UNIVERSIDAD NACIONAL

MICAELA BASTIDAS DE
APURIMAC
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERIA
AGROINDUSTRIAL

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA
AGROINDUSTRIAL

PRACTICA Nº 01
“PREPARACION DE MATERIALES, PREPARACION DE MEDIOS
DE CULTIVO, OBSERVACION DE MICROORGANISMOS Y
SIEMBRA EN PLACA”

GRUPO DE PRÁCTICAS: MIERCOLES 16 – 18 pm.

ALUMNO: HECTOR JUNIOR BAZAN JURO

CODIGO: 051455

DOCENTE: Bach. Zulema Ludeña Cervantes

FECHA DE ENTREGA: 29 / 10 / 2008

SEMESTRE: 2008-II

ABANCAY- APURIMAC- PERU

 I. INTRODUCCION

La esterilización se define como la destrucción o eliminación total de todos los

microorganismos vivos en un objeto o material, incluidas las endosporas bacterianas.
El material que se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se conserve sin
contaminar una vez esterilizado:

El Material de Vidrio, como tubos, matraces, frascos, etc, se cierran con algodón
graso o tapones metálicos para evitar la entrada o salida de los microorganismos.
Además, cuando se usa algodón, ha de cubrirse éste con un papel impermeabilizado.
En el caso de las pipetas, se les coloca en la boquilla un trocito de algodón que
actuará como filtro, evitando la contaminación del operario con los microorganismos de
la muestra y que éste a su vez contamine la muestra. Una vez preparadas, se
introducen en estuches o cajas metálicas, o bien se envuelven individualmente en
papel satinado para ser posteriormente esterilizadas.
Todo el material de vidrio se esteriliza con calor seco. (Universidad de Complutence,
2007).

Un Medio de Cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes, preparados en el laboratorio, que suministran los compuestos
necesarios para el desarrollo de los microorganismos.
Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo,
otras bacterias necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer
en ninguno de los medios desarrollados hasta ahora. Los distintos tipos de medios de
cultivo varían según las necesidades de los microorganismos objeto de estudio, pero
todos han de cumplir los siguientes requisitos: (Universidad de Complutence, 2007).

- Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del

microorganismo que se siembra.
- Han de mantenerse estériles hasta el momento de la siembra.

La Identificación y Morfología de los Microorganismos, puede examinarse de dos

formas: Observando microorganismos vivos sin colorear (en fresco) y observando
células muertas teñidas con colorantes.
El examen en fresco de los microorganismos permite conocer algunas de sus
características (morfología, tamaño, movimiento, etc). Sin embargo, las
microorganismos vivos son casi incoloros y no se pueden visualizar fácilmente al
microscopio óptico normal cuando se encuentran suspendidos en agua, de ahí que se
utilizan colorantes para incrementar su contraste con el entorno que los rodea y de
esta forma hacerlos visibles.
Los colorantes son compuestos solubles en agua (generalmente en forma de sales),
que contienen un ión orgánico coloreado y otro ión inorgánico. . (Universidad de
Complutence, 2007).

El Colorante es ácido si la porción coloreada tiene carga negativa, es decir, si tiene un

anión coloreado, siendo en este caso repelido por estructuras de la célula que
presenten la misma carga, como es el caso de la superficie bacteriana. El colorante se
denomina básico si la porción coloreada es el catión, cargado positivamente y con
afinidad por estructuras de la célula con carga negativa, como es la superficie celular.
Las bacterias toman mejor los colorantes básicos, como son el cristal violeta, el azul
de metil eno y la safranina. La eosina es un colorante de tipo ácido, así como la
nigrosina. . (Universidad de Complutence, 2007).
 II. OBJETIVOS

 Conocer la importancia de la esterilización y del acondicionamiento,

preparación de los materiales utilizados en biotecnología, así también
familiarizarse con el manejo de los procedimientos más frecuentemente
utilizados para llevarlas a cabo.

 Aprender a preparar, esterilizar y almacenar distintos tipos de medios de cultivo

utilizados en biotecnología.

 Observar microorganismos vivos en el microscopio de campo claro. Estudiar su

morfología y agrupación, apreciar las diferencias de color mediante una tinción
Gram, para identificarlos según su grupo, presentes en un determinado
alimento.

III. MARCO TEORICO

MATERIALES DE VIDRIO

A parte del instrumental, variado equipo, que se requiere en todo laboratorio de

biotecnología, el material de vidrio, constituye una de las principales herramientas para
los fines que se persigue. La lista y variedad son grandes según el empleo. Como
requisito general los materiales de vidrio deben ser:

- De buena calidad, neutro, resistente a la acción mecánica y cambios de

temperatura, transporte, de superficie lisa, sin rajaduras. Que contenga una
mínima cantidad de álcali libre y de bajo coeficiente de dilatación.
(Campos, 2005)

GENERALIDADES

El material de vidrio constituye una de las principales herramientas de trabajo en los

laboratorios. Existe una grana variedad de acuerdo a las necesidades de cada
laboratorio. Como registro general el material de vidrio debe ser:

- De buena calidad, preferentemente de vidrio neutro

- Resistente a la acción mecánica y cambios de temperatura ya que estas son
sometidas a repetidas esterilizaciones.
- Deben ser transparentes de superficie lisa y sin ralladuras.
- Contener una mínima cantidad de álcali libre.
- Debe tener bajo coeficiente de dilatación.

Las marcas reconocidas son: PIREX y KIMAX, que son de máxima garantía
(Guardino, 1994).

PREPARACION DE LOS MATERIALES DE VIDRIO PARA LA ESTERILIZACION

Los materiales de vidrio son muy utilizados con frecuencia en los procedimientos dado
que esta tiene una gran influencia en la calidad de los resultados, por lo cual es de
suma importancia tener en cuenta la adecuada limpieza y esterilización, es decir se
debe prestar en especial cuidado a su preparación los métodos de limpieza del
material deberán adoptarse al tipo de sustancia que sea necesario remover. En un
principio se va contar con dos tipos de material: el contaminado (el que ha tenido
contacto con microorganismos) y el no contaminado. Cuando se trata de material
contaminado, se deberá esterilizar en autoclave a 121 ºC, 15 libras de presión, durante
20-30 minutos antes de someterlo al proceso de lavado. (Robilotti, 2006)
Para llevar a cabo el proceso de lavado, se emplea una solución de detergente con
agua caliente, anteriormente se enjuaga con agua caliente, posteriormente se enjuaga
con agua destilada y dejar secar a Tº ambiente, en este caso se deberán utilizar
detergentes que dejen poco o ningún residuo. (Robilotti, 2006)
Si se quiere limpiar material de vidrio que tiene manchas de gasa de difícil remoción se
sugiere, sumergirlo en una solución de dicromato de sodio o potásico en ácido
sulfúrico concentrado (mezcla sulfo-crómicos), durante 24 horas, luego se enjuaga con
abundante agua y finalmente con agua destilada. Se deja secar a ºT ambiente, una
vez que el material este limpio y seco debe ser esterilizado, para ello, previamente
deberá empacarse de manera que pueda mantenerse estéril hasta el momento de su
uso. El material que sirve de envoltura final, o que se emplea para su preparación
debe tener las siguientes características: (Robilotti, 2006)

- Ser resistente a pinchazos y abrasiones.

- Permitir envolver el material completamente.
- Permitir la identificación del material estéril.
- Permitir retirar el material estéril con facilidad.
- Estar libre de colorantes y de sustancias tóxicas.
- Ser económico

Entre los materiales que más se emplean para envolver el material antes de ser
esterilizado, se encuentran:

- Para la esterilización por calor húmedo: papel kraft.

