitativa para determinar la
contaminación durante la siembra. Para el control de la CIM de los antibióticos frente a los microorganismos.
calidad se recomienda sembrar las cepas de referencia Etest utiliza tiras plásticas calibradas con una escala
de N. gonorrhoeae de la OMS del 2008 (16) (véase el de CIM en µg/ml (mg/l) y un código para identificar el
cuadro 4.8). Dejar que los inóculos se sequen e incubar antibiótico. La otra cara de la tira está impregnada
de un gradiente de concentraciones de antibiótico usarse en un plazo de 15 minutos). No emplear
predefinido. Una vez aplicada la tira a la superficie nunca un caldo nutritivo para preparar la suspensión.
de una placa de agar, el antibiótico se difunde en el
4. Sumergir un hisopo estéril nuevo en la suspensión y
medio. Se producirá una zona elíptica de inhibición
eliminar el líquido excesivo apretando y rotando el
del crecimiento de N. gonorrhoeae sembrada en el
hisopo contra la pared del tubo.
medio (antes de aplicar la tira) e incubada hasta el día
siguiente si es sensible al antibiótico que se prueba. 5. Sembrar toda la superficie de agar de la placa de
La CIM debe leerse en la intersección de la elipse y la GCVIT por igual en tres direcciones (fig. 4.10) de
escala de gradiente marcada en la tira. En lo que se forma que se obtenga un crecimiento confluente.
refiere a la conservación de las tiras, el desempeño y 6. Volver a colocar la tapa de la placa y dejar que la
la lectura de los resultados de Etest, se deben seguir al superficie del agar se seque durante
pie de la letra las instrucciones del fabricante. aproximadamente 10 minutos.
4.8.5.2 Protocolo para la determinación de la CIM por 7. Presionar el aplicador Etest sobre una tira Etest para
Etest sacarla (o usar unas pinzas estériles), colocar la tira
sobre la superficie de agar y empujar el émbolo
1. Secar (deben estar sin humedad visible, pero no
hacia abajo para liberar la tira.
se deben secar en exceso) el número de placas
de agar de GCVIT (véase el anexo 4) necesarias. 8. Comprobar que la tira está totalmente en contacto
Dejar que las tiras de Etest se atemperen durante con el agar y eliminar las posibles burbujas de aire
aproximadamente 30 minutos. Una vez abierto un con cuidado pasando rápidamente un asa de
empaque de Etest, se conservará en un recipiente siembra desde la parte de menor a mayor
hermético con un secante. concentración de antibiótico.
2. Dejar que las tiras de Etest se atemperen durante 9. Colocar cuatro tiras de Etest como máximo por placa
aproximadamente 30 minutos. Una vez abierto un de 140 a 150 mm de diámetro y una tira por placa
empaque de Etest, se conservará en un recipiente de 90 mm.
hermético con un secante.
10. Una vez colocada la tira Etest en el agar, no debe
3. Recoger con un asa de siembra o un hisopo estériles moverse ya que el antibiótico se libera rápidamente.
colonias de N. gonorrhoeae de un cultivo puro tras
11. Incubar inmediatamente las placas invertidas
incubación de 18 a 24 horas en un medio de agar
durante 20 a 24 horas a 36 ± 1 °C en una atmósfera
para gonococos no selectivo y preparar una
enriquecida con 5 ±1% de CO2 y una humedad
suspensión bacteriana homogénea (con una turbidez
elevada (70% a 80%) (en incubadora de CO2 o si no
de 0,5 en la escala nefelométrica de McFarland,
está al alcance, en una jarra de anaerobiosis con
aproximadamente 108 UFC por ml) en 1 ml de
vela y algo más de humedad).
solución salina estéril o PBS (la suspensión debe
1. Sembrar en una dirección 2. Girar la placa 90° y sembrar 3. Girar la placa 45° y
hacia abajo toda la en una dirección hacia abajo nuevamente sembrar en una
superficie de agar. toda la superficie de agar. dirección hacia abajo toda la
superficie de agar.
Figura 4.10
Siembra con hisopo de las placas de cultivo para Etest
Gonorrea 47
4.8.5.3 Lectura e interpretación de los resultados del 4.8.6 Método de difusión en disco
Etest después de la incubación
4.8.6.1 Introducción
1. Los resultados de las cepas de referencia de la
OMS del 2008 (véase el cuadro 4.8 sobre las CIM Las pruebas de difusión en disco son técnicas
aceptables de diferentes antibióticos), cuando estén cualitativas para clasificar las cepas aisladas en
incluidas como control de la calidad, deben sensibles, moderadamente sensibles (o sensibilidad
examinarse y aprobarse antes de leer los otros disminuida) o resistentes a diferentes antibióticos. En
resultados. Si no se aprueban, localizar el problema consecuencia, estos métodos no determinan la CIM
y repetir la prueba. En el caso de las cepas exacta del antibiótico frente a los microorganismos; sin
probadas, leer las placas solo cuando se vea embargo, deben reflejar las CIM. En el método de
crecimiento suficiente y la elipse de inhibición esté difusión en disco se emplean discos comercializados
claramente visible. De lo contrario, la prueba tendrá que están impregnados con una concentración
que repetirse con más crecimiento. conocida de antibiótico. Este se difunde en la
superficie de agar sembrada con la cepa bacteriana y
2. Leer la CIM exacta en la zona de intersección de produce un gradiente de concentración que es más
la elipse y la escala de CIM de la tira Etest (fig. alto cerca del disco y disminuye proporcionalmente al
4.11). Si la intersección de la elipse de inhibición alejarse. Tras la incubación, se observa una zona de
con la tira Etest está entre dos valores de CIM, leer
inhibición que se mide y posteriormente se interpreta
siempre el valor más alto. Se debe leer el punto
atendiendo a la categoría de sensibilidad. Hay varios
extremo de completa inhibición de todo crecimiento,
métodos de difusión en disco usados internacionalmente;
incluidos los velos de crecimiento, la microcolonias
sin embargo, todos requieren una buena estandarización
y las macrocolonias aisladas.
y un control de la calidad adecuado para lograr un alto
3. El crecimiento a lo largo de toda la tira implica nivel de reproducibilidad y que reflejen bien la CIM de
que no hay inhibición, es decir, la CIM es mayor los antibióticos probados. Las diferencias principales
que (“>”) la concentración más alta de la tira. Si entre estos métodos residen en la diferente potencia de
la elipse de inhibición está por debajo de la tira y los discos (contenido de antibiótico) y en el agar
no se cruza con la misma significa que la CIM es empleado, que da lugar a distintos valores críticos de
inferior (“<”) a la concentración más baja de la tira. la clasificación en categorías de sensibilidad. El
método de difusión en disco del CLSI (45 ) y de la
4. Interpretar los resultados de las cepas probadas
British Society for Antimicrobial Chemotherapy
atendiendo a la categoría de sensibilidad (véase el
[sociedad británica de quimioterapia antimicrobiana]
cuadro 4.7).
(BSAC; www.bsac.org.uk) son métodos que se han
usado y recomendado en varias regiones (46). En el
presente manual de la OMS se describe la prueba de
difusión en disco por el método calibrado para el análisis
dicotómico de la sensibilidad (antibiograma dicotómico
calibrado) (47, 48). Este método se usa para el
antibiograma y la vigilancia gonocócica en, por ejemplo,
la Región del Pacífico Occidental y la Región de Asia
Sudoriental de la OMS. NOTA: El medio de agar, el
protocolo y los criterios de interpretación del método
de antibiograma dicotómico calibrado difieren de los
utilizados en los otros métodos de difusión en disco. Si
se utilizan estos métodos, deben seguirse
estrictamente las instrucciones que correspondan.
Figura 4.11
Resultados de la determinación de la CIM para N.
gonorrhoeae usando Etest. La CIM de penicilina
G (PG) se determina en el punto de intersección
de la elipse con la tira (0,094 mg/l).
Cuadro 4.11: Criterios de interpretación para la clasificación de N. gonorrhoeae en la categoría de sensibilidad
correspondiente usando el método de antibiograma dicotómico calibrado; debe medirse el radio anular en mm
y no el diámetro del halo.
Categoría de sensibilidad
Contenido del Sensibilidad
Antibiótico disco Resistencia reducida Sensibilidad
Bencilpenicilina 0.5 IU <3 mm 3–9 mm >9 mm
Azitromicina 15 µg <8 mm — ≥8 mm
Ciprofloxacina probadoa
–– Ácido nalidíxico 30 µg 0 mm 0 mm >6 mm
–– Ciprofloxacina 1 µg ≤6 mm >6 mm >6 mm
Ceftriaxone testingb
–– Ceftriaxona 0.5 µg TBDc 5–9 mm >9 mm
–– Cefpodoxima 10 µg TBDc ≤12 mm >12 mm
Espectinomicina 100 µg <6 mm — ≥6 mm
a
Para probar la sensibilidad a la fluoroquinolona (ciprofloxacino), deben usarse discos de ácido nalidíxico y de ciprofloxacino, y leerse
simultáneamente.
b
Para probar la sensibilidad a la ceftriaxona, deben usarse discos de ceftriaxona y de cefpodoxima, y leerse simultáneamente.
c
PDD, pendiente de determinar. Debido a un número insuficiente de cepas resistentes y a la falta de correlación demostrada entre la CIM de las cepas
aisladas y el resultado del tratamiento, los valores críticos no pueden determinarse todavía. Las cepas con una sensibilidad/resistencia reducida a la
ceftriaxona deben confirmarse con la prueba de la CIM (dilución en agar o Etest) en un laboratorio local o idealmente en un laboratorio de referencia
de la OMS.
4.8.6.2 Medio de agar recomendado en el método de 4.8.6.4 Control de la calidad del método de
antibiograma dicotómico calibrado antibiograma dicotómico calibrado
El medio utilizado con este método para las cepas de N. Se deben incluir las cepas de referencia de N.
gonorrhoeae es agar chocolate que incluye una base de gonorrhoeae OMS C, OMS K y OMS P (si se prueba la
agar Columbia (Oxoid, es adecuado; si se usan otras azitromicina) con cada lote de antibiograma y siempre
marcas comerciales, se evaluará la calidad) con 8% de que se utilice un nuevo lote de medio de agar o de
sangre “chocolatada” de caballo a 70 °C durante 30 discos. El radio anular de cada antibiótico y la cepa de
minutos (véase el anexo 4). referencia deben registrarse en un gráfico de control de
la calidad. Los radios anulares aceptados en el control
Los otros medios no se han validado y no deben
de la calidad se indican el cuadro 4.12.
usarse sin que se lleve a cabo una evaluación estricta
y probablemente un ajuste de los criterios de 4.8.6.5 Protocolo del método de antibiograma
interpretación. dicotómico calibrado
1. Secar (placas sin humedad visible, pero no secar
4.8.6.3 Criterios de interpretación del método de
en exceso) el número necesario de placas de agar
antibiograma dicotómico calibrado
chocolate (véase el anexo 4). Secar las placas
En el cuadro 4.11 se indican los criterios de
invertidas, con la tapa quitada, a 36 ± 1 °C durante
interpretación de la sensibilidad, sensibilidad disminuida
1 hora.
y resistencia que se recomiendan con el método de
antibiograma dicotómico calibrado (48). 2. Tomar un muestra de la mayor parte de las colonias
de N. gonorrhoeae (incubadas desde el día anterior,
de al menos 1 a 2 mm de diámetro) en medio de
Gonorrea 49
Cuadro 4.12: Antibióticos, potencia de los discos y radios anulares de inhibición aceptables para las cepas de
referencia de N. gonorrhoeae de la OMS recomendadas para el control de la calidad
Cepa/antibiótico Potencia del disco Radios anulares (mm)

N. gonorrhoeae ACM 5239 (OMS C)
Azitromicina 15 µg 8,9–12,5
Bencilpenicilina 0,5 IU 2,1–4,1
Cefpodoxima 10 µg 10,9–14,5
Ceftriaxona 0,5 µg 8,2–11,0
Ciprofloxacina 1 µg 12,7–16,3
Ácido nalidíxico 30 µg 11,3–14,5
Espectinomicina 100 µg 6,9–8,9
N. gonorrhoeae OMS K
Cefpodoxima 10 µg 7,6–11,1
Ceftriaxona 0,5 µg 7,3–9,3
N. gonorrhoeae OMS P
Azitromicina 15 µg 3,8–7,4
agar para gonococos no selectivo con un asa de 6. Eliminar el exceso de inóculo con una pipeta de
siembra de plástico (1 µ) o con un alambre de Pasteur estéril.
cromoníquel recto (después de flamear y dejar que
7. Dejar que se seque la placa durante
se enfríe). Si solo hay colonias pequeñas (<1 mm),
aproximadamente 10 a 15 minutos a temperatura
puede ser necesario recoger de 3 a 5 colonias para
ambiente (las placas no deben dejarse más de 15
que se vean en la punta del alambre recto.
minutos después de que el inóculo se haya secado).
3. Preparar una suspensión en 2,5 ml de solución
8. Poner los discos de antibiótico (atemperados con el
salina estéril (aproximadamente 107 UFC por ml)
ambiente) en la placa inoculada usando pinzas
rotando el alambre recto al menos 10 veces y
estériles o un dispensador de discos. En una placa
tocando con la punta el fondo del tubo de ensayo.
de 90 mm pueden ponerse hasta seis discos. Los
Asegurarse de que el material se ha desprendido de
discos se colocarán bien nivelados y no deben
la punta, mezclar el inóculo al menos 10 veces
retirarse una vez que han tocado el agar.
usando una pipeta de Pasteur estéril y comprobar
que la solución es homogénea. Un inóculo 9. Incubar las placas durante 18 horas a 36 ± 1 °C en
demasiado denso causará una ligera disminución una atmósfera enriquecida con un 5±1% de CO2
del tamaño de los halos. Un inóculo liviano causará (70% - 80% de humedad). Puede usarse una
un aumento marcado del tamaño de los halos. incubadora de CO2 o una jarra de anaerobiosis con
vela y algo más de humedad.
4. Usar la misma pipeta para transferir toda la
suspensión a la superficie de la placa de agar 10. Medir los radios anulares con una regla de plástico
chocolate que se ha secado antes. graduada en mm o un compás nonio (fig. 4.12). Los
resultados de las cepas de referencia de la OMS,
5. Distribuir el inóculo meciendo la placa y comprobar
usadas como control de la calidad, deben leerse y
que la suspensión cubre toda la superficie de agar.
aprobarse antes de seguir leyendo los otros
resultados (véase el cuadro 4.12). Si no se
aprueban, buscar el problema y solucionarlo antes 2. Recoger con un asa estéril varias colonias del
de repetir el antibiograma. cultivo gonocócico puro sembrado el día anterior y
estriarlas sobre la superficie del disco.
11. Interpretar el tamaño de los halos de acuerdo con la
categoría de sensibilidad (véase el cuadro 4.11). 3. Si la reacción es positiva se produce un color
rojo en el plazo de 1 minuto, generalmente. Sin
4.8.7 Detección de la resistencia conferida por embargo, las reacciones positivas débiles pueden
plásmidos a la penicilina tardar más tiempo, pero esto es muy raro. Un
N. gonorrhoeae puede tener plásmidos productores resultado negativo se ve cuando no hay cambio de
de una enzima (ß-lactamasa [penicilinasa]) que color (permanece amarillo).
inactiva algunos compuestos penicilínicos como
la bencilpenicilina, penicilina genérica, ampicilina 4.8.7.2 Método de la solución de nitrocefina
y amoxicilina. Se han empleado varios métodos El método de la solución de nitrocefina se realiza ya
cualitativos para detectar la producción de ß-lactamasa sea dejando gotear el reactivo directamente sobre las
por los microorganismos. colonias crecidas en medios selectivos o no selectivos o
inoculando la solución en un portaobjetos de vidrio o un
El método de la cefalosporina cromogénica es sencillo,
papel de filtro con colonias.
sensible, específico y muy usado para detectar la
producción de ß-lactamasa por los gonococos. Cuando Se puede usar una solución comercializada de
el anillo ß-lactámico de la cefalosporina cromogénica, nitrocefina o una preparada en el propio laboratorio con
nitrocefina, es hidrolizado por la ß-lactamasa, se nitrocefina en polvo.
produce un cambio de color de amarillo a rojo. Esta
prueba está comercializada en diferentes formatos, Prueba directa en placa:
y también puede adquirirse la nitrocefina liofilizada
para realizar la prueba en el propio laboratorio (49). 1. Agregar una gota de solución de nitrocefina
Hay también otros métodos menos estandarizados directamente sobre las colonias gonocócicas
y que no han sido sometidos al control de la calidad aisladas en agar. Se pueden usar las mismas
para la detección de ß-lactamasa, como el método placas de agar del método de dilución en agar o
acidométrico y la prueba yodométrica. Etest después de leer las CIM de los antibióticos
probados.
4.8.7.1 Método del disco de nitrocefina
2. Un cambio de color de la solución de nitrocefina
1. Hidratar con agua destilada estéril un disco de de amarillo a rojo en 1 minuto indica un resultado
nitrocefina sobre un portaobjetos de vidrio o en una positivo. Sin embargo, aunque es raro, a veces se
placa vacía y limpia. producen reacciones positivas débiles que tardan
Borde del crecimiento

Radio
anular
Borde del disco
Figura 4.12
El radio anular (mm) es la distancia más corta medida desde borde del disco al borde del crecimiento confluente.
El borde del crecimiento confluente corresponde generalmente al borde más nítido del halo de inhibición.
Fuente: Reproducido a partir de CDS Antibiotic Susceptibility Test (http://web.med.unsw.edu.au/cdstest/).
Gonorrea 51
Figura 4.13
Actividad de la ß-lactamasa de N. gonorrhoeae determinada en una placa de cultivo por el método de la
cefalosporina cromogénica, nitrocefina. El medio de la izquierdo presenta una reacción positiva (rojo) y el de
la derecha presenta una reacción negativa (permanece amarillo).
algo más de tiempo en desarrollarse. El resultado papel de filtro. Incubar el papel de filtro inoculado a
negativo se observa cuando no se produce cambio temperatura ambiente durante 30 minutos en la placa
de color (permanece amarillo) (fig. 4.13). de Petri tapada. La actividad de la ß-lactamasa
dará lugar a un cambio de color de azul a amarillo,
Prueba en portaobjetos o en papel de filtro: generalmente visible en menos de 10 minutos.
1. Agregar una gota de solución de nitrocefina sobre 4.8.7.4 Prueba yodométrica

un portaobjetos de vidrio limpio o un papel de filtro. Preparar en el momento una mezcla de penicilina y
2. Recoger con un asa de siembra estéril varias yodo agregando 1,1 ml de una solución de yodo (1,5 mg
de yoduro de potasio y 0,3 g de yodo en 100 ml de
colonias del cultivo gonocócico puro sembrado el
tampón fosfato 0,1 mol/l, pH 6,4 y conservada en un
día anterior y emulsionar en la gota de nitrocefina.
frasco ámbar a 4 °C) a un vial que contiene 0,15 ml
3. Un cambio de color de amarillo a rojo en el plazo de de solución de bencilpenicilina (1 millón de unidades
1 minuto indica un resultado positivo. Raramente se internacionales por ml, conservada a
producen reacciones positivas débiles que tardan –20 °C).
algo más de tiempo en desarrollarse. El resultado
La mezcla de los reactivos debe usarse antes de que
negativo se observa cuando no se produce cambio
transcurra 1 hora. Tomar con un asa las colonias a
de color (permanece amarillo).
examinar de un cultivo en una placa de agar y emulsionar
con 1 gota de la mezcla de penicilina y yodo en una
4.8.7.3 Método acidométrico
placa de vidrio. La adición de una gota de una solución
Colocar una tira del papel de filtro en una placa de Petri de almidón (4 g/l en agua destilada, esterilizada en
vacía y limpia. Impregnar el papel con solución de autoclave y conservada a 4 °C) dará un color violeta
penicilina (tampón fosfato 0,05 mol/l, pH 8,0; 0,2 g/l oscuro o morado a la mezcla. Un resultado negativo
de púrpura de bromocresol y 50 g/l bencilpenicilina sin se constata cuando este color se mantiene durante
amortiguador de pH [conservar congelada]). Con un 5 minutos. Un cambio de color a incoloro antes de 5
asa de siembra bacteriológica, extender de 10 a 20 minutos (normalmente en 1 minuto) indica una prueba
colonias en un área de aproximadamente 5 mm del positiva.
4.9 Conservación de las cepas de N. 15% a 20% de glicerol, se suspende con una pipeta
gonorrhoeae estéril y se congela de inmediato a –20 °C o –25 °C.
Para mantener la viabilidad de las cepas de N. gonorrhoeae • No es aconsejable la conservación prolongada a

en el medio de agar para gonococos, es necesario esta temperatura ya que los gonococos perderán su
subcultivar al menos cada 48 horas. En consecuencia, viabilidad.
es fundamental disponer de métodos eficaces para la
conservación a largo plazo de las cepas gonocócicas. Conservación a largo plazo:
• Todo el crecimiento de una placa de cultivo puro

4.9.1 Conservación en agar chocolate inclinado
que se había sembrado el día anterior en medio de
(50, 51) agar para gonococos se inocula en un vial pequeño
Conservación hasta 9 meses (las cepas se mantienen que contiene aproximadamente de 0,5 ml a 1,0 ml
viables durante el transporte hasta 5 días): de un caldo nutritivo crioprotector estéril con 15% a
20% de glicerol, se suspende con una pipeta estéril y
• A partir de un cultivo puro sembrado el día anterior en
se congela de inmediato a –70 °C.
un medio de agar para gonococos hacer un inóculo
denso en un volumen de 3 ml de agar chocolate • Todo el crecimiento de una placa de cultivo puro
inclinado en un frasco Bijou de policarbonato con que se había sembrado el día anterior en medio
tapa de rosca (debe ser un frasco de plástico de 5 ml de agar para gonococos se inocula en un criovial
de volumen) e incubar con la tapa de rosca aflojada pequeño que contiene medio crioprotector estéril
durante un mínimo de 24 horas a 36 ± 1 °C en una (por ejemplo, caldo nutritivo con 15% a 20% de
atmósfera enriquecida con 5±1% de CO2 o hasta glicerol), se suspende con una pipeta estéril y se
que se observe crecimiento en la superficie del agar. congela de inmediato en nitrógeno líquido.
A continuación, añadir parafina líquida estéril hasta
llenar completamente la pendiente de agar, enroscar • Todo el crecimiento de una placa de cultivo puro
la tapa bien apretada y conservar el frasco Bijou de que se había sembrado el día anterior en medio de
agar inclinado a 37 °C. Cuando se necesite hacer una agar para gonococos se inocula en un vial pequeño
prueba con los gonococos, se introduce un asa de que contiene aproximadamente de 0,5 a 1,0 ml de
siembra bacteriológica estéril a través de la cubierta un líquido criogénico estéril con perlas congeladas
de parafina para sacar algunas colonias de N. (comercializado), se suspende invirtiéndolo cinco veces
gonorrhoeae que se inoculan en un medio de cultivo y, posteriormente, se elimina tanto líquido como sea
selectivo para gonococos. Después de incubar 48 posible y se congela el vial de inmediato a –70 °C.
horas a 36 ± 1 °C en una atmósfera enriquecida con
• Todo el crecimiento de una placa de cultivo puro
5±1% de CO2, las colonias gonocócicas son fácilmente
que se había sembrado el día anterior en medio
discernibles y puede subcultivarse para realizar las
de agar para gonococos se inocula en un caldo
pruebas correspondientes (también habrá burbujas de
nutritivo estéril (por ejemplo, caldo nutritivo, caldo
parafina que se distinguen fácilmente de las colonias
de tripticasa de soja, caldo de infusión de cerebro-
gonocócicas). La parafina original que cubre la
corazón) con 15% a 20% de glicerol (otra opción,
pendiente puede volver a almacenarse para otro uso.
si no hay ningún caldo nutritivo al alcance, es usar
leche desnatada estéril) y se conserva liofilizado.
4.9.2 Conservación por congelación o
liofilización 4.10 Extracción de las cepas de
Conservación de 1 a 3 meses: N. gonorrhoeae congeladas
• Todo el crecimiento de una placa de un cultivo puro Sacar el criotubo que contiene las cepas del
que se había sembrado el día anterior en medio de congelador o del nitrógeno líquido y no dejar que se
agar para gonococos se inocula en un vial pequeño descongele. Recoger suavemente con la punta de
que contiene 0,5 ml de un caldo nutritivo estéril (por una pipeta de Pasteur estéril una muestra pequeña
ejemplo, caldo nutritivo, caldo de tripticasa de de la suspensión bacteriana congelada (o una perla
soja, caldo de infusión de cerebro-corazón) con congelada) y transferirla a un medio de cultivo de agar
Gonorrea 53
para gonococos. A partir del inóculo hacer estrías con 12. Jephcott AE, Bhattacharyya MN, Jackson DH. Improved
un asa de siembra para obtener colonias aisladas transport and culture system for the rapid diagnosis of
gonorrhoea. British Journal of Venereal Disease, 1976,
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5±1% de CO 2. Guardar inmediatamente el criotubo en el for cultivation of N. gonorrhoeae and N. meningitidis.
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Gonorrea 55
Capítulo 5
Infecciones por clamidias
5.1 Introducción
Chlamydia trachomatis es el agente etiológico de serotipos también pueden aislarse de la infección
la clamidiosis y causa una gran morbilidad y costo ocular en los recién nacidos, contraída al pasar por el
económico en todo el mundo. Según estimaciones de la conducto del parto infectado, pero no son en esencia
Organización Mundial de la Salud (OMS) en el 2008 se los causantes del tracoma. Los recién nacidos también
produjeron 106 millones de casos nuevos de clamidiosis pueden contraer una neumonía por clamidias debido a la
urogenital en adultos en el mundo. Se deduce, por exposición a estos serotipos durante el parto vaginal (no
consiguiente, que la clamidiosis es la infección debe confundirse con la infección por C. pneumoniae).
de transmisión sexual (ITS) bacteriana con mayor
prevalencia junto con la gonorrea (también 106 millones Por último, los serotipos L1–L3 de la biovariedad
de casos nuevos). LGV son también de transmisión sexual, pero con
una preferencia tisular por las células linfoides y una
En la clasificación de C. trachomatis hay tres evolución de la enfermedad más activa. Las infecciones
biovariedades, que contienen cada una de ellas varios por LGV son pues más invasoras y tienen mayor
serotipos o genotipos (dependiendo del método usado probabilidad de causar una infección sistémica que las
para la clasificación). Las biovariedades se definieron otras biovariedades. El LGV es endémico en muchos
sobre la base del tipo de infección, la localización más países en desarrollo. Desde el 2003, se han registrado
frecuente (tropismo tisular) y la virulencia relativa de la brotes de proctitis y proctocolitis por LGV en hombres
enfermedad (cuadro 5.1) en: las que producen tracoma que tienen relaciones sexuales con otros hombres en
(la principal causa de ceguera prevenible en el mundo Europa y América del Norte, donde anteriormente solo
y endémica en muchos países en desarrollo), las que presentaban casos esporádicos (véase el capítulo 11).
causan infección genital (una de las principales ITS
bacterianas a escala mundial) y las que producen
linfogranuloma venéreo (enfermedad ulcerosa genital • C. trachomatis causa la ITS bacteriana más
que afecta el tejido linfático) (véase el capítulo 11). frecuente a escala mundial, que incluye
una serie de enfermedades en diversas
La biovariedad ocular está integrada por los serotipos
localizaciones (genital, ocular, ganglios
A–C, que se encuentran predominantemente en las
linfáticos y bronquial).
infecciones conjuntivales. El tropismo tisular no es
• Las consecuencias negativas de las
absoluto ya que estos microorganismos, especialmente
infecciones por C. trachomatis sin tratar son la
el serotipo B, también pueden aislarse de infecciones
enfermedad pélvica inflamatoria, el embarazo
genitales, aunque son casos infrecuentes.
ectópico, la infertilidad de causa tubárica, la
La biovariedad predominante está integrada por los epididimitis, la prostatitis y otras.
serotipos D–K, que se transmiten sexualmente e
infectan el epitelio genital, causan uretritis en el hombre
y cervicitis (y uretritis) en la mujer (cuadro 5.2). La 5.2 Aspectos generales de los métodos
infección urogenital asintomática llega a afectar hasta de diagnóstico existentes
el 50% de los hombres y el 90% de las mujeres. Si
pasa desapercibida y no se la trata, la infección alcanza Aunque la prevalencia de las infecciones por clamidias es
el aparato genital superior y produce epididimitis en muy alta, el conocimiento de esta infección de transmisión
el hombre y enfermedad pélvica inflamatoria (EPI) con sexual era muy limitado en los entornos de salud pública
las secuelas correspondientes (embarazo ectópico hasta los años ochenta debido a las deficiencias de los
e infertilidad de causa tubárica) en la mujer. Estos métodos de diagnóstico. Las técnicas de diagnóstico
Infecciones por clamidias 57

Cuadro 5.1: Características e infecciones relacionadas con diferentes serotipos de C. trachomatis
Serotipo Características Tropismo tisular - Biovariedad Infección

A–C Tracoma endémico causante de
No invasor Células epiteliales - Tracoma
(Incl. Ba) ceguera
D–K Urogenital, conjuntivitis,
No invasor Células epiteliales - Tracoma
(Incl. Da, Ia, Ja) neumonía neonatal
L1, L2, L3
Invasor Células linfáticas - LGV LGV
(Incl. L2a, L2b)
LGV, linfogranuloma venéreo.
Cuadro 5.2: Manifestaciones clínicas de la infección por C. trachomatis
Infección genital Primarias Secuelas

Mujer Cervicitis, leucorrea abundante, cuello Enfermedad pélvica inflamatoria, embarazo
uterino friable, disuria, dolor pelviano, ectópico, salpingitis, infertilidad de causa
dolor a la palpación y con la movilización tubárica
del cuello uterino
Hombre Secreción uretral, disuria, dolor testicular Epididimitis, prostatitis
Infecciones
extragenitales Primarias Secuelas
Rectal Secreción, dolor rectal, sangre en heces Proctitis
Orofaríngea Faringitis, dolor de garganta leve
Ganglios linfáticos Inflamación linfática
Cicatrización tracomatosa conjuntival,
Ocular Conjuntivitis
tracoma que causa ceguera
Neumonía neonatal Neumonía
Nota: Los estudios demuestran que la infección por C. trachomatis facilita la transmisión del VIH; sin embargo, la razón de posibilidades ha sido
relativamente baja.
temprano se desarrollaron a raíz de las iniciativas de antígenos, la inmunofluorescencia directa (IFD) y

de control del tracoma más que de las iniciativas de los enzimoinmunoanálisis de absorción en fase sólida
control de las ITS. La serología se usó para diferenciar (ELISA) se desarrollaron a comienzos de los años
las infecciones agudas de las crónicas, pero carece ochenta, lo que facilitó mucho más el diagnóstico
de la sensibilidad y especificidad adecuadas para el
de las infecciones por clamidias. A medida que se
diagnóstico de la infección aguda y la obtención de
fueron desarrollando otros ELISA, se pudo disponer de
estimaciones de la exposición a lo largo de la vida de la
población. El cultivo se estandarizó en los años setenta, numerosos análisis de diagnóstico inmediato, es decir,
de esta forma el aislamiento de la bacteria se convirtió pruebas diagnósticas realizadas en el punto de atención.
en un instrumento de diagnóstico útil. La IFD, el ELISA realizado en el laboratorio y las pruebas
diagnósticas en el punto de atención presentaban
Sin embargo, la necesidad de que la bacteria se
una sensibilidad baja en relación con el cultivo y una
mantenga viva exige condiciones estrictas de transporte
y conservación que limitan la utilización de esta prueba especificidad insuficiente. Sin embargo, el menor tiempo
a los consultorios que colaboran con laboratorios más de obtención de un resultado analítico y las exigencias
avanzados técnicamente. Los ensayos de detección menos restrictivas para el transporte de las muestras los
convertía en una opción atractiva, en particular en los
entornos de prevalencia elevada. • Se sigue avanzando en las técnicas de
diagnóstico de la clamidiosis, que proporcionan
El siguiente adelanto importante en cuanto al diagnóstico mayor sensibilidad.
de la clamidiosis fue la utilización de secuencias de • Debido a que las características de desempeño
ácidos nucleicos en lugar de antígenos como objetivo son superiores, se recomiendan las PAAN para
de la detección. La sensibilidad de las primeras pruebas el diagnóstico y el cribado de las infecciones por
de hibridación de ácidos nucleicos sin amplificación clamidias. Sin embargo, la elección de las
(PHSA) era similar a la del cultivo, pero de nuevo pruebas depende de los recursos y del nivel de
había problemas con respecto a la especificidad. No apoyo prestado por el laboratorio.
obstante, la posibilidad de detectar la presencia de
Neisseria gonorrhoeae con este ensayo lo convirtió en
extremadamente útil. Las pruebas de amplificación 5.3 Toma, transporte y condiciones de
de ácidos nucleicos (PAAN) constituyeron el siguiente conservación de las muestras
avance en el diagnóstico. Las pruebas de amplificación La recogida, el transporte y las condiciones de
de ácidos nucleicos usan métodos enzimáticos para conservación de las muestras (cuadro 5.3) dependen
amplificar el DNA o el RNA diana exponencialmente a en muchos casos del tipo de ensayo que se vaya
miles de millones de copias. El producto amplificado a realizar. En esta sección se presentarán algunas
se detecta por diversos medios, lo que da a cada pautas generales, pero los detalles de cualquiera de las
ensayo características de desempeño únicas. Al igual pruebas diagnósticas específicas se encontrarán en las
que ocurre en la hibridación de ácidos nucleicos sin instrucciones de uso correspondientes.
amplificación, la prueba de amplificación de ácidos
El lugar anatómico de muestreo variará según el cuadro
nucleicos combina la detección de clamidias y
clínico, los antecedentes del paciente y la sensibilidad
gonococos en una única muestra. Debido a las mejores
general del método analítico. Para el cultivo, que requiere
características de desempeño, por ejemplo, sensibilidad,
microorganismos vivos, la muestra debe tomarse de
especificidad, distintos tipos de muestra, automatización
sitios con células epiteliales cilíndricas o cúbicas, cuya
e independencia respecto a mantener la viabilidad del
probabilidad de tener una infección activa es mayor. Por
microorganismo, las pruebas de amplificación de ácidos
lo tanto, se tomarán muestras del orificio endocervical
nucleicos se recomiendan sin la menor duda para el
externo en la mujer y del epitelio uretral en el hombre y,
diagnóstico y el cribado de las infecciones por clamidias.
si fuera necesario, también en la mujer. Los estudios han
Se puede encontrar más información respecto a las puesto de manifiesto infecciones repetidas aisladas del
características de desempeño de los diferentes métodos endocérvix o de la uretra femenina. El cultivo de muestras
de diagnóstico de la clamidiosis en el sitio web: procedentes de estas dos localizaciones en la mujer
www.chlamydiae.com. aumentará la identificación de casos.
Las cuestiones relacionadas con la evaluación del Las muestras endocervicales se obtienen introduciendo
ensayo y la variabilidad de desempeño (1, 2 ) subrayan la el dispositivo de toma de muestras 2 o 3 cm en el
orificio y rotando 360°. En niñas impúberes no se
necesidad de confirmar los ensayos y llevar a cabo una
toman muestras endocervicales; en cambio, se tomarán
garantía de la calidad estricta en cada laboratorio, no
muestras del vestíbulo de la vagina y también se
solo antes de la adopción de un método, sino también
recogerá una muestra de orina. Las muestras uretrales
de manera periódica. Para más información sobre este
se toman insertando el hisopo 2 o 3 cm en la uretra,
tema, véase el capítulo 2 y el anexo 3. Para lograr
seguido de una rotación completa para obtener material
características de desempeño adecuadas con cualquiera
celular. Se han descrito casos en los que la toma de
de los métodos de diagnóstico, es fundamental seguir
muestra inadecuada representa un problema frecuente
estrictamente las recomendaciones del fabricante en
que afecta negativamente a la sensibilidad del cultivo.
cuanto a la recogida, el transporte y la conservación de
las muestras, así como para la realización de los ensayos Aunque en otras pruebas que no implican cultivo ni
específicos, sin olvidar los controles de calidad. amplificación de ácidos nucleicos no se requieren

microorganismos vivos, la sensibilidad limitada de esas de ácidos nucleicos presenta mayor sensibilidad en
pruebas exige que se recoja un número suficiente de el caso de estas infecciones a pesar de que no haya
microorganismos para obtener un resultado positivo. especificaciones de ningún fabricante sobre este tipo
Además, los métodos de detección de antígeno suelen de muestras. Las pruebas de amplificación de ácidos
requerir que estén en su mayoría intactos. nucleicos con muestras extragenitales de hombres
que tienen relaciones sexuales con otros hombres
Por lo tanto, en general, se aplican a estos métodos
aumentan la identificación de casos sustancialmente
de diagnóstico las mismas restricciones de muestreo
(5 –8). Se toman muestras rectales, obtenidas por
que las exigidas para el cultivo. Se ha autorizado la
el médico o por el propio paciente, introduciendo un
utilización de algunos ELISA con muestras de orina de
hisopo de dacrón sin producir molestias (2–3 cm) en el
hombres ya que este método de muestreo arrastra los
recto y girándolo 360°. Actualmente no hay necesidad
microorganismos de la uretra. Si se controla bien la
de visualizar el recto para tomar una muestra adecuada
recogida del volumen emitido en la primera parte de
debido a la mayor sensibilidad de las pruebas de
la micción (menos de 25 ml en general) y el paciente
amplificación de ácidos nucleicos. Para alguien que
no había orinado en la hora anterior, la concentración
declare haber practicado el coito anal receptivo,
de microorganismos puede que ser suficientemente
la muestra rectal está justificada. La recogida de
elevada como para que se detecten realizando estos
muestras por el propio paciente para la PAAN hará
análisis. Sin embargo, esto no es válido en el caso
que aumente la aceptación del cribado y reducirá la
de orina de la mujer ya que la frecuencia de las
carga del tiempo asistencial (9, 10). Deben recogerse
infecciones uretrales es menor y la orina no es una
muestras orofaríngeas de la faringe posterior y las
muestra representativa del tejido cervicouterino.
criptas amigdalinas cuando se diagnostican infecciones
La prueba de amplificación de ácidos nucleicos tiene la transmitidas durante las relaciones sexuales orales. Las
ventaja de depender de material con ácidos nucleicos muestras de los recién nacidos con sospecha de haber
que no necesita microorganismos viables o intactos. contraído neumonía por clamidias durante el parto
En consecuencia, estos procedimientos analíticos deben proceder de la nasofaringe. Estas muestras
han ampliado la capacidad de tomar muestras menos se destinarán al cultivo o la inmunofluorescencia
traumáticas que exigían entornos clínicos. Las pruebas directa pero aún no se han evaluado rigurosamente
de amplificación de ácidos nucleicos son muy sensibles en ningún otro sistema. Sin embargo, debido a la
cuando se usan muestras obtenidas por el propio reducida concentración de bacterias, las pruebas de
paciente (por ejemplo, hisopos vaginales u orina de amplificación de ácidos nucleicos son posiblemente
los hombres). Estas pruebas de amplificación también más eficaces; es necesario investigar más en este
son útiles para el análisis de la muestra residual de campo. Introducir el hisopo a través del orificio nasal
la citología en medio líquido, que permite hacer un hasta que pueda tomarse una muestra de la pared
cribado de las mujeres a las que se les realiza una faríngea. Tomar una muestra conjuntival retirando
prueba de Papanicolaou (Pap). La toma de muestra el párpado inferior y desplazando el hisopo por la
con un hisopo vaginal la puede hacer la paciente o el superficie de la conjuntiva palpebral inferior hacia el
médico (3, 4 ). Introducir el hisopo en la vagina y rotar ángulo medio del ojo. En caso de sospecha de LGV,
con el fin de obtener una muestra de toda la superficie véase el capítulo 11.
de las paredes vaginales.
Dada la rigurosa evaluación requerida antes de que la
En algunos casos se necesitan muestras que no sean Administración de Alimentos y Medicamentos de los
de origen genital, dependiendo de los signos clínicos Estados Unidos de América (FDA) autorice una prueba
y los hábitos sexuales. Mediante el cultivo se pueden diagnóstica, que incluye ensayos clínicos multicéntricos
detectar infecciones rectales y orofaríngeas, pero comparados con patrones, el desempeño de las
la sensibilidad es muy baja debido a la microflora pruebas autorizadas por la FDA debe estar bien
contaminante. Sin embargo, la prueba de amplificación probado. Por consiguiente, usamos este nivel de la
Cuadro 5.3: Obtención, transporte y conservación de las muestras
Pruebas
Dispositivo diagnósticas
de Procedimiento de en el punto
Localización recogida muestreo PAAN Cultivo IFD de atención
Endocérvix Hisopo - Usar una torunda Colocar en Colocar Extender Colocar en
plásticoa, de algodón para el dispositivo directamente en un el tampón de
espátula o eliminar el exceso de recogida en un medio de portaobjetos extracción
cepillo para de moco antes de del fabricante transporte adecuado (una capa del estuche
citología tomar la muestra. La o utilizar el para clamidias fina) y secar y seguir las
en medio toma con espátula medio líquido (por ejemplo, al aire. indicaciones
líquido. solo es válida para para citología. tampón sacarosa- de uso.
la PAAN. Introducir Conservar y fosfato-glutamato
el dispositivo de transportar según con inhibidores
toma de muestras las indicaciones antimicrobianos).
2 o 3 cm y rotar de uso. Mantener a 4°C
el hisopo 360° hasta la inoculación
en el orificio antes de 24 h o
endocervical. La a –70 °C si se
recogida de células conserva más
endocervicales es tiempo.
esencial para la IFD.
Uretra Hisopo Introducir el hisopo Colocar en el Colocar Extender Colocar en
- aluminiob 2 o 3 cm en la uretra dispositivo de directamente en un en un el tampón de
y rotar 360°. La recogida del medio de transporte portaobjetos extracción
recogida de células fabricante. adecuado para (una capa del estuche
epiteliales cúbicas es Conservar y clamidias (por fina) y secar y seguir las
esencial para la IFD. transportar según ejemplo, tampón al aire. indicaciones
las indicaciones sacarosa-fosfato- de uso
de uso. glutamato con
inhibidores
antimicrobianos).
Mantener a 4 °C
hasta la inoculación
antes de 24 h
o a –70°C si se
conserva más
tiempo.
Orina Recipiente Sin limpiar la zona Colocar en el NP NP NP
estéril para genital del paciente, dispositivo de
orina. recoger la primera recogida del
porción de la micción fabricante.
(menos de 25 ml en Conservar y
general). transportar según
las indicaciones
de uso.

Cuadro 5.3: Obtención, transporte y conservación de las muestras (continuación)
Pruebas
Vagina Hisopo- Tanto el médico Colocar en el NP NP Seguir las
plásticoa como el paciente dispositivo de indicaciones
pueden obtener la recogida del de uso.c
muestra. Girar el fabricante.
hisopo de modo que Conservar y
toque las paredes transportar según
vaginales por todas las indicaciones
partes. de uso.
Muchos
procedimientos
permiten el uso
de “hisopos
secos” que vienen
sin ningún medio.
Rectum Hisopo- Introducir el hisopo 2 Ningún Colocar Extender NP
plásticoa o 3 cm en el recto y fabricante da directamente en un en un
rotar 360°. especificaciones medio de transporte portaobjetos
actualmente adecuado para (una capa
para este tipo de clamidias (por fina) y secar
muestra.d ejemplo, tampón al aire.
Proceder como sacarosa-fosfato-
con la muestra glutamato con
endocervical. inhibidores
Las muestras antimicrobianos).
pueden enviarse Mantener a 4 °C
sin ningún medio hasta la inoculación
si la prueba antes de 24 h o
utilizada permite a –70 °C si se
este tipo de conserva más
recogida para tiempo.
las muestras
endocervicales.
Pruebas
Orofaringe Hisopo- Frotar con el hisopo Ningún Colocar Extender NA
plásticoa la parte posterior de fabricante da directamente en un en un
la faringe y la cripta especificaciones medio de transporte portaobjetos
amigdalina. actualmente adecuado para (una capa
para este tipo de clamidias (por fina) y secar
muestra.d ejemplo, tampón al aire.
Proceder como sacarosa-fosfato-
con la muestra glutamato con
endocervical. inhibidores
Las muestras antimicrobianos).
pueden enviarse
sin ningún medio
si la prueba
utilizada permite
este tipo de
recogida para
las muestras
endocervicales.
Nasofaringe Hisopo- Frotar con el hisopo NP Colocar NP NP
(en caso de aluminiob la nasofaringe o directamente en un
sospecha de recoger el aspirado medio de transporte
neumonía traqueobronquial. adecuado para
neonatal) clamidias (por
ejemplo, tampón
sacarosa-fosfato-
glutamato con
inhibidores
antimicrobianos).
Mantener a 4 °C
antes de 24 h o
a –70 °C si se
conserva más
tiempo.

Pruebas
Conjuntiva Hisopo- Frotar con el hisopo NP Colocar Extender NP
aluminiob la superficie de la directamente en un en un
conjuntiva palpebral medio de transporte portaobjetos
inferior. adecuado para (una capa
clamidias (por fina) y secar
ejemplo, tampón al aire.
sacarosa-fosfato-
glutamato con
inhibidores
antimicrobianos).
Mantener a 4 °C
antes de 24 h o
a –70 °C si se
conserva más
tiempo.
IFD: ensayo de inmunofluorescencia directa; NP: no procede; PAAN: prueba de amplificación de ácidos nucleicos.
a Hisopos de dracón o rayón con mango de plástico.
b Hisopos de dracón o rayón con mango de aluminio.
c Solo están autorizados algunas pruebas diagnósticas en el punto de atención para las muestras vaginales.
d Los datos indican que las PAAN adecuadas dan resultados satisfactorios para este tipo de muestras, pero ningún fabricante indica
especificaciones para las muestras extragenitales.
evaluación como norma para la determinación de las

• La recogida, el transporte y las condiciones de
pruebas de alta calidad. En el cuadro 5.4 se resumen
conservación de las muestras varían según el
las características de desempeño de diferentes
ensayo de detección utilizado y pueden tener
pruebas diagnósticas autorizadas por la FDA para la
una influencia significativa en la sensibilidad del
detección de C. trachomatis.
método analítico.
• La elección de la muestra adecuada y de la
prueba de detección son fundamentales para el
diagnóstico eficaz.
Cuadro 5.4: Pruebas diagnósticas evaluadas* (a fecha de junio de 2012) para la detección de C. trachomatis
Pruebas
diagnósticas en el
PAAN Cultivo IFD punto de atención
Tipos de muestras
Hisopado endocervical Sí Sí Sí Sí
Medio líquido para
Sí (algunas pruebas) No No No
citología
Hisopado vaginal
obtenido por el paciente Sí (algunas pruebas) No No Sí (algunas pruebas)
o el médico
Sí (algunas pruebas) No No Sí (some tests)
Orina
Mujer Sí No No No
Hombre Sí No No No
Hisopado uretral
Sí Sí Sí Sí
masculino
Hisopado rectal Noa Síb Síb No
Hisopado orofaríngeo Noa Síb Síb No
Hisopado conjuntival Noa Sí Sí No
Desempeño
Sensibilidadc Muy alta Moderada–alta Baja–moderada Baja–moderada
Especificidad Muy alta Muy alta Moderada Muy alta
Costo Muy alto Moderado Bajo Bajo
Condiciones
4 °C durante 24 h
Transporte y ambiente hasta 60 Condiciones
– 70 °C después de NP
conservación días (comprobar las ambiente
24 h
instrucciones)
Gran superficie (para Microbiología o Microscopio de
Instrumental Pequeño o ninguno
los aparatos) virología corriente fluorescencia
Capacidad analítica/
Alta - sí Baja - nula Baja - nula Baja - nula
automatización
Moderada
Complejidad técnica Alta Alta (experiencia en Baja
microscopia)
Tipo de laboratorio Referencia Referencia Central Local

Cuadro 5.4: Pruebas diagnósticas evaluadas* (a fecha de junio de 2012) para la detección de C. trachomatis
(continuación)
Pruebas
diagnósticas en el
PAAN Cultivo IFD punto de atención
N. gonorrhoeae,
Varios patógenos en una Tricomonas vaginalis
No No No
muestra y PVH en algunos
sistemas analíticos.
Otras observaciones • Debido a • Las condiciones • Muy • Las infecciones
las mejores estrictas de toma recomendada detectadas
características y transporte son para la pueden tratarse
de desempeño, esenciales para identificación antes de que el
las PAAN se mantener la inmediata de paciente salga del
recomiendan viabilidad, este infecciones consultorio.
mucho para es el principal conjuntivales.
el diagnóstico obstáculo en la
y la detección sensibilidad de esta
sistemática. prueba.
• La posibilidad de • La posibilidad de
contaminación del obtener cepas
laboratorio requiere viables es útil para
un cumplimiento otras pruebas
estricto de los tales como la
protocolos. determinación
• Algunas requieren del genotipo y el
lotes de gran antibiograma.
tamaño, lo que
puede alargar
el tiempo de
obtención de
resultados
analíticos.
IFD: ensayo de inmunofluorescencia directa; VPH: virus de los papilomas humanos; PAAN: prueba de amplificación de ácidos nucleicos.
* Evaluado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos de América.
a Los datos indican que las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos apropiadas funcionan satisfactoriamente para este tipo de muestras,
pero ningún fabricante da especificaciones para muestras extragenitales.
b Comparado con las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos modernas, la sensibilidad del cultivo y de la inmunofluorescencia directa es
probablemente aun menor para estos tipos de muestra.
c Los cálculos de sensibilidad dependen en gran medida de la diferente sensibilidad de las pruebas efectuadas con la misma metodología y de
las utilizadas como referencia. Las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos son superiores al resto en cuanto a la sensibilidad y tienen una
especificidad excelente.
Fuente: Adaptado de Unemo M, Papp JR. Infections caused by Chlamydia trachomatis. En: Morse SA et al., eds. Atlas of sexually transmitted
diseases and AIDS, 4ª ed. Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010:40–63.
5.4 Pruebas de amplificación de ácidos algunos problemas en común. Estas técnicas son
nucleicos exigentes en cuanto al instrumental y no son
apropiadas para muchos laboratorios situados
La detección molecular de secuencias específicas
en países con recursos limitados. Por otro lado,
de ácidos nucleicos y la posterior validación y
también se puede producir contaminación ambiental
comercialización de este tipo de pruebas ha mejorado
fácilmente debido a la amplificación exponencial
enormemente la detección en el laboratorio de C.
de las secuencias diana. La manipulación de una
trachomatis. Las primeras pruebas de hibridación de
muestra ya amplificada abierta es una fuente
ácidos nucleicos sin amplificación desarrolladas, como
potencial de contaminación ambiental por formación
Gen-Probe PACE 2 y PACE 2C (Gen-Probe, EUA),
de aerosoles. Una vez que las instalaciones y el
estaban basadas en la unión de sondas de ácidos
equipo de laboratorio (por ejemplo, los pipeteadores)
nucleicos específicas complementarias y posterior
se contaminan, desprenderse de la contaminación
amplificación de la señal para detectar la unión. La
remanente puede resultar extremadamente difícil.
sensibilidad de estas pruebas es aproximadamente
un 10% a 15% menor que la de las pruebas de Otro problema es la posible obtención de resultados
amplificación de ácidos nucleicos, y no deben usarse negativos falsos. El proceso de extracción de ácidos
si existen pruebas de amplificación y son asequibles. nucleicos es una etapa fundamental pero es difícil
Las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos garantizar para cada muestra. La amplificación requiere
tienen características de desempeño superiores a concentraciones precisas de sal, nucleótido y enzima
cualquier otro tipo de prueba para detectar las para proceder con eficacia, lo que exige una gran
infecciones por clamidias (11–14) y, como tal, son el precisión de pipeteado. La enzima que promueve
tipo de ensayo recomendado por los Centros para el la amplificación podrá también ser sensible a los
Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de los componentes de la sangre, el moco y la orina. Por
Estados Unidos de América (y otros organismos de consiguiente, un resultado negativo puede indicar,
orientación y regulación) tanto para el diagnóstico de en realidad, una falta de ácido nucleico diana
localizaciones genitales y extragenitales como para el debido a que la toma o extracción de la muestra fue
cribado de las infecciones por clamidias (15). inadecuada o a que no hubo amplificación en vez de a
una verdadera falta de secuencia diana. La proporción
Las pruebas de confirmación de las muestras de muestras que son inhibitorias puede variar según
positivas de C. trachomatis ya no se recomiendan. el método de la prueba y, con algunos de ellos, llegará
Las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos hasta 7,5% en ciertos segmentos de la población (16).
que son eficaces y están validadas tienen varias Sin embargo, el desempeño de estas pruebas se
ventajas independientemente de quien sea el sigue prefiriendo al del cultivo, que tiene el riesgo
fabricante. Son sin duda las más sensibles de de proporcionar resultados negativos falsos debido
todas las pruebas existentes, además presentan la a la pérdida de viabilidad de las bacterias, y al de
posibilidad de agrupar las muestras en aquellos los métodos sin cultivo, que tienen una sensibilidad
entornos con recursos limitados; no dependen de inferior (o como mucho igual) a la del cultivo pero cuya
la viabilidad de los microorganismos; la mayoría especificidad es también insuficiente. Por consiguiente,
de las pruebas comercializadas detectan tanto a pesar de tener que tomar las correspondientes
clamidias como gonococos; y pueden realizarse a precauciones en el laboratorio, las ventajas de las
partir de una gran variedad de tipos de muestras cuya pruebas de amplificación de ácidos nucleicos sobrepasan
toma es menos traumática, como las de orina o las con creces los inconvenientes. Debe promoverse el
de flujo vaginal además de las ya utilizadas antes, uso de estas pruebas aun en entornos con recursos
es decir, las endocervicales y uretrales recogidas limitados mediante la creación de laboratorios de
con hisopo. Por otro lado, estos ensayos se adaptan referencia regionales que presten servicios de
bien a la automatización, lo que da lugar a una diagnóstico con estos métodos. Los laboratorios de
mayor estandarización y garantía de la calidad de la referencia regionales proporcionan muchas ventajas
extracción y la detección, así como a una capacidad como consecuencia del gran volumen de muestras
analítica ultrarrápida. No obstante, las pruebas de analizadas, el cumplimiento riguroso de las prácticas
amplificación de ácidos nucleicos también tienen correctas de laboratorio y la mayor experiencia del

personal. Recurrir a laboratorios regionales reduce los
costos, al tiempo que se utilizan pruebas de mayor • Las técnicas moleculares son las que tienen
sensibilidad. A pesar de que haya que enviar las mejor sensibilidad con una especificidad
muestras a un establecimiento regional externo, el excelente.
gran volumen de estas y la automatización analítica • Los ensayos moleculares disminuyen la
ultrarrápida hace que el tiempo de obtención necesidad de condiciones de transporte y
de los resultados analíticos sea equivalente o conservación estrictas y se suprime el análisis
inferior. Por esta razón, los laboratorios que no subjetivo (como en el caso de la microscopia).
pueden permitirse el lujo de realizar las pruebas • Si no pueden usarse las PAAN autorizadas
de amplificación de ácidos nucleicos más sensibles internacionalmente, se recomienda que se
deben plantearse la posibilidad de recurrir a los valide la eficacia de la prueba propuesta
servicios de un laboratorio de referencia regional para los entornos locales y se evalúe
en lugar de utilizar otro medio de diagnóstico menos estrictamente la garantía de la calidad antes
sensible. Actualmente hay cuatro empresas que han de usarla frente, al menos, una prueba de
comercializado la prueba de amplificación de ácidos amplificación de ácidos nucleicos autorizada
nucleicos autorizada por la FDA para la detección de C. internacionalmente.
trachomatis. A continuación se describen los ensayos • Están apareciendo rápidamente nuevas
que estos fabricantes tienen en el mercado. Todas las técnicas analíticas que no pueden anticiparse
pruebas de amplificación de ácidos nucleicos autorizadas en este documento. Es importante examinar
y comercializadas detectan el LGV como C. trachomatis la bibliografía pertinente continuamente en
positiva; sin embargo, no se distinguen los resultados busca de información sobre evaluaciones de
como L1–L3 positivo. Para esto, es necesario la calidad de los nuevos ensayos, con el fin de
el genotipado (véase el capítulo 11). Es importante determinar el más apto para cada laboratorio.
señalar que a escala mundial se usan muchas otras
PAAN para la detección de C. trachomatis que están
comercializadas o incluso desarrolladas en el propio 5.4.1 Ensayos moleculares de Abbott
laboratorio (17, 18). En el caso de que se utilicen PAAN Los ensayos de Abbott en tiempo real para N.
no autorizadas por la FDA, deben existir procedimientos gonorrhoeae y C. trachomatis (RealTime CT/NG) y
normativos internacionales —como los de la Unión solo para C. trachomatis se realizan en el sistema
Europea— u otros procedimientos normativos automatizado m2000 (Abbott Molecular, EUA). Este
nacionales que garanticen la calidad y el desempeño de ensayo ha reemplazado el LCx autorizado por la FDA,
las PAAN. Se insiste en recomendar el uso de pruebas que fue uno de los primeros de amplificación de ácidos
autorizadas internacionalmente. Si esto no fuera nucleicos comercializados. La reacción en cadena de la
posible, se recomienda que se valide la eficacia de la polimerasa (RCP) en tiempo real se hace en el m2000sp,
PAAN propuesta en los entornos locales y se evalúe un instrumento para la preparación automatizada de
estrictamente la garantía de la calidad antes de usarla las muestras que extrae el DNA usando un sistema
frente al menos una PAAN autorizada internacionalmente de captura con partículas magnéticas. Después de la
y cuando se use posteriormente se añadan los debidos extracción, el m2000sp carga la mezcla de componentes
controles positivos, negativos y de inhibición; también
de la RCP en la bandeja de RCP, agrega las muestras
se recomienda la participación en un sistema de
purificadas y están listas para la amplificación y
evaluación externa de la calidad apropiado (véase el
detección en tiempo real en el m2000rt (19). Este
capítulo 2 y el anexo 3).
termociclador en tiempo real detecta la amplificación
(La información elemental relativa a las diferentes mediante la fluorescencia emitida cuando las sondas
técnicas de la prueba de amplificación de ácidos se unen específicamente a las secuencias diana
nucleicos se encuentra en el anexo 3). amplificadas durante cada ciclo de amplificación. La
prueba incluye ahora dianas dobles, es decir, dos
secuencias en el plásmido críptico (7 a 10 copias
por microorganismo), de forma que en el caso de C.
trachomatis se garantice la detección de la nueva
variante sueca de C. trachomatis (nvCT), que causó 5.4.2 Ensayos diagnósticos de Becton
miles de informes negativos falsos en Suecia y algunos Dickinson (BD)
otros países nórdicos cuando se usaba la prueba de El ensayo BD ProbeTec ET para clamidias y gonococos
amplificación de ácidos nucleicos comercializada en (Becton, Dickinson and Company, EUA), autorizado por la
ese momento por Roche y Abbott (20–22). El sistema FDA, fue el primer ensayo en tiempo real comercializado.
puede detectar señales múltiples que facilitan la Esta prueba emplea amplificación isotérmica por
detección de clamidias y gonococos, y un control interno desplazamiento de cadenas (SDA) para amplificar y
no competitivo para controlar la posible inhibición en detectar simultáneamente secuencias diana a 52,5 °C. La
cada muestra. La secuencia del control interno está amplificación de una secuencia del plásmido críptico de
basada en el DNA vegetal que se agrega durante el paso clamidia tiene lugar en una placa sellada con una lectura
de extracción de DNA para proporcionar una medida de transferencia de energía fluorescente. Este esquema
de la eficacia de extracción y la posible inhibición de se diseñó para reducir al mínimo la posible contaminación
la RCP. Esta es la única prueba que proporciona una ambiental remanente ya que las muestras amplificadas
indicación apropiada de que el aislamiento de DNA se nunca se abren.
ha realizado con éxito. El sistema es capaz de procesar
96 muestras de una vez, incluidos 3 controles, en Las muestras autorizadas para las pruebas ProbeTec son
definitiva pueden analizarse 186 muestras y 6 controles las de orina y las endocervicales y uretrales tomadas
en aproximadamente 8 horas. con hisopo. Nuevamente, los datos probatorios indican
que los hisopos vaginales son un tipo de muestra útil
Entre las muestras autorizadas están las de orina y y están en marcha estudios de investigación sobre el
los hisopos de muestras vaginales, endocervicales desempeño de la prueba con otros tipos distintos de
y uretrales. Todas estas muestras se recogen con muestra. Las muestras tomadas con hisopo se toman
un multicolector proporcionado por el fabricante y son usando el dispositivo proporcionado por el fabricante
estables 14 días si se conservan entre 2 °C y 30 °C y son estables a temperatura ambiente hasta 6 días
antes del análisis. El multicolector es un dispositivo antes de analizarlas. La primera porción de orina es
único para todos los tipos de muestras que pueden estable a 4 °C hasta 24 horas más tarde. Si se añade un
analizarse simultáneamente en el sistema m2000. conservante a la muestra, la estabilidad de la orina se
El prolongado tiempo de estabilidad a temperatura prolonga hasta 2 días a temperatura ambiente o de 4 a 6
ambiente de las muestras de orina y las tomadas con días a 4 °C.
hisopo hace que este ensayo sea muy solicitado por
los centros de salud pública que envían muestras a los Este ensayo puede detectar tanto clamidias como
laboratorios de referencia. gonococos y tienen un control de amplificación externo
optativo (14). La elección de las pruebas solicitadas
El ensayo RealTime CT/NG tiene una sensibilidad es específica de la tira (es decir, cada tira de ocho
analítica excelente y aventaja incluso al ensayo muestras debe analizarse con la misma combinación de
APTIMA Combo 2 (23). El proceso de purificación microorganismos) para clamidias y gonococos.
del DNA está diseñado para eliminar los inhibidores
potenciales al tiempo que el control interno proporciona Sin embargo, el uso del control de amplificación es
una señal de alerta si existe inhibición. También específico de la placa de tal manera que si se elige esta
está diseñado para eliminar fluoróforos naturales que opción, se aplica a todas las muestras en esa placa.
podrían dificultar la realización de la prueba. Al utilizar La prueba se presenta en un formato de 96 pocillos
tecnología de detección de fluorescencia homogénea que están separados para cada secuencia diana. Por
con cebadores específicos de la RCP se combina la consiguiente, si se solicitan clamidias, gonococos
amplificación y la detección en un sistema cerrado de y control de amplificación, se usan los pocillos de
una etapa. La naturaleza cerrada del sistema reduce la cada una de las 3 columnas y se pueden analizar 32
posibilidad de contaminación remanente y el uso del muestras y controles en una placa. En cambio, si solo
control negativo proporciona al usuario un método para se solicitan clamidias, se podrán analizar 96 muestras
identificar rápidamente la contaminación ambiental. de una vez en 1 placa.