- Para la esterilización por calor seco: papel kraft o papel aluminio
(Robilotti, 2006)

PREPARACIONES DE LOS MATERIALES DE VIDRIO

PREPARACION DE PLACAS PETRI

Lavado y secado:
- Retirar el agar con auxilio de la espátula.
- Lavar con agua corriente, detergente y esponja, retirando todo los residuos del
interior de la placa, así como todas las marcas externas, ejuagar
aproximadamente 10 veces en agua corriente.
- Utilizar aguad estilada para el último enjuague.
- Colocar en bandeja las placas cabeza abajo (tapas y fondos) y dejar en estufa.
- Juntar tapa y fondo adecuadamente.
Para esterilizar:
- Se coloca la placa petri en el centro de papel café y se dobla abriéndola,
cogiéndola de sus extremos (frente posterior) de tal manera que parezca un
rectángulo con unas pequeñas salientes en la parte superior. Con las salientes
del papel Kraft. Alzar los extremos del papel (lados laterales del rectángulo).
Doblar las cuatro esquinas del rectángulo, de tal manera que queden dos
puntos y luego estas doblarlas hacia abajo.
Nota: envolver en grupo o individualmente y luego rotular el empaque identificando el
material y colocar la fecha de la esterilización.
PREPARACION DE PROBETAS, ERLENMEYER
- Lavar con agua y detergente utilizando esponja y escobilla.
- Caso de los materiales presentes incrustaciones o residuos grasosos, proceder
a la inmersión de estos en solución sulfocrómico.
 - Enjuagar 10 veces con agua corriente, llenando y vaciando totalmente los
vidrios.
- Usar en el último enjuague, agua destilada.
- Dejar drnhar el agua de los vidrios en cestos de acero inoxidable.
- Secar en estufa a 100 ºC.

Preparación y esterilización
- Colocar tapón de algodón hidrófobo y gasa en la abertura de los balones y
frascos de erlenmeyer.
- Cubrir con hoja de aluminio o papel kraft y fijar con un cordel o cinta adhesiva.
- Cubrir las aberturas y tallos de los embudos y las aberturas de las probetas y
de los vasos de precipitación con hoja de aluminio o papel kraft y fijar con
cordel.
- Rotular el material con fecha de esterilización y prueba de esterilización.
- Esterilizar en autoclave a 121 ºC por 30 minutos, a 170-180 ºC por dos horas.

Nota: Los frascos destinados a la preparación de medios de cultivo, que son

sometidos a autoclave, dispensan esterilización previa.
Cuando se utilizan los tapones de algodón para cubrir la apertura de los tubos,
estas no deben de estar ni muy apretados, ni muy flojos y deben de alcanzar 3cm
dentro del material de vidrio.

PREPARACION DE PIPETAS

- Retirar el algodón de cada pipeta con estilete de punta fina o pinza.

- Sumergir las pipetas en solución de detergente por 24 horas.
- Enjuagar con agua corriente.
- Sumergir en solución sulforcrómica hasta total eliminación de residuos.
- Transferir para lavadora automática de pipetas y lavar por tiempo necesario o
la remoción de los residuos.
- Enjuagar con agua destilada.
- Secar en estufa a 100 ºC.

Preparación y esterilización

- Colocar una pequeña torunda de algodón en el extremo superior de la pipeta

con la ayuda de un alambre.
- Acondicionar en porta pipetas o envolver individualmente un papel kraft.
- Colocar la pipeta aproximadamente a 45º sobre el papel kraft, cuidando que la
punta este cerca de uno de los extremos. Doblar la esquina en la que no es la
apoyada la pipeta, de tal manera que la punta de esta quede cubierta.
Nuevamente doblar las esquinas en la cual no se encuentra la pipeta, luego
enrollar hasta el otro extremo helicoidalmente.

MEDIOS DE CULTIVO

La riqueza de determinados nutrientes en el medio de cultivo, puede incrementar o

disminuir la termo resistencia de las células; pero es imposible generalizar en vista a
las variables y efectos de los diferentes componentes de los medios de cultivo, solos o
en combinación. (Curran, 199).

CULTIVO: Procedimiento a través del cuál se crean en el laboratorio las condiciones

ambientales adecuados con el fin de promover el crecimiento de los microorganismos.
CULTIVOS: Es la técnica de referencia ya que permite la identificación del agente
biológico y realizar estudios de la sensibilidad a los agentes antimicrobianos, requiere
la presencia de microorganismos vivos capaces de desarrollarse en los medios
utilizados. Donde el resultado dependerá de los factores de siembra en medios
enriquecidos de buena calidad (Mendo M, 2000).

- Un medio de cultivo es cualquier “medio” que proporcione sustancias nutritivas

que permitan el desarrollo y reproducción de microorganismos.
- Los medios de cultivo son sustancias nutritivas que se daría a los
microorganismos para si desarrollo invitro, sus componentes básicos los cuales
deben satisfacer en condiciones físicas, químicas convenientes. (Curran, 199).

Para el aislamiento de bacterias de un alimento a estudiar es necesario el cultivo de

éstas por medios para el aislamiento de bacterias de un material a estudiar.

Los microorganismos de acuerdo a sus requerimientos nutricionales se clasifican en:

- microorganismos autótrofos
- microorganismo heterótrofos

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

A) MEDIOS LIQUIDOS

No contienen ningún tipo de agente solidificante y son también denominados

caldos. Favorecen mucho el desarrollo y multiplicación de las bacterias porque al
difundirse éstas por todo el medio encuentran con facilidad las sustancias que
necesitan para nutrirse. Se de gran utilizad para la realización de múltiples
pruebas. (Curran, 1999).

B) MEDIOS SÓLIDOS

Son los típicos agares, el agar es una sustancia que proviene del extracto de
algunas algas rojas, principalmente especies del género gelidium; sirve como
agente solidificante, esta sustancia funde a la temperatura de ebullición del agua y
al enfriar se solidifica dando un gel homogéneo, transparente que no modifica las
propiedades del medio de cultivo. Ejm: agar nutritivo, agar manitol, etc. (Curran,
1999).
C) MEDIOS SEMISÓLIDOS

Compuestos por cualquier medio líquido, al que se le adiciona una concentración

de Agar suficiente para obtener un estado de gel blanco (0.3-0.5%). Se utiliza
principalmente para ver la movilidad bacteriana (. (Curran, 1999).

REQUISITOS QUE DEBEN LLENAR LOS MEDIOS DE CULTIVO

a) Contener las sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo de los

microorganismos.
b) Tener un pH apropiado para la especie microbiana que se va a cultivar (7.2
para los microorganismos patógenos comunes, 5.1 para Lactobacillus
acidophilus).
c) Corregir el pH según lo necesario para el experimento.
d) Estar previamente esterilizado.
e) Estar protegidos de la contaminación ambiental.
REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

Todas las formas de vida; desde los microorganismos a los seres humanos, comparten
ciertos nutricionales en lo que se refiere a la sustancia química necesarias para el
crecimiento y funcionamiento normal.

¿QUE SON NUTRIENTES?: Son aquellas sustancias necesarias para que la bacteria
sintetice su material celular y pueda generar energía.
Todos los organismos vivos quieren carbono en alguna forma; otros quieren en mayor
proporción y otros en pequeñas proporciones (Mendo M, 2000).

Las bacterias son extremadamente versátiles en este aspecto; algunos tipos utilizan
nitrógeno atmosférico; algunos utilizan compuesto inorgánico de nitrógeno y otros
requieren nitrógenos procedentes de compuestos orgánicos nitrogenados.
Todos los organismos requieren azufre y fósforo. El requerimiento animal típico de
azufre se satisface como compuestos orgánicos de azufre, mientras el requerimiento
típico vegetal de azufre se satisface con compuestos inorgánicos de azufre elemental,
el fósforo lo proporcionan los fosfatos; Ejm: sales de ácido fosfórico.
También los organismos vivos requieren de vitaminas (compuestos orgánicos
específicos, necesarios para el crecimiento) y compuestos semejantes a las vitaminas
(Mendo M, 2000).

DE LOS REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

- Todas las formas de vida desde los microorganismo a los seres humanos;
comparten ciertos requerimientos nutricionales en lo que se refieren a
sustancia químicas necesarias para su crecimiento y funcionamiento normal
(Mendo, 2000). Pero debemos tener en cuenta que en la naturaleza existen
gran variedad de tipos de requerimientos nutricionales entre las bacterias; por
tal razón los nutrientes son todas aquellas sustancias necesarias para que la
bacteria sintetice su material y pueda generas energía, y que todos lo
organismos requieren una fuente de energía. Los animales dependen de la
oxidación (pérdida de electrones de un átomo), de compuestos químicos, para
su energía, donde estos organismos se denominan quimiótrofos, ya también
fotótrofos.
- Los nutrientes que utilizan dependen del tipo de bacterias los cuales necesitan
N que son como fuentes de energía como el CHONPS, y cationes de Mg +2,
Mn+2, Na+1, Cu+1 y Ca+2 (Mendo, 2000), pero también requieren en el cultivo y
medio; las fuentes de carbono necesarias para ala síntesis de componentes
celulares, que obtienen energía de ácidos orgánicos.
Las fuentes de N (amonio, NH3, aminoácidos), aminoácidos para sintetizar
proteínas, fosfatos y sulfatos.

DE LA TEMPERATURA

- La temperatura influencia en la rapidez del creamiento, donde cada uno de los

microorganismos según la especie tienen una temperatura mínima y máxima
de crecimiento, lo óptimo es 30 ºC, el cual la temperatura coincide con la
práctica donde mas o menos la misma (Feyman R, 1998).

DEL pH y ACTIVIDAD DE AGUA (Aw)

- Cada microorganismo crece en pH definido, vanan si son bacterias, levaduras

y mohos, igualmente la actividad de agua es diferente, donde las bacterias
necesitan más actividad de agua que la levadura y mohos, pero el pH actúa
 también como regulador, y también pueden vivir en un medio donde el pH varía
de 1.2-11, es el caso del Penecillium y Asperguillus a pH de 0.5-1.

DE LAS PEPTONAS Y EXTRACTOS DE CARNE

- Productos que resultan de la digestión de materiales proteicos, por ejemplo

carne, caseína y gelatina (Mendo R, 2000), pero también existen disponibles
en el comercio diferentes tipos de peptonas (dependiendo de la proteína
utilizada y del método de extracción), para su utilización , es en medios
bacteriológicos, las peptonas difieren en cuanto a su capacidad de soportar el
crecimiento de las bacterias y en la extracción de carne, la concentración de
NaCl 0.5% para evitar el fenómeno de lisis en la célula bacteriana.

DE LA SIEMBRA EN SUPERFICIE Y PROFUNDIDAD

- En la siembra a profundidad, depositar sobre la superficie de una placa con

agar nutritivo 1 gota de 0.2 ml de un determinado microorganismo y extenderlo
con asa de Digralsky (www/http/siembra, 2007), en la práctica se emplea 1 ml
del problema en estudio y se extiende con la ayuda del asa de Drigalsky.
- En la siembra a estrías en superficie, donde con asa de siembra, previamente
esterilizado se toma una muestra de cultivo de microorganismos y se extiende.

DEL CRECIMIENTO DE MICROORGANIMOS

- Para estudiar las características químicas, físicas y fisiológicas de un bacteria

se necesita que esta sea aislada en cultivo puro, la morfología de las colonias
es importante y puede ser apreciada mediante las observaciones de cada
colonia, o observando la forma, y tamaño, superficie, borde elevación,
estructura interna, color, opacidad, consistencia.

CARACTERIZACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

BACILLUS CEREUS SELECTIVO AGAR

Fundamento: Bacillus cereus, ha sido implicado en toxoinfecciones alimentarias,

particularmente asociado al consumo de arroz contaminado, y también en algunos
procesos infecciosos en seres humanos y animales.
El medio de cultivo, contiene los nutrientes necesarios para el apropiado desarrollo
bacteriano.
Es diferencial debido a la presencia de manitol. Bacterias fermentadoras de manitol,
acidifican el medio produciendo el viraje del indicador de pH rojo de fenol del rojo al
amarillo, mientras las bacterias que no lo fermentan, producen colonias del color del
medio.
La adición de emulsión de yema de huevo, mejora el aislamiento y la esporulación de
esta bacteria, además favorece y facilita la visualización de las colonias de B. cereus
ya que se produce un halo de precipitación de la lecitina hidrolizada alrededor de las
mismas.
Puede lograrse el aislamiento selectivo de B. cereus, inhibiendo el desarrollo de la
flora acompañante presente en la muestra, por el agregado del suplemento para
Bacillus cereus con el que se obtiene una concentración final de 100 U de Polimixina B
por ml de medio. (Mossel, 2003).
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Supender 46,0 g de polvo en 950 ml de agua

Peptona de carne 10.0 destilada. Dejar reposar 5 a 10 minutos.
Calentar con agitación frecuente hasta
Extracto de carne 1.0 disolución completa. Esterilizar por autoclave a
Manitol 10.0 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 50°C y
Cloruro de sodio 10.0 asépticamente agregar 50 ml de Emulsión
yema de huevo Britania (código B03-602-61).
Rojo fenol 0.025 Si se desea el aislamiento selectivo de B.
Agar 15.0 cereus, agregar al medio fundido y enfriado a
50 ºC, el contenido de 1 vial de suplemento
para Bacillus cereus (código B03-606-32)
reconstituido con2 ml de agua destilada estéril,
para obtener una concentración final de 100 U
de Polimixina B por ml de medio.
Mezclar bien y distribuir en placas de Petri
estériles.

pH final: 7.2 ± 0.2

Siembra: Homogeneizar 10 g de la muestra de alimento en 90 ml de agua peptonada

0.1%. Efectuar diluciones y sembrar 0.1 ml sobre la superficie del medio de cultivo y
extender sobre la superficie de la placa.

Incubación: En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24-48 horas.

Resultados: corresponden al medio suplementado con yema de huevo y

polimixina B, siguiendo las instrucciones de preparación descriptas mas arriba.

Color de la
Microorganismo Crecimiento Colonia Precipitado
Rojo
Bacillus cereus ATCC Bueno +
10876
Blanco-Amarillo
Staphylococcus aureus Bueno +
ATCC 25923
Amarillo
Bacillus subtilis ATCC 6633 Bueno -
-----
P. mirabilis ATCC 43071 Inhibido -----
-----
Escherichia coli ATCC Inhibido -----
25922

Bacillus cereus presenta colonias de tamaño aproximado de 5 mm, rojas, rugosas y

secas, con halo de precipitación sobre fondo rosa-púrpura.
Estas características son útiles para diferenciar B. cereus de bacterias que utilizan el
manitol (colonias amarillas), pero no permiten diferenciar Bacillus cereus de Bacillus
anthracis, por eso será necesario realizar pruebas bioquímicas para la identificación de
este microorganismo.

Características del medio: amarillo anaranjado.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

PERFRINGENS AGAR BASE (TSC)

FORMULACION
Suspender 22.8g en 500ml del agua destilada y tener cuidado al agua hirviendo para
disolverse completamente. Esterilice para autoclavar en 121°C durante 15 minutos.
Permita enfriarse a 50°C y asépticamente añade el contenido de un frasco cada uno
de Perfringens Agar (OPSP) complementa un y la B (SR0076 y SR0077). La mezcla
bien y fluye en platos estériles. (Mossel, 2003).

DESCRIPCION
Oxoid Perfringens Agar (OPSP), está basado en la formulación desarrollada por
Handford. El medio utiliza sulphadiazine (100 µ g/ml), oleandomycin el fosfato (0.5 µ
g/ml) y el sulfato de B polymyxin (10IU/ml), presentado como suplementos liofilizados
(SR0076 y SR0077) para dar un alto grado de selectividad y especificidad para
Clostridium perfringens. El sodio metabisulphite y el amonio que citrate férrico es
usado como un indicador de reducción sulphite por Clostridium perfringens que
produce colonias negras sobre este medio usando una técnica de plato (placa) verteré.
Las pruebas para la confirmación de Clostridium perfringens son descritas en un
estudio iniciado por la Comisión Internacional sobre Datos específicos Microbiológicos
para Productos de alimentación (I.C.M.S.F, 1998). Sulfato es reducido de la bacteria
como Clostridium perfringens como salmonellae, Proteus spp. y Citrobacter freundii,
así como staphylococci y la especie de Bacilo, son inhibidos sobre OPSP Agar.
Perfringens Agar (OPSP), también, tiene la ventaja de inhibir el crecimiento de
Clostridium bifermentans y Clostridium butyricum. Estos sulfatos se reducen de
organismos que crecen fácilmente sobre Shahidi-Ferguson Perfringens Agar (SFP) 3 y
Tryptone-Sulphite-Neomycin Agar (TSN) 4 como colonias negras con una tendencia de
extender y obscurecer (obscuro) la superficie entera del medio.
Las tensiones ocasionales de enterococci crecerán sobre Perfringens Agar (OPSP)
como colonias blancas, fácilmente distinguidas de las colonias grandes negras de
Clostridium perfringens. Clostridium perfringens los medios de comunicación de
enumeración que incluyen la yema para descubrir la actividad lecithinase no ha
demostrado satisfactoria en parte porque Clostridium perfringens colonias con
frecuencia puede fallar en producir halos y así aparecer falsamente ser negativo, y en
parte porque el conteo es dado poco práctico como el organismo a menudo cultiva las
colonias de extensión en forma de grandes que completamente ennegrecen el medio
(Mossel, 2003).