Dado que el ensayo se diseñó para ser un sistema fabricante y son estables hasta 60 días a temperatura
cerrado, no se incluyó ningún método enzimático ambiente, lo que las hace idóneas para el transporte a
para degradar los contaminantes remanentes de laboratorios distantes. Una muestra de orina de la
amplificaciones anteriores. Lamentablemente, primera parte de la micción es estable hasta 24 horas
han ocurrido numerosos incidentes de importante después de su recogida y, una vez que se pone en el
contaminación ambiental. Limpiar y recuperar el estado medio del fabricante, es estable a temperatura ambiente
inicial en estos casos puede llevar semanas, lo que da hasta 30 días. La prueba APTIMA Combo 2 también
lugar a retrasos muy costosos y, a menudo, exige la detecta N. gonorrhoeae (16S rRNA) y, en total, se pueden
reubicación en una zona que no ha estado expuesta procesar aproximadamente 500 muestras en un período
anteriormente al ensayo. Los laboratorios que realizan de 8 horas usando un sistema automatizado (el sistema
este ensayo deben adherirse rigurosamente a un plan de TIGRIS). La aceptación de este ensayo está aumentando
vigilancia ambiental para detectar oportunamente estos a pasos agigantados en muchos países debido a la gran
casos de contaminación. Se está evaluando una segunda sensibilidad y especificidad, la prolongación del período
generación de ensayos que parecen ser más resistentes de estabilidad y la automatización del proceso.
a este tipo de contaminación.
Dado que las muestras permanecen selladas después de
Becton Dickinson también ha desarrollado un ensayo la amplificación, se espera que la posible contaminación
de nueva generación, el ProbeTec ET CTQx/GCQX en ambiental remanente sea muy baja. Sin embargo, es
el Sistema Viper con tecnología XTR (Viper) autorizado muy recomendable la vigilancia ambiental si no existen
por la FDA. Este ensayo está también totalmente medidas de control de la degradación de los productos
automatizado y puede generar 278 resultados en un amplificados ya sean enzimáticas o de otro tipo. Según
solo turno de trabajo de 8 horas. El nuevo ensayo usa indicaciones del fabricante es muy recomendable que se
una química doble que incluye una amplificación con cumplan estrictamente los procedimientos de limpieza y
cada reacción de detección de clamidias o gonococos. descontaminación.
El sistema es de una gran solidez con excelentes
características de eficacia (24). Debe vigilarse la reproducibilidad. Además, para una
especificidad ideal, hay ensayos de confirmación que
5.4.3 Ensayos diagnósticos de Gen-Probe detectan 16S rRNA específico de C. trachomatis
(APTIMA CT) y 16S rRNA específico de N. gonorrhoeae
El ensayo APTIMA Combo 2 (Gen-Probe, EUA),
autorizado por la FDA, se basa en el principio de captura (APTIMA GC; otra secuencia del 16S rRNA respecto a la
de rRNA diana (destinado a reducir o eliminar la empleada en APTIMA Combo 2) y estos ensayos son
inhibición de la amplificación), es decir, aislamiento de ideales para la confirmación de los resultados positivos
secuencias de rRNA diana usando oligonucleótidos de así como para la repetición de pruebas (26).
captura y perlas magnéticas de DNA, seguido de
amplificación usando una técnica de amplificación 5.4.4 Ensayos de Roche Diagnostics
mediada por transcripción (TMA, por sus siglas en El ensayo Cobas Amplicor CT/NG (Roche Diagnostics,
inglés) de una secuencia del 23S rRNA de C. EUA), autorizado por la FDA, emplea tecnología basada
trachomatis. La amplificación se detecta utilizando la en la RCP para amplificar secuencias de DNA diana
cinética de emisión de luz por sondas de DNA marcadas usando pares de cebadores biotinilados específicos para
que son complementarias de la región diana. Los datos detectar el microorganismo. La diana se encuentra en el
que confirman la falta de inhibición cuando se usa este plásmido críptico de C. trachomatis. Después de un
ensayo se han obtenido principalmente mediante el proceso de amplificación de tres temperaturas, los
análisis de muestras negativas de pacientes a las que se productos son hibridados en perlas magnéticas
les ha añadido cepas de laboratorio de C. trachomatis. recubiertas de secuencias de sondas específicas para la
especie y que están dentro de las secuencias del
Las muestras autorizadas son las de orina y las
cebador.
vaginales, endocervicales y uretrales tomadas con
hisopo, así como las muestras tomadas en el medio El proceso de detección se basa en las interacciones
líquido para citología (12, 26). Las muestras tomadas biotina-avidina. Un analizador Cobas puede analizar
con hisopo se introducen en el medio de transporte del aproximadamente 96 muestras, incluidas muestras y
controles, en 8 horas. Las muestras se recogen en un amplificación y un proceso de prevención de
medio de transporte comercializado. La orina y las contaminación remanente junto con un sistema de
muestras tomadas con hisopo son estables hasta 7 días automatización sólido que permite analizar hasta 278
conservadas a 4 °C. Los tipos de muestras autorizadas muestras durante un turno de 8 horas. Por otro lado, da
incluyen las endocervicales y uretrales tomadas con buenos resultados con muestras obtenidas de forma
hisopo, el medio líquido para citología y la primera parte cruenta e incruenta, como las vaginales obtenidas con
de la micción, aunque la orina de mujer no debe usarse hisopo y las de orina en el caso de los hombres.
para la detección de la gonorrea. Se ha demostrado que Actualmente se está evaluando para las muestras
los resultados obtenidos a partir de hisopos vaginales tomadas en el medio líquido para citología.
son aceptables con este sistema analítico (27, 28).
5.4.5 Otros ensayos de amplificación de ácidos
Este ensayo incluye una medida de la inhibición basada
nucleicos
en una secuencia de DNA inaplicable precargada en
cada tubo de reacción. Esto tiene por objeto poder Los ensayos descritos anteriormente se basan en la
comprobar que un resultado negativo es verdaderamente información disponible al momento de redactarse este
negativo y no meramente afectado por el contenido de la manual. Actualmente se están poniendo a punto y
muestra. El ensayo también utiliza una enzima (uracilo evaluando varias pruebas de amplificación de ácidos
N-glicosilasa) en la mezcla de amplificación que degrada nucleicos nuevas y, dada la naturaleza cambiante en
las secuencias previamente amplificadas basándose en este ámbito, podemos esperar una proliferación de
la presencia de dUTP en lugar de dTTP en el producto pruebas nuevas. Los laboratorios deben revisar la
amplificado. Se proporciona de este modo al usuario una bibliografía a medida que las descripciones de estos
red de seguridad que protege frente a salpicaduras ensayos nuevos se encuentren publicadas. Por otro
menores y la formación de aerosoles que se producen lado, en muchos entornos, los ensayos autorizados por
normalmente al manipular un gran número de muestras la FDA no se encuentran fácilmente en el mercado o no
y mejora la reproducibilidad de los resultados. pueden realizarse debido a las exigencias de
instrumental especializado o al costo elevado. En
El Cobas TaqMan CT v2,0, con marca CE en Europa, es consecuencia, los ensayos que están comercializados y
el ensayo de segunda generación fabricado por Roche. que no han sido examinados por la FDA y otros que han
Este sistema analítico está basado en la RCP en tiempo desarrollado los propios laboratorios se usan como
real y puede acoplarse con un sistema de procesamiento métodos que proporcionan una mayor sensibilidad con
automatizado para reducir al mínimo el tiempo de trabajo respecto a otras técnicas de análisis (por ejemplo, IFD,
de los técnicos. Este ensayo puede servir para detectar ELISA). En el caso de que se utilicen PAAN no
únicamente clamidias sin combinar con el análisis de autorizadas por la FDA, deben existir procedimientos
gonococos. El ensayo de última generación de Roche normativos internacionales —como los de la Unión
(Cobas 4800 CT/NG), que también detecta N. Europea— u otros procedimientos normativos
gonorrhoeae, ya está autorizado por la FDA. Este ensayo nacionales que garanticen la calidad y el desempeño de
se basa en la RCP en tiempo real en una plataforma esas PAAN. (17, 18). En estos casos también es
totalmente automatizada. Las dianas del cebador usadas fundamental que los laboratorios se comprometan a
en ambos, Cobas TaqMan CT v2.0 y Cobas 4800 CT/NG, hacer una validación rigurosa del desempeño de las
se han diseñado de nuevo y se han incluido dianas pruebas de amplificación de ácidos nucleicos antes de
dobles para la detección de clamidias con objeto de usarlas para la obtención de resultados de pacientes;
garantizar la detección de la variante sueca nvCT véase también el capítulo 2 y el anexo 3 con respecto a
(20–22). La segunda diana no está ubicada en el las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos y su
plásmido sino en las regiones conservadas del gen validación y control de la calidad.
ompA de CT que codifica la proteína principal de la
membrana externa. Las características de desempeño
son similares a las otras pruebas de amplificación de
ácidos nucleicos. Este ensayo proporciona un control de

5.5 Métodos de detección que no están 5.5.2 Pruebas diagnósticas en el punto de
basados en ácidos nucleicos atención
Los enzimoinmunoanálisis tienen una sensibilidad baja
5.5.1 Ensayo de inmunofluorescencia directa
y la especificidad es insuficiente (especialmente los
La inmunofluorescencia directa utiliza un anticuerpo
ELISA que detectan el lipopolisacárido) en comparación
monoclonal marcado con fluoresceína para permitir la
con las prueba de amplificación de ácidos nucleicos,
visualización al microscopio de cuerpos elementales de
que pueden requerir confirmación de los resultados
C. trachomatis en los frotis celulares recogidos de la
positivos. Los resultados negativos deben interpretarse
conjuntiva, la uretra o el endocérvix. Es el único tipo de
con precaución debido al bajo desempeño de estas
prueba que mantiene la capacidad de evaluar la calidad
pruebas que pueden pasar por alto algunas infecciones
de la muestra directamente; sin embargo, la
sin detectarlas. Debido a esta limitación de los ELISA
inmunofluorescencia directa adolece de sensibilidad
existentes, dichas pruebas no deberían usarse cuando
suficiente incluso en relación con el cultivo.
haya otras opciones al alcance.
Dos ensayos directos con anticuerpo fluorescente, la
Sin embargo, a diferencia del ELISA, las pruebas
tinción directa de MicroTrak (Trinity Biotech, Irlanda) y
diagnósticas en el punto de atención (“pruebas
la tinción directa de Pathfinder (BioRad Laboratories,
rápidas”) que utilizan la técnica de ELISA tienen
EUA), se comercializan para la tinción de los frotis
ventajas que las hacen aconsejables en entornos
recogidos de la uretra, el endocérvix, el recto, la
específicos. Se han desarrollado varias pruebas
orofaringe y la conjuntiva destinados a la visualización
diagnósticas en el punto de atención, generalmente
de los cuerpos elementales de las clamidias. El ensayo
basadas en formatos de flujo lateral y captación del
MicroTrak usa un anticuerpo monoclonal marcado con
antígeno de membrana en tiras
fluoresceína específico de la proteína principal de la
inmunocromatográficas, para el diagnóstico de
membrana externa de C. trachomatis y no presenta
infecciones por C. trachomatis. Muchos de estas se
reacción cruzada con C. pneumoniae.
han puesto a punto y comercializado, pero la mayoría
Por el contrario, el reactivo de Pathfinder usa un no se han sometido a una evaluación adecuada e
anticuerpo policlonal específico frente al integral. Sin embargo, cuando se comparan con las
lipopolisacárido (LPS) que es más reactivo y teñirá C. pruebas de amplificación de ácidos nucleicos, estas
pneumoniae así como C. trachomatis. La pruebas rápidas presentan una sensibilidad claramente
inmunofluorescencia directa se usa con mayor insuficiente y solo deben usarse si no existen los
frecuencia para la tinción de frotis conjuntivales, laboratorios idóneos. En el anexo 2 se trata el
predominantemente en los recién nacidos de países fundamento de las pruebas diagnósticas en el punto de
desarrollados. Estos ensayos ofrecen la ventaja de la atención. A pesar de la baja sensibilidad de estas
rapidez en la obtención de los resultados, la elevada pruebas analíticas, en las poblaciones con recursos
especificidad y la detección de microorganismos no limitados y muy vulnerables, una disminución de la
viables. Además, ningún otro ensayo comercializado sensibilidad puede ser aceptable a cambio de poder
tiene especificaciones reglamentarias para las realizar los análisis y administrar un tratamiento al
muestras conjuntivales ni tiene la capacidad de evaluar paciente mientras aún está en el lugar en el que se
la calidad de la muestra directamente. Sin embargo, la presta la asistencia sanitaria (29).
sensibilidad de la inmunofluorescencia directa es
En un estudio de análisis de decisiones realizado por
sustancialmente inferior a la de la prueba de
Gift et al., cuando el porcentaje de pacientes que
amplificación de ácidos nucleicos, es difícil e
regresaban para recibir tratamiento era del 65% o
inadecuada para un diagnóstico que precise una
menos, el diagnóstico inmediato con pruebas en el
capacidad analítica ultrarrápida y exige microscopistas
punto de atención proporcionaba un aumento del
con gran experiencia. Los resultados negativos deben
número de pacientes tratados aunque se identificaran
interpretarse con cautela debido al escaso desempeño
menos infecciones (30). Las pruebas diagnósticas en el
de estas pruebas que pueden pasar por alto algunas
punto de atención también podrían usarse en estos
infecciones.
entornos para aumentar la especificidad de los
algoritmos de manejo sindrómico, que reducirán el
tratamiento excesivo y detectarán las infecciones 5.6.1.1 Cultivo de C. trachomatis en la línea celular
asintomáticas. McCoy
Las pruebas diagnósticas rápidas en el punto de • Separación de matraces

atención brindan una mayor oportunidad para llegar a –– Comprobar la esterilidad de los medios antes del
las poblaciones sin acceso a ambulatorios y les uso.
proporcionan un tratamiento inmediato. En algunas
circunstancias, las consecuencias del aumento de –– Comprobar visualmente las monocapas
tratamientos administrados a los pacientes puede confluentes y la ausencia de contaminación
compensar la menor sensibilidad de estas pruebas microbiana.
comparadas con las de amplificación de ácidos
–– Proseguir con una técnica estéril y trabajando en
nucleicos.
una cabina de bioseguridad. Aspirar los medios
del matraz confluente con una pipeta estéril y un
matraz de vacío.
• Las pruebas diagnósticas rápidas en el punto
de atención brindan una mayor oportunidad –– Lavar la monocapa con 10 ml de solución de
para llegar a las poblaciones sin acceso a glucosa-potasio-sodio-fosfato (GKNP) (véase
servicios ambulatorios y les proporcionan un anexo 4) y aspirar.
tratamiento inmediato. En algunas situaciones,
las consecuencias del aumento del tratamiento –– Agregar 4 ml de tripsina e incubar las células
administrado a los pacientes pueden a temperatura ambiente hasta separar la
compensar la menor sensibilidad de estas monocapa del matraz (aproximadamente 3 a 7
pruebas comparadas con las PAAN. minutos). Golpear levemente los lados del matraz
para despegar las células.
5.6 Métodos de uso únicamente en los –– Agregar 4 ml de medio Dulbecco con
modificación de Iscove (IMDM-VGA) (véase
laboratorios de referencia
anexo 4) para inactivar la tripsina y mezclar bien.
5.6.1 Cultivo Usar el líquido para arrastrar posibles restos de
Hasta principios de los años ochenta, el principal células de la parte posterior del matraz.
método de referencia para el diagnóstico de la infección
–– Agregar 1 ml de esta suspensión de células a
por C. trachomatis consistía en centrifugar muestras
cada uno de los nuevos matraces de 175 cm2 y
clínicas que se inoculaban después a células viables
completar hasta 75 ml con IMDM-VGA. Cuando
susceptibles de cultivo tisular, seguido de visualización
se siembre un matraz de 75 cm2, agregar 0,5 ml
de las inclusiones clamidiales características tras la
y completar hasta 35 ml.
incubación. En resumen, la muestra se recogía con
hisopos de dacrón o citocepillos y se introducía en –– Incubar los matraces a 37 °C durante 48 a 96
un tubo con medio de transporte tamponado que horas herméticamente cerrados.
contenía, por ejemplo, sacarosa, fosfato y glutamato
(véase el anexo 4) y suero fetal bovino con antibióticos • Siembra de las placas de microtitulación y los viales
(vancomicina, gentamicina) y antifúngicos (nistatina) –– Seguir los pasos anteriores de 1 a 6.
para inhibir el crecimiento de otras bacterias y hongos.
Aunque actualmente este método debe reservarse para –– Para sembrar cada placa se necesitan 15 ml
los laboratorios de referencia, es importante mantener la de una suspensión celular diluida. Calcular el
capacidad de obtener de vez en cuando cepas aisladas volumen total necesario teniendo en cuenta
de pacientes, y para ello hay que recurrir a los cultivos el número de placas. Por ejemplo, para 10
tisulares. placas se necesitan 150 ml de IMDM-VGA. Para
cada vial se necesita 1 ml de medio de Eagle
modificado (MEM-VG) (véase el anexo 4); calcular

el volumen total necesario teniendo en cuenta el muestras deben analizarse sin diluir y diluidas
número de viales. en proporción de 1:2 y 1:10 (en medio de
sacarosa-fosfato-glutamato).
–– Para cada 50 ml de IMDM-VGA de las placas de
microtitulación, agregar 1 ml de la suspensión –– Trabajar en una cabina de bioseguridad. Colocar
de células del matraz tripsinizado. Por ejemplo, la mitad de cada muestra en el criovial con el
para 150 ml de IMDM-VGA se necesitan 3 ml de mismo número de la muestra.
células. Para cada 100 ml de IMDM-VGA de los
–– Aspirar las placas que contienen monocapas
viales, agregar 1 ml de células.
confluentes.
–– Cargar un hemacitómetro con la suspensión de
–– Agregar 100 µl de cada muestra y distribuirlos
células diluida. Hacer el recuento en 5 cuadrados
en capas sobre la monocapa de células. Cada
(las 4 esquinas y el centro); el número medio
muestra se inocula sobre tres monocapas
de células contadas por cuadrado se multiplica
consecutivas. Una vez finalizada la inoculación
por 105 para obtener el número de células por
de cada placa, agregar 200 µl de IMDM-VGA en
mililitro. Las placas de microtitulación requieren
cada pocillo.
de 1 a 1,4 × 10 6 células/ml (10–14 células por
cuadrado); los viales requieren de 7 a 10 × 105 –– Tapar las placas con una película de sellado y
células/ml para que la capa sea confluente en centrifugar a 1400 g durante 1 hora a 30 °C.
48 horas. Si el número de células contado está Incubar a 37 °C durante 48 horas.
fuera del intervalo, se ajusta la concentración
agregando más IMDM-VGA o más células del –– Conservar las muestras a –70 °C hasta que se
matraz según convenga. Volver a hacer el obtengan los resultados. Todas las muestras
recuento y ajustar hasta lograr la concentración positivas se conservan más de 2 semanas.
correcta. –– Eliminar el medio de las placas. Fijar las
–– Agregar 200 µl a cada pocillo. Tapar las placas monocapas cubriéndolas con metanol durante 10
con una película de sellado. Agregar 1 ml a cada minutos. Eliminar el metanol.
vial y cerrar herméticamente. • Inoculación de los viales
–– Incubar a 37 °C hasta su uso (entre 48 y 96 –– Solo algunas muestras excepcionales se
horas). cultivan en viales. Por ejemplo las biopsias de
• Inoculación de las placas de microtitulación endometrio, las de trompas de Falopio y las de
tejido de los ganglios linfáticos.
–– Comprobar que la monocapa de células de la
línea McCoy sea confluente. Las células deben –– Comprobar en los viales que las células de
tocarse y estar ligeramente aglomeradas. El McCoy sean confluentes; las células deben
medio debe estar transparente. tocarse y estar levemente alargadas. El medio
debe estar transparente.
–– Las muestras de origen cervicouterino, uretral,
vaginal, rectal, orofaríngeo y conjuntival deben –– Agitar las muestras con una agitadora vorticial
analizarse en placas microtitulación. durante 5 segundos y luego homogeneizar con
ultrasonidos durante 20 segundos. Durante la
–– Agitar con una agitadora vorticial durante 5 homogeneización se deben proteger los oídos y
segundos y luego homogeneizar, si es posible, los ojos.
durante 20 segundos. Se deben proteger oídos y
ojos durante la homogeneización. –– Las muestras que presentan gran contaminación
bacteriana (por ejemplo, medio de transporte
–– Las muestras que presentan gran contaminación turbio o cambio de pH del medio) pueden
bacteriana (por ejemplo, medio de transporte causar toxicidad en el cultivo tisular. Estas
turbio o cambio de pH del medio) pueden muestras deben analizarse sin diluir y diluidas
causar toxicidad en el cultivo tisular. Estas
en proporción de 1:2 y 1:10 (en medio de trachomatis, es técnicamente compleja y carece de
sacarosa-fosfato-glutamato). métodos internacionalmente estandarizados y con
garantía de la calidad. El cultivo se solicita hoy en día
–– Etiquetar y aspirar tres viales por muestra
predominantemente en casos médico-forenses, debido a
en la cabina de bioseguridad. Agregar 0,2 ml
la supuesta especificidad del 100% (aunque se produce
de la muestra a cada vial. Cubrir con 1 ml de
contaminación cruzada entre las muestras) y para las
IMDM-VGA.
analíticas de las pruebas de curación que se solicitan
–– Centrifugar a 2500 g durante 1 hora a 30 °C. algo antes de 14 días del inicio el tratamiento. De
Incubar a 37 °C durante 72 horas. hecho, las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos
tienen la suficiente especificidad como para que sean
–– Conservar todas las muestras a –70°C hasta que aceptables en los casos médico-forenses, pero la
se obtengan los resultados. Todas las muestras confianza en el cultivo refleja la lentitud en el cambio de
positivas se conservan indefinidamente. las normas legales.
–– Aspirar el medio de 1 vial por muestra y fijar Las pruebas de curación rara vez se realizan debido a la
cubriendo la monocapa con metanol durante 10 eficacia de los tratamientos con dosis única que existen
minutos. actualmente; sin embargo, algunos estudios recientes
–– Teñir con anticuerpos fluorescentes. han señalado que la eficacia de la azitromicina 1 g era
insuficiente para la erradicación. Cuando se realizan
–– Seguir las instrucciones del prospecto relativas estas pruebas, se suelen hacer 2 a 3 semanas después
al anticuerpo específico anticlamidia que se use. del tratamiento, momento en el que, en la mayoría de los
En general: casos, las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos
son adecuadas ya que la eliminación del DNA de la
–– Distribuir en capas el antisuero en la monocapa
infección inicial debe estar terminada en ese momento.
fijada (después de la extracción del metanol).
Sin embargo, el momento ideal para la prueba de
En los pocillos de microtitulación se ponen 40 µl
curación puede ser distinto en el caso de las pruebas de
de antisuero en cada uno con un pipeteador
amplificación de ácidos nucleicos con RNA.
multicanal.
Por consiguiente, a menos que las cepas aisladas se
–– Incubar a temperatura ambiente durante 30
quieran utilizar con fines de investigación, hoy en día
minutos.
ya no hay una justificación válida para que el cultivo
–– Enjuagar suavemente tres veces con solución sea el método habitual de diagnóstico. Esto concuerda
salina amortiguada con fosfatos (PBS) (véase el con las recomendaciones de las guías actuales de
anexo 4). laboratorio sobre enfermedades de transmisión sexual
de los Centros para el Control y la Prevención de
–– Las placas se leen de la siguiente manera, retirar Enfermedades (15).
el cubreobjetos redondo de 13 mm de los viales
y, utilizando líquido de montaje, colocar en portas Las cepas obtenidas en entornos en los que se mantiene
de vidrio con cubreobjetos de 22 × 50 mm. el cultivo deben preservarse en un depósito de muestras
Mantener los cultivos teñidos en la oscuridad para los estudios epidemiológicos. Estos estudios
hasta que se lean. Los cultivos deben leerse el pueden incluir el antibiograma (véase más adelante) y el
mismo día que se tiñen. genotipado. El genotipado puede realizarse con técnicas
moleculares y no requiere microorganismos vivos
En la mayoría de los laboratorios, el cultivo ya no es
(31–33). Por consiguiente, deben mantenerse también
una prueba diagnóstica idónea dado que es mucho
en las diferentes regiones del mundo los depósitos de
menos sensible que la prueba de amplificación de
muestras que dan positiva la PAAN.
ácidos nucleicos, el tiempo de obtención del resultado
es significativamente más largo, la toma de muestra
es traumática, requiere condiciones de manipulación
más exigentes para preservar la viabilidad de C.

5.6.3 Pruebas serológicas
• La sensibilidad del cultivo es insuficiente
comparada con las pruebas de amplificación de Las pruebas serológicas para el diagnóstico de las
ácidos nucleicos comercializadas y autorizadas infecciones por clamidias fueron las primeras técnicas
internacionalmente, y no debe recomendarse utilizadas.
para el diagnóstico si existen PAAN idóneas y
Estas pruebas identifican y, en algunos casos, valoran
asequibles.
el grado de respuesta de los anticuerpos frente a los
• La posibilidad de hacer cultivos debe antígenos de clamidia. Aunque las primeras pruebas,
mantenerse en algunos laboratorios de fijación de complemento y microinmunofluorescencia,
referencia y deben conservarse los depósitos dependían de microorganismos enteros, se desarrollaron
de cepas para posibles estudios futuros pruebas posteriores que son específicas para proteínas
fenotípicos o genéticos. individuales o determinadas clases de anticuerpo.
Estas pruebas pueden ayudar al diagnóstico o cribado
de infecciones complicadas por C. trachomatis (artritis
5.6.2 Antibiograma reactiva, EPI, embarazo ectópico, infertilidad de causa
tubárica), servir para el diagnóstico de la neumonía
No se dispone de pruebas inequívocas sobre la neonatal y el linfogranuloma venéreo (véase el
aparición de resistencia adquirida homotípica capítulo 11) y ser valiosas en investigación y estudios
(fenotípica y genéticamente) y estable a los antibióticos epidemiológicos, por ejemplo, para los antecedentes de
recomendados para las cepas clínicas de C. trachomatis, exposición acumulada a la infección por clamidias de
aunque las observaciones clínicas han sugerido que una muestra de población. No obstante, es importante
la resistencia bacteriana es una causa del fracaso interpretar siempre con cautela los resultados
terapéutico. Además, el antibiograma in vitro de C. serológicos y nunca fuera de contexto.
trachomatis nunca se ha realizado sistemáticamente,
y hace falta un método con garantía de la calidad, En las infecciones agudas primarias por clamidias se
reproducible, estandarizado y aceptado universalmente, detectará IgM específica, pero también IgG e IgA. Sin
así como una correlación fiable y con datos probados embargo, la respuesta de anticuerpos sistémica puede
entre la actividad in vitro y la eficacia in vivo (respuesta estar retardada o no ser cuantificable tras la infección
clínica al tratamiento) (34). urogenital sin complicaciones.
Por el contrario, concentraciones elevadas de

El antibiograma de C. trachomatis requiere mucha
anticuerpos frente a C. trachomatis pueden persistir
mano de obra especializada y práctica en la realización
mucho tiempo después de que haya desaparecido la
de cultivos tisulares, y solo es factible en los
infección. En consecuencia, debido a la sensibilidad y
laboratorios de referencia. Sin embargo, no debería
especificidad bajas, la determinación de los anticuerpos
descartarse la aparición y propagación en el futuro de
anticlamidia tienen un valor limitado para el diagnóstico
resistencias de importancia clínica a los antibióticos
de las infecciones agudas por C. trachomatis y no debe
de C. trachomatis. Esto pone de relieve la necesidad
usarse en el diagnóstico habitual de las infecciones sin
de evaluar adecuadamente los métodos de realización
complicaciones causadas por esta especie.
del antibiograma actuales y el desarrollo de un método
con garantía de la calidad y, objetivo, estandarizado
y eficaz, así como la correlación entre la actividad in • No usar las pruebas serológicas en
vitro y la respuesta al tratamiento. Este método puede el diagnóstico de las infecciones sin
ser útil en el futuro para vigilar la posible resistencia complicaciones por C. trachomatis.
a los antibióticos, los estudios de tratamiento clínico y • Usar las pruebas serológicas solo como una
la evaluación de la actividad in vitro de los antibióticos posible ayuda en el diagnóstico o cribado de las
nuevos. En caso de propagación de la resistencia a los infecciones complicadas por C. trachomatis, la
antibióticos de importancia clínica de C. trachomatis, los neumonía neonatal y el linfogranuloma venéreo,
depósitos de las cepas serán útiles para evaluaciones así como en los estudios epidemiológicos.
retrospectivas en los centros de investigación.
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Capítulo 6
Tricomoniasis
6.1 Introducción
Trichomonas vaginalis es el agente causal de la infección sustancialmente más tardías de la vida (entre los 40
de transmisión sexual (ITS) no viral más prevalente a y 50 años de edad) (4, 5). Esta diferencia en cuanto
escala mundial. En el 2008, la Organización Mundial de a distribución es pertinente para suministrar datos de
la Salud calculó que se habían producido 276,4 millones apoyo a los programas de control de las ITS y establecer
de nuevos casos de infección por T. vaginalis a nivel el objetivo apropiado de las actividades de tamizaje.
mundial en adultos de 15 a 49 años, lo que representó No se ha estudiado adecuadamente la distribución
sustancialmente más casos de ITS que los causados específica por edades de la infección en hombres.
por Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae
La segunda diferencia reside en que, a pesar de que
conjuntamente (1). A pesar de esta alta prevalencia de la
depende de la transmisión sexual mediante el paso de
infección por T. vaginalis, en las iniciativas de control de
huésped a huésped, la distribución por sexos de las
las ITS se ha restado históricamente importancia a este
infecciones por T. vaginalis diagnosticadas en laboratorio
microorganismo patógeno. Aunque T. vaginalis puede
es muy asimétrica, con un cociente mujeres/hombres de
causar un flujo o exudado vaginal anormal (tricomoniasis)
hasta 4:1 (6–8). Esta distribución queda demostrada por
en las mujeres y puede ser responsable de hasta 10 a
las tasas de infección en los compañeros sexuales de las
12% de los casos de uretritis no gonocócica en hombres
mujeres infectadas, que varían de 22% a 72% (9), y por
(2), la infección puede ser asintomática en al menos
los pocos estudios llevados a cabo en hombres y mujeres
50% de las mujeres y en 70% a 80% de los hombres
conjuntamente. Es probable que esto se deba a que la
(3). Por lo tanto, el diagnóstico de laboratorio es esencial
infección en hombres tiene un carácter más transitorio,
para complementar las estrategias de manejo sindrómico
a la brevedad del periodo en que el organismo se puede
dirigidas al tratamiento de esta infección.
detectar, y al tamizaje y el diagnóstico deficientes en
T. vaginalis es un protozoo móvil, ovoideo, con forma hombres. T. vaginalis se adhiere a las membranas
de pera y flagelado (de 10 a 20 mµ de longitud). El mucosas revestidas por epitelio escamoso y no invade la
organismo presenta cuatro flagelos libres anteriores y un mucosa. Como consecuencia del ambiente de la uretra
quinto flagelo incrustado en una membrana ondulante masculina, este organismo tiene menor probabilidad de
que se extiende alrededor de los dos tercios anteriores mantenerse en esa ubicación que en el medio vaginal.
de la célula. Los flagelos confieren al protozoo un Existen escasos datos con respecto a la patogenia de la
movimiento entrecortado. infección por T. vaginalis en hombres (8). En hombres y
mujeres, este organismo a menudo produce una intensa
Las características epidemiológicas de la infección por respuesta inflamatoria que da lugar a un exudado
T. vaginalis difieren en dos aspectos importantes de las grisáceo, signo inequívoco de enfermedad. Véase el
de otras infecciones que también cursan con exudado cuadro 6.1, donde se describen las manifestaciones
genital. En primer lugar, la distribución por edades de clínicas de la infección por T. vaginalis.
esta infección se diferencia de la de la infección por
clamidias o la gonorrea en que las tasas de prevalencia El diagnóstico de la tricomoniasis se basa en el olor, la
de las infecciones por clamidias, y en menor grado calidad y la cantidad del exudado vaginal, el pH vaginal, y
de las gonocócicas, alcanzan su punto máximo en la posible presencia de friabilidad del cuello uterino. El pH
las mujeres de edades comprendidas entre los 15 y vaginal, habitualmente superior a 6,0, el exudado grisáceo
25 años, mientras que las infecciones por T. vaginalis o blanco espumoso, y el cuello uterino friable y punteado
parecen llegar a su prevalencia máxima en etapas (“cuello uterino de fresa”) son indicativos de una infección
por T. vaginalis. Sin embargo, la ausencia de estos signos
clínicos no constituye un dato probatorio suficiente para
Tricomoniasis 79
Cuadro 6.1: Manifestaciones clínicas de la infección por Trichomonas vaginalis
Infección genital Primarias Secuelas
Exudado grisáceo, purulento, o blanco

Resultados adversos del embarazo, mayor
Mujeres a amarillento y espumoso, disuria, dolor
riesgo de transmisión y adquisición del VIH
pelviano, prurito
Hombres Exudado uretral, disuria, dolor testicular Posibles epididimitis y prostatitis
descartar esta infección, especialmente si se tiene en meses de seguimiento (14). Ello indica un mayor riesgo
cuenta que es asintomática en casi 50% de las mujeres y de transmisión a las parejas no infectadas por el VIH.
70% a 80% de los hombres (5, 6). En consecuencia, para Ante el mayor riesgo de incremento de la transmisión del
aumentar la sensibilidad y la especificidad del diagnóstico, VIH, similar al observado en las personas con gonorrea,
se requieren técnicas de laboratorio. y las tasas de prevalencia, que son casi tres veces
mayores, el diagnóstico y el tratamiento apropiados de la
La respuesta inflamatoria de la tricomoniasis en infección por T. vaginalis merecen una mayor prioridad.
mujeres y de la uretritis por T. vaginalis en hombres
es significativa, y aumenta sustancialmente el riesgo
de transmisión y adquisición del VIH, así como la • Las infecciones por T. vaginalis son las
probabilidad de resultados adversos del embarazo. En ITS no virales más frecuentes, favorecen
hombres, el tratamiento de la uretritis por T. vaginalis la transmisión y la adquisición del VIH, y
logra una disminución de 0,5 a 2 log de la carga viral aumentan la probabilidad de resultados
del VIH en el líquido seminal (10, 11). Se han observado adversos del embarazo.
resultados similares en mujeres tratadas por la presencia
de exudado vaginal (12, 13). En vista de que la carga
viral en el compartimiento genital constituye uno de los 6.2 Descripción de los métodos de
factores de riesgo más significativos de transmisión a diagnóstico disponibles
una pareja no infectada, el diagnóstico y el tratamiento
Existen cuatro tipos principales de pruebas de
apropiado de las infecciones por T. vaginalis deben diagnóstico de laboratorio: el estudio microscópico en
ser una prioridad de salud pública como estrategia de fresco, la detección antigénica, el cultivo y las pruebas
reducción de la infección por el VIH. De manera análoga, de amplificación de ácidos nucleicos (PAAN). El estudio
desde hace muchos años se dispone de datos indicativos microscópico en fresco puede llevarse a cabo en los
de que la presencia de ITS que cursan con exudado entornos clínicos y en combinación con las pruebas
aumenta el riesgo de adquisición del VIH. En estudios diagnósticas de la vaginosis bacteriana, y es un método
realizados en el África subsahariana se ha calculado que ideal de diagnóstico de primera línea. Esto significa que,
en mujeres con tricomoniasis el riesgo de seroconversión si se lo lleva a cabo y se lo interpreta adecuadamente
del VIH es de 1,5 a 3,0 veces superior (9). Estos estudios y el resultado es positivo, proporciona un diagnóstico
se han llevado a cabo en poblaciones de mujeres con definitivo con una alta especificidad. Sin embargo, es
alto riesgo de infección por el VIH (profesionales del preciso proceder con cautela al descartar la infección
sexo) y en poblaciones más generales (mujeres que con base exclusivamente en un estudio microscópico
acuden a los consultorios de planificación familiar). En negativo, principalmente por tres razones. En primer
el análisis de supervivencia realizado durante un amplio lugar, las tricomonas son muy sensibles a la temperatura
estudio llevado a cabo en consultorios se calculó que el y pierden su motilidad en tan sólo diez minutos tras
riesgo relativo de infección por el VIH a lo largo de un la obtención de la muestra. Dado que la motilidad
período de 30 meses en mujeres con tricomoniasis se constituye una característica distintiva, la pérdida de
incrementa el doble (14). Por otra parte, las mujeres con motilidad puede dar lugar a resultados negativos falsos.
infección por el VIH presentaron un incremento del riesgo En segundo lugar, el tamaño de las tricomonas es similar
de contraer tricomonas de 2,1 veces durante los 30 al de los leucocitos (linfocitos o pequeños granulocitos
neutrófilos), a menudo presentes como resultado del había aprobado únicamente una prueba, pero se están
proceso inflamatorio. Por lo tanto, las tricomonas pueden evaluando otras, que es posible que ya estén disponibles
encontrarse ocultas o confundirse con estas células. en algunos entornos. La sensibilidad y la especificidad
Por último, en muchas mujeres y en la mayor parte de de la prueba aprobada por la FDA (APTIMA TV,
los hombres, la carga de organismos puede estar por Gen-Probe, EUA) son muy altas (5, 16, 18). Es preciso
debajo del límite a partir del cual pueden ser detectados evaluar con rigor las características de desempeño
al microscopio. Además de las muestras de hisopado de las otras PAAN, idealmente comparándolas con la
vaginal, el estudio microscópico también puede llevarse prueba aprobada por la FDA, en el entorno donde se
a cabo con el exudado uretral o el sedimento de orina de van a emplear y antes de la ejecución de medios de
los hombres, pero es una técnica de baja sensibilidad, diagnóstico corrientes en el laboratorio.
probablemente como consecuencia de la baja carga de
Se han descrito varios métodos para la detección
organismos (15).
de anticuerpos contra T. vaginalis. Sin embargo, las
Actualmente, en muchos entornos se dispone de pruebas de anticuerpos tienen una sensibilidad baja y
pruebas de detección antigénica en el punto de atención una especificidad subóptima para la detección de una
(PA). Únicamente han sido aprobadas para el estudio infección activa por T. vaginalis, y no deben utilizarse
de muestras de hisopado vaginal. La última generación para el diagnóstico corriente de la tricomoniasis.
de este tipo de pruebas, por ejemplo, la Prueba Rápida
El cuadro 6.3 resume las características de desempeño
de Tricomonas de OSOM (Genzyme Diagnostics, EUA),
de las pruebas diagnósticas disponibles para la
presenta una sensibilidad superior a la del estudio
detección de T. vaginalis. Para un desempeño apropiado
microscópico (16, 17 ) y puede proporcionar resultados
de todos los métodos de diagnóstico, es crucial seguir
en aproximadamente 30 minutos, es decir, mientras la
minuciosamente los procedimientos normalizados
paciente espera. Del mismo modo que ocurre con otras
de trabajo y las recomendaciones del fabricante en
pruebas en el PA, la oportunidad de tratar las infecciones
cuanto a la toma, el transporte y el almacenamiento
de inmediato constituye una ventaja de este tipo de
de las muestras, así como el desempeño de la prueba
pruebas en comparación con las pruebas que requieren específica, incluidos los controles de calidad.
la derivación a un laboratorio central.
Hace muchos años que se dispone de técnicas de

• Las pruebas en el PA y el cultivo, si son
cultivo basadas en el laboratorio y, en el último decenio,
apropiados, muestran una sensibilidad mayor
también se dispone de estuches comerciales para el
que el estudio microscópico.
cultivo como el sistema de cultivo InPouch TV (BioMed
Diagnostics, EUA). Los hisopados vaginales, los • Las PAAN, si son apropiadas y están validadas,
muestran una sensibilidad mayor que otros
hisopados uretrales y el sedimento de orina en hombres
métodos de diagnóstico.
constituyen los tipos de muestra autorizados para el
cultivo (véase el cuadro 6.2). Este método requiere
un periodo de hasta 5 a 7 días tras la obtención de la
muestra y es necesario el estudio microscópico para
6.3 Toma, transporte y conservación de las
determinar los resultados. Sin embargo, el cultivo muestras (véase el cuadro 6.2)
muestra una sensibilidad muy superior a la del estudio
Mujeres
microscópico en fresco (15–17 ).
Las muestras vaginales son óptimas para la detección
Por último, se dispone de las PAAN para la detección de T. vaginalis. La toma de una muestra del fondo de
del DNA o el RNA específicos de T. vaginalis. En los saco vaginal posterior debe llevarse a cabo mediante
programas que emplean las PAAN para la detección de el empleo de un hisopo de Dacrón o rayón con mango
las infecciones por clamidias y la gonorrea, la inclusión de plástico. Los hisopos de algodón con mango de
de las pruebas diagnósticas de T. vaginalis puede ser madera son aceptables para el estudio microscópico
una estrategia razonable. Al momento de redactarse o la siembra de cultivo, pero no se recomiendan para
este documento, la Administración de Alimentos y las pruebas en el PA o las PAAN. Por consiguiente,
Medicamentos de los Estados Unidos de América (FDA) para evitar confusión, en la práctica conviene evitar
Tricomoniasis 81
Cuadro 6.2: Toma, transporte y conservación de las muestras
Dispositivo Procedimiento
de toma de de toma de la Estudio
Origen muestra muestra microscópico PA Cultivo PAAN
Vagina Hisopo con Tome una Elúya en ≤ 0,5 Deposítela Deposítela Deposítela en el
(obtenida por mango de muestra del ml de solución en el directamente dispositivo de
el médico) plásticoa fondo de saco salina, vierta amortiguador en el medio recolección del
vaginal posterior una gota de extracción de cultivo (por fabricante. Se
antes de la de solución del estuche ejemplo, de puede enviar en
inserción del salina en el y siga las Diamond o seco al laboratorio.
espéculo. portaobjetos instrucciones InPouch).b Almacénela y
y cubra con el incluidas en el transpórtela según
cubreobjetos. paquete. las instrucciones
incluidas en el
paquete.
Vagina Hisopo con Haga rotar el Entréguela al Entréguela al Entréguela al Deposítela en el
(obtenida por mango de hisopo 360°, proveedor para laboratorio laboratorio dispositivo de
la paciente) plásticoa tocando todas su elución y la para su para su recolección del
las paredes de preparación procesamiento siembra en fabricante. Se
la vagina. del frote o según la un medio de puede enviar en
extendido. descripción cultivo. seco al laboratorio.
previa. Almacénela y
transpórtela según
las instrucciones.
Uretra Hisopo con Obtenga los Elúya en ≤ 0,5 NP Deposítela Deposítela en
(únicamente mango de exudados ml de solución directamente el dispositivo
en hombres aluminioc uretrales >1 salina, vierta en el medio de recolección
sintomáticos) hora después una gota de cultivo del fabricante.
de la micción de solución (por ejemplo, Almacénela y
anterior. salina en el de Diamond transpórtela según
portaobjetos o InPouch).b las instrucciones
y cubra con el Incube a 37° C. incluidas en el
cubreobjetos. paquete.
Orina Recipiente No es necesario Centrifugue NP Centrifugue a Deposítela en
estéril de orina que el paciente a 500 g 500 g durante el dispositivo
limpie su zona durante 5 min. 5 min. Deposite de recolección
genital. Obtenga Deposite el el sedimento del fabricante.
la primera sedimento en en el medio Almacénela y
porción de la ≤ 0,5 ml de de cultivo transpórtela según
micción (en solución salina, (por ejemplo, las instrucciones
general menos vierta una gota de Diamond incluidas en el
de 25 ml), >1 de solución o InPouch).b paquete.
hora después salina en el Incube a 37° C.
de la micción portaobjetos
anterior. y cubra con el
cubreobjetos.
NP: no procede; PAAN: pruebas de amplificación del ácido nucleico; PA: en el punto de atención.
a Hisopos de Dacrón o rayón con mango de plástico.
b En los sitios en que no se tiene acceso a un medio de cultivo, los hisopados se pueden colocar en tubos que contengan medio Amies y
almacenarse a 4 °C para su transporte, de manera que lleguen al laboratorio central en un plazo de 24 horas.
c Hisopos de Dacrón o rayón con mango de aluminio.
Cuadro 6.3: Características de desempeño de las pruebas diagnósticas para la detección de T. vaginalis
Estudio
microscópico PA Cultivo PAAN
Tipos de muestra
Hisopado No No No Sí
endocervical
Citología en medio No No No Sí
líquido
Hisopado vaginal
Autorrecolectado Sí Sí Sí Sí
Obtenido por el Sí Sí Sí Sí
médico
Orina
Mujeres No No No Sí
Hombres Sí No Sí Sí
Hisopado uretral Sí No Sí Sí
masculino
Desempeño
Sensibilidad Baja Alta a De moderada a alta Muy alta
Especificidad Muy alta Muy alta Muy alta Muy alta
Costo Bajo Moderado Moderado Alto
Transporte y NP NP En condiciones En condiciones
almacenamiento ambientales ambientales
Instrumental Microscopio Ninguno Incubadora, Requiere mucho
microscopio espacio
Rendimiento/ Bajo/no Bajo/no Bajo/no Alto/posible
automatización
Complejidad técnica Moderada (aptitudes Baja Moderada (aptitudes Alta
para el examen para el examen
microscópico) microscópico)
Nivel de Periférico Periférico Intermedio o central Central
infraestructura de
laboratorio
Otras observaciones • Son más probables • Las infecciones • Se requiere prestar • Ante la posible
los resultados detectadas se una estricta atención contaminación
negativos falsos pueden tratar a la realización de un de laboratorio,
que los resultados antes de que la estudio microscópico se requiere una
negativos reales; paciente salga del minucioso. estricta adherencia
por lo tanto, el consultorio. • La posibilidad de a los protocolos.
contexto clínico es obtener cepas • Algunas requieren
fundamental. viables resulta útil un lote de gran
para llevar a cabo tamaño y ello
pruebas diagnósticas puede retrasar
adicionales, la entrega de
tales como la resultados.
genotipificación y el
antibiograma.
NP, no procede; PAAN, pruebas de amplificación del ácido nucleico; PA, en el punto de atención.
a Se refiere a la Prueba Rápida de Tricomonas de OSOM (Genzyme Diagnostics, EUA).
Tricomoniasis 83
el uso de hisopos de algodón. Las muestras pueden central para una evaluación adicional, en particular en
ser obtenidas por el médico antes de la inserción de casos de personas sintomáticas. Sin embargo, cuando
un espéculo durante la exploración ginecológica o se detectan la motilidad (estrictamente necesaria)
por la propia paciente. El médico debe proporcionar y la morfología características, la especificidad de
instrucciones para garantizar que la paciente comprenda este método es excelente y todos los pacientes cuyos
cómo obtener sus propias muestras. Se ha comprobado resultados del estudio microscópico son positivos se
que la provisión de instrucciones apropiadas constituye consideran infectados.
un factor determinante de la aceptabilidad de la
Para obtener resultados óptimos, el estudio
autorrecolección de muestras por parte de las pacientes.
microscópico, que presenta la mayor sensibilidad
Las muestras residuales (vaginales, de cuello uterino u
en mujeres sintomáticas, se debe llevar a cabo e
orina) obtenidas para llevar a cabo pruebas diagnósticas
interpretarse durante los 10 minutos posteriores a la
de las infecciones por clamidias o la gonorrea pueden
obtención de la muestra.
emplearse para las PAAN de T. vaginalis.
Hombres • Para obtener resultados óptimos, el estudio

Se pueden obtener exudados uretrales mediante el microscópico, que presenta la mayor
empleo de un hisopo de Dacrón o rayón con mango de sensibilidad en mujeres sintomáticas, se
aluminio. Estas muestras se pueden emplear para el debe llevar a cabo e interpretarse durante los
estudio microscópico en fresco, el cultivo o las PAAN. 10 minutos posteriores a la obtención de la
La primera orina del día puede ser centrifugada para muestra.
obtener un sedimento apropiado para el cultivo. La orina
no centrifugada es adecuada para llevar a cabo las
PAAN. 6.4.2 Pruebas de detección de antígenos en el
punto de atención (PA)
6.4 Métodos de diagnóstico
Se han elaborado diversas pruebas de detección de
6.4.1 Estudio microscópico antígenos para el diagnóstico de T. vaginalis (16, 17,
20). Los requisitos en cuanto a equipo y los costos de
Inmediatamente después de la obtención de la muestra,
los reactivos varían, y el desempeño de las pruebas
los hisopados deben eluirse en ≤ 0,5 ml de una solución
también es variable. Algunas de estas pruebas van
salina estéril a temperatura ambiente. Se debe depositar
destinadas a su uso exclusivo en mujeres sintomáticas,
en el portaobjetos una gota de la muestra eluída y cubrir
lo que las hace menos útiles que las otras opciones. La
con un cubreobjetos. La extensión debe examinarse
última generación de este tipo de pruebas, por ejemplo,
a 100 aumentos durante los diez minutos posteriores
la Prueba Rápida de Tricomonas de OSOM (Genzyme
a la recolección en busca de tricomonas móviles. La
confirmación de la característica forma de pera, al igual
que la visualización de los flagelos, debe llevarse a
cabo a 400 aumentos (fig. 6.1). Las células no móviles
no pueden diagnosticarse como tricomonas y, por ello,
es crucial la inmediatez del estudio microscópico, dado
que las tricomonas pierden rápidamente su motilidad
(19). La sensibilidad de la microscopia es limitada (sólo
de 40% a 65% para muestras de mujeres en algunos
entornos y aun menor para muestras de hombres) (6, 15,
16). En consecuencia, los resultados negativos deben
interpretarse con cautela.
En algunos entornos, el estudio microscópico constituye

el método de diagnóstico y tamizaje de primera línea. Figura 6.1
Las muestras negativas se remiten a un laboratorio Trichomonas vaginalis al estudio microscópico en
fresco
Diagnostics, EUA), muestra una sensibilidad superior debe reducir previamente y los tubos de cultivo se deben
al estudio microscópico (16, 17 ). Los procedimientos dejar algo abiertos antes de disponerlos en un recipiente
variarán de acuerdo con el fabricante y deben seguirse anaerobio para su incubación a 37 °C.
minuciosamente las instrucciones incluidas en el
El medio de Diamond original (21, 22) (véase el anexo 4)
paquete para cada prueba específica.
ha sido modificado posteriormente según el método de
Las pruebas en el PA, si son apropiadas, muestran Fouts y Kraus, en que la estreptomicina es reemplazada
una sensibilidad sustancialmente mayor que el estudio por netilmicina (22, 23). El medio modificado mejora la
microscópico, proporcionan resultados rápidos y sensibilidad hasta aproximadamente 75% en relación
solo requieren mínimos conocimientos técnicos con las PAAN. Sin embargo, el cultivo de T. vaginalis
especializados. presenta también desventajas: la sensibilidad del cultivo
es baja en comparación con los resultados obtenidos
por las PAAN (especialmente en hombres), se trata de
• Las pruebas en el PA, si son apropiadas, un procedimiento lento y requiere que el paciente vuelva
muestran una sensibilidad sustancialmente para recoger los resultados. También se han descrito
mayor que el estudio microscópico, otros medios de cultivo (22, 24–26) (véase el anexo 4).
proporcionan resultados rápidos y Los hisopados deben eluirse o el sedimento de orina
solo requieren conocimientos técnicos debe ser inoculado, directamente en el medio de cultivo,
especializados mínimos. en el punto donde se presta la atención médica. En los
sitios en que no se tiene acceso a un medio de cultivo
debido a que el período máximo de almacenamiento
6.4.3 Cultivo es breve o por otras razones, los hisopados se pueden
Durante muchos años, el cultivo ha sido la piedra colocar en tubos que contengan medio Amies y
angular del diagnóstico de T. vaginalis. T. vaginalis es almacenarse a 4 °C para su transporte, de manera que
un organismo anaerobio que crece más lentamente lleguen al laboratorio central en un plazo de 24 horas.
en condiciones aeróbicas. En la actualidad, el cultivo Se debe mezclar suavemente el cultivo y obtener una
se lleva a cabo habitualmente mediante el empleo del gota del fondo del tubo (donde la concentración de
medio de Diamond modificado o del sistema de cultivo tricomonas es más alta) para el estudio microscópico en
comercial InPouch TV (BioMed Diagnostics, EUA) (fig. fresco, cada día durante hasta 7 días. Si no es posible
6.2). El tiempo de incubación debe ser de hasta 5 a realizar este estudio diariamente, el examen al cabo de
7 días. Es importante señalar que T. vaginalis debe 3 o 4 días y nuevamente a los 7 días será suficiente para
crecer en el fondo del tubo o la bolsa de cultivo y, en detectar casi todas las muestras positivas.
consecuencia, el tubo o los tubos deben incubarse en
A mediados de los años noventa, se comercializó un
una posición vertical. Además, el medio de cultivo se
sistema de cultivo que incrementó el empleo del cultivo
como método diagnóstico (22, 27–30). Este sistema
de cultivo, denominado InPouch TV, utiliza una bolsa
independiente de dos cámaras (fig. 6.2). Las muestras
de hisopado se eluyen o el sedimento de orina se
inocula en el medio de la primera cámara, se fuerza
el desplazamiento del medio a la segunda cámara y
la bolsa se cierra herméticamente. Las bolsas son
transportadas al laboratorio para su incubación a 37 °C
durante hasta 5 días.
El cultivo en bolsa puede concluirse antes que el cultivo

estándar ya que cada vez se evalúa todo el volumen. Las
bolsas selladas se leen mediante la colocación de toda la
bolsa en la platina del microscopio a 100 aumentos. La
Figura 6.2 bolsa posee unos soportes que encajan en las pinzas del
Sistema de cultivo InPouch TV portaobjetos y sirven para ayudar a desplazar la bolsa
Tricomoniasis 85
durante el estudio microscópico. Se examina el cultivo aprobada por la FDA (véase a continuación), y que
explorando minuciosamente toda su extensión de posteriormente se utilicen con un sistema de garantía de
extremo a extremo. Es importante señalar que el espesor calidad apropiado (véanse el capítulo 2 y el anexo 3).
de la bolsa requiere que se evalúen todos los planos de Como ya se ha mencionado, la FDA ha aprobado una
foco, lo que requiere un movimiento de arriba abajo y de prueba, la APTIMA TV (Gen-Probe, EUA). Esta prueba
lado a lado. Las extensiones deben leerse diariamente se ha mostrado altamente sensible y específica (16,
hasta el quinto día. Si el último día no se observa 18, 43, 44), y puede ser ejecutada en una plataforma
ninguna tricomona, se notifica que el cultivo es negativo. semiautomatizada o totalmente automatizada. Como todas
las PAAN, requiere una atención minuciosa a las pautas
de manipulación de líquidos para reducir al mínimo los
• El cultivo tiene una sensibilidad similar a las
casos de contaminación. Las necesidades de esta prueba
pruebas en el PA, si son apropiadas, pero
tanto de espacio para el equipo como de energía son
también se puede utilizar para llevar a cabo
sustanciales. Su empleo se debe restringir a laboratorios
pruebas diagnósticas en hombres.
de referencia con una elevada capacidad técnica.
6.4.4 Pruebas de amplificación de ácidos • Las PAAN, si son eficaces y han sido validadas,
nucleicos (PAAN) muestran una sensibilidad muy alta y son
Las PAAN ofrecen la mayor flexibilidad en cuanto a métodos especialmente útiles en entornos donde ya
de obtención de muestras, así como la sensibilidad más alta se emplean las PAAN en el diagnóstico de las
de todos los métodos de diagnóstico existentes. Las infecciones por clamidias y la gonorrea.
muestras genitales residuales usadas para el diagnóstico de • El diagnóstico mediante las PAAN requiere
las infecciones por clamidias y la gonorrea mediante PAAN equipo, reactivos y conocimientos técnicos
son apropiadas para detección de ácidos nucleicos de T. especializados.
vaginalis. Los laboratorios que realizan de manera
sistemática PAAN para el diagnóstico de las infecciones por
clamidias y la gonorrea deben considerar la posibilidad de
6.5 Antibiograma
llevar a cabo pruebas diagnósticas de las infecciones por
tricomonas. A pesar de la diferencia en la prevalencia Se han descrito cepas de T. vaginalis que muestran
específica por edades, en muchos entornos la prevalencia resistencia y reducción de la sensibilidad al metronidazol
poblacional de la infección por T. vaginalis es suficiente (generalmente, tratamiento de primera línea) y al tinidazol
como para justificar la inclusión de su estudio como parte (generalmente, tratamiento de segunda línea), pero ello
de las pruebas diagnósticas de las infecciones que cursan ocurre rara vez (45, 46). No obstante, en ciertos entornos
con exudado vaginal o uretral. Existen descripciones de las se han detectado niveles bajos de resistencia al
pruebas de laboratorio que utilizan muchas de las metronidazol en 2% a 5% de los casos de tricomoniasis
plataformas diagnósticas actuales de las infecciones por en mujeres. El origen de la resistencia a los antibióticos
clamidias y la gonorrea mediante PAAN (6, 15, 31–42). está poco claro, pero muchas de las cepas de T. vaginalis
Todas estas pruebas incluyen el procesamiento para el resistentes parecen ser tolerantes a un medio aeróbico.
aislamiento de los ácidos nucleicos, la amplificación de las Los organismos facultativos generalmente son resistentes
secuencias diana y la detección del material amplificado. al metronidazol. Sin embargo, los datos de resistencia son
Estas pruebas muestran una sensibilidad y una escasos y se requieren estudios adicionales en esta área
especificidad excelentes, pero se pueden ver afectadas por para determinar los mecanismos, la prevalencia y las
la contaminación ambiental y, por lo tanto, requieren una características epidemiológicas de esta resistencia. Sin
estricta adherencia a las buenas prácticas de laboratorio. embargo, dado que la mayor parte de los organismos son
También se recomienda encarecidamente que, antes de su sensibles, el antibiograma no se realiza sistemáticamente
uso con fines diagnósticos, se valide de forma minuciosa la (47, 48). No obstante, es preciso que algunos laboratorios
efectividad de las PAAN de T. vaginalis propuestas para de referencia mantengan su capacidad de realizar el
entornos locales frente como mínimo a una de las PAAN antibiograma de cepas de T. vaginalis, en particular en los
validadas internacionalmente, idealmente la APTIMA TV casos de pacientes en que fracasa el tratamiento con
metronidazol. Los pacientes que regresan con persistencia 11. Hobbs MM et al. Trichomonas vaginalis as a cause
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metronidazole-resistant vaginal trichomoniasis. Clinical
amplification of Trichomonas vaginalis in males. Journal
Infectious Diseases, 2001, 33(8):1341–1346.
45. Schmid G et al. Prevalence of metronidazole-resistant
34. Kaydos SC et al. Development and validation of a
Trichomonas vaginalis in a gynecology clinic. Journal of
PCR-based enzyme-linked immunosorbent assay with
Reproductive Medicine, 2001, 46(6):545–549.
urine for use in clinical research settings to detect
Trichomonas vaginalis in women. Journal of Clinical 46. Upcroft JA, Upcroft P. Drug susceptibility testing
Microbiology, 2002, 40(1):89–95. of anaerobic protozoa. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 2001, 45(6):1810–1814.
35. Jordan JA, Lowery D, Trucco M. TaqMan-based
detection of Trichomonas vaginalis DNA from female 47. Meri T et al. Resistance of Trichomonas vaginalis to
genital specimens. Journal of Clinical Microbiology, metronidazole: report of the first three cases from
2001, 39(11):3819–3822. Finland and optimization of in vitro susceptibility testing
under various oxygen concentrations. Journal of Clinical
36. Lawing LF, Hedges SR, Schwebke JR. Detection
Microbiology, 2000, 38(2):763–767.
of trichomonosis in vaginal and urine specimens
from women by culture and PCR. Journal of Clinical
Microbiology, 2000, 38(10):3585–3588.
Capítulo 7
Vaginosis bacteriana
7.1 Introducción o la calificación (6) de las bacterias de un frotis vaginal

teñido con la tinción de Gram.
La vaginosis bacteriana (VB) es la causa más frecuente de
aumento del flujo vaginal en las mujeres en edad fecunda. • La vaginosis bacteriana es la causa más frecuente
Aunque no se considera una enfermedad de transmisión de aumento del flujo vaginal y se relaciona con
sexual, se ha demostrado que la actividad sexual es un la alteración de la flora vaginal, la reducción del
factor de riesgo (1), ya que su incidencia aumenta al número de lactobacilos vaginales y la proliferación de
aumentar el número de parejas sexuales recientes a lo largo anaerobios y G. vaginalis.
de la vida y al tener una nueva pareja. Los signos clínicos
de la vaginosis bacteriana observados también en mujeres
vírgenes descartan que su transmisión sea exclusivamente 7.2 Diagnóstico
sexual. El cuadro clínico está probablemente mucho más
La vaginosis bacteriana es una entidad clínica
relacionado con alteraciones de la flora vaginal (debido
caracterizada por el aumento de la cantidad de flujo
a mecanismos y factores del hospedador desconocidos
vaginal maloliente. El diagnóstico se basa en la
hasta la fecha) que causan un aumento del pH, como
presencia de por lo menos tres de los cuatro criterios a
resultado de la disminución de los lactobacilos productores
continuación (criterios de Amsel) (4):
de peróxido de hidrógeno. Los lactobacilos ayudan a
mantener el pH ácido propio de la vagina de las mujeres • flujo homogéneo pegajoso de color blanco a grisáceo;
sanas e inhiben el crecimiento de otros microorganismos • pH de la secreción vaginal >4,5;
anaerobios. Normalmente, la vagina de una mujer sana
tiene una concentración elevada de lactobacilos. En caso • desprendimiento de “olor a pescado” causado por la
de vaginosis bacteriana, la población de lactobacilos se producción de aminas cuando se mezcla la secreción
reduce considerablemente, mientras que aumenta la de vaginal con una solución de hidróxido de potasio al
anaerobios y Gardnerella vaginalis. Entre los anaerobios 10% (KOH);
implicados en la vaginosis bacteriana se puede citar • observación de células clave de la vaginosis en el
Mobiluncus spp., Prevotella spp., Bacteroides spp., examen microscópico.
Peptostreptococcus, Fusobacterium y Eubacterium spp.;
también se ha observado la presencia de Mycoplasma Flujo vaginal. La evaluación de este signo clínico es
hominis y Ureaplasma urealyticum. Con técnicas actuales subjetiva. La cantidad de flujo vaginal en las mujeres con
independientes del cultivo, se ha identificado un mayor vaginosis bacteriana no suele ser mucho mayor que en
las mujeres sanas. Por otro lado, la aplicación de duchas
número de microorganismos formando parte de la flora
vaginales puede reducir la cantidad.
encontrada en las mujeres con vaginosis bacteriana,
incluido Atopobium vaginae (2). Muchas de las bacterias pH vaginal. El pH de la secreción vaginal debe medirse
asociadas a la vaginosis bacteriana se encuentran también usando tiras de papel indicador de pH con un intervalo
en las mujeres normales, aunque en menor cantidad; en adecuado (3,8 a 6,0) como el papel de pH Whatman de
consecuencia, el diagnóstico de laboratorio de la vaginosis rango reducido. La muestra se recoge con un hisopo de
bacteriana presenta gran dificultad, con los múltiples los fondos de saco laterales y posterior de la vagina y
métodos descritos en la literatura científica. Se propone luego se toca directamente con el hisopo en la tira de
a menudo el aislamiento e identificación individual de papel. Otra posibilidad es tocar el papel de pH con la
bacterias como G. vaginalis, pero no es adecuado y no tiene punta del espéculo una vez retirado de la vagina (fig. 7.1).
ninguna utilidad clínica en el diagnóstico de la vaginosis Se debe evitar el contacto con el moco cervical ya que
bacteriana (3), además, podría conducir al exceso de tiene un pH >7,0. La vagina madura normal tiene un pH
tratamiento. En realidad, se diagnostica mejor mediante los ácido de 4,0. En la vaginosis bacteriana, el pH se eleva
criterios clínicos de Amsel (4) o mediante la evaluación (5) por regla general por encima de 4,5.
Vaginosis bacteriana 89
Figura 7.1
Prueba del pH realizada en la secreción vaginal,
comparación con una escala de color estandarizada. Figura 7.3
Tinción de Gram de un frotis vaginal normal que
De las cuatro características, la prueba del pH vaginal es muestra lactobacilos (1000×)
la que tiene la mayor sensibilidad, pero la especificidad Fuente: Reimpreso con el permiso de la Asociación
más baja; un pH elevado también se observa si la Británica para la Salud Sexual y el VIH.
secreción vaginal está contaminada con sangre
menstrual, moco cervical o semen, y en las mujeres con mundo, el KOH no se encuentra en el mercado debido
infección por T. vaginalis. a su naturaleza cáustica y, por consiguiente, solo se
comprueban tres de los cuatro criterios, esto hace que
Olor. Las mujeres con vaginosis bacteriana a menudo se pierda la sensibilidad.
se quejan del olor vaginal nauseabundo. Este olor
se debe a la liberación de aminas, producidas por Células clave de la vaginosis. Mezclar una gota de
la descarboxilación de los aminoácidos lisina (para secreción vaginal con una gota de solución salina en un
dar cadaverina) y arginina (para dar putrescina) por portaobjetos de vidrio. Colocar un cubreobjetos sobre la
las bacterias anaerobias. Cuando se agrega KOH suspensión y examinar al microscopio con un aumento
a la secreción vaginal, las aminas se volatilizan total de 400X. Las células clave son células epiteliales
inmediatamente y producen el “olor a pescado” escamosas recubiertas de muchos microorganismos
característico. Colocar una gota de secreción vaginal pequeños coccobacilares, que le dan un aspecto
en un portaobjetos de vidrio y agregar una gota de KOH granular, deshilachado; los bordes de estas células
al 10%. Sostener el portaobjetos cerca de la nariz para epiteliales no están claramente definidos debido al gran
detectar el olor a aminas. Después de dar una reacción número de bacterias presentes y a la desintegración
positiva, la muestra se vuelve rápidamente inodora evidente de las células (figs. 7.2A y 7.2B). En la mayoría
al dejarla en reposo porque las aminas se volatilizan de las pacientes con vaginosis bacteriana se observará
por completo con rapidez. En algunas partes del una mezcla de células epiteliales vaginales exfoliadas
A. Células clave en una preparación en fresco B. Célula clave en una tinción de Gram del frotis
observada al microscopio (400X) vaginal
Figura 7.2
Microscopia de frotis vaginales
normales y 20% o más de células clave. Las bacterias La abundancia de morfotipos de lactobacilos en un frotis
adheridas a las células son de G. vaginalis mezcladas se considera normal; por lo tanto, las puntuaciones
con anaerobios. de lactobacilos se relacionan inversamente con su
número: 4+ lactobacilos representan 0, 3+ representan
La vaginosis bacteriana es reconocible en un frotis
1, etc. Las puntuaciones de morfotipos de Gardnerella
vaginal teñido con tinción de Gram. Los portaobjetos
y Mobiluncus se correlacionan con el número de
pueden examinarse en el consultorio, cuando se
organismos: 4+ Gardnerella representan 4 puntos,
disponga de los medios, o guardarse para examinarlos
etc. Mobiluncus se pondera menos; por lo tanto, 1+ y
en el laboratorio y hacer una comprobación
2+ organismos ponderados representan 1, y 3+ y 2+
independiente posterior. En el frotis se pueden
puntúan 2.
apreciar diferentes grados de la flora vaginal que
va de normal (fig. 7.3) a morfotipos intermedios de Un diagnóstico de “vaginosis bacteriana grave”
vaginosis bacteriana. En el frotis de una mujer con representa 10 puntos (4 por la ausencia de morfotipos
vaginosis bacteriana, los lactobacilos han desaparecido de lactobacilos, 4 por 4+ morfotipos de Gardnerella
o el número es reducido y en su lugar hay una flora y 2 por 4+ morfotipos de Mobiluncus). Una tinción de
microbiana mixta. Para leer los frotis se siguen Gram de un frotis vaginal “normal” representa 0 (0 por
generalmente dos métodos: criterios de Ison y Hay (5), 4+ morfotipos de lactobacilos, 0 por 0 morfotipos de
que evalúan la flora y son muy adecuados en la práctica Gardnerella y 0 por 0 morfotipos de Mobiluncus).
clínica corriente; puntuación de Nugent (6), que califica
las bacterias individuales y proporciona un análisis En la puntuación de Nugent, una puntuación total de
cuantitativo que es particularmente útil a fines de 7 a 10 (la suma de las puntuaciones de los 3 grupos
investigación pero apenas ofrece ventajas desde el punto descritos anteriormente) es indicativa de vaginosis
de vista clínico. La variabilidad entre los observadores en bacteriana, una puntuación de 4 a 6 indica flora
el caso de los criterios de Nugent y los de Ison y Hay es intermedia y de 0 a 3 indica flora normal.
la misma según se desprende de lo informado (7 ).
7.5 Otras pruebas de la vaginosis bacteriana
7.4 Puntuación de Nugent El examen microscópico de una tinción de Gram de un
Este método se basa en la calificación o atribución de frotis vaginal sigue siendo actualmente el método de
puntos a tipos individuales de microorganismos; una laboratorio preferido para el diagnóstico de la vaginosis
puntuación de 0 a 10 resulta de una suma ponderada de bacteriana. Se han descrito algunas otras pruebas, que
los siguientes morfotipos: bacilos largos grampositivos pueden ser útiles si no se dispone de un microscopio.
(lactobacilos), bacilos cortos grampositivos o Gram Entre otras las siguientes:
variable (G. vaginalis o anaerobios de otro tipo) y bacilos 1. Affirm VP III (8): Esta prueba usa hibridación de
curvos gramnegativos o Gram variable (Mobiluncus DNA para detectar concentraciones elevadas de
spp.). Cada uno de estos tres grupos se pondera Gardnerella.
cuantitativamente con una puntuación de 0 a 4 en un
frotis, de la siguiente manera: 2. BV Blue (9): Esta es una prueba diagnóstica en el
punto de atención que está comercializada. Mide
0 = ningún morfotipo por campo (con aceite de
la sialidasa, una enzima que produce algunas de
inmersión)
las aminas liberadas en la vaginosis bacteriana.
1+ = menos de 1 morfotipo por campo (con aceite de Comparada con los criterios de Nugent y de Amsel,
inmersión) tiene una sensibilidad de 88% y una especificidad
de 95% y 91%, respectivamente.
2+ = 1 a 4 morfotipos por campo (con aceite de
inmersión) 3. FemExam (10): Esta prueba consta de dos tarjetas
con indicadores que miden el pH vaginal, aminas
3+ = 5 a 30 morfotipos por campo (con aceite de y actividad enzimática. Los indicadores de la
inmersión) tarjeta FemExam 1 miden valores de pH superior
o igual a 4,7 y aminas con concentración mayor
4+ = más de 30 morfotipos por campo (con aceite de
de 0,5 mmol. La tarjeta 2 mide la actividad de
inmersión)
7.3 Criterios de Ison y Hay
Este método evalúa la proporción relativa de los diferentes morfotipos bacterianos y los clasifica de la siguiente manera:
Grado I (flora normal): solo morfotipos de lactobacilos o En el sistema de Ison y Hay se incluyen dos grados más:
preponderancia de estos (fig. 7.4). grado 0, presencia de células epiteliales y ausencia
de bacterias (fig. 7.7) y el grado IV, células epiteliales
recubiertas solamente con cocos grampositivos (fig. 7.8).
Figura 7.4
Grado I
Grado II (flora intermedia): disminución del número

Figura 7.7
de morfotipos de lactobacilos con una mezcla de
Grado 0
morfotipos bacterianos (fig. 7.5).
Figura 7.5 Figura 7.8

Grado II Grado IV
Grado III (vaginosis bacteriana): flora bacteriana mixta

con escaso número de lactobacilos o sin ellos (fig. 7.6).
Tanto el grado 0 como el grado IV se encuentran

en mujeres normales. El grado 0 se observa
predominantemente tras un tratamiento antibiótico
intravaginal y el grado IV se encuentra en un
número reducido de mujeres que están colonizadas
longitudinalmente por cocos grampositivos,
generalmente estreptococos, a menudo sin lactobacilos
o en número reducido.
Figura 7.6
Grado III
Fuente (figs. 7.4–7.8): Reimpreso con el permiso de la Asociación Británica para la Salud Sexual y el VIH.
la prolina aminopeptidasa. Comparado con la 7.6 Referencias
puntuación de Nugent, la tarjeta FemExam 1 tiene
1. Bradshaw CS et al. High recurrence rates of bacterial
una sensibilidad y especificidad de 71,4% y 72,8%, vaginosis over the course of 12 months after oral
respectivamente, y la tarjeta FemExam 2 tiene metronidazole therapy and factors associated with
una sensibilidad y especificidad de 70% y 81%, recurrence. Journal of Infectious Diseases, 2006,
193(11):1478–1486.
respectivamente.
2. Tabrizi SN et al. Prevalence of Gardnerella vaginalis
Los métodos moleculares se han usado recientemente and Atopobium vaginae in virginal women. Sexually
también para detectar bacterias en vaginosis bacterianas Transmitted Diseases, 2006, 33(11):663–665.
que no se podían reconocer antes y proporcionan la
3. Krohn MA, Hillier SL, Eschenbach DA. Comparison
posibilidad de dar un diagnóstico sensible y específico de of methods for diagnosing bacterial vaginosis among
la vaginosis bacteriana (11, 12). pregnant women. Journal of Clinical Microbiology, 1989,
27(6):1266–1271.
• El diagnóstico puede hacerse mediante los 4. Amsel R et al. Non specific vaginitis. Diagnostic criteria
criterios de Amsel demostrando la presencia and microbial and epidemiologic associations. American
Journal of Medicine, 1983, 74(1):14–22.
de por lo menos tres de estos cuatro criterios:
flujo vaginal homogéneo pegajoso de color 5. Ison CA, Hay PE. Validation of a simplified grading of
blanco a grisáceo, pH>4,5, olor a aminas y Gram stained vaginal smears for use in genitourinary
medicine clinics. Sexually Transmitted Infections, 2002,
células clave de la vaginosis. 78(6):413–415.
• El cultivo de los microorganismos asociados
6. Nugent RP, Krohn MA, Hillier SL. Reliability of
a la vaginosis bacteriana no tiene valor diagnosing bacterial vaginosis is improved by a
diagnóstico. standardized method of Gram stain interpretation.
Journal of Clinical Microbiology, 1991, 29(2):297–301.
• Si se dispone de las instalaciones necesarias,
una tinción de Gram del flujo vaginal que 7. Forsum U et al. An international study of the
pone de manifiesto grados de la flora vaginal, interobserver variation between interpretations of
vaginal smear criteria of bacterial vaginosis. APMIS,
que van de normal pasando por intermedio
2002, 110(11):811–818.
y hasta morfotipos de vaginosis bacteriana,
puede calificarse según los criterios de Ison y 8. Gazi H et al. Use of DNA hybridization test for
diagnosing bacterial vaginosis in women with
Hay y los de Nugent para el diagnóstico de la symptoms suggestive of infection. APMIS, 2006,
vaginosis bacteriana. 114(11):784–787.
9. Bradshaw CS et al. Evaluation of a point-of-care test,

BVBlue, and clinical and laboratory criteria for diagnosis
of bacterial vaginosis. Journal of Clinical Microbiology,
2005, 43(3):1304–1308.
10. West B et al. Evaluation of a new rapid diagnostic kit

(FemExam) for bacterial vaginosis in patients with
vaginal discharge syndrome in the Gambia. Sexually
11. Fredricks DN et al. Targeted PCR for detection of vaginal

bacteria associated with bacterial vaginosis. Journal of
12. Shipitsyna E et al. Composition of the vaginal microbiota

in women of reproductive age – sensitive and specific
genetic diagnosis of bacterial vaginosis is possible?
PLoS ONE, 2013, 8(4):e60670.
Capítulo 8
Candidiasis
8.1 Introducción
La candidiasis vulvovaginal está causada por el hongo o balanopostitis y, en raras ocasiones, uretritis.
Candida albicans (1) en aproximadamente 85% de los Normalmente los hombres desarrollan una respuesta
casos y por C. glabrata en el 15% restante (2). Otras alérgica al antígeno candidiásico, aunque se puede
especies, como C. krusei y C. tropicalis, causan vaginitis observar una infección fulminante con mayor frecuencia
en raras ocasiones (3). El género Candida suele ser de en los pacientes que presentan los factores de riesgo ya
origen endógeno y puede aislarse en el aparato genital mencionados (6).
de hasta 25% de las mujeres en edad fecunda sanas
asintomáticas. Para que la cándida colonice la vagina, 8.2 Diagnóstico
primero tiene que adherirse a las células epiteliales El diagnóstico de la candidiasis vulvovaginal suele
vaginales y posteriormente debe crecer, proliferar y establecerse basándose en la combinación de las
germinar, antes de causar una inflamación sintomática. manifestaciones clínicas y los signos observados en
Antes de que este microorganismo pueda provocar una preparación en fresco. Entre los síntomas y signos
efectos patológicos, generalmente es preciso que se clásicos de la candidiasis vulvovaginal se encuentran
produzcan cambios en el medio vaginal. Probablemente el prurito vaginal, un flujo vaginal blanquecino, inodoro
la defensa más importante contra la colonización y la y grumoso (similar al requesón), sensación de escozor
inflamación es la flora bacteriana natural. Todavía no en la vulva, disuria y eritema de los labios vulvares y
se ha dilucidado cuál es el mecanismo por el que la la vulva. No obstante, los síntomas y signos suelen ser
cándida induce la inflamación, pero existen algunos más equívocos. La detección de las células de levadura
factores importantes que predisponen a la colonización en gemación mediante examen microscópico de la
y la inflamación: preparación en fresco o con hidróxido de potasio (KOH)
• cambios de la concentración de las hormonas puede realizarse en el laboratorio o en el consultorio,
sexuales asociados al periodo premenstrual, el y tiene un gran valor predictivo en el diagnóstico de
embarazo y los anticonceptivos orales; la candidiasis vulvovaginal. Aunque esta combinación
se usa generalmente, en las mujeres que presentan
• uso de antibióticos; los signos clásicos a menudo es razonable administrar
tratamiento basándose en el diagnóstico clínico de
• diabetes sacarina;
sospecha sin necesidad de confirmación adicional
• inmunodepresión. mediante microscopia. En algunos centros se prefiere el
examen del frotis con tinción de Gram y la detección de
La candidiasis suele ser de origen endógeno y no una las células de levadura en gemación y de las seudohifas
enfermedad de transmisión sexual. La candidiasis para el diagnóstico de la candidiasis.
vulvovaginal crónica o recidivante afecta a un escaso
número de mujeres, causa síntomas persistentes y En el caso de mujeres con flujo vaginal anormal, y si no
puede asociarse a los factores de riesgo ya descritos se dispone de microscopio, la detección de un pH <4,5
(4, 5). Los productos químicos, la alergia y la es un buen indicador de la candidiasis vulvovaginal y
hipersensibilidad retardada locales también pueden puede ayudar a diferenciarla de la vaginosis bacteriana y
influir en la inducción de la vaginitis y la vulvitis de la tricomoniasis, que suelen dar lugar a un pH >4,5.
sintomáticas. Se puede usar una tira de papel indicadora de pH de
intervalo reducido (Whatman), que es un método barato,
En los hombres, no se sabe a ciencia cierta qué
sensible y sencillo, disponible en la mayoría de las
importancia tiene el género Candida, aunque puede
situaciones.
transmitirse entre parejas sexuales y causar balanitis
Candidiasis 95
El cultivo es el método más sensible del que
actualmente se dispone para detectar Candida spp.,
pero debe usarse con cuidado, ya que la cándida
también se encuentra en las mujeres sin candidiasis
vulvovaginal. Por consiguiente, el cultivo debe
considerarse solo cuando clínicamente se sospeche
una candidiasis vulvovaginal pero los resultados del
examen microscópico sean negativos (aunque en este
caso el tratamiento empírico puede ser apropiado, Figura 8.1A
resulta más barato y consume menos recursos) o Preparación del exudado vaginal con hidróxido de
cuando sea preciso realizar un antibiograma. potasio (KOH) que muestra las levaduras en gemación
y las seudohifas (400×)
Se ha descrito la detección molecular de Candida
spp. mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(RCP), pero no ofrece ninguna ventaja respecto a las
pruebas actualmente disponibles, pues debido a la
gran sensibilidad de la RCP, esta detectará levaduras
del género Candida en las mujeres sin candidiasis
vulvovaginal, lo que conllevará un diagnóstico indebido y
la instauración de un tratamiento innecesario.
8.3 Recogida de muestras