Composición gr/Lt.

Trypstose………………………. 15.00
Papaio digest………………….. 5.00
Beef extract…………………….. 5.00
Yeast extract………………….... 5.00
Sodium metabisulphite………… 1.00
Ferric ammonium citrate………. 1.00
Agar……………………………… 15.00

Final pH (at 25 ºC) 7.6 +- 0.2

PLATE COUNT AGAR

Composición

Casein enzymic hidrolysate………………. 5.00

Yeast extract……………………………….. 2.50
Dextrose……………………………………...1.00
Agar………………………………………….15.00

Final pH (at 25 ºC) 7.0 +- 0.2

Preparación: Disolver 2,35g de medio de cultivo en polvo en 100ml de agua destilada
y agitar con varilla de vidrio.

Se utiliza para la determinación de microorganismo de la leche y otros productos

lácteos y también puede ser usado determinar la calidad sanitaria de productos de
alimentación, agua y otros materiales.1-5 Cada parte de base deshidratada media es
sujetada al control de calidad APHA prueban y ha encontrado el APHA
requerimientos.1,6 deberían consultar referencias Apropiadas para procedimientos de
cuenta de plato(placa) estándar recomendados. (Mossel, 2003).

TINCION SIMPLE

Se utiliza un solo colorante por lo que toda estructura celular con las mismas
tonalidades (tinta china, azul de metileno, etc). El hidróxido de potasio al 10% (KOH),
filamentos de hongos, ya que KOH dirige parcialmente los elementos proteicos. Las
propiedades ácidas o básicas que son colaterales permiten su fácil clasificación en
ácido, estos ionizan en soluciones acuosas para producir núcleos colorantes con carga
(-), es decir el grupo iónico que imparte el color de carga negativa o sea el anión.
Estos colorantes tienen material cupro, por ejemplo: eosina, rojo congo, fusina ácida.
Básicos en los que lleva el color la carga (+) estos colorantes tienen la afinidad por el
material y otros componentes. Como son los más usados en microbiología, ya que
debido a la gran ribosomas que contienen ácido ribonucleico en todo el organelo de la
célula bacteriana, estos tiene fácilmente: azul de metileno, fusina y cristal violeta
(Manuel M, 2005).

TINCION DIFERENCIAL GRAM

Es uno de los métodos de tinción más importante en el laboratorio microbiológico para

la visualización de bacterias, sobre todo varias muestras. Se utilizan tanto para poder
referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realzar una primera
aproximación a la diferenciación bacteriana considerándose bacteria Gram positiva las
bacterias de color azul y Gram negativa las cuales se visualizan de color rosa.

Los fundamentos de las bacterias están basadas en las diferencias entre las paredes
celulares de las bacterias Gram + y Gram -, las paredes celulares de las bacterias
Gram + poseen una capa de péptido glúcidos además de 2 clases de ácidos. Anclato
en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática se encuentra
el ácido lipoteicoico, y es más en la superficie el ácido teicoico que está anclado
solamente en el péptido glucano, también conocido como mureina, por el contrario la
capa peptidoglucano de las Gram – es delgada y se encuentra unido a una segunda
membrana plasmática exterior (de composición interna distinta), por medio de
lipoproteínas, tiene una capa delgada peptidoglucano unido a una membrana exterior
por lipoproteínas, la membrana externa por lipopolisacáridos. Por tanto ambas
bacterias se tiñen distintas debido a estas diferencias constitutivas de su pared la
clave es el peptidoglucano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared
celular bacteriana, y las Gram positivas lo posee en mucho mayor proporción que las
Gram negativas, la diferencia se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a
que la membrana externa de las Gram – es soluble en compuesto orgánicos, como por
ejemplo a la mezcla alcohol –acetona de la capa péptidoglucano, que posee es
demasiada delgada para poder retirar el complejo de cristal violeta/yodo que se forma
previamente y por lo tanto este color escapa poniéndose la coloración azul-violáceo,
pero por el contrario la Gram + al poseer una pared celular mas resistente y con mayor
proporción de peptidoglucano no son susceptibles a la adición de solventes orgánicos,
sino que este actúa deshidratando y cerrando los poros, los que impiden que pueda
escaparse el color azul violeta, pero por el contrario en la Gram – no ocurre eso.
(Jay, 2003),

OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

MORFOLOGÍA BACTERIANA
La morfología bacteriana puede ser examinada de dos formas: a)observando al
microorganismo vivo y sin teñir, y b)observando las células muertas fijadas
a un portaobjeto y teñidas con colorantes. Las bacterias vivas son generalmente
incoloras y ofrecen por lo general un contraste insuficiente con el medio acuoso
en el cual están suspendidas, como para ser claramente visibles en el microscopio.
Al realizarse una tinción, este contraste se incrementa notablemente.
La morfología de las bacterias puede considerarse en dos aspectos principales:

1. el de las células aisladas o grupos de células observadas por

medio del microscopio
2. el de las colonias bacterianas desarrolladas sobre medios sólidos
y que resultan visibles a simple vista.

En el primer caso, las diferencias de forma, tamaño, agrupación, así como algunos
detalles estructurales, son características por lo menos de los principales grupos de
bacterias y proporcionan la base fundamental para su estudio sistemático. En el
segundo caso, características de la colonia bacteriana como ser color, forma,
volumen, textura y consistencia, poseen valor diferencial pero no la significación
que aporta la morfología celular.

FORMA
La mayoría de las células bacterianas tienen formas celulares características que
se mantienen más o menos constantes en cultivos jóvenes que crecen activamente
en buenas condiciones. Sin embargo, puede darse que en cultivos viejos, donde la
estructura celular se está desintegrando, aparezcan formas degenerativas o formas
de involución.
Cocos - La forma esférica de una bacteria recibe el nombre de coco o cocci.
Bacilos - Las células con forma cilíndrica o de bastones reciben el nombre de
bacilos.
 Espirilos - El tercer grupo morfológico principal de bacterias está formado
por las formas espirales, que en el caso de espirales largas adquieren forma
de hélice.
Otros - Bacterias cuadradas han sido descubiertas recientemente.
Son microorganismos excepcionales, encontrados en medios
extremadamente salados, con lados y esquinas rectos.

AGRUPACIÓN
Al dividirse una célula, las células hijas pueden o no separarse inmediatamente. La
combinación de los diferentes planos de división y la probabilidad de separación
de la célula hija de la célula madre, conducen a agrupaciones características
de las células bacterianas. El arreglo resultante es taxonómicamente muy útil.
Agrupación de cocos: Los subtipos morfológicos de los cocos se distinguen según la
disposición de las células unas con otras. La división en un plano da lugar a
pares de organismos, diplococos. Cuando la tendencia a quedar unidos es más
intensa, el resultado es una cadena de células, streptococos, consistentes en 4 a 10 o
con más de 20 células (cadenas largas) que muchas veces tienen aspectos de
diplococos unidos en serie.
La división regular en dos planos, uno respecto al otro a 90 º, resulta en tetradas y la
división regular en tres planos da lugar a paquetes cúbicos de ocho células, como los
que se dan en el género Sarcina. La división irregular en dos o tres planos, lleva
a acúmulos irregulares en forma de racimos de uva, característico por ejemplo del
Stafilococcus aureus.
Agrupación de bacilos: Algunas de las formas bacilares adoptan agrupaciones
características, consecuencia de movimientos después de la división celular. En
algunos tipos de bacilos hay tendencia a formar cadenas, el tipo morfológico
denominado estreptobacilo En el caso de las cadenas formadas por bacilos, éstas
pueden ser cortas o largas.

Figura 1- Arreglos en empalizadas, angulares y combinación de ambos, en formas bacilares

Los microorganismos espirilares se dividen únicamente en un plano, pero por lo
general se separan de inmediato y no forman cadenas.
Figura 2- Arreglos de las formas coco, bacilo y espirilares.
MORFOLOGÍA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS
La identificación de diferentes colonias bacterianas aisladas en una placa de Petri
basadas en su apariencia y morfología, permitirá la selección de diferentes especies
de un cultivo mixto. También permitirá la transferencia de una colonia aislada a un
medio estéril para la obtención de un cultivo puro.
Cuando una célula bacteriana es inoculada sobre la superficie de un medio
nutritivo sólido, ésta comienza a reproducirse exponencialmente; después de
formarse algunos miles o millones de células, se hace visible esa masa celular, a la
cual llamamos colonia.
Cada especie bacteriana exhibe colonias con diferentes características. Para
la descripción de las colonias, se considera:

1. Tamaño y forma de la colonia

2. Forma de los bordes de la colonia
3. Elevación de la colonia
4. Color
5. Textura
 Figura 3- Guía de términos empleados en descripción de colonias

FROTIS
El material que se va a observar debe ser “fijado” o pegado sobre el
portaobjeto, de manera que durante la tinción, la solución de colorante no
arrastre o “lave” la capa de células colocada sobre el portaobjeto. La
preparación de la muestra de esta forma, se llama frotis.
La preparación del frotis comprende tres etapas:
a) extensión del material sobre el portaobjeto
b) secado de la preparación
c) fijado o adhesión de las células al portaobjeto

Una vez realizado el frotis, la preparación está lista para su tinción.

TINCIONES
Las ventajas de realizar tinciones son:
1. Al teñir los microorganismos se incrementa el contraste con sus
alrededores y por tanto son mucho más visibles.
2. Ciertas tinciones pueden ayudar a identificar estructuras de las
células que de otra manera no podrían ser vistas (cápsulas, esporas,
etc.). Más aún, el uso de un objetivo de un microscopio con aceite de
inmersión para obtener una magnificación mayor, es mucho más
conveniente para preparaciones teñidas.
3. Pueden ser utilizadas con fines taxonómicos, ya que no todos los
microorganismos presentan la misma afinidad por los distintos
colorantes.
Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con
precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante
forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras
celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales
inducidas por el mismo colorante.
COLORANTES
Los colorantes reaccionan químicamente con la célula bacteriana pero no con
sus alrededores, permitiendo así distinguir las bacterias. Es así, que la mayor
ventaja de la tinción es de proveer de un contraste entre el microorganismo y sus
alrededores, permitiendo de esta forma una diferenciación entre distintos tipos de
morfología, y permitiendo el estudio de estructuras bacterianas tales como ser
pared celular, cápsulas y esporas.

Los colorantes básicos o colorantes catiónicos, cargados positivamente, se

combinanfuertemente con los constituyentes celulares ácidos cargados
negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos. La célula
bacteriana, que en medio de pH cercano a la neutralidad, está cargada
negativamente, se combina con los colorantes básicos, cargados positivamente,
con lo cual queda teñida. Por esto, son excelentes colorantes generales. Como
ejemplo de colorantes básicos tenemos, el violeta de cristal y la safranina. Otro
ejemplo es el azul de metileno.
Los colorantes ácidos o aniónicos, cargados negativamente, son moléculas que se
combinan con constituyentes celulares cargados positivamente, como ser muchas
proteínas. Ejemplos de estos colorantes son la eosina, fucsina ácida, rojo Congo.
Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles, que se combinan con los
lípidos de la célula, revelando la ubicación de los depósitos de grasa en la misma. Un
ejemplo de este grupo es el negro Sudán.
También se utilizan colorantes que no tiñen al microorganismo, sino que colorean
en cambio al medio que los rodea; por lo tanto, lo que se ve es el perfil de las
células. Este tipo de tinción se llama tinción negativa. Las sustancias utilizadas son
materiales opacos que no tienen afinidad por los constituyentes celulares. Un
ejemplo de este tipo de colorante es la tinta china (suspensión de partículas de
carbono coloidal) y la nigrosina.

Figura 4- Tinción de Gram

Las bacterias Gram-negativas contienen solo una capa de peptidoglucano rodeada
por una fina membrana exterior compuesta de lipopolisacáridos (LPS). La
región entre el peptidoglucano y las capas de LPS es llamada espacio
periplasmático, es una región que contiene enzimas y proteínas de transporte. El
complejo violeta-yodo es fácilmente removido de la capa de LPS y de la fina capa de
peptidoglucano cuando es tratado con un solvente, el cual fácilmente penetra al
interior y atraviesa la capa externa.
 a b

Figura 5- Tinción de Gram positiva de Staphylococcus (a); Tinción de Gram negativa de E. coli.

La reacción de Gram no está relacionada directamente con la química de la pared

celular bacteriana sino con la estructura física de la pared, la cual confiere la
característica de Gram positividad. Esto se puede observar en el caso de las
levaduras, que teniendo una gruesa pared celular, de composición química
totalmente diferente a las bacterias, dan una reacción Gram positiva.
El examen de los frotis con la técnica de Gram, revela al mismo tiempo la morfología
y la reacción de Gram de las bacterias.
Debe tenerse en cuenta al clasificar las bacterias, que si bien las Gram
negativas son constantes en su reacción, los organismos Gram positivos pueden
presentar respuestas variables en ciertas condiciones; por ejemplo los cultivos
viejos de algunas bacterias Gram positivas pierden la capacidad de retener el
colorante básico y en consecuencia se tiñen con el colorante de contraste.
Tabla 1- Comportamiento de distintos géneros a la tinción de Gram
Género Reacción de Gram
Bacillus Positivo
Clostridium Positivo
Lactobacillus Positivo
Streptococcus
Pseudomona
Acetobacter Negativo
Escherichia Negativo
Salmonella Negativo
Bacillus Positivo
Clostridium Positivo

MICROORGANISMOS EN CARNES

El tejido muscular está recubierto por sus fascias protectoras y las miofibrillas
contenidas dentro del sarcolema. Una vez que han sido descuartizadas las reses, gran
parte de su protección inicial se destruye y durante el picado desaparece por
completo. Los alimentos de origen animal poseen sustancias inhibidoras como las
inmunoproteínas, muy específicas en su acción pero con un reducido espectro de
actividad antimicrobiana, que no proveen protección práctica alguna (Mossel, 2003).
Todos los animales transportan grandes cantidades de microorganismos. Numerosas
bacterias, además de mohos y levaduras, están presentes en el cuero, los pelos y las
pezuñas de los vacunos, y son transmitidos a la carcasa luego del sacrificio. Los
restos de estiércol en la pelambre suelen acceder al músculo, así como el contenido
intestinal si la evisceración no se hace cuidadosamente. Por otra parte, las bacterias
también pueden proceder de los pisos, paredes, mesadas, cuchillos y manos de los
operadores en la planta de faena (ICMS, 1998).
Los bacterias psicrotróficas de la superficie de las carnes no provienen del intestino e
incluyen especies de Pseudomonas, Moraxella, Flavobacterium, Acinetobacter,
Brochothrix thermosphacta, y algunas Enterobacteriaceae y Lactobacillaceae
(Mossel, 2003).
En la superficie de la carne bovina suelen encontrarse varios tipos de Escherichia coli,
algunas especies de freundii, Klebsiella pneumoniae, Yersinia enterocolitica ,
Enterococcus, Listeria, Salmonella, Campylobacter , Clostridium, Streptococcus,
Corynebacterium, Staphylococcus, Bacillus, bacterias lácticas, mohos y levaduras
(Mossel, 2003).