Figura 8.1B
Se obtiene una muestra de exudado de la pared vaginal Preparación en fresco de levaduras sin seudohifas
lateral con un hisopo (no es importante el tipo de fibra). Fuente (A y B): Reimpreso con permiso de la Asociación
En las pacientes que tienen solo una secreción vaginal Británica para la Salud Sexual y el VIH.
leve y afectación amplia de la vulva o los labios vulvares,
es mejor recoger una muestra de la mucosa irritada.
Esta puede examinarse de inmediato al microscopio
en el consultorio, o bien puede enviarse al laboratorio.
Si deben identificarse levaduras, no es necesario usar
un medio de transporte, como el Amies, aunque es
preferible emplearlo para mantener la viabilidad y la
motilidad de las tricomonas.
En los hombres que presentan balanitis, se utiliza un Figura 8.2A

hisopo prehumedecido en solución salina para tomar la Frotis del flujo vaginal con tinción de Gram que
muestra del glande. muestra levaduras grampositivas y seudohifas (1000×)
8.4 Microscopia directa

Se coloca la muestra en un portaobjetos de vidrio y, si
fuera preciso, dependiendo de su fluidez, se mezcla con
una gota de solución salina. La preparación se cubre
con un cubreobjetos y se examina al microscopio con
un aumento de 400×, no solo para detectar células de
levadura, sino también para evaluar la presencia de
tricomonas y de células clave. Las levaduras son células
redondeadas u ovoideas, de 4 mm de diámetro, que Figura 8.2B
muestran la gemación característica (blastoconidios) Levaduras en gemación sin seudohifas
(figs. 8.1A y 8.1B). La adición de KOH al 10% a la Fuente (A y B): Reimpreso con permiso de la Asociación
preparación aumenta algo la sensibilidad de detección Británica para la Salud Sexual y el VIH.
de las levaduras, haciendo que sea mucho más fácil 8.6 Referencias
identificar los micelios (seudohifas). Las levaduras
1. Sobel JD. Vulvovaginal candidosis. The Lancet, 2007,
pueden reconocerse fácilmente en un frotis con tinción 369(9577):1961-1971.
de Gram, ya que son células grampositivas (figs. 8.2A y
8.2B). 2. Sobel JD. Vulvovaginitis due to Candida glabrata. An
emerging problem. Mycoses, 1998, 41(Suppl 2):18-22.
8.5 Cultivo 3. Horowitz BJ, Giaquinta D, Ito S. Evolving pathogens in

vulvovaginal candidiasis: implications for patient care.
El agar dextrosa Sabouraud con cloranfenicol es un Journal of Clinical Pharmacology, 1992, 32(3):248-255.
medio de crecimiento excelente para el aislamiento de
4. Morton RS, Rashid S. Candidal vaginitis: natural history,
Candida spp. Después de sembrar la muestra clínica, las predisposing factors and prevention. Proceedings of the
placas se incuban a 36 °C durante 2 días. Las colonias Royal Society of Medicine, 1997, 70(Suppl 4):3-6.
de células de levadura son opacas y de color blanco
5. Sobel JD. Pathogenesis and treatment of recurrent
a crema. La única identificación importante en lo que vulvovaginal candidiasis. Clinical Infectious Diseases,
al diagnóstico ordinario se refiere es la diferenciación 1992, 14(Suppl 1):S148-S153.
de las bacterias. Se puede usar la microscopia para
6. Marrazzo J, Hillier S, Sobel J. Vaginal infections. In:
confirmar la presencia de la levadura. Morse SA et al., eds. Atlas of sexually transmitted
diseases and AIDS, 4th ed. Edinburgh, Saunders/
Para el diagnóstico corriente de la candidiasis Elsevier, 2010:76-93.
vulvovaginal sin complicaciones no es necesaria la
identificación posterior de las levaduras. Sin embargo,
la prueba de germinación es una prueba sencilla para la
identificación preliminar de C. albicans. Se emulsiona
una colonia en 0,5 ml de suero bovino o equino y se
incuba a 36 °C durante 4 horas. C. albicans mostrará
hifas laterales cortas sin ninguna constricción. Puede
hacerse una identificación completa de las levaduras
en el nivel de la especie por medio de métodos
auxanográficos para la asimilación de carbohidratos
y nitratos, o mediante pruebas de fermentación de
carbohidratos. Se comercializan estuches para la
identificación de levaduras en el nivel de la especie.
• El diagnóstico de la candidiasis se establece

basándose tanto en las características clínicas
como en los signos observados en el análisis
microscópico de una muestra apropiada.
• Cuando los resultados del examen
microscópico son negativos y el paciente
presenta síntomas clínicos, se planteará la
posibilidad de hacer un cultivo del exudado
genital.
• En ocasiones está justificado hacer el
antibiograma de Candida spp., que debe
realizarse en centros especializados.
Candidiasis 97
Capítulo 9
Infecciones por el virus del herpes simple
9.1 Introducción
El virus del herpes simple de tipo 1 (VHS-1) y de tipo Después de la recuperación de la infección inicial, el
2 (VHS-2) son virus grandes conformados por DNA virus permanece latente en el ganglio sensorial durante
bicatenario. Ambas formas comparten una estructura la vida del huésped. Periódicamente, se puede reactivar
similar del genoma, con una homología de 40% en y migrar de nuevo por los nervios sensoriales hasta
la secuencia y de 83% en las regiones que codifican la superficie cutánea o mucosa. Puede ocurrir una
proteínas, lo cual explica las numerosas semejanzas excreción intermitente de virus, ya sea cuando aparecen
biológicas y la reactividad antigénica cruzada entre lesiones (reactivación clínica) o con síntomas muy leves
ambos serotipos. o inexistentes (reactivación asintomática). La excreción
de virus a partir de las superficies mucosas da origen a
Durante la primoinfección, el virus del herpes entra a
su transmisión a los compañeros sexuales.
través de las soluciones de continuidad de la piel o la
mucosa, se adhiere y penetra en las células epiteliales, Los episodios sintomáticos recurrentes tienden a ser más
y se multiplica. Luego es captado por las terminaciones leves que el episodio primario y suelen curarse en 10
libres de los nervios sensoriales y migra hacia el días, pero también pueden ser graves, sobre todo en las
ganglio sensorial que corresponde a esa zona de la piel. personas inmunodeprimidas. En el cuadro 9.1 se resumen
Las manifestaciones cutáneas consisten en lesiones los principales síntomas, las manifestaciones clínicas y las
vesiculares que evolucionan hacia ulceraciones planas complicaciones de las infecciones genitales por el virus
que forman costra y curan de manera espontánea en 2 a del herpes. Cerca de 70% a 90% de las personas con
3 semanas sin dejar cicatriz. Las lesiones provocan una infección genital sintomática por el VHS-2 y entre 20%
destrucción focal de la capa epitelial y una infiltración y 50% de las personas con infección genital por VHS-1
por células inflamatorias en el borde circundante y en la presentarán una recidiva en el primer año. Las personas
capa dérmica subyacente. Sin embargo, solo 10% a 30% inmunocompetentes con herpes genital pueden presentar
de las nuevas infecciones son sintomáticas (fig. 9.1). lesiones genitales frecuentes, dolorosas y recurrentes que
coinciden con períodos de gran estrés psicosocial.
Duración de la excreción del virus
Vesícula Úlcera húmeda Cicatrización

pústula úlcera y costra
Síntomas Síntomas
generalizados locales
Síntomas
-6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Días
Contacto Aparición de Consulta Aparición de Comienzo de Desaparición Curación

sexual lesiones médica una nueva cicatrización de los de las
lesión, de las síntomas, a lesiones
frecuente lesiones menos que
Figura 9.1 se irriten las
lesiones
Curso clínico del herpes genital primario
Infecciones por el virus del herpes simple 99

El modelo clásico de las infecciones por el VHS-1 y el adultos, pero en los países desarrollados solo llegan a
VHS-2 que se asocian con enfermedades bucodentales 50% o 70% y, en estos últimos, se ha notificado un gran
o genitales, respectivamente, sigue siendo la regla en incremento de las infecciones genitales por VHS-1 en el
ciertas regiones del mundo como en África subsahariana, último decenio.
donde la infección por el VHS-1 es una enfermedad
frecuente de la niñez y la infección por VHS-2 es de En la actualidad, las infecciones genitales por el VHS-1
transmisión sexual. Por el contrario, la diferenciación representan al menos la mitad de todos los episodios
del VHS-1 y el VHS-2 basada exclusivamente en la primarios de herpes genital en los adultos jóvenes de
localización anatómica de la infección no es de ninguna las sociedades occidentales. Además, la seropositividad
manera absoluta en los países desarrollados, ya que el frente al VHS-2 comienza a partir del inicio de la vida
VHS-1 con frecuencia puede ser causa de herpes genital. sexual y aumenta en forma sostenida con la edad. La
El retraso en la adquisición de la infección bucal por el seroprevalencia frente al VHS-2 varía según la región
VHS-1 durante la niñez en los países desarrollados hace del mundo y oscila entre cerca de 10% a 40% en
que una proporción notable de adultos jóvenes sean los adultos y puede alcanzar de 60% a 95% en las
susceptibles a la infección genital por el VHS-1 cuando personas infectadas por el VIH y las profesionales del
inician su actividad sexual y los contactos sexuales sexo. La infección por el VHS-2 comparte factores de
bucogenitales, que se consideran más seguros que el riesgo con las demás infecciones de transmisión sexual,
coito con penetración y además un medio de evitar el a saber, un alto número de compañeros sexuales,
embarazo. Las tasas de seropositividad al VHS-1 en las antecedentes de infecciones de transmisión sexual y el
sociedades en desarrollo suelen alcanzar 100% en los inicio temprano de la vida sexual activa. El período de
Cuadro 9.1: Síntomas, signos clínicos y complicaciones durante las infecciones genitales sintomáticas por el
virus del herpes
Síntomas Signos clínicos Complicaciones

Hombres • Lesiones papulares o vesiculares en los • Lesiones papulares, • Meningitis aséptica
genitales, las zonas perigenitales o en vesiculares y • Erupción vesicular
localizaciones extragenitales (muslo, ojo, pustulosas seguidas de extensa
nalga, dedo) ulceraciones en el pene, • Retención urinaria
• Lesiones pustulosas el perineo o el muslo • Radiculopatía
• Ulceración genital • Exudado uretral sensitiva por
• Dolor perineal • Uretritis afectación de los
• Disuria nervios sacros
• Malestar o dolor inguinal (periadenitis) • Mielitis transversa
• Infección faríngea (contacto bucogenital) • Mayor riesgo de
contraer el VIH por
Mujeres • Lesiones papulares o vesiculares en los • Lesiones papulares,
exposición sexual
genitales, las zonas perigenitales o en vesiculares y
• Mayor riesgo
localizaciones extragenitales (muslo, ojo, pustulosas seguidas de
de transmisión
nalga, dedo) ulceraciones en la vulva,
sexual del VIH
• Lesiones pustulosas el perineo o el muslo
en las personas
• Ulceración genital • Flujo vaginal o exudado
coinfectadas por el
• Flujo vaginal o exudado cervicouterino cervicouterino
VIH y el VHS
• Dolor perineal • Cervicitis
• Herpes neonatal
• Disuria • Hiperemia de las
después de parto
• Malestar o dolor inguinal (periadenitis) mucosas vulvar y
vaginal
• Dispareunia vaginal
• Infección faríngea (contacto bucogenital) • Exudado uretral
• La primoinfección suele ser de mayor • Uretritis
intensidad y duración y más prolongada en
las mujeres que en los hombres
VIH: virus de la inmunodeficiencia humana.
incubación de las infecciones por el virus del herpes infección por el VHS durante los dos últimos decenios.
de ambos tipos suele ser de 2 días a 10 días (hasta 4 Sin embargo, la detección de DNA viral en las muestras
semanas). En los hombres y las mujeres con herpes clínicas mediante amplificación molecular surge hoy
genital primario, las lesiones comienzan como pápulas como una nueva opción diagnóstica, pues su sensibilidad
o vesículas y evolucionan hacia lesiones pustulosas que es hasta cuatro veces superior, es menos vulnerable a
se ulceran. Estas lesiones ulcerosas persisten entre 4 las condiciones de toma de muestras y transporte, y es
días y 15 días, hasta que se forma una costra y al final más rápida que el cultivo. La elección de la prueba y la
se reepitelizan. forma de interpretar los resultados son consideraciones
importantes para los microbiólogos y sus colegas
La consecuencia más grave de la infección genital
médicos.
herpética es la posibilidad de transmisión vertical de
la madre infectada al recién nacido durante el parto
9.3 Toma y transporte de las muestras
vaginal. Esta situación puede dar lugar a una infección
El VHS-1 y el VHS-2 se pueden recuperar en un frotis de
generalizada, con afectación del sistema nervioso
las lesiones genitales mucocutáneas y, en los pacientes
central y posible muerte neonatal. Además, durante los
con infección asintomática, de las localizaciones de
dos últimos decenios, la infección por el VHS-2 también
lesiones mucocutáneas anteriores. Las muestras
se ha vinculado con un riesgo tres veces mayor de
destinadas al cultivo o a las pruebas de biología
contracción de la infección por el VIH. La destrucción de
molecular se obtienen mediante un hisopo pequeño con
la mucosa que causan las úlceras genitales favorece la
punta de algodón o dacrón, montado en un mango de
adquisición del VIH al proporcionar un punto permeable
alambre. Los hisopos de alginato de calcio disminuyen
de entrada. Asimismo, la reactivación de la infección
la recuperación de virus e inhiben los métodos de
por VHS-2 da lugar a una infiltración de la mucosa
detección por amplificación de ácidos nucleicos. Dado
por linfocitos activados que expresan CD4, que son
que la excreción genital del virus es intermitente, no
las células selectivas de la adhesión del VIH-1. Estos
se recomienda la prueba del hisopo en el diagnóstico
mismos factores facilitan la transmisión de la infección
corriente de los pacientes asintomáticos pues es poco
por el VIH de una persona coinfectada por el VIH y el
probable que este método aporte la confirmación de la
VHS a un compañero sexual sin infección.
situación de portador.
9.2 Aspectos generales de los En el caso de lesiones recientes, el método preferido
procedimientos diagnósticos es la obtención del fluido vesicular o del exudado de
La infección genital herpética a menudo se diagnostica las vesículas pequeñas. El líquido de las vesículas
con base en criterios clínicos, por la presencia de un grandes que contiene una alta concentración de
conglomerado de lesiones vesiculares. Sin embargo, virus se puede aspirar con una jeringa de tuberculina.
puesto que otras causas de ulceración genital pueden Después de la aspiración, se elimina la superficie de la
presentar un cuadro clínico semejante, sobre todo vesícula y se frota vigorosamente la base de la lesión
cuando solo se observan ulceraciones, es necesario a fin de recuperar las células epiteliales infectadas. En
confirmar el diagnóstico por medios de laboratorio. las lesiones más antiguas, el rendimiento diagnóstico
Los métodos de laboratorio usados en el diagnóstico puede ser inadmisiblemente bajo. Sin embargo, se
de la infección por el VHS comprenden la detección debe recomendar a las personas con estas lesiones
directa del virus en el material de las lesiones y los que regresen cuando aparezcan lesiones frescas con
métodos serológicos indirectos (cuadros 9.2 y 9.3). Las el objeto de tomar la muestra. En ocasiones se pueden
pruebas diagnósticas del VHS existentes consisten en la tomar muestras con un hisopo de otras localizaciones
detección de antígenos, el cultivo del virus y las pruebas anatómicas, por ejemplo, la uretra, la vagina o el cuello
de amplificación de ácidos nucleicos (PAAN) que ponen uterino.
en evidencia el ácido desoxirribonucleico (DNA) del virus,
Es preciso prestar especial atención a las condiciones
además de las pruebas serológicas de tamizaje de la
de transporte y almacenamiento de las muestras
exposición al VHS que detectan anticuerpos específicos
clínicas. Después de tomarla, la muestra destinada
de cada serotipo. El cultivo seguido del tipado del virus
a la detección del virus debe colocarse de inmediato
ha constituido la piedra angular del diagnóstico de la
en viales que contengan 1 ml de medio de transporte

Cuadro 9.2: Recomendaciones sobre la toma de las muestras de diagnóstico de las infecciones genitales por
el VHS, adaptadas de Domeika y colegas (1)
Punto de obtención de la Instrumentos para tomar las

muestra muestras Método de obtención de la muestra
Lesiones cutáneas o • Agujas estériles • Abrir las vesículas con una aguja estéril
mucosas en el hombre • Hisopo estéril con punta de • Obtener el contenido de las vesículas con un
(incluida la región perianal) algodón, dacrón o conglomerado hisopo estéril y:
de nailon en un mango de madera, –– extender sobre un portaobjetos (para
plástico o aluminio tinción por inmunofluorescencia) o
• Portaobjetos para microscopio
–– incluir en un medio de transporte para
cultivo del virus o PAAN.
Uretra masculina • Hisopo estéril con punta de • Limpiar la parte externa del meato uretral con
algodón hidrófilo, dacrón o un hisopo humedecido en solución salina
conglomerado de nailon en un • Retraer el prepucio a fin de evitar la
mango de madera, plástico o contaminación de la muestra
aluminio • Insertar con cuidado un hisopo estéril en el
meato uretral externo (a una profundidad
de 0,5 a 2 cm) y obtener el exudado uretral
destinado al examen
Lesiones cutáneas o • Gasa e hisopos de algodón • De igual manera que en las muestras de
mucosas en la mujer • Portaobjetos para microscopio lesiones cutáneas o mucosas en el hombre
(incluida la región perianal)
Uretra femenina • Hisopo estéril de gasa (a fin de • Limpiar el introito con un hisopo estéril de
retirar el exceso de exudados) gasa
• Hisopo estéril con punta de • Introducir con cuidado el hisopo estéril con
algodón hidrófilo, dacrón o un mango de aluminio en la uretra (a una
conglomerado de nailon en un profundidad de 0,5 cm) a fin de obtener el
mango de aluminio exudado destinado al examen
Cuello uterino • Espéculo vaginal • Introducir el espéculo vaginal, que se puede
• Hisopo estéril de gasa humedecer previamente con agua caliente
• Hisopo estéril con punta de y limpiar a fondo el orificio del cuello con un
algodón hidrófilo, dacrón o hisopo estéril de gasa
conglomerado de nailon en un • Introducir con cuidado un hisopo de algodón
mango de madera o plástico hidrófilo o dacrón en el cuello uterino (a una
profundidad de 2 cm) y obtener el material de
las lesiones
PAAN: Pruebas de amplificación de ácidos nucleicos.

Nota: Se obtiene material del recto cuando el paciente ha tenido contactos sexuales anales, cuando existe inflamación anorrectal o cuando se
observa engrosamiento de la piel perianal o de los pliegues del ano.
Cuadro 9.3: Métodos directos de laboratorio en el diagnóstico del VHS
Método Principio Muestra Sensibilidad Especificidad Ventajas Desventajas

Examen Frotis de • Lesiones Baja Baja • De bajo costo • Lesiones frescas
citológico Tzanck, cutáneas o • Sensibilidad y
frotis de mucosas especificidad
Papanicolaou • Biopsias insuficientes
o tinción de • Frotis de la
Romanovsky conjuntiva o
la córnea
Detección • Frotis, corte Intermedia Alta (>95%) • De bajo costo • Vesículas
de las células histológico (úlcera genital: • Rápido (posible frescas
infectadas • Frotis de la 70% a 90%; en menos de 4 • Sensibilidad
por inmuno- base de la asintomático: horas) insuficiente
fluorescencia vesícula <40% a 50%) • El tipado es • Lento
directa posible • Mano de obra
intensa
• Falta de
normalización
Detección Tinción de • Hisopo Intermedia Alta (90%) • El costo de los • Vesículas
de la inmuno- • Frotis de las (80%) reactivos frescas
antígenos peroxidasa lesiones • Rápida (posible •
virales • Frotis del en menos de 4 • Sensibilidad
exudado de horas) insuficiente
la base de • No exige la
la vesícula integridad de la
o el fluido muestra
vesicular • El tipado es
posible
ELISA de • Hisopo Alta (úlcera Alta (62% a • Vesículas
captación • Líquido genital: >95%) 100%) frescas
vesicular o • No permite el
exudado de tipado del virus
la base de la
vesícula
Dispositivo • Hisopo Desconocida Desconocida • Prueba diagnóstica • Aun no se ha

de prueba • Líquido inmediata en el evaluado
inmediata vesicular o punto de atención
exudado de
la base de la
vesícula

Cuadro 9.3: Métodos directos de laboratorio en el diagnóstico del VHS (continuación)

Cultivo del Aislamiento del • Hisopo • De baja Alta (~100%) • Pone en evidencia • Menos sensible
virus VHS de células • Lesiones a alta en el virus que la RCP
susceptibles cutáneas función del • Ha sido • Las
• Líquido contexto clásicamente condiciones de
vesicular o clínico el “método de almacenamiento
exudado de • Contenido referencia” y transporte
la base de la vesicular: • Actualmente influyen sobre
vesícula >90% es la “prueba la sensibilidad
• Muestra de • Úlcera: 95% preferida” (2) (transporte
mucosa sin • Hisopo: 70% • Sencillez de rápido,
lesiones a 80% la toma de la refrigerado,
• Biopsias • Mucosa sin muestra protegido de la
• Frotis de la lesión: 30% • Tipado posible del luz en medio de
conjuntiva o virus transporte para
la córnea • Prueba del virus)
• Recién fenotipo de • Mano de obra
nacidos resistenciaa intensa
• Costoso
• Laboratorios
especializados
• Resultados en
• 2 días a 7 días
• Exige
concertación
con el
laboratorio
Cuadro 9.3: Métodos directos de laboratorio en el diagnóstico del VHS (continuación)

Biología Detección del • Hisopo La más alta Alta (~100%) • Sensibilidad alta • Solo en
molecular DNA del VHS y • Lesiones (98%) Es importante • Actualmente la • laboratorios
cuantificación cutáneas limitar las prueba “preferi- especializados
mediante • Líquido posibles da” (2) • No se ha
PAAN, incluidas vesicular o contaminacio- • Permite la detec- normalizado
la RCP clásica nes cruzadas
exudado de ción y el tipado • No se ha
y la RCP en
la base de la del virus en la validado con
tiempo real
vesícula misma prueba todos los tipos
internas del
• Muestras de • Rápida de muestras
laboratorio y
mucosas sin • Se puede • Riesgo de
pruebas RCP
comerciales lesiones automatizar contaminación
• Humor • Mano de obra (RCP)
acuoso o eficiente • Puede ser
vítreo • Resultado en 24 relativamente
• Líquido horas a 48 horas costoso (RCP en
cefalorra- y posiblemente tiempo real)
quídeo en menos de 3 • No se cuenta
• Sangre horas. con el
• Genotipado de la genotipado
resistencia corriente de la
• Método preferido resistencia
con el LCR
• RCP en tiempo
real:
–– Amplificación
rápida
–– Análisis cuan-
titativo
–– Riesgo redu-
cido de con-
taminación
– Método
preferido en
las lesiones
cutáneas
ELISA: enzimoinmunoanálisis de adsorción; LCR: líquido cefalorraquídeo; PAAN: Pruebas de amplificación de ácidos nucleicos; RCP: reacción en
cadena de la polimerasa.
a
La detección de las mutaciones que codifican la resistencia a los medicamentos contra el herpes (aciclovir) por genotipado de la
farmacorresistencia del VHS podría remplazar en un futuro próximo a las pruebas fenotípicas.

de virus apto para el cultivo de células, un medio de cuando se transportan allí los hisopos. Cuando las
transporte universal (para cultivo o PAAN) o enviarse muestras se transportan es preciso concentrar las
en un hisopo seco (solo las destinadas a las PAAN). células antes de realizar los frotis. Los antígenos del
El cultivo se recomienda en las situaciones donde VHS-1 y el VHS-2 se detectan mediante anticuerpos
es posible enviar las muestras clínicas al laboratorio monoclonales específicos de cada tipo, marcados con
en menos de 4 horas. De no ser posible, se pueden fluoresceína (fig. 9.2). Las principales limitaciones
conservar las muestras a 4 ºC y enviarlas al día de la inmunofluorescencia directa son el tiempo
siguiente. El tiempo de transporte, entre la toma de prolongado de realización, el costo relativamente alto
la muestra y la recepción en el laboratorio, no debe debido a los reactivos y equipamiento (un microscopio
ser superior a 48 horas y, en estas situaciones, es de fluorescencia), y una sensibilidad inferior a la
esencial enviar las muestras al laboratorio sobre hielo sensibilidad de los métodos moleculares modernos. La
en una nevera portátil. Es importante señalar que la inmunofluorescencia directa ofrece una sensibilidad de
recuperación de virus disminuye considerablemente 70% a 90% al compararla con el cultivo en los casos de
con un ciclo de congelación y descongelación, y no enfermedad sintomática; la sensibilidad es mucho más
se recomienda la congelación a -20 °C durante el baja en los casos asintomáticos, lo cual excluye su uso
transporte. En los cuadros 9.2 a 9.4 se señalan los tipos en ausencia de lesiones.
de muestras, las zonas de obtención y los métodos de La tinción indirecta con inmunoperoxidasa ofrece la
toma de muestras que se recomiendan en el diagnóstico ventaja de utilizar un microscopio de luz normal, con
de la infección genital por herpes. En el cuadro 9.3 lo cual es más apropiada en los laboratorios de nivel
se indican recomendaciones sobre el transporte y intermedio. Las muestras se preparan de igual manera
el almacenamiento de las muestras destinadas a la que las destinadas a la inmunofluorescencia directa,
microscopia, el cultivo y las PAAN. y se incuban con anticuerpos policlonales de conejo
o de ratón específicos del VHS o con anticuerpos
9.4 Diagnóstico directo del VHS a partir de monoclonales específicos del VHS-1 o el VHS-2.
las muestras clínicas La fijación se pone en evidencia con un anticuerpo
marcado con peroxidasa de rábano, dirigido contra
9.4.1 Examen citológico
las inmunoglobulinas de ratón o de conejo, mediante
Se ha observado que el examen directo de las muestras los métodos corrientes de la inmunoperoxidasa. Los
y el examen citológico mediante los procedimientos métodos de inmunofluorescencia directa y de la
de tinción convencionales (frotis de Tzanck o las peroxidasa ofrecen una sensibilidad equivalente.
tinciones de Papanicolaou y Romanovsky) ofrecen
baja sensibilidad y especificidad, por lo que no deben Las proteínas herpéticas también se pueden detectar en
constituir el fundamento del diagnóstico de la infección las muestras clínicas mediante una prueba clásica de
por el virus del herpes. Sin embargo, el diagnóstico de ELISA de captación, que emplea un anticuerpo policlonal
cervicitis herpética puede ser un hallazgo incidental o monoclonal específico del VHS. En comparación
durante el examen de los frotis de Papanicolaou
corrientes que se realizan con la citología del cuello
uterino.
9.4.2 Detección de los antígenos virales

Cuando existen lesiones mucocutáneas se puede
detectar el antígeno viral en el material de las lesiones
mediante la inmunofluorescencia directa, la tinción
de la inmunoperoxidasa o el enzimoinmunoanálisis de
adsorción (ELISA).
La inmunofluorescencia directa se puede clasificar
como una prueba rápida de diagnóstico, que permite Figura 9.2
diferenciar los serotipos del virus del herpes genital en Inmunofluorescencia intracelular del virus del herpes
los frotis preparados en el consultorio o en el laboratorio en una muestra clínica (400x)
con el cultivo del virus, la sensibilidad de las pruebas ml de medio de mantenimiento de células herpéticas y
comerciales de ELISA de captación es igual o superior se incuban los tubos de cultivo a 36 °C en una atmósfera
a 95% con especificidades que fluctúan entre 62% y que contenga 5% CO2 durante un período de 7 días. Los
100% en los pacientes sintomáticos. La sensibilidad de tubos se deben examinar diariamente en un microscopio
ELISA de captación de antígenos puede ser mayor que estereoscópico, a fin de verificar la aparición del efecto
la sensibilidad del cultivo del virus en las presentaciones citopático característico del VHS, el cual suele ocurrir
características, pero es inferior en los frotis de cuello entre 24 y 72 horas después de la siembra.
uterino y de uretra. Con todo, la mayoría de las pruebas
El efecto citopático causado por el VHS se caracteriza
comerciales no permiten diferenciar entre el VHS-1 y el
por la transformación de las células alargadas y
VHS-2.
dispersas (fig. 9.3 izquierda) en células agrandadas,
Existen pruebas inmediatas en el punto de atención que refringentes, redondeadas, “en balón”, cuyo número
detectan los antígenos del VHS, pero su rendimiento no aumenta y adquieren una apariencia granular (fig.
se ha evaluado en forma amplia. 9.3 derecha). Se puede observar necrosis focal de las
células y sincicios, y células gigantes multinucleadas en
9.4.3 Aislamiento y tipado del virus en el el borde de los conglomerados de células infectadas por
cultivo de células el virus.
Las células que se utilizan con mayor frecuencia en
Se recomienda confirmar la presencia del VHS en los
el aislamiento del VHS a partir de muestras clínicas
cultivos de células que exhiben un efecto citopático,
son los fibroblastos diploides primarios humanos y las
ya que otros virus pueden causar un efecto semejante
líneas celulares como las células MRC-5 (fibroblastos
al que se observa en los cultivos herpéticos. Esta
humanos), las células Vero (riñón de monos), las células
confirmación puede ser directa en los cultivos celulares
Hep-2 (carcinoma escamocelular laríngeo), las células
infectados, mediante anticuerpos monoclonales
de riñón de cría de hámster y las células renales de
específicos, marcados con isotiocianato de fluoresceína
conejo.
o inmunoperoxidasa, en un frotis de material de cultivo
Se permite la proliferación de las células en cultivo hasta o en el sobrenadante del cultivo mediante PAAN. La
que forman una monocapa confluente en un tubo de estrategia más práctica es la detección y el tipado
cultivo hístico con un lado aplanado. Se retira el medio por inmunofluorescencia directa. Se retira el medio
de cultivo de crecimiento y se siembran dos tubos de de cultivo de la monocapa infectada y se agrega 1
cultivo con alícuotas de 0,25 ml de muestras mezcladas ml del suero fetal de ternera al 5% en solución salina
en agitadora vorticial. Los tubos se colocan en posición tamponada con fosfato. Luego se despegan las
horizontal en una incubadora durante una hora a 36 °C, células en monocapa del cubreobjetos del lado llano,
con el fin de mejorar absorción de las partículas virales se homogeneizan, se centrifugan a 500 g durante
por las células. Después de la absorción, se agregan 2 5 minutos y se deposita una gota del sedimento
Figura 9.3
Aislamiento del virus del herpes en el cultivo de celular (50x). A la izquierda, una monocapa confluente de
fibroblastos diploides humanos MRC-5 sin infección; a la derecha, el efecto citopático característico del VHS
en las células MRC-5, obtenido después de 24 a 48 horas de cultivo del virus.

una vez mezclado en agitadora vorticial sobre cada Las ventajas del cultivo del VHS consisten en su alta
uno de los dos pocillos de un portaobjetos en vidrio especificidad y la recuperación de cepas virales que
recubierto con politetrafluoroetileno, se seca al aire se pueden tipar y someter a la prueba fenotípica de
y se fija con acetona en frío (2 °C a 8 °C) durante 10 sensibilidad a los medicamentos antivirales. El cultivo
minutos. Luego, se tiñe un pocillo con un anticuerpo es costoso, exige una gran intensidad de mano de obra,
monoclonal marcado con fluoresceína, específico del es lento y su sensibilidad diagnóstica es menor que la
VHS-1 y el otro pocillo con un anticuerpo específico del sensibilidad de la PAAN. El retraso en la preparación y la
VHS-2. Se incuba el portaobjetos durante 30 minutos a falta de cadena de frío después de la toma de la muestra
temperatura ambiente en una cámara húmeda y luego disminuyen de manera considerable el rendimiento
se lava tres veces durante 5 minutos con la solución diagnóstico.
salina tamponada con fosfato, usando un agitador
mecánico. Luego se colocan los cubreobjetos sobre 9.5 Detección y cuantificación del virus
portaobjetos con una solución de glicerol y solución mediante técnicas moleculares
salina (50%:50%) y se examinan en un microscopio de Se han propuesto diversos procedimientos moleculares
fluorescencia con un objetivo 400x. Cuando solo una con el objeto de detectar o cuantificar el genoma del VHS
de las manchas muestra partículas fluorescentes de en las muestras clínicas, entre ellos las reacciones en
color verde manzana, se confirma la detección del VHS cadena de la polimerasa (RCP) competitivas, internas
del tipo específico. Los aislados del VHS cultivados se de cada laboratorio (3), la detección por RCP seguida
pueden almacenar en sacarosa 0,2 M y solución salina de inmunoensayo enzimático e hibridación con DNA
tamponada con fosfato 0,02 M de pH 7,2 (medio 2SP) a (4), la RCP en tiempo real (5–8) y varios estuches
–80 °C o en nitrógeno líquido. comercializados. Las PAAN en tiempo real permiten la
El aislamiento del virus en frascos redondos para detección y también la cuantificación del DNA del VHS en
cultivo celular es lento y exige intensa mano de obra, las muestras clínicas. En comparación con las pruebas
pero ofrece la ventaja de demostrar la infección activa convencionales de amplificación de ácidos nucleicos,
en una lesión clínica, y facilita además el tipadodel la RCP en tiempo real hace posible la reacción de
virus y la realización de las pruebas fenotípicas de amplificación del DNA del virus en un solo tubo, es más
sensibilidad a los medicamentos antivirales. Un cultivo rápida, facilita las condiciones de realización y disminuye
más rápido del VHS se puede lograr en frascos ampolla el riesgo de contaminación cruzada. Los cebadores de
con un cubreobjetos circular al fondo (shell vial) o en las secuencias de DNA del VHS que son comunes al
placas multipocillos y centrifugando la muestra sobre VHS-1 y el VHS-2 (gen de la polimerasa del DNA [gen
monocapas de células en cubreobjetos, de una manera pol F ], de la quinasa de timidina o del dominio B de la
análoga a los cultivos de clamidia. glucoproteína del virus del herpes) pueden detectar el
DNA del VHS (6–8). Los cebadores y las sondas de
El diagnóstico de la infección por el VHS en el cultivo
secuencias de DNA, específicas del VHS-1 o el VHS-2,
tisular ofrece una baja sensibilidad, pues el virus se
como los genes gG, gD, o gI, permiten la amplificación
aísla de las lesiones en aproximadamente 80% de
de uno de los serotipos del virus herpético. En cada
las primoinfecciones pero solo en 25% a 50% de las
extracción de DNA y su análisis posterior es necesario
lesiones recurrentes y en una proporción aun menor en
contar con un testigo negativo y también con un testigo
las personas cuyas lesiones están en vía de curación.
interno positivo que ponga en evidencia la presencia
Por lo tanto, el líquido obtenido de las ampollas intactas de inhibidores de la amplificación en las muestras y
(lesiones vesiculares o pustulosas) ofrecerá un resultado verifique la calidad de preparación de las mismas. En
positivo en cultivo en más de 90% de los casos. Cuando condiciones ideales, se deberían usar grupos certificados
las lesiones han formado costra, solo cerca de 25% de y registrados de muestras de referencia que comporten
los cultivos serán positivos. La imposibilidad de detectar testigos codificados y controlen la calidad de cada
el VHS en cultivo no significa que no exista una infección laboratorio y de los diferentes laboratorios (véase el
herpética. capítulo 2).
El aislamiento del VHS en cultivo celular ha constituido Las PAAN representan el método más sensible
la piedra angular del diagnóstico de la infección, pero actualmente al alcance de detección del VHS a partir de
solo es factible en los laboratorios especializados. muestras genitales. Se ha demostrado que las pruebas
por RCP ofrecen tasas de detección de 11% a 71% progreso evidente con respecto al diagnóstico clínico del
superiores al cultivo del virus. Además, la PAAN permite herpes genital, el cual ofrece una sensibilidad de 39% en
detectar la excreción asintomática de VHS. Sin embargo, el mejor de los casos y establece un diagnóstico positivo
un resultado negativo de la RCP no indica la ausencia falso en cerca de 20% de los pacientes.
de infección, pues la excreción del virus es intermitente.
Los inmunoensayos enzimáticos comerciales mejoran
La utilización de PAAN en el diagnóstico del VHS exige
continuamente y se han propuesto algunos algoritmos
condiciones de transporte de las muestras menos
encaminados a resolver los casos cuyas pruebas no
estrictas que las necesarias en el diagnóstico por cultivo.
son conclusivas. Al decidir cuándo utilizar una prueba,
La RCP en tiempo real ofrece además otras ventajas como
los médicos deben tener presente que las personas sin
son la rapidez de detección, la cuantificación y el tipado
diagnóstico son quienes ocasionan la mayoría de las
del DNA del virus sin riesgo de contaminación, gracias a la
nuevas transmisiones y que los estudios en muchos
realización de los procedimientos en un solo tubo.
entornos muestran que la mayoría de los pacientes
Aunque la Administración de Alimentos y Medicamentos acogen favorablemente la oportunidad de conocer su
todavía no ha autorizado ninguna PAAN para uso en situación serológica.
los Estados Unidos, en las guías de tratamiento de Los anticuerpos de tipo IgG suelen ser negativos en
las enfermedades de transmisión sexual del 2010, el herpes genital primario, pues solo se detectan de
de los Centros para el Control y la Prevención de 2 semanas a 3 meses después de la aparición de los
Enfermedades se sostiene que se puede realizar la RCP síntomas y persisten indefinidamente. Por lo tanto,
con el fin de diagnosticar el herpes, en los laboratorios inmediatamente después de la infección existe un
clínicos que han elaborado sus propias pruebas y han “intervalo” durante el cual la búsqueda de anticuerpos
realizado un estudio de verificación de las enmiendas dará un resultado negativo. En consecuencia, las
para el mejoramiento del laboratorio clínico y que el primoinfecciones por VHS se pueden documentar con
cultivo de células y la RCP son las pruebas preferidas cualquier método serológico que ponga en evidencia
de diagnóstico del VHS en las personas que buscan la seroconversión en sueros apareados. Dado que la
tratamiento médico por úlceras genitales u otras prueba con IgM también puede ser positiva durante la
lesiones mucocutáneas (2). Es importante una validación reactivación de la enfermedad, este método no permite
estricta de las RCP internas y de las PAAN comerciales diferenciar entre una primoinfección y una infección
en cada entorno. recurrente y, por consiguiente, su uso con fines
diagnósticos es limitado en la práctica corriente.
9.6 Diagnóstico serológico indirecto de las
Cuando existen lesiones genitales, la prueba serológica
infecciones herpéticas
específica de serotipo y la prueba directa del virus
La prueba serológica se recomienda como una ayuda
pueden ayudar a establecer si el episodio corresponde
al diagnóstico del herpes genital en los pacientes con a una adquisición reciente de la infección por el VHS
síntomas recurrentes, lesiones atípicas o lesiones en o a una reactivación (cuadro 9.4). La aparición de
curso de cicatrización que presentan cultivos negativos anticuerpos específicos del tipo de VHS puede tardar
para el VHS. Cuando no existen lesiones o las pruebas de entre 2 semanas y 3 meses. Por lo tanto, en una persona
detección del virus son negativas, la prueba serológica con infección herpética recién contraída, la ausencia
puede ser útil en el manejo de los compañeros sexuales inicial de anticuerpos contra la glucoproteína G2 (gG2)
de las personas con herpes genital y en la detección y la aparición de estos anticuerpos después de 12
de la infección por VHS en las personas en riesgo de semanas confirma la primoinfección por el VHS-2. La
contraer la infección, como los pacientes infectados por distinción entre la infección herpética recién adquirida y
el VIH o con otras infecciones de transmisión sexual y la reactivación es útil en los estudios epidemiológicos, y
en las personas con múltiples compañeros sexuales. El en ocasiones es de ayuda clínica para el manejo de los
método de tamizaje serológico del VHS-1 y el VHS-2 no aspectos psicosociales.
está indicado en la población general.
Dado que casi todas las infecciones por el VHS-2 se
Aunque la exactitud de las pruebas serológicas del VHS contraen sexualmente, la presencia de anticuerpos
no iguala la exactitud de las pruebas de anticuerpos específicos dirigidos contra este tipo de virus del
dirigidos contra el VIH, estas pruebas representan un herpes corresponde a una infección genitoanal, y se

debe ofrecer educación y orientación apropiadas a las serológicas exactas y específicas del tipo de virus
personas que la padecen. La presencia exclusiva de del herpes se basan en la detección de anticuerpos
anticuerpos contra el VHS-1 es más difícil de interpretar. específicos contra la gG1 (del VHS-1) y gG2 (del VHS-2)
La mayoría de las personas con anticuerpos contra y utilizan como antígenos gG1 o gG2 nativos, purificados
el VHS-1 han contraído una infección bucal durante o recombinados.
la niñez, que quizá sea asintomática. Sin embargo,
Las pruebas ELISA basadas en la gG específica del
la adquisición de la infección genital por el VHS-1
serotipo de VHS se empezaron a comercializar en 1999,
está aumentando y esta forma también puede ser
pero aun se encuentran en el mercado pruebas más
asintomática. La falta de síntomas en una persona
antiguas que no establecían esta diferencia (aunque
seropositiva al VHS-1 no permite diferenciar entre
se afirme lo contrario). Las pruebas diagnósticas
la infección genitoanal y la infección bucolabial. Las
inmediatas también pueden aportar resultados con los
personas que presentan una infección por el VHS-1,
anticuerpos del VHS-2 a partir de sangre capilar o suero,
independientemente de la localización de la infección,
durante una cita en el consultorio. La sensibilidad en la
siguen siendo susceptibles a contraer el VHS-2.
detección de anticuerpos del VHS-2 de las pruebas de
Las pruebas serológicas basadas en la glucoproteína gG específicas de serotipo varían entre 80% y 98% y los
G (gG) específica de serotipo viral pueden distinguir resultados negativos falsos quizá sean más frecuentes
la infección por VHS-1 de la infección por el VHS-2 y en fases iniciales de la infección. Las especificidades
siempre se debe solicitar específicamente cuando se de estas pruebas son iguales o superiores a 96%.
practica el examen serológico. Las pruebas serológicas Las pruebas cuyo uso está aprobado en los Estados
específicas del tipo de VHS pueden resultar útiles en las Unidos tienen una sensibilidad entre 97% y 100%, y
siguientes situaciones: síntomas genitales recurrentes una especificidad entre 94% y 98% respectivamente,
o síntomas atípicos con cultivo negativo para el virus al compararlas con la transferencia de Western. Pueden
del herpes; diagnóstico clínico de herpes genital sin ocurrir resultados positivos falsos, sobre todo en los
confirmación de laboratorio; en los compañeros sexuales pacientes con un bajo riesgo de infección por el virus
de los pacientes con herpes genital confirmado, con del herpes. La repetición de la prueba o una evaluación
el fin de verificar la concordancia o discordancia confirmatoria podría estar indicada en algunos entornos,
serológica antes de proveer la orientación. Además, en especial cuando se sospecha una adquisición reciente
la prueba serológica del VHS se debe incluir en la del herpes genital.
evaluación integral de las infecciones de transmisión
Las infecciones sexualmente transmisibles concurrentes
sexual en las personas con múltiples compañeros
pueden aumentar los resultados positivos falsos
sexuales o infectadas por el VIH, y en los hombres que
por ELISA del VHS-2 (11 ). Además, al comparar las
tienen relaciones sexuales con otros hombres, quienes
pruebas de ELISA con las transferencias de Western en
presentan un mayor riesgo de contraer el VIH.
África subsahariana se puso en evidencia una menor
Los genomas del VHS-1 y el VHS-2 codifican cada especificidad a la observada previamente, sobre todo
uno como mínimo 80 polipéptidos estructurales y no en las personas infectadas por el VIH (12 ). De manera
estructurales diferentes, entre ellos al menos diez más general, se ha comunicado una especificidad
proteínas glucosiladas, denominadas de la glucoproteína deficiente de ciertas pruebas herpéticas basadas en
A hasta la glucoproteína I (gA–gI). La mayoría de las gG específicas de serotipo en muestras de África
los anticuerpos contra la infección por el VHS se subsahariana (12 –14 ). La causa de este bajo rendimiento
dirigen contra estas glucoproteínas de superficie. no se conoce bien, pero puede ser consecuencia
Las glucoproteínas gB, gC, gD y gE desencadenan de problemas del laboratorio o dificultades técnicas
respuestas inmunitarias intensas. Ambos tipos de VHS o de la reactividad cruzada con infecciones aun no
comparten algunos epítopos que están presentes en diagnosticadas, que son más frecuentes en África
estas glucoproteínas y, por consiguiente, presentan un subsahariana (13, 15 –16 ).
grado considerable de reactividad cruzada cuando se
También se han elaborado pruebas serológicas
utilizan ciertas pruebas comerciales. Sin embargo, no
inmediatas en el punto de atención que detectan
se ha detectado ninguna reactividad cruzada entre la
anticuerpos específicos del VHS-2. Estos ensayos
gG1 del VHS-1 y la gG2 del VHS-2 (10 ). Las pruebas
inmunocromatográficos utilizan muestras de sangre
capilar por punción digital (o suero) y de manera Los anticuerpos IgG e IgM específicos del VHS se
característica aplican un flujo lateral de suero a través detectan mediante diversos métodos inmunológicos
de una membrana que contiene un punto de antígeno (18 –19 ). En los laboratorios especializados de referencia
gG1 o gG2. Cuando al pasar el suero por el dispositivo se han desarrollado varias pruebas de transferencia de
ocurre un cambio de coloración (punto rosado), esto Western no comerciales, pero no están al alcance con
significa que existen anticuerpos del VHS. Pese a fines de aplicación diagnóstica en la mayoría de los
una variabilidad entre operadores de 5% a 10% en entornos (20 ). En el cuadro 9.4 se resume el diagnóstico
la interpretación, estas pruebas inmediatas ofrecen serológico de las infecciones por el VHS y las pruebas de
un buen rendimiento diagnóstico con sensibilidades anticuerpos específicos del serotipo.
iguales o superiores a 91% y especificidades iguales La prueba serológica del VHS no se recomienda de
o superiores a 94% (17 ). De igual manera que los manera sistemática en los pacientes asintomáticos, pero
sistemas basados en ELISA, el desempeño de las está indicada en los siguientes grupos:
pruebas inmediatas en el punto de atención depende
en parte de la prevalencia del VHS en la población. La • Antecedentes de enfermedad genital recurrente o
principal ventaja de estas pruebas inmediatas es que atípica cuando los métodos de detección directa del
proporcionan rápidamente un resultado (incluso mientras virus han sido negativos. La presencia de anticuerpos
el paciente está todavía en el centro de atención), lo dirigidos contra el VHS-2 respaldan el diagnóstico de
cual favorece la educación y la orientación oportunas de herpes genital; los anticuerpos dirigidos contra el
los pacientes. El principal inconveniente de las pruebas VHS-1 no diferencian entre la infección genital y la
inmediatas es su alto costo, en comparación con los infección bucofaríngea. Se ofrece orientación a los
sistemas basados en ELISA. pacientes con resultados negativos de la IgG del
Cuadro 9.4: Estrategia de diagnóstico virológico y serológico del VHS-2 en presencia o ausencia de lesiones
genitales, adaptada de Gupta y colegas (9)
Detección del
VHS-2 por el IgG específica IgG específica
método directo del VHS-1 del VHS-2 Interpretación
Primera Positiva Positiva o Negativa • Infección aguda por VHS-2
evaluación de negativa • Repetir la serología específica del VHS-2 en
las lesiones 15 días a 30 días
genitales
Positiva Positiva Positiva • Infección recurrente VHS-2 contraída, como
o negativa mínimo, 6 semanas antes
Ninguna lesión NA Negativa Negativa • Pacientes en riesgo de contraer infecciones
bucolabiales o genitales por el VHS-1 y el
VHS-2
NA Positiva Negativa • Pacientes en riesgo de contraer infecciones
bucolabiales o genitales por el VHS-2
• Infecciones antiguas por el VHS de tipo 1 y
NA Positiva Positiva
de tipo 2
Lesiones Positiva Positiva o Positiva • Infección recurrente por el VHS-2
genitales negativa
recurrentes
Negativa Negativa Positiva • Posible infección recurrente por el VHS-2
• Se deben considerar otras causas posibles
de enfermedad genital ulcerosa
NA: no se aplica.

VHS-2; en los pacientes con resultados positivos de sistemática de la prueba en las embarazadas
la IgG del VHS-1 se debe tener en cuenta que este seropositivas al VIH.
tipo de herpes es una causa relativamente
infrecuente de enfermedad genital recurrente. • Las personas portadoras del VHS-2 que incurren en
comportamientos sexuales de alto riesgo deben
• Primer episodio de herpes genital, cuya orientación y recibir orientación sobre el mayor riesgo que
tratamiento dependen de la diferenciación entre las presentan de contraer la infección por el VIH.
primoinfecciones y las infecciones establecidas. En el
momento de la aparición de los síntomas, la ausencia 9.7 Vigilancia terapéutica: Pruebas de
la IgG contra el VHS del tipo detectado en la lesión farmacorresistencia
genital es indicativo de una infección primaria. La La profilaxis a largo plazo y el tratamiento con
seroconversión se debe demostrar durante el medicamentos antiherpéticos como el aciclovir
seguimiento. o el valaciclovir pueden dar lugar a la aparición
de resistencia, sobre todo en los pacientes
• Compañeros sexuales de pacientes con herpes
inmunodeprimidos (21). La prevalencia relativa de
genital, cuando existen inquietudes acerca de la
cepas del VHS resistentes a aciclovir difiere entre las
transmisión. Las parejas serodiscordantes se pueden
personas inmunocompetentes e inmunodeprimidas
aconsejar sobre las estrategias que disminuyen el
debido a la replicación prolongada del virus y al deterioro
riesgo de contraer la infección y padecer la
de la respuesta del huésped, que puede favorecer la
enfermedad.
supervivencia de las cepas del VHS resistentes menos
adaptadas. La persistencia de las lesiones durante más
Serología del VHS y embarazo: de una semana después del comienzo del tratamiento
sin una disminución apreciable del tamaño, una
• No se recomienda la práctica sistemática de la presentación atípica de las lesiones o la aparición de
prueba a las embarazadas asintomáticas, pero está nuevas lesiones satélites a pesar de la administración
indicada cuando existen antecedentes de herpes de medicamentos antivirales son indicativas de fracaso
genital en la pareja. terapéutico. Es preciso contar con un diagnóstico de
laboratorio de la resistencia a aciclovir a fin de guiar a
• Se debe orientar a las mujeres seronegativas frente al
los médicos hacia opciones diferentes de tratamiento
VHS-1 o el VHS-2 sobre las estrategias de prevención
en los casos de fracaso. La resistencia a aciclovir se
de una nueva infección por cualquiera de los
puede diagnosticar al poner en contacto el virus con los
serotipos virales durante el embarazo.
productos antivirales (pruebas fenotípicas) o mediante
la detección de mutaciones génicas específicas de
Serología del VHS en el contexto de la infección por el la quinasa de timidina (UL23) y la DNA-polimerasa
VIH: (UL30), que confieren resistencia a los medicamentos
antivirales (pruebas genotípicas). La utilidad de los
• No se recomienda la práctica sistemática de la métodos genotípicos en la práctica clínica depende de la
prueba a los pacientes infectados por el VIH. Aunque posibilidad de diferenciar entre las variaciones aleatorias
la seropositividad al VHS-2 aumenta el riesgo de (polimorfismos) y las mutaciones verdaderas que
transmisión del VIH y las recurrencias frecuentes de confieren farmacorresistencia.
la infección por el VHS-2 aumentan la replicación del
VIH, existen pocos datos fidedignos que documenten 9.8 Referencias
el manejo de la coinfección por el VHS-2 en pacientes
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infectados por el VIH sin síntomas de herpes genital. of genital herpes in eastern European countries.
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transmisión del VIH perinatal en las mujeres 2. Centers for Diseases Control, Sexually transmitted
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infectadas por el VIH y seropositivas frente al VHS-2.
Mortality Weekly Report, 2010, 59(RR–12) (http://
Dado que los resultados de los estudios no son www.cdc.gov/std/treatment/2010/STD-Treatment-
homogéneos, no se recomienda la práctica 2010-RR5912.pdf, consultado el 4 de abril del 2013).
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Capítulo 10
Sífilis
10.1 Introducción
La sífilis es una enfermedad crónica de transmisión general, ya que la bacteria causal entra en el torrente
sexual caracterizada por manifestaciones floridas y sanguíneo poco después de la infección.
largos periodos de latencia. Está causada por Treponema
En la figura 10.1 se muestra el curso de la sífilis sin
pallidum subsp. pallidum, un microorganismo fino y de
tratar. La primera manifestación de la enfermedad en los
forma espiral que se relaciona estrechamente con los
adultos es una macula pequeña, que se convierte en una
microorganismos que causan las treponematosis no
pápula que a su vez se ulcera. La úlcera característica
venéreas: T. pallidum subsp. pertenue (pian o frambesia),
(chancro primario) suele ser una lesión única, indolora,
T. pallidum subsp. endemicum (sífilis endémica) y T.
que tiene una base limpia y es relativamente avascular.
carateum (mal de pinto). Estos cuatro microorganismos
La lesión se encuentra frecuentemente en el surco
patógenos son morfológica y antigénicamente idénticos,
coronal, en el glande o en el cuerpo del pene en los
y solo pueden distinguirse por su modo de transmisión,
hombres, y en la vulva, las paredes vaginales o el cuello
sus características epidemiológicas, sus manifestaciones
uterino en las mujeres. Las lesiones extragenitales son
clínicas y, más recientemente, gracias a la secuenciación
raras, pero pueden producirse chancros bucales como
genética (1).
resultado de la felación, y frecuentemente se observan
La sífilis venérea suele transmitirse como resultado lesiones perianales y rectales en hombres que tienen
del contacto sexual con una lesión infecciosa de relaciones sexuales con otros hombres o en mujeres que
las mucosas o de la piel abrasionada, o bien por vía han practicado el coito anal (en ambos casos, adoptando
trasplacentaria, de la madre al feto. La multiplicación un papel pasivo). Con frecuencia las lesiones primarias
bacteriana tiene lugar preferentemente en el punto de son indoloras, por lo que pueden pasar desapercibidas.
inoculación, dando lugar a una úlcera genital primaria Si no se instaura tratamiento, la úlcera desaparecerá
tras un periodo de incubación de 9 a 90 días. Sin espontáneamente en 3 a 8 semanas sin dejar cicatriz.
embargo, la sífilis debe considerarse una enfermedad Los chancros genitales primarios generalmente se
6 semanas
De muchos
a 6 meses
años a toda
la vida
Infección
Primaria Secundaria Sífilis latente (sin signos de

Terciaria
(chancro) (exantema) enfermedad)
(Sífilis
Sífilis tardía benigna gomosa
Periodo de incubación meningovascular)
Sífilis cardiovascular
9-90 días Neurosífilis tardía
De muchos
1 año años a toda
Sífilis precoz la vida
Sífilis tardía
Figura 10.1
Representación esquemática del curso de la sífilis sin tratar
Sífilis 115
asocian a una linfadenopatía inguinal bilateral, que suele las lesiones destructivas de la sífilis terciaria y pueden
ser discreta y no es dolorosa a la palpación. afectar a cualquier órgano, aunque se encuentran con
mayor frecuencia en la piel, el cartílago y el hueso
En los pacientes que no han recibido tratamiento, el (sífilis tardía benigna), en las paredes de la aorta
inicio de la sífilis secundaria puede producirse entre (sífilis cardiovascular), en los vasos cerebrales (sífilis
6 semanas y 6 meses después de la infección inicial. El meningovascular) o en el cerebro y la médula espinal
chancro primario todavía puede estar presente cuando (neurosífilis).
aparecen lesiones secundarias clínicamente evidentes. En general, estas manifestaciones tardías se
La característica principal de la sífilis secundaria es diagnostican considerando los datos clínicos así como
un exantema cutáneo distribuido uniformemente, los resultados de las radiografías de tórax o de otras
no irritante, que puede ser macular, papular o pruebas de diagnóstico por imágenes (en el caso de la
papuloescamoso; a menudo se encuentra en las palmas sífilis cardiovascular), de la exploración radiográfica de
de las manos y las plantas de los pies. El exantema los huesos afectados para detectar gomas óseos, y de
puede ir acompañado de linfadenopatías generalizadas las pruebas serológicas, incluido el análisis del líquido
y fiebre, cefalea y malestar general. En zonas cálidas y cefalorraquídeo para diagnosticar la neurosífilis. En
húmedas, como la vulva o la región perianal, el exantema textos autorizados puede encontrarse una descripción
puede agrandarse y formar lesiones sobreelevadas, más exhaustiva de las diversas manifestaciones clínicas
similares a verrugas, denominadas condilomas planos; de la enfermedad (2).
en superficies mucosas se forman lesiones serpiginosas
superficiales de color blanco grisáceo. 10.2 Métodos de detección directos para el
diagnóstico de la sífilis
Si no se diagnostica la sífilis secundaria y, por tanto,
T. pallidum no puede cultivarse en medios artificiales,
no se la trata, todas las manifestaciones visibles de la
por lo que los métodos de elección para el diagnóstico de
enfermedad desaparecen espontáneamente y el paciente
la sífilis precoz son métodos de detección directa, como
pasa a un periodo de latencia que puede durar muchos
la microscopia de campo oscuro, la inmunofluorescencia
años. La sífilis latente se divide en dos etapas: la sífilis
(IF) directa y pruebas para detectar secuencias de DNA
latente precoz y la sífilis latente tardía; la línea divisoria
específicas de T. pallidum en muestras obtenidas de
entre ambas se fija en el año posterior a la fecha en
lesiones cutáneas o de tejidos. Durante mucho tiempo
que se contrajo la enfermedad (fig. 10.1). No obstante,
se ha considerado que la prueba de la infectividad
hay que tener en cuenta que a menudo es imposible
en el conejo era la prueba de referencia para la
determinar la duración exacta de la infección sin tratar
detección directa de T. pallidum en muestras clínicas
y que tales casos deben clasificarse en principio como
(3). Este método tiene una sensibilidad de casi un solo
sífilis latente tardía. Durante los periodos de latencia
microorganismo cuando se usan pases repetidos en
de la enfermedad, no hay ninguna lesión cutánea o
conejos; sin embargo, rara vez se realiza, salvo en los
mucosa de la que se puedan obtener muestras, por lo
laboratorios de investigación, ya que es lento (hacen
que el diagnóstico debe basarse en los resultados de
falta de 1 a 2 meses para concluirlo) y exige tener
las pruebas serológicas y en la ausencia de signos y
acceso a una instalación apropiada para animales.
síntomas de sífilis terciaria.
En general se considera que la sífilis terciaria es la 10.2.1 Microscopia de campo oscuro

etapa destructiva de la enfermedad. Normalmente La microscopia de campo oscuro es el único método en
sus signos y síntomas suelen aparecer muchos años el punto de atención que permite hacer el diagnóstico
después de la infección inicial, aunque el curso puede directo de la sífilis en casos de sífilis primaria o
ser mucho más rápido en pacientes coinfectados secundaria del adulto o de sífilis congénita precoz; por
por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). esta razón, se recomienda usarla en consultorios de
Las diversas manifestaciones de la sífilis terciaria se infecciones de transmisión sexual y en laboratorios
han clasificado como sífilis tardía benigna gomosa, hospitalarios cercanos al centro clínico. Esta prueba
sífilis cardiovascular y neurosífilis, aunque estas debe limitarse a laboratorios especializados, dado que
características clínicas pueden coexistir. Los gomas son se requiere un microscopio especializado equipado
con un condensador de campo oscuro, además del coloca la muestra que debe examinarse en la platina y se
cumplimiento de estrictas condiciones técnicas para eleva el condensador hasta que haya un buen contacto
obtener resultados fiables. entre el aceite y la parte inferior de la preparación. Es
importante evitar que queden burbujas de aire atrapadas
En la microscopia de campo oscuro, solo los rayos en el aceite. La muestra se examinará primero usando
luminosos que inciden en los microorganismos o las un objetivo de baja potencia (10×).
partículas en ángulo oblicuo entran en el objetivo del
microscopio, dando lugar a cuerpos luminiscentes Después de enfocar el objetivo, hay que centrar la luz en
blancos brillantes sobre fondo negro. La microscopia el medio del campo ajustando los tornillos de centrado
de campo oscuro debe ser realizada por personal situados en el condensador; el condensador se enfoca
adecuadamente capacitado y con experiencia que subiéndolo y bajándolo hasta que se obtiene el diámetro
pueda ajustar el microscopio correctamente y distinguir de luz más pequeño posible. Posteriormente, se centra
T. pallidum de treponemas no patógenos y de otros de nuevo la luz si fuera necesario. Usando el objetivo de
microorganismos espiralados que suelen encontrarse observación en seco de 40×, se enfoca la muestra y se
en la mucosa genital y la anal. La cavidad bucal a examina minuciosamente la preparación. El examen por
menudo es colonizada por espiroquetas diferentes de microscopia de campo oscuro se realiza mejor en una
los treponemas, por lo que no se recomienda examinar habitación oscura.
mediante microscopia de campo oscuro las lesiones T. pallidum aparece como cuerpos espirales, brillantes
bucales. y blancos, iluminados contra un fondo negro. El
Tanto las lesiones sifilíticas primarias como las microorganismo se identifica por su morfología, tamaño
secundarias pueden examinarse mediante microscopia y movimiento característicos. Es un microorganismo
de campo oscuro. La muestra ideal es un exudado fino (0,10-0,18 µm de ancho), 6-20 µm de largo, con
8-14 espiras regulares y próximas (fig. 10.2). Presenta
seroso de las lesiones activas, que carezca de hematíes.
movimientos rápidos y bastante abruptos, con una
Las lesiones activas deben limpiarse cuidadosamente
rotación relativamente lenta en torno a su eje longitudinal.
con una torunda de gasa estéril y solución salina estéril.
Esta rotación se acompaña de una flexión o un giro
Luego se frota suavemente la lesión con una torunda de
sincopado en el centro del microorganismo. Puede
gasa seca estéril para producir un exudado seroso. En
observarse cómo se alarga y acorta (como un muelle).
caso de hemorragia, las gotas de sangre se limpian y el
En ocasiones se producen distorsiones en espirales
líquido seroso que aparece se coloca en un portaobjetos
tortuosas. Pueden observarse otras espiroquetas,
de vidrio usando una espátula fina de acero inoxidable
normalmente saprofitas. Sin embargo, a menudo las
o de platino o un asa de siembra bacteriológica, o bien
espirales son más laxas o más gruesas, con diferentes
presionando el portaobjetos directamente en el líquido.
El material puede mezclarse con una gota de solución
salina para elaborar una suspensión homogénea sobre
la que pueda colocarse el cubreobjetos. La preparación
debe examinarse de inmediato, pues la motilidad
característica de estos microorganismos es un factor
importante para identificarlos y cualquier retraso en
el examen la reduce rápidamente; la probabilidad de
visualizar los treponemas también disminuye si la lesión
está seca o está cicatrizando.
Es fundamental la alineación óptica correcta del

microscopio de campo oscuro para que el examen sea
satisfactorio. Primero se colocan unas cuantas gotas Figura 10.2
de aceite de inmersión sobre el condensador de un Treponema pallidum, microscopia de campo oscuro
microscopio previamente alineado. Después se baja Fuente: Por cortesía de David Cox, Centros para el
ligeramente el condensador de modo que el aceite esté Control y la Prevención de Enfermedades (Atlanta,
por debajo del nivel de la platina. A continuación se Georgia, EUA).
Sífilis 117
movimientos, incluido un movimiento de retorcimiento con con el microscopio de fluorescencia. T. pallidum
flexión y relajación marcadas de las espirales. aparece en la muestra como un microorganismo de
color verde manzana, con su característica morfología
Evidenciar la presencia de treponemas con la morfología
sobre un fondo negro (fig. 10.3). La especificidad y
y la motilidad que caracterizan a T. pallidum constituye
la sensibilidad de la inmunofluorescencia directa son
un diagnóstico positivo de sífilis primaria y secundaria (4).
superiores a las de la microscopia de campo oscuro,
Los pacientes con un chancro primario que es positivo en
sobre todo si el anticuerpo monoclonal se usa para
el examen en el microscopio de campo oscuro pueden
hacer el conjugado de fluoresceína, dado que la técnica
presentar resultados negativos en las pruebas serológicas,
de inmunofluorescencia directa elimina la confusión
pero normalmente cabe esperar la seroconversión en unos
con otros microorganismos espiralados, y un número
cuantos días. Sin embargo, el hecho de que no se logre
reducido de treponemas teñidos por la fluoresceína se
observar el microorganismo en el microscopio de campo
detectan más fácilmente en el frotis teñido que en la
oscuro no descarta el diagnóstico de sífilis. Los resultados
preparación sin teñir (5).
negativos pueden significar:
Lamentablemente, el conjugado de fluoresceína
• que el número de microorganismos presentes en
específico no se comercializa en muchos países.
la muestra es insuficiente (un solo examen con el
microscopio de campo oscuro tiene una sensibilidad
inferior a 50%); NOTA: El conjugado de fluoresceína puede titularse
• que el paciente ya ha sido tratado o que se ha convenientemente aplicando diluciones al doble
aplicado en la lesión un preparado antibacteriano; del conjugado en portaobjetos comercializados
que pueden adquirirse para realizar la prueba
• que la resolución natural de la lesión está próxima;
de absorción de anticuerpos antitreponémicos
• que la lesión no es sifilítica. fluorescentes (FTA-Abs), incubando, lavando y
Cualquiera sea el resultado del examen con el examinando la muestra como en el procedimiento
microscopio de campo oscuro, siempre debe extraerse de inmunofluorescencia directa antes descrito.
sangre para hacer pruebas serológicas. La dilución que debe usarse para la prueba de
inmunofluorescencia directa es la mayor dilución del
conjugado que muestre una fluorescencia evidente
NOTA: Se puede realizar la técnica de campo oscuro y específica en ausencia de tinción de fondo.
y optimizar la óptica del microscopio examinando
muestras obtenidas en el margen gingival en
el interior de la boca. Las células epiteliales
gingivales y las bacterias bucales, incluidos los
microorganismos espirales, se ven como cuerpos
blancos y brillantes sobre un fondo negro.
10.2.2 Prueba de inmunofluorescencia directa