MICROORGANISMOS PATÓGENOS
La carne vacuna está considerada como el origen de la diseminación de ciertos tipos
virulentos de E. coli. Las bacterias Staphylococcus aureus, C. perfringens,
Campylobacter spp., Listeria monocytogenes y Salmonella spp., se encuentran en un
bajo número sobre las superficies de las carnes crudas sin embargo pero puede
aumentar por una manipulación inadecuada (Doyle, 1987). Los patógenos más
comunes transmitidos por la carne vacuna son Salmonella spp., Staphylococcus
aureus y C.perfringens. La carne de cerdo es un vector importante en la transmisión
de Campylobacter jejuni y Y. enterocolitica. Por otra parte Listeria puede sobrevivir, a
temperatura reducida, en la carne procesada porque es osmóticamente tolerante y
acumula solutos compatibles en el citosol (Smith, 1996).La presencia de patógenos en
la carne cruda es un problema imposible de solucionar. Ninguno de los procedimientos
disponibles actualmente puede proporcionar una carne roja, cruda, libre de patógenos.
A pesar de este riesgo, la carne y las hamburguesas se suelen consumir crudas o mal
cocidas. Esto ha producido en los últimos años brotes de infección humana por E. coli
O157:H7, que podrían haberse evitado si la temperatura interna de cocción hubiera
alcanzado los 65ºC (Jay, 2005).

EL GENERO MORAXELLA
Es un género de bacterias Gram negativas con forma de bacilo corto, cocobacilo o,
como en el caso de Moraxella catarrhalis, cocos asociados en parejas (diplococos), o
incluso en pequeñas cadenas. La mayoría de estos microorganismos son inmóviles,
no esporulados, con características oxidasa-positiva y catalasa-positiva. Unos son
hemolíticos y algunas especies son capsuladas, aerobios aunque algunos puede ser
anaerobios facultativos y no son muy hábiles para fermentar los carbohidratos.
Su hábitat es el ambiente en general, pero son más abundantes en la región
nasofaríngea de algunos animales, como los bovinos (vacunos).
Estos microorganismos no son muy exigentes, pero muestran una mejoría en su
crecimiento en agar sangre y más si les agregamos suero, además, vemos una
hemólisis en el agar.
 Moraxella bovis es la causa de una enfermedad característica en la conjuntiva
de los bovinos, provocando queratoconjuntivitis, llamada comúnmente la
enfermedad del "pink eye", en otras partes del cuerpo, este microorganismo es
saprófito. (Wikipedia, 2008).
Figura 6- Tinción de Moraxella (forma de cocos).

MICROORGANISMOS EN EL PLATANO
Por generalidad el pH de las frutas no permite el crecimiento de bacterias, por esto el
más amplio intervalo de crecimiento del pH es para los mohos y levaduras para que
estos puedan actuar como agentes de alteración en las frutas, sin embargo el plátano
representa una excepción por el desarrollo de enfermedades como el Moko (marchitéz
bacteriana) ocasionado por la bacteria Pseudomonas solanacearum que causa
pudriciones que provocan el rechazo de la fruta. Cuando el fruto es atacado por el
Moko, externamente parece normal, pero la pulpa se torna seca, de un color negro,
completamente inapropiada para el consumo. Otros daños comunes son el picado del
fruto y la pudrición punta de puro. En mayoría se encuentran levaduras que utilizan
algunos azúcares del plátano, sin embargo en el plátano la utilización o destrucción de
los componentes de elevado peso molecular de las frutas es llevada a cabo por
mohos. (Jay, 2003).

Figura 7. Pseudomonas solacacearum.

MICRORGANISMOS EN LA LECHE

Dentro del llamado "grupo coliforme" se incluyen todos los bacilos Gram negativo,
aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, capaces de fermentar la lactosa
con producción de gas y ácido en 48 horas, en medios de cultivo sólidos o líquidos.
Los géneros que integran este grupo son el Escherichia, Enterobacter, Citrobacter y
Klebsiella (Flia. Enterobacteriaceae). Siendo las especies más importantes la
Escherichia coli y el Enterobacter aerogenes El primero en particular es huésped
normal del trato intestinal del hombre y los animales de sangre caliente, por lo cual se
encuentra en grandes cantidades en las heces y el estiércol. El segundo (E.
aerogenes) también se presenta en las heces, pero mas frecuentemente se origina del
suelo y materia vegetal en descomposición (Jay, 2003). La presencia en el agua de
estos microorganismos se considera inaceptable, asociándose con contaminación
fecal y por ende con la posible presencia de otros microorganismos patógenos de
origen intestinal, como por ejemplo las especies del género Salmonella productoras de
la fiebre tifoidea y disenterías bacilares, también se consideran en un número
importante a las bacterias fermentativas presentes en medios contaminados como los
de la especie Leuconostoc ssp, caracterizado por una fermentación de azúcares
lácteos (Jay, 2003).
La leche cruda se contamina corrientemente con bacterias coliformes, derivadas
directa o indirectamente del tracto intestinal de las vacas, animales que
afortunadamente no sufren las infecciones entéricas propias del hombre. Por estas
razones, es sumamente difícil producir leche cruda libre de coliformes, dándole a su
presencia una significación diferente que en el agua, y aunque es indeseable, se
tolera. (Jay, 2003).
Bacterias termodúricas: mesófilas que resisten pasteurización. Esporas de Bacillus y
Clostridium
Termófilas: L. bulgáricus, L. Lacti, L. Helveticus, acidophilus, St. termophilus
Psicrófilas: Pseudomonas, Bacillus

PRINCIPALES ESPECIES PATÓGENAS EN PRODUCTOS LÁCTEOS

- Bacilo tuberculoso: Virulento para el hombre, principalmente en niños
- Brucela: Síntomas parecidos a la gripe
- Estafilococos hemolíticos: contaminación por animal y fabrica toxinas

Productos concentrados
- Estreptococos:
- Enterobacterias: salmonela
(Jay, 2003).

Figura 8. Cultivos aislados de Streptoccus en Agar Mc Conkey.

IV. MATERIALES Y METODOS

Materiales:

- Placas petri
- Probeta
- Pipetas
- Matraces
- Laminas portaobjetos
- Asas de kholle
- Hisopos
- Torundas de algodón
- Retazos de papel kraft
- Pabilo
- Tijeras
- Plumón marcador

Equipos

- Autoclave
- Incubadora acondicionada
- Balanza de precisión
- Mechero Bunsen
 - Microscopio electrónico
- Refrigerador

Muestras, Medios y Reactivos

- Muestra de carne en descomposición

- Muestra de leche de tarro en descomposición
- Muestra de plátano en descomposición
- Agar Plate Count
- Agar Perfringens
- Agar Bacillus Cereus
- Cristal violeta
- Lugol
- Alcohol-acetona
- Safranina
- Agua destilada
METODOS

Las pruebas para esterilizar los materiales y los medios de cultivo se realizaron por
esterilización convencional con vapor húmedo a 15 lbs/plg2 durante 10 minutos,
mientras que el reconocimiento y diferenciación de microorganismos se realizó por
medio de una tinción diferencial de Gram; así mismo los métodos de siembra se
realizaron por estría múltiple con hisopo.

V. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

DE LA PREPARACIÓN DE MATERIALES:

 En primer lugar se reconocieron los materiales, estos se lavaron con un

detergente, así mismo se secaron, luego se procedió a colocar las torundas de
algodón en los materiales de vidrio que contenían orificios (pipetas, matraces);
mientras que las placas se fueron envolviendo en forma de paquetes con papel
kraft, así como la espátula de Drigalsky y pipetas; finalmente los materiales con
torunda también se les envolvió el pico con un retazo de papel kraft, sostenidos
para todos los casos con pabilo.
 Previamente se fue calentando la autoclave con agua destilada, y luego de
terminar el proceso de acondicionamiento de los materiales de vidrio se
procedió a colocar los materiales en forma ordenada; luego se selló la tapa de
la autoclave ajustando por sus perillas.
 Luego de haber transcurrido 10 minutos de haber alcanzado la presión de 15
lbs/plg2 se procedió a liberar el gas interno por medio de una abertura de fuga.
 Finalmente se dejó enfriar la autoclave, y luego se retiraron los materiales para
guardarlos en un lugar seguro y aséptico hasta su posterior uso.

DE LA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO:

 Primeramente se reconocieron los medios de cultivo ha utilizarse que se

describen en la revisión bibliográfica, luego se procedió a realizar los cálculos
para la preparación de los medios de cultivo de la siguiente manera:

BACILLUS CEREUS AGAR BASE

20.5 gr. 475 ml X = 1.94 gr. de medio de cultivo

X 45 ml
PERFRINGENS AGAR BASE (TSC/S.F.P Agar Base)

23.5 gr. 475 ml X = 2.23 gr. de medio de cultivo

X 45 ml

PLATE COUNT AGAR

23.5 gr. 1000 ml X = 1.06 gr. de medio de cultivo

X 45 ml

 Luego se pesaron los medios un una balanza de precisión en función a lo

calculado, luego se midió un volumen de 45ml de agua destilada en una
probeta, para cada medio de cultivo.

 Seguidamente se diluyeron las muestras con agua destilada en matraces,

luego se homogenizaron cuidando de no revasar por los bordes del matráz, los
medios que necesitaban calentar se llevaron a homogenizar directamente en
un mechero bunsen.

 A continuación se llevaron los preparados a la autoclave para esterilizar, luego

de este proceso se dejaron enfriar los preparados hasta 45 ºC
aproximadamente, momento en el cual se procedió a plaquear en las placas
petri previamente rotuladas, las cuales se dejaron enfriar para luego llevarlas a
refrigerar hasta su posterior uso.

DE LA SIEMBRA POR ESTRIAS EN LOS MEDIOS DE CULTIVO:

 En primer lugar se obtuvieron los medios contaminados: leche de tarro

malograda, carne en descomposición y plátano podrido.
 Seguidamente se sacaron los medios conservados, y se procedió a sembrar
directamente, de la muestra por estrías con un hisopo (3 agares por cada
muestra).
  Finalmente las placas sembradas se llevaron a incubar durante 24 horas para
luego observar el crecimiento bacteriano.

DE LA TINCION DE GRAM POR MEDIO DE FROTISS:

 Primeramente se cogió una porta objetos y se desengrasó con un detergente,

posteriormente se dejó secar e imaginariamente se dejó caer una gota de
agua destilada sobre el cual se extendió con un asa de kholle, una colonia de
un cultivo de carne en descomposición.

 Luego se extendió completamente alrededor de 1 cm2 hasta dejarlo secar al

ambiente
 De ahí se tomo una gota de cristal violeta y se agregó 3 gotas de cristal violeta
sobre la superficie extendida y seca, y se dejó colorear por 20 segundos, y se
procedió a enjuagar.

 Luego se agregaron 2 gotas de solución de lugol que fue mantenida por 20

segundos y se enjuago con agua destilada.
  Seguidamente se dejaron caer unas gotas de alcohol acetona sobre la
superficie trabajada, el cual no se enjuagó.

 Para finalizar el proceso de tinción se procedió a agregar una gota de safranina

que fue mantenida por 1 minuto, luego del cual se enjuagó con agua destilada
y se procedió a secar al ambiente hasta su observación.

 Finalmente sobre la muestra secada se coloco 1 gota de aceite de inmersión y

se llevó a observación en un microscopio electrónico a una resolución de 100X.

VII. DISCUSIONES

DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

 Según (M, Mendo 2002), para trabajar con medios de cultivo es necesario un
conocimiento de las necesidades fisiológicas y nutritivas del los
microorganismos que se quieren cultivar, pues si no se cumplen con estas
consideraciones, es posible que los cultivos obtenidos no sean los deseados,
debido a que cada microorganismo es único, y por ende tiene necesidades que
solo le son atribuibles; así este autor menciona que si se quiere trabajar por
ejemplo con agar gelatina, este presenta inconvenientes ya que se funde a 25
ºC lo que no permitiría esterilizar, además de que muchas bacterias presentan
la enzima gelatinasa que hidroliza esta sustancia.

 Los medios de cultivo son compuestos que proporcionan sustancias nutritivas

que permiten el desarrollo y reproducción de los microorganismos (Curran,
1999), pero estos medios deben de poseer las condiciones ambientales
adecuadas como: temperatura, pH, actividad de agua, para lo cual primero se
realiza un estudio del microorganismo, de manera que los medios le confieran
realizar el salto de escala. En gran medida el estudio se deberá enfocar en el
carácter de los microorganismos (autótrofos y heterótrofos).
  Según (M, Mendo 2002), para la preparación de medios de cultivo resulta
importante prepararlos con agua destilada, que esta exenta de sales minerales,
de contaminantes microbiológicos ya que son obtenidos por procesos de
purificación y poseen un pH neutro; respecto a la práctica se utilizó el agua
destilada tanto en la preparación de los medios como en la utilización en el
autoclave para generar el vapor, de manera que este liquido no deja sarro en
las paredes del equipo.

 Así también la importancia de dejar enfriar los medios a 45 ºC, facilita el

manipuleo, además de que el medio presenta un estado de gelatinidad que es
necesario para su posterior inoculado (M, Mendo 2002), ya que de lo contrario
a una temperatura mayor ocurre el fenómeno físico de condensación que se
manifiesta en forma de gotas.

DE LA TINCION GRAM

 Según (M, Mendo 2002), “frotis se denomina a la extensión que se realiza

sobre un porta objeto de una muestra o cultivo con el objeto de separar lo mas
posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación
es muy difícil de obtener una imagen clara y nítida”, y haciendo referencia a la
práctica se pudo observar que algunas preparaciones realizadas no mostraron
correctamente la morfología de las bacterias Gram, ello infiere que no se
realizaron las adecuadas extensiones durante el proceso.
Así mimo Manuel Mendo, hace referencia que la fijación de la extensión de
una bacteria hace que estas queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando
lo menos posible su morfología y las posibles agrupaciones de células
existentes, la práctica realizada pudo tuvo dichas consideraciones por lo que en
su gran mayoría se pudieron observar formas de: cocos, diplococos y bacilos.

 Según (Jay, 2003), la diferencia que se observa en la resistencia a la

decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram – es soluble en
compuesto orgánicos, como por ejemplo a la mezcla alcohol –acetona de la
capa péptidoglucano, que posee es demasiada delgada para poder retirar el
complejo de cristal violeta/yodo que se forma previamente y por lo tanto este
color escapa poniéndose la coloración azul-violáceo, pero por el contrario la
Gram + al poseer una pared celular mas resistente y con mayor proporción de
peptidoglucano no es susceptible a la adición de solventes orgánicos, sino que
este actúa deshidratando y cerrando los poros, los que impiden que pueda
escaparse el color azul violeta, pero por el contrario en la Gram – no ocurre
esto, esta aseveración demuestra lo observado en el resultado, pues se
observan cocos muy unidos de color rojo que demuestran ser Gram -, según lo
inferido por Jay respecto a la coloración, al parecer el origen de la muestra
(cultivo de carne en descomposición), contenía gran cantidad de Gram -.

 Según (Stern, 1993), refieren que la explicación del fenómeno de coloración,

que permite su observación se debe a una “combinación química entre el
colorante y las proteínas de las bacterias, la reacción de tinción de las
bacterias obedece en gran parte a su contenido proteínico”. Podemos decir que
la tinción de las bacterias analizadas de la muestra dependerá completamente
de su composición proteica en su pared celular.

 Respecto a la forma de cocos la carne contiene bacterias psicrotróficas en su

superficie que no provienen del intestino e incluyen especies de Pseudomonas,
Moraxella, Flavobacterium, Acinetobacter, Brochothrix thermosphacta, y
 algunas Enterobacteriaceae y Lactobacillaceae (Mossel, 2003). Así mismo
una primera aseveración sería identificar a la bacteria observada como la
perteneciente al género Moraxella, por sus similitudes morfológicas con nuestro
resultados (ver fig 6), estas son bacterias Gram - con forma de bacilo corto,
cocobacilo o, como en el caso de Moraxella catarrhalis, cocos asociados en
parejas (diplococos), o incluso en pequeñas cadenas. La mayoría de estos
microorganismos son inmóviles, no esporulados, con características oxidasa-
positiva y catalasa-positiva (Wikipedia, 2008).