(DFA)
El método que se usa para recoger material de la lesión
para la prueba de inmunofluorescencia directa (DFA) es
idéntico al que se emplea para la microscopia de campo
oscuro. Las muestras se extienden en una superficie de
1 cm2 de un portaobjetos, se deja que se sequen al aire, Figura 10.3
y se fijan con acetona o metanol, después de lo cual Prueba de inmunofluorescencia directa positiva de
pueden envasarse para transportarlas al laboratorio. T. pallidum
Después de añadir una globulina contra T. pallidum Fuente: Por cortesía de David Cox, Centros para el
marcada con fluoresceína comercializada y de hacer la Control y la Prevención de Enfermedades (Atlanta,
incubación y el lavado, los portaobjetos se examinan Georgia, EUA).
10.2.3 Pruebas de amplificación de ácidos sindrómicos apropiados para el manejo de la enfermedad
nucleicos de T. pallidum ulcerosa genital.
La prueba de reacción en cadena de la polimerasa
(RCP) puede detectar equivalentes de DNA de menos 10.3 Pruebas serológicas luéticas
de 10 microorganismos en una muestra, mediante Las pruebas serológicas luéticas pueden dividirse en
amplificación de segmentos génicos específicos del dos grupos: pruebas no treponémicas o reagínicas,
DNA genómico de T. pallidum. Puede usarse para como la reacción de Wasserman, la prueba de la reagina
examinar muestras de cualquier lesión, exudado, tejido plasmática rápida (RPR), la prueba VDRL (del inglés
o humor orgánico, y la muestra puede de ser fresca, Venereal Disease Research Laboratory) y la prueba del
o se puede congelar o fijar e incluir en parafina. Dado rojo de toluidina en suero no calentado (TRUST); y
que no se dispone de pruebas de RCP comercializadas pruebas treponémicas, como la FTA-Abs, el ensayo de
para T. pallidum que hayan sido autorizadas por la hemaglutinación de T. pallidum (TPHA), la prueba de
Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de aglutinación pasiva de partículas de T. pallidum (TPPA),
los Estados Unidos, algunos laboratorios han empleado el ELISA, la quimioluminiscencia y la gran mayoría de
pruebas de RCP desarrolladas en el laboratorio. pruebas diagnósticas en el punto de atención o pruebas
rápidas que se comercializan hoy en día.
Se han desarrollado varios ensayos de RCP, que se han
utilizado con éxito para detectar secuencias diana de
10.3.1 Pruebas serológicas no treponémicas
DNA específicas de T. pallidum en lesiones primarias
Actualmente, todas las pruebas serológicas no
y secundarias (6-8). La sensibilidad analítica de estos
treponémicas para la sífilis detectan la reagina (una
ensayos es aproximadamente de 10 microorganismos.
mezcla de anticuerpos de tipo IgG e IgM presentes en
El uso de cebadores marcados con fluoresceína y
el suero de pacientes con sífilis), que puede reaccionar
de un analizador genético ABI 310 para detectar los
con un antígeno complejo (una mezcla de cardiolipina,
amplicones ha mejorado la sensibilidad analítica
lecitina y colesterol) en las pruebas. La prueba
de una RCP para polA hasta aproximadamente un
serológica no treponémica que antes empleó este
microorganismo por reacción de RCP. Estos métodos
antígeno fue la prueba de Wasserman, que se basa en
teóricamente pueden aplicarse al diagnóstico de la
el principio de la fijación del complemento. Sin embargo,
sífilis congénita y también de la neurosífilis, en las que
las pruebas que se usan con mayor frecuencia se basan
el número de microorganismos probablemente es bajo;
en reacciones de floculación que pueden incluir o no
sin embargo, no pueden recomendarse estas pruebas
partículas indicadoras. Se considera que los anticuerpos
para la detección corriente de T. pallidum en la sangre,
antilípidos de tipo IgG e IgM se forman como parte
ni siquiera en la sífilis primaria y la secundaria, dada
de la respuesta del huésped al material que se libera
la presencia de inhibidores de la RCP. No obstante, se
de las células hospederas dañadas al principio de la
utilizó una RCP semicuantitativa en tiempo real para
infección, así como a lípidos de la superficie celular
indicar que el número de espiroquetas en la sangre de
del microorganismo causal (11, 12). Las pruebas no
los pacientes varía según la etapa de la sífilis, desde 200
treponémicas, aunque son muy sensibles y pueden
hasta 105 microorganismos por mililitro de sangre (9).
cuantificarse, carecen de especificidad respecto a la
Se han desarrollado pruebas de RCP múltiple para sífilis; se calcula que en 0,2% a 0,8% de las pruebas
la detección simultánea de los microorganismos que se obtienen resultados positivos falsos, que se asocian
con mayor frecuencia causan enfermedades ulcerosas a diversas afecciones médicas no relacionadas con
genitales de transmisión sexual, esto es, T. pallidum, la sífilis (11, 12). Generalmente se ha observado que
Haemophilus ducreyi y el virus del herpes simple (10). las reacciones positivas falsas agudas (que persisten
La diana de T. pallidum en la RCP múltiple es el gen de durante menos de 6 meses) se asocian a otras
47 kDa, y se usa un enzimoinmunoanálisis de adsorción enfermedades infecciosas, como la malaria, la hepatitis,
(ELISA) para detectar amplicones específicos. Este la varicela o el sarampión, así como a la vacunación
ensayo se ha adaptado a un formato múltiple en tiempo reciente. Por el contrario, las reacciones positivas falsas
real que se ha utilizado para determinar las causas de crónicas (que persisten durante más de 6 meses) se
las úlceras genitales en diversos entornos de distintos han asociado a conectivopatías, neoplasias malignas,
países y, posteriormente, para determinar los algoritmos infecciones crónicas como la lepra, a la toxicomanía
Sífilis 119
por vía intravenosa y a la edad avanzada. Así pues, treponémicos debe disminuir significativamente (es decir,
teóricamente los resultados positivos en muestras al menos una disminución del título de 25%) y hacerse
de suero sometidas a pruebas no treponémicas finalmente negativo. Sin embargo, si se administra
deben confirmarse con una prueba treponémica más tratamiento adecuado durante las últimas fases de
específica. la enfermedad se puede producir una seropositividad
persistente aunque a un título bajo (fig. 10.4). Cabe señalar
Cabe señalar que, si bien durante mucho tiempo
que cualquier ascenso posterior del título (≥4 veces)
se consideró que el embarazo era una situación
podría indicar una recaída o una reinfección.
posiblemente asociada a resultados positivos
falsos en las pruebas no treponémicas, la tasa de
10.3.1.1 Prueba VDRL (Venereal Disease Research
resultados positivos erróneos en embarazadas no
Laboratory)
parece ser superior a la observada en mujeres que
En la prueba VDRL, no se estabiliza el antígeno y se
no están embarazadas, y es posible que se relacione
debe utilizar una suspensión fresca, elaborada el mismo
exclusivamente con el gran número de embarazadas
día en que se vaya a utilizar. La prueba se realiza en
sometidas a la detección de la sífilis, sobre todo en
suero calentado (56 °C) y los resultados se leen con
entornos con baja prevalencia (13). Generalmente, la
un microscopio con un aumento 100×. La VDRL sigue
gran mayoría de los sueros con resultados positivos
siendo la prueba de elección para detectar la reagina en
falsos tienen un título de anticuerpos ≤1:4. Para excluir
muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) obtenidas de
los resultados positivos falsos de las pruebas no
pacientes con presunta neurosífilis. A continuación se
treponémicas, todos los sueros con resultados positivos
describe detalladamente esta prueba. La prueba de la
en una prueba no treponémica deben someterse a una
reagina en suero sin calentar es una versión mejorada de
prueba treponémica para confirmar el resultado.
la VDRL que se realiza en suero sin calentar y usando un
Sin embargo, los títulos bajos no descartan la sífilis y a antígeno estabilizado.
menudo se encuentran en la sífilis latente tardía y en la
Procedimiento de la prueba VDRL (adaptado de Larsen
sífilis terciaria.
et al., 1998; 3).
La determinación de los títulos séricos no treponémicos
Reactivos y equipo necesarios
mediante un procedimiento cuantitativo puede ser útil
para hacer una interpretación más correcta de los 1. Antígeno VDRL. Solución alcohólica incolora
resultados y para evaluar a los pacientes después del que contenga cardiolipina (0,03%), colesterol
tratamiento. (0,9%) y lecitina (0,21% + 0,01%). El antígeno
debe almacenarse en la oscuridad a temperatura
Las pruebas treponémicas, cuando se usan como
ambiente (23 °C a 29 °C) o bien refrigerarse
pruebas de detección inicial, pueden arrojar resultados
a una temperatura entre 2 °C y 8 °C, pero sin
positivos unas 6 semanas después de la infección; en
congelarlo. A estas temperaturas, los componentes
consecuencia, hasta 40% de las lesiones primarias que
del antígeno se mantienen en solución. Se deben
se detectan en la microscopia de campo oscuro o son
desechar los frascos o los viales que contengan un
positivas en la RCP pueden ser inicialmente seronegativas. precipitado.
Después de la seroconversión, suben los títulos de
anticuerpos no treponémicos hasta alcanzar un valor 2. Antígeno VDRL con solución salina (NaCl al 1,0%)
máximo entre 1 y 2 años después de la infección, en el amortiguada, a pH 6,0 ± 0,1. El antígeno VDRL en
caso de que no se instaure un tratamiento eficaz. Más solución salina amortiguada puede comprarse o
tarde, en la sífilis latente tardía y la sífilis terciaria, el título elaborarse en el laboratorio.
desciende lentamente, y con frecuencia se hace negativo VDRL-buffered saline comprises:
en los casos de sífilis tardía muy prolongada. La gran
ventaja de las pruebas no treponémicas es que pueden Formaldehído, neutro (ACS) 0,5 ml
usarse para evaluar la eficacia del tratamiento. Por lo NA 2HPO4, anhidro 0,037 g
tanto, después del tratamiento satisfactorio de la sífilis KH2 PO4 0,170 g
precoz (es decir, la sífilis primaria, la sífilis secundaria NaCl 10,00 g
o la sífilis latente precoz), el título de anticuerpos no Agua destilada 1000,0 ml
Sífilis precoz Sífilis tardía
Primaria Secundaria Latente prcoz Latente tardía Terciaria
Generalmente
Negativa
Sin tratar Siempre Generalmente Generalmente positiva pero
volviéndose
ositiva positiva positiva haciéndose
positiva
negativa
Tratada Se hace Se hace Se hace Sigue siendo Resultado sin

satisfactoria- negativa negativa negativa positiva cambios
mente
Prueba de anticuerpos no treponémicos positiva Prueba de anticuerpos no treponémicos negativa
Figura 10.4
Reactividad en las pruebas serológicas no treponémicas en el curso de la sífilis sin tratar (cajas) y después del
tratamiento eficaz (círculos), por etapa de la enfermedad
Se mide el pH de la solución, que se almacena en 8. Solución salina al 10,0%. Se agregan 10 g de

frascos con tapa de rosca. cloruro de sodio seco por cada 100 ml de agua
destilada.
Nota: Cuando se produzca un cambio inexplicable de
la reactividad de los sueros de referencia (controles), Equipo
se medirá el pH de la solución salina amortiguada para
1. Agujas calibradas no desechables sin bisel
determinar si puede ser un factor causal. Se desechará
a. Para la prueba serológica: calibre 18
la solución salina amortiguada cuyo pH esté fuera del
b. Para el análisis del LCR: calibre 21 o 22
intervalo de 6,0 ± 0,1.
2. 2. Frascos de 30 ml con base plana.
3. Muestras de suero de referencia. En la prueba se
3. Dispositivo de seguridad para pipetear, con puntas
usan como referencia (controles) sueros reactivos,
desechables de 50 µl.
débilmente reactivos y no reactivos, ya sea en
forma liofilizada o líquida. Si deben realizarse 4. Pipetas de 1,0 ml, 5,0 ml y 10,0 ml.
pruebas cuantitativas, se utilizará un suero de
referencia que pueda titularse hasta al menos una 5. Portaobjetos de 5 × 7,5 cm, con 12 anillos de
dilución 1:4. parafina o cerámica de aproximadamente 14
mm de diámetro. Nota: Los anillos deben ser
4. Acetona suficientemente altos para evitar que el suero se
5. Alcohol, etanol al 95% derrame durante la rotación.
6. Parafina 6. Soporte para portaobjetos de 5 × 7,5 cm.
7. Solución salina al 0,9%. Se agregan 0,9 g de 7. Molde para hacer anillos de parafina de
cloruro de sodio seco por cada 100 ml de agua aproximadamente 14 mm de diámetro (n.º cat.
destilada. 2600, Eberbach Corp., Ann Arbor, Michigan, EUA).
Sífilis 121
8. Agitador rotativo mecánico ajustable a 180 ± 2 rpm, conllevar la ruptura de partículas y la pérdida de
que circunscriba un círculo 19 mm de diámetro en reactividad.)
el plano horizontal.
Prueba cualitativa (suero)
9. Microscopio binocular con oculares 10× y objetivo 10×.
1. La temperatura ambiente influye en las pruebas
10. Recipientes para residuos; desinfectantes. de floculación en portaobjetos para la sífilis. Para
que los resultados de la prueba sean fiables y
11. Guantes de látex desechables, gafas de seguridad y
reproducibles, la suspensión de antígeno VDRL, los
ropa protectora.
controles y las muestras que deben analizarse han
12. Los portaobjetos deben cubrirse mientras estén en de mantenerse a temperatura ambiente (23 °C a
el agitador rotativo a fin de mantener la humedad e 29 °C) cuando se lleven a cabo las pruebas.
impedir que se sequen.
2. Se añaden 50 µl de los sueros que se van a
13. Jeringas de 2 ml o 5 ml. analizar a cada anillo de parafina o cerámica del
Procedimientos de análisis de las muestras séricas portaobjetos.
Preparación de la suspensión de antígeno 3. Se mantienen la jeringa y la aguja de dispensación

de la suspensión de antígeno VDRL en posición
1. Cada día se elabora una suspensión fresca de vertical, y se dejan salir varias gotas para eliminar
antígeno VDRL. Cuando se prepara la suspensión el aire de la aguja. Luego se agrega una gota (17 µl)
de antígeno, la temperatura de la solución salina de la suspensión de antígeno que caiga libremente
amortiguada, el antígeno y el equipo debe en cada uno de los anillos que contienen suero.
mantenerse entre 23 °C y 29 °C.
4. Se coloca el portaobjetos en el agitador rotativo
2. Se vierten 0,4 ml de la solución salina amortiguada
mecánico y se hace rotar durante 4 minutos a 180
con antígeno VDRL en el fondo de un frasco
± 2 rpm bajo una cubierta para mantener una
redondo de 30 ml, de base plana y con tapón, o
atmósfera húmeda e impedir que se produzca una
bien en un matraz de 25 ml con tapa.
evaporación excesiva.
3. Se agregan 0,5 ml de la suspensión de antígeno
5. Inmediatamente después de concluir la rotación, se
VDRL directamente en la solución salina, mientras
se hace girar el frasco continua, pero suavemente, leen los resultados del portaobjetos y se registran
sobre una superficie plana. El antígeno debe añadirse los resultados de la prueba.
gota a gota, a una velocidad de aproximadamente 6
6. Todas las muestras séricas cuyos resultados sean
segundos por cada 0,5 ml de antígeno.
reactivo, débilmente reactivo o no reactivo “rugoso”
4. La última gota de antígeno se verterá sin que la en la prueba VDRL cualitativa en portaobjetos
pipeta toque la solución salina; la rotación del deben analizarse cuantitativamente; se registrará el
frasco debe mantenerse durante 10 segundos. título final.
5. Se agregan 4,1 ml de solución salina amortiguada. Lectura y notificación de los resultados
6. Se tapa el frasco y se agita aproximadamente 30 1. Se leen los portaobjetos en el microscopio con

veces en 10 segundos. Tras esto, la suspensión oculares 10× y un objetivo 10×.
de antígeno ya está lista para usarse, y puede
2. Los resultados se notifican de la siguiente manera:
utilizarse durante el día en que se ha elaborado.
Lectura Informe
7. Cada vez que se vaya a usar la suspensión de
• Flóculos medianos o grandes • Reactivo (R)
antígeno VDRL, hay que mezclarla, agitándola
suavemente en círculos. (La suspensión no debe • Flóculos pequeños • Débilmente
mezclarse extrayéndola e introduciéndola mediante reactivo (D)
una jeringa y una aguja, ya que esto puede • Sin floculación o ligeramente rugoso • No reactivo (N)
Prueba cuantitativa (suero) de floculación. A diferencia de los reactivos usados
en la RPR, los de la prueba TRUST no requieren la
1. Se realizan diluciones al doble del suero que debe
conservación en condiciones de refrigeración.
titularse. En un portaobjetos pueden hacerse
pruebas cuantitativas de tres muestras de suero
10.3.2 Pruebas serológicas treponémicas
hasta la dilución 1:8.
A diferencia de las pruebas no treponémicas, se
2. Se realiza la prueba en las diluciones al doble
considera que las pruebas treponémicas son más
del suero, exactamente igual que en la prueba específicas. Sin embargo, en raros casos se han
cualitativa. registrado resultados positivos falsos en las pruebas
3. Se leen los resultados en el microscopio usando treponémicas, que pueden ser pasajeros y de causa
oculares 10× y un objetivo 10× como en la prueba desconocida o pueden asociarse a conectivopatías
cualitativa. (11). Tiene poco valor la vigilancia de las respuestas
al tratamiento mediante pruebas treponémicas, dado
4. Se registran los títulos con la mayor dilución que dé
que después de la seroconversión suelen mantenerse
un resultado reactivo (no débilmente reactivo).
positivas de por vida, incluso tras administrar un
5. Tras concluir las pruebas del día, se desecha la tratamiento eficaz (fig. 10.6). Así pues, no tiene sentido
suspensión de antígeno, se limpian la aguja y la realizar pruebas treponémicas cuantitativas como
jeringa dispensadoras aclarándolas con agua, parte de los algoritmos diagnósticos. Algunas pruebas
alcohol y acetona, en este orden. Se quita la aguja treponémicas pueden hacerse reactivas antes que las
de la jeringa después de la limpieza. pruebas no treponémicas (la prueba de absorción de
anticuerpos antitreponémicos fluorescentes [FTA-Abs]
puede hacerse reactiva aproximadamente 3 semanas
NOTA: La prueba VDRL es la prueba preferida para después de la infección), y algunos pacientes con
analizar el LCR en el diagnóstico de la neurosífilis. infección primaria muy precoz pueden ser seronegativos
Se realiza de manera idéntica a como se lleva en las pruebas no treponémicas y seropositivos en
a cabo en el suero; sin embargo, la muestra de las treponémicas. Sin embargo, se debe tener mucha
LCR no tiene que calentarse hasta 56 °C antes de precaución al interpretar los resultados de estas
realizar la prueba.
pruebas, pues encontrar un resultado negativo en una
prueba no treponémica y un resultado positivo en una
prueba treponémica indica la mayoría de las veces que
10.3.1.2 Prueba de reagina plasmática rápida (RPR) se trata de una sífilis precoz previamente tratada, a no
Las ventajas principales de la prueba de reagina ser que haya signos obvios de una infección primaria
plasmática rápida (RPR) respecto a la prueba VDRL son actual (véanse y compárense las figuras 10.4 y 10.6).
el uso de un antígeno estabilizado, el uso de tarjetas
en lugar de portaobjetos y la adición al antígeno de Todas las pruebas treponémicas actuales usan
partículas de carbón como indicador de la floculación. El lisados celulares completos de T. pallidum o antígenos
antígeno no recubre estas partículas, sino que el carbón treponémicos recombinantes únicos (o una mezcla de
queda atrapado en la retícula que forma el complejo ellos) para detectar los anticuerpos contra componentes
antígeno-anticuerpo en las muestras reactivas, haciendo celulares treponémicos específicos. Se usan diferentes
que la reacción se haga visible a simple vista. La prueba plataformas analíticas para realizar las pruebas
puede realizarse en suero o plasma no calentado, en serológicas treponémicas, como la inmunofluorescencia
círculos de 18 mm en tarjetas plastificadas. La RPR es la indirecta, la aglutinación usando eritrocitos sensibilizados
o partículas de gelatina, los ELISA, incluidas variantes
prueba no treponémica macroscópica más disponible, y
que usan tecnología de quimioluminiscencia y pruebas
se utiliza en todo el mundo. En la figura 10.5 se muestra
inmunocromatográficas (flujo lateral) o pruebas de flujo
cómo se lleva a cabo.
directo en el punto de atención. Todos estos ensayos
Una modificación de la RPR, la prueba del rojo de son muy específicos y se diseñaron inicialmente para
toluidina en suero no calentado [TRUST], utiliza rojo de usarlos como pruebas confirmatorias. Sin embargo,
toluidina en lugar de carbón para visualizar la reacción las pruebas que pudieron automatizarse, en concreto
Sífilis 123
(A)
1. Se deben utilizar guantes, bata de 2. Antes de usar el estuche y todos los 3. Preparación del equipo. Se
laboratorio y gafas de seguridad reactivos necesarios se dejará que humedece la esponja y se coloca en
cuando se manipulen las muestras y alcancen la temperatura ambiente. la cubierta del agitador rotativo.
los reactivos.
4. Se prepara la hoja de trabajo y la 5. Se extraen 50 μl de la muestra de 6. Se vierten 50 μl (1 gota) del suero

tarjeta de la prueba marcada con el suero en la punta de la pipeta de problema y los sueros de referencia
número de identificación (ID) de la precisión o “dispenstir”. en cada círculo marcado en la
muestra. tarjeta.
7. Se extienden las muestras y los 8. Se fija la aguja gotero al frasco 9. Se coloca la tarjeta en un agitador
controles suavemente dentro del con el antígeno de la RPR. Se rotativo, y se hace rotar a 100 rpm
círculo mediante el extremo plano comprueba que el antígeno está durante 8 minutos.
del “dispenstir”. adecuadamente mezclado. Se añade
1 gota de antígeno a cada círculo.
10. Manualmente se hace rotar la 11. Se debe disponer de una buena 12. Los resultados se registran en los
tarjeta con suavidad unas cuantas iluminación para interpretar los formularios apropiados. ]
veces. resultados.
Figura 10.5
Procedimientos para realizar (A) e interpretar (B) la prueba de reagina plasmática rápida (RPR)
Fuente: Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (Atlanta, Georgia, EUA).
algunos ELISA y ensayos de quimioluminiscencia, han fluorescentes (FTA-Abs) era la prueba treponémica de
recibido en algunos países la autorización de uso como referencia, pero recientemente ha sido reemplazada por
pruebas de tamizaje inicial; las pruebas treponémicas en pruebas que son más sensibles, menos exigentes desde
el punto de atención se emplean a menudo como único el punto de vista técnico y mucho menos subjetivas. Es
indicador de la infección, en particular en entornos con preciso comprobar a fondo tanto el rendimiento de la
pocos recursos. prueba como la lectura de los resultados. Para que la
prueba sea fiable es crucial contar con un microscopio
10.3.2.1 Prueba de absorción de anticuerpos
de fluorescencia de buena calidad, experiencia en
antitreponémicos fluorescentes (FTA-Abs)
la lectura de los resultados, reactivos de calidad y
Durante mucho tiempo se ha considerado que la una dilución apropiada del conjugado (fig. 10.7).
prueba de absorción de anticuerpos antitreponémicos Lamentablemente, tanto los resultados positivos falsos
(B) Resultados cualitativos
Reactivo Mínimamente reactivo No reactivo
(Aparecen grumos o (Leve formación de grumos (Aspecto gris homogéneo)
aglutinación) o aglutinación)
Se considera que las muestras con el mismo grado Todas las muestras Todas las muestras Se notifica el resultado
de reactividad o un grado mayor de reactividad reactivas deben analizarse reactivas deben analizarse como “no reactivo”.
que el suero de referencia mínimamente reactivo mediante RPR cuantitativa mediante RPR cuantitativa
(Rm) son reactivas (R). Los 3 círculos de la parte para obtener un título. para obtener un título.
inferior derecha de la tarjeta son los controles:
reactivo (R), mínimamente reactivo (Rm) y no
reactivo (N).
Procedimiento de la RPR cuantitativa
1. Se marca una tarjeta de la prueba 3. Se añaden 50 µl de la muestra al 5. Se transfieren 50 µl de esta mezcla

con los números de identificación de primer círculo (1:1) y al segundo (círculo 2) al siguiente círculo (3) y
las muestras y se hacen diluciones (1:2). se repite la etapa de mezcla hasta
seriadas al doble. Cada muestra se que se realiza la última dilución. Se
analizará sin diluir (1:1) y diluida (1:2, 4. Usando una pipeta, se mezcla la eliminan los últimos 50 µl.
1:4, etcétera). muestra con la gota de solución
salina aspirando y expulsando la 6. Se siguen los pasos 7-12 de la página
2. Se añaden 50 µl de solución salina al mezcla 5-8 veces en la pipeta. 1 (RPR cualitativa) y se anotan los
0,9% a cada círculo, que contendrá resultados de tal manera que se
una muestra diluida o un control. registre el nivel de dilución (es decir,
NO debe añadirse solución salina la mayor dilución reactiva a 1:4 se
al primer círculo de cada muestra notificaría como R4).
(pocillo 1:1).
Resultados cuantitativos
Se notifica la mayor dilución reactiva. En este caso, En este caso, la muestra es reactiva hasta la dilución
la muestra 7 (primera fila) muestra reactividad a 1:64 y se notificaría como R64. Si la muestra sigue
la dilución 1:1 y se registra como R1. La muestra 8 siendo reactiva a la mayor dilución, se debe diluir aún
(segunda fila) se notifica como R4. Los 3 círculos más. Se prepara una nueva tarjeta de la prueba y se
situados en la fila inferior a la derecha son los extienden las diluciones hasta que la mezcla del círculo
controles: reactivo (R), mínimamente reactivo (Rm) y no no sea reactiva.
reactivo (N).
Figura 10.5 (continúa)

Procedimientos para realizar (A) e interpretar (B) la prueba de reagina plasmática rápida (RPR)
Sífilis 125
Sífilis precoz Sífilis tardía
Primaria Secundaria Latente precoz Latente tardía Terciaria
Negativa Generalmente
Sin tratar haciéndose Siempre Siempre Siempre positiva, final-
positiva positiva positiva positiva mente hacién-
(temprana) dose negativa
Se
Tratada mantiene Se mantiene Se mantiene Se mantiene Resultado sin
satisfactoria- positiva (si positiva positiva positiva cambios
mente inicialmente
era positiva)
Prueba treponémica positiva Prueba treponémica negativa
Figura 10.6
Reactividad de las pruebas serológicas treponémicas en el curso de la sífilis sin tratar (cajas) y respuesta
después del tratamiento eficaz (círculos), por etapa de la enfermedad
Reactivos
1. Los portaobjetos con antígeno de T. pallidum se

pueden adquirir en el mercado. Otra alternativa
es comprar el antígeno en suspensión o
prepararlo a partir de T. pallidum (cepa de Nichols)
extraído de tejido testicular de conejos y lavado
con solución salina tamponada con fosfato (SSTF)
para eliminar las globulinas de conejo. Los viales se
conservan, sin abrirlos, a una temperatura de 2 °C
a 8 °C.
Figura 10.7
2. Inmunoglobulina antihumana marcada con
Prueba FTA-Abs positiva. Se observan espiroquetas
isotiocianato de fluoresceína (FITC).
(T. pallidum) fluorescentes
Fuente: Adaptado de Larsen et al., 1998 (3). 3. El sorbente se elabora a partir de cultivos de
treponemas de Reiter no patógenos, generalmente
sin añadir conservantes. A menudo se dispensa
como los resultados negativos falsos en la FTA-Abs son
fraccionado en cantidades de 5 ml y liofilizado o
comunes, debido a errores de laboratorio y al carácter
como suspensión.
subjetivo de la lectura de los resultados de la prueba
(14, 15). A continuación se describe detalladamente este 4. Suero de control reactivo. Se obtiene una mezcla
método. de muestras de suero humano de donantes
seropositivos que son reactivos 4+. Se dispensa
la mezcla de sueros en alícuotas y se conserva
congelada, a ser posible a -70 °C o a una 3. Centrifugadora
temperatura inferior. El suero sumamente reactivo
4. Dispositivos de seguridad para pipetear
puede diluirse apropiadamente con sueros no
reactivos para conseguir un suero de referencia 5. Micropipetas graduables de 10 µ 200 µl
mínimamente reactivo 1+. El suero de referencia
1+ muestra el mínimo grado de fluorescencia que 6. Asa de siembra bacteriológica convencional de
se notifica como reactivo, y se usa como patrón de platino, de 2 mm de diámetro y calibre 26
lectura.
7. Papel absorbente
5. Suero de referencia inespecífico. El suero de
8. Soporte para portaobjetos con cámara húmeda y
referencia inespecífico es una mezcla de sueros
toallas de papel
obtenidos de individuos que no padecen la
sífilis. No se añade ningún conservante. Este 9. Placas de coloración, de vidrio o plástico, con
suero de referencia muestra una reactividad soportes para portaobjetos desmontables
inespecífica >2+ a una dilución 1:5 en solución
salina tamponada con fosfato, y esencialmente no 10. Portaobjetos para microscopio de 2,5 × 7,5 cm, con
muestra tinción alguna cuando se diluye en una un extremo mate, de 1 mm de grosor, con
proporción 1:5 en el sorbente. 2 círculos, con un diámetro interno de 1 cm
6. Aceite de inmersión de baja fluorescencia, no 11. Cubreobjetos, n.º 1, de 22 mm2

secante. 12. Tubos de ensayo (12 × 75 mm) y gradillas
7. Acetona. 13. Recipientes para residuos y desinfectantes
Reactivos que deben prepararse 14. Guantes de látex desechables, gafas de seguridad y
1. S olución salina tamponada con fosfato (SSTF). ropa protectora
Debe elaborarse mediante la siguiente formulación 15. Microscopio de fluorescencia con oculares 10× y
en agua destilada y almacenarse en grandes objetivos 10× y 40×
volúmenes:
NaCl 7,65 g 16. Agitador vorticial
Na2HP04 0,724 g
Si los portaobjetos de antígeno no se adquieren
KH2P04 0,21 g
en el mercado, se pueden elaborar a partir de
Agua destilada 1000 ml
suspensiones treponémicas, tal como se indica a
Se determinará el pH y se ajustará a un valor de 7,2 ± continuación.
0,1 con NaOH 1 N.
1. Los portaobjetos, que se conservan limpios en
2. Tween 80 al 2,0% en SSTF. alcohol, se secan con una gasa limpia.
Se calientan los reactivos en un baño María a 56
°C. Se añade 1 ml de Tween 80 a 49 ml de SSTF 2. Si fuera necesario, se rehidrata el antígeno según
estéril. Se ajusta el pH a 7,2 con NaOH 1 N. Se las instrucciones del fabricante. Los viales abiertos
desecha el reactivo en caso de que aparezca un se conservan a una temperatura entre 2 °C y 8 °C,
precipitado o si cambia el pH. y deben ser estables durante una semana.
3. Medio de montaje. Se agrega una parte de SSTF 3. Se mezclan completamente las suspensiones
(pH 7,2) a nueve partes de glicerina (de grado de antígeno en un agitador vorticial durante 10
analítico). segundos y se examinan las muestras mediante
microscopia de campo oscuro para comprobar que
Equipo los treponemas se dispersaron adecuadamente
(microorganismos individualizados en lugar de
1. Estufa de incubación de 35 °C-37 °C
grumos) antes de preparar los portaobjetos para la
2. Baño de agua, ajustable a 56 °C FTA-Abs.
Sífilis 127
4. Se preparan frotis muy delgados de antígeno de 6. Los portaobjetos se leen en el siguiente orden:
T. pallidum en cada círculo, usando para ello un
a. Se examinan los tres portaobjetos de
asa de alambre de 2 mm. Se coloca el antígeno
referencia (punto 5) para comprobar que los
contenido en un asa dentro de los dos círculos de
reactivos y las condiciones de análisis son
1 cm y se deja secar al aire durante al menos 15
satisfactorios.
minutos.
b. Se examinan los portaobjetos del nuevo
5. Los portaobjetos se fijan en acetona durante 10
conjugado, comenzando con la menor dilución
minutos y se dejan secar al aire. Se conservan los
del conjugado; los resultados se registran
frotis fijados en acetona a -20 °C. Los frotis no
como 1+, 2+, 3+ o 4+.
deben descongelarse y congelarse de nuevo.
c. El punto final de la titulación es la dilución más
Sorbente
alta, que da una fluorescencia máxima 4+ con
Se rehidrata el sorbente liofilizado con agua estéril el suero de referencia reactivo y un resultado
destilada o según las instrucciones del fabricante. El 1+ con la dilución 1+. El título de trabajo
sorbente rehidratado se conserva a 2 °C-8 °C o a -20 del nuevo conjugado es uno que duplique la
°C. Puede utilizarse siempre que la reactividad sea dilución por debajo del punto final, y debe
aceptable y que el producto no esté contaminado. ser el punto final del control mínimamente
reactivo.
Inmunoglobulina antihumana marcada con
fluoresceína (conjugada) d. El nuevo conjugado no debe teñirse
inespecíficamente a tres diluciones al doble
1. Se rehidrata el conjugado marcado con por debajo del título de trabajo del conjugado.
isotiocianato de fluoresceína (FITC) según las
instrucciones del fabricante. Si está turbio, e. El conjugado se conserva según indica el
se centrifuga a 500 g durante 10 minutos. Se fabricante y se dispensa en cantidades no
fracciona en alícuotas pequeñas y se conserva a inferiores a alícuotas de 0,3 ml a menos de
-20 °C. El conjugado descongelado no se debe -20 °C. Antes de la congelación, un conjugado
congelar de nuevo, sino que se conservará a y una con una dilución de trabajo de 1:1000 o
temperatura entre 2 °C y 8 °C. superior puede diluirse 1:10 con SSTF estéril
que contenga albúmina sérica bovina al 0,5%
2. Se preparan diluciones al doble seriadas del nuevo y azida de sodio al 0,1%.
conjugado en SSTF, a pH 7,2, que contenga Tween
80 al 2%, de modo que las diluciones incluyan el f. Se debe comprobar el título del conjugado
título indicado por el fabricante. después de conservarlo varios días en el
congelador.
3. Se analiza cada dilución del conjugado con el suero
de referencia reactivo 4+ diluido en una proporción Procedimiento de ensayo
1:5 en SSTF, y con la dilución de referencia 1. Se identifican los portaobjetos de antígeno
mínimamente reactiva 1+ apropiada usando el previamente preparados numerándolos en el
procedimiento de FTA-Abs que se describe a extremo esmerilado.
continuación.
2. Se numera cada tubo y cada portaobjetos de modo
4. Se incluye un suero de referencia de tinción que se correspondan con el suero problema y el
inespecífica con cada dilución del conjugado. suero de referencia que deben analizarse.
5. Se prepara un conjugado previamente analizado 3. Se preparan diluciones de suero de referencia
a su dilución de trabajo y se hacen pruebas con reactivo (4+), mínimamente reactivo (1+) e
un suero de referencia reactivo 4+, un suero de inespecífico en sorbente o en SSTF conforme a las
referencia mínimamente reactivo 1+ y un control instrucciones.
de tinción inespecífica con SSTF para que actúen
como controles cuando se haga el primer análisis 4. Se pipetean 200 µl de sorbente en un tubo de
de un lote del nuevo conjugado. ensayo para cada suero problema.
5. Se agregan 50 µl de suero problema calentado al 10.3.2.2 Pruebas de aglutinación treponémicas
tubo apropiado y se mezcla. La TPHA y la TPPA son más fáciles de realizar que la
6. Se cubren los frotis de antígeno apropiados FTA-Abs, y su sensibilidad es similar a la de esta. Estas
con 30 µl de diluciones de suero reactivo (4+), pruebas de aglutinación también son más prácticas que
mínimamente reactivo (1+) e inespecífico. la FTA-Abs para procesar por lotes un gran número de
muestras. La TPHA, y más recientemente la TPPA, se
7. Se cubren los frotis de antígeno apropiados con 30 ha convertido en la prueba treponémica confirmatoria
µl de SSTF y 30 µl del sorbente para los sueros de de elección en muchos laboratorios. En la figura 10.8 se
referencia de tinción inespecífica. muestra cómo se realiza la TPPA. El método para llevar a
8. Se cubren los frotis de antígeno apropiados con 30 cabo la TPHA es similar.
µl de las diluciones del suero problema.
10.3.2.3 Enzimoinmunoanálisis (EIA) treponémicos y
9. Se impide la evaporación colocando los ensayos de quimioluminiscencia (CIA)
portaobjetos en una cámara húmeda y se incuba
Más recientemente aún se han desarrollado
a una temperatura entre 35 °C y 37 °C durante 30
enzimoinmunoanálisis (EIA) y ensayos de
minutos.
quimioluminiscencia (CIA) para detectar anticuerpos
10. Se colocan los portaobjetos en los soportes y se contra T. pallidum. Su sensibilidad y su especificidad
enjuagan durante 5 segundos con SSTF corriente. son equivalentes a las de la FTA-Abs y los ensayos de
Luego se colocan los portaobjetos durante 5 aglutinación.
minutos en cubetas de tinción que contengan
La mayoría de los enzimoinmunoanálisis treponémicos
SSTF y se agitan los portaobjetos sumergiéndolos
emplean antígeno de T. pallidum sonicado, un solo
y retirándolos del SSTF al menos 20 veces. Se
antígeno treponémico recombinante, o una mezcla de
utiliza SSTF nuevo y se repite el procedimiento de
enjuague una vez más. Por último, se enjuagan los antígenos recombinantes que recubren los pocillos de
portaobjetos durante 5 segundos en agua destilada placas de microtitulación. Se añade una dilución del
corriente y se seca con suavidad con papel suero del paciente a cada pocillo. Si el suero contiene
absorbente. anticuerpos específicos contra T. pallidum, se unirán
a los antígenos treponémicos. Tras eliminar mediante
11. Se diluye IgG antihumana marcada con FITC hasta lavado cualquier exceso de anticuerpo, se añade un
su título de trabajo en SSTF que contenga Tween conjugado compuesto por IgG antihumana biotinilada
80 al 2%, y se colocan aproximadamente 30 µl del de cabra y marcada con estreptavidina-peroxidasa
conjugado diluido sobre cada frotis. para detectar el anticuerpo específico. Después de una
12. Se repiten los pasos 9 y 10. etapa de lavado adicional para eliminar cualquier exceso
de conjugado, se añade un sustrato de la enzima para
13. Se montan los portaobjetos inmediatamente detectar el complejo antígeno-anticuerpo-conjugado.
colocando una gota pequeña de medio de montaje Se produce una reacción de color si el paciente tiene
en cada frotis y aplicando un cubreobjetos. anticuerpos contra el antígeno o los antígenos de
T. pallidum. La intensidad de desarrollo del color
14. Se colocan los portaobjetos en una habitación
oscura y se hace la lectura en un plazo máximo de es directamente proporcional a la concentración de
4 horas. anticuerpo presente. Para leer el cambio de color se usa
un lector de placas.
15. Se examina el frotis mediante microscopia de
campo oscuro, usando primero la lámpara de En algunos enzimoinmunoanálisis se adopta una
tungsteno, para comprobar la presencia de estrategia diferente para detectar anticuerpos
treponemas en el frotis; luego se hace la lectura específicos. Se inmovilizan antígenos treponémicos
mediante el microscopio de fluorescencia, usando recombinantes de 15 kDa, 17 kDa, 44,5 kDa y 47 kDa
los filtros de FITC apropiados. específicos en pocillos de microplacas. Luego se añade
suero del paciente a los pocillos; si hay anticuerpos
antitreponémicos, se unirán específicamente a los
Sífilis 129
antígenos inmovilizados. Todas las proteínas no unidas de nitrocelulosa. Las hojas se secan posteriormente y
se eliminan luego durante una fase de lavado. Los se cortan en tiras para usarlas con muestras de suero
mismos antígenos recombinantes que se han conjugado individuales. Se diluye el suero de un paciente y se
con peroxidasa de rábano se agregan después a los incuba con cada tira. Si en la muestra hay anticuerpos
pocillos de la placa. Tras un paso de lavado adicional de tipo IgG o IgM específicos de T. pallidum, se unirán a
para eliminar todo el conjugado no unido, se añade un uno o más de los antígenos de 15 kDa, 17 kDa, 44,5 kDa
sustrato cromógeno para la peroxidasa. El cambio de y 47 kDa que se encuentran en la tira. Los anticuerpos
color resultante se mide espectrofotométricamente que no estén unidos se eliminan mediante lavado.
después de añadir una solución de parada. La intensidad
del color es proporcional a la cantidad de anticuerpo Los anticuerpos unidos se detectan con fosfatasa
presente en el suero del paciente. Como resultado de alcalina conjugada con una IgG o IgM antihumana. Luego
esta configuración, la especificidad y la sensibilidad de la se lava la tira para eliminar el exceso de conjugado
prueba son superiores a las de los ELISA treponémicos y por último se hace reaccionar con una solución de
de primera generación. precipitación que forma bandas de antígeno de color
violeta. La reactividad en zonas de la banda específicas
Los ensayos de quimioluminiscencia para detectar de los antígenos de 15 kDa, 17 kDa y 47 kDa se
anticuerpos antitreponémicos se usan casi considera significativa (fig. 10.9). Por el contrario, la
exclusivamente en grandes laboratorios clínicos de reactividad en otras zonas de la tira no se considera
países industrializados donde los costos de mano de significativa. Los ensayos de inmunoelectrotransferencia
obra son elevados y se prevé un gran volumen de se utilizaron en el pasado para estudiar la respuesta
muestras. Estos ensayos usan el principio de unión inmunitaria a la sífilis (17, 18) y posteriormente para
de un anticuerpo específico a esferas recubiertas de seleccionar los antígenos apropiados que deben incluirse
antígeno, y la posterior detección de las esferas que en los inmunoensayos en línea.
han sido marcadas con ficoeritrina conjugada con
una IgG antihumana de cabra, o bien la detección
10.3.2.5 Inmunoensayos en línea
de anticuerpos usando un conjugado de isoluminol y
Los inmunoensayos en línea para la sífilis se han
antígeno para generar destellos de quimioluminiscencia
diseñado para que sean pruebas treponémicas
que se detectan mediante un sistema fotomultiplicador
confirmatorias y para usarlas como pruebas
sofisticado (16).
suplementarias cuando los resultados de las pruebas
Dado el gran número de enzimoinmunoanálisis y de treponémicas habituales son dudosos. Cuatro proteínas
ensayos de quimioluminiscencia disponibles en el recombinadas (TpN47, TpN17, TpN15 y TmpA) son
mercado en todo el mundo, la descripción detallada recubiertas como líneas en tiras de membrana de
de los procedimientos de análisis de las pruebas de nitrocelulosa con soporte de plástico rígido. Se añade
cada fabricante supera el alcance de este capítulo. Así el suero del paciente a estas tiras. Si en la muestra
pues, el lector deberá seguir las instrucciones con la hay anticuerpos específicos contra T. pallidum, se
información sobre el producto que incluye el fabricante unirán a las líneas de cada antígeno (19). Después de
en cada estuche. eliminar mediante lavado el exceso de suero, se añade
una IgG o una IgM antihumana de cabra marcada con
fosfatasa alcalina, que se unirá a cualquier complejo
10.3.2.4 Ensayos de inmunoelectrotransferencia para
antígeno-anticuerpo treponémico que se haya formado.
treponemas
La adición posterior de un sustrato para la enzima da
El ensayo de inmunoelectrotransferencia (Western blot) lugar a bandas de color marrón oscuro, cuya densidad
para treponemas se ha usado como prueba confirmatoria es proporcional a la concentración de los anticuerpos
para detectar anticuerpos antitreponémicos en el suero específicos presentes en la muestra. Cuando no hay
de pacientes con sífilis. Los antígenos individuales de anticuerpos contra T. pallidum, solo se desarrollará en el
T. pallidum se fraccionan mediante electroforesis en fondo un color débil.
gel de poliacrilamida de lisados de células enteras.
Las bandas de polipéptidos de diversas masas
moleculares se transfieren luego a hojas de membrana
(A) • Se verifica el estuche antes de usarlo. Se deja que todas las muestras y los reactivos alcancen la temperatura ambiente. Se
registra el número de lote y la fecha de caducidad.
• Siempre deben adoptarse medidas de seguridad cuando se manipulen las muestras.
• Tiempo de la prueba: aproximadamente 1 hora; el número máximo de muestras por placa es de 21.
Este esquema gráfico no pretende sustituir a la información sobre el producto o los procedimientos normalizados de trabajo.
1. Se deben usar guantes, bata de 2. Se prepararán los elementos 3. Antes de empezar la prueba, se
laboratorio y gafas de seguridad necesarios (estuche, placa, deja que el estuche y todos los
cuando se manipulen las muestras agitador, pipeta, placa de reactivos necesarios alcancen la
y los reactivos. microtitulación en U). temperatura ambiente.
4. Se marca la hoja de trabajo y 5. Se añaden 100 ml del diluyente 6. Se invierte la muestra de suero
la placa de microtitulación con de muestras de la TPPA al primer para mezclarla. Se añaden 25 ml
los números de identificación pocillo de cada conjunto de de la muestra al primer pocillo
(ID) de la muestra. Se divide la muestras y controles. Se añaden de cada conjunto de muestras.
muestra de manera que cada una 25 ml del diluyente de muestras de Se mezcla pipeteando 5-6 veces.
ocupe un conjunto de 4 pocillos la TPPA a los pocillos restantes de Se transfieren 25 ml al segundo
consecutivos. Los controles la placa. pocillo y se mezcla 5-6 veces.
positivos ocuparán toda la primera Se repite hasta el pocillo #4,
fila (8 pocillos). Los controles descartando 25 ml, a partir del
negativos ocuparán 4 pocillos. pocillo #4 de cada muestra.
7. Se reconstituyen los reactivos 8. Se añade 1 gota (25 ml) de las 9. Se añade 1 gota (25 ml) de las
de partículas sin sensibilizar partículas sin sensibilizar (tapón partículas sensibilizadas (tapón
y sensibilizadas. Se mezcla gris) al tercer pocillo de cada rojo) al cuarto pocillo de cada
suavemente para lograr una muestra y control. muestra y a los pocillos del 5-8 del
resuspensión completa. control positivo.
10. Se tapa con un cubreplacas y se 11. Se incuba durante 2 horas a 12. Se leen, interpretan y registran
agita durante 30 segundos. temperatura ambiente. los resultados en los formularios
apropiados.
Figura 10.8
Procedimientos para realizar (A) e interpretar los resultados (B) de la prueba de aglutinación pasiva de
partículas de T. pallidum (TPPA)
Sífilis 131
(B)
El control positivo ocupa

toda la primera fila
El control positivo ocupa
toda la primera fila
Cada muestra ocupa 4
pocillos consecutivos
Se añaden
las partículas
sensibilizadas
Se añaden las
partículas no
sensibilizadas
Interpretación de los resultados de la TPPA

Dilución
del control
positivo
Interpretación Celdas de análisis Celdas control Patrón de disposición

Gran círculo definido con un margen externo
multiforme rugoso y aglutinación periférica o
Positivo
partículas aglutinadas dispersas que cubren el
fondo del pocillo uniformemente.
Las partículas se concentran en forma de botón

Negativo en el centro del pocillo, con un margen exterior
redondo poco definido.
Las partículas se concentran en forma de anillo

Inespecífico compacto con un margen exterior redondo poco
definido.
Figura 10.8 (continuación)

Procedimientos para realizar (A) e interpretar los resultados (B) de la prueba de aglutinación pasiva de
partículas de T. pallidum (TPPA)
10.3.2.6 Pruebas diagnósticas de la sífilis en el punto clave de la estrategia de la Organización Mundial de la
de atención Salud para la eliminación mundial de la sífilis congénita
En todo el mundo hay una variedad grande defabricantes (24). El uso de estas pruebas simples permite realizar el
de pruebas diagnósticas de la sífilis para el punto de mismo día el tamizaje y el tratamiento en consultorios
atención. Estas pruebas suelen tener el formato de periféricos que están lejos de los laboratorios. Estas
pruebas en tiras con flujo lateral o de flujo a través del pruebas pueden llevarse a cabo usando sangre entera
dispositivo. En el formato de flujo lateral, uno o más (obtenida mediante punción del dedo), plasma o suero,
antígenos recombinantes se disponen en franjas en una y no requieren un equipo especial (que incluya un
tira inmunocromatográfica de nitrocelulosa para captar refrigerador o una centrifugadora). Aunque las pruebas
anticuerpos treponémicos específicos, y se produce son fáciles de realizar, es necesario seguir estrictamente
una línea de color tras la unión de una inmunoglobulina las instrucciones del fabricante para garantizar su
antihumana unida a una enzima, oro coloidal, o exactitud permanente. Para adoptar el uso de pruebas
partículas de látex coloreadas. en el punto de atención en centros clínicos se precisa la
supervisión continua de un laboratorio de referencia, que
Se incorpora también una línea de control separada, que incluya un programa de garantía de calidad externa.
actúa como control de la prueba (en algunas pruebas) o
señala si la muestra es adecuada (indicando la presencia Aparte de su aplicación en el tamizaje, estas pruebas
de inmunoglobulina humana inespecífica en la muestra pueden usarse para confirmar la especificidad de las
del paciente) (20-22). En el formato de flujo directo, pruebas no treponémicas reactivas en lugar de ensayos
puntos de antígenos sustituyen a las líneas, y la unión del treponémicos de laboratorio más complicados. Es
anticuerpo específico a los antígenos tiene lugar durante importante señalar que la utilización exclusiva de estas
el paso a través de la membrana y no cuando se produce pruebas treponémicas rápidas (es decir, sin la posterior
el paso lateral a lo largo de una tira de membrana. confirmación no treponémica de las pruebas rápidas
Todas estas pruebas indican rápidamente si ha existido reactivas) inevitablemente implicará un gran número
una exposición anterior a la infección treponémica, y de casos de tratamiento innecesario, dado que, al
se han usado convenientemente para el tamizaje de igual que ocurre con todas las pruebas treponémicas,
las embarazadas en los países en desarrollo para la probablemente se mantendrá la reactividad de por vida,
prevención de la sífilis congénita. Se ha demostrado incluso después de aplicar un tratamiento eficaz. Lo ideal
que el uso de estas pruebas para detectar la sífilis en el es que la prueba no treponémica cuantitativa se realice
embarazo es sumamente eficaz en función de los costos antes para aumentar la especificidad del diagnóstico
(23), y su utilización se ha convertido en un componente de la infección activa y para que sirva como valor inicial
Cont + + + + + + – – – Cont
Figura 10.9
Detección de anticuerpos contra Treponema pallidum mediante inmunoelectrotransferencia (Western blot)
Fuente: Por cortesía de Arnold Castro, Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (Atlanta, Georgia, EUA).
Sífilis 133
de referencia para vigilar el tratamiento. Por la misma una prueba no treponémica cuantitativa también permite
razón, estas pruebas treponémicas rápidas no pueden interpretar de forma más precisa estos resultados, junto
usarse solas para la serovigilancia de la sífilis, a no ser con una medida inicial (título) que puede utilizarse como
que se realice una prueba no treponémica en todos los referencia para evaluar la eficacia del tratamiento.
casos con resultados positivos en la prueba de detección
rápida y que solo se cuenten como casos aquellos que El desarrollo reciente de pruebas de ELISA y de
sean doblemente reactivos. quimioluminiscencia treponémicas que pueden
automatizarse ha hecho que esta estrategia cambie,
En la figura 10.10 se muestra un ejemplo del en particular en muchos laboratorios de países
procedimiento que puede seguirse y los resultados industrializados con un gran volumen de trabajo en los
que pueden obtenerse en un ejemplo de dispositivo de que los costos laborales son altos y la seroprevalencia es
análisis rápido de flujo lateral. En lo que respecta a otros baja, como los bancos de sangre.
dispositivos, se seguirán estrictamente las instrucciones
del fabricante. Tanto con el formato de flujo directo Por lo tanto, el tamizaje por lotes de los sueros se realiza
como con el formato de flujo lateral puede realizarse usando una de estas pruebas treponémicas de ELISA o
el multiplexado. Como resultado, hoy en día se están de quimioluminiscencia más nuevas, y solo se hará una
desarrollando pruebas inmunocromatográficas dobles prueba no treponémica refleja si se encuentra un suero
para el análisis de treponemas y del VIH en el punto de reactivo. Si el suero es reactivo tanto en las pruebas
atención. treponémicas como en las no treponémicas, se debe
llevar a cabo una prueba no treponémica cuantitativa, tal
Cabe señalar que actualmente existe en el mercado, en como ya se ha indicado.
algunas regiones del mundo, al menos una prueba doble
(no treponémica y treponémica) para realizar en el punto Estas dos estrategias deben teóricamente dar el mismo
de atención (25, 26). Como detectan tanto anticuerpos resultado. Sin embargo, con la segunda se detectan los
no treponémicos como treponémicos (fig. 10.11), se sueros positivos en la prueba treponémica y negativos
prevé que estas pruebas reducirán considerablemente en la prueba no treponémica que no se detectaron
las tasas de tratamiento innecesario inherentes a las mediante la estrategia convencional (27 ). Este modelo
actuales pruebas rápidas, y que permitirán utilizar un de reactividad serológica puede encontrarse en la sífilis
solo dispositivo de análisis en el punto de atención para muy incipiente, en la sífilis precoz tratada previamente,
la serovigilancia de la sífilis. y en raras ocasiones en la infección terciaria, por lo que
se debe prestar considerable atención a los resultados
10.3.3 Utilización apropiada de las pruebas de la exploración física del paciente, a los antecedentes
serológicas luéticas patológicos y al riesgo sexual reciente antes de iniciar
En el cuadro 10.1 se muestra la sensibilidad y la cualquier actividad de tratamiento y de notificación a la
especificidad de las pruebas no treponémicas y las pareja.
pruebas treponémicas en las diferentes fases de la Los laboratorios deben considerar los siguientes factores
sífilis.
antes de decidir cuál es el método más apropiado (a
El método convencional para realizar pruebas serológicas menudo el más eficaz en función de los costos) para
luéticas incluye el tamizaje de sueros con una prueba brindar servicios de realización de pruebas serológicas
no treponémica, relativamente barata y sensible, pero luéticas a una población en particular, a saber: el
relativamente menos específica y con menor carga de número de sueros sometidos a tamizaje de la sífilis en
trabajo y, si el suero es reactivo, la confirmación con un sitio en particular; la seroprevalencia (no treponémica
una prueba treponémica, más específica pero más cara. y treponémica) de la sífilis; el costo de inversión
Con el paso de los años, se ha demostrado que este de los instrumentos para el ELISA o los ensayos de
método es eficaz, en particular en los entornos donde la quimioluminiscencia; y el costo de los estuches de
enfermedad se encontraba frecuentemente. La posterior pruebas no treponémicas y treponémicas y los costos de
titulación de los sueros reactivos confirmados mediante mano de obra.
(A) • Se verifica el estuche antes de usarlo. Solo se utilizarán los que no hayan caducado o no estén dañados.
• Siempre deben adoptarse medidas de seguridad universales cuando se manipulen las muestras. Mantener el área de trabajo
limpia y organizada.
Este esquema gráfico no pretende sustituir a la información sobre el producto o los procedimientos normalizados de trabajo.
1. Reúna los elementos de la prueba 2. Abra 1 envase de la prueba. 3. Marque la tira con el número de
y otros elementos de laboratorio identificación del paciente.
necesarios.
4. Obtenga sangre mediante punción en el 5. Obtenga 20 µl de sangre entera. En el 6. Aplique la muestra a la almohadilla
dedo o venopunción. caso de la punción en el dedo, use dos absorbente de la tira.
gotas de sangre obtenidas de la yema
del dedo. En caso de venopunción, abra
un tubo para extracción de sangre por
sistema de vacío (Vacutainer) y use una
pipeta de precisión.
7. Añada 3 gotas del disolvente del ensayo 8. Espere 10 minutos y lea cuanto antes los 9. Lea y registre los resultados y toda la
a la almohadilla de la muestra. resultados. información pertinente en el cuestionario
de estudio.
Figura 10.10
Procedimientos para realizar una prueba treponémica rápida en un dispositivo de flujo lateral (A) e interpretar
los resultados (B)
Cuadro 10.1: Características del rendimiento de determinadas pruebas serológicas luéticas, por fase de la
enfermedad
Sensibilidad (%)
Etapa de la infección sifilítica
Prueba Primaria Secundaria Latente Terciaria Especificidad (%)
FTA-Abs 98 (93–100) 100 100 96 99
TPHA/PA 82 (69–90) 100 100 94 99
RPR 86 (81–100) 100 80 (53–100) 73 (36–96) 98
VDRL 80 (74–87) 100 80 (71–100) 71 (37–94) 98
FTA-Abs: prueba de absorción de anticuerpos antitreponémicos fluorescentes; RPR: prueba rápida de reagina plasmática; TPHA: prueba de
hemaglutinación de T. pallidum; TPPA: prueba de aglutinación pasiva de partículas de T. pallidum; VDRL: prueba serológica luética.
Sífilis 135
(B)
Positivo
xxx de cualquier intensidad aparece en las zonas de xxx y xxx
Negativo
xxx aparece en la zona xxx en la zona xxx
Inválido
xxx aparece en la zona xxx
No se notifican los resultados inválidos. La prueba se repite con un nuevo dispositivo.
Inválido
xxx aparece en la zona xxx y xxx aparece en la zona xxx.
No se notifican los resultados inválidos. La prueba se repite con un nuevo dispositivo.
Figura 10.10 (continuación)

Procedimientos para realizar una prueba treponémica rápida en un dispositivo de flujo lateral (A) e interpretar
los resultados (B)
Si se detecta una reacción dudosa en alguna prueba, se tratamiento (28). Sin embargo, en algunos individuos,
debe repetir esta, si es posible, en una nueva muestra sobre todo en los que fueron tratados 1-2 años después
sérica. Si en las pruebas iniciales el suero no es reactivo de la infección inicial, los anticuerpos no treponémicos
y se sospecha una sífilis primaria, las pruebas deben pueden persistir durante periodos prolongados incluso
repetirse al cabo de 2 a 3 semanas en una nueva después de administrar un tratamiento eficaz. Se dice
muestra de suero. Por último, algunos pacientes que han que estos individuos son “seropositivos rápidos”. La
recibido tratamiento adecuado que se inició en etapas seroinversión de las pruebas treponémicas puede
muy tempranas de la sífilis primaria seguirán mostrando producirse también en una minoría de pacientes en un
resultados negativos en la determinación de anticuerpos. plazo de unos pocos años.
La seroinversión de las pruebas no treponémicas en 10.4 Diagnóstico de laboratorio de la sífilis

pacientes que han sido tratados adecuadamente suele
congénita
ocurrir en un plazo que va de 6 meses hasta unos
pocos años, y se asocia a la duración de la infección y Cualquier lesión cutánea o mucosa que esté presente
al título de anticuerpos en el suero en el momento del en un recién nacido hijo de una mujer seropositiva
No reactiva Reactiva confirmada
Sólo línea de control 3 líneas
Reactiva (2 líneas) Reactiva (2 líneas)

Treponémica y control No treponémica y control
(caso antiguo o (positivo falso)
tratado)
Figura 10.11
Prueba doble (no treponémica y treponémica) en el punto de atención que indica los modelos de
reactividad y la interpretación probable.
debe examinarse mediante microscopia de campo pueden atravesar la barrera placentaria. Encontrar tal
oscuro, inmunofluorescencia directa o RCP para obtener anticuerpo IgM en la circulación del niño es indicativo de
pruebas directas de la infección por T. pallidum. Los una infección congénita, pero la IgM específica no puede
treponemas saprofitos no aparecen en la boca hasta detectarse en todos los casos de infección congénita
aproximadamente 6 semanas después del nacimiento, (29).
de manera que la probabilidad de obtener resultados
positivos falsos de las muestras bucales es baja. La especificidad de las pruebas de inmunofluorescencia
indirecta específicas de las IgM es notablemente
Cuando se encuentra un suero reactivo en una baja, y la FTA-IgM, al igual que la FTA-Abs de la
prueba serológica de un neonato, puede deberse a la que deriva, es inherentemente subjetiva. Por otra
transferencia pasiva de anticuerpos maternos a través parte, las columnas que se usaban para separar las
de la placenta durante el embarazo, por lo que no puede fracciones de inmunoglobulinas para su uso en la
considerarse diagnóstico. Sin embargo, anteriormente se prueba 19S-FTA-IgM, que sustituyó en gran medida a la
consideraba que encontrar un título significativamente FTA-IgM, ya no pueden adquirirse en muchos países.
más elevado en la RPR/VDRL (es decir, ≥4 veces mayor)
en el suero del neonato en comparación con el título En enzimoinmunoanálisis específicos de la IgM,
materno, o detectar un aumento importante del título el anticuerpo IgM (específico de la cadena µ)
de la RPR/VDRL durante un periodo de 3 meses, era antihumano de conejo recubre los pocillos de placas
indicativo de una infección congénita. de microtitulación. Se añade una dilución medida del
suero del paciente a los pocillos de la placa. La IgM
Las modificaciones de la FTA-Abs (FTA-IgM), de antihumana de conejo captura cualquier IgM que
enzimoinmunoanálisis específicos y de inmunoensayos haya en el suero del paciente. Se añade antígeno de
en línea que detectan solo IgM pueden usarse para T. pallidum purificado a los pocillos y se elimina el
detectar IgM antitreponémicas específicas, que no exceso de antígeno mediante lavado. A continuación se
Sífilis 137
añade a los pocillos una mezcla de antisuero biotinilado ensayos específicos de la IgM en el diagnóstico de la
anti-T. pallidum humano o de conejo y estreptavidina- enfermedad en el adulto.
peroxidasa de rábano. Después de eliminar mediante
enjuague los complejos no unidos, se añade el sustrato 10.7 Referencias
de la enzima e indicadores cromógenos. Si el suero
contiene anticuerpos IgM específicos contra T. pallidum, 1. Pillay A et al. Laboratory-confirmed case of yaws in a
10-year-old boy from the Republic of the Congo. Journal
se produce una reacción de color, de tal manera que la of Clinical Microbiology, 2011, 49(11):4013-4015.
intensidad del color es proporcional a la concentración
de anticuerpos. 2. Sparling PF et al. Clinical manifestations of syphilis. In:
Holmes KK et al., eds. Sexually transmitted diseases,
4th ed. New York, McGraw-Hill Medical, 2008:661-684.
10.5 Neurosífilis 3. Larsen S et al. A manual of tests for syphilis, 9th ed.
Washington, DC, American Public Health Association,
Las alteraciones del líquido cefalorraquídeo (LCR) 1998.
son comunes en los pacientes con sífilis precoz
4. Wheeler HL, Agarwal S, Goh BT. Dark ground
que no presentan síntomas ni signos neurológicos.
microscopy and treponemal serological tests in the
Aunque una gran proporción de estos pacientes tienen diagnosis of early syphilis. Sexually Transmitted
treponemas en el sistema nervioso central, no necesitan Infections, 2004, 80(5):411-414.
el tratamiento reforzado que es preciso administrar
5. Hook EW III et al. Detection of Treponema pallidum in
en la neurosífilis (30). Como resultado, no se realiza lesion exudate with a pathogen-specific monoclonal
sistemáticamente la punción lumbar en la sífilis precoz antibody. Journal of Clinical Microbiology, 1985,
a no ser que esté claramente indicado desde el punto 22(2):241-244.
de vista clínico. Sin embargo, cuando está indicado, 6. Chen CY et al. Diagnosis of gastric syphilis by direct
deben analizarse muestras de LCR para determinar la immunofluorescence staining and real-time PCR
cantidad total de proteínas y el número de leucocitos, y testing. Journal of Clinical Microbiology, 2006,
44(9):3452-3456.
también para hacer una prueba VDRL-LCR. La prueba
VDRL-LCR tiene gran especificidad (99%-100%) pero 7. Gayet-Ageron A et al. Assessment of a real-time
PCR test to diagnose syphilis from diverse biological
baja sensibilidad para la neurosífilis (31, 32). Por lo
samples. Sexually Transmitted Infections, 2009,
tanto, aunque una muestra reactiva en la VDRL-LCR es 85(4):264-269.
indicativa de la neurosífilis, no se puede descartar la
8. Liu H et al. New tests for syphilis: rational design of a
neurosífilis si la muestra no es reactiva. Por el contrario,
PCR method for detection of Treponema pallidum in
el FTA-Abs del LCR tiene gran sensibilidad pero escasa clinical specimens using unique regions of the DNA
especificidad en lo que respecta a la neurosífilis, dada polymerase I gene. Journal of Clinical Microbiology,
la transferencia pasiva de anticuerpos IgG específicos 2001, 39(5):1941-1946.
a través de la barrera hematoencefálica. Así pues, 9. Marfin AA et al. Amplification of the DNA polymerase
cuando se obtenga un resultado negativo en la FTA-Abs I gene of Treponema pallidum from whole blood of
en el LCR, la probabilidad de que se pueda descartar la persons with syphilis. Diagnostic Microbiology and
Infectious Diseases, 2001, 40(4):163-166.
neurosífilis es elevada (33).
10. Orle KA et al. Simultaneous PCR detection of
Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, and herpes
10.6 Detección de IgM antitreponémicas en el simplex virus types 1 and 2 from genital ulcers. Journal
suero de adultos of Clinical Microbiology, 1996, 34(1):49-54.
11. Larsen SA, Steiner BM, Rudolph AH. Laboratory