DE LA SIEMBRA DE MUESTRAS EN TRES AGARES

 DE LA MUESTRA DE LECHE MALOGRADA

 Respecto al agar de Bacillus cereus, según (Mossel,

2003), este agar es diferencial debido a la presencia de manitol. Bacterias
fermentadoras de manitol, acidifican el medio produciendo el viraje del
indicador de pH rojo de fenol del rojo al amarillo, tal como es observado en los
resultados donde se ve la presencia de 1 colonia de color amarillo, mientras las
bacterias que no fermentan el manitol, producen colonias del color del medio,
así se pudo expresar en el dibujo de los resultados donde se puede observar
una buena cantidad de bacterias de color verde (color inicial del medio de
cultivo). Así mismo (Jay, 2003). Hace referencia que los microorganismos
atribuibles a la leche por lo general son del género Enterobactericiae, del cual
uno de las más representativos es la E. coli, que es una bacteria fermentadora
y manifiesta un cambio de color debido al consumo de azúcares del medio
(posiblemente el manitol), pero también pudo estar Staphylococcus aureus y
Leuconostoc ssp como lo muestra el autor.
 Respecto al agar Plate Count se utiliza para la
determinación de microorganismo de la leche y otros productos lácteos y
puede ser usado para determinar la calidad sanitaria de productos de
alimentación, agua y otros materiales (Mossel, 2003), para este agar se pudo
observar un crecimiento de microorganismos de color crema-amarillo que
identifica la presencia posible de la bacteria Leuconostoc ssp,, debido a que
este medio esta enriquecido con azúcares como la dextrosa (componente del
medio de cultivo) que es exclusivamente consumido por este microorganismo
(Jay, 2003).
 Respecto al agar Perfringens las tensiones ocasionales
de Enterococcus, crecerán sobre Perfringens Agar, como colonias blancas,
fácilmente distinguidas de las colonias grandes negras de Clostridium
perfringens. Clostridium perfringens, a menudo cultiva las colonias de
extensión en forma de grandes que completamente ennegrecen el medio
(ICMSF, 1998), este fenómeno que describe el autor fue observado en la
muestra de leche como se registra en el dibujo de los resultados, colonias con
rasgos jaspeados de color negro lo cual confirmaría la presencia de
Clostridium perfringens.

 DE LA MUESTRA DE CARNE EN DESCOMPOSICION

 Respecto al agar Plate Count que generalmente se

utiliza para la determinación de microorganismo de la leche y otros productos
lácteos y también puede ser usado determinar la calidad sanitaria de productos
de alimentación, agua y otros materiales (Mossel, 2003), se pudo observar un
crecimiento de microorganismos de color crema-amarillo que identifica la
presencia posible de la bacteria Leuconostoc ssp,, que es muy común en las
 superficies de los alimentos y por encontrarse casi siempre en el medio, y
debido a que su principal sustrato es la dextrosa (componente del medio de
cultivo), es posible atribuirle los resultados de la observación.(Jay, 2003).

 Respecto al agar de Bacillus cereus, según (Mossel,

2003), Bacterias fermentadoras de manitol que contiene el medio, acidifican el
medio produciendo el viraje al color amarillo, mientras las bacterias que no
fermentan el manitol, producen colonias del color del medio, así se pudo
expresar en el dibujo de los resultados bacterias de color verde, que no
fermentaron el medio (color inicial del medio de cultivo). Así mismo (Jay,
2003). Hace referencia que los microorganismos atribuibles a la leche por lo
general son del género Enterobactericiae, Sallmonelacea, Clostridium,
Staphylococcus del cuales unos son más representativos que otros,
manifestando cambios de color debido al consumo de azúcares del medio.

 Respecto al agar Perfringens, son fácilmente distinguidas las colonias grandes

negras de Clostridium perfringens. Clostridium perfringens, a menudo se cultiva
en las colonias de extensión de formas considerables que completamente
ennegrecen el medio (ICMSF, 1998), este fenómeno que describe el autor fue
observado en la muestra de carne malograda como se registra en el dibujo de
los resultados, se muestran colonias predominantes a diferencia de las demás
muestras, las colonias son muy negruscas que revelan su presencia.

 DE LA MUESTRA DE PLATANO

 Al respecto de esta muestra diremos que no se pudo

identificar ningún microorganismo, debido a que el producto utilizado parecía
que estuviese en descomposición, pero mas no fue así debido a que esta
muestra se obtuvo de un examen de congelación, y por ende los únicos daños
que pudo sufrir son los daños de quemadura por congelación, proceso en el
que es muy poco probable la presencia de microorganismos, excepto los
psicrótrofos.

VIII. CONCLUSIONES

 La correcta adecuación de los materiales para la esterilización, así como el

mismo proceso, hará posible el desarrollo óptimo y la obtención de buenos
resultados de operaciones con microorganismos en biotecnología, gracias la
importancia de la esterilidad.

 El conocimiento de los requerimientos nutricionales de los microorganismos,

permitirá seleccionar el medio correcto para el crecimiento de los estos, así
mismo será importante las formas de preparación, los estados de esterilidad y
el correcto manipuleo de los materiales (plaqueo, homogenizado, pipeteado,
flameado), para su posterior conservación en refrigeración.

 la preparación de un frotis, se debe realizar sobre un portaobjetos limpio seco y

desengrasado, ya que las bacterias que se han de analizar quedaran fijadas
adheridas al vidrio alterando lo menos posible su morfología bacteriana.
  Las técnicas de tinción de la bacteria, se fundamento, en la diferenciación de la
composición debido a la combinación química entre el colorante y las proteínas
de las bacterias, la reacción de tinción de las bacterias obedecerá en gran
parte a su contenido proteínico; dependiendo completamente de la
composición proteica en la pared celular del microorganismo.

 El microorganismo observado al microorganismo representado respondió a la

forma de cocos asociados en parejas (diplococos), o incluso en pequeñas
cadenas, que se le pueden atribuir al género Moraxella ssp.

 Los microorganismos encontrados en las muestras, lograron ser vistos luego

de un cultivo bacteriano, respondiendo en mayor parte al género
Enterobactericiae, Sallmonellaceae, Leuconstoc, etc; que en primera instancia
fueron comparados y resultaron presentar las mismas características a las
encontradas en las placas.

 Los estudiantes del curso de microbiología pudieran familiarizarse y a su vez

reconocieron los métodos de preparación de materiales, preparación de
medios de cultivo, observación de microorganismos y siembra de
microorganismos.

IX. CUESTIONARIO

1. ¿Qué tipos de preparados microscópicos podría citar usted? Descríbalos.

Las preparaciones microscópicas son aquellas en las que nos permiten observar mejor
al microscopio los elementos de los microorganismos. Pueden ser 3:

- Las preparaciones en fresco son aquellas en las que no se utiliza ningún tipo
de colorante ni tinción.
- Las semipermanentes son aquellas en las que se utiliza un colorante vital, que
sirve para no "matar" a las células, y en ciertos casos es necesaria su
utilización.
- Las fijas, son las que se utiliza fijadores químicos. En la que produce un
endurecimiento que facilita la manipulación, preserva su morfología y mata las
células.

2. ¿Existe alguna relación entre el carácter de crecimiento en medio líquido y

sólido?
El carácter de creamiento dependerá de las suspensiones, pues en los medios
líquidos hay mejor homogeneidad de nutrientes que en los sólidos, por ende el
crecimiento de los microorganismos será el más conveniente si los nutrientes se
encuentran en forma dispersa y disponible para su utilización, mientras que los
microorganismo que crecen en medios de agar, la difusión o transferencia de materia
(nutrientes), demorará mas que el de un medio líquido.

3. ¿Qué tipo de microorganismo ha podido visualizar? Podría usted

identificarlos e indicar el género o especie a la cual pertenecen.
Los microorganismos que posiblemente pudieron estar presentes fueron:
Moraxella, Flavobacterium, Acinetobacter, Brochothrix thermosphacta, y algunas del
género Enterobacteriaceae y Lactobacillaceae.
Por el momento