Al igual que en otras infecciones bacterianas y virales, diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clinical
en la sífilis la síntesis de anticuerpos IgM específicos es Microbiology Reviews, 1995, 8(1):1-21.
la primera respuesta inmunitaria humoral después de
12. Ratnam S. The laboratory diagnosis of syphilis.
la infección. Sin embargo, en la sífilis, los anticuerpos Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical
IgM antitreponémicos no solo están presentes en los Microbiology, 2005, 16(1):45-51.
pacientes con sífilis precoz, sino que pueden encontrarse
13. Nandwani R, Evans DT. Are you sure it’s syphilis? A
también durante el periodo de latencia y en pacientes review of false positive serology. International Journal of
con sífilis tardía. Este fenómeno limita el valor de los STD and AIDS, 1995, 6(4):241-248.
14. Aktas G et al. Evaluation of the fluorescent treponemal 26. Yin YP et al. A dual point-of-care test shows
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(immunoglobulins G and M) to Treponema pallidum in nontreponemal and treponemal antibodies in patients
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treponemal antibodies in patients with syphilis. Journal
Sífilis 139
Capítulo 11
Linfogranuloma venéreo
11.1 Introducción
El linfogranuloma venéreo (LGV) es una de las tres la infección primaria del cuello uterino. En la mayoría
infecciones de transmisión sexual “tropicales” clásicas. de los casos las personas buscan atención médica
Está causado por la biovariedad L de Chlamydia cuando los vasos linfáticos regionales contraen la
trachomatis, que contiene serovariedades (L1, L2, infección, como resultado de la propagación linfática
L2a, L2b, L3) más invasoras que las que causan la del microorganismo causal. En los hombres, la
enfermedad ocular clásica, el tracoma (serovariedades tumefacción de los ganglios inguinales y femorales a
A-C), y que las serovariedades que provocan uretritis menudo da lugar a bubones supurados a uno o ambos
no gonocócicas e infecciones asociadas del aparato lados del ligamento inguinal (es el denominado “signo
genital (serovariedades D-K). El linfogranuloma venéreo del surco”, que puede verse también en una minoría
tiene distribución mundial, pero es más prevalente en de pacientes con chancro blando) (1). Los ganglios
los países tropicales y subtropicales; por ejemplo, es perirrectales y pélvicos profundos pueden resultar
endémico en zonas del este y el oeste de África, en la afectados si la lesión primaria se encuentra en el
India y Asia sudoriental, así como en América del Sur y el cuello uterino, y la enfermedad puede comenzar con
Caribe. En la mayoría de los casos, estas observaciones síntomas compatibles con una enfermedad pélvica
epidemiológicas representan el cuadro clínico clásico inflamatoria grave.
de linfogranuloma venéreo, que se caracteriza por
En los hombres que tienen relaciones sexuales con
linfadenopatía inguinal con una lesión primaria asociada
otros hombres, la enfermedad puede comenzar con
o sin ella (1). Estos signos suelen observarse más en los
una proctitis o proctocolitis ulcerosa grave, con
hombres que en las mujeres. En el 2003, se registró en
dolor rectal, exudado sanguinolento, importantes
los Países Bajos un grupo de infecciones rectales por
anomalías en la exploración mediante anoscopia, fiebre
linfogranuloma venéreo, con la característica afectación
y linfadenopatía (6, 7 ). Al igual que en las mujeres, en
ganglionar y proctitis o proctocolitis, en hombres que
las que el padecimiento también pueden comenzar
mantenían relaciones sexuales con otros hombres
con tales lesiones, si no se trata la enfermedad en
(2). Se notificaron posteriormente casos en muchos
esta etapa se pueden formar abscesos perirrectales,
otros países de Europa, América del Norte, Australia
así como estenosis rectales, fístulas y cicatrización
y otras zonas, donde anteriormente sólo se habían
crónica. Aparte de estas complicaciones, que surgen
registrado casos de linfogranuloma venéreo importados
como resultado de los cambios inflamatorios agudos, las
esporádicamente (3-5). Sigue sin conocerse el número
manifestaciones crónicas de la enfermedad pueden
de infecciones rectales por C. trachomatis debidas
obstruir los vasos linfáticos de drenaje de los genitales
a la biovariedad relacionada con el linfogranuloma
o el recto, con el consiguiente edema. Se denomina
venéreo o a biovariedades no relacionadas con el
“elefantiasis” al edema grave de origen linfático.
linfogranuloma venéreo, debido a que el tamizaje no se
hace sistemáticamente ni se usa de forma generalizada
11.2 Pruebas de laboratorio
una prueba discriminatoria.
Hasta principios de la década de 1980, el aislamiento
Por lo general, el linfogranuloma venéreo se manifiesta de C. trachomatis en el cultivo celular seguía siendo
inicialmente por una lesión primaria herpetiforme el método principal de diagnóstico de la infección por
y transitoria en los genitales externos, pero en clamidias (véase el capítulo 5). Se constató que las
muchos casos esta lesión puede pasar inadvertida, cepas de los casos de linfogranuloma venéreo crecen
o bien puede manifestarse como una uretritis no más rápidamente en células de cultivos tisulares
gonocócica aguda en los hombres o ser completamente que las cepas de clamidias no relacionadas con el
asintomática en las mujeres como consecuencia de linfogranuloma venéreo. Desde mediados de la década
Linfogranuloma venéreo 141

de 1990, las pruebas de amplificación de ácidos venéreo no complicado pueden tener respuestas
nucleicos (PAAN) se han convertido en las pruebas inmunitarias similares. Sigue sin conocerse el valor de las
de elección para el diagnóstico de las infecciones por pruebas serológicas en el diagnóstico de la proctitis y la
clamidias. Las pruebas de amplificación de ácidos proctocolitis del linfogranuloma venéreo.
nucleicos comercializadas son sustancialmente más
sensibles que las pruebas diagnósticas anteriores (véase 11.3 Referencias
el anexo 3), aunque no pueden discriminar entre cepas 1. Mabey D, Peeling RW. Lymphogranuloma venereum.
no relacionadas con el linfogranuloma venéreo y cepas Sexually Transmitted Diseases, 2002, 78(2):90-92.
causantes del linfogranuloma venéreo. Posteriormente
2. Nieuwenhuis RF et al. Resurgence of lymphogranuloma
se han desarrollado ensayos moleculares que pueden venereum in Western Europe: an outbreak of Chlamydia
diferenciar las cepas basándose en una eliminación trachomatis serovar L2 proctitis in The Netherlands
en el gen pmpH que solo tiene lugar en las cepas que among men who have sex with men. Clinical Infectious
Diseases, 2004, 39(7):996-1003.
causan el linfogranuloma venéreo (8-10). Es crucial
obtener, transportar y conservar las muestras de manera 3. Rönn MM, Ward H. The association between
apropiada si se quiere conseguir que la sensibilidad y la lymphogranuloma venereum and HIV among men who
have sex with men: systematic review and meta-
especificidad de todos los métodos diagnósticos sean analysis. BMC Infectious Diseases, 2011, 11:70-78.
elevadas.
4. Martin-Iguacel R et al. Lymphogranuloma venereum
En el diagnóstico del linfogranuloma venéreo, proctocolitis: a silent endemic disease in men who
have sex with men in industrialised countries. European
las muestras de elección para el cultivo y para las
Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases,
pruebas de amplificación de ácidos nucleicos son las 2010, 29(8):917-925.
obtenidas con hisopo directamente de las lesiones
5. White J, Ison C. Lymphogranuloma venereum: what does
primarias (cuando están presentes), las muestras
the clinician need to know? Clinical Medicine, 2008,
uretrales obtenidas con hisopo o muestras de orina 8(3):327-330.
de la primera parte de la micción en los hombres,
6. Levine JS, Smith PD, Brugge WR. Chronic proctitis in
muestras del exudado endocervical obtenidas con male homosexuals due to lymphogranuloma venereum.
hisopo en las mujeres y muestras rectales obtenidas Gastroenterology, 1980, 79(3):563-565.
con hisopo en los hombres que tienen relaciones
7. Quinn TC et al. The polymicrobial origin of intestinal
sexuales con otros hombres. Las muestras que infections in homosexual men. New England Journal of
se obtienen mediante aspiración con aguja de los Medicine, 1983, 309(1):576-582.
ganglios linfáticos regionales fluctuantes rara vez dan
8. Morré SA et al. Real-time polymerase chain reaction
resultados positivos. A diferencia de otras infecciones to diagnose lymphogranuloma venereum. Emerging
del aparato genital por clamidias no invasivas, el Infectious Diseases, 2005, 11(8):1311-1312.
linfogranuloma venéreo tiende a producir una respuesta
9. Chen CY et al. The molecular diagnosis of
inmunitaria humoral importante. En el pasado se lymphogranuloma venereum: evaluation of a real-time
usó mucho la prueba de fijación del complemento multiplex polymerase chain reaction test using rectal
para el diagnóstico de la infección tropical clásica, and urethral specimens. Sexually Transmitted Diseases,
2007, 34(7):451-455.
detectándose títulos ≥1:64. Posteriormente, se utilizó
la prueba de microinmunofluorescencia, detectándose 10. Alexander S, Martin IM, Ison C. A comparison of two
títulos de anticuerpos ≥1:256 con gran reactividad methods for the diagnosis of lymphogranuloma venereum.
Journal of Medical Microbiology, 2008, 57:962-965.
cruzada.
Cabe señalar que las mujeres con enfermedad pélvica

inflamatoria y otras que presentan un linfogranuloma
Capítulo 12
Chancro blando
12.1 Introducción
El chancro blando o chancroide está causado por microorganismo patógeno productor de enfermedades
Haemophilus ducreyi y se transmite exclusivamente ulcerosas genitales, pero actualmente esto es menos
por contacto sexual, con invasión directa del común debido a la disminución de la prevalencia relativa
microorganismo a través de la piel sana o erosionada. de las enfermedades ulcerosas genitales de origen
Es aproximadamente siete veces más frecuente en los bacteriano.
hombres que en las mujeres, y su transmisión se asocia
El microorganismo patógeno H. ducreyi es un bacilo
al hecho de tener múltiples parejas sexuales. El chancro
gramnegativo corto e inmóvil. Es difícil de cultivar
blando produce úlceras en los genitales, normalmente
y, debido a sus complejas necesidades nutritivas,
en el surco coronal peneano en los hombres y en
es preciso utilizar medios de cultivo sumamente
la vulva en las mujeres. El chancro blando perianal
enriquecidos para aislarlo. El crecimiento de las cepas de
puede observarse en hombres que tienen relaciones
H. ducreyi puede ser aerobio o anaerobio, y es óptimo a
sexuales con otros hombres (papel pasivo) y también
una temperatura entre 32 °C y 33 °C en una atmósfera
en mujeres que han practicado el coito anal. El chancro
saturada de agua. La mayoría de las cepas, en particular
blando puede asociarse a veces a linfadenitis inguinal
en el aislamiento primario, dependen del dióxido de
supurativa, en particular si el paciente tarda en acudir
carbono (CO2). H. ducreyi tiene pocas características
a los servicios asistenciales o si se tarda en hacer el
bioquímicas distintivas: todas las cepas reducen el
diagnóstico correcto. En raras ocasiones el chancro
nitrato a nitrito, son positivas tanto a la oxidasa como a
blando se adquiere en el laboratorio por inoculación
la fosfatasa alcalina y necesitan hemina (factor X) para
accidental de H. ducreyi en los dedos.
crecer.
El periodo de incubación suele ser de 4-10 días. La
Aunque en tiempos el chancro blando era muy común
úlcera genital comienza como una pápula dolorosa
en ciertas partes del mundo, la prevalencia de la
a la palpación que se convierte en una pústula y se
enfermedad ha disminuido extraordinariamente desde la
ulcera en 2 días. La úlcera es dolorosa, irregular, con
década de 1990, en parte debido al mejor acceso a los
bordes excavados y generalmente no está indurada;
antimicrobianos, la introducción del manejo sindrómico,
estas son las características clásicas que diferencian el
la mejor atención de salud de los profesionales del sexo
chancro blando de las úlceras sifilíticas. Sin embargo,
y el cambio del comportamiento sexual en la era de la
es importante señalar que la sensibilidad del diagnóstico
infección por el VIH.
basado simplemente en la aparición clínica de la
úlcera es escasa. La base de la úlcera a menudo está
cubierta por un exudado purulento y necrótico, y sangra
12.2 Aspectos generales de los
fácilmente si se hace un raspado o se obtiene el exudado procedimientos diagnósticos
mediante hisopo. Es frecuente que haya lesiones El diagnóstico de laboratorio del chancro blando se
múltiples, que pueden converger formando úlceras ha basado tradicionalmente en la recuperación de
muy grandes. También pueden darse casos de adenitis H. ducreyi en el cultivo, que es un procedimiento
inguinal dolorosa unilateral que, si no se trata adecuada técnicamente exigente cuyo rendimiento es bajo salvo en
y prontamente, puede dar lugar a la ruptura espontánea los laboratorios sumamente capacitados que se utilizan
de los ganglios linfáticos supurados (bubones). Las para trabajar con este microorganismo (1). Aunque no
manifestaciones iniciales atípicas del chancro blando existe en el mercado ninguna prueba de amplificación de
son frecuentes y la enfermedad puede confundirse ácidos nucleicos (PAAN), se han utilizado varias PAAN
fácilmente con otras enfermedades ulcerosas genitales, internas para aumentar la sensibilidad diagnóstica (1).
sobre todo con el herpes genital. Algunas úlceras Por otra parte, se han descrito varias técnicas basadas
genitales pueden estar infectadas por más de un en investigaciones, como el uso de la detección de
Chancro blando 143

antígenos basada en anticuerpos monoclonales y las Inicialmente se intentó cultivar H. ducreyi usando sangre
sondas de DNA (1). La sensibilidad y la especificidad de conejo fresca coagulada calentada a 55 °C, sangre
de la microscopia directa son muy bajas, por lo que humana fresca coagulada y suero humano inactivado
su utilidad como herramienta diagnóstica del chancro mediante calor, pero estos métodos estaban sujetos a
blando es escasa. Las pruebas serológicas desarrolladas problemas recurrentes de contaminación microbiana (1).
en laboratorios de investigación de las que se dispone El problema de la contaminación se abordó
actualmente son útiles exclusivamente a efectos posteriormente mediante la adición de vancomicina a
seroepidemiológicos. agar chocolate semisólido en una concentración de 3 µg/
ml (4). Usando tales medios selectivos, Hammond et al.
12.3 Toma y transporte de las muestras lograron el crecimiento de H. ducreyi en 7 (44%) de 16
pacientes con chancro blando diagnosticado
Las muestras para el cultivo de H. ducreyi deben
clínicamente (4). Cabe observar que con esa
obtenerse de la base de la úlcera. Se limpia la úlcera con
concentración de vancomicina puede inhibirse el
una gasa seca o con un hisopo para retirar las costras
crecimiento de algunas cepas de H. ducreyi y, por lo
y los residuos superficiales. No es preciso hacer una
tanto, tales cepas deberán aislarse en medios de cultivo
limpieza exhaustiva, que puede provocar una hemorragia
sin antibióticos.
y ser dolorosa para el paciente. Se obtiene el exudado
de la base con un hisopo; el tipo de fibra del hisopo no Se han desarrollado varios medios artificiales selectivos,
parece afectar a la sensibilidad del cultivo. El aislamiento que se examinan detalladamente en diversos artículos
de H. ducreyi del pus del bubón inguinal es mucho menos (5). Nsanze et al. demostraron que el rendimiento de los
satisfactorio que a partir del material de la úlcera genital, cultivos positivos podía ser mayor cuando se utilizaba
por lo que rara vez se realiza. Para obtener resultados más de un tipo de medio de cultivo para aislar H. ducreyi
óptimos, se inoculan las muestras de inmediato en los del material obtenido de las úlceras genitales (6). Esto
medios de aislamiento y se mantienen en un frasco puede deberse en parte a diferencias entre las cepas
con vela o en una incubadora de tipo ambulatorio en de H. ducreyi en lo que respecta a las necesidades
una atmósfera húmeda, a una temperatura que no sea nutritivas. Un medio que contenga base de agar GC,
superior a 35 °C hasta la incubación final. Cuando no hemoglobina (1%-2%), suero de bovino fetal (5%),
se dispone de medios de cultivo en el centro clínico, las medio de enriquecimiento con cofactores, vitaminas
muestras pueden transportarse a 4 °C en un medio de y aminoácidos (CVA; 10%) y vancomicina (3 mg/ml)
transporte. Un medio a base de hemina y tioglicolato parece tener la mayor sensibilidad para el aislamiento
que contenga L-glutamina y albúmina bovina parece de H. ducreyi en muestras clínicas, con una tasa de
mantener la viabilidad de H. ducreyi durante varios días cultivos positivos de hasta aproximadamente 80% de
a 4 °C (2). los casos de chancro blando definidos clínicamente (fig.
12.1) (5). No obstante, se ha observado que algunas
12.4 Aislamiento e identificación de cepas de H. ducreyi no crecerán en este medio, pero
que pueden aislarse en un medio diferente compuesto
H. ducreyi
de agar de Mueller-Hinton (MH), sangre de caballo
El cultivo bacteriológico de H. ducreyi sigue siendo el chocolatada (5%), medio enriquecido con CVA (1%) y
medio principal para el diagnóstico del chancro blando vancomicina (3 mg/ml) (5). Para facilitar la optimización
en el marco clínico y durante muchos años fue el método del cultivo de H. ducreyi en el marco clínico, pueden
de referencia para evaluar otros métodos diagnósticos. incorporarse dos medios diferentes en una sola biplaca.
Para que el cultivo sea satisfactorio, es fundamental Más recientemente, se ha desarrollado un medio a base
utilizar medios preparados recientemente (lo ideal es de carbón que evita la necesidad de agregar el costoso
que tengan menos de 7 días) y que las condiciones suero de bovino fetal y puede ser un medio diagnóstico
de incubación sean correctas. Sin embargo, con el más rentable en entornos con recursos escasos (fig.
advenimiento de pruebas de amplificación de ácidos 12.2) (7 ). En el anexo 4 se describen las recetas de
nucleicos desarrolladas en laboratorios de investigación, laboratorio de los medios apropiados. A fin de poner
que son más sensibles, ahora se constata que el cultivo establecer el cultivo de H. ducreyi, es aconsejable usar al
puede detectar, en el mejor de los casos, solo 75% de menos dos de los medios antes mencionados y definir su
las infecciones por H. ducreyi (3). sensibilidad en el curso de estudios piloto.
Figura 12.1
Crecimiento de H. ducreyi en una placa de agar-chocolate GC enriquecido
Figura 12.2
Agregados de H. ducreyi en un medio de carbón
Después de la siembra, se incuban las placas de son prominentes y granuladas, de color grisáceo a
cultivo a una temperatura de 32 °C a 34 °C en una amarillento, y pueden obtenerse con un asa de siembra,
atmósfera saturada de agua que contenga 5% de CO2 deslizándose por la superficie del agar, manteniéndose
o, preferentemente, en condiciones microaerófilas. Los intactas y formando agregados. Las colonias son
cultivos se incuban durante 48 horas antes de hacer la translúcidas u opacas, y esta variabilidad puede dar la
lectura inicial, y se mantienen 5 días antes de llegar a impresión de un cultivo mixto e impuro. La tinción de
la conclusión de que son negativos. El tamaño de las Gram de los frotis de las colonias muestra cocobacilos
colonias de H. ducreyi puede variar según el tiempo gramnegativos en cadenas cortas, agregados o
y la temperatura de incubación, la atmósfera y el espirales. Los microorganismos son polimorfos en
medio de crecimiento. Las colonias no son mucoides, aproximadamente 50% de los cultivos. Las bacterias a
Chancro blando 145

veces parecen tener tinción bipolar. En muchas zonas de la hemina. Por lo tanto, H. ducreyi debe dar un
del mundo, casi todas las cepas de H. ducreyi producen resultado negativo y no presentar fluorescencia roja.
lactamasa, característica que puede servir de ayuda
• Detección de la fosfatasa alcalina
para hacer una identificación presuntiva. En el trabajo de
diagnóstico ordinario en zonas donde la enfermedad es Se hace una suspensión bacteriana densa (patrón 3
endémica, no hay ninguna necesidad de identificación de McFarland, 109 UFC/ml) en un tubo que contenga
adicional, aunque la identificación confirmatoria puede 0,5 ml de fosfato disódico sin fenol (0,3 g/l) en
ser necesaria en caso de presuntas cepas en zonas tampón de citrato-hidróxido de sodio de Sörensen
donde no es endémica. Para facilitar este proceso, (0,01 mol/l), a pH 5,6, y se incuba el tubo en un baño
pueden combinarse algunos de los siguientes métodos: María a 37 °C durante 4 horas. Se añaden 4 gotas de
prueba de la oxidasa, reducción de nitratos, prueba de la 2,6-dibromoquinona-4-clorimida (5 g/l) en metanol, se
porfirina y detección de la fosfatasa alcalina. agita y se deja reposar el tubo a temperatura ambiente
durante 15 minutos. Se añaden 0,3 ml de n-butanol, se
• Prueba de la oxidasa
agita y se deja reposar 5 minutos. La aparición de un
La producción de citocromo oxidasa puede evidenciarse color de azul a violeta en la capa del butanol indica
poniendo unas cuantas gotas de hidrocloruro de un resultado positivo.
tetrametil-p-fenilendiamina en una tira del papel de
• Otras características de H. ducreyi
filtro y haciendo una extensión de varias colonias
sobre la zona impregnada mediante un asa de siembra Las pruebas de la catalasa, el indol y la ureasa
bacteriológica. Se considera que el resultado es positivo son negativas. No se considera que H. ducreyi sea
si el color cambia al azul o al violeta en 1 minuto. sacarolítico. Sin embargo, se han referido casos de
reacciones positivas con diferentes carbohidratos.
• Reducción de nitratos
H. ducreyi posee una amplia actividad aminopeptidasa
Se prepara una suspensión bacteriana densa (patrón y todas las cepas analizadas han mostrado actividad
3 de McFarland, 109 UFC/ml) y se transfieren 0,04 ml con derivados ß-naftilamídicos de L-lisina, L-arginina,
a un tubo pequeño. Se agregan 0,04 ml de solución de L-alanina, L-glicina, glicil-glicina, glicil-L-alanina y
nitrato de sodio (0,5 g/I) y 0,04 ml de tampón fosfato L-leucina.
(0,025 mol/l), a pH 6,8, y se incuba en un baño María a
37 °C durante 1 hora. Luego se añaden 0,06 ml de ácido 12.5 Detección de H. ducreyi basada en los
sulfanílico (8 g/l) a ácido acético (5 mol/l) y 0,06 ml de ácidos nucleicos
ß-naftilamina (5 g/l) a ácido acético (5 mol/l). Se agita
Al momento de redactarse esta publicación (junio
el tubo y el resultado se considera positivo si se observa
del 2012), no existía en el mercado ninguna prueba
una coloración rosa.
de amplificación de ácidos nucleicos aprobada por
• Dependencia de la hemina (factor X): prueba de la Administración de Alimentos y Medicamentos
la porfirina (FDA) de los Estados Unidos para la detección de
H. ducreyi. En la bibliografía se han descrito varias
La prueba clásica de crecimiento con discos o tiras prueba de amplificación de ácidos nucleicos, que
impregnados de hemina no puede usarse para detectar utilizan diversas dianas moleculares, como el gen
H. ducreyi. La única manera fiable de demostrar la de rRNA de 16s de H. ducreyi, la región espaciadora
dependencia de la hemina es la prueba de la porfirina. intergénica ribosómica rrs (16S)-rrl (23S) y el gen
Se hace una suspensión bacteriana densa (patrón 3 groEL (1). También se ha desarrollado una robusta
de McFarland, 109 UFC/ml) en 0,5 ml de una solución reacción en cadena de la polimerasa múltiple para la
de clorhidrato del ácido ß-aminolevulínico (2 mmol/l) detección de microorganismos patógenos que producen
en tampón fosfato (0,1 mol/l), a pH 6,9, que contenga enfermedades ulcerosas genitales, incluido H. ducreyi,
solución de sulfato de magnesio (0,8 mmol/l). Se incuba que se utiliza en algunos centros de referencia
en un baño María a 37 °C durante 4 horas. El sustrato internacionales (8).
se expone a la luz de Wood (longitud de onda de 360
nm) en un cuarto oscuro. Una fluorescencia roja indica la
presencia de porfirinas, es decir, que no hay dependencia
12.6 Tecnologías de sondas de ácidos clínica y los estudios de inoculación experimental en el
nucleicos ser humano, parece probable que no exista inmunidad
adquirida contra H. ducreyi. Las pruebas serológicas
Se ha investigado el uso de ensayos de hibridación
aportan poco como ayuda diagnóstica, pero serían
de DNA-DNA y DNA-RNA como posibles medios para
una herramienta útil para quienes realizan encuestas
detectar H. ducreyi en el laboratorio y se ha demostrado
seroepidemiológicas de infecciones pasadas por
que tanto su sensibilidad como su especificidad alcanzan
H. ducreyi en las comunidades.
el 100%. No obstante, todavía es preciso establecer su
función como herramienta diagnóstica para detectar el
12.10 Antibiograma
chancro blando (1).
Se han observado y descrito casos de resistencia de
12.7 Microscopia alto nivel conferida por plásmidos a las sulfonamidas,
las penicilinas, la kanamicina, la estreptomicina, la
El examen directo del material clínico en frotis
tetraciclina, el cloranfenicol y la trimetoprima en cepas
con tinción de Gram a veces puede ser útil para el
de H. ducreyi. La resistencia cromosómica conferida
diagnóstico del chancro blando si se observan los
por plásmidos puede variar enormemente de una
característicos bacilos gramnegativos pequeños
zona geográfica a otra. Muchas cepas de H. ducreyi
agrupados en cadenas en forma de “bancos de peces”,
muestran resistencia a varios antimicrobianos. El
“vías de tren” o “huellas digitales”. Sin embargo, estos
aumento continuo de la farmacorresistencia de los
aspectos morfológicos clásicos rara vez se ven en la
microorganismos patógenos que provocan infecciones
práctica clínica. Por otra parte, la mayoría de las úlceras
de transmisión sexual (ITS) exige la adecuada vigilancia
genitales presentan una flora polimicrobiana debido a
de la sensibilidad de las cepas clínicas de H. ducreyi
la contaminación secundaria, por lo que la presencia
en las zonas donde el chancro blando sigue siendo
de bacilos gramnegativos en un frotis puede resultar
un importante problema clínico. Sin embargo, hasta
engañosa y contribuye a que el rendimiento de la
ahora no existe ningún procedimiento estándar para los
microscopia como medio diagnóstico sea bajo. Así pues,
antibiogramas de este microorganismo.
no se recomienda la tinción de Gram de los frotis para el
diagnóstico del chancro blando. La mayoría de los estudios publicados han usado
la técnica de dilución en agar para determinar las
12.8 Detección de antígenos de H. ducreyi concentraciones inhibitorias mínimas (CIM). Uno de los
Se han utilizado algunos anticuerpos monoclonales medios más apropiados es el agar de Mueller-Hinton
contra importantes antígenos de H. ducreyi, incluidos la (MH) enriquecido con hemoglobina al 1%, suero de
proteína y el lipooligosacárido de la membrana externa bovino fetal al 5% y suplemento de enriquecimiento
de 29 kDa, para detectar la infección por H. ducreyi IsoVitaleXTM al 1% (anexo 4). Como alternativa, el agar
en varios formatos diagnósticos, como ensayos de de Mueller-Hinton puede reemplazarse por la base de
inmunofluorescencia y ensayos de inmunolimulus (1). agar GC. La determinación de las CIM antimicrobianas de
Estos ensayos se han desarrollado en laboratorios de las cepas de H. ducreyi es un procedimiento engorroso
investigación y no se han usado como medio diagnóstico y delicado desde el punto de vista técnico, que solo
en la práctica clínica. puede realizarse con éxito en laboratorios de referencia
especializados.
12.9 Pruebas serológicas La lista de antimicrobianos que han de examinarse
Actualmente no se comercializan pruebas serológicas debe incluir aquellos que se recomiendan localmente
para la detección de anticuerpos contra H. ducreyi. para tratar el chancro blando, así como medicamentos
Las respuestas serológicas humanas y de conejo a la alternativos, antimicrobianos que sean útiles para el
infección por H. ducreyi se han detectado mediante estudio epidemiológico de H. ducreyi y, por último,
diversas tecnologías, como los enzimoinmunoanálisis, la fármacos recién desarrollados que requieren una
precipitación, la aglutinación y la inmunofijación puntual evaluación microbiológica. Entre los antimicrobianos
(1). Durante la fase ulcerativa del chancro blando se que suelen incluirse se encuentran el sulfametoxazol
desarrolla una respuesta humoral a la infección por y la trimetoprima (usados solos o en combinación),
H. ducreyi, pero, teniendo en cuenta la experiencia las tetraciclinas, el cloranfenicol, la eritromicina, la
Chancro blando 147

kanamicina (o la estreptomicina), el ciprofloxacino (o Las placas para el análisis de la CIM se calientan a
el fleroxacino) y la ceftriaxona (o la cefotaxima). La temperatura ambiente y, si fuera preciso, se secan
preparación de soluciones madre antimicrobianas y de colocándolas en una incubadora en posición invertida
diluciones para su uso en la determinación de las CIM con las tapas entreabiertas. Los inóculos bacterianos
se describe detalladamente en la sección 4.8.4.2 del preparados se pasan a las placas de análisis usando
capítulo 4. un replicador de puntas múltiples, para producir puntos
de aplicación que contengan aproximadamente 104
Para elaborar el medio, se disuelven en agua destilada, UFC. Primero se inocula una placa de referencia que
por separado, agar de Mueller-Hinton deshidratado y no contenga antimicrobianos y, a continuación, las
hemoglobina. El volumen de agua usado debe ser 16% placas que contienen los diferentes antimicrobianos,
inferior al volumen de la fórmula del medio normal comenzando con la menor concentración de cada
(para permitir la adición posterior del volumen de fármaco. Por último, se inocula una segunda placa
suplementos y solución antimicrobiana). Se calienta de referencia. Se deja que los inóculos se sequen, se
hasta llegar al punto de ebullición y se dispensan el agar invierten las placas y se incuban durante 24 horas, a 33
de Mueller-Hinton y la hemoglobina por separado en dos °C, en una atmósfera saturada de agua que contenga un
recipientes, en volúmenes apropiados para el número 5% de CO2.
de placas que deban prepararse para cada dilución
antimicrobiana, lo cual dependerá del número de cepas La CIM es la menor concentración de antimicrobiano
que deban analizarse. Se introduce en el autoclave en que no produce ningún crecimiento, o bien muy pocas
envases herméticamente cerrados, se deja que baje colonias únicas o una fina turbidez, apenas visible. El
la temperatura hasta 50 °C a 55 °C en un baño María, crecimiento en ambas placas de referencia debe ser
luego se mezcla en un recipiente y se añade suero de confluente y sin contaminación. La determinación de
bovino fetal al 5%, suplemento de H. ducreyi al 1% y la CIM de las sulfonamidas es algo difícil, ya que los
solución antimicrobiana al 10%. Se mezcla suavemente y valores extremos son menos nítidos que con otros
se vierten cantidades de aproximadamente 20 ml sobre antimicrobianos. Se logra una lectura normalizada y
placas con un diámetro interno de 9 cm. Cuando el agar resultados reproducibles si la segunda dilución en la
se ha solidificado, las placas pueden conservarse a 4 °C que hay una disminución extraordinaria del crecimiento
hasta 1 semana en bolsas de plástico selladas. se toma como CIM. Puede ser útil comparar este
crecimiento con el de las placas de referencia.
Para preparar el inóculo, se suspende el crecimiento de
un subcultivo de 24 horas en agar GC o agar de Mueller-
12.11 Conservación de las cepas
Hinton enriquecido (similar al medio de aislamiento pero
sin vancomicina) en caldo con triptona y soja (TSB) Para mantener la viabilidad de las cepas de H. ducreyi
hasta alcanzar una densidad de unidades formadoras en el laboratorio, es necesario hacer subcultivos cada
de colonias (UFC) de 108 por mililitro. Las colonias de 4 días. Las cepas también pueden conservarse hasta 4
H. ducreyi a menudo son tan cohesivas que no puede semanas si se inoculan y cultivan por picadura en agar
obtenerse una suspensión homogénea, ni siquiera chocolate enriquecido. Para periodos de mantenimiento
después de agitar vigorosamente en un agitador vorticial. de varios meses, las suspensiones en leche desnatada
Mediante una jeringa con aguja de calibre 25G naranja pueden conservarse congeladas a ‑70 °C. En lo que
se dispersan los agregados, extrayendo la suspensión se refiere a la conservación a largo plazo, se puede
y echándola a chorro en repetidas ocasiones, lo cual hacer una suspensión de las cepas en un medio de
ayuda a crear una suspensión más homogénea, además crioconservación —como suero de bovino fetal más
de ser un procedimiento menos destructivo para los dimetilsulfóxido al 10% o leche desnatada más glicerol al
bacilos. La centrifugación a velocidad baja (500 g) puede 20%— y conservarla en nitrógeno líquido.
ser útil para sedimentar grandes agregados. Luego se
compara la densidad del sobrenadante con el patrón
12.12 Cuestiones médico-legales
0,5 de McFarland (108 UFC/ml). Se diluye la suspensión
en caldo de triptona y soja (1:10) para obtener 107 El chancro blando siempre debe considerarse una ITS,
UFC/ml y se ponen 0,5 ml de esta dilución en el pocillo salvo en los raros casos en que la infección se haya
correspondiente de un sembrador replicador. contraído en el laboratorio.
12.13 Referencias
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Transmitted Infections, 2000, 76(2):137-141.
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Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, and herpes
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Chancro blando 149

Capítulo 13
Donovanosis (granuloma inguinal)
13.1 Introducción
La donovanosis, también denominada granuloma histológicos teñidos procedentes de biopsias de tejidos.
inguinal, es una infección crónica que afecta a la piel, Este microorganismo solo puede cultivarse con dificultad
las mucosas y el sistema linfático de los genitales y la en centros especializados que utilizan cultivos de
región perineal (1). La donovanosis se produce en una monocitos y células Hep-2; todavía no puede cultivarse
zona geográficamente limitada, como Brasil, el Caribe, en medios artificiales. Se han publicado casos de
India, Papua Nueva Guinea y el África meridional. Esta realización de ensayos internos de amplificación de
enfermedad, cuya infectividad es baja, se transmite ácidos nucleicos, pero en la mayoría de los países
entre los seres humanos principalmente por contacto estas pruebas no se pueden utilizar en el diagnóstico
sexual. El periodo de incubación puede ser prolongado, ordinario (3).
y oscila entre 1 y 12 semanas. La enfermedad comienza
como un nódulo subcutáneo indurado que erosiona 13.3 Recogida de muestras
la superficie de la piel, formando una úlcera
Antes de obtener un frotis del material de la úlcera,
granulomatosa hipertrófica de tono rojo oscuro y
se toma un hisopo con punta de algodón y se hace
con un borde bien definido. La lesión sangra fácilmente
girar con los dedos, pasándolo suavemente por toda la
con el contacto. La úlcera evoluciona lentamente
lesión para eliminar los exudados debidos a la infección
y se vuelve dolorosa si se produce una infección
o los detritos, de manera que se reduzca al mínimo la
bacteriana secundaria; esta infección secundaria por
hemorragia. Se toma un segundo hisopo y, girándolo
otros microorganismos puede contribuir a los restos
con los dedos, se pasa por la base de la úlcera,
necróticos de la úlcera. En ocasiones se forman lesiones
comprobando que se hace un buen muestreo de los
nuevas por autoinoculación, y los ganglios linfáticos
bordes de la úlcera, donde es más probable encontrar
inguinales pueden aumentar de tamaño debido a la
los cuerpos de Donovan. Luego se extiende por igual en
infección secundaria (seudobubones). La donovanosis
un portaobjetos de cristal; el aire seca el portaobjetos
puede diseminarse por vía hematógena a los huesos,
antes de transportarlo al laboratorio. Cabe señalar que
las articulaciones y el hígado; la difusión también puede
dar lugar a lesiones cutáneas en zonas extragenitales. algunos profesionales prefieren utilizar pinzas para
Las lesiones genitales y perianales en diversos estadios biopsia en sacabocados para obtener un pequeño
se asemejan a veces a las lesiones que se observan en trozo de tejido, que luego se presiona, se extiende en
otras enfermedades, como la sífilis, el chancro blando, los un portaobjetos de vidrio y se seca al aire. El frotis
carcinomas y la amebiasis. realizado mediante la técnica de aplastamiento facilita
la interpretación microscópica y aumenta el valor
La donovanosis está causada por Klebsiella diagnóstico.
(anteriormente Calymmatobacterium) granulomatis, una
bacteria gramnegativa (1,5 µm × 0,7 µm) que puede 13.4 Microscopia
observarse en el interior de vacuolas en grandes células
Se ha descrito un método de Giemsa sencillo y
histiocíticas; este corpúsculo intravacuolar se conoce
rápido (1 minuto) (4). Con este método de tinción,
como “cuerpo de Donovan” (1, 2).
el portaobjetos se sumerge cinco veces en un fijador,
seis veces en una solución de eosina y seis veces en
13.2 Aspectos generales del diagnóstico de
una mezcla de colorante tiazínico, y luego se enjuaga
laboratorio con tampón fosfato a pH 6,8. Se puede emplear una
El diagnóstico de laboratorio depende de la tinción de Giemsa al 10% o una tinción de Leishman con
visualización de los cuerpos de Donovan en frotis una dilución similar como alternativa después de fijar el
teñidos obtenidos de las lesiones clínicas o en cortes material en el portaobjetos con metanol durante 2 a 3
Donovanosis (granuloma inguinal) 151

minutos. Se cubre el portaobjetos durante 10 minutos con
la tinción diluida (tinción de Leishman) o hasta 30 minutos
(tinción de Giemsa), y luego se enjuaga el portaobjetos
con un chorro de agua amortiguada o de solución
salina tamponada con fosfato (pH 7,0-7,2). Después
de esto, se deja que el portaobjetos se seque al aire
y a continuación se examina en el microscopio óptico
empleando la inmersión en aceite (aumento de 1000×).
Los cuerpos de Donovan aparecen como cocobacilos
dentro de grandes vacuolas (25-90 µm de diámetro) en
Figura 13.1
el citoplasma de histiocitos grandes y ocasionalmente
Frotis del material de una úlcera que contiene
en células plasmáticas y leucocitos polimorfonucleares. monocitos y cuerpos de Donovan (tinción de Giemsa;
Los microorganismos aparecen con una coloración 1000×)
entre azul y violeta, y a menudo están rodeados por
una cápsula prominente entre translúcida y de color
13.6 Cultivo
rosa acidófilo (fig. 13.1). Las bacterias características
se asemejan a imperdibles cerrados. A menudo se Tras un artículo de 1962 que describía el cultivo
observa contaminación por otras bacterias. Aunque de K. granulomatis en las heces, se demostró
la microscopia de los frotis de las úlceras es la manera posteriormente que era muy difícil cultivar el
convencional de diagnosticar la donovanosis, los cuerpos microorganismo a partir de muestras clínicas (1,
de Donovan también se han identificado mediante la 7 ). En 1997, dos grupos informaron de la multiplicación
prueba de Papanicolaou que se emplea en el tamizaje satisfactoria de K. granulomatis utilizando diferentes
ordinario del cáncer del cuello uterino mediante citología sistemas de cultivo: un sistema de cocultivo de
cervicovaginal (5). monocitos y una técnica modificada de cultivo
de clamidias (8, 9). Aparte de las técnicas que se
13.5 Histopatología presentan en estos dos artículos, no existe ninguna otra
técnica de cultivo in vitro para el aislamiento de
El examen histológico de una muestra de biopsia puede
K. granulomatis. Sin embargo, este microorganismo
ser útil para hacer el diagnóstico diferencial entre la
puede cultivarse mediante la siembra de muestras
donovanosis y otras infecciones. Una úlcera con un
clínicas en el saco vitelino de huevos de gallina
infiltrado inflamatorio mixto de células plasmáticas,
embrionados de 5 días (10). El microorganismo es
neutrófilos e histiocitos, y ausencia evidente de linfocitos,
detectable al cabo de 72 horas de incubación.
indica una donovanosis. Con unas pinzas para biopsia
en sacabocados se toma una porción de tejido (3-5 mm
13.7 Nucleic acid amplification
de grosor) del borde de la lesión, y se coloca en un
frasco con solución salina y formaldehído como fijador. A research-based diagnostic polymerase chain reaction
El diagnóstico se confirma si se evidencia la presencia (PCR) has been developed, which targets the phoE gene
de los cuerpos de Donovan mediante la técnica de and incorporates post-amplification HaeIII restriction
impregnación con plata de Warthin-Starry (6). Se deben enzyme-based digestion of amplicons (3). This method
hacer cortes de 6 µm de muestras de biopsia incluidas has been refined further into a colorimetric PCR test (11).
en parafina. Después de desparafinar e hidratar con
agua destilada, los cortes se fijan en un portaobjetos 13.8 Serological tests
de vidrio con glicerol, se secan y se tratan con No serological assays are currently available to assist
solución ácida de nitrato de plata a 43 ºC durante 30 with diagnosis.
minutos. Se lava con agua caliente, se enjuaga con
agua destilada, se deshidrata en etanol a 95% y se 13.7 Amplificación de ácidos nucleicos
aclara con xileno. En laboratorios de investigación se ha desarrollado una
reacción en cadena de la polimerasa (RCP) diagnóstica,
dirigida al gen phoE y que incorpora la digestión de
amplicones con la enzima de restricción HaeIII posterior
a la amplificación (3). Este método se ha refinado más, 6. Freinkel AL. Histological aspects of sexually
dando lugar a una RCP colorimétrica (11). transmitted genital lesions. Histopathology, 1987,
11(8):819-831.
13.8 Pruebas serológicas 7. Goldberg J. Studies on granuloma inguinale. V. Isolation

of a bacterium resembling Donovania granulomatis from
Actualmente no se dispone de ningún ensayo serológico the faeces of a patient with granuloma inguinale. British
que ayude a realizar el diagnóstico. Journal of Venereal Diseases, 1962, 38(2):99-102.
8. Kharsany AB et al. Growth and cultural characteristics

13.9 Referencias of Calymmatobacterium granulomatis - the aetiological
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reclassification of Calymmatobacterium granulomatis as donovanosis (Calymmatobacterium granulomatis) in
Klebsiella granulomatis comb nov. International Journal HEp-2 cells. Journal of Clinical Microbiology, 1997,
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for donovanosis. Clinical Infectious Diseases, 1999, etiologic consideration of Donovania granulomatis
28(5):1168-1169. cultivated from granuloma inguinale (three cases) in
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identification of Donovan bodies in granuloma inguinale.
Acta Cytologica, 1984, 28(2):126-128.
Donovanosis (granuloma inguinal) 153

Capítulo 14
Infecciones por los virus de los papilomas humanos
14.1 Virus de los papilomas humanos
Los virus de los papilomas humanos (VPH) son virus conglomerados pequeños se denominan especies y se
pequeños (~55 nm de diámetro), icosaédricos, sin les asigna un número. Por ejemplo, el género de los
envoltura conformados por un genoma circular y papilomavirus contiene las especies 9 y 7 que incluyen
superhélice de doble hebra de DNA de aproximadamente respectivamente las dos causas más frecuentes del
8 kilobases (fig. 14.1). Estos virus infectan habitualmente cáncer cervicouterino, el VPH de genotipo 16 y 18 (2).
la piel y las superficies mucosas de los seres humanos
Existen más de 200 tipos diferentes, de los cuales 100
(1). A diferencia de la mayoría de los virus humanos, los
se han secuenciado integralmente y 40 se sabe que
papilomavirus no se pueden propagar in vitro en el medio
infectan específicamente la mucosa genitoanal de los
de cultivo habitual y, por consiguiente, no permiten una
seres humanos (VPH mucosótrofo).
clasificación antigénica clásica por serotipificación.
En su lugar, estos virus se identifican mediante una Los tipos de VPH que se detectan con frecuencia en la
estrategia de genotipificación. Los VPH individuales zona genitoanal se subdividen en VPH de bajo riesgo
se denominan tipos o genotipos, se diferencian por su y VPH de alto riesgo, con base en el riesgo relativo de
secuencia genómica y se numeran en el orden de su aparición de una complicación infrecuente, que es la
descubrimiento. El gen L1 que codifica el componente neoplasia maligna (3). Los tipos de VPH de bajo riesgo
principal de la cápside viral (fig. 14.2) es la región más se suelen encontrar en las lesiones intraepiteliales de
conservada en todos los tipos del virus y se usa en grado bajo (lesiones que no son precancerosas) y en
taxonomía en la construcción de los árboles filogénicos las verrugas genitoanales. Los VPH de tipos 6 y 11
(fig. 14.3) (2). Los VPH cuya secuencia de L1 presenta causan cerca de 90% de las verrugas genitales (4, 5).
una divergencia de 2% a 10% se conocen como Los VPH de alto riesgo se encuentran en las lesiones
subtipos y los que poseen una divergencia de menos de bajo grado y alto grado, y también en los cánceres
de 2% son las variantes. El término “género” se aplica de cuello uterino y de otras localizaciones genitoanales
a los conglomerados de mayor orden y se denominan (vulva, vagina, ano) (6). En conjunto, el VPH 16 y el 18 se
siguiendo el abecedario griego y, dentro del género, los
P97
URR
E6
E7
MY11 MY09
E1
L1
HPV
L2 E2
E4
E5
Figura 14.1
Microscopia electrónica de VPH natural donde se Figura 14.2
aprecian las partículas virales en algunas células de Organización génica del VPH (48)
una preparación de frotis de Papanicolaou Región reguladora hacia la región 5’.
Fuente: Por cortesía de Colin Laverty, Sídney, Nueva Fuente: Reimpreso con autorización de la Organización
Gales del Sur (Australia), 1978. Mundial de la Salud (OMS).
Infecciones por los virus de los papilomas humanos 155

Género Papiloma virus a
Género Papiloma virus-b
Papiloma virus d
Papiloma virus g
Papiloma virus e
Papiloma virus z
Papiloma virus p
Papiloma virus h
Papiloma virus o
Papiloma virus m Papiloma virus x
Papiloma virus Q Papiloma virus l
Papiloma virus k
Papiloma virus n
Papiloma virus i
Figura 14.3
Árbol filogénico que contiene las secuencias de L1 de 118 tipos de papilomavirus (2)
Fuente: Reimpreso con autorización de Virology.
encuentran de manera constante en cerca de 70% de la edad temprana del primer parto y los estados que
todos los casos de cáncer cervicouterino en el mundo provocan inmunodepresión como la coinfección por el
(7-11). Aparte de los cánceres de la esfera genitoanal, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (17 ). No
los VPH oncógenos, sobre todo del tipo 16, desempeñan se ha definido aun si existen factores específicos del
un papel causal en algunos cánceres bucofaríngeos, en huésped u otros factores ambientales que determinen
especial en los cánceres de la amígdala (12, 13). las lesiones destinadas a evolucionar hacia lesiones
precancerosas o neoplasias (18).
14.2 Evolución natural de la infección genital
En general, la transmisión del VPH genital ocurre
por el VPH fácilmente por contacto sexual directo con una persona
La mayoría de las infecciones genitales por el VPH infectada y se calcula que da lugar a tasas de infección
se adquiere por vía sexual, es transitoria y regresa vitalicia del VPH hasta de 60% a 80% (piel genital con
lentamente como consecuencia de la respuesta del piel genital) (19, 20). La mediana de la edad de la primera
sistema inmunitario del huésped (14). Con menor relación sexual en muchos países occidentales como
frecuencia, en cerca de 5% a 10% de los casos, las Australia, el Reino Unido y los Estados Unidos es 16
infecciones por VPH se vuelven persistentes. El VPH de años (19, 21). Por consiguiente, las tasas más altas de
alto riesgo persistente es un marcador indicativo de la infecciones por VPH recién contraídas se observan en las
probabilidad de aparición de afecciones precancerosas; mujeres jóvenes, con un valor máximo a una edad poco
cuando estas lesiones no se tratan comportan el después del comienzo de la actividad sexual; se calcula
riesgo de progresión hacia el cáncer con el transcurso que hasta 75% de las infecciones por VPH ocurren en las
de los años (15, 16). Los cofactores reconocidos que mujeres de 15 a 24 años de edad. Según datos recientes,
favorecen la aparición de la infección persistente y el muchas infecciones nuevas en las mujeres jóvenes sin
cáncer cervicouterino son el tabaquismo, el uso de contacto previo con el VPH consisten en infecciones
anticonceptivos orales a largo plazo, la multiparidad, múltiples (se detectan múltiples tipos del VPH) (22).
Se cuenta con menos información acerca de la evolución 14.4 Manifestaciones de la enfermedad
natural de la infección por el VPH en los hombres. De
nuevo, la infección es muy frecuente (piel peneana, Verrugas genitoanales
genital o anal) y ocurre poco después del inicio de la vida Las verrugas genitoanales, que se conocen también
sexual activa, con tasas rápidas de adquisición del virus como condiloma acuminado, consisten en tumores
y de regresión (23, 24). Además, el comportamiento benignos exofíticos, papulares o planos que pueden
sexual con un mayor número de compañeros sexuales ocurrir en cualquier lugar de la zona genitoanal. Son
aumenta el riesgo y la circuncisión ejerce un efecto extremadamente frecuentes sobre todo en los jóvenes
protector (24). que comienzan su actividad sexual y el diagnóstico es
en gran medida clínico. En raras ocasiones las lesiones
14.3 Características inmunológicas de la pueden provocar trastornos por causa del tamaño o
infección por el VPH por obstrucción, pero los principales problemas son
cosméticos y psicosociales. Las lesiones tienden a
En la respuesta inmunitaria del huésped al VPH participa
reaparecer después del tratamiento. Los VPH de tipos
el compartimiento humoral y la inmunidad mediada por
6 y 11 causan la mayoría de las verrugas genitoanales
células. A continuación de las infecciones naturales,
(85% a 90%) (5).
la respuesta humoral de producción de anticuerpos es
específica del tipo y se detecta por primera vez entre
Papilomatosis respiratoria recurrente
6 meses y 18 meses después de la infección (14). La
respuesta es débil y solo alrededor de 50% a 60% de La papilomatosis respiratoria recurrente es una
las personas que presentan una respuesta positiva al afección muy rara que se caracteriza por tumores
recurrentes semejantes a verrugas (papilomas) en las
DNA del VPH generan una respuesta de anticuerpos
vías respiratorias superiores, pero se pueden localizar en
cuantificable (14). Después de la infección natural, la
las vías respiratorias inferiores y ocasionar morbilidad
persona puede seguir teniendo resultados positivos al
y mortalidad considerables. Los VPH de tipos de 6 y 11
DNA del VPH a pesar de haber desarrollado anticuerpos
causan gran parte de estas lesiones. La localización
específicos; estas personas no están protegidas contra
más frecuente es la laringe y provoca cambios de la
la enfermedad por este tipo de VPH en el futuro. La
voz. En los niños pequeños, puede ocurrir obstrucción
regresión de la infección por el VPH y la resolución
de las vías respiratorias. El diagnóstico se establece
de las lesiones clínicas como las verrugas genitales
por criterios clínicos, con la observación de las lesiones
se caracterizan por una respuesta inmunitaria eficaz
verrugosas características mediante laringoscopia
mediada por células (25).
o broncoscopia. Las lesiones son benignas, pero
La serología del VPH no se usa como medio diagnóstico. reaparecen con frecuencia después del tratamiento.
La serovigilancia es útil con el fin de calcular la edad Existen dos modos de presentación: la forma de
y la prevalencia de la exposición en una población aparición juvenil en los niños (la media de la edad es 2
en situaciones previas a la vacunación. El examen años) y la forma de aparición tardía que se observa en
serológico pos vacunación se usa como una medida los adultos (28).
de eficacia de la vacuna. La protección consiste en la
presencia de anticuerpos neutralizantes detectables, Afecciones precancerosas y los carcinomas
aunque no se comprende a cabalidad el mecanismo genitoanales
real de protección. Los estudios en modelos animales La infección persistente por los genotipos oncógenos
con papilomavirus específicos del huésped ponen en o los VPH de alto riesgo se ha asociado de manera
evidencia anticuerpos neutralizantes de la infección estrecha con un mayor riesgo de cáncer genitoanal.
primaria que son protectores, incluso después de una Este aspecto se ha estudiado mejor en el cuello uterino,
nueva exposición al virus respectivo (26). Es digno de donde se definieron por primera vez los criterios de
mención que aunque se ha documentado en los ensayos detección citológica e histológica de las afecciones
humanos una durabilidad de los anticuerpos inducidos precancerosas lentamente progresivas. La nomenclatura
por la vacuna más allá de 8 años, no se ha definido aun ha cambiado a lo largo de los años y continúa
un correlato inmunitario de la protección (27 ). evolucionando. Las lesiones precursoras de cáncer se

Cuadro 14.1: Cáncer atribuible al VPH en el 2002
De los cuales Ambos sexos

son positivos % todos % todos
Atribuible al al VPH 16 o 18 Total de los Atribuible los Atribuible al los
Localización VPH (%) (%) cánceres al VPH cánceres VPH 16 o 18 cánceres
Cuello uterino 100 70 492 800 492 800 4,54 344 900 3,18
Pene 40 63 26 300 10 500 0,10 6 600 0,06
Vulva y vagina 40 80 40 000 16 000 0,15 12 800 0,12
Ano 90 92 30 400 27 300 0,25 25 100 0,23
Boca 3 95 274 300 8 200 0,08 7 800 0,07
Oro-pharynx 12 89 52 100 6 200 0,06 5 500 0,05
Todas las
localizaciones 10 862 500 561 100 5,17 402 900 3,71
Fuente: Adaptado de Parkin DM. The global burden of infection-associated cancers in the year 2002. International Journal of Cancer, 2006,
118:3030-3044.
han denominado displasias (leve, moderada y grave) o localizaciones genitoanales y de la orofaringe (la base de
neoplasias intraepiteliales cervicouterinas (NIC1, 2 y la lengua y las amígdalas), con lo cual genera una carga
3) y, últimamente, se denominan lesiones escamosas de morbilidad considerable (cuadro 14.1).
intraepiteliales de alto (LIAG) o de bajo grado (LIBG) (29).
La proporción de carcinomas que presentan el VPH
La terminología en otras localizaciones anatómicas sigue
difiere con cada localización y el VPH 16 predomina
el mismo modelo: anal (NIA), vulvar (NIV), vaginal (NIVa),
especialmente en los carcinomas diferentes del cáncer
peneana (NIP). En cada caso, las lesiones precursoras
cervicouterino.
(de alto grado o de grado 3) son asintomáticas,
progresan lentamente y se diagnostican mediante el
14.5 Procedimientos de detección del VPH
examen histológico. Solo se recomienda la detección
en el laboratorio
sistemática de las lesiones cervicouterinas, pero se
están evaluando métodos de detección de las lesiones Las pruebas del VPH se basan en técnicas moleculares.
anales (30). En la actualidad, solo se recomienda el Como se señaló anteriormente, esto se debe a la
tratamiento de las lesiones precursoras (de alto grado). imposibilidad de cultivar este virus mediante los métodos
clásicos y a la sensibilidad relativamente baja de la
Existen datos fidedignos de laboratorio y epidemiológicos serología. Las técnicas de las pruebas que se utilizan
sólidos que vinculan el VPH al cáncer cervicouterino, y con fines de vigilancia epidemiológica son diferentes de
los VPH de alto riesgo y persistentes se consideran un las usadas en las aplicaciones clínicas. Los métodos
factor causal necesario, pero no suficiente del cáncer epidemiológicos requieren pruebas específicas del tipo
cervicouterino. Cuando no existe infección por el VPH, el con alta sensibilidad analítica. Dado que las evaluaciones
cáncer cervicouterino es extremadamente improbable; clínicas usan la presencia del VPH como un marcador
este vínculo estrecho es la razón por la cual la vacuna de enfermedades subyacentes, sus resultados se
tiene como objeto evitar las infecciones más frecuentes asimilan a los criterios de valoración en los estudios
por VPH oncógenos, a fin prevenir el cáncer y también es de enfermedades. No existe ningún tratamiento contra
la razón por la cual el examen del VPH puede contribuir el VPH en sí mismo; los tratamientos se dirigen contra
al tamizaje del cáncer cervicouterino. Las vacunas las lesiones precursoras del cáncer que se asocian con
existentes contra el VPH se dirigen contra los VPH de alto el VPH o contra otras lesiones relacionadas con este
riesgo de tipos 16 y 18, los cuales explican el 70% de virus. Se cuenta con una amplia variedad de pruebas
casos de cáncer cervicouterino en el mundo (7-11). Los diagnósticas del VPH comerciales y desarrolladas
datos epidemiológicos con respecto a otros carcinomas internamente por los laboratorios. La aplicación de
que se asocian con el VPH son menos definitivos, pero estas pruebas en los entornos clínicos exige que los
se atribuyen también al virus carcinomas de otras laboratorios practiquen pruebas que han sido validadas
Normal Atipias escamosas de Lesiones escamosas intraepiteliales de
significado indeterminado bajo grado
o limítrofe
Lesiones escamosas Coilocitos

intraepiteliales de alto
grado
Figura 14.4
Citología vaginal de células normales exfoliadas que presentan coilocitosis, característica pero no
patognomónica de infección por el VPH, atipias escamosas de significado indeterminado, LIE de bajo grado y
cambios celulares de LIE de alto grado.
por los organismos reguladores con indicaciones • La selección de las mujeres con anomalías mínimas
clínicas específicas o que los laboratorios emprendan en la citología (no concluyentes, dudosas o limítrofes),
la validación del desempeño clínico de las pruebas. Al con el fin de discriminar los cambios que se
considerar que las lesiones precursoras de cáncer se relacionan verdaderamente con el VPH y precisan
asocian solo con el VPH de alto riesgo, no hay ninguna seguimiento (37 ).
indicación clínica de practicar pruebas dirigidas al VPH • El tratamiento posresección de las displasias de
de bajo riesgo. Existe cierta variación con respecto a los alto grado y la vigilancia de las mujeres en busca
tipos de VPH de alto riesgo con significación clínica, pero de signos de enfermedad persistente o recurrente y
la mayoría de las pruebas incluyen (o presentan reacción como una prueba de curación (32, 38).
cruzada) con los siguientes 14 tipos: 16, 18, 31, 33, 35,
En este momento se está evaluando el uso del VPH como
39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68.
medio primario de detección del cáncer cervicouterino
14.6 Aplicación clínica de las pruebas de (39). En la actualidad, si bien la prueba del VPH
constituye un excelente factor pronóstico negativo de
detección del VPH
la enfermedad, el examen carece de la especificidad
Las aplicaciones clínicas de las pruebas de detección del exigida con fines de tratamiento directo. La citología
VPH incluyen las siguientes situaciones: cervical es una opción para una segunda prueba. Otras
pruebas moleculares están en curso de evaluación, como
• El tamizaje primario solo o asociado con la citología
el factor p16INK4a del huésped (p16), que es un inhibidor
cervical (fig. 14.4) en las mujeres a partir de los 30
de la quinasa dependiente de ciclina.
años de edad. Los estudios longitudinales revelan
que la prueba del DNA del VPH tiene una mayor Una alta concentración de p16 está en favor de la
sensibilidad en el pronóstico de la displasia prevalente supresión del control por retroalimentación negativa
o que puede evolucionar más tarde hacia displasia que ejerce el gen pRB del retinoblastoma. Cuando
de alto grado. Además, el valor pronóstico de un las proteínas oncógenas E7 del VPH se fijan al pRB,
resultado negativo es extremadamente alto y superior se sobreexpresa el gen p16 y aumenta el p16, lo cual
al de la citología. Por consiguiente, se propone que corresponde a una expresión activa de los oncogenes
en las personas con un resultado negativo al DNA del del VPH (40) (fig. 14.5). Además, la sobreexpresión de
VPH en dos ocasiones, se prolongue el intervalo de la p16, aunada a una mayor expresión de otros factores
detección sistemática. Esta observación hace que la del huésped como el Ki67, se correlaciona bien con
asociación del frotis de Papanicolaou y la prueba del las infecciones virales que inducen transformaciones
DNA del VPH sea una estrategia costoeficaz (31-36). malignas (fig. 14.6) (41).

14.7 Métodos de detección del DNA del VPH Además, existe una versión de la técnica apropiada para
los entornos de escasos recursos, que exige un mínimo
Los métodos clásicos de detección del DNA del VPH
de equipo y capacitación, y se practica como una prueba
fueron las pruebas directas de hibridación como la
rápida (43).
inmunotransferencia por puntos y la transferencia de
Southern. Estas técnicas exigen mano de obra intensa, Aunque durante mucho tiempo se utilizó solo en
son lentas, presentan una baja sensibilidad y requieren investigación, esta prueba inmediata del VPH está
grandes cantidades de DNA en las muestras clínicas. hoy al alcance en la práctica clínica. En un estudio de
Las aplicaciones clínicas actuales consisten en pruebas gran escala realizado en la China la sensibilidad de
muy bien normalizadas que simplifican la manipulación la prueba en las NIC2+ fue 90% y no se observó una
de las muestras, cuyo método se basa en alguna forma diferencia significativa al compararla con la prueba HC2;
de amplificación. En el cuadro 14.2 se enumeran las en consecuencia, esta técnica representa un método
pruebas autorizadas actualmente por la Administración promisorio de detección primaria en la prevención del
de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos (FDA). cáncer cervicouterino en las regiones con escasos
recursos (43).
La prueba de captura de híbridos (HC2), elaborada
por Digene (Qiagen), se utilizaba ampliamente en los Los resultados de las pruebas no diferencian los genotipos
primeros estudios y fue la primera prueba autorizada de alto riesgo que están presentes, pero el informe indica
por la FDA. La prueba HC2 consiste en un ensayo la presencia de uno o varios tipos incluidos en la prueba.
semicuantitativo que ofrece muy buena comparabilidad Recientemente, en una evaluación de diversas pruebas de
reacción en cadena de la polimerasa (RCP) destinadas al
entre los laboratorios y un alto valor pronóstico de un
tamizaje primario y la detección precoz de las lesiones de
resultado negativo con respecto a las NIC2 y 3 (42).
alto grado, se comunicó una alta sensibilidad cercana a
96% con la amplificación de secuencias selectivas, en el
diagnóstico de NIC2+ subyacentes (34, 44). Por ejemplo,
la prueba del VPH COBAS 4800 autorizada hace poco por
la FDA, que comporta una preparación automatizada de
las muestras, aunada a la tecnología de RCP en tiempo
real y detecta el VPH de tipo 14 de alto riesgo en un tubo
único, aventajó la prueba de captura de híbridos, pues su
sensibilidad y especificidad clínica demostraron ausencia
de inferioridad frente a la prueba HC2 (44). De manera
análoga, según los resultados finales de un ensayo
poblacional comparativo y aleatorizado (POBASCAM
por la sigla en inglés de Population-Based Screening
Amsterdam) publicados recientemente, una RCP dirigida
a L1 (GP5+/6+) facilitó la detección más temprana de
NIC2 o más graves, con importancia clínica, con lo cual
se respalda el uso de las pruebas de DNA en todas las
mujeres a partir de los 29 años de edad (34). Las pruebas
de RCP con cebadores generales dirigidos a la región
consensual de L1 en el genoma del virus se denominan
pruebas RCP de consenso L1. Cada prueba usa diferentes
Figura 14.5
cebadores: MY09 y MY11, reemplazados luego por
El p16 no se expresa en los tejidos normales, pero se
PGMY09 y PGMY11, cuyo resultado es un amplicón de
expresa en forma progresiva con la evolución de las
NIC1 hacia NIC3. 450 pb (45); otros pares de cebadores descritos son
Fuente: Reimpreso con autorización de Magnus von GP5+ y GP6+ que producen un amplicón de cerca de
Knebel Doeberitz, Departamento de Biología Tumoral 160 pb (46) y el SPF10 que genera un amplicón corto de
Aplicada, del Instituto de Anatomía Patológica, 65 pb (47). El sistema PGMY09 y PGMY11 se comercializa
Universidad de Heidelberg, Heidelberg (Alemania). como prueba de genotipado del VPH en matriz lineal
Persistencia de LIAG Regresión de LIAG
LIAG: lesión intraepitelial de alto grado;

LIBG: lesión intraepitelial de bajo grado.
Evolución de LIAG
Porcentaje de núcleos positivos a p53 en la mitad
Regresión
Persistencia
profunda del epitelio
Porcentaje de núcleos positivos a la proteína del

retinoblastoma en la mitad profunda del epitelio
Figura 14.6
Diversos marcadores de riesgo de padecer LIAG, provenientes del huésped y del virus. Centro: Gráfico de
dispersión de la detección de la proteína del retinoblastoma (pRb) y del p53 en la mitad inferior del epitelio
de LIAG que persisten (triángulos rojos) o que regresan (círculos abiertos azules) durante el seguimiento.
Izquierda: LIAG persistente. Derecha: LIBG en regresión (41).
Fuente: Reimpreso con autorización del American Journal of Surgical Pathology.
Cuadro 14.2: Pruebas del VPH autorizadas por la FDA
Prueba Fabricante Método Tipos (diana)

Captura de híbridos Qiagen (Valencia, CA, EUA.) Amplificación de señal Tipo 13 de alto riesgo
(HC2) (DNA genómico)
Cervista VPH de alto Hologic (Bedford, MA, EUA.) Amplificación con sonda Tipo 14 de alto riesgo
riesgo (Invader Technology) (DNA patentado)
Cervista VPH 16 y 18 VPH de tipos 16 y 18
APTIMA VPH GenProbe (San Diego, CA, EUA.) Amplificación de secuencia Tipo 14 de alto riesgo
selectiva (amplificación (RNA de E6 y E7)
mediada por transcripción)
Cobas VPH Roche (Pleasanton, CA, EUA.) Amplificación de secuencia Tipo 14 de alto riesgo
selectiva (RCP) (DNA de L1)
FDA: Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos; VPH: virus de los papilomas humanos; RCP: reacción en cadena de la
polimerasa.

(Lineal Array, Roche); el sistema de SPF se conoce como con estas recomendaciones. El uso de las pruebas
el genotipado del VPH INNO-LiPA HPV v2 (Innogenetics); comerciales no exime a los laboratorios de la necesidad
los sistemas GP5+ y GP6+ se aplican en la prueba de de ejecutar métodos cuidadosos de garantía de la
genotipado del VPH RUO LQ (Qiagen) o el estuche de calidad y de control de calidad. La incorporación de
genotipado múltiple del VPH, Multiplex HPV (Multimetrix, líneas celulares como testigo positivo y negativo en la
Heidelberg). Con los tejidos incluidos en parafina, sobre prueba contribuye a la supervisión de los resultados. Es
todo las biopsias de archivo, se prefieren las pruebas que primordial procesar soluciones blanco, compuestas por
detectan amplicones cortos con cebadores SPF, en caso agua en todas las etapas de la prueba a fin de vigilar
de que el DNA esté degradado. la obtención de resultados positivos falsos que pueden
ocurrir por una contaminación cruzada de las muestras.
A fin de obtener información más detallada sobre cada
una de las pruebas, se remite el lector al manual sobre Algunas pruebas incluyen una secuencia diana endógena
el VPH de la Organización Mundial de la Salud (OMS), en de las células del huésped, como la a globina, con el
el cual se exponen de manera pormenorizada todos los objeto de confirmar la presencia de DNA apto para
procedimientos, incluida la descripción de los cebadores, la amplificación. Las muestras que dan resultados
los testigos apropiados, los medios de prevención de la negativos con la secuencia endógena y con el VPH no
contaminación, la interpretación de datos, etc. (48). se pueden interpretar. Las pruebas autorizadas en la
práctica clínica comportan pautas de supervisión y
Pruebas de mRNA del VPH notificación. También es posible utilizar como medio
de diagnóstico corriente las pruebas desarrolladas
Además de las pruebas basadas en el DNA, existen otros
internamente y bien verificadas en el laboratorio. Cuando
sistemas que detectan la expresión del RNA mensajero
se cuenta con una prueba comercial autorizada, las
(mRNA) de los oncogenes E6 y E7 (49, 50).
autoridades de certificación recomiendan su uso. Una
En los apartados a continuación se analizan los de las ventajas de usar las pruebas comerciales es
principios de estas pruebas moleculares (51). que estos sistemas suelen incluir reactivos de calidad
controlada, además de los testigos apropiados.
Etapa preanalítica
Es primordial contar con muestras clínicas adecuadas Garantía de la calidad del laboratorio
y prepararlas de manera óptima a fin de obtener un Se debe cumplir con las prácticas microbiológicas
resultado exacto. Las pruebas idóneas para la detección óptimas, incluidos los testigos positivos y negativos
del VPH incluyen los hisopos, los raspados y las idóneos. La participación en las baterías de pruebas
biopsias. Una manipulación apropiada de los hisopos de competencia y en los programas de garantía de
exige su transporte en forma seca o en un medio de la calidad es primordial con el fin de determinar el
transporte de virus, pero los raspados y las biopsias desempeño de la prueba y se debe hacer todo lo posible
se deben recoger en medio de transporte de virus. La por tomar parte en estos programas con cada analito.
muestra puede estar a temperatura ambiente durante
el transporte hasta un lapso de 24 horas o a 4 °C hasta Pruebas con fines epidemiológicos y de
4 días. Las pruebas autorizadas por la FDA especifican investigación
los métodos de obtención y almacenamiento de las En los estudios epidemiológicos y de investigación se
muestras, y los resultados no se consideran válidos usan numerosas pruebas comerciales y de desarrollo
cuando no se respetan estas condiciones. interno de los laboratorios. Las pruebas exhiben
diferencias en sus características de desempeño como
Etapa analítica lo destacan los estudios de competencia sobre la
Después de la toma de las muestras, se debe practicar tipificación del VPH a escala mundial (52). En el cuadro
la extracción o la liberación del ácido nucleico de las 14.3 se presentan ejemplos de las pruebas comerciales
muestras. Las pruebas autorizadas por la FDA definen existentes que se basan en el DNA o el mRNA. Es
los métodos de procesamiento o extracción que precisa preciso incitar a los laboratorios que procuran datos
cada una. Los resultados no se consideran válidos sobre la vigilancia de la respuesta a la vacunación a
cuando la extracción o el procesamiento no cumplen que sigan las pautas del manual de laboratorio sobre el
Cuadro 14.3: Diversas pruebas del VPH disponibles, y normalizados; desarrollar sistemas de control de la
con el nombre, la diana y el cebador calidad y pruebas de competencia; capacitar al personal;
y poner en servicio una red de vigilancia. Esta red de
Tipo de prueba del VPH Región selectiva del
la OMS se financió mediante una subvención de la
VPH (cebador)
Fundación Gates y estuvo en funcionamiento bajo el
Todas las pruebas L1/E1/E6/E7 auspicio de la OMS del 2006 al 2010. Durante estos
Matriz lineal (Roche) L1 (PGMY) cuatro años de operación, la red se dedicó a actividades
básicas de preparación de las normas internacionales
PGMY-RBH L1 (PGMY)
sobre las pruebas de DNA y los exámenes serológicos
InnoLiPA (Innogenetics) L1 (SPF10) del VPH, normalización de las pruebas y elaboración de
CLART (Genomica) L1 (PGMY) un manual de laboratorio y un programa de capacitación,
con hincapié en la garantía de la calidad y el control
Matriz de DNA (Biocore) L1
de calidad. La red colaboró con el Instituto Nacional
Micromatriz (Genetel) L1 de Patrones Biológicos e Inspección de Sustancias
Pruebas DEIA LiPA L1 (SPF10) Biológicas (NIBSC) en la formulación de las referencias
internacionales del DNA de los tipos 16 y 18 del
Micromatriz (Papillocheck) E1
VPH y los anticuerpos del tipo 16, que se encuentran
RCP específica de tipos (GenolD) L1 disponibles en el catálogo del NIBSC. El manual de
RCP interna Luminex L1 (PGMY-GP) laboratorio de la OMS sobre el VPH se publicó en el 2009
y se fundamenta en los conocimientos y las experiencias
RCP Luminex (Multimetrix) L1 (GP) adquiridas por conducto de los estudios internacionales
RCP + enzimoinmunoanálisis de L1 en colaboración; el manual se puede obtener en la OMS
(GenoID) (55). La obra tiene por objeto ayudar a establecer el
apoyo de laboratorio necesario durante la ejecución y
RCP de tiempo real VPH de alto L1
la vigilancia de los programas de vacunación contra el
riesgo de Abbott
VPH y se ocupa de las pruebas epidemiológicas, pero
Prueba del VPH Amplicor L1 no de las pruebas de carácter clínico. Los laboratorios
Gen-Sonda APTIMA (TMA) E6/E7 miembros de la red continúan operando como grupo
con el fin de mantener una red de expertos que vele
NucliSENS EasyQ HPV E6/E7
por la aplicación óptima de las pruebas del VPH, al
convocar cada año la Conferencia Internacional sobre
Papilomavirus.
VPH de la OMS (véase la sección 14. 8 sobre la red de
laboratorios del VPH). Marcadores de progresión
No todas las lesiones de las mujeres portadoras del VPH
14.8 Creación de una red de laboratorios del de alto riesgo persistente evolucionan hasta el cáncer
VPH de la OMS cervicouterino cuando no reciben tratamiento y, de
La OMS convocó a un grupo de expertos que se reunió hecho, tampoco todas las NIC3; por esta razón se están
en Ginebra en agosto del 2005 y recomendó la creación investigando otros marcadores que permitan pronosticar
la progresión, como el p16. Estos marcadores de
de una red mundial de laboratorios del VPH (LabNet del
progresión, aunados a la detección del VPH de alto riesgo
VPH), con el objeto de contribuir a mejorar la calidad de
ofrecen muy buenas perspectivas de un diagnóstico más
los servicios de laboratorio, de manera que practiquen
exacto de la displasia de alto grado (40, 41).
una vigilancia eficaz, supervisen las repercusiones de
la vacunación contra el VPH y ofrezcan capacitación 14.9 Conclusiones
(53-55).
La información sobre el VPH y las enfermedades afines
Se supuso que la LabNet del VPH aceleraría la se ha incrementado de manera extraordinaria, incluidas
introducción de las vacunas contra este virus al facilitar las numerosas técnicas nuevas de detección del virus.
la ejecución de procedimientos de laboratorio validados Es importante utilizar las pruebas apropiadas, ya sea en

Puntos clave:
• Los VPH oncógenos son la causa necesaria de la mayor parte de carcinomas cervicouterinos y de cierta
proporción de otras neoplasias malignas genitoanales, incluidos algunos tumores malignos bucofaríngeos. Los
VPH genitales son extremadamente frecuentes, pues cerca de 80% de la población que ejerce una vida sexual
activa contrae la infección en algún momento de su vida.
• La infección por el VPH oncógeno persistente es un prerrequisito a la aparición de las lesiones precursoras y
el desarrollo posterior de neoplasias malignas.
• El cáncer constituye un desenlace raro de esta infección genital muy frecuente.
• Los tipos 16 y 18 del VPH causan de manera constante 70% de casos de cáncer cervicouterino en el mundo.
• La lesión precursora del cáncer cervicouterino es la NIC3, y los VPH de tipo 16 y 18 causan alrededor de 50%
de estas lesiones.
• La detección del VPH se basa en técnicas moleculares, pues su cultivo no es fácil por los métodos
convencionales de diagnóstico de las infecciones virales y la serología ofrece una sensibilidad insuficiente. El
tamizaje primario del VPH se está incorporando a la detección del cáncer cervicouterino, asociado de diversas
maneras con la citología cervicouterina tradicional (frotis de Papanicolaou).
• Las pruebas que se utilizan en la práctica clínica con el fin de detectar las NIC3 o el cáncer son diferentes
a las pruebas que se aplican en el campo epidemiológico, como los estudios de vigilancia anteriores a
la introducción de los programas de vacunación y posteriores a la misma. No existen en la actualidad
indicaciones clínicas para practicar la prueba del VPH de bajo grado. Las pruebas clínicas requieren una
cuidadosa normalización en materia de obtención y procesamiento de las muestras, y de ejecución de la
prueba, en correlación con los criterios clínicos de valoración (diferentes de los criterios analíticos).
• Es importante que exista una garantía y un control de la calidad muy eficientes en materia de detección del
VPH. La red de laboratorios del VPH de la OMS, en colaboración con el NIBSC, ha elaborado las referencias
internacionales del DNA del VPH de tipo 16 y 18, y de los anticuerpos del VPH de tipo 16.
• En las pruebas de detección del VPH, la obtención cuidadosa y el transporte apropiado de las muestras
clínicas al laboratorio, además de su manipulación adecuada en el laboratorio, son factores primordiales a fin
de evitar la contaminación y los resultados positivos falsos.
• La detección del DNA del VPH representa un excelente factor de predicción negativa (cuando no se detecta
el VPH de alto riesgo, la enfermedad es improbable), pero existen muchos resultados positivos falsos en la
predicción de la enfermedad. Las investigaciones en curso examinan la utilidad de algunos marcadores de
progresión, a fin de mejorar la especificidad de los desenlaces con importante significación clínica.
• Con programas sanitarios de vacunación contra el VPH adecuados se disminuirá el valor pronóstico positivo
de la citología en la detección de la displasia de grado alto y es probable que en el futuro se utilicen más,
algunos métodos moleculares de detección del virus.
las aplicaciones clínicas o con fines epidemiológicos. 2. de Villiers EM et al. Classification of papillomaviruses.
Además, con miras a velar por la mejor calidad de los Virology, 2004, 324(1):17-27.
resultados, los laboratorios que realizan estas pruebas 3. Schiffman M et al. Classification of weakly carcinogenic
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Capítulo 15
Infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana
15.1 Introducción
Los primeros casos del síndrome de inmunodeficiencia virus de la anemia infecciosa equina y el virus de la
adquirida (sida) se describieron en 1981 y el virus inmunodeficiencia de monos. El virión de
causal se aisló por primera vez en 1983. Desde aproximadamente 100 nm de diámetro consta de una
entonces, el virus se ha propagado en todo el mundo, cápside cónica que contiene dos copias de RNA
existen cerca de 34 millones de personas infectadas y, genómico (fig. 15.1). La proteína de la cápside, p24,
tan solo en el 2010, se registraron 2,7 millones de constituye el componente principal del virus y está
nuevas infecciones (1). El África subsahariana ha sido la recubierta a su vez por una membrana lipídica que
zona más afectada, con 23,1 millones de personas contiene dos glucoproteínas, la gp41 y la gp120.
infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH) y cerca de 1,9 millones de infecciones nuevas en Estas glucoproteínas de superficie son importantes en
el 2010. La prevalencia del VIH ha alcanzado más de la fijación del virus a los linfocitos CD4; la fijación es la
30% de los adultos en algunos países. Aunque se primera etapa en el mecanismo de la infección y
han desarrollado tratamientos antirretrovirales también en la generación de la respuesta inmunitaria
eficaces y se ha ampliado la cobertura del tratamiento del huésped frente al virus. El VIH es sumamente
a muchos países de escasos recursos, se calcula que diverso, pues existen en todo el mundo varios subtipos o
por cada nueva persona que comienza el tratamiento, clados. En diferentes regiones predominan diferentes
ocurren de dos a tres nuevas infecciones por el VIH-1. subtipos del virus. Además, el VIH consta de dos tipos
Por consiguiente, mientras no exista una vacuna eficaz, principales, el VIH-1 y el VIH-2. El VIH-1 se subdivide en
los medios de diagnóstico accesibles, aunados a la tres grupos, a saber: M (los subtipos A–K), N y O. El
orientación sobre la prevención y a la derivación de las VIH-1 es el virus más frecuente y predomina en la
personas infectadas a los centros de atención epidemia, con multitud de subtipos y virus
apropiada, constituyen las estrategias fundamentales recombinados. El VIH-2 se encuentra principalmente en
para frenar el ritmo al que se propaga la epidemia. África Occidental y se han notificado casos
ocasionales en muchos países en todo el mundo.
El VIH se transmite principalmente por el intercambio de Existen algunas diferencias entre los subtipos del
humores orgánicos, que puede ocurrir por vía sexual y VIH-1 pero con fines de diagnóstico, presentan
por la sangre o los hemoderivados contaminados. Las reacciones cruzadas muy frecuentes y, por
embarazadas infectadas por el VIH pueden transmitir consiguiente, los antígenos o las proteínas derivados de
el virus al hijo durante el embarazo, durante el parto un solo subtipo son adecuados para diagnosticar la
(transmisión perinatal) o por la lactancia materna infección, independientemente de los subtipos que
(transmisión posnatal). También se ha notificado predominen. Dada la reactividad cruzada entre el
transmisión del VIH después del trasplante de órganos VIH-1 y el VIH-2, se precisan antígenos específicos a
cuando se descubre a posteriori que el donante era fin de diagnosticar con exactitud la infección por el
seropositivo. Con el propósito de garantizar la seguridad, VIH-2.
ahora se investiga de manera sistemática la presencia
del VIH o de anticuerpos contra el mismo en la sangre, 15.2 Pruebas de diagnóstico
los hemoderivados y los donantes de órganos a fin de
eliminar la posibilidad de transmisión del VIH. 15.2.1 Diagnóstico serológico de la infección por
el VIH
El VIH pertenece a la familia Retroviridae y la subfamilia El diagnóstico serológico de la infección por el VIH se
de los lentivirus, junto con virus análogos como el obtiene habitualmente mediante la detección de
Visna, el virus de la artritis-encefalitis caprina, el anticuerpos contra el virus en la sangre o en otros
Infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana 167

humores orgánicos. Los anticuerpos se producen en
promedio entre 4 y 6 semanas después de la
infección, aunque en algunos casos la presencia de
anticuerpos detectables puede tardar hasta 3 a 6 meses
después de la exposición. Por lo tanto, la infección por el
VIH no se puede descartar con base en una prueba
negativa entre 4 y 6 semanas después de una
exposición documentada. Durante el período inicial de
duplicación del virus, no existen anticuerpos y no se
puede establecer con exactitud el diagnóstico de la
infección mediante las pruebas de detección basadas Figura 15.1
exclusivamente en los anticuerpos. El período silente Estructura y organización de la partícula viral del VIH
agudo se puede acortar con métodos que detecten
directamente uno o varios componentes del VIH (el
antígeno p24 o el RNA). La duplicación del virus genera
en el cuerpo respuestas inmunitarias humorales y
también mediadas por células, que estabilizan la
carga viral. La presencia de virus detectables en la
mayoría de las personas que no reciben tratamiento
continúa estimulando la respuesta de las células B y las
concentraciones de anticuerpos permanecen altas durante
todo el período ulterior, a menos que el paciente presente
una inmunodepresión grave, como se observa en las etapas
avanzadas de la enfermedad. Por consiguiente, la Figura 15.2
detección de anticuerpos específicos contra el virus Dinámica inicial de la duplicación del virus y
representa un marcador muy fiable en el diagnóstico de la aparición de anticuerpos con marcadores de
la infección por el VIH. Se indican los tiempos
infección por el VIH (fig. 15.2).
aproximados hasta la detección de anticuerpos
Existen tres usos principales de las pruebas de detección mediante los inmunoensayos enzimáticos de
del VIH. Esta prueba se practica con el fin de garantizar la primera, segunda, tercera y cuarta generación.
seguridad de la sangre, los hemoderivados y el trasplante
de órganos; llevar a cabo la vigilancia; y establecer el Estas pruebas eran más sensibles y específicas para la
diagnóstico individual en una persona. Cuando se detección de los anticuerpos contra el VIH; sin embargo,
realiza la prueba con el propósito de velar por la debido a su estructura y diseño todavía no detectaban
seguridad de la sangre, se suele practicar mediante los las respuestas muy tempranas de anticuerpos del tipo
procedimientos más sensibles y perfeccionados que IgM. Los inmunoensayos enzimáticos de tercera
detectan los anticuerpos contra el VIH y el antígeno p24 generación utilizan una modalidad en sándwich, que
o el RNA del VIH-1, a fin de acortar el período silente. comporta antígenos marcados con enzimas y pueden
detectar respuestas tempranas del tipo IgM, y acortan
15.2.1.1 Inmunoensayos enzimáticos con ello el período silente. En los últimos años, se han
Poco después del descubrimiento del VIH, se desarrollado nuevos inmunoensayos enzimáticos de
desarrollaron inmunoensayos enzimáticos destinados a cuarta generación que reducen aun más el período
diagnosticar la infección por el virus. Estos ensayos silente, al combinar la detección del antígeno viral
detectaban anticuerpos específicos del VIH, un signo (p24) y los anticuerpos contra el VIH (fig. 15.2). Estos
indirecto de la infección y usaban como antígeno un ensayos que asocian antígenos y anticuerpos son muy
lisado de virus. Las pruebas de primera generación se sensibles en la detección de la infección aguda por el
reemplazaron luego con las de segunda generación VIH antes de la producción de anticuerpos y en la
que empleaban antígenos más específicos en forma actualidad se usan sistemáticamente en el tamizaje
de péptidos sintéticos o proteínas recombinadas. de la sangre y los hemoderivados en muchos países.
Aunque las pruebas moleculares detectan los ácidos
nucleicos virales unos pocos días antes de que los
inmunoensayos enzimáticos de cuarta generación
detecten el antígeno p24, el costo y la complejidad de
la detección de los ácidos nucleicos exceden las
ventajas de la prueba, excepto en los bancos de sangre
muy modernos.
Por consiguiente, el valor pronóstico de un resultado

positivo de uno o dos resultados de inmunoensayos
enzimáticos reactivos será mucho más alto cuando los (A) (B)
resultados se interpretan en el contexto de la señal. Los
resultados con una señal baja, aun cuando sean Figura 15.3
Ejemplo de las pruebas rápidas del VIH que muestra:
reactivos en dos inmunoensayos, se deben examinar de
A) el dispositivo de inmunoconcentración y B) el
nuevo con una prueba más específica o una muestra de
dispositivo de inmunocromatografía. Se observan
seguimiento con el fin de confirmar la infección. pruebas rápidas con resultados positivos y
negativos.
15.2.1.2 Pruebas rápidas
trabajadores legos y orientadores capacitados por fuera
En los últimos años, el diagnóstico del VIH se ha
del ámbito del laboratorio, con lo cual se amplía el
desplazado del laboratorio hacia ámbitos externos al
acceso a la detección del VIH. La Organización Mundial
laboratorio como consecuencia de la puesta al alcance
de la Salud (OMS) y los Centros para el Control y la
de varias pruebas rápidas. Solo en el 2011 se
Prevención de Enfermedades de Estados Unidos (CDC)
practicaron las pruebas rápidas de detección del VIH a
han desarrollado un módulo de capacitación exhaustivo
más de 100 millones de personas en todo el mundo.
que aborda diversos temas como la calidad, la exactitud
Estas pruebas rápidas aplican principalmente dos
y la seguridad (2). Al ampliar la disponibilidad de la
técnicas diferentes, que son los dispositivos de
atención y el tratamiento, se da un mayor impulso a la
inmunoconcentración y las tiras o cartuchos de
prestación de la orientación y las pruebas diagnósticas a
inmunocromatografía (fig. 15.3). Dado que las pruebas
millones de personas en todo el mundo como un
rápidas se diseñan con el fin de detectar anticuerpos
componente importante de la prevención.
contra el VIH en unos pocos minutos (1 a 15 minutos), en
comparación con los inmunoensayos enzimáticos que Debido a la alta demanda y a la ampliación del mercado,
pueden tardar entre 2 y 4 horas, los dispositivos se existen más de 50 estuches de pruebas al alcance en
optimizan de manera que se acelere la interacción entre todo el mundo, pero no todos tienen características
el antígeno y el anticuerpo. Esta característica exige el óptimas de desempeño. Es importante procurar que las
uso de una alta concentración de antígeno y la detección pruebas rápidas se produzcan con la más alta calidad,
de los complejos de antígeno y anticuerpo con colorantes en conformidad con las buenas prácticas de fabricación
reactivos sensibles como el oro coloidal. Las pruebas y presenten características de desempeño equivalentes a
rápidas suministran los resultados en el mismo día y, por otros métodos diagnósticos. La OMS y los CDC cuentan
ello, son ideales en una diversidad de situaciones como con programas de calificación, destinados a evaluar la
las poblaciones de difícil acceso, la orientación y las calidad de los nuevos estuches de pruebas rápidas (3, 4).
pruebas en el hogar, las pruebas por iniciativa del
profesional de salud, las pruebas a embarazadas y las Recientemente, se han elaborado pruebas rápidas de
unidades móviles de diagnóstico. Las pruebas rápidas de cuarta generación capaces de diagnosticar la infección
detección del VIH con frecuencia se usan en entornos aguda por el VIH mediante la detección del antígeno p24,
con un bajo volumen de muestras, a fin de prestar una aunada a la detección de anticuerpos contra el virus. La
atención más costo-eficiente. Estas pruebas se pueden detección del antígeno p24 puede acortar el período
practicar con muestras de suero, plasma o sangre, lo silente unos pocos días y reconocer a las personas que
cual facilita el uso de muestras obtenidas por punción se encuentran en la fase aguda de la infección. Sin
digital; su realización es sencilla y la pueden ejecutar embargo, dado que la detección de la infección aguda es

un fenómeno todavía raro en los entornos con P N Reciente Larga evolución
prevalencia e incidencia altas, es preciso que después de
una prueba de antígenos positiva se practique una
prueba de seguimiento en 4 semanas o más, a fin de
verificar la seroconversión. En una evaluación reciente de
una de estas pruebas rápidas en el terreno se puso en
evidencia que la sensibilidad y la especificidad de la
detección de antígenos todavía no son aceptables (5).
Además, puesto que se trata de una nueva técnica y las
infecciones agudas son infrecuentes, sería importante
contar con una validación complementaria en el terreno
que confirme todas las posibles infecciones agudas,
mediante una prueba de ácidos nucleicos. Del mismo
modo que con toda prueba, es primordial adoptar las
medidas de garantía de la calidad con el fin de velar por Figura 15.4
la exactitud de la prueba rápida. Prueba de confirmación por
inmunoelectrotransferencia con el bandeo
Se han desarrollado varias pruebas rápidas que utilizan característico de anticuerpos que se observa
muestras de secreciones bucales recogidas con un durante las infecciones recientes (tiras 3 a 7) y en
hisopo. Estas muestras contienen una concentración de las infecciones de larga evolución (tiras 8 a 13). P es
IgG entre 1/500 y 1/1000 veces inferior a las muestras el testigo positivo; N son las muestras de testigos
sanguíneas, pero es suficiente para diagnosticar la negativos. Al lado del testigo positivo se indican las
infección por el VIH. La mayoría de los anticuerpos en las diversas proteínas específicas del virus.
secreciones bucales provienen de la sangre por
anticuerpos secundarios marcados con fluoresceína y se
transferencia pasiva, en lugar de ser producidos
observan con un microscopio de fluorescencia. La
localmente y contienen un complemento total de IgG
inmunofluorescencia ya no se usa de manera
séricas, aunque en una concentración más baja. El uso
generalizada, y se ha reemplazado con otros métodos
de las secreciones bucales simplifica aun más las
como la inmunoelectrotransferencia y los inmunoensayos
pruebas de detección del VIH, al ampliar su accesibilidad
lineales. Estas técnicas comportan el uso de tiras de
y disminuir el riesgo biológico que comporta la prueba
membrana que contienen de manera aislada proteínas o
con muestras sanguíneas. En la actualidad existen como
proteínas y péptidos recombinados, específicos del VIH.
mínimo tres estuches comerciales de pruebas rápidas
Las muestras séricas se ponen en contacto con estas
bucales (OraQuick, ChemBio DPP y Aware OMT).
tiras. Los anticuerpos específicos de VIH que se fijan, se
detectan mediante anticuerpos secundarios que se
15.2.1.3 Pruebas de confirmación
conjugan con una enzima y este complejo se pone en
Aunque los ensayos individuales mencionados evidencia con un sustrato que genera un producto de
anteriormente son muy sensibles y específicos, pueden color. En la figura 15.4 aparecen combinaciones de
presentar resultados positivos falsos y negativos falsos. bandas representativas en la inmunoelectrotransferencia,
Los resultados positivos falsos generan repercusiones que indican la presencia de anticuerpos contra las
importantes a escala individual. Por esta razón se proteínas específicas del virus, incluido un testigo positivo
desarrollaron las pruebas de confirmación que pueden que muestra todos los anticuerpos específicos de las
ratificar los resultados positivos iniciales. Las pruebas de proteínas virales que se pueden detectar, con su perfil
confirmación se basan en diferentes formatos y técnicas característico (carril P). Las personas con una infección
como las pruebas de inmunofluorescencia, la nueva o reciente poseen anticuerpos débiles dirigidos
inmunoelectrotransferencia (Western blot) y los contra pocas proteínas, en general contra p24 y gp120 o
inmunoensayos lineales. La inmunofluorescencia gp160. A medida que la infección progresa se producen
comporta la utilización de portaobjetos con células fijadas anticuerpos dirigidos contra otras proteínas virales y se
infectadas por el VIH. Los anticuerpos contra el VIH, hacen más fuertes con el transcurso del tiempo, como se
cuando están presentes, se detectan mediante demuestra las personas con infecciones de larga
evolución. Los inmunoensayos lineales son semejantes a las infecciones por el VIH en los adultos y los menores de
la inmunoelectrotransferencia, pero usan determinadas 1 año de edad. La detección de la infección aguda
proteínas recombinadas o péptidos purificados que son mediante las pruebas de amplificación de ácidos
importantes en el diagnóstico, desde el punto de vista nucleicos (PAAN) está indicada con el propósito de
inmunitario. La inmunoelectrotransferencia y los aumentar la seguridad de la sangre de donantes y los
inmunoensayos lineales son costosos y exigen una hemoderivados y tal vez en las poblaciones de alto riesgo.
interpretación a fin de establecer el diagnóstico, con base En muchos bancos de sangre de países desarrollados y
en una combinación de anticuerpos específicos contra de países en desarrollo se usan sistemáticamente las
antígenos presentes en la sangre (dirigidos contra p24 y PAAN como parte de los algoritmos de pruebas. Las
una o varias proteínas de la envoltura). personas que padecen una infección aguda presentan
una alta carga viral y corren un alto riesgo de transmitir la
Estas pruebas solo detectan la IgG específica del VIH. Por
infección a la pareja. Por lo tanto, se ha fomentado la
consiguiente, no se pueden usar con el fin de confirmar la
detección de las personas con infección aguda como
presencia de IgM específica del VIH ni de virus, como la
parte de la estrategia general de prevención de la
detectan los inmunoensayos enzimáticos más sensibles
infección por el VIH. Sin embargo, la detección de los
de tercera y cuarta generación respectivamente. Una
casos agudos ofrece un bajo rendimiento en la mayoría
estrategia de pruebas que incluya el uso de dos o varios
de los entornos y resulta muy costosa cuando se
inmunoensayos enzimáticos o pruebas rápidas en un
considera la brevedad del período silente (alrededor de 2
algoritmo seriado o paralelo proporciona resultados que
semanas).
son casi tan fiables como las pruebas de confirmación
por inmunoelectrotransferencia o los inmunoensayos Otra aplicación importante de las pruebas moleculares
lineales, pero con un costo muy inferior. es el diagnóstico precoz de la infección por el VIH en los
menores de 1 año expuestos al virus durante el período
15.2.2 Detección del RNA, el DNA o el p24 perinatal.
del VIH
El VIH también se puede diagnosticar por detección Dado que todos los niños menores de 1 año nacidos de
directa del virus o los componentes virales (el antígeno madres seropositivas adquirieron de manera pasiva
p24, el RNA o el DNA proviral). La detección del virus anticuerpos contra el VIH, las pruebas corrientes que
mediante el cultivo u otros métodos no se suele practicar detectan anticuerpos no se pueden usar con el fin de
debido a que la sensibilidad es deficiente comparada con confirmar o descartar la infección. Los anticuerpos
los métodos inmunológicos o moleculares corrientes y a residuales en los lactantes no infectados persisten y se
la complejidad de las técnicas de cultivo. La detección pueden detectar hasta los 18 meses de edad. Por esta
del antígeno p24, el RNA o el DNA del VIH-1 cumple un razón, el reconocimiento de la presencia o la ausencia de
importante papel cuando no es posible establecer el RNA o DNA del VIH en los lactantes de 6 semanas o
diagnóstico con base en los anticuerpos, como ocurre en mayores constituye el medio más definitivo de
los lactantes menores de 1 año expuestos durante el diagnosticar la infección en este grupo etario. En el
período perinatal o en la infección aguda en los adultos diagnóstico precoz de los lactantes en medios con
antes de la producción de anticuerpos contra el virus recursos limitados, se aplica una gota de sangre sobre
(6–10). La detección molecular de una secuencia papeles de filtro y se seca (gota de sangre seca) lo cual
selectiva de ácidos nucleicos es más sensible que la facilita la obtención, el procesamiento, el transporte y el
detección del p24. almacenamiento de las muestras sanguíneas. Les
técnicas moleculares de diagnóstico precoz se han
Según la fase de la infección, el VIH se puede ser introducido en un gran número de laboratorios, con un
encontrar principalmente como DNA proviral en las interés principal en la prevención de la transmisión
células infectadas o como RNA en la sangre (como maternoinfantil. Existen varios estuches comerciales que
componente de partículas libres y RNA viral intracelular). se usan en el diagnóstico del VIH en los menores de 1
Existen estuches comerciales que pueden detectar el año de edad. Estas pruebas incluyen la extracción
DNA o el RNA de manera cualitativa o cuantitativa. Las manual de ácidos nucleicos o las plataformas
pruebas cualitativas son suficientes con fines de moleculares de vanguardia que ofrecen una
diagnóstico y están indicadas en la detección precoz de automatización avanzada de la extracción y la detección

cualitativa de RNA y DNA del VIH-1. La extracción resultado negativo se suele transmitir al usuario con base
manual de ácidos nucleicos exige un número en una prueba única, pero un resultado positivo se
considerable de etapas, con posibilidad de error humano confirma con una segunda prueba diferente. En función
y contaminación de la reacción en cadena de la de la especificidad de las pruebas y cuando la prevalencia
polimerasa (RCP). Frente a la necesidad de una mayor de la infección por el VIH en la población es relativamente
calidad, se han elaborado plataformas que reducen al alta (>5%), se usan dos resultados positivos con el fin de
mínimo las intervenciones del operador y aceleran el diagnosticar la infección. En las poblaciones con baja
procesamiento de las muestras. Se ha notificado que la prevalencia, se recomienda una tercera prueba antes de
detección cualitativa de la infección por el VIH-1 en los confirmar un diagnóstico positivo. El algoritmo seriado es
menores de 1 año ofrece una sensibilidad de detección lógico y costoeficiente, y comporta en primer lugar una
suficiente a partir de tan solo 500 copias de DNA por prueba más sensible, seguida de una prueba más
mililitro, en función del tipo de muestra (plasma, sangre específica con el objeto de eliminar los resultados
o gota de sangre seca). En el diagnóstico precoz de la positivos falsos. Sin embargo, en algunas situaciones se
infección en los lactantes no se recomienda la mezcla de aplican algoritmos paralelos, en los cuales se utilizan dos
pruebas simultáneamente y el resultado se registra como
las muestras, que a menudo se practica en la detección
negativo o positivo con base en los resultados
de las infecciones agudas en los adultos con el fin de
concordantes. En el caso de resultados discordantes, se
aumentar la eficiencia y reducir costos.
realiza una tercera prueba o se repite el examen en una
Lamentablemente, en la mayoría de los países las
fecha posterior, a fin de confirmar o descartar la
pruebas cuantitativas del VIH no están autorizadas con
seroconversión reciente. Los algoritmos paralelos pueden
fines diagnósticos, sino únicamente en el seguimiento de
ser más costoeficientes en una situación de prevalencia
la infección. Sin embargo, el uso de una prueba
muy alta, alto volumen de usuarios o cuando se practica
cuantitativa de RNA del VIH en las muestras de plasma
la prueba a las embarazadas durante el trabajo de parto.
antes de iniciar el tratamiento antirretroviral es el método
Es importante escoger la combinación correcta de
preferido como segunda prueba de confirmación.
pruebas con el fin de aportar un diagnóstico certero (11).
Si bien la realización de pruebas serológicas rápidas del
VIH de buena calidad en los centros periféricos se ha 15.2.4 Muestras de gotas de sangre seca
convertido en práctica ordinaria, las pruebas de DNA por Si bien la mayoría de las pruebas diagnósticas están
RCP en el punto de atención, donde existe una mínima destinadas al uso de sangre procesada (muestras de
infraestructura de laboratorio, avanza lentamente. En los suero o plasma), la obtención de las muestras precisa un
entornos con recursos limitados se pueden realizar las flebotomista experimentado y equipo. Además, el
nuevas pruebas inmediatas en el punto de atención, que transporte de muestras líquidas requiere una cadena de
se basan en la amplificación isotérmica con detección frío, que es relativamente costosa. La muestra en gota
rápida de las secuencias diana. Algunas pruebas de sangre seca es una opción sencilla y fácil para la
inmediatas utilizan instrumentos pequeños portátiles que serología y el análisis molecular del VIH. Los
suelen realizar la extracción y la amplificación de los inmunoensayos enzimáticos y la
ácidos nucleicos, la amplificación de la señal y la inmunoelectrotransferencia se han optimizado con el
detección. La evaluación de estas pruebas en el terreno objeto de que acepten este tipo de muestras (12). Las
será fundamental en la validación de su consistencia muestras de sangre seca se pueden tomar, almacenar y
analítica y su capacidad de proporcionar resultados transportar a temperatura ambiente. En general, se usa
exactos. un sacabocados de 6 mm a fin de eluir los anticuerpos
de la prueba. Según la técnica usada, suele ser
15.2.3 Algoritmos de pruebas necesaria alguna optimización de la técnica con el objeto
Con el propósito de diagnosticar la infección por el VIH se de lograr sensibilidad y especificidad óptimas (13).
asocian dos o varias pruebas en un algoritmo que Cuando se cuenta con sistemas optimizados de pruebas,
aumenta el valor pronóstico del resultado positivo de una la muestra de sangre seca es ideal en la vigilancia de la
prueba inicial. En la mayoría de las situaciones, el infección por el VIH. Como se indicó anteriormente, la
algoritmo que más se aplica incluye la utilización seriada gota de sangre seca es una muestra práctica que se usa
o secuencial de las pruebas (algoritmo seriado). Un de manera sistemática en el diagnóstico precoz de los
lactantes en muchos países. Recientemente, se han todo en los países que no cuentan con la determinación
optimizado y validado las pruebas destinadas a la de la carga viral. La decisión sobre el momento de iniciar
vigilancia de la carga viral de muestras en gotas de el tratamiento antirretroviral es fundamental en los
sangre seca. Después del tratamiento eficaz, la viremia países con recursos limitados, en el contexto de las
plasmática disminuye rápidamente, en unas pocas tasas más altas de mortalidad y la mayor incidencia de
semanas, a concentraciones por debajo del umbral de infecciones oportunistas (15, 16). Cuando disminuye el
detección. Sin embargo, el RNA y el DNA intracelulares recuento de linfocitos CD4, es más probable que las
persisten y se pueden detectar en las muestras de personas seropositivas al VIH contraigan infecciones por
sangre seca. Por consiguiente, el uso de estas muestras patógenos oportunistas. El tratamiento antirretroviral se
en el seguimiento longitudinal de los pacientes que usa cuando el recuento de linfocitos CD4 alcanza un
reciben tratamiento exige cautela. cierto umbral, con el propósito de prevenir la aparición
de estas infecciones. El recuento normal de linfocitos
15.3 Seguimiento de la infección por el VIH en CD4 en los menores de 5 años de edad es más alto que
el laboratorio clínico en los adultos y disminuye con la edad. Esta evolución
hace más difícil que los niños cumplan con los requisitos
15.3.1 Utilidad de la prueba de linfocitos CD4 en
del tratamiento antirretroviral cuando se tiene en cuenta
el seguimiento clínico de la infección el recuento absoluto. Se han utilizado los porcentajes de
La infección por el VIH conduce a la aparición del sida, linfocitos CD4 a fin de determinar el momento de iniciar
que se caracteriza por una pérdida de linfocitos CD4 que los antirretrovirales en los niños infectados por el VIH.
son primordiales en el funcionamiento adecuado del
sistema inmunitario de una persona. La prueba de los 15.3.1.1 Fundamentos de la prueba de linfocitos CD4
linfocitos T4 se usa en el seguimiento clínico de las
En general, el recuento de linfocitos CD4 se refiere al
personas infectadas, con el fin de determinar el
cálculo del número de células CD4, también llamados
momento oportuno para iniciar el tratamiento
linfocitos T 4 o linfocitos T colaboradores. La prueba de
antirretroviral, vigilar la eficacia de este tratamiento y
células CD4 se usa con el objeto de determinar la
definir cuándo se debe suministrar la profilaxis de las
concentración absoluta de linfocitos CD4 en la sangre o
infecciones oportunistas. La OMS recomienda el
tratamiento antirretroviral en los adultos y los el porcentaje de células CD4 en la población de
adolescentes infectados por el VIH con recuentos de CD4 linfocitos. Los recuentos normales de CD4 oscilan entre
inferiores a 350 células/µl, independientemente de los 400 y 1600 células/dl y el porcentaje normal de linfocitos
síntomas (14). En los países con recursos limitados, la CD4 entre 35% y 55% (17).
cifra con la cual se comienza el tratamiento difiere según Los métodos corrientes de recuento de células CD4
el país pero suele oscilar entre 200 y 350 células/µl. El utilizan anticuerpos monoclonales marcados que
recuento de linfocitos CD4 también constituye una detectan moléculas de superficie como CD4, CD3, CD8 y
herramienta de seguimiento de la progresión de la CD45 en las células sanguíneas. En la figura 15.5 se
enfermedad y de la eficacia real del tratamiento
ilustran los principales leucocitos con anticuerpos
antirretroviral. Cuando un paciente no responde al
marcados, dirigidos contra el CD4 y el CD3.
tratamiento, el recuento de linfocitos CD4 se usa con el
fin de determinar el cambio de una pauta de primera Las células sanguíneas que expresan las moléculas de
línea a un esquema terapéutico de segunda línea, sobre superficie de interés se reconocen con los citómetros de
Marcado Marcado
dorado rojo
Anti- Anti-
CD4 CD3
Linfocito T CD8 Linfocito T CD4 Monocito Linfocito B
Figura 15.5
Leucocitos con anticuerpos marcados antiCD4 y anti-CD3

citómetros de flujo a partir de un volumen preciso
10 0 101 10 2 10 3 10 4
1000
escogido de la muestra de sangre. Este método se basa

800
CD4 T-cells ya sea en un principio volumétrico con recuento de las

side scatter
CD4 Cy5
células CD4 por una unidad de volumen de la muestra
0 200 400 600
Monocytes
R2 procesada o en la comparación del recuento de un número

R1
CD8 T-cells conocido de microcuentas agregadas a la muestra
B-cells
procesada, con el recuento de células CD4.
10 0 101 10 2 10 3 10 4 10 0 101 10 2 10 3 10 4
CD45 PerCP CD3 FITC
La estrategia recomendada de la ventana de análisis
Figura 15.6 para el recuento de CD4, reconoce la población de
Ejemplo de gráficos de puntos de una prueba de linfocitos mediante los marcadores CD45 y sus
células CD4 en citometría de flujo propiedades de dispersión lateral de la luz. Existen
también varias pruebas destinadas a las células CD4,
flujo que detectan el marcador específico de cada uno de que utilizan estrategias de ventanas de análisis fijas que
los anticuerpos monoclonales. Los citómetros de flujo son exclusivas de la prueba. Ejemplos de estas pruebas
también diferencian las células por sus propiedades de son el FACSCount CD4 y el Guava Auto CD4/CD4%.
dispersión de la luz. En la figura 15.6 se muestra un
análisis de citometría de flujo en gráficos de puntos con 15.3.1.3 Pruebas de células CD4
dos parámetros, como ejemplo de la prueba de células
En el cuadro 15.1 se indican las diversas técnicas
CD4. El primer gráfico destaca la población de glóbulos
comercializadas de la prueba de células CD4. En el
blancos por su propiedad de dispersión de la luz y las
cuadro se presentan los métodos manuales de
moléculas de superficie CD45. La casilla denominada R1
determinación de las células CD4 que se basan en un
muestra la población de linfocitos y la casilla R2 la
recuento directo en el microscopio y la nueva prueba
población de monocitos.
inmediata en el punto de atención, que es el analizador
El segundo gráfico de puntos solo examina las células CD4 Pima. Antes de introducir las pruebas de células
escogidas en las casillas R1 y R2 del primer gráfico. Las CD4, se deben considerar las políticas del país o de la
células CD4 corresponden al conglomerado superior OMS sobre la utilización de estas pruebas en función de
derecho de células que expresan CD4 y también CD3. las necesidades de infraestructura y de personal para
Los linfocitos CD8 se encuentran inmediatamente debajo una instalación adecuada; el suministro y la logística de
del conglomerado CD4 y expresan CD3, pero no CD4. servicios; y la evaluación y el seguimiento de la calidad
Las células B se agrupan en la esquina abajo a la de las pruebas (16).
izquierda y no expresan CD4 ni CD3. Los monocitos
corresponden al conglomerado verde de células por 15.3.2 Garantía de la calidad de las pruebas de
encima de las células B con baja expresión de CD4 y sin células CD4
expresión de CD3. El citómetro de flujo puede contar el La formulación de las pautas de garantía de la calidad de
número de células en cada uno de los conglomerados y las pruebas de células CD4 se fundamentó en los
así facilita la determinación del recuento de células CD4. adelantos y las experiencias adquiridas en los medios
desarrollados y en entornos con recursos limitados
15.3.1.2 Plataformas de análisis de células CD4 y las (17–19). Es importante que las muestras destinadas a la
estrategias de la ventana de análisis prueba de células CD4 se rotulen adecuadamente, se
El recuento de CD4 se ha realizado mediante una técnica recojan en tubos destinados a las muestras de sangre,
de plataforma dual con un citómetro de flujo que se mantengan a la temperatura ambiente pero sin
suministra el porcentaje de células CD4 en la población de exponerlos al calor extremo y se analicen en el lapso que
leucocitos o de linfocitos, y un analizador de hematología se recomienda con cada prueba. Se han utilizado
que proporciona el recuento absoluto de leucocitos y estabilizadores sanguíneos como el Cyto-chex y el
linfocitos. En la actualidad, se prefieren las técnicas de Transfix con el fin de prolongar el tiempo durante el cual
plataforma única y se ha demostrado que mejoran la una muestra se puede analizar, en especial cuando es
precisión de la prueba de las células CD4 (15). El método preciso remitirlas. La muestra se debe preparar en
de plataforma única determina el recuento de CD4 en los conformidad con un procedimiento normalizado escrito.
Es importante contar con pipetas calibradas y reactivos Siempre que se practique la prueba de células CD4 se
almacenados adecuadamente que no estén vencidos, a debe realizar diariamente el control de calidad. La sangre
fin de lograr resultados fiables. La realización de las estabilizada se puede usar como material de control de
pruebas de células CD4 debe estar a cargo de un su calidad y se consigue comercialmente (19). Se deben
personal de laboratorio capacitado y competente. En examinar como las muestras de pacientes, dos
todos los resultados generados, incluidas las referencias de material de control de calidad, normal y
inmunotransferencias en gotas, es necesario examinar la bajo.
exactitud, la integridad y el uso de los identificadores
Los resultados del control de calidad se deben examinar
correctos. Se debe realizar diariamente el mantenimiento
diariamente. Otra posibilidad es utilizar las cuentas de
de los equipos y los instrumentos en horarios referencia con el objeto de velar por la exactitud de la
programados. Los contratos de servicio de los citómetros función de recuento del instrumento de CD4. Los
de flujo pueden extender la vida útil del instrumento y laboratorios que realizan la prueba de las células CD4
contribuir a obtener una función adecuada. Es preciso deben además estar inscritos en un programa externo de
contar con un inventario de reactivos y una cadena de garantía y evaluación de la calidad.
suministro fiable, de manera que no haya ningún tiempo
de inactividad en la práctica de las pruebas como
consecuencia de la falta de reactivos.
Cuadro 15.1: Pruebas e instrumentos del examen de las células CD4
Tipo Instrumentos y empresa Prueba Principio de la prueba

Sistemas Epic XL-MCL & FC500 de PLG CD4 Citometría de flujo con cuentas
de gran Beckman Coulter
productividad Brea, CA (EUA)
FACSCalibur & Canto de Tritest & MultiTest Citometría de flujo con cuentas
BD Bioscience
San José, CA (EUA)
Sistemas de FACSCount de BD Reactivo FACSCount & Citometría de flujo con cuentas
productividad Bioscience Reactivo CD4
intermedia o
baja Guava PCA de Millipore Easy CD4, Citometría de flujo volumétrica
Billerica, MA (EUA) Easy CD4%
Auto CD4/CD4%
CyFlow SL_3 & Counter de Partec Easy CD4 & Citometría de flujo volumétrica
Partec CD4%
Gorlitz (Alemania)
Sistemas Beckman Coulter Cyto-Spheres Direct observation of bead-rosetted cells
manuales Invitrogen Observación directa de células en rosetas con
Oslo (Noruega) Estuche T4 Quant cuentas
Observación directa de células escogidas por

immunocaptación
Pruebas Analizador Pima de Imagen digital de células con doble marcado,
inmediatas en Alere Technologies Jena Pima CD4 técnica volumétrica
el punto de (Alemania)
atención

15.3.3 Determinación de la carga viral específicas del genoma de RNA del virus, sobre las cuales
Aunque el recuento de células CD4 es un criterio clínico actúan los antirretrovirales y que, en último término,
importante que permite comprender el estado clínico de provocan cambios en las proteínas enzimáticas que
los pacientes y definir el momento de iniciar el tratamiento son primordiales en la replicación del virus y permiten
antirretroviral, la carga viral es la medida cuantitativa que el VIH se duplique en presencia de determinados
de la cantidad de VIH en la sangre y es un parámetro antirretrovirales. En los entornos con recursos limitados,
importante en el seguimiento de la eficacia del tratamiento los antirretrovirales recetados con mayor frecuencia se
con el transcurso del tiempo. Existen muchas pruebas dirigen a las regiones de la transcriptasa inversa y la
comerciales de determinación de la viremia y se utilizan proteasa del gen pol del VIH, por lo tanto, las mutaciones
principalmente con el fin de coordinar la atención de la de farmacorresistencia que se detectan se suelen localizar
infección por el VIH, en conjunto con el cuadro clínico y en estas regiones. La evolución de las subpoblaciones
otras pruebas de laboratorio. La técnica de amplificación farmacorresistentes del VIH puede alterar de manera
de ácidos nucleicos in vitro se usa con el fin de cuantificar considerable la capacidad de los antirretrovirales de
las partículas del VIH en el plasma humano. La RCP con suprimir la duplicación del virus. Una vez que surgen
transcriptasa inversa, la amplificación de secuencias y se multiplican las cepas virales resistentes, estas
de ácidos nucleicos y los métodos con DNA de cadena persisten indefinidamente ya sea como virus circulantes o
ramificada (bDNA) se usan con el fin de cuantificar el integrados en los genomas de los linfocitos T de memoria,
RNA del VIH mediante la RCP, la amplificación isotérmica en forma de DNA proviral. Estas cepas no solo causan
de ácidos nucleicos y la amplificación de señal, una infección que no responde a los medicamentos en los
respectivamente. Las técnicas que no se basan en los
pacientes que adquieren la resistencia, sino que además
ácidos nucleicos utilizan la detección de las enzimas
se pueden transmitir a las personas recién infectadas
(transcriptasa inversa) y las proteínas (antígeno p24)
y alterar la eficacia del tratamiento antirretroviral en
del virus como una medida indirecta de la carga viral.
estos pacientes. Se cuenta con dos tipos reconocidos
Las pruebas de determinación de la carga viral difieren
de pruebas de farmacorresistencia del VIH a saber, las
con respecto a la sensibilidad, el intervalo analítico y la
pruebas genotípicas y las fenotípicas. Ambos métodos
capacidad de detectar y cuantificar diferentes subtipos
son complejos y costosos. En los países con abundantes
del VIH. Sin considerar la técnica de medición de la
recursos, la vigilancia de la farmacorresistencia adquirida
viremia, el plasma humano es el tipo de muestra corriente;
en los pacientes que reciben tratamiento antirretroviral y
sin embargo, las limitaciones de su procesamiento, el
mantenimiento de la cadena de frío y el almacenamiento la detección de la farmacorresistencia transmitida en los
de las muestras constituyen auténticas fuentes de pacientes recién infectados por el VIH se ha convertido
preocupación. No obstante, el uso de sangre seca como en la norma de atención (17). Se ha demostrado que
fuente de muestras ofrece buenas perspectivas; en las pruebas de farmacorresistencia del VIH mejoran
los establecimientos de atención primaria se pueden la supervivencia y la respuesta inmunitaria cuando se
recoger las muestras de sangre seca y transportarlas usan como guías en la adopción de decisiones clínicas
a los laboratorios centrales con el fin de practicar la en los pacientes con antecedente de fracaso de una o
determinación. La determinación centralizada de la carga varias pautas terapéuticas. En los entornos con escasos
viral es la norma actualmente en los países con recursos recursos, las pruebas de farmacorresistencia a escala
limitados, pero las pruebas inmediatas en el punto de individual no se practican de manera sistemática debido a
atención pueden modificar la situación general, allí donde la falta o la limitación en las infraestructuras, el personal
se pueda determinar la carga viral de manera sistemática capacitado y a los altos costos. La OMS recomienda la
en el futuro. supervisión y la vigilancia de la farmacorresistencia del
VIH en las poblaciones, con el fin de prevenir la aparición
15.3.4 Pruebas de farmacorresistencia y la transmisión de la resistencia en los países en curso
La farmacorresistencia del VIH consiste en la capacidad de ampliación rápida de los programas de tratamiento
del virus de continuar su duplicación en presencia y procurar mantener la eficacia de los esquemas de
de los medicamentos antirretrovirales que suelen tratamiento antirretroviral que se escogen para formar
suprimirla. La causa de la farmacorresistencia son las parte de las pautas terapéuticas nacionales y de los
mutaciones o las modificaciones que afectan porciones programas antirretrovirales que los suministran (18–20).
15.3.4.1 Pruebas genotípicas de farmacorresistencia VIH-1 derivadas de una persona infectada por este virus,
del VIH e incorporan estas regiones génicas con el fin de generar
Las pruebas genotípicas de farmacorresistencia del VIH un virus recombinado; luego se examina el virus
evalúan las secuencias de nucleótidos a partir de las recombinado mediante las pruebas de sensibilidad, en
cuales se deducen los aminoácidos de las enzimas presencia de diversas concentraciones de un
transcriptasa inversa y proteasa del virus. La secuencia medicamento específico. Los resultados se expresan
de aminoácidos de las regiones de la transcriptasa como los cambios de sensibilidad en X veces de la
inversa y de la proteasa del gen pol del VIH se compara concentración inhibidora del 50% (CI50), comparada con
con las secuencias de una cepa natural de referencia del los umbrales obtenidos con un virus natural de
virus o con una secuencia consenso de referencia, referencia. Las pruebas fenotípicas presentan varias
específica del subtipo y todos los cambios en los limitaciones. En primer lugar, las pruebas fenotípicas no
aminoácidos se registran como un cambio en el pueden pronosticar en forma adecuada el desenlace
aminoácido de un codón específico. Las mutaciones se clínico cuando existe una población mixta de cepas de
denominan siguiendo un formato normalizado, con base virus de tipo natural y de mutantes en las cuasiespecies
en la posición numérica del codón mutante en la virales. Además, las pruebas fenotípicas están al alcance
secuencia de aminoácidos de la proteasa o la solo en un número limitado de laboratorios que aplican
transcriptasa inversa. Por ejemplo, un cambio de métodos diferentes y pueden dar resultados
metionina (M) por valina (V) en la posición 184 de la discordantes. Aun más importante, el costo actual de las
transcriptasa inversa se describe como M184V. La letra pruebas fenotípicas es como mínimo tres veces superior
a la izquierda del número representa el aminoácido en al costo de la prueba genotípica. Debido a estas
esa posición en la secuencia de referencia de la limitaciones, las pruebas fenotípicas no se recomiendan
transcriptasa inversa y la letra a la derecha corresponde con fines de vigilancia rutinaria de la farmacorresistencia
al aminoácido asociado con la mutación en la cepa del en la población.
VIH examinada. Se ha demostrado que las pruebas
genotípicas ofrecen gran reproducibilidad y sensibilidad, 15.3.4.3 Tipos de muestras de las pruebas de
y suministran una secuencia génica completa y exacta farmacorresistencia del VIH
de los dominios de interés. Los estudios han indicado El tipo de muestra que se usa de ordinario con las
que la prueba genotípica detecta las mutaciones de pruebas genotípicas y que se considera el “método de
farmacorresistencia del VIH presentes en cerca de 20% referencia” es el plasma. Las dos pruebas genotípicas
de las cuasiespecies circulantes. autorizadas por la FDA se practican con plasma. La OMS
también recomienda que se use el plasma en las
Los sistemas TRUGENE® y Viroseq®, comercializados en encuestas de vigilancia de la farmacorresistencia
Estados Unidos y autorizados por la FDA, se diseñaron y adquirida del VIH en los pacientes que han recibido
aprobaron para el genotipado de los virus VIH-1 del medicamentos antirretrovirales de primera línea durante
subtipo B, que corresponden a las cepas circulantes 12 a 15 meses (23). Además, muchos estudios han
dominantes en Europa y América del Norte. Aunque con evaluado las muestras de sangre seca con las pruebas
estas pruebas se han genotipado otros subtipos del de farmacorresistencia en los entornos con recursos
VIH-1 diferentes del B, aun no se han evaluado limitados y en los últimos años se han usado con éxito
plenamente sus características de desempeño y los con las pruebas genotípicas en poblaciones recién
resultados de la prueba son variables. En laboratorios de diagnosticadas con infección por el VIH y sin antecedente
todo el mundo se han elaborado y validado pruebas de tratamiento, en el estudio de la farmacorresistencia
genotípicas dirigidas a los diferentes subtipos del grupo transmitida. La OMS también recomienda el uso de
M del VIH-1 y las formas recombinadas circulantes (21, muestras de sangre seca en las encuestas de
22). farmacorresistencia transmitida en las poblaciones que
no han recibido previamente antirretrovirales y en las
15.3.4.2 Pruebas fenotípicas de farmacorresistencia encuestas de farmacorresistencia adquirida en los
del VIH pacientes que inician el tratamiento (23–25). Si bien las
Las pruebas fenotípicas in vitro utilizan las regiones de la muestras de sangre seca ofrecen ventajas importantes
transcriptasa inversa y de la proteasa del gen pol del en las pruebas de farmacorresistencia del VIH, como son

una mayor facilidad en la obtención, el transporte y el farmacorresistencia del VIH del Departamento de VIH/
almacenamiento, sin necesidad de una cadena de frío sida de la OMS, en colaboración con el Laboratorio de
(21, 22, 26–28), este método presenta limitaciones con Farmacorresistencia de la División Internacional de
las muestras obtenidas de pacientes tratados con Laboratorios, la División Mundial del VIH/sida, el Centro
medicamentos antirretrovirales de primera línea que para la Salud Mundial y los CDC, elaboró un módulo de
participan en las encuestas de farmacorresistencia capacitación de laboratorio sobre farmacorresistencia
adquirida del VIH durante los primeros 12 meses del VIH. Todas estas medidas de calidad han favorecido
después de la iniciación del tratamiento antirretroviral la buena calidad de los datos de genotipado.
(23, 29). Esto se debe sobre todo al aporte de una
muestra más pequeña para la extracción, una menor 15.4 Referencias
carga viral en la mayoría de los pacientes que han
recibido tratamiento y a la menor sensibilidad de las 1. Informe de ONUSIDA para el Día Mundial del Sida 2011.
Ginebra, Programa Conjunto de las Naciones Unidas
pruebas genotípicas de desarrollo interno en los sobre el VIH/SIDA, 2011.
laboratorios. Sin embargo, los resultados recientes de
estudios realizados en entornos de recursos limitados 2. WHO, UNAIDS, CDC. HIV rapid testing: training package.
Atlanta, GA, USA, Centros para la Prevención y el
con pruebas de carga viral por RCP en tiempo real de Control de las Enfermedades, 2006.
segunda generación han revelado que la medición de la
3. WHO, UNAIDS. HIV assays: operational characteristics
viremia a partir de muestras de sangre seca de
(phase 1). Report 14, simple/rapid tests. Ginebra,
pacientes tratados con antirretrovirales de primera línea Organización Mundial de la Salud, 2004.
puede constituir una alternativa viable (30–34). Al
4. USAID. HIV/AIDS rapid test kits: process for USAID
asociar las pruebas de carga viral por RCP en tiempo real approval and technical guidance. Washington, DC,
de segunda generación con unas algunas pruebas United States Agency for International Development,
genotípicas sensibles de elaboración interna (21, 22), 2010 (http://transition.usaid.gov/our_work/global_
puede llegar a ser factible la supervisión de la health/aids/TechAreas/treatment/testkit_explain.pdf,
consultado el 5 de abril del 2013).
farmacorresistencia del VIH en los pacientes que han
recibido tratamiento, a partir de muestras de sangre 5. Bhowan K et al. Identifying HIV infection in South
African women: how does a fourth generation HIV rapid
seca en los entornos con recursos limitados.
test perform? African Journal of Laboratory Medicine,
2011, 1(1). http:// dx.doi.org/10.4102/ajlm.v1i1.4.
15.3.4.4 Garantía de la calidad de los resultados de 6. Leelawiwat W et al. Dried blood spots for the diagnosis
genotipado and quantitation of HIV-1: stability studies and
evaluation of sensitivity and specificity for the diagnosis
Al igual que todas las técnicas moleculares, la prueba of infant HIV-1 infection in Thailand. Journal of
genotípica de farmacorresistencia del VIH es susceptible Virological Methods, 2009, 155(2):109–117.
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7. Ou CY et al. Early diagnosis of HIV infection in the
cumplen los procedimientos recomendados o no se breastfed infant. Advances in Experimental Medicine
utilizan los medios de laboratorio previstos en el diseño and Biology, 2012, 743:51–65.
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organización han realizado estas pruebas y generado los
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24. Somi GR et al. Surveillance of transmitted HIV drug
resistance among women attending antenatal clinics in

Anexo 1
Microscopia y principios que rigen la tinción
A1.1 Introducción
La microscopia proporciona en el caso de las infecciones de la lente y usar el aumento más bajo que dé la mejor
de transmisión sexual (ITS) una prueba sencilla, imagen.
rápida y de bajo costo que puede realizarse cerca del
Procedimiento para instalar el microscopio óptico:
paciente (1). Puede ser sensible y específica, es ideal
1. Encender el microscopio.
para el cribado o detección sistemática, y suele dar
una sospecha diagnóstica que orienta el tratamiento 2. Bajar la platina, colocar el portaobjetos.
y, en consecuencia, rompe la cadena de transmisión.
La interpretación de la imagen microscópica es una 3. Rotar el revólver hasta el objetivo de 10X.
habilidad que requiere capacitación, lo que supone un
4. Subir la platina sin perderla de vista (pensando en
buen conocimiento práctico del microscopio (1).
la distancia de trabajo).
A1.2 Preparación de los frotis para 5. Ajustar la distancia entre los oculares y enfocar la
microscopia muestra.
Uno de los requisitos esenciales para una buena técnica 6. Cerrar el diafragma de campo y abrir el
de microscopia es una muestra de buena calidad tomada condensador completamente.
en el sitio conveniente con un hisopo o un asa de
siembra adecuados. Es importante que el portaobjetos 7. Levantar o bajar el condensador justo hasta el
esté limpio y que la muestra se coloque en el lado borde del portaobjetos.
correcto si está esmerilado por uno de los lados. En
8. Rotar los tornillos hasta enfocar la imagen (el borde
el caso de preparaciones para el examen en fresco,
se verá nítido).
se colocará una cantidad suficiente de la muestra en
el portaobjetos con una gota de solución salina de ser 9. Abrir el diafragma de campo (cuidado con la
necesario y un cubreobjetos colocado cuidadosamente cantidad de luz).
encima. La cantidad de líquido debe ser suficiente para
10. Ajustar nuevamente la cantidad de luz para que el
que extienda bajo el cubreobjetos pero sin salirse por los
examen sea cómodo.
bordes y debe examinarse de inmediato con un objetivo
de poco aumento y sin aceite de inmersión. En los 11. Cerrar el diafragma del condensador lentamente
frotis para la tinción Gram, la muestra se debe extender hasta que la imagen es nítida y el resplandor
uniformemente en todo el portaobjetos y fijarse con calor desaparezca.
o con alcohol, teñir bien y examinar con aceite inmersión.
12. Ajustar nuevamente la cantidad de luz de ser
A1.3 Microscopia de transmisión de luz necesario.
La clave de la buena microscopia es que el microscopio

esté instalado correctamente y sentarse cómodamente Definiciones clave
junto a la mesa de laboratorio con la espalda apoyada
Aumento total: número de veces que se amplía el
y el ocular a la altura de los ojos. El microscopista
largo, el ancho o el diámetro, pero no el área, de un
debe tener un buen conocimiento de los componentes
objeto.
individuales del microscopio (fig. A1.1). El microscopio
a. “Aumento útil” es cuando la imagen es nítida
debe mantenerse limpio y cubierto cuando no se utilice,
y se distinguen los detalles, generalmente con
y se debe hacer el mantenimiento correspondiente
un máximo de 1000X.
regularmente. Es una práctica correcta alejar la platina
Anexo 1: Microscopia y principios que rigen la tinción 181

Ajuste de la distancia interpupilar
Lente ocular
(visor)
Cuerpo
Revólver Brazo
Objetivos (4)
Regulador de la
Platina mecánica intensidad luminosa
Condensador Mando de ajuste del

macrométrico
Lente ocular (visor)
Base con foco o fuente de luz Mando de ajuste de la
platina
Palanca del diafragma
de campo
Control de cierre del
diafragma
Figura A1.1
Componentes de un microscopio óptico
Fuente: Reimpreso con el permiso de la Asociación Británica para la Salud Sexual y el VIH (BASHH).
b. “Aumento vacío” se produce a una Condensador: concentra los rayos luminosos en el

determinada ampliación en la que la nitidez objeto. Los instrumentos modernos tienen un “lupa” o
de la imagen se pierde y no se logra distinguir lente auxiliar para usar con los objetivos de 20X y más, y
más detalles. evitar así el continuo reajuste de la óptica.
Aumento total = aumento del ocular × aumento del Problemas que pueden aparecer con la microscopia
objetivo × aumento del cabezal inclinado. A menudo óptica:
es mejor usar un aumento inferior para distinguir los
• Objeto borroso e incapacidad de conseguir un
detalles del objeto claramente y tener un campo de
enfoque claro
visión más grande.
–– aceite en el objetivo, que debe limpiarse con el
Resolución: capacidad de poder distinguir detalles
disolvente recomendado,
estructurales estrechamente adyacentes como separados
y distintos. –– aceite detrás del objetivo, puede ser necesario
llamar al fabricante.
Definición: capacidad de una lente para dar un contorno
claro y diferenciado de la imagen del objeto. –– aceite en las lentes del condensador;
Diafragma de campo: protege el objeto del exceso de –– portaobjetos humedecido antes de aplicar el
calor y luz que no son necesarios para la formación de aceite;
imágenes.
–– diferentes lotes de aceite pueden haberse
Condensador o apertura de diafragma: contribuye a mezclado;
la resolución y el contraste de la imagen. No debe usarse
para la regulación de la luminosidad. –– cubreobjetos demasiado grueso;
–– portaobjetos con una extensión mal hecha, La microscopia de fluorescencia puede presentar los
demasiado espesa; siguientes problemas:
–– puede que no se haya puesto el lado correcto del • la imagen no es visible o es más oscura de lo previsto
portaobjetos; si el microscopio no se ha instalado correctamente
o la manija del obturador está cerrada (cierre del
–– cubreobjetos sucio con restos de aceite o marcas
diafragma);
de dedos;
• la muestra irradia una fluorescencia secundaria
–– presencia de aceite seco en el portaobjetos.
o emite autofluorescencia debido a la tinción
• Burbujas que se mueven a lo largo del portaobjetos inespecífica de la muestra o suciedad en la lente del
objetivo;
–– diferentes lotes de aceite pueden haberse
mezclado; • la imagen se ilumina de forma desigual debido a
que los componentes del microscopio no están bien
–– restos de agua aún en el portaobjetos al aplicar alineados;
el aceite;
• hay resplandor excesivo en el ocular porque faltan los
–– formación de burbujas de aire al aplicar el aceite. filtros correctos;
• Iluminación desigual • la decoloración rápida de la muestra cuando se está

visualizando.
–– el microscopio no se ha instalado correctamente;
condensador descentrado;
A1.5 Microscopia de campo oscuro
–– la torreta de lentes puede estar alineada La microscopia de campo oscuro difiere de la de
incorrectamente. transmisión óptica en que solo los rayos luminosos
• Aparición de artefactos que inciden sobre los microorganismos o las partículas
con un ángulo oblicuo penetran en el objetivo del
–– Puede haber polvo en el ocular, las lentes, microscopio, dando lugar a estructuras brillantes,
el portaobjetos o el cubreobjetos, que hay luminiscentes blancas, sobre un fondo oscuro (fig.
que limpiar con cuidado. en particular para A1.2). La microscopia de campo oscuro utilizada para
distinguir la fluorescencia artificial de fondo de la la detección de T. pallidum en el diagnóstico de la
fluorescencia específica. Lo mejor es mantener sífilis debe ser realizada por personal bien formado
el microscopio y hacer las observaciones en una y con experiencia, que sepa ajustar el microscopio
habitación que pueda oscurecerse. correctamente y diferenciar T. pallidum de los
En la microscopia de fluorescencia, la muestra se tiñe

transmitidos campo oscuro
usando un fluorocromo y luego se ilumina con luz de una
determinada longitud de onda que excita el fluorocromo
de la muestra; la fluorescencia emitida es captada
por la lente de los objetivos. Para el propósito general
de las ITS, esto puede lograrse con una conexión a
un microscopio de transmisión de luz, que contiene
una fuente luminosa (lámpara de vapor de mercurio o
halógena de tungsteno) y tiene dos filtros especiales:
el filtro de iluminación (o excitación), que asegura una
iluminación cercana al monocromático y de una longitud Figura A1.2
de onda correcta; y un segundo filtro de emisión (o Comparación del recorrido de los rayos luminosos
de barrera), que asegura que ninguna de las fuentes de un microscopio de transmisión de luz y uno de
luminosas de excitación llegue al detector. campo oscuro.
Fuente: Reimpreso con el permiso de la Asociación
Británica de Salud Sexual y el VIH.

treponemas no patógenos y otras espiroquetas que • La preparación tiene demasiadas burbujas de aire.
se hallan generalmente en la mucosa genital y anal.
• El condensador no está correctamente enfocado o
Dado que la cavidad bucal a menudo es colonizada por
centrado.
otras espiroquetas diferentes de los treponemas, no se
recomienda el examen con el microscopio de campo • La iluminación puede que no sea suficientemente
oscuro de las muestras procedentes de lesiones bucales. intensa.
Procedimiento para usar el microscopio de campo • El campo de visión es demasiado pequeño (abrir el
oscuro: diafragma de campo).
1. Hacer una preparación delgada (capítulo 10) • El centro del campo de visión está oscuro (el
utilizando un portaobjetos y cubreobjetos portaobjetos es demasiado grueso o el condensador
completamente limpios. Demasiada muestra no está en la posición adecuada).
anulará el efecto.
2. Bajar el condensador y poner una gota de aceite

A1.6 Microscopia de contraste de fases
encima de la lente. Se debe evitar que queden La microscopia de contraste de fases rara vez está
burbujas de aire atrapadas. disponible o puede utilizarse, pero tiene algunas ventajas
cuando se examinan muestras vivas sin teñir porque
3. Colocar el portaobjetos en la platina y subir tienen el mismo índice de refracción que el líquido de
lentamente el condensador hasta que el aceite montaje y los detalles internos pueden ser difíciles de
toque el portaobjetos. Se verá un rápido destello de ver. Se puede considerar que las muestras sin teñir
luz. Se debe tener cuidado de que no se formen tienen las propiedades de una red de difracción. La luz
burbujas. que atraviesa las distintas partes de la muestra se ve
4. Enfocar el objeto con un objetivo de poco aumento afectada y la fase de los rayos luminosos se modifica
(10X). Si el condensador está correctamente levemente, pero el ojo humano no puede percibirlo.
enfocado, un punto pequeño de luz iluminará el Sin embargo, por medios ópticos estas diferencias de
objeto sobre un fondo oscuro. Si se ve un anillo fase se pueden hacer visibles como zonas luminosas y
hueco de luz, deberá ajustarse el condensador. oscuras.
5. Con los tornillos para desplazar la platina, ajustar el Los siguientes componentes son necesarios en la
condensador hasta que el punto luminosos esté en microscopia de contraste de fases:
el medio del campo. 1. un condensador especial que lleva una serie de
6. Poner una gota de aceite de inmersión en el diafragmas anulares, el tamaño del anillo varía con
cubreobjetos y enfocar el objeto con el objetivo la abertura numérica del objetivo usado;
inmersión. Si se usa un objetivo con un diafragma 2. objetivos especiales de fase que contienen una
iris, puede ser necesario un ajuste leve. Si los placa de difracción (o placa de fase); esta placa
objetivos no son par-central (el objeto sigue en el consta de un disco de vidrio con una ranura circular
centro del campo cuando se cambia de objetivo), de una profundidad tal que la luz que pasa a través
entonces puede ser necesario centrar el de esta porción tiene una diferencia de fase de un
condensador. cuarto de longitud de onda comparada con el resto
7. La microscopia de campo oscuro se hace mejor en de la placa.
una habitación sin iluminación. Procedimiento para el uso del microscopio de contraste
A veces se presentan los siguientes problemas con la de fases:
microscopia de campo oscuro: 1. Preparar un portaobjetos con una muestra delgada,
• El portaobjetos o cubreobjetos son demasiado no demasiado abundante, y girar sobre ella el
gruesos. objetivo (los objetivos están marcados como Ph,
Phaco o similar). Rotar el anillo en el condensador
que sea apropiado para el objetivo colocado.
2. Comprobar que el anillo y la placa de fase están en A1.7 Tinción de Gram
la posición correcta usando el sistema óptico Esta tinción fue descrita por primera vez en 1884
provisto con el microscopio. por Gram y pone de manifiesto la morfología de las
bacterias y los hongos. Según se tiñan, las bacterias se
3. Retirar el visor e insertar el sistema óptico. Las
dividen en dos grupos: la que aparecen positivas y las
imágenes del anillo y la placa de fase deben
que aparecen negativas. Cada uno de estos grupos se
coincidir. Si no, ajustar con los tornillos
divide a su vez en cocos (esferas) y bacilos (bastones),
macrométrico y micrométrico del condensador.
dando lugar a cuatro grupos. Muchas bacterias que
4. Reemplazar el visor y examinar la muestra. se diferencia muy bien, como N. gonorrhoeae, son
diplococos gramnegativos, pero es importante recordar
5. Pueden usarse los objetivos de todos los aumentos que la reacción frente a la tinción de Gram solo da una
siempre que se coloque una placa de fase y que identificación de sospecha. Se necesitan otros métodos
haya un anillo apropiado en el condensador. de identificación para clasificar cualquier bacteria. Los
En la microscopia de contraste de fase pueden hongos aparecen como grampositivos.
presentarse los siguientes problemas:
A1.7.1 Fundamento de la tinción de Gram
• el condensador y el objetivo no se corresponden
La tinción de Gram refleja diferencias en la estructura de
según el código Ph;
la pared celular bacteriana. Las bacterias grampositivas
• la placa de fase no está alineada, por lo que es tienen grandes cantidades de peptidoglicano en la
necesario comprobar utilizando el sistema óptico; pared celular, que retiene el colorante violeta (fig.
A1.3a), mientras que las bacterias gramnegativas tienen
• el diafragma de campo no está enfocado sobre la una pared celular compleja con menor cantidad de
superficie de la muestra, lo que debe solucionarse peptidoglicano, por lo que no retiene la tinción violeta
moviendo el condensador hacia arriba o abajo. sino que toma el colorante de contraste rosado (fig.
A1.3b).
Peptidoglicano Parte externa
Espacio
periplásmico
Membrana Parte interna

celular
Figura A1.3A
Estructura de la pared celular de una bacteria grampositiva
Fuente: Reimpreso con el permiso de la Asociación Británica de Salud Sexual y el VIH.

Parte externa
Lípido A
Porina Lipoproteína
Porina Fosfolípido
Espacio
periplásmico
Fosfolípido
Membrana Parte interna

celular
Figura A1.3B
Estructura de la pared celular de una bacteria gramnegativa
Fuente: Reimpreso con el permiso de la Asociación Británica de Salud Sexual y el VIH.
A1.7.2 Procedimiento de tinción correr por el frotis. El complejo violeta se eliminará y tan
Un frotis fijado se cubre completamente con cristal pronto como deje de salir, se lavará el frotis con agua.
violeta durante 30 segundos, en ese tiempo todas las En esta etapa es fácil que se produzca una decoloración
bacterias se tiñen (fig. A1.4). A continuación se lava excesiva del frotis, en particular, si se usa acetona;
el frotis suavemente con agua corriente (del grifo) y
Grampositivo Gramnegativo
se cubre de nuevo otros 30 segundos con solución
yodoyodurada de Lugol, que actúa como mordiente y fija Fijación
el colorante violeta a la membrana celular.
Cristal violeta
Después de lavar con agua, se echa un decolorante
para eliminar el exceso de tinción; en este estadio es en Tratamiento con yodo
el que se arrastra el complejo cristal violeta-yodo de la
membrana de celular de las bacterias gramnegativas Decoloración
porque no hay suficiente peptidoglicano para retenerlo.
Se usan varios decolorantes, desde el alcohol, que es Tinción de contraste con
lento y suave, a la acetona, que es un decolorante fuerte safranina
y rápido. Figura A1.4

Reacción de las bacterias grampositivas y
El tiempo que se deja el decolorante en el frotis gramnegativas en los diferentes pasos de la tinción
varía desde unos minutos para el alcohol a solo unos de Gram
segundos en el caso de la acetona. Es aconsejable Fuente: Reimpreso con el permiso de la Asociación
mantener el frotis sobre el lavabo y dejar el colorante Británica para la Salud Sexual y el VIH.
muchos laboratorios prefieren utilizar una mezcla de A1.8 Tinción con azul de metileno
acetona y alcohol (1:1), ya que la velocidad de la acetona
El uso de azul de metileno como único colorante es muy
se modera levemente con el alcohol.
útil en entornos en los que las instalaciones de laboratorio
Después de la decoloración, se cubre el frotis o los recursos son inadecuados para realizar la tinción de
completamente con un colorante de contraste durante Gram. Se pondrá de manifiesto la morfología de los dos
aproximadamente 1 minuto, en esta etapa las bacterias tipos de bacterias y de las células que las albergan, pero
gramnegativas se tiñen de rosa. Hay también varios carecerá de la diferenciación obtenida con la tinción de
colorantes de contraste: la safranina, rojo neutro y carbol- Gram. El uso principal es en la tinción de los frotis para
fucsina. La safranina y el rojo neutro son buenos colorantes el diagnóstico provisional de la gonorrea, ya que da una
para los frotis que contienen polimorfos, ya que estos dan imagen distintiva que tiene un alto valor diagnóstico en los
buena definición de la estructura de las células, mientras pacientes con riesgo elevado.
que la carbol-fucsina es preferible para las bacterias.
A1.9 Tinción de Giemsa
Los tiempos individuales de cada colorante pueden
La tinción de Giemsa es una tinción diferencial usada
variar, pero los tiempos absolutos no son cruciales. Sin
para el diagnóstico de la donovanosis. Es una mezcla
embargo, es importante recordar que mientras el primer
de azul de metileno, eosina y azur B y se encuentra
colorante (cristal violeta) actúa casi instantáneamente,
comercializada. Preparar un frotis, fijarlo con metanol
el colorante de contraste tiene un proceso más lento y
durante 30 segundos, sumergirlo en tinción de Giemsa
requiere más tiempo. Es aconsejable dejar la coloración
al 5% recién preparada durante 20 a 30 minutos, lavar y
de contraste el doble de tiempo que en el caso del
dejar que se seque.
primer colorante.
A1.10 Inmunofluorescencia
A1.7.3 Problemas y soluciones
La inmunofluorescencia es una técnica que se basa
Es muy importante que los colorantes estén
en la unión altamente específica de un anticuerpo
correctamente preparados y conservados para conseguir
con el antígeno correspondiente de forma se marcan
un frotis bien teñido. Los colorantes se comercializan
determinadas proteínas u otras moléculas de la
y actualmente es relativamente raro que se preparen
célula. La muestra se trata con un anticuerpo primario
a partir del polvo. Sin embargo, aun cuando los
específico de la molécula de interés. Se puede conjugar
colorantes sean comprados, ya sea listos para su uso o
directamente un fluoróforo con el anticuerpo primario.
concentrados para diluir antes de su uso, es importante
Otra posibilidad es conjugar un anticuerpo secundario
conservarlos correctamente. Deben conservarse en
con un fluoróforo, que se une específicamente al primer
frascos limpios y, si los frascos son reutilizables, debe
anticuerpo.
desecharse cualquier resto que haya de colorante y
luego enjuagarse con agua antes de rellenarlos. La
A1.11 Salud y seguridad
conservación inadecuada puede dar lugar a depósitos de
colorante sobre todo el frotis o adheridos a las células Se debe nombrar a una persona responsable de la
epiteliales, que podrían confundirse con las células clave salud y la seguridad en cada lugar de trabajo, ya
de la vaginosis bacteriana. sean consultorios o laboratorios. Los métodos de
tinción deben estar descritos en los procedimientos
El frotis debe tener un espesor adecuado; un frotis normalizados de trabajo, que deben actualizarse
demasiado grueso retendrá el colorante y no se podrá regularmente y que todo el personal debe haber leído y
ver la diferencia entre gramnegativos y grampositivos comprendido cabalmente.
y un frotis que sea demasiado delgado y tenga poco
material puede que no sea representativo de la muestra. Se debe seguir una serie de normas básicas:
La etapa de la decoloración es la más importante de la • No comer, fumar ni beber en la zona de laboratorio.

tinción de Gram y el exceso o defecto de decolorante
• Proporcionar buena ventilación a la zona de tinción
llevará a una clasificación de las bacterias incorrecta
para evitar la inhalación de gases y los riesgos de
como gramnegativas en lugar de grampositivas, o
incendio.
viceversa.

• Usar guantes y batas de laboratorio apropiadas • Guardar el material inflamable en una alacena
cuando se manipulen los reactivos de las tinciones, específica y alejado de cualquier fuente de calor.
ya que se sabe que son tóxicos; algunos colorantes
de Gram son cancerígenos. A1.12 Referencia
• Almacenar los colorantes cuidadosamente para evitar 6. British Association for Sexual Health and HIV (BASHH).
Microscopy for Sexually Transmitted Infections (http://
que se derramen. www.bsig-resources.org.uk/).
• No olvidarse de desechar los portaobjetos y
cubreobjetos de los pacientes infectados.
Anexo 2
Principios que rigen las pruebas diagnósticas rápidas en el

punto de atención
A2.1 Introducción
Recuadro 1: Criterios de una prueba rápida
En el Informe sobre la salud en el mundo del 2004 ideal (ASSURED, por su sigla en inglés)
se citan como razones principales del fracaso de
los servicios de salud la falta de asequibilidad y la A = Asequible
inaccesibilidad (1). En los países con una gran cantidad
de infecciones de transmisión sexual (ITS), a veces S = Sensible
no hay servicios de laboratorio para las ITS o, cuando
S = Específica
hay alguno, puede ocurrir que los pacientes no tengan
acceso físico o no puedan pagar estos servicios. La U = Sencilla (fácil de realizar en unos pocos pasos
OMS recomienda recurrir al manejo sindrómico, es decir, con la mínima capacitación)
tratar al paciente por todas las causas principales de un
R = Resistente y rápida (puede almacenarse a
síndrome particular (2). El manejo sindrómico de las ITS
temperatura ambiente y los resultados se
funciona bien en el caso de la secreción uretral, el dolor
obtienen en <30 minutos)
pelviano y las úlceras genitales, pero las evaluaciones
de los diagramas de la OMS han demostrado que E = Equipo mínimo (solar o con pilas) o sin
el algoritmo para el flujo vaginal carece tanto de necesidad de equipo.
sensibilidad como de especificidad para la detección
de infecciones por Chlamydia trachomatis y Neisseria
gonorrhoeae en mujeres. Se necesitan con urgencia A2.2 Características ideales de las pruebas
pruebas asequibles, sencillas y rápidas que puedan diagnósticas rápidas en el punto de
realizarse en el lugar en el que se presta la atención atención
de salud y faciliten el tratamiento y las decisiones de
Si el diagnóstico puede hacerse en el lugar en el que
manejo clínico de casos de estas infecciones. Las
se presta la atención de salud, se podrá comenzar sin
pruebas diagnósticas rápidas y sencillas en el punto
dilación el tratamiento, la asistencia y la notificación a
de atención se necesitan no solo para aumentar la
los colegas. En una reunión que tuvo lugar en el 2003
especificidad del manejo sindrómico y reducir el
del Programa Especial de Investigaciones y Enseñanzas
exceso de tratamiento de las infecciones genitales por
sobre Enfermedades Tropicales de la OMS (OMS/
gonococos y clamidias sino también para la detección
TDR), se acuñó la sigla ASSURED (véase el recuadro 1)
sistemática (tamizaje o cribado) de las ITS asintomáticas
para definir las características ideales de las pruebas
(3, 4, 5). Según los cálculos realizados con un modelo
diagnósticas rápidas en el punto de atención en
matemático, una prueba para detectar la sífilis que
no requiera ninguna infraestructura de laboratorio cualquiera de los niveles de un sistema de atención de
podría salvar más de 201 000 vidas y evitaría 215 000 salud (7 ).
mortinatos cada año en todo el mundo. Una prueba
similar podría ahorrar aproximadamente 4 millones de Pruebas rápidas frente a pruebas diagnósticas
años de vida ajustados en función de la discapacidad en el punto de atención
(AVAD), evitar más de 16 millones y medio de nuevas Las pruebas rápidas en general se han definido como
infecciones por clamidias y gonococos y evitar más de las pruebas cuyo resultado se obtiene en <30 minutos.
212 000 infecciones por el VIH cada año (6). Las pruebas diagnósticas en el punto de atención se
Anexo 2: Principios que rigen las pruebas diagnósticas rápidas en el punto de atención 189
definen como pruebas sencillas que pueden realizarse en Las pruebas diagnósticas rápidas y sencillas en el
todos los entornos de atención de salud, especialmente punto de atención para treponemas, que como su
en establecimientos de salud primaria, con capacitación nombre indica son sencillas y rápidas, desarrolladas
mínima y sin equipos (o equipos pequeños que funcionan como tests inmunocromatográficos (TIC) en formato de
con pilas o energía solar). De siempre, el examen flujo lateral o de tira reactiva, han demostrado tener un
microscópico de la tinción de Gram, el examen en fresco, rendimiento aceptable (8). Estas pruebas se realizan en
la determinación del pH, la prueba de Whiff o prueba muestras de sangre obtenida por punción en el dedo,
de aminas y la de la reagina plasmática rápida (RPR) o se conservan a temperatura ambiente hasta 18 meses,
el test serológico para la sífilis (en inglés TTS o VDRL) requieren capacitación mínima y el resultado se obtiene
han sido consideradas pruebas rápidas y, en principio, en 15 a 20 minutos. En la tabla A2.1 se resumen las
pueden proporcionar resultados inmediatos para orientar diferencias entre dos tipos de pruebas rápidas para el
el tratamiento. Sin embargo, algunas de estas pruebas serodiagnóstico de la sífilis.
necesitan electricidad para el funcionamiento del equipo,
Hay diversas pruebas rápidas comercializadas para
una centrifugadora o un microscopio, lo que significa que
el diagnóstico de las ITS (tabla A2.2). Las infecciones
no pueden realizarse en el lugar en el que se presta la
vaginales como la candidiasis, la vaginosis bacteriana
atención de salud si no hay una fuente de electricidad.
o la tricomoniasis pueden diagnosticarse con un
La prueba para detectar la reagina plasmática rápida de
microscopio y frotis teñidos con la tinción de Gram o
la sífilis es un ejemplo. Se realiza en solo 8 a 10 minutos,
el examen en fresco del flujo vaginal. Sin embargo,
pero a menudo el análisis es discontinuo (se acumulan
a menudo se prescribe un tratamiento empírico con
varias muestras para analizarlas de una vez) y, por
metronidazol a las pacientes con flujo vaginal, ya
consiguiente, no puede usarse para facilitar el análisis y
que los resultados de microscopia para la vaginosis
tratamiento inmediatos. Además, el reactivo de la RPR
bacteriana, la candidiasis o la tricomoniasis rara vez
requiere refrigeración, se necesita una centrifugadora para
pueden obtenerse durante la visita de una paciente al
separar el suero de la sangre entera y un rotador para
consultorio. Las pruebas rápidas que pueden ayudar al
mezclar los reactivos de la reacción. En consecuencia, la
diagnóstico de la vaginosis bacteriana son la detección
RPR, a pesar de su nombre, no se usa como una prueba
de pH ácido usando un pedazo de papel de pH o el olor a
rápida ni podría considerarse una prueba diagnóstica en el
aminas característico tras agregar hidróxido de potasio
punto de atención ya que no puede realizarse en entornos
al flujo vaginal.
en los que no hay electricidad.
Tabla A2.1: Diferencias entre dos tipos de pruebas rápidas, usando como ejemplo las pruebas no treponémicas
y las pruebas treponémicas rápidas
Prueba rápida Prueba rápida en el lugar de atención
Por ejemplo, prueba de la reagina plasmática rápida Por ejemplo, prueba treponémica
no treponémica (RPR)
Se realiza con suero o plasma (requiere centrifugadora) Se realiza con sangre entera, suero o plasma
El reactivo debe refrigerarse Los estuches de las pruebas pueden transportarse y
conservarse a temperatura ambiente
Se necesita personal capacitado y equipo (refrigerador, No se necesita ningún equipo y solo una capacitación
centrifugadora y rotador) mínima
Obtención de los resultados en 8 a 10 minutos Obtención de los resultados en 15 a 20 minutos
Los anticuerpos asociados a una infección reciente Los anticuerpos treponémicos persisten durante años; la
pueden usarse para distinguir una infección activa de otra medida de las exposición no puede usarse para distinguir
ya tratada y para la prueba de curación. una infección activa de otra ya tratada.
Dado que la mayoría de los estuches de pruebas rápidas como floculación. Se pone una cantidad pequeña de
no tienen controles internos de la calidad y se usan suero en un círculo de la placa, se le agrega una gota
generalmente fuera del laboratorio, es fundamental de reactivo que contiene la cardiolipina y partículas
que los programas de control desarrollen programas de carbono, y se remueve o se agita suavemente la
de garantía de la calidad para asegurar la calidad de la mezcla durante 8 minutos. Si la reacción antígeno-
prueba y de los métodos analíticos. Las precauciones anticuerpo es positiva, se forma un retículo en el que se
especiales cuando se usan estuches de pruebas rápidas quedan atrapadas las partículas de carbono, tal como
se enumeran en el recuadro 2 que figura a continuación. se muestra en figura A2.1. Las partículas de carbono
ayudan a la visualización de una reacción positiva. Un
aspecto homogéneo denota un resultado negativo. Un
Recuadro 2: Precauciones con el uso de exceso de anticuerpo en una muestra sérica puede
pruebas rápidas
dar lugar a un resultado negativo falso, dado que la
estructura reticulada antígeno-anticuerpo característica
• Antes del uso:
no puede formarse. Este resultado negativo falso se
–– Reparar en la fecha de caducidad de los conoce como fenómeno de prozona.
estuches de pruebas rápidas; no usar más
Algunas pruebas emplean, en vez de las partículas de
allá la fecha de vencimiento.
carbono, el colorante rojo de toluidina para mejorar la
–– Comprobar que todos los elementos visualización de los resultados de la prueba. Dado que la
se proveen según se indica en las lectura del resultado es subjetiva, es importante que el
instrucciones de uso. personal esté adecuadamente capacitado para realizar e
–– Observar el aspecto de la caja con el fin de interpretar los resultados de la prueba.
comprobar la integridad de la caja y que
los estuches de pruebas no se han dañado
en el transporte.
• Modo de empleo del estuche de pruebas:
–– Seguir las instrucciones que figuran en

el prospecto; no mezclar reactivos de
diferentes cajas.
• Después del uso:
–– Garantizar la eliminación adecuada de los Figura A2.1

objetos punzocortantes y otros desechos. Prueba de la reagina plasmática rápida (RPR)
Fuente: Van Dyck E, Meheus AZ, Piot P. Laboratory
diagnosis of sexually transmitted diseases. Ginebra,
A2.3 Fundamento técnico de las pruebas Organización Mundial de la Salud, 1999.
diagnósticas rápidas en el punto de
atención A2.3.1.2 Reacción de aglutinación con partículas de
látex
A2.3.1 Reacciones de aglutinación para detectar
antígenos o anticuerpos Las partículas de látex recubiertas con un antígeno,
como los antígenos treponémicos, ofrecen una prueba
A2.3.1.1 Floculación que puede ser más fácil de interpretar que la prueba de
En la prueba de la reagina plasmática rápida los la RPR que usa partículas de carbono. En un círculo de la
anticuerpos contra los antígenos no treponémicos, placa se mezcla una muestra sérica con las partículas de
como la cardiolipina, pueden detectarse en las muestras látex recubiertas durante 8 minutos. Si los anticuerpos
séricas con una reacción antígeno-anticuerpo conocida no treponémicos están presentes en el suero, se
Tabla A2.2: Pruebas rápidas para el diagnóstico de ITS
Pruebas ITS Equipo Costo Observaciones
aproximado
(US$)
Microscopia:
• Tinción de Gram Neisseria gonorrhoeae • Microscopio $0,50 95% de sensibilidad en
• Electricidad infecciones uretrales
• Oscuro campo Treponema pallidum en hombres sintomáticos,

(directo o con pero <50% en mujeres
anticuerpo
fluorescente
• Examen en fresco Tricomonas vaginalis
Candidiasis
Vaginosis bacteriana
• Células clave Vaginosis bacteriana
• Puntuación de
Nugent
pH Vaginosis bacteriana Ninguno
Aminas (KOH) Vaginosis bacteriana Ninguno $3–6
Floculación: Sífilis • Electricidad para el $0,20 A menudo el resultado no
• RPR funcionamiento de se da el mismo día debido
• VDRL la centrifugadora y al análisis discontinuo de
el rotador las muestras
• Microscopio
Pruebas rápidas Neisseria ninguno $6–20
gonorrhoeae
(Tiras inmuno- Chlamydia trachomatis $6–20
cromatográficas)
Tricomonas vaginalis $3–5

Sífilis $0,50–3,00
VIH $5–10
Virus del herpes simple $35
Detección Vaginosis bacteriana ninguno $3–6
enzimática (Gardnerella spp.)
PAAN Neisseria gonorrhoeae • Ensayos de RCP $15–35 Estos ensayos moleculares
Chlamydia trachomatis en tiempo real nuevos requieren muy
o ensayos de poca intervención del
amplificación usuario y los resultados
isotérmica se obtienen en 15 a 100
minutos
VIH: virus de la inmunodeficiencia humana; KOH: hidróxido de potasio; PAAN: prueba de amplificación de ácidos nucleicos; RCP: reacción en cadena
de la polimerasa; RPR: reagina plasmática rápida; ITS: infección de transmisión sexual; VDRL: test serológico para la sífilis (TSS).
producirá una aglutinación con las partículas de látex A2.3.2.2 Pruebas inmunocromatográficas de detección
recubiertas que se verá a simple vista. Una suspensión múltiple
de aspecto homogéneo denota un resultado negativo. Actualmente se encuentran comercializadas pruebas
Esta prueba está sujeta a resultados negativos falsos por inmunocromatografía de flujo lateral para
debido al efecto de prozona, similar al de la RPR. determinaciones dobles (VIH y sífilis) o múltiples (VIH,
sífilis y hepatitis B o C) que utilizan una única muestra
A2.3.2 Pruebas inmunocromatográficas de sangre obtenida por punción en el dedo. Varias
A2.3.2.1 Formato de flujo lateral de estas pruebas ya forman parte de los estudios o
ensayos clínicos. Recientemente se ha evaluado una
En el diseño de la inmunocromatografía para la detección
prueba rápida que puede detectar tanto anticuerpos
de anticuerpos, el anticuerpo marcado (conjugado) con
treponémicos como no treponémicos usando técnicas
un colorante, específico para el antígeno a analizarse
de doble vía patentadas y se ha visto que tienen un
(Ag), está presente en la parte inferior de la tira
rendimiento aceptable (9). Diversas empresas están
de nitrocelulosa o en un cerco que cubre la tira. El
desarrollando pruebas sencillas para detectar la sífilis
Anticuerpo, específico para otro epítopo presente en el
en secreciones bucales y pruebas dobles para sífilis y el
antígeno a analizar, está inmovilizado en la tira en una
VIH (10).
zona (línea) de detección delgada y el Ac específico
para el Ac marcado (conjugado) está unido a la zona A2.3.2.3 Formato de flujo continuo
(línea) de control. En la figura A2.2A se muestra una En vez de una tira como en el formato de flujo lateral,
representación esquemática de las cuatro etapas de algunas inmunocromatografías están configuradas
la progresión de una muestra (sanguínea, sérica o según un dispositivo de flujo continuo en el que los
plásmica) que contiene anticuerpos treponémicos a antígenos están adsorbidos en un disco de nitrocelulosa.
través de una tira inmunocromatográfica de flujo lateral. Se deja que el suero o el plasma fluya luego a través
En la etapa 1 la muestra se deposita en el pocillo de de los discos y se lava antes de añadir el conjugado
muestra, anticuerpos treponémicos, representados por de los marcadores de color que pone de manifiesto los
rombos amarillos, que fluyen del pocillo de la muestra a resultados.
la almohadilla de la zona de muestra. En la etapa 2 los
anticuerpos siguen migrando a través de la almohadilla A2.3.2.4 Lectores rápidos de pruebas
de la zona de conjugado y se unen al antígeno coloidal Hay varios lectores ópticos o escáneres sencillos de bajo
marcado con oro y forman un complejo oro-antígeno- costo que se comercializan en la actualidad y se emplean
anticuerpo. En la etapa 3, al cruzar este complejo la zona con las inmunocromatografías. El uso de estos lectores
de detección, se combina con el antígeno inmovilizado elimina el sesgo del observador, aumenta la sensibilidad
en la zona de detección y cuando se acumula suficiente y permite la cuantificación como en el caso de los títulos
cantidad de antígeno marcado, el colorante marcador se de anticuerpos no treponémicos.
hace visible a simple vista como una banda roja estrecha
(línea de detección). En la etapa 4 el conjugado libre es A2.4 Tecnologías nuevas
capturado por el anticuerpo inmovilizado en la línea de La inmunocromatografía tiene una sensibilidad suficiente
control y lo vuelve de color rojo. para detectar anticuerpos gracias a la gran cantidad de
anticuerpos presentes en la sangre, sin embargo, tiende
Si una muestra no contiene anticuerpos treponémicos,
a ser menos sensible para la detección de antígenos.
fluirá a través de la zona de conjugado y la zona de
La mayoría de las pruebas rápidas para la detección de
detección sin que esta aparezca de color rojo. El
infecciones genitales por clamidias y gonococos tienen
conjugado libre que fluye con la muestra solo pondrá
sensibilidades de solo 50% a 70% en comparación las
de color rojo la línea de control. Si una muestra no ha
pruebas de amplificación de ácidos nucleicos.
migrado desde el pocillo de muestra, no aparecerá
ninguna línea en la zona de detección ni en la zona de
control, esto indica que la prueba no es válida.
Muestra
Almohadilla absorbente Zona de muestra

Zona (línea) de control
Zona (línea) de detección Zona de conjugado
Figura A2.2A
Representación esquemática de una prueba de sífilis positiva en un formato inmunocromatográfico de flujo
lateral
Lectura de los resultados de la prueba:
C T Un resultado negativo muestra en la ventana solo la línea

S de control (C).
negativo
C T Un resultado positivo muestra en la ventana la línea de

S prueba (P) y la línea de control.
positivo
C T Un resultado incorrecto no presenta ninguna línea en la

S ventana. La muestra (M) no ha logrado migrar a lo largo
de la tira o la prueba ya no funciona.
indeterminado
Figura A2.2B
Interpretación de una prueba de flujo lateral para la detección de anticuerpos treponémicos de un paciente
con sífilis
A2.4.1 Análisis microfluídico Amplificación por recombinasa polimerasa (RPA, por
Se han desarrollado técnicas de análisis microfluídicas sus siglas en inglés): es un ensayo que dura 15 minutos
que pueden detectar múltiples analitos en una única y puede tener la misma sensibilidad y especificidad
muestra o pueden reproducir todas las características que la mayoría de las pruebas moleculares más
de desempeño de un inmunoensayo y se han aplicado recientes. Es una técnica de acoplamiento isotérmico
al VIH y la sífilis (11, 12). La técnica tiene pocas partes de cebadores mediante recombinasa con la síntesis
móviles y los chips cuestan muy poco, lo que los hace posterior de DNA por desplazamiento de cadena. En
apropiados para los entornos de escasos recursos. Los el ensayo se usan recombinasas capaces de aparear
resultados pueden leerse con un dispositivo pequeño los oligonucleótidos cebadores con las secuencias
que funciona con una pila. Algunas de estas técnicas ya homólogas en el DNA bicatenario (14). Este ensayo
están usándose ahora en ensayos clínicos en África. puede lograr una amplificación exponencial a partir de
solo unas pocas copias diana sin necesidad de escindir
En general, estas técnicas funcionan bien para la el DNA bicatenario antes de la amplificación. Todos los
detección de anticuerpos en la sangre debido a la reactivos requeridos para este ensayo se estabilizan con
abundancia de moléculas diana. Para otras muestras formulaciones secas y pueden transportarse con total
como la orina o las obtenidas con un hisopo, será seguridad sin refrigerar. Los resultados se leen con un
necesario el procesamiento previo de la muestra fluorímetro o visualmente en una tira de flujo lateral.
antes de introducirla en el cerco. Para la detección de
antígenos, el mayor obstáculo es conseguir suficientes Amplificación dependiente de helicasa (HDA, por sus
moléculas diana en las zonas de detección. siglas en inglés): es un procedimiento de amplificación
isotérmico, con un solo tubo, que puede detectar
A2.4.2 Ensayos moleculares rápidos secuencias cortas de DNA (80–120 bp). Los resultados
están disponibles en menos de dos horas. Sin embargo,
Los avances recientes en los sistemas analíticos
los reactivos deben conservarse a –20 °C.
o plataformas integradas para la amplificación de
ácidos nucleicos han dado lugar a instrumentos para Amplificación mediante cebadores cruzados (cross
el diagnóstico de enfermedades infecciosas que son priming o CPA, por sus siglas en inglés): es un tipo de
sensibles, específicos, fáciles de usar y la obtención de reacción isotérmica de amplificación de ácidos nucleicos
los resultados se produce poco después de introducir que utiliza múltiples cebadores y sondas, uno o más
las muestras (13). Esta tecnología es propicia para de estos es un cebador cruzado. La reacción se basa
la detección múltiple de patógenos compatibles con en el uso de una DNA-polimerasa con actividad de
síndromes de ITS graves. El sistema GeneXpert para desplazamiento de cadena sin necesidad de un paso
la detección doble de clamidias y gonococos a partir inicial de desnaturalización ni adición de enzimas de
de una única muestra tiene un rendimiento razonable restricción (15). A la temperatura de ensayo de 63 °C,
comparado con el cultivo y la RCP en tanto que patrones la formación de un híbrido transitorio cebador-molde, la
de referencia. Puede obtenerse un resultado en menos producción de bucles espontáneos de desnaturalización
de dos horas. El analizador permite un acceso libre, del DNA molde, está favorecida por la alta concentración
lo que lo hace más eficaz en función de los costos si de cebadores complementarios que se rehibridan a
el equipo puede usarse para diferentes enfermedades las cadenas molde. El desplazamiento de la cadena se
infecciosas. promueve mediante la hibridación de los cebadores
cruzados con extremos 5’ que no son complementarios
Hay algunas técnicas de amplificación isotérmica de
de la cadena molde y por la unión del cebador de
ácidos nucleicos prometedoras que son rápidas y
desplazamiento en dirección 5’ del cebador cruzado. La
fáciles de realizar. Y se están poniendo a punto para
amplificación exponencial del DNA diana que resulta es
la detección de enfermedades infecciosas, como la
sumamente específica y sensible, y produce amplicones
clamidiosis y la gonorrea.
a partir de tan sólo cuatro células bacterianas.
Amplificación por círculo rodante (RCA, por sus siglas 7. Kettler H, White K, Hawkes S. Mapping the landscape of
en inglés) y amplificación círculo a círculo (C2CA, diagnostics for sexually transmitted infections. WHO/
TDR publication. World Health Organization on behalf of
por sus siglas en inglés): son plataformas integradas de the Special Programme for Research and Training in
amplificación isotérmica con detección electroforética Tropical Diseases, 2004.
posterior de un gen específico en una micromatriz 8. Mabey D et al. Prospective, multi-centre clinic-based
genética (microchip) de poli(metil metacrilato) (16). La evaluation of four rapid diagnostic tests for syphilis.
Sexually Transmitted Infections, 2006, 82(Suppl
RCA y la C2CA se llevan a cabo a 37 °C en el pocillo de
5):v13–16.
muestra de la micromatriz y proporciona un método para
la amplificación de señales que es sensible, rápido, de 9. Castro AR et al. Novel point-of-care test for
simultaneous detection of nontreponemal and
capacidad analítica ultrarrápida y reproducible. treponemal antibodies in patients with syphilis. Journal
El progreso rápido en las tecnologías de secuenciación,
10. Tucker JD, Bien CH, Peeling RW. Point-of-care testing
como la tecnología de detección de nanoporos, ha
for sexually transmitted infections: recent advances and
permitido llevar a cabo amplios barridos del genoma implication for disease control. Current Opinion in
rápidamente y a un costo relativamente bajo. Estas Infectious Diseases, 2013, 26(1):73–79.
tecnologías pueden aplicarse a la detección de los genes 11. Sorger PK. Microfluidics closes in on point-of-care
que confieren resistencia gonocócica. assays. Nature Biotechnology, 2008,
26(12):1345–1346.
A2.5 Referencias 12. Chin CD et al. Microfluidics-based diagnostics of
infectious diseases in the developing world. Nature
1. Devarajan S, Reinikka-Soininen R, World Bank. Making Medicine, 2011, 17(8):1015–1019.
services work for poor people: world development report
2004. Nueva York, Oxford University Press para el 13. Niemz A, Ferguson TM, Boyle DS. Point-of-care nucleic
Banco Mundial, 2003. acid testing for infectious diseases. Trends in
Biotechnology, 2011, 29(5):240-250.
2. Guidelines for the management of sexually transmitted
infections. Ginebra, Organización Mundial de la Salud, 14. Piepenburg O et al. DNA detection using recombination
2003. proteins. PLoS Biology, 2006, 4(7):e204.
3. Peeling RW et al. Why do we need quality-assured 15. Xu G et al. Cross priming amplification: mechanism and
diagnostic tests for sexually transmitted infections? optimization for isothermal DNA amplification. Scientific
Nature Reviews. Microbiology, 2006, 4(12):909–921. Report, 2012, 2:246.
4. Peeling RW et al. Rapid tests for sexually transmitted 16. Mahmoudian L et al. Rolling circle amplification and
infections (STIs): the way forward. Sexually Transmitted circle-to-circle amplification of a specific gene
Infections, 2006, 82(Suppl 5):v1–6. integrated with electrophoretic analysis on a single
chip. Analytical Chemistry, 2008, 80(7):2483-2490.
5. Peeling RW. Applying new technologies for diagnosing
sexually transmitted infections in resource-poor
settings. Sexually Transmitted Infections, 2011,
87(Suppl 2):ii28–30.
6. Aledort JE et al. Reducing the burden of sexually

transmitted infections in resource-limited settings: the
role of improved diagnostics. Nature, 2006, 444(Suppl
1):59–72.
Anexo 3
Principios que rigen las pruebas moleculares para el

diagnóstico de las infecciones de transmisión sexual
A3.1 Introducción
Las infecciones de transmisión sexual (ITS) pueden ser ITS se utilizan muchas PAAN comercializadas e incluso
causadas por virus, bacterias o parásitos, y no es raro PAAN con sondas únicas o múltiples sondas (múltiplex)
que se produzcan coinfecciones. Las muestras clínicas desarrolladas en el laboratorio. En el caso de que se
para el análisis de las ITS se obtienen de diversas zonas utilicen PAAN no autorizadas por la FDA, deben existir
del organismo —usando para ello diferentes dispositivos procesos normativos internacionales —como los de la
y técnicas—, así como en distintos entornos en los que Unión Europea— u otros procesos normativos nacionales
hay grandes variaciones en lo que respecta al transporte que garanticen la calidad y el rendimiento de dichas
y a la conservación de las muestras, así como diversos PAAN. Para el diagnóstico de las ITS, se recomienda
recursos para el diagnóstico de las ITS. En consecuencia, usar solo PAAN aprobadas internacionalmente. Si ello
para lograr un eficaz diagnóstico de laboratorio de las no fuera posible, es esencial que la PAAN propuesta
ITS en todo el mundo, existen muchos métodos, y su haya sido estrictamente validada antes de utilizarla
sensibilidad, especificidad y reproducibilidad para analizar conforme a las normas locales. La evaluación debe
una sola infección o ITS muy diversas pueden diferir hacerse comparándola al menos con una PAAN aprobada
significativamente. Entre los métodos de laboratorio internacionalmente, y el ensayo se utilizará después con
tradicionales para detectar los microorganismos causales los controles positivo, negativo y de inhibición apropiados.
de las ITS se encuentran el cultivo bacteriológico y el Por otra parte, es muy recomendable la participación
cultivo de tejidos, diversos análisis serológicos para en un sistema de evaluación externa de la calidad (EEC)
detectar la presencia de anticuerpos específicos, la apropiado.
inmunohistoquímica, la detección de antígenos y la
En muchos casos, se prefiere usar las PAAN antes
microscopia. Al igual que ocurre con el diagnóstico
que los métodos diagnósticos convencionales, debido
de muchas otras enfermedades infecciosas, la
a su sensibilidad y especificidad superiores, a su
detección directa de ácidos nucleicos específicos de los
menor tiempo de respuesta, a su gran rendimiento
microorganismos patógenos que causan las ITS mediante
y a la posibilidad de automatización, de análisis
diferentes pruebas de amplificación de ácidos nucleicos
simultáneo de varias dianas y de cuantificación.
(PAAN) se ha convertido en la prueba de referencia en el
Debido a su gran sensibilidad, las PAAN son también
diagnóstico de muchas ITS, ya que su sensibilidad y su
efectivas en la detección de microorganismos en
especificidad son superiores. Muchas de las PAAN han
caso de infecciones asintomáticas o en una fase
recibido la autorización de la Administración de Alimentos
temprana de la infección (antes de la seroconversión),
y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) o de otras
y pueden aplicarse a muestras obtenidas por el
instancias normativas internacionales, nacionales o
propio sujeto y de manera incruenta, como las
regionales, y se comercializan. Sin embargo, también es
muestras vaginales y las muestras de orina de la
popular el uso de ensayos desarrollados en el laboratorio
primera parte de la micción.
que utilizan métodos de detección basados en la reacción
en cadena de la polimerasa (RCP) convencional o en la El diagnóstico molecular de las ITS mediante pruebas
RCP en tiempo real (RCP simultánea) para el diagnóstico basadas en los ácidos nucleicos es muy sólido, pero
de las ITS, especialmente en el campo de la investigación presenta algunas limitaciones. Una de las ventajas de
y la epidemiología. Hoy en día, para el diagnóstico de las las PAAN es su capacidad de detectar microorganismos
Anexo 3: Principios que rigen las pruebas moleculares para el diagnóstico de las infecciones de transmisión sexual 197
patógenos sin necesidad de que estos estén vivos, lo En teoría, una PAAN diseñada adecuadamente puede
que hace que el transporte y la conservación de las detectar con gran especificidad incluso una sola diana en
muestras no sean tan cruciales; sin embargo, esto una muestra. Sin embargo, para alcanzar este nivel de
también constituye uno de sus puntos débiles (por límite de detección se requieren procesos prolongados
ejemplo, las cepas aisladas no están disponibles para de optimización de la PAAN. Por otra parte, en la
realizar posteriormente el antibiograma o para otro tipo sensibilidad analítica de las PAAN pueden influir diversos
de caracterización fenotípica). En consecuencia, las factores, como factores inherentes de cada muestra
PAAN detectan el ácido nucleico de microorganismos clínica —inhibidores, tipo de muestra, número de copias
muertos y vivos, por lo que no son apropiadas como de la secuencia diana—, así como la tecnología de
prueba de curación, a no ser que se haya dejado extracción, amplificación y detección de ácidos nucleicos
pasar suficiente tiempo para que los microorganismos que se utilice. Existen cinco etapas cruciales en las
residuales, así como los ácidos nucleicos, se eliminen pruebas basadas en los ácidos nucleicos: obtención de
del huésped infectado antes de obtener una muestra la muestra; estabilización, conservación y transporte de
para la prueba de curación. Además, la estrecha relación la muestra; extracción y purificación de ácidos nucleicos;
genética entre el microorganismo en cuestión y especies amplificación y detección. Todas las etapas tienen una
estrechamente relacionadas —por ejemplo, Neisseria importante relación con la calidad y la fiabilidad de los
gonorrhoeae y Neisseria spp. comensal— puede dar resultados de las pruebas de laboratorio. Para que una
lugar a resultados positivos falsos (1, 2). También PAAN diagnostique satisfactoriamente las ITS, es preciso
pueden obtenerse resultados negativos falsos debido a obtener de manera adecuada una muestra clínica de la
una variación de la secuencia o a una supresión de la zona anatómica apropiada, y los ácidos nucleicos de las
secuencia diana específica en el microorganismo que dianas deben estabilizarse en el medio de transporte
debe detectarse a causa de una mutación, como la para su conservación y traslado. En el laboratorio, es
nueva variante sueca de Chlamydia trachomatis (nvCT) crucial contar con un sistema eficiente de extracción
(3, 4). El futuro inmediato del diagnóstico molecular de y purificación de ácidos nucleicos para preparar la
las ITS debe centrarse en validar y autorizar el uso de muestra, a fin de producir una plantilla de RCP pura que
diferentes ensayos en muestras rectales y faríngeas, esté libre de nucleasas e inhibidores contaminantes.
y en la expansión de la ciencia de los microfluidos Posteriormente, es esencial una PAAN adecuadamente
y la nanotecnología actuales que permita integrar diseñada y optimizada para lograr una amplificación
la obtención, estabilización y manipulación de las eficiente de modo que se produzcan suficientes
muestras, así como el desarrollo de procesos de análisis amplicones de RCP; por último, pero no por eso menos
que dé lugar a sistemas asequibles, completamente importante, es preciso contar con una estrategia de
automatizados, de gran rendimiento y fácil utilización. detección adecuada para producir señales de positividad
En los países desarrollados, las aplicaciones en el claras e intensas y señales evidentemente negativas en
punto de atención pueden ser centro de la expansión caso de negatividad. Se considera que la complejidad
del catálogo de detección de microorganismos
del proceso de realización de la PAAN es media o
patógenos causantes de las ITS, la incorporación de
alta, y generalmente es necesario contar con personal
la detección cuantitativa y el establecimiento de la
adecuadamente capacitado y laboratorios sofisticados.
tipificación molecular o la detección de marcadores de
la resistencia a los antimicrobianos en un solo ensayo La gran sensibilidad de las PAAN puede ser
de multiplexado. En los países de recursos limitados, las problemática, dado que incluso un grado de
necesidades más importantes sobre el terreno son una contaminación muy bajo puede dar lugar a resultados
instrumentación asequible y sostenible con procesos de positivos falsos. La posibilidad de contaminación, que
análisis simplistas, menor tiempo de manipulación y un es la principal preocupación de muchos laboratorios
sistema cerrado para reducir el riesgo de contaminación, de diagnóstico molecular, afecta prácticamente a
capacidad analítica y reactivos de las pruebas que sean todas las etapas del procesamiento basado en los
económicos. ácidos nucleicos. En algunos métodos, la adición
Cuadro A3.1: Ejemplos de pruebas comercializadas para el diagnóstico de las ITS basadas en ácidos nucleicos
(junio del 2012)
Microorganismos analizados Tecnología Empresa

Chlamydia trachomatis (CT), Neisseria RCP Roche, Cepheid
gonorrhoeae (NG) o ambas (CT/NG) TMA-HPA Gen-Probe
CH (sonda de DNA) Gen-Probe
RCP en tiempo real Abbott, Roche, Siemens
SDA Becton, Dickinson
CH (sonda de RNA) Qiagen
VIH RT-RCP Roche
RCP en tiempo real
RCP en tiempo real Abbott
NASBA bioMérieux
RCP en tiempo real
RT-RCP National Genetics Institute
bDNA Siemens
Genotipado del VIH Secuenciación Siemens

Secuenciación Abbott
PVH RCP en tiempo real Abbott

TMA-HPA Gen-Probe
CH Qiagen
RCP Roche
Genotipado del PVH RCP Roche

RCP-hibridación en línea Innogenetics
VHB RCP en tiempo real Roche

bDNA Siemens
CH Qiagen
Genotipado del VHB Secuenciación Siemens

VHC RCP en tiempo real Roche
RT-RCP
RT-RCP National Genetics Institute
bDNA Siemens
Genotipado del VHC RT-RCP Abbott

VHS RCP en tiempo real Abbott
RCP en tiempo real Roche
RCP en tiempo real Qiagen
RCP en tiempo real EraGen Biosciences
SDA Becton, Dickinson
Amplificación isotérmica dependiente BioHelix
de helicasa
Cuadro A3.1: Ejemplos de pruebas comercializadas para el diagnóstico de las ITS basadas en ácidos nucleicos
(junio del 2012) (continuación)
( )
Microorganismos analizados Tecnología Empresa

Trichomonas vaginalis TMA-HPA Gen-Probe
C. trachomatis, N. gonorrhoeae y RCP Bio-Rad Laboratories
Mycoplasma genitalium
Gardnerella vaginalis, T. vaginalis y Candida Hibridación de sondas de DNA Becton, Dickinson

spp.
bDNA: ensayo de hibridación de DNA ramificado; CH: captura de híbridos; HPA: ensayo de protección de la hibridación; PVH: papilomavirus
humano; VHS: virus del herpes simple; NASBA: amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico; RCP: reacción en cadena de la polimerasa;
RT-RCP: RCP con transcripción inversa; SDA: amplificación por desplazamiento de cadena; TMA: amplificación mediada por transcripción; VHB:
virus de la hepatitis B; VHC: virus de la hepatitis C; VIH: virus de la inmunodeficiencia humana.
de una enzima, como la uracilo N-glicosilasa, a la para dar lugar a suficientes productos amplificados que
preparación de mezcla de componentes de la RCP ayuda deben convertirse, mediante diferentes tecnologías, en
a reducir la contaminación remanente por amplicones señales de detección. La segunda categoría (tecnología
mediante la degradación de estos, pero no impide la basada en ácidos nucleicos sin amplificar) utiliza
contaminación del DNA genómico directamente de sondas de ácidos nucleicos sin amplificar (por ejemplo,
muestra a muestra. Así pues, los requisitos previos marcados con enzimas) que se hibridan directamente
para lograr una PAAN satisfactoria son las buenas a la plantilla deseada; posteriormente, a través, por
prácticas de laboratorio molecular, un flujo de trabajo ejemplo, de reacciones entre enzima y sustrato, se
unidireccional, salas separadas para la extracción de amplifican y detectan las señales. Las tecnologías
ácidos nucleicos de las muestras, la preparación de basadas en ácidos nucleicos sin amplificar suelen ser
mezcla de componentes de la RCP y el análisis. Otra menos caras, y la sensibilidad analítica supera a la de los
alternativa para reducir la posibilidad de contaminación métodos diagnósticos convencionales, como el cultivo
es utilizar un sistema cerrado y robótico, como en o los enzimoinmunoanálisis (EIA), si bien su sensibilidad
muchas plataformas comerciales para la realización de es sustancialmente inferior a las de las tecnologías de
pruebas diagnósticas de las ITS. Aparte de la obtención amplificación. En el cuadro A3.1 se enumeran algunas
de muestras en el correspondiente medio de transporte de las pruebas diagnósticas basadas en ácidos nucleicos
patentado, las restantes etapas del proceso de PAAN para el diagnóstico molecular de las ITS que estaban en
están completamente automatizadas, lo que elimina el mercado cuando se redactó este anexo.
las laboriosas etapas de procesamiento de muestras.
Sin embargo, la complejidad de la prueba molecular, la A3.2 Tecnologías de ácidos nucleicos
necesidad de equipo sofisticado y a menudo caro, los amplificados
costosos estuches de las PAAN, así como la necesidad Las PAAN son las pruebas de diagnóstico molecular
de contar con técnicos experimentados, pueden más sensibles y a la vez complejas y, por lo general,
constituir un obstáculo para los laboratorios con pocos tienen un rendimiento superior en lo que se refiere a la
recursos. sensibilidad, en comparación con las pruebas directas
basadas en sondas (sin amplificar), así como las demás
Al momento de redactarse este anexo (junio del 2012),
clases de pruebas diagnósticas. Algunas de las primeras
existían dos categorías principales de tecnologías
PAAN para el diagnóstico de las ITS se han automatizado
diagnósticas para la identificación de las ITS mediante
parcialmente para reducir los requisitos laborales,
métodos moleculares. Una categoría (tecnologías de
pero siguen teniendo el riesgo de contaminación.
ácidos nucleicos amplificados, como las PAAN), la más
Actualmente, las plataformas de análisis de segunda
utilizada, se basa en la amplificación de ácidos nucleicos
generación que se encuentran en el mercado cuentan
específicos (DNA o RNA) del microorganismo diana
Cuadro A3.2: Pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (junio del 2012)
Prueba
Tecnología Empresa Diana Enzimas
isotérmica
RCP Roche No DNA DNA-polimerasa
RCP en tiempo real Abbott, Roche No DNA DNA-polimerasa
TMA Gen-Probe Sí RNA Retrotranscriptasa y RNA-polimerasa
SDA Becton, Dickinson Sí DNA DNA-polimerasa y endonucleasa de restricción
NASBA bioMérieux Sí RNA Retrotranscriptasa, RNasa H, RNA-polimerasa
NASBA: amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico; RCP: reacción en cadena de la polimerasa; SDA: amplificación por
desplazamiento de cadena; TMA: amplificación mediada por transcripción.
con módulos de procesamiento de muestras mejorados someterían a análisis de utilizar estrategias tradicionales.
y están completamente automatizadas para lograr un Ahora se dispone de alternativas, como la obtención
diagnóstico molecular sumamente eficiente y libre de domiciliaria de muestras para los programas de tamizaje
contaminación, así como el tamizaje a gran escala. Los fuera de los consultorios de ITS o de los consultorios de
sistemas comerciales de diagnóstico molecular basados planificación familiar, cuando no se necesita una muestra
en la amplificación se han centrado principalmente obtenida por el médico. La orina de la primera parte
en ensayos para la detección de N. gonorrhoeae, C. de la micción o las muestras vaginales obtenidas por
trachomatis, el virus del herpes simple (VHS), el virus los propios pacientes son más que aceptables para los
de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la programas de detección sistemática de C. trachomatis
hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC) y el y N. gonorrhoeae cuando se utilizan con tecnologías de
virus de los papilomas humanos (VPH). Además de ácidos nucleicos amplificados. La obtención incruenta
la detección cualitativa de virus, la cuantificación de de muestras diagnósticas puede constituir un medio
la carga viral en muestras clínicas tiene gran valor, y para llegar a personas sexualmente activas que deberían
está disponible para hacer el diagnóstico, establecer someterse al tamizaje de las ITS pero carecen de un
el pronóstico y hacer la vigilancia del efecto del acceso adecuado a la atención de salud o temen las
tratamiento de la infección por el VIH, el VHB y el VHC. exploraciones ginecológicas. También puede ahorrar
En el cuadro A3.2 se indican algunas de las tecnologías costos cuando no es preciso que el médico realice
de amplificación de ácidos nucleicos disponibles en el exploraciones ginecológicas onerosas.
mercado y se muestran las empresas que comercializan
estas pruebas, sean o no isotérmicas, así como el tipo A3.2.1 Reacción en cadena de la polimerasa
de diana y las enzimas que utilizan. Como ya se ha (RCP)
mencionado, uno de los principales puntos fuertes de La RCP se desarrolló en 1983 (5, 6) y a menudo se
estos ensayos amplificados sumamente sensibles es la considera uno de los más importantes avances
su capacidad de analizar tipos de muestras obtenidos científicos en los campos de la biología y la medicina.
de forma incruenta, como las muestras de orina de Actualmente es una técnica fundamental y a menudo
la primera parte de la micción y muestras vaginales, indispensable, ampliamente usada en biología molecular,
que pueden obtener los propios pacientes. El uso microbiología, diagnóstico clínico y muchas otras
satisfactorio de ensayos amplificados con multiplexado aplicaciones.
y de tipos de muestras obtenidos de forma incruenta
El nombre RCP proviene de la DNA-polimerasa utilizada
ha facilitado enormemente el proceso de tamizaje, algo
para amplificar una secuencia específica de DNA
que es particularmente importante ya que la mayoría
mediante replicación enzimática in vitro. La fase inicial
de las ITS son asintomáticas y su detección depende
de calentamiento (por lo general a 94 ºC a 95 ºC)
del tamizaje de poblaciones que normalmente no se
Colaboradores
del DNA DNA Nucleótidos
polimerasa (dTTP, dCTP, dATP, dGTP)
P P
Taq
DNA original P P
P P
Etapa 1: Cadena plantilla de DNA
desnaturalización
(95°C) 5' 3' 5' 3'
Etapa 2:
apareamiento 3' P 5'
Dos cadenas de DNA Sección de DNA que se
amplificará
(55°C) 5' P 3'
Etapa 3: síntesis (72°c)

3' 5' 3' 5'
Taq
5' 3' 5' 3'
Repetición del
ciclo 3' P 5' P 5'
(20 a 40 veces)
Nuevas cadenas de DNA
5' P 3' 5' P
3' 5' 3' 5'

Cuatro cadenas de DNA Taq
Figura A3.1
Reacción en cadena de la polimerasa (RCP): un proceso de tres etapas
Fuente: Por cortesía de Encyclopædia Britannica, Inc. (http://www.britannica.com/EBchecked/media/18071/The-three
step-process-of-the-polymerase-chain-reaction; consultado el 23 de junio del 2013).
desnaturaliza el DNA bicatenario (dsDNA) diana original aparato denominado termociclador, que está equipado
y da lugar a dos cadenas de DNA complementarias, con elementos o ventiladores para calentar o enfriar a
lo que permite que los cebadores se apareen a menor fin de alterar rápidamente la temperatura y así permitir
temperatura (dependiendo del cebador) con sus la desnaturalización del DNA, el apareamiento de
secuencias complementarias, flanqueando la secuencia los cebadores y la extensión. Es importante señalar
específica que debe amplificarse. A continuación, la que el mantenimiento apropiado y la verificación de
extensión (generalmente a 72 °C) de los cebadores las temperaturas y la duración de la rampa de los
es catalizada por una DNA-polimerasa termoestable termocicladores son fundamentales para conseguir
(como la Taq DNA-polimerasa), que sintetiza dos nuevas resultados de gran calidad y reproducibles.
cadenas de DNA usando trifosfodesoxirribonucleósidos
(dNTP) y las cadenas originales como plantillas. Este La tecnología de RCP ha revolucionado la detección y
proceso (figura A3.1) da lugar a la duplicación de la la caracterización de microorganismos que provocan
secuencia del DNA diana original, y cada una de las enfermedades infecciosas, incluidos los que causan
nuevas moléculas contiene una hebra antigua de las ITS. Tradicionalmente, los amplicones específicos
DNA y una nueva. Posteriormente, cada una de estas producidos por RCP se detectaban mediante
cadenas puede usarse para crear dos nuevas copias, electroforesis en gel teñido con bromuro de etidio. Otros
y así sucesivamente. Numerosos ciclos repetitivos de métodos de detección de amplicones son el uso de
desnaturalización, apareamiento y extensión pueden sondas de captura y detección (marcadas, por ejemplo,
traducirse en una acumulación exponencial de un con enzimas o moléculas fluorescentes) en formato
fragmento de DNA específico. Estos ciclos de RCP de de micropocillos, y la determinación del tamaño de los
tres etapas pueden repetirse hasta 30 o 40 veces, productos de la RCP usando un aparato Genetic Analyzer
dando lugar a millones de copias de la secuencia de (Applied Biosystems) o un Bioanalyzer (Agilent). Para
DNA diana original. Todo el proceso cíclico de la RCP ampliar el uso y los beneficios de la técnica de RCP
está automatizado, es programable y puede finalizarse original se han hecho numerosas modificaciones
en apenas unas pocas horas. Se lleva a cabo en un y adaptaciones, entre las que se encuentran las
siguientes técnicas: RCP anidada, RCP con gradiente base de una RCP en tiempo real es el nivel de la señal
decreciente de temperatura, RCP de inicio en caliente, durante los 5 a 15 ciclos iniciales, en los que la señal
RCP por retrotranscriptasa (RT) (para dianas de RNA), fluorescente cambia poco, mientras que el umbral es
RCP asimétrica, RCP digital, RCP múltiplex, RCP el nivel de señal que refleja un aumento significativo
semicuantitativa y RCP cuantitativa en tiempo real. respecto a la señal inicial calculada. El umbral puede
establecerse automáticamente mediante el programa
A3.2.2 RCP en tiempo real informático del equipo o bien lo puede establecer
El principio de la RCP en tiempo real es idéntico al manualmente el usuario. El umbral de ciclos (Ct) es el
de la RCP convencional salvo en que los procesos de número de ciclos de RCP en los que la señal fluorescente
amplificación y detección se combinan para permitir de la reacción supera el umbral. En consecuencia, la
el control de la amplificación de la RCP a medida que presencia de un umbral de ciclos refleja la acumulación
ocurre, en tiempo real; la RCP convencional solo puede de un número suficiente de amplicones para considerar
hacer mediciones finales, es decir, detectar o visualizar que la reacción es positiva, y el umbral de ciclos está
los productos de la RCP tras finalizar la amplificación. El inversamente relacionado con la cantidad de plantilla
inicial. Los datos de la RCP en tiempo real suelen
avance más importante del diseño de una RCP en tiempo
mostrarse en un gráfico con el número de ciclos de RCP
real es la incorporación de una tecnología de detección
en comparación con la intensidad de la fluorescencia,
basada en la fluorescencia que utiliza colorantes de
que se relaciona con el número de plantillas iniciales.
unión al DNA bicatenario (dsDNA) o sondas marcadas
En la figura A3.2 se muestra una curva característica de
con moléculas fluorescentes específicas (como sondas
amplificación de la RCP en tiempo real.
hidrolizables, de hibridación o conformacionales, balizas
moleculares) para permitir no solo la detección de la Dos métodos frecuentes para detectar productos de
diana de ácido nucleico específica, sino también la amplificación en la RCP en tiempo real son: la detección
cuantificación de la diana (Q-RCP). Además, la RCP en inespecífica usando colorantes fluorescentes que se
tiempo real integra y automatiza la amplificación y la intercalan con cualquier DNA bicatenario, como SYBR
detección en un solo equipo, lo que a menudo requiere Green; y la detección específica mediante sondas
menos tiempo y trabajo para obtener resultados, en fluorescentes específicas de las dianas, como la sonda
comparación con la RCP convencional. Otras ventajas
de la RCP en tiempo real son el uso de secuencias
Rn
diana más cortas (<150 bp), la necesidad de un menor Meseta
2.000.000
volumen de muestras, un intervalo de detección
dinámico más amplio, mayor sensibilidad y especificidad
analítica, la capacidad de multiplexado y el análisis de Muestra
las curvas de fusión, así como el hecho de que no se 1.000.000
requiera la manipulación posterior a la RCP. Fase
Umbral CT exponencial
Para controlar la amplificación durante la RCP en tiempo
real, se usan moléculas indicadoras fluorescentes
0
(fluoróforos) para generar señales de fluorescencia. La Linea de base Sin plantilla
mayoría de los sistemas de RCP en tiempo real usan 0 20 40

Número de ciclos de RCP
una matriz fija de un dispositivo emisor de luz para la
excitación de la fluorescencia y una cámara con un Figura A3.2
dispositivo de carga acoplada o un tubo fotomultiplicador Curva característica de amplificación de la RCP en
tiempo real
con filtros adecuados para detectar la fluorescencia.
Fuente: Por cortesía del National Center for Biotechnology
El aumento de la señal fluorescente es directamente Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/
proporcional al número de amplicones de RCP generados probe/doc/TechQPCR.shtml; consultado el 23 de junio del
en la fase exponencial de la reacción. La línea de 2013).
TaqMan (sonda hidrolizable), balizas moleculares o sondas gran especificidad, debido a que el colorante se une
de hibridación dobles. SYBR Green es probablemente el indiscriminadamente a todos los DNA bicatenarios que
colorante de unión al DNA bicatenario que más se utiliza se forman durante la RCP y, en consecuencia, cualquier
en la RCP en tiempo real. En la solución, las moléculas producto espurio de la amplificación puede contribuir
de colorante no unidas muestran una fluorescencia muy también a las señales fluorescentes generales. Sin
escasa, pero la fluorescencia aumenta significativamente embargo, la amplificación que usa colorantes de unión
cuando se unen al DNA bicatenario. A medida que el DNA al DNA bicatenario puede someterse a análisis de las
bicatenario se acumula, SYBR Green genera señales que curvas de fusión para diferenciar los productos de la RCP
son proporcionales a la concentración del DNA diana específicos e inespecíficos mediante los picos de fusión
(fig. A3.3A). Se considera que esta tecnología no tiene (fig. A3.3B).
(A) 0.5
Fluorescencia normal
0.4
0.3
0.2
0.1 Umbral
0.0
5 10 15 20 25 30 35 40 45
Ciclo
35 Ciclado A. Green (página 1):

R=0,99716
30 R^2=0,99433
M=-3,283
CT
B=38,737
25
Eficiencia=1,02
20
101 102 103 104 105 10 6

Concentración
(B)
15
Fluorescencia
10
45 50 50
55 60 65 70 75 80 85 90
°C
0.8
0.6
0.4
dF/dT
+
0.2
0.0
45 50 50
55 60 65 70 75 80 85 90
°C
Figura A3.3
A) Curvas típicas de amplificación de la RCP en tiempo real que presentan las muestras con una dilución
seriada del DNA diana y la curva estándar. B) Análisis de las curvas de fusión usando las temperaturas de
fusión (Tm) para aumentar la especificidad de la RCP en tiempo real con utilización del colorante SYBR Green.
Fuente: Centros para el Control y la Prevención de enfermedades (Atlanta, EUA).
La sonda TaqMan (sonda hidrolizable; fig. A3.4) es la para liberarse (separarse del extintor); después de la
sonda específica de dianas que más se emplea en la excitación producida por una fuente de luz, el fluoróforo
detección mediante RCP en tiempo real. La RCP que genera fluorescencia que aumenta con cada ciclo de
utiliza la sonda TaqMan requiere un par de cebadores de RCP. Los ensayos que utilizan la sonda TaqMan se han
RCP específicos y una sonda TaqMan oligonucleotídica usado mucho en la RCP en tiempo real para la expresión
complementaria de una secuencia de DNA específica génica, la determinación de la carga viral, el genotipado
de la plantilla entre los cebadores directo e inverso. La de los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), la
sonda suele diseñarse con un colorante de alta energía, identificación bacteriana, la discriminación alélica y
denominado indicador (fluoróforo), en el extremo 5’, la verificación de los resultados de los estudios de
y una molécula de baja energía, denominada extintor micromatrices.
de fluorescencia, en el extremo 3’ (que impide la
Las balizas moleculares (sondas en horquilla) son sondas
emisión de fluorescencia por parte del fluoróforo). Esta
de hibridación de oligonucleótidos monocatenarios
sonda fluorescente doblemente marcada emite poca
que forman una estructura en horquilla (fig. A3.5). La
fluorescencia cuando está libre en la solución, debido
porción curva de la horquilla contiene una secuencia
a que el extintor y el fluoróforo están muy cerca el uno
sonda que es complementaria de una secuencia diana,
del otro. Durante la amplificación de la RCP en tiempo
y la porción recta de la horquilla está formada por el
real, la sonda apareada a la plantilla es escindida debido
apareamiento de secuencias de brazo complementarias
a la actividad 5’ nucleasa de la Taq DNA-polimerasa
que se encuentran a ambos lados de la secuencia
sonda. Un fluoróforo se une covalentemente al extremo
1. Polimerización: Un colorante indicador (R) fluorescente y un 5’ de uno de los brazos y un extintor de fluorescencia
extintor de fluorescencia (Q) están unidos a los extremos 5’ y 3’ de se une covalentemente al extremo 3’ del otro brazo.
una sonda TaqMan, respectivamente.
Cebador directo R SONDA Q
La porción recta de la horquilla mantiene estas
5' 3'
3' 5' dos moléculas muy próximas entre sí, lo que hace
5' 3'
5' que la fluorescencia del fluoróforo sea extinguida
Cebador inverso
2. Desplazamiento de la hebra: Cuando la sonda está intacta, la

emisión del colorante indicador se extingue.
R
Q Secuencia sonda
5' 3'
3' 5'
5' 3'
5'
3. Escisión: Durante cada ciclo de extensión, la DNA-polimerasa

separa el colorante indicador de la sonda.
R
Q Horquilla
5' 3'
3' 5'
5' 3'
5'
Fluoróforo Extintor
4. Polimerización concluida: Cuando el colorante indicador se ha
separado del extintor, el indicador emite su fluorescencia
característica..
Q
R 3'
5'
3' 5'
DNA o RNA
5' 3' Baliza molecular Híbrido
5' diana
Figura A3.4 Figura A3.5
RCP en tiempo real con sonda TaqMan (sonda Baliza molecular (sonda en horquilla)
hidrolizable) Fuente: Por cortesía de Horspool D. Wikipedia, 2009 (http://
Fuente: Por cortesía de Life Technologies Corporation en.wikipedia.org/wiki/Molecular_beacon, consultado el 11
(http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/ de abril del 2013); Introduction to molecular beacons. Nueva
applications-technologies/real-time-pcr/taqman-and- Jersey, EUA, Public Health Research Institute, 2013 (http://
sybr-green-chemistries.html, consultado el 23 de junio del molecular-beacons.org/MB_introduction.html, consultado el
2013). 23 de junio del 2013).
por transferencia de energía, por lo que las balizas (indicadora) con otro fluoróforo en el extremo 5’. Los
moleculares no muestran fluorescencia cuando están fluoróforos están diseñados para permitir que el espectro
libres en la solución. Sin embargo, cuando se hibridan a de emisión de uno se superponga significativamente
una hebra de ácido nucleico que contiene su secuencia con el espectro de excitación del otro. Durante la RCP,
diana complementaria experimentan un cambio de el fluoróforo donante es excitado por una fuente de luz
conformación que les permite emitir fluorescencia externa, y la energía se transfiere al fluoróforo aceptor
intensamente. En consecuencia, cuando la sonda se si se encuentra junto al anterior. Luego el fluoróforo
hibrida a la molécula diana, forma un híbrido sonda- aceptor excitado emite luz con una longitud de onda
diana que es más largo y más estable que el híbrido de diferente, que posteriormente puede detectarse y
la parte recta de la horquilla. La rigidez y la longitud del medirse. Las sondas de transferencia de energía por
híbrido sonda-diana impiden la existencia simultánea del resonancia de fluorescencia se usan a menudo en la
híbrido de la parte recta de la horquilla. En consecuencia, RCP en tiempo real, por ejemplo, en los ensayos de
la baliza molecular experimenta una reorganización discriminación alélica.
conformacional espontánea que fuerza la separación de
las partes rectas de la horquilla y hace que el fluoróforo A3.2.3 Amplificación mediada por transcripción
y el extintor de fluorescencia se separen, lo que a su vez (TMA)
hace que la fluorescencia se restaure. La tecnología de amplificación mediada por transcripción
(TMA) patentada (7, 8) puede usarse para amplificar DNA
Las balizas moleculares pueden usarse en la RCP en
o RNA, y produce amplicones de RNA, a diferencia de la
tiempo real para la detección de polimorfismos de un
mayoría de las otras PAAN, que solo producen DNA. En
solo nucleótido y la detección de mutaciones.
los sistemas de amplificación mediada por transcripción
La hibridación doble o sistema de sondas de disponibles en el mercado, se realiza un proceso de
transferencia de energía por resonancia de fluorescencia captura de dianas (TC) antes de la amplificación mediada
(FRET) (fig. A3.6) consiste en dos sondas fluorescentes por transcripción, es decir, para reducir la inhibición de
emparejadas que se hibridan muy cerca en la secuencia la amplificación y la contaminación. En este método de
diana (en general con una diferencia máxima de cuatro captura de dianas, se usan oligómeros poli-T unidos a
nucleótidos). La sonda donante (ancla) está marcada partículas magnéticas para que se unan a una sonda de
con un fluoróforo en el extremo 3’, y la sonda aceptora captura que contiene una cola poli-A y una secuencia
Fluoróforo donante 3’ (FD)
Oligosonda 1 Fluoróforo
aceptor 5’ (FA)
DNA diana amplificado

Oligosonda 2
1. Las sondas en solución emiten una 2. Emisión a través de transferencia de

fluorescencia baja. energía por resonancia de fluorescencia
Figura A3.6
Hibridación doble o sistema de sondas de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)
Fuente: Por cortesía de SIGMA-ALDRICH (Saint Louis, Misuri, EUA) (http://www.sigmaaldrich.com/life-science/custom-
oligos/dna-probes/product-lines/fluorescent-probes/lightcycler-probes.html, consultado el 23 de junio del 2013).
específica de la diana, que luego puede hibridarse (cDNA). El RNA del heterodúplex RNA:DNA resultante
específicamente a la secuencia complementaria del RNA es degradado por la actividad RNasa H de la
diana. El posterior proceso de amplificación mediada retrotranscriptasa. Esto permite que el segundo cebador
por transcripción (fig. A3.7), que amplifica la secuencia se una a la copia de DNA y que se sintetice una nueva
diana capturada, usa dos cebadores específicos de cadena de DNA mediante la retrotranscriptasa, lo que
la diana y dos enzimas diferentes (retrotranscriptasa crea una molécula de DNA bicatenario. Ambas cadenas de
y RNA-polimerasa) para la amplificación. Uno de los la molécula de DNA bicatenario creada ahora contienen
cebadores específicos de la diana contiene una secuencia secuencias del promotor para la RNA-polimerasa, y por
promotora para la RNA-polimerasa, y cuando este lo tanto pueden usarse como plantilla para iniciar la
cebador se hibrida al RNA diana se inicia una transcripción transcripción. Posteriormente, cada uno de los amplicones
inversa, que da lugar a una copia de DNA complementario de RNA recién sintetizados reentra en el proceso de
1
Diana de rRNA
2 RT
3 DNA
RNA
Actividad
4 RNAsa H
DNA
RT Cebador 2
6
Plantilla DNA
Promotor-
cebador
RNA pol RT
7 12
100–1000 copias Amplicón RNA
8 11
Actividad
RNAsa H
9 10
RT
Cebador 2
Figura A3.7
Amplificación mediada por transcripción (TMA)
Fuente: Hill CS. Gen-Probe transcription-mediated amplification: system principles. Cortesía de Gen-Probe Inc. (San
Diego, California, EUA) (http://www.gen-probe.com/pdfs/tma_whiteppr.pdf; consultado el 23 de junio del 2013).
amplificación mediada por transcripción y sirve como o de DNA. Esta tecnología es similar a la amplificación
plantilla para un nuevo ciclo de replicación, lo que da lugar mediada por transcripción salvo porque la amplificación
a una expansión exponencial de la secuencia diana de basada en secuencias de ácidos nucleicos utiliza tres
RNA. La amplificación mediada por transcripción puede enzimas (en lugar de dos): retrotranscriptasa del virus
producir 100-1.000 copias por ciclo de amplificación, a de la mioblastosis aviaria (AMV-RT), RNasa H y T7
diferencia de la RCP, que solo produce 2 copias por ciclo. RNA-polimerasa. Estas enzimas, junto con cebadores
La amplificación mediada por transcripción es isotérmica; específicos, permiten la amplificación de la secuencia del
toda la reacción se realiza a la misma temperatura en un ácido nucleico diana (fig. A3.8). Los productos de RNA
baño María o bloque térmico y no en un termociclador. amplificados pueden detectarse mediante hibridación
posterior a la amplificación usando sondas marcadas por
Los amplicones de RNA producidos en la reacción
electroquimioluminiscencia o mediante un sistema de
de amplificación mediada por transcripción pueden
detección en tiempo real que utilice balizas moleculares.
combinarse con antorchas moleculares para la detección
en tiempo real o con una sonda génica específica en
A3.2.5 Amplificación por desplazamiento de
el ensayo de protección de la hibridación (HPA) para la
cadena (SDA)
detección final por quimioluminiscencia. La técnica de
protección de la hibridación se describe en el apartado La amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) es
dedicado a las tecnologías basadas en ácidos nucleicos otro proceso enzimático isotérmico in vitro que permite
sin amplificar (véase el apartado A3.3.2). la amplificación de moléculas diana a partir de una sola
plantilla de DNA o RNA (8, 10).
A3.2.4 Amplificación basada en secuencias de Esta tecnología patentada se basa en la acción
ácidos nucleicos (NASBA) combinada de una enzima de restricción, la
La amplificación basada en secuencias de ácidos DNA-polimerasa, y dos pares cebadores (cebadores
nucleicos (NASBA) (8, 9) es otra tecnología de de amplificación y cebadores bumper [adaptadores]
amplificación isotérmica para secuencias diana de RNA de la amplificación por desplazamiento de cadena).
Baliza
molecular
Retro- RNasa H Retro-
RNA efector Oligo P1 transcriptasa Cebador P2 transcriptasa
Fluoróforo Extintor
P2
T7 RNA-polimerasa
P1
RNasa H
41°C Procesode Oligo P1
amplificación
Retrotranscriptasa
Retrotranscriptasa
Cebador P2
T7 RNA-polimerasa
Luz
RNA antisentido
Figura A3.8
Amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA)
Fuente: Tecnología NASBA. Por cortesía de PREMIER Biosoft (Palo Alto, California, EUA) (http://www.premierbiosoft.
com/tech_notes/NASBA.html; consultado el 23 de junio del 2013).
Los cebadores bumper contienen solo secuencias de en la generación de DNA bicatenario de la plantilla
DNA específicas de la diana, mientras que los pares de interés que contiene el sitio de reconocimiento
de cebadores de amplificación de la amplificación por de la endonucleasa de restricción que alimenta la
desplazamiento de cadena contienen una secuencia segunda fase de amplificación exponencial, en la que
de reconocimiento de la endonucleasa de restricción la endonucleasa de restricción hace una muesca en
específica en su extremo 5’ además de una secuencia una de las dos hebras del DNA bicatenario recién
complementaria con el segmento diana. La amplificación formado, lo que permite que la DNA-polimerasa cree
por desplazamiento de cadena consta de dos fases. En una nueva secuencia de DNA bicatenario a partir de
la figura A3.9 se muestra el proceso de amplificación la hebra desplazada. Este proceso, que se asemeja a
por desplazamiento de cadena. La primera fase consiste la replicación en círculo rodante de fagos y pequeños
A. Generación de la diana
El cebador de amplificación (AP) y el

BP AP cebador bumper (BP) de la amplificación por
TS
desplazamiento de cadena se hibridan a la
hebra de DNA diana (TS).
DN-polimerasa
El cebador de amplificación (AP) y el
cebador bumper (BP) de la amplificación por
Extensión y desplazamiento de cadena se extienden por
desplazamiento acción de la DNA-polimerasa a lo largo de la
hebra diana.
La extensión del cebador bumper desplaza

el producto de extensión del cebador de
amplificación.
Hibridación del cebador de amplificación por
desplazamiento de cadena complementario
y amplificación exponencial
B. Amplificación exponencial
Hibridación del cebador de amplificación (AP1) y de la sonda
detectora (DP) de la amplificación por desplazamiento de cadena
a la secuencia de DNA diana (TS2).
5' 5' TS1 La extensión del cebador de amplificación desplaza al producto

de extensión de la sonda detectora (la conversión de la sonda
AP1 5' AP2 5'
TS2 detectora se muestra abajo), formando un dúplex con el sitio de
la enzima de restricción (BsoBI).
La enzima de restricción crea una muesca en el sitio de

restricción; la DNA-polimerasa se une a la muesca y se
TS1 extiende para desplazar la hebra. Las hebras de DNA que están
desplazadas en la solución son capturadas por cebadores
complementarios que experimentan el mismo proceso de
TS2 extensión seguida por formación de muescas y desplazamiento,
lo cual da lugar a una amplificación exponencial, tal como se
muestra.
Figura A3.9
Amplificación por desplazamiento de cadena (SDA)
Fuente: Por cortesía de Becton, Dickinson and Company (Franklin Lakes, Nueva Jersey, EUA).
plásmidos monocatenarios, se repite continuamente la diana, la polimerasa hace que la horquilla comience
hasta que se produce una cantidad suficientemente a linealizarse y extenderse. Esta extensión crea una
grande de la hebra de DNA de interés y puede detectarse sonda detectora bicatenaria con un sitio de restricción
mediante una sonda detectora. escindible, que la enzima de restricción escinde
rápidamente. Esto provoca la separación física del
Actualmente, en una plataforma comercial de segunda
donante y del aceptor (y sus efectos de extinción), lo que
generación, la detección en tiempo real de los productos
permite detectar la fluorescencia en tiempo real.
de la amplificación por desplazamiento de cadena tiene
lugar simultáneamente con la amplificación mediante
A3.3 Tecnologías basadas en ácidos nucleicos
una sonda detectora fluorescente y transferencia de
sin amplificar
energía de fluorescencia (fig. A3.10). La sonda detectora
consta de una región de hibridación específica de la También existen pruebas de ácidos nucleicos sin
diana en el extremo 3’ y una estructura en horquilla en amplificación para ciertas ITS, como la gonorrea y las
el extremo 5’. La parte curva de la horquilla contiene infecciones por clamidias, el virus de la hepatitis y el
la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa VIH. Suelen ser rápidas, pueden automatizarse para
de restricción, y la base 5’ se conjuga con la molécula realizar el tamizaje a gran escala, son relativamente
donante, mientras que la base 3’ de la parte recta de baratas y sólo requieren una pericia técnica moderada.
la horquilla se conjuga con una molécula aceptora. En Sin embargo, su sensibilidad es considerablemente
su estado natural, la horquilla mantiene a las moléculas inferior a la de métodos basados en la amplificación
donante y aceptora muy cerca y se observa poca de la diana (PAAN). Es más probable que se usen
fluorescencia. Cuando la sonda detectora se aparea con ensayos de hibridación y detección de sondas más
Conversión de la sonda detectora

AP1 DP Hibridación del cebador de amplificación (AP1) y de la sonda detectora (DP)
5' de la amplificación por desplazamiento de cadena con la secuencia de DNA
TS2 5' diana (TS2).
La extensión del cebador de amplificación desplaza el producto de extensión

de la sonda detectora.
El producto de extensión de la sonda detectora se convierte en la diana del

cebador de amplificación (AP2) de la amplificación por desplazamiento de
cadena.
AP2 El cebador de amplificación y el producto de extensión de la sonda detectora

5' se extienden en dirección 3’ formando un dúplex.
El sitio de restricción de la sonda detectora es diferente del incorporado
en las secuencias del cebador de amplificación y sigue siendo vulnerable
a la escisión por parte de BsoBI. Así pues, el fluoróforo y el extintor de
la fluorescencia difunden aparte, lo que da lugar a un aumento de la
fluorescencia. En ausencia del DNA diana, las sondas detectoras se
mantienen sin escindirse y la fluorescencia sigue apagada.
Figura A3.10
Amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) de segunda generación, en la que los productos
amplificados se detectan en tiempo real usando una sonda detectora fluorescente y transferencia de energía.
Fuente: Por cortesía de Becton, Dickinson and Company (Franklin Lakes, Nueva Jersey, EUA).
directos cuando se espera que estén presentes grandes A3.3.2 Ensayo de protección de la hibridación
cantidades de DNA o RNA diana (por ejemplo, en un (HPA)
frotis uretral o un cultivo bacteriano). La detección fiable La tecnología del ensayo de protección de la hibridación
de la diana sin el uso de la amplificación de señales (HPA) es un método patentado mediante el cual se detectan
generalmente requerirá al menos 104 copias de la dianas de RNA o de DNA monocatenario por medio de una
diana de ácido nucleico por microlitro. Sin embargo, la sonda de DNA quimioluminiscente (12, 13). En el ensayo de
amplificación de la señal después de la hibridación de la protección de la hibridación, se permite que sondas de DNA
sonda mejora la detección hasta un valor tan bajo como específicas de secuencias marcadas con éster de acridinio
aproximadamente 500 moléculas diana por microlitro y (EA) se hibriden a los productos de la amplificación. La
aporta capacidades cuantitativas. separación (selección) de las sondas hibridadas de las no
hibridadas se hace mediante la adición de un reactivo de
A3.3.1 Captura de híbridos (CH) selección (un álcali), que hidroliza el marcador (el éster de
La tecnología de captura de híbridos (CH) es un acridinio) de las sondas no hibridadas. Cuando la sonda se
ensayo de hibridación de ácidos nucleicos in vitro con une a su secuencia diana específica, el éster de acridinio
amplificación de señal que usa la quimioluminiscencia de la sonda hibridada está protegido en la doble hélice y
en microplacas para la detección cualitativa de las no se hidroliza. Tras añadir el reactivo de detección, sólo
dianas de ácidos nucleicos (11). El ensayo de captura el éster de acridinio unido a la sonda hibridada se libera
de híbridos consta de las siguientes etapas básicas: para producir una señal que indica que el DNA o el RNA
lisis de los virus o de las bacterias para que liberen el diana está presente. Las sondas no hibridadas no emiten
DNA o el RNA diana; hibridación con sondas de RNA o quimioluminiscencia (fig. A3.12). En el ensayo de protección
DNA específicas para crear híbridos RNA:DNA; captura de la hibridación no son necesarias las engorrosas etapas
de los híbridos de RNA:DNA en una fase sólida usando de lavado que se precisan en las pruebas con sondas y
anticuerpos universales específicos de los híbridos; los inmunoanálisis convencionales. Además, solo una
amplificación de la señal con anticuerpos conjugados molécula de la sonda marcada con éster de acridinio
con una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina); puede unirse a cada amplicón de RNA; así pues, la señal
detección de la señal cuando el sustrato (por ejemplo, quimioluminiscente obtenida es directamente proporcional
dioxetano quimioluminiscente) es escindido por la al número de moléculas diana de la muestra inicial. La
enzima; y medición de la quimioluminiscencia producida tecnología de ensayo cinético doble (DKA), que es una
en unidades de luz relativas (RLU) con un luminómetro modificación del ensayo de protección de la hibridación,
(fig. A3.11).
1. La sonda de RNA se hibrida 2. Captura de híbridos. Los 3. Amplificación de la señal. Los

al DNA diana. El DNA diana se híbridos de RNA:DNA se híbridos de RNA:DNA capturados
combina con sondas específicas capturan en una fase sólida se detectan con múltiples
de RNA, formando híbridos de recubierta con anticuerpos de anticuerpos conjugados con
RNA:DNA. captura universales específicos la fosfatasa alcalina. Se lee la
de híbridos de RNA:DNA. señal resultante de la reacción
quimioluminiscente y se
Figura A3.11 interpretan los resultados.
Tecnología de captura de híbridos (CH)
Fuente: Por cortesía de Qiagen Inc. (Germantown, Maryland, EUA) (http://www.qiagen.com/hpv/hc2technology.aspx).
Amplicón de RNA Sonda
60°C
A. AE AE AE AE
15 min
hibridación
Sonda sin hibridar
Selección Detección
B. AE AE Sin luz
Sonda hibridada
Selección Detección Luz
AE AE AE AE
C.
Figura A3.12
Ensayo de protección de la hibridación (HPA)
Fuente: Hill CS. Gen-Probe transcription-mediated amplification: system principles. Por cortesía de Gen-Probe Inc. (San
Diego, California, EUA) (http://www.gen-probe.com/pdfs/tma_whiteppr.pdf; consultado el 23 de junio del 2013).
utiliza dos tipos de sondas marcadas con dos ésteres de (B). El segundo conjunto de oligonucleótidos (extensores
acridinio distintos que muestran una cinética de apagado del marcador) se han diseñado para que se hibriden con
de la luminiscencia diferente en un ensayo único que regiones contiguas de la diana y para que proporcionen
permite detectar simultáneamente dos dianas distintas. El secuencias para la hibridación de un oligonucleótido
ensayo de protección de la hibridación o el ensayo cinético preamplificador. El preamplificador forma un híbrido
doble se utilizan frecuentemente para detectar amplicones estable solo si se hibrida a dos extensores del marcador
de RNA producidos mediante amplificación mediada por adyacentes (C). Luego se hibridan al preamplificador
transcripción. numerosas moléculas amplificadoras del DNA ramificado
para crear una estructura ramificada (D). Por último, los
A3.3.3 Hibridación del DNA ramificado (bDNA) oligonucleótidos marcados con fosfatasa alcalina que
A diferencia de la tecnología de RCP que se basa en la son complementarios de secuencias amplificadoras del
amplificación in vitro de la secuencia diana, la hibridación DNA ramificado se unen a la molécula de DNA ramificado
del DNA ramificado (bDNA) implica el uso de una serie mediante hibridación. La señal del DNA ramificado es el
de oligonucleótidos en un método de hibridación en producto quimioluminiscente de la fosfatasa alcalina y su
sándwich de ácidos nucleicos para detectar y cuantificar sustrato específico. De esta manera, la señal se amplifica
la diana mediante la amplificación de señales (14). El sin copiar la secuencia del ácido nucleico diana, y la
proceso de hibridación del DNA ramificado implica la cantidad de señal detectada es directamente proporcional
lisis de los microorganismos analizados, la captura de a la cantidad de ácido nucleico unido.
la diana, la amplificación de la señal y la detección, tal
La tecnología de DNA ramificado ha progresado desde
como se muestra en la figura A3.13.
los ensayos de primera generación, que eran precisos y
La etapa inicial de un ensayo de hibridación del DNA reproducibles aunque relativamente insensibles, hasta
ramificado consiste en la lisis de los microorganismos las pruebas de tercera generación, que son precisas,
estudiados usando detergente y proteinasa K para reproducibles, muy sensibles y pueden automatizarse
liberar los ácidos nucleicos (A). El primer conjunto de completamente. Por otra parte, los ensayos de DNA
oligonucleótidos específicos de la diana (extensor de la ramificado no requieren la amplificación de una
captura) se hibrida luego en condiciones muy rigurosas secuencia diana, por lo que la contaminación cruzada
tanto a los ácidos nucleicos diana como a las sondas de entre las réplicas de las muestras o remanente es menos
captura que están unidas a una placa de micropocillos probable en los ensayos de DNA ramificado.
A B
Liberación del RNA
Extensor de
Las sondas se la captura Sonda de captura
hibridan al RNA o
al DNA y a la fase Micropocillo
Liberación y sólida
desnaturalización
del RNA
C
Moléculas amplificadoras
Preamplificador
RNA diana
Extensor del marcador
Extensor de la captura
Sonda de captura
Micropocillo
D Amplificador con sondas

marcadoras hibridadas
Preamplificador
RNA diana
Extensor del marcador
Extensor de la captura
Sonda de captura
Micropocillo
Figura A3.13
Ensayo de amplificación de señales de DNA ramificado (bDNA)
Fuente: Tsongalis, GJ. Branched DNA technology in molecular diagnostics. American Journal of Clinical Pathology, 2006,
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5. Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro
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Anexo 4
Medios, reactivos, pruebas diagnósticas y tinciones (recetas de

laboratorio)
NOTA: Los reactivos para las tinciones y la preparación de los medios se han incluido por categorías en orden
alfabético. No se repiten en este anexo algunas recetas de laboratorio que se encuentran en los capítulos.
A4.1 Medios de cultivo, transporte y conservación

Medio de transporte de Amies (ingredientes referidos al producto comercializado; Van Dyck et al., 1999)
Carbón neutro farmacéutico 10 g
Cloruro de sodio 3,0 g
Hidrogenofosfato de sodio 1,15 g
Dihidrogenofosfato de potasio 0,2 g
Cloruro de potasio 0,2 g
Tioglicolato de sodio 1,0 g
Cloruro de calcio 0,1 g
Cloruro de magnesio 0,1 g
Agar 4,0 g
Agua destilada 1l
1. Suspender todos los ingredientes en 1 litro de agua destilada.

2. Calentar a ebullición para disolver el agar completamente.
3. Distribuir en los tubos o frascos pequeños con tapa de rosca, agitando entretanto para mantener el carbón en
suspensión. Esterilizar en autoclave a 120 °C durante 15 minutos.
4. Conservar el medio a una temperatura de 2 a 8 °C hasta 6 meses.
Agar de infusión de cerebro-corazón (BIH) + medio de conservación glicerol al 20% (comercializado)
Infusión de cerebro-corazón 3,7 g

Glicerol 20 ml
1. Mezclar los ingredientes en un frasco con tapa de rosca de 150 ml, esterilizar en autoclave y dejar que se enfríe a
temperatura ambiente.
2. Dispensar asépticamente con una pipeta estéril 1,0 ml de la solución en criotubos de polipropileno con tapa de
rosca de 1,5 ml (es importante usar tubos adecuados para evitar roturas).
3. Conservar el medio a una temperatura de 4 °C hasta su uso.
Anexo 4: Medios, reactivos, pruebas diagnósticas y tinciones (recetas de laboratorio) 215

Agar chocolate, véase el medio base de agar para gonococos (GCMB) más hemoglobina (debajo del medio de
Thayer–Martin).
Agar sangre tipo Columbia
Base de agar sangre tipo Columbia 39 g

Sangre de caballo (desfibrinada) 90 ml
Agua destilada 1l
1. Suspender 39 g de base de agar sangre tipo Columbia en 1 litro de agua destilada al tiempo que se mezcla. A
continuación se somete a vapor fluente o se calienta a ebullición suavemente hasta la disolución completa.
2. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
3. Dejar que se enfríe el medio de agar a 70 °C en un baño María.
4. Agregar asépticamente 90 ml de sangre desfibrinada de caballo al agar. Agitar para mezclar y dejar a 70 °C
durante 30 minutos, sin dejar de mezclar de vez en cuando suavemente, hasta que la sangre tome un color marrón
chocolate.
5. Transferir el matraz a un baño de agua a 50 °C para que se enfríe antes de distribuir volúmenes de 20 ml en
placas de Petri de 9 cm.
6. Dejar que las placas se solidifiquen a temperatura ambiente y luego mantenerlas invertidas a una temperatura
entre 2 y 8 °C en bolsas de plástico cerradas hasta 4 semanas.
Agar Columbia + 1% de hemoglobina + carbón activado + 5% de suero fetal de ternero + 1% de

enriquecimiento IsoVitaleX + vancomicina (3 µg/ml)
Se recomienda para el cultivo de Haemophilus ducreyi.
Base de agar tipo Columbia 40 g
Hemoglobina bovina 10 g
Carbón activado 2g
Suero fetal de ternero 50 ml
Enriquecimiento IsoVitaleX 10 ml
Solución de vancomicina 3 mg en 5–10 ml de líquido
Agua destilada 1l
1. Pesar la hemoglobina bovina en un matraz (A) y agregar 400 ml de agua destilada. Dejar reposar en un
refrigerador a 4 °C hasta el día siguiente. A la mañana siguiente agitar el matraz y suspender todo el polvo. Con
una pipeta o una varilla suspender la hemoglobina en polvo que pueda estar adherida al fondo del matraz. Dejar a
2. Poner en un segundo matraz (B) el agar Columbia, el carbón activado y 600 ml del agua destilada.
3. Esterilizar en autoclave los matraces A y B por separado a 121 °C durante 15 minutos.
4. Enfriar los matraces a 56 °C en baño María.
5. Con una técnica aséptica en una campana de flujo laminar, transferir lentamente con cuidado la solución
esterilizada de hemoglobina bovina (matraz A) al matraz B que contiene la base de agar Columbia y el carbón,
vertiendo sobre el lado interno del matraz para evitar que se formen burbujas.
6. Agregar asépticamente 50 ml (5%) de suero fetal de ternero estéril, 10 ml (1%) de enriquecimiento IsoVitaleX y un
volumen de líquido estéril que contenga 3 mg de vancomicina (realizar una filtración estéril en caso necesario).
7. Una vez que se ha agregado todo, mezclar el medio agitando con un movimiento suave. Verter asépticamente
el medio en placas de Petri de 20 ml y dejar que se solidifique antes de colocar las placas en bolsas de plástico
y conservarlas en el refrigerador a 4 °C hasta que se necesiten. Las placas de agar deben usarse antes de
transcurridas 1 o 2 semanas de su preparación.
Medio Diamond (ingredientes referidos al producto comercializado; Van Dyck et al., 1999)
El medio Diamond se usa para el cultivo de Trichomonas vaginalis. Otro sistema de cultivo comercializado es InPouch
TV (anexo 5).
Peptona tripticasa 20 g
Extracto de levadura 10 g
Maltosa 5,0 g
Hidrocloruro de L-cisteína 1,0 g
Ácido L-ascórbico 0,2 g
Hidrógenofosfato de potasio 0,8 g
Dihidrogenofosfato de potásico 0,5 g
Agar 0,5 g
1. Suspender y disolver 38 g de medio Diamond en polvo (todos los ingredientes anteriores) en 900 ml de agua
destilada.
2. Esterilizar en autoclave y dejar que se enfríe el medio a 50 °C.
3. Agregar 100 ml de suero ovino o bovino y 0,1 g/l de cloranfenicol.
4. Conservar a 4 °C y utilizarlo en un plazo de 3 meses desde la preparación.
Medio base de agar para gonococos (GC) complementado con 1% de suplemento de crecimiento definido
(suplemento definido de Kellogg o IsoVitaleX-Vitox)
El medio base de agar para GC con suplementos se recomienda en la realización del antibiograma de N. gonorrhoeae
con los métodos: dilución en agar, difusión en disco y Etest (bioMérieux Francia).
Medio base de agar para GC 36 g

Suplemento definido IsoVitaleX-Vitox-Kellogg 10 ml
Agua destilada 1l
1. Disolver 36 g de medio base de agar para GC en 1 litro de agua destilada y esterilizar en autoclave a 121 °C
durante 15 minutos.
2. Dejar que se enfríe el medio de agar en baño María a 50 °C, agregar 10 ml de IsoVitaleX-Vitox disuelto o Kellogg y
mezclar bien.
3. Dispensar 20 a 25 ml por placa de Petri de 9 cm y 60 ml por placa de Petri de 14 cm.
4. Dejar que las placas se solidifiquen a temperatura ambiente y mantenerlas invertidas a una temperatura entre 2 y
8 °C en bolsas de plástico cerradas hasta 4 semanas.
5. IsoVitaleX y Vitox están comercializadas mientras que el suplemento definido de Kellogg se prepara en el
laboratorio (ver más adelante).

Suplemento definido de Kellogg (1, 2)
Glucosa 40 g
Glutamina 1,0 g
Solución de nitrato de hierro (III) al 0,5% 10 ml
1. Mezclar todos los ingredientes en un matraz de 150 ml.

2. Esterilizar en autoclave.
3. Enfriar en un baño María a 50 °C.
4. Agregar 1 ml de solución de cocarboxilasa estéril al 20% (filtrada sin esterilizar en autoclave).
5. Dispensar asépticamente la solución en un frasco de almacenamiento con tapa de rosca de 100 ml y conservar a
4 °C (estable durante varios meses).
GCMB + 2% de hemoglobina + 5% de suero fetal de ternero + 1% de enriquecimiento IsoVitaleX +

vancomicina (3 µg/ml)
Este medio se recomienda para el cultivo del H. ducreyi.
GCMB 36 g
Hemoglobina bovina 20 g
Solución de vancomicina 3 mg en 5–10 ml de líquido
Agua destilada 1l
1. Poner en un matraz de 2 litros (A) 500 ml de agua destilada y agregar la hemoglobina bovina, a continuación
agitar bien para mezclar.
2. Poner en otro matraz de 2 litros (B) 500 ml de agua destilada y agregar el GCMB, a continuación calentar en una
placa de agitación hasta ebullición.
3. Esterilizar en autoclave ambos matraces a 121 °C durante 30 minutos y luego enfriar a 56 °C.
4. Con una técnica aséptica en una campana de flujo laminar, verter lentamente con cuidado la solución de
hemoglobina bovina esterilizada (matraz A) en el matraz B que contiene el GCMB, vertiendo sobre la pared interna
del matraz para evitar la formación de burbujas.
5. Agregar 50 ml (5%) de suero fetal de ternero estéril, 10 ml (1%) de enriquecimiento IsoVitaleX y un volumen de
líquido estéril que contenga 3 mg de vancomicina (realizar una filtración estéril en caso necesario).
6. Mezclar el medio con un movimiento de agitación suave.
7. Verter el medio asépticamente en placas de Petri de 20 ml y dejar que el medio se solidifique antes de ponerlas en
bolsas de plástico y colocarlas en el refrigerador a 4 °C hasta que se necesiten.
8. Las placas de agar deben utilizarse en un plazo de 1 a 2 semanas desde la preparación.
Medio de Dulbecco con modificación de Iscove (IMDM-VGA) (comercializado, Sigma-Aldrich Life technologies, EUA)
Medio de Kupferberg (ingredientes referidos al producto comercializado; Van Dyck et al., 1999)
Triptosa (o tripticasa) 20 g
Maltosa 1,0 g
Hidrocloruro de L-cisteína 1,5 g
Agar 1,0 g
Azul de metileno 0,003 g
Cloranfenicol 0,1 g
Extracto de levadura 0,1 g
1. Suspender 23,7 g de medio de Kupferberg en polvo en 950 ml de agua destilada, esterilizar en autoclave y enfriar
hasta 50 a 55 °C.
2. Agregar 50 ml de suero (bovino, humano, ovino, de conejo o de caballo), 1 000 000 UI de penicilina y 150 mg de
estreptomicina.
Medio líquido para citología (comercializado, BD Diagnostics)
Medio de Eagle modificado (MEM-VG) (comercializado, Sigma-Aldrich, Sigma-Aldrich, Gibco Life Technologies, EUA)
Medio de Martín Thayer modificado

Preparar el GCMB con la hemoglobina y los suplementos (véase medio de Thayer–Martin). Agregar las mezclas de
los antibióticos selectivos, que están comercializadas: VCAT (vancomicina, colistina, anfotericina B o anisomicina,
lactato de trimetoprima), VCNT (vancomicina, colistina, nistatina, lactato de trimetoprima) o LCAT (lincomicina, colistina,
anfotericina B o anisomicina, lactato de trimetoprima). Estos suplementos deben hidratarse según la recomendación del
fabricante y agregarse al medio (3, 4). El medio también está comercializado.
Caldo de Mueller-Hinton (comercializado)

Ingredientes en las preparaciones comerciales:
Extracto de carne de bovino 2,0 g

Hidrolizado ácido de caseína 17,5 g
Almidón soluble 1,5 g
1. Suspender 21 g de medio deshidratado en 1 litro de agua destilada.

2. Mezclar y dispensar en pequeñas alícuotas (1,5 ml o 2 ml) y esterilizar en autoclave.
Agar de Mueller-Hinton + 5% de sangre de caballo lisada + 1% de enriquecimiento IsoVitaleX + vancomicina

(3 µg/ml)
Medio que se recomienda para el cultivo del H. ducreyi.
Base para agar de Mueller-Hinton 36 g

Sangre de caballo 50 ml
Solución de vancomicina 3 mg en 5-10 ml de líquido
Agua destilada 1l

1. Pesar 38 g de base para agar de Mueller–Hinton y enrasar a 1 litro con agua destilada, esterilizar en autoclave y
enfriar a 56 °C.
2. Agregar 50 ml (5%) de sangre de caballo estéril cuando la base para agar disuelta alcance los 56 °C y mezclar.
3. Lisar la suspensión colocando el matraz en un baño María a 70 °C durante aproximadamente 15 minutos.
4. Enfriar hasta 56 °C y luego agregar 50 ml (5%) de suero fetal de ternero estéril, agregar 10 ml (1%) de
enriquecimiento IsoVitaleX y un volumen de líquido estéril que contenga 3 mg de vancomicina (realizar una
filtración estéril en caso necesario).
5. Mezclar el medio con un movimiento de agitación suave.
6. Verter el medio asépticamente en placas de Petri de 20 ml y dejar que el medio se solidifique antes de ponerlas en
bolsas de plástico y colocarlas en el refrigerador a 4 °C hasta que se necesiten.
7. Las placas de agar deben utilizarse en un plazo de 1 a 2 semanas desde la preparación.
Base de caldo de micoplasma (5) (medio comercializado)
Infusión de corazón bovino 50 g

Peptona 10 g
NaCl 5,0 g
Agua destilada 1l
1. Mezclar los ingredientes.

2. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos y conservar a 4 °C.
Agar New York City (NYC) (comercializado; Van Dyck et al., 1999)
Preparar el GCMB con los suplementos y agregar sangre de caballo hemolizada, una mezcla de dializado de levadura y
los inhibidores VCAT.
La mezcla de dializado de levadura contiene:
Dializado de levadura 5,0 g

Glucosa 0,5 g
Bicarbonato de sodio 0,075 g
Sangre de caballo hemolizada: lisar mediante congelación y descongelación o mediante la adición de 5 ml/l de saponina
al medio base de agar para GC.
1. Suspender 18 g de medio base de agar para GC en 430 ml de agua destilada, mezclar y calentar a ebullición.
2. Esterilizar en autoclave y enfriar hasta 50 a 55 °C.
3. Agregar 50 ml de sangre de caballo hemolizada, una mezcla de dializado de levadura y los inhibidores VCAT
(siguiendo las instrucciones del fabricante).
4. Mezclar y verter en las placas de Petri.
Agar de Sabouraud dextrosado (5)
Glucosa 40 g
Neopeptona o polipeptona (comercializado) 10 g
Agar 15–20 g
Agua desmineralizada 1l
1. Calentar la mezcla para que se disuelva completamente. El pH final será de 5,6.
2. Dispensar en los tubos (18 a 25 mm de diámetro) y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
Si hay que añadir cloranfenicol al medio, el volumen y la concentración serán los adecuados.
Medio de leche desnatada (Van Dyck et al., 1999)
Leche en polvo 100 g

Agua destilada 1l
1. Suspender 100 g de leche en polvo en 1 litro de agua destilada.

2. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a una temperatura entre 112 y 115 °C.
3. Conservar a una temperatura entre 4 y 8 °C.
Nota: Es importante evitar el sobrecalentamiento para que no se produzca caramelización.
Medio de transporte según Stuart (también comercializado)
Tioglicolato de sodio 1,0 g

Glicerofosfato de sodio 10,0 g
Cloruro de calcio 0,1 g
Hidrocloruro de cisteína 0,5 g
Agar 3–5,0 g
Agua destilada 1l
1. Mezclar los ingredientes en agua destilada y calentar a ebullición.

2. Distribuir en frascos pequeños con tapa de rosca una vez ajustado el pH entre 7,3 y 7,4.
3. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos y enroscar de inmediato la tapa.
4. Cuando esté frío, el medio debe ser incoloro.
5. Conservar en un refrigerador a una temperatura entre 4 y 8 °C.
6. Si el color se torna azul durante el almacenamiento, el medio se ha aireado y por consiguiente es inadecuado para
su uso.
7. Aflojar la tapa de rosca y calentar el medio para eliminar el aire retenido.
Medio de transporte sacarosa-fosfato (2SP) con antibióticos (ingredientes referidos al producto comercializado;
Van Dyck et al., 1999)
Hidrogenofosfato de potasio 2,1 g

Sacarosa 68,5 g
Agua destilada 1l
1. Reunir los ingredientes, llevar a pH 7,2 y filtrar para esterilizar.

2. Agregar asépticamente los suplementos (véase a continuación) a alícuotas de 90 ml.

Suplementos:

Gentamicina 10 mg
Vancomicina 10 mg
Anfotericina B 0,5 mg
Medio de conservación sacarosa-fosfato-glutamato (SPG)
Sacarosa 75 g
KH2PO4 0.6 g
K 2HPO4 2.83 g
Agua, cantidad suficiente para 1l
1. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH 2N, en caso necesario.

2. Hacer alícuotas en botellas de 100 ml y esterilizar en autoclave durante 20 minutos.
3. Conservar hasta 1 año a 4 °C.
Medio de Thayer Martin

Medio base de agar para GC (ingredientes en la preparación comercializada): agar chocolate
Peptona 15,0 g
Almidón de maíz 1,0 g
Agar 10,0 g
Hemoglobina: polvo seco de hemoglobina bovina 10,0 g
Enriquecimiento IsoVitaleX, Vitox o suplemento de Kellogg 10,0 ml
Agua destilada 1l
4. Disolver 36 g de medio base de agar para GC (Difco, BD) en 500 ml de agua destilada, dejar en reposo hasta que
el polvo se disuelva completamente. En caso necesario, usar una barra agitadora magnética.
5. Suspender 10 g de hemoglobina en 500 ml de agua destilada, hacer una pasta antes de agregar el agua, mezclar
enérgicamente para que se disuelva y calentar a ebullición.
6. Esterilizar las soluciones en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Enfriar colocando los matraces en baño María
50 °C.
7. Sacar los matraces del baño María y agregar asépticamente la solución de hemoglobina al matraz de GCMB.
8. Agregar asépticamente 10 ml de suplemento definido disuelto (por ejemplo, suplemento definido de Kellogg,
IsoVitaleX o Vitox).
9. Mezclar el contenido totalmente con un suave movimiento de agitación.
10. Inmediatamente verter 20–25 ml de la mezcla en cada placa de Petri (9 cm).
11. Dejar que los medios se solidifiquen a temperatura ambiente.
12. Las placas se conservan invertidas en bolsas de plástico cerradas entre 2 y 8 °C durante 3 semanas.
Se pueden adquirir IsoVitaleX y Vitox comercializados, mientras que el suplemento definido de Kellogg se prepara en el
laboratorio (véase GCMB).
Agregar al agar chocolate los inhibidores vancomicina, colistina y nistatina (VCN).
Fórmula de VCN:
Vancomicina 300 μg/ml
Colistín 750 μg/ml
Nistatina 1250 unidades/ml
El medio de Thayer–Martin modificado se prepara agregando lactato de trimetoprima a una concentración de 5,0 μg/
ml.
Caldo de triptona y soja (Van Dyck et al., 1999)
Hidrolizado ácido de caseína (triptona) 17 g

Peptona de soja 3g
Cloruro de sodio 5g
Glucosa 2,5 g
Agua destilada 1l
1. Suspender 36 g de polvo comercial en 1 litro de agua destilada; pH 7,3.

2. Mezclar bien y dispensar alícuotas de 2 ml en tubos pequeños.
Medio para el transporte de virus (Van Dyck et al., 1999)
El medio consta de una solución salina equilibrada de Hank (HBSS, comercializado), complementado con anfotericina
B, albúmina sérica bovina y gentamicina.
Solución salina equilibrada de Hank (comercializado) 10,3 g
Anfotericina B 5,0 mg
Albúmina sérica bovina al10% 100 ml
Gentamicina 50 mg
Agua destilada 1l
1. Disolver 10,3 g de polvo de solución salina equilibrada de Hank en 1 litro de agua destilada.
2. Agregar anfotericina B, albúmina sérica bovina (disuelta en agua destilada) y gentamicina.
3. Mezclar y ajustar el pH a 7,3 con una solución de hidrogenocarbonato de sodio al 7,5%.

A4.2 Reactivos y pruebas diagnósticas
API NH: Neisseria gonorrhoeae

Dado que el sistema API NH requiere un inóculo con una turbidez equivalente al estándar 4,0 de la escala de McFarland,
generalmente es necesario subcultivar la colonia aislada antes de identificarla para obtener inóculo suficiente. Antes
de realizar las pruebas con la tira API NH se puede cultivar N. gonorrhoeae en el siguiente medio: agar chocolate
con 2% IsoVitaleX o su derivado (es decir, Thayer–Martin) con o sin antibióticos; también puede usarse el GCMB con
suplementos. Otra opción es usar medios de agar con sangre (la base de agar sangre tipo Columbia, medio de tripticasa
de soja, medio New York City), aunque ciertas reacciones bioquímicas pueden modificarse y resultar más débiles
(esto debe tenerse en cuenta al leer la reacción; lea las instrucciones del fabricante). El sistema API NH puede sustituirse
también por el RapID NH (Remel).
1. Registrar el número de cepa en la tira.

2. Colocar la tira en la caja de incubación.
3. Recoger con un hisopo unas pocas colonias bien aisladas y preparar una suspensión (en el NaCl proporcionado
con el estuche) con una turbidez equivalente al estándar 4,0 de la escala de McFarland, asegurarse de que está
bien mezclado usando una agitadora vorticial. Utilizar un cultivo de 18 a 24 horas. La suspensión debe usarse
inmediatamente después de la preparación.
4. Distribuir la suspensión bacteriana preparada (aproximadamente 50 μl) en los 7 primeros microtubos (de PEN a
URE, ambos inclusive). Evite la formación de burbujas.
5. Llenar los 3 últimos microtubos con la suspensión (aproximadamente 150 μl), evitando que se forme un menisco
convexo.
6. Cubrir los 7 primeros microtubos (PEN a URE, inclusive) con el aceite mineral (proporcionado con el estuche).
7. Incubar durante 2 horas a 36 °C en condiciones aeróbicas.
8. Tras el período de incubación, leer las reacciones con referencia a la tabla de lectura incluida en el estuche
(bioMérieux, consultar en www.biomerieux.com).
Cepas de referencia:
Para el control de la calidad, véase la recomendación del fabricante (bioMérieux, Francia). Utilizar la cepa
N. gonorrhoeae ATCC 31426 o una cepa de referencia de N. gonorrhoeae de la OMS del 2008.
Amortiguadores del pH
Volumen (ml) para preparar

Peso por litro de solución madre pH 100 ml de solución de trabajo
Tipo de Concentración
A B A B
solución (mol/l)
Tampón de 0,025 3,41 g de KH2PO4 4,46 g de 6,8 50,8 49,2
fosfato Na2HPO4 × 2H2O
0,1 13,62 g de KH2PO4 17,82 g de 6,9 43,9 56,1
compra 4 Na2HPO4 × 2H2O
Tampón 0.01 Disolver 2,1 g HCl 0,01 mol/l 5,6 69,3 30,7
de citrato- de ácido cítrico
hidróxido monohidrato en 20 ml
de sodio de de NaOH 1 mol/l
Sörensen y agregar agua
destilada hasta llegar
a un 1 litro
(=citrato disódico
0,01 mol/l)
Prueba de la ß-lactamasa
Hay varias pruebas para determinar si una cepa produce ß-lactamasa (por ejemplo, método yodométrico, rojo de fenol)
(3). La más fácil es la prueba de la cefalosporina cromogénica (nitrocefina). Véase el capítulo 4 para más detalles.
Prueba rápida de utilización de los hidratos de carbono

Ingredientes para el agar tripticasa de cisteína (ATC) (Difco, BD, EUA):
Triptona 20 g
L-Cisteína 0,5 g
Sulfito de sodio 0,5 g
Agar 2,5 g
Rojo de fenol 17 mg
1. Suspender 28,5 g de agar tripticasa de cisteína en polvo en 1 litro de agua destilada. Mezclar enérgicamente.
2. Calentar agitando frecuentemente y dejar en ebullición durante 1 minuto para disolver completamente el polvo.
3. Esterilizar en autoclave a una temperatura que no pase de 118 °C durante 15 minutos.
4. Agregar 5 a 10 g de hidratos de carbono, es decir, glucosa, maltosa, sacarosa o lactosa, antes de esterilizar en
autoclave o disolver el medio en 900 ml de agua, esterilizar en autoclave y agregar asépticamente 100 ml de una
solución estéril de carbohidratos al 5% a 10%.
5. Mezclar el contenido del matraz con un movimiento de agitación suave y distribuir asépticamente en tubos de
10 ml con tapa de rosca ya esterilizados.
6. Enfriar los tubos en posición inclinada para que se forme una pendiente y dejar que el medio se solidifique a

7. Conservar los tubos a 4 °C.
8. Probar el resultado del medio preparado usando cultivos estables característicos de control según las
especificaciones del fabricante (Difco, BD, EUA).
Prueba rápida de utilización de los hidratos de carbono

Los siguientes reactivos están comercializados:
Medio de agar sangre lisada con solución de glucosa al 0,5%
Solución salina tamponada, equilibrada, con indicador (SST)
Soluciones de hidratos de carbono:
glucosa al 10%
lactosa al 10%
sacarosa al 10%
maltosa al 10%
Solución de ampicilina (200 mg/ml) para la prueba de producción de ß-lactamasa
El cultivo puro para la identificación de la posible N. gonorrhoeae se obtiene subcultivando una única colonia en un
medio de agar sangre lisada que contiene solución de glucosa al 0,5%.
1. Emulsionar 2 asas de siembra de 10 μl llenas de colonias aisladas que han crecido en un cultivo puro sembrado
el día anterior en un tubo que contiene 1,5 ml de solución salina tamponada, equilibrada, con indicador y mezclar
bien con una pipeta Pasteur para obtener 109 bacterias por ml.
2. Marcar 6 pocillos de una placa de microtitulación de la siguiente forma: C (control), G (glucosa), L (lactosa), M
(maltosa), S (sacarosa) y Pasa (penicilinasa).
3. Agregar 25 ml de una solución de hidratos de carbono estéril al 10% a los pocillos G, L, M, S y 25 ml de solución
de ampicilina al pocillo Pasa. El primer pocillo sin ningún azúcar servirá de control.
4. Agregar 100 ml (4 gotas) de suspensión bacteriana a cada uno de los seis pocillos.
5. Leer después de 2 a 4 horas de incubación a una temperatura entre 35 y 37 °C en aerobiosis (no en atmósfera de
CO2). Se recomienda examinar la reacción de la ß-lactamasa nuevamente después de 24 horas ya que algunas
cepas pueden producir una reacción lenta de la ß-lactamasa.
Interpretación:
Dado que N. gonorrhoeae utiliza glucosa (no maltosa, sacarosa ni lactosa), solo el tubo que contiene glucosa debe
presentar un cambio de color.
Los resultados de la utilización de los hidratos de carbono y la producción de ß-lactamasa se registran de la

siguiente manera:
Tubo o pocillo control = Rojo

Color amarillo = Reacción positiva
Color rojo anaranjado = Reacción negativa
Nota: Si se sospecha la presencia de N. gonorrhoeae y se obtiene un resultado dudoso con la prueba rápida de utilización de los hidratos de
carbono, comprobar la pureza del cultivo y confirmar la identificación utilizando otro tipo de prueba como las pruebas serológicas.
Solución de glucosa-potasio-sodio-fosfato (GKNP)
Es la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin Ca++ ni Mg++ (comercializada)
10× solución madre
NaCI 80,0 g
Glucosa 10,0 g
KCI 4,0 g
KH2PO4 0,60 g
Na2HPO4 0,48 g
Solución madre de rojo de fenol (optativo) 100 ml
H2O 900 ml
1. Mezclar los ingredientes.

2. Esterilizar en autoclave y conservar la 10× solución madre a 4 °C hasta su uso; la solución madre caduca a los 6
meses.
3. La solución de trabajo se obtiene diluyendo la 10× solución madre 1:10 con H2O.
Gonochek-II
El Gonochek-II (TCS Biosciences, Ltd.) es una prueba que no depende del crecimiento y se utiliza para distinguir las
especies de Neisseria por su capacidad para hidrolizar tres enzimas producidas específicamente por cada una de las
especies: iminopeptidasa de prolina /proliliminopeptidasa (PIP) por N. gonorrhoeae, ß-glutamilaminopeptidasa por
N. meningitidis y ß-galactosidasa por N. lactamica.
El estuche Gonochek-II comprende un único tubo que contiene tres sustratos cromogénicos. La hidrólisis de estos
sustratos produce un color diferente. El color específico producido está relacionado con la enzima presente y, por
consiguiente, indica la presencia de N. gonorrhoeae, N. meningitidis o N. lactamica, según sea el color.
Otras especies comensales de Neisseria pueden producir proliliminopeptidasa, por tanto las pruebas enzimáticas deben
realizarse con las cepas que han crecido en medios selectivos. También se han registrado cepas de N. gonorrhoeae PIP
negativa (6–8); por consiguiente, deben confirmarse estas muestras utilizando un método alternativo (3).
GonoGen-II
El GonoGen-II (New Horizons Diagnostics Corporation) es una prueba colorimétrica que emplea anticuerpos
monoclonales. En esta prueba los anticuerpos monoclonales frente a la proteína PorB (PorB IA y PorB IB) de N.
gonorrhoeae se han reunido y adsorbido sobre partículas coloidales metálicas en suspensión. GonoGen II usa un
tampón solubilizador para separar la pared celular de la bacteria analizada, de ese modo queda expuesta la proteína
PorB. Se usa una mezcla de anticuerpos monoclonales unidos a un portador rojo de partículas coloidales metálicas en
suspensión para detectar los antígenos específicos de N. gonorrhoeae. El consiguiente complejo formado antígeno-
anticuerpo se detecta con un dispositivo de filtración que hace que aparezca un punto final rojo perfectamente
dibujado (3).
1. Marcar un tubo de ensayo para cada una de las cepas aisladas y las cepas de referencia.
2. Dispensar 0,5 ml de tampón solubilizador y ajustar la turbidez al estándar 1,0 de McFarland añadiendo colonias
crecidas en un agar selectivo o enriquecido.

3. Agitar vigorosamente a mano o con una agitadora vorticial el reactivo GonoGen-II.
4. Agregar una gota de reactivo GonoGen-II en cada uno de los tubos a analizar. Mezclar bien.
5. Dejar que los tubos reposen durante al menos 5–15 minutos (tiempos de reacción más largos aumentan la
claridad de la reacción).
Interpretación:
Positivo: es N. gonorrhoeae, punto de color rosa a rojo en el pocillo.
Negativo: no es N. gonorrhoeae, punto de color blanco a rosa pálido en el pocillo.
Estándares de turbidez de McFarland (9)
Los estándares de turbidez de McFarland se preparan mezclando las siguientes soluciones en diferente proporción
para obtener la turbidez deseada de la escala de McFarland (por ejemplo 0,5, 1, 2 etc.).
Escala de turbidez de McFarland 0.5 1 2 3 4
Solución de cloruro de bario anhidra al 1% (w/v) 0,05 ml 0,1 ml 0,2 ml 0,3 ml 0,4 ml
Solución de ácido sulfúrico al 1% (v/v) 9,95 ml 9,9 ml 9,8 ml 9,7 ml 9,6 ml
Cerrar herméticamente los tubos y conservarlos a temperatura ambiente en la oscuridad (estos permanecerán estables
durante 6 meses). Antes del uso, invertir los tubos varias veces para suspender el precipitado de bario.
Para la comparación, utilizar un fondo con rayas horizontales blancas y negras. Prueba de la oxidasa (para
confirmar la identificación de N. gonorrhoeae tras el cultivo): Preparación en el laboratorio (Morse et al., 1996 y 2010):
Dihidrocloruro de tetrametil-p-fenilendiamina 0,5 g
1. Disolver el sustrato en 50 ml de agua destilada.

2. Colocar un trozo de papel de filtro en una placa de Petri y empaparlo con el reactivo.
3. Recoger una porción de la colonia a analizar con un alambre platino y frotar sobre el papel de filtro.
Interpretación:
Un resultado positivo estará indicado por la aparición de un color violeta oscuro en un plazo de 10 segundos. Los reactivos
de la prueba de la oxidasa pueden adquirirse en el comercio.
Método del papel de filtro:

1. Comprimir la ampolla de vidrio que contiene el reactivo en el dispensador apretando los lados del tubo.
2. Marcar el papel de filtro con el número de la bacteria a analizar y humedecer el papel de filtro con el reactivo.
3. Tomar una colonia de un cultivo de un día para otro con un asa de siembra estéril o una varilla.
4. Frotar el inóculo sobre el papel de filtro empapado con el reactivo.
5. Examinar la posible aparición de un color violeta oscuro (reacción positiva) en 10 a 30 segundos.
Método directo en placa de agar:

1. Agregar de 2 a 3 gotas del reactivo de la oxidasa directamente sobre las placas de agar con un cultivo sembrado
el día anterior.
2. Observar el cambio de color rápido de rosa a granate y a violeta oscuro en 10 a 30 segundos.
Interpretación:
Las bacterias oxidasa positiva dan un color violeta en 30 segundos. Las bacterias oxidasa negativa dan un color
rosado claro o permanece incoloro.
Prueba Phadebact monoclonal GC
En la prueba de Phadebact monoclonal GC dos mezclas (pool) de anticuerpos monoclonales murinos se juntan por
separado con la Proteína A de Staphylococcus no viable, que permite formar subgrupos con las cepas gonocócicas
aisladas dando el grupo WI (PorB IA) y el WII/WIII (PorB IB).
1. Recoger colonias frescas de N. gonorrhoeae que supuestamente se han identificado y suspenderlas en 0,5 ml de
solución salina estéril al 0,9% amortiguada con fosfato (PBS, ver abajo) hasta alcanzar una turbidez equivalente al
estándar 0,5 de McFarland. Utilizar un tubo de ensayo con tapa.
2. Colocar el tubo cerrado en un baño de agua hirviendo durante al menos 5 minutos y luego enfriar a temperatura
ambiente.
3. Antes de usar el reactivo gonocócico, agitar enérgicamente. Poner una gota del reactivo WI y una gota del WII/
WIII, separadas, en un portaobjetos.
4. Agregar una gota de la suspensión gonocócica calentada a ebullición al reactivo WI y una gota al reactivo WII/WIII.
No olvidar de incluir un control negativo al que solo se le agrega solución salina amortiguada con fosfato.
5. Mezclar las gotas por completo pero suavemente con un asa de siembra desechable recién abierta. Usar un asa
de siembra nueva para cada reactivo.
6. Balancear el portaobjetos y leer el resultado en el plazo de 1 minuto.
Interpretación:
Un precipitado con uno de los reactivos gonocócicos, WI o WII/WIII, indica un resultado positivo. Una reacción positiva
con ambos reactivos es un resultado dudoso y deberá volver a realizarse. Si no se produce ninguna reacción con el
reactivo gonocócico WI ni con el WII/WIII, el resultado de la prueba es negativo (un resultado negativo indica que las
cepas analizadas no son de N. gonorrhoeae).
Tampón de fosfato (véase amortiguadores del pH)
Solución salina amortiguada con fosfato (PBS)

La solución salina amortiguada con fosfato se puede preparar en el laboratorio (véase abajo) y está también
comercializado en polvo o comprimidos preparados con antelación. Para preparar 1 litro de la 1× solución salina
amortiguada con fosfato mezclar:

Cloruro de potasio 0,2 g
Hidrogenofosfato de sodio 1,78 g
Dihidrofosfato de potasio 0,27 g
Agua destilada 1l
1. Disolver los ingredientes en 80 ml de agua destilada.

2. Ajustar el pH según convenga (7,4, 6,8, etc.).
3. Ajustar el volumen a 1 litro con el agua destilada restante.
4. Esterilizar en autoclave.

Tampón de citrato-hidróxido de sodio de Sörensen (véase amortiguadores del pH)
A4.3 Tinciones
Tinción de Giemsa (10%) (10)–Klebsiella granulomatis (cuerpos de Donovan)
Solución madre:
Giemsa, polvo 0.5 g

Glicerol 33 ml
Metanol puro, sin acetona 33 ml
1. Disolver el colorante de Giemsa, polvo, en el glicerol poniendo la mezcla en un baño María a 55 °C durante 90
minutos.
2. Una vez disueltos los cristales, agregar el metanol puro.
3. Conservar a temperatura ambiente.
Solución de trabajo (se debe preparar en el momento de uso):
Solución madre 1 ml
Tampón de fosfatos 23 ml
Tampón de fosfatos:
Solución 1 Solución 2
Na2HPO 4 9,47 g KH2PO4 9,08 g
Enrasar hasta 1 litro con agua destilada Enrasar hasta 1 litro con agua destilada
1. Mezclar 72 ml de la solución 1 con 28 ml de la solución 2.

2. Agregar 900 ml de agua destilada.
Procedimiento de tinción:
1. Secar al aire el frotis, fijar con metanol puro durante al menos 5 minutos y dejar que se seque otra vez.
2. Cubrir con la solución de trabajo de Giemsa durante 1 hora.
3. Lavar rápidamente con alcohol etílico al 95% para eliminar el exceso de colorante.
Tinción de Gram
El procedimiento de la tinción de Gram se describe en el capítulo 4 y se recuerda en este anexo ya que también se usa
para teñir otros agentes patógenos. Los reactivos pueden adquirirse en el comercio o prepararse en el laboratorio (Van
Dyck et al., 1999). También se encuentran comercializados juegos de reactivos ya preparados para usar.
Solución de cristal violeta (tinción primaria)

Solución de yodo (mordiente)
Etanol-acetona (decolorante)
Solución de Safranina (colorante de contraste)
1. Cubrir con cristal violeta durante 30 segundos una extensión fijada (con calor). Lavar suavemente con agua fría del
grifo.
2. Inundar el porta con solución de yodo durante 30 segundos. Lavar suavemente con agua fría del grifo.
3. Decolorar con acetona, etanol-acetona o solo etanol al 95% hasta que deje de salir colorante violeta del frotis. Es
mejor sujetar el porta con la mano, protegida con guantes, cerca del agua corriente. El tiempo de decoloración
dependerá del decolorante químico utilizado y del espesor del frotis y será más corto (normalmente solo unos
segundos) con acetona y más largo (hasta un minuto) con etanol. Debe evitarse la decoloración excesiva ya que
las bacterias grampositivas podrían confundirse con las gramnegativas. No tener en cuenta las porciones gruesas
que puedan teñirse de azul en un frotis que no esté bien extendido y nivelado.
4. Lavar rápidamente con agua corriente para detener la decoloración y escurrir el exceso de agua.
5. Cubrir con el colorante de contraste, safranina o fucsina, durante 1 minuto.
6. Lavar con agua corriente y secar suavemente el porta con papel de filtro.
Solución de cristal violeta:
Solución A (10%) Solución B (10%)
Cristal violeta en polvo 2 g Oxalato de amonio 0,8 g
Etanol al 95% 20 ml Agua destilada 80 ml
Mezclar las soluciones A y B con el fin de obtener el reactivo de tinción cristal violeta. Almacenar durante 24 horas y
filtrar a través del papel. Etanol-acetona (proporción 1:1):
Acetona 50 ml
Etanol al 95% 50 ml
Solución de yodo:
Yoduro de potasio 2g
Cristales de yodo 1g
La mayoría de las referencias bibliográficas recomiendan triturar yodo y yoduro de potasio en un mortero.
Agregar agua lentamente al tiempo que se sigue triturando los productos químicos hasta que se disuelva el yodo.
Solución de safranina:
Solución madre Solución de trabajo

Safranina 5 g Solución madre 10 ml
Etanol al 95% 100 ml Agua destilada 90 ml

Tinción de Leishman
La tinción de Leishman puede usarse en lugar de la tinción de Giemsa para Klebsiella granulomatis (donovanosis,
capítulo 13) una vez fijado el frotis en el portaobjetos con metanol.
Solución madre:
Leishman, polvo 1,5 g
Metanol 1l
1. Agregar el colorante Leishman, polvo, al metanol y mezclar bien utilizando unas perlas de vidrio.
2. Dejar en reposo la solución madre a temperatura ambiente durante 24 horas.
Solución de trabajo:
Solución madre 1 parte
Agua tamponada 2 partes
1. Preparar una solución de trabajo nueva cada día diluyendo 1 parte de solución madre en 2 partes de agua
destilada (agua tamponada con 3,76 g/l de hidrogenofosfato de sodio y 2,10 g/l de dihidrogenofosfato de potasio,
pH 7,0–7,2).
2. Conservar en un frasco herméticamente cerrado para evitar que la solución madre se humedezca.
Método:
1. Preparar un frotis con la muestra tomada de los bordes de la úlcera (donde es más probable que se encuentren los
cuerpos Donovan) en un portaobjetos de vidrio.
2. Cubrir el portaobjetos con la solución de trabajo de la tinción de Leishman durante 10 minutos o hasta 30 minutos
(tinción de Giemsa).
3. Lavar el portaobjetos con agua tamponada o solución salina tamponada con fosfato (pH 7,0–7,2).
4. Dejar que el portaobjetos se seque al aire y luego examinar al microscopio óptico con aceite de inmersión
(aumento total 1000X).
Interpretación:
Los cuerpos de Donovan aparecen en forma de cocobacilos con grandes vacuolas en el citoplasma de los
histiocitos grandes y de vez en cuando en las células plasmáticas y los leucocitos polimorfonucleares. Los
microorganismos se ven de color azul-violeta, a menudo rodeados por una cápsula rosada acidófila.
Tinción de azul de metileno: N. gonorrhoeae (5)

Etanol 30 ml
1. Disolver el colorante en etanol.

2. Agregar agua destilada.
3. Preparar y fijar el frotis en un portaobjetos de vidrio.
4. Cubrir el portaobjetos con la tinción de azul de metileno durante 1 minuto.
5. Lavar el colorante del portaobjetos con agua corriente del grifo.
6. Enjuagar, secar al aire y examinar al microscopio.
Tinción de azul de metileno o violeta de genciana: N. gonorrhoeae (11)
Azul de metileno
Violeta de genciana
La tinción de azul de metileno o violeta de genciana se prepara añadiendo 4 partes de azul de metileno a 1 parte de
violeta de genciana (fórmula de Huker).
1. Preparar un frotis delgado a partir de una muestra clínica gonocócica y otro a partir de un cultivo de control
adecuado, etiquetar ambos portaobjetos.
2. Fijar con calor pasando el portaobjetos sobre una llama.
3. Agregar azul de metileno durante 30 a 60 segundos.
4. Lavar, dejar secar al aire y examinar al microscopio.
5. N. gonorrhoeae aparecerá como cocos o diplococos de color violeta oscuro.
Técnica de impregnación con plata de Warthin–Starry
Ácido cítrico al 1%:
Ácido cítrico 1g
Agua destilada o desionizada 100 ml
Agua acidulada:
Agua destilada o desionizada 500 ml
Agregar una cantidad suficiente de ácido cítrico al 1% para llegar a un pH de 4,0.
Solución de nitrato de plata al 2% para la solución de revelado:
Nitrato de plata 5g
Agua acidulada 250 ml
Solución de nitrato de plata al 1% para la impregnación:
Solución de nitrato de plata al 2% 25 ml

Agua acidulada, pH 4,0 25 ml
Solución de gelatina al 5%:
Gelatina, calidad analítica elevada 2,5 g

Solución de hidroquinona al 0,15%:
Cristales de hidroquinona 0,075 g

Solución de revelado:
Solución de nitrato de plata al 2% 12 ml

Solución de gelatina al 5% 30 ml
Solución de hidroquinona al 0,15% 16 ml

A4.4 Agradecimientos 4. Young H, Moyes A. An evaluation of pre-poured
selective media for the isolation of Neisseria
Los autores reconocen las contribuciones de Rajinder gonorrhoeae. Journal of Medical Microbiology, 1996,
Parti y Aura Helena Corredor en la preparación de este 44(4):253–260.
anexo. 5. Sarafian SK. Media, reagents, test procedures and

stains. In: Morse SA, Moreland AA, Holmes KK, eds.
Los siguientes textos se reconocen agradecidamente Atlas of sexually transmitted diseases and AIDS, 2nd ed.
Baltimore, Mosby-Wolfe, 1996:326–332.
como una fuente para varias recetas:
6. Brown S et al. Absence of prolyminopeptidase-
Morse SA, Moreland AA, Holmes KK, eds. Atlas of
negative Neisseria gonorrhoeae strains in Ontario,
sexually transmitted diseases and AIDS, 2nd ed.
Canada. Canada Communicable Disease Report, 2008,
Baltimore, Mosby-Wolfe, 1996.
34:20–23.
Morse SA, et al., eds. Atlas of sexually transmitted
7. Martin IE et al. Identification of prolyliminopeptidase-
diseases and AIDS, 4th ed. Edinburgh, Saunders/
negative Neisseria gonorrhoeae strains in Canada.
Elsevier, 2010.
Sexually Transmitted Diseases, 2011, 38(1):40–42.
Van Dyck E, Meheus AZ, Piot P. Laboratory diagnosis
8. Unemo M et al. Global transmission of
of sexually transmitted diseases. Geneva, World Health
prolyliminopeptidase-negative Neisseria gonorrhoeae
Organization, 1999.
strains: implication for changes in diagnostic strategies.
A4.5 Referencias 9. Benson HJ. Microbiological applications. A laboratory
1. Kellogg DS Jr et al. Neisseria gonorrhoeae: virulence manual in general microbiology, 6th ed. Dubuque, Wm C
genetically linked to clonal variation. Journal of Brown Company, 1994.
Bacteriology, 1963, 85:1274–1279.
10. Pillay A et al. Media, stains, reagents and test
2. Dillon JA, Tostowaryk W, Pauzé M. Effects of different procedures. In: Morse SA et al., eds. Atlas of sexually
media and methods of inoculum preparation on results transmitted diseases and AIDS, 4th ed. Edinburgh,
of antimicrobial susceptibility testing of Neisseria Saunders/Elsevier, 2010:355–365.
gonorrhoeae by agar dilution. Antimicrobial Agents and
11. Taylor SN, DiCarlo RP, Martin DH. Comparison of
Chemotherapy, 1987, 31(11):1744–1749.
methylene blue/gentian violet stain to Gram’s stain for
3. Dillon JR, Starnino S. Laboratory manual: identification the rapid diagnosis of gonococcal urethritis in men.
and antimicrobial susceptibility testing of Neisseria Sexually Transmitted Diseases, 2011, 38(11):995–996.
gonorrhoeae, 2nd ed. Co-ordinating Centre for the
Gonococcal Antimicrobial Susceptibility Surveillance
Program in Latin America and the Caribbean, 2002
(http://www.gasp-lac.net/wp-content/uploads2/
EnglishFull_FINAL-VERSION-1_Mar-27-2012.pdf,
accessed 5 April 2013).
Anexo 5
Material de laboratorio
NOTA: El material de laboratorio figura en esta lista en el mismo orden cronológico con el que aparece en cada
capítulo. Solo se ha indicado el nombre del fabricante del producto o reactivo. El propósito de la lista no es identificar
integralmente a cada fabricante. No se hace mención de los distribuidores locales.
Capítulo 3. Micoplasmas genitales

• Equipo
–– Centrifugadora
–– Cámara de electroforesis
–– Congelador (–70 °C)
–– Refrigerador (4 °C)
–– Equipo para la reacción en cadena de la polimerasa (RCP)
–– Equipo para la RCP en tiempo real
• Reactivos
–– Agarosa en polvo
–– Bromuro de etidio
–– Reactivos de la reacción en cadena de la polimerasa
–– Reactivos de la RCP en tiempo real
• Material fungible
–– Puntas de pipeta con filtro (1 μl, 10 μl, 100 μl, 1.000 μl)
–– Pipeteadores (10 μl, 200 μl, 1.000 μl)
–– Hisopos (dacrón o rayón)
–– Tubos de ensayo (2 ml, 200 μl)
• Pruebas (estuches comercializados)

–– Pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (PAAN), una prueba de amplificación mediada por transcripción
(AMT) para uso exclusivo en investigación (Gen-Probe)
Capítulo 4. Gonorrea
• Equipo
–– Balanza analítica (para pesar)
–– Crioviales
–– Jarra de anaerobiosis (con vela o con sobres generadores de CO2)
–– Mechero de gas
–– Incubadoras (a 37 °C, 5±1% CO2)
–– Estándares nefelométricos de McFarland (PRO-LAB Diagnostics)
Anexo 5: Material de laboratorio 235

–– Microscopio (microscopio óptico y microscopio de fluorescencia)
–– Pehachímetro
–– Regla de plástico (mm) o compás nonio
–– Replicador automático de Steer (inoculador de puntas múltiples o asa de siembra calibrada) (CMI-Promex Inc.,
NJ, EUA)
–– Agitadora vorticial o vórtex
–– Baño de agua o baño María
• Reactivos
–– Discos de antimicrobianos (o antibióticos) para antibiograma (Oxoid)
–– Polvos antimicrobianos o antibióticos (Sigma-Aldrich o del fabricante de productos farmacéuticos, si lo hay)
–– Caldo para infusión de cerebro - corazón (BHI) (Oxoid)
–– Agar chocolate inclinado
–– Base de agar Columbia (Oxoid)
–– Agar tripticasa de cisteína (ATC) (contiene glucosa, maltosa y sacarosa en una concentración final de 1% a 2%)
(Difco, Becton, Dickinson)
–– Discos (antibióticos) (Oxoid)
–– Tiras Etest (bioMérieux, Francia)
–– Medio base para GC (Difco)
–– Glicerol (15% a 20%) (Sigma-Aldrich)
–– Tinción de Gram (cristal violeta, solución de yodo, [acetona, etanol–acetona o etanol], safranina) (PRO-LAB
Diagnostics)
–– Isovitalex-Vitox (Oxoid)
–– Azul de metileno (PRO-LAB Diagnostics)
–– Caldo de Mueller–Hinton (Oxoid)
–– Nitrocefina (Oxoid)
–– Reactivo de la oxidasa
–– Medios selectivos (Thayer–Martín, Thayer–Martín modificado y NYC)
–– Estos medios pueden adquirirse comercialmente, mediante proveedores locales o se puede preparar en el
propio laboratorio, es decir, preparación interna
–– Medio de transporte, no nutritivo (Amies o Stuart) (Sigma-Aldrich)
–– Crioviales
–– Portaobjetos de vidrio
–– Pipetas graduadas
–– Líquido criogénico estéril con perlas congeladas
–– Placas de microtitulación
–– Pipetas de Pasteur
–– Placas de Petri (90 mm)
–– Puntas de pipeta (1 μl, 10 μl, 200 μl, 1.000 μl)
–– Tubos transparentes de plástico
–– Asa de siembra de plástico (1 μl, 10 μl)
–– Frasco Bijou de policarbonato con tapa de rosca
–– Gradillas para tubos (15 ml o 50 ml) y para crioviales (2 ml)
–– Hisopos (dacrón o rayón)
–– Abbott RealTime CT/NG (Abbott Molecular)
–– API NH (bioMérieux)
–– APTIMA Combo 2 (Gen-Probe)
–– Prueba de la cefalosporina cromogénica (discos de nitrocefina)
–– Cobas Amplicor CT/NG (Roche Diagnostics)
–– Gonochek-II (E-Y Laboratories)
–– GonoGen II (New Horizons Diagnostics Corporation)
–– Captura de híbridos de segunda generación (HC2) CT/NG (Digene Corporation)
–– MicroTrak (Trinity Biotech PLC Co)
–– Caldo de Mueller–Hinton (Oxoid)
–– Prueba de la oxidasa (BACTIDROP oxidase)
–– PACE 2 (Gen-Probe)
–– Prueba Phadebact Monoclonal GC (Boule Diagnostics)
–– ProbeTec ET (Becton, Dickinson)
–– ProbeTec GC Q (Becton, Dickinson)
–– RapID NH (Remel-Termo Fisher Scientific)
–– Medio selectivo (Thayer–Martin, Thayer–Martin modificado y NYC) (Oxoid)
Capítulo 5. Infecciones por clamidias

• Equipo
–– Cabina de seguridad biológica o bioseguridad
–– Crioviales
–– Microscopio de fluorescencia
–– Mechero de gas
–– Hemocitómetro
–– Incubadoras (una a 37 °C y una a 35 °C)
–– Pipeteador multicanal
–– Homogeneizador ultrasónico
–– Matraz de vacío
–– Agitadora vorticial
• Reactivos
–– Acetona
–– Anfotericina B
–– Anticuerpos monoclonales fluorescentes contra C. trachomatis
–– Solución de glucosa-potasio-sodio-fosfato (GKNP)
–– Medio de Dulbecco con modificación de Iscove (IMDM-VGA) (Invitrogen; Sigma-Aldrich)
–– Medio de transporte sacarosa-fosfato (SP) con suero y antibióticos
–– Medio de conservación sacarosa-fosfato-glutamato (SPG)

–– Puntas de pipeta de 200 μl
–– Pipetas calibradas
–– Crioviales
–– Cubreobjetos de vidrio
–– Línea celular McCoy (McCoy B; ATCC CRL-1696)
–– Pipetea de Pasteur
–– Película de sellado
–– Matraces de cultivo tisular
–– Placas de cultivo tisular (96 pocillos)
–– Viales de cultivo tisular (5 ml) con cubreobjetos de vidrio de 13 mm
Capítulo 6. Tricomoniasis
• Equipo
–– Incubadora (37 °C)
–– Microscopio óptico
• Reactivos
–– Medio Diamond
–– Medio Kupferberg
–– Cubreobjetos
–– Hisopos de dacrón o de rayón con mango de aluminio
–– Hisopos de dacrón o de rayón con mango de plástico

–– Prueba diagnóstica en el punto de atención: Prueba rápida para tricomonas OSOM (Genzyme Diagnostics)
(autorizado solo para muestras vaginales tomadas con hisopo)
–– Estuche para cultivo: Sistema de cultivo InPouch TV (BioMed Diagnostics)
–– Prueba de amplificación de ácidos nucleicos: APTIMA TV (Gen-Probe)
Capítulo 7. Vaginosis bacteriana

• Equipo
–– Espéculo
• Reactivos
–– Hidróxido de potasio al 10% (KOH)
–– Tinción de Gram (cristal violeta, solución de yodo, safranina) (PRO-LAB Diagnostics)
–– Solución salina o solución salina amortiguada con fosfato (PBS)
–– Hisopos de algodón
–– Cubreobjetos de vidrio
–– Tiras de papel indicador del pH (intervalo de pH 3,8–6,0)

–– Affirm VP III (Becton, Dickinson)
–– BV blue (OSOM)
–– FemExam Card Test (New Rapid Diagnostic Kit) (Litmus Concepts)
Capítulo 8. Candidiasis
• Equipo
–– Incubadora a 36 °C
• Reactivos
–– Solución de KOH al 10%
–– Suero bovino (o equino)
–– Tinción de Gram (cristal violeta, solución de yodo, safranina) (PRO-LAB Diagnostics)
–– Solución salina o solución salina amortiguada con fosfato (PBS)
–– Agar de Sabouraud dextrosado, selectivo, con o sin cloranfenicol
–– Medio de transporte (Amies)
–– Cubreobjetos
–– Tiras de papel indicador del pH
–– Tubos de ensayo

–– API 20C (bioMérieux)
–– API ID3 2C (bioMérieux)
–– Vitek Yeast Biochemical Card (bioMérieux)
Capítulo 9. Infecciones por el virus del herpes simple

• Equipo
–– Congelador (–20 °C y –80 °C)
–– Incubadora (36 °C, 5% de CO2)
–– Microscopio (de fluorescencia y estereoscópico)

• Reactivos
–– Acetona
–– Isotiocianato de fluoresceína (sondas moleculares)
–– Ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N-(2- etanosulfónico) (HEPES)
–– Solución salina amortiguada con fosfato (PBS)
–– Sacarosa
–– Hisopos con punta de algodón, dacrón o conglomerado de nilón
–– Tubos de cultivo
–– Anticuerpos monoclonales específicos de tipo marcados con isotiocianato de fluoresceína o inmunoperoxidasa
(para usar directamente en células infectadas)
–– Portaobjetos de microscopio
–– Frascos ampolla con cubreobjetos circular al fondo (shell vial) o placas multipocillos
–– Hisopos con punta de algodón, dacrón o conglomerado de nilón y mango de madera, plástico o aluminio
–– Agujas estériles
–– Espéculo vaginal
–– Frascos con medio de transporte
• Pruebas
–– Prueba de amplificación de ácidos nucleicos (comercializado pero no autorizado por la FDA)
–– Pruebas diagnósticas rápidas en el punto de atención para el VHS que están comercializadas pero sin evaluar
en muchos entornos
Capítulo 10. Sífilis

• Analizador genético ABI 310 (Applied Biosystems)
–– Microscopio binocular con condensador de campo oscuro
–– Analizador de quimioluminiscencia
–– Lector de enzimoinmunoanálisis (ELISA)
–– Refrigerador
–– Homogeneizador ultrasónico
• Reactivos
–– Acetona
–– IgG o IgM antihumana de cabra marcada con fosfatasa alcalina
–– IgG antihumana de cabra biotinilada, marcada con estreptavidina-peroxidasa
–– Carbón
–– Fluoresceína
–– Conjugado de fluoresceína
–– Globulina contra Treponema pallidum marcada con fluoresceína
–– Peroxidasa de rábano
–– Aceite de inmersión
–– Parafina
–– Solución salina amortiguada con fosfato (PBS)
–– Proteínas recombinantes para inmunoensayos lineales (TpN47, TpN17, TpN15 y TmpA)
–– Rojo de tolueno
–– Asas de siembra bacteriológicas o espátula de acero inoxidable
–– Portaobjetos de microscopio
–– Placas de microtitulación
–– Tiras inmunocromatográficas de nitrocelulosa
–– Pipetas
–– Tiras de membrana de nitrocelulosa
–– Jeringas (2 ml o 5 ml)
–– Pruebas (estuches comercializados y preparación en el laboratorio de los reactivos de las pruebas)
• Pruebas
–– Pruebas serológicas (no treponémicas o reagínicas)
Prueba de la reagina plasmática rápida (RPR) (Becton, Dickinson)
Prueba de rojo de toluidina en suero no calentado (TRUST; New Horizon Diagnostics)
Test serológico para la sífilis (TTS o VDRL por su sigla en inglés)
Reacción de Wasserman (RW)
–– Pruebas serológicas (treponémicas)
Prueba de absorción de los anticuerpos antitreponémicos fluorescentes (FTA-Abs)
Prueba de hemaglutinación con T. pallidum (TPHA por su sigla en inglés)
Aglutinación pasiva de partículas para la detección de anticuerpos contra T. pallidum (TPPA) (Fujirebio)
Enzimoinmunoanálisis treponémico (EIA) y ensayos por quimioluminiscencia (CIA)
Detección de anticuerpos treponémicos por inmunoelectrotransferencia (WB)
–– Pruebas diagnósticas rápidas en el punto de atención para la sífilis
Estas pruebas se formatean como:
1) Pruebas en tiras de flujo lateral (véase el procedimiento en el capítulo 10)
2) Dispositivo o sistema de flujo directo (Span Diagnostics, Ltd.)
–– Pruebas dobles: rápidas no treponémicas y treponémicas (Chembio Diagnostic Systems, Inc.)
Capítulo 11. Linfogranuloma venéreo

• Prueba
–– Las pruebas moleculares para distinguir las cepas que causan el linfogranuloma venéreo de las que no lo
producen se basan en la detección del gen pmpH, que solo está presente en las cepas de linfogranuloma
venéreo

Capítulo 12. Chancro blando
• Equipo
–– Incubadora (32 a 34 °C, atmósfera saturada de vapor de agua o 5% de CO2)
–– Estándares nefelométricos de McFarland (PRO-LAB Diagnostics)
• Reactivos
–– Detección de la fosfatasa alcalina (n-butanol, tampón de citrato-hidróxido de sodio de Sörensen [0,01 mol/l],
2,6-dibromoquinona-4-clorimida en metanol [5 g/l], hidrogenofosfato de sodio sin fenol)
–– Reactivos de tinción de Gram (véase el anexo 4)
–– Prueba de reducción de nitratos (solución de nitrato de sodio [0,5 g/l], tampón de fosfato, pH 6,8 [0,025 mol/l],
ácido acético [5 mol/l], naftilamina [5 g/l])
–– Prueba de la oxidasa (dihidrocloruro de tetrametil-p-fenilendiamina)
–– Prueba de la porfirina (solución de sulfato de magnesio, tampón de fosfato, pH 6,9 [0,1 mol/l], hidrocloruro del
ácido aminolevulínico [2 mol/l]
–– Medios de crecimiento (véase el anexo 4)
–– Asas de siembra bacteriológicas
–– Hisopo de algodón
–– Tiras de papel de filtro
• Pruebas (identificación de dianas moleculares)

–– Pruebas de amplificación de ácidos nucleicos desarrolladas en laboratorios de investigación
Capítulo 13. Donovanosis (granuloma inguinal)

• Equipo
–– Pinzas para biopsia en sacabocados
• Reactivos
–– Etanol al 95%
–– Reactivos de la tinción de Giemsa (véase el anexo 4)
–– Reactivo de la tinción de Leishman (véase el anexo 4)
–– Técnica de impregnación con plata de Warthin-Starry (véase el anexo 4)
–– Parafina
• Pruebas (identificación de dianas moleculares)

–– Pruebas de amplificación de ácidos nucleicos desarrolladas en laboratorios de investigación, dirigidas
al gen phoE
Capítulo 14. Infecciones por el virus de los papilomas humanos
• Equipo
–– Refrigerador
–– Horno de microondas
–– Adaptador de pipetas
–– Transiluminador ultravioleta
• Reactivos
–– Ácido acético
–– Agarosa o acrilamida en polvo
–– Bromuro de etidio
–– Sondas de DNA específicas del VPH
–– Mercaptoetanol
–– Marcadores serológicos
–– Microplacas o tubos pequeños para la reacción de la RCP
–– Pipetas (2 ml, 5 ml y 10 ml)
–– Puntas con filtro (10 μl, 100 μl, 1.000 μl)
• Pruebas (véanse también los cuadros 14.2 y 14,3, capítulo 14)

–– Métodos de detección de DNA del VPH
RCP con la técnica de captura de híbridos 2 (HC2),
Prueba del VPH (Qiagen)
Prueba del VPH en el punto de atención
Prueba del VPH COBAS 4800 (Roche)
Prueba de genotipado del VPH en matriz lineal (Roche)
Prueba de genotipado del VPH RUO LQ (Qiagen)
Estuche de genotipado múltiple del VPH (Multimetric)
–– Prueba del RNAm del VPH
Prueba del VPH APTIMA (Gen-Probe)
PreTect HPV proofer (Norchip)

Capítulo 15. Infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana
• Equipo
–– Lector y lavador de ELISA
–– Citómetro de flujo
–– Refrigerador
–– Adaptador de pipetas
• Reactivos
–– Acrilamida en polvo
–– Anticuerpos monoclonales marcados para análisis en un citómetro de flujo (antiCD4, antiCD3, antiCD8 y
antiCD45)
–– Estabilizadores sanguíneos (tubos Cyto-Chex y TransFix)
–– Tubos sanguíneos
–– Pipetas calibradas
–– Reactivo colorante o reactivo de detección (oro coloidal)
–– Papel de filtro
–– Anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia
–– Tiras de la membrana (con proteínas separadas específicas del VIH o proteínas recombinadas o péptidos)
–– Portaobjetos (para células fijadas infectadas por el VIH)
• Pruebas
–– Pruebas serológicas
EIA (de primera, segunda, tercera y cuarta generación)
Pruebas rápidas
–– Ensayos confirmatorios (serológicos)
Pruebas de inmunofluorescencia
Pruebas de WB
Inmunoensayos lineales
–– Pruebas moleculares
Detección de RNA, DNA y p24 del VIH (estuches comercializados para las PAAN)
Prueba diagnóstica en el punto de atención de DNA por RCP
Prueba de resistencia genotípica del VIH a los antirretrovirales (TRUGENE y Viroseq)
Prueba de resistencia fenotípica del VIH a los antirretrovirales (sumamente costosa, no se recomienda para el
diagnóstico habitual)
Agradecimientos
Los autores agradecen a Rajinder Parti y Aura Helena Corredor su colaboración en la preparación de este anexo.
Diagnóstico de laboratorio de las infecciones de transmisión sexual, incluida la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana
Jefe de redacción
Magnus Unemo
Redactores
Ronald Ballard, Catherine Ison, David Lewis, Francis Ndowa, Rosanna Peeling
Para mayor información favor ponerse en contacto con:

OFICINA REGIONAL PARA LAS
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Switzerland ISBN 978 92 4 350584 8
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Diagnóstico de laboratorio de las infecciones de transmisión sexual, incluida la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana

Diagnóstico de laboratorio de las

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Siglas y abreviaturas vii

Elección de las pruebas diagnósticas de las infecciones de

1.1 Introducción de la sensibilidad a los antibióticos. Algunos de estos

Elección de las pruebas diagnósticas de las infecciones de transmisión sexual 1

Microorganismo patógeno Manifestaciones clínicas y otras enfermedades asociadas

Microorganismo patógeno Manifestaciones clínicas y otras enfermedades asociadas

Elección de las pruebas diagnósticas de las infecciones de transmisión sexual 3

Elección de las pruebas diagnósticas de las infecciones de transmisión sexual 5

Elección de las pruebas diagnósticas de las infecciones de transmisión sexual 7

2. Gift TL et al. The rapid test paradox: when fewer cases

Gestión de la calidad en los laboratorios

Gestión de la calidad en los laboratorios 9

Evaluación de la calidad Control de la calidad

Evaluación Evaluación Evaluación y Control interno Evaluación y

Gestión de la calidad en los laboratorios 11

Gestión de la calidad en los laboratorios 13

3. Nkengasong JN et al. Laboratory systems and

Cuadro 3.1: Asociaciones mórbidas de los micoplasmas urogenitales

Vaginosis Endometritis Infertilidad Transmisión

M. genitalium ++++ +++ – +++ +/– + +

SD: sin determinar; EIP: enfermedad inflamatoria pélvica.

Se ha asociado M. genitalium con la cervicitis, pero

9. Horner P et al. Role of Mycoplasma genitalium

14. Haggerty CL et al. Failure of cefoxitin and doxycycline

Gonorrea sin complicacionesa Gonorrea con complicacionesb

Microscopiaa Cultivo PAAN

Uretra: Tomar las muestras uretrales al menos 1 hora

4. Lavar rápidamente con agua corriente para detener

Figura 4.1 5. Cubrir con el colorante de contraste, safranina o

2. Enjuagar con agua corriente y secar suavemente el

4.4.4 Lectura del frotis e interpretación

La fiabilidad de un cultivo para el diagnóstico de la

4.5.1 Transporte y cultivo • técnica e hisopos usados para la recogida de las

Localización Dispositivo de Procedimiento

Localización Dispositivo de Procedimiento

NP: no procede; PAAN: prueba de amplificación de ácidos nucleicos.

4.5.3 Siembra e incubación del cultivo

Tradicionalmente, el principal método de identificación

4.5.6.4 Control de la calidad de las pruebas

La confirmación molecular de la identidad puede

APTIMA Cobas Probetec GC CT/NG en

No obstante, distintos fabricantes sacan al mercado

CIM, concentración inhibitoria mínima.

de referencia de N. gonorrhoeae de la OMS que se estéril (o equivalente). A continuación, se inoculan

Cepas de referencia de la OMS

<0,016 <0,016 0,25–1,0 0,125–0,5 <0,016 <0,016 <0,016– <0,016 0,004–

<0,002 0,004– 0,032– 0,064– 0,008– 0,002– 0,016– 0,002– 0,004–

0,25– 0,5– 0,5– 1,0– 0,5– 0,25–1,0 0,5– 2,0– 1,0–

0,064– 0,125–0,5 0,125– 0,25– 0,125–0,5 0,064– 0,125–0,5 1,0– 0,5–

Serotipo Arst Arst Bpyust Brpyust Bpyust Arst Boys Bopt

TSMA-NGd ST3303 ST621 ST1424 ST1422 ST3304 ST556 ST495 ST3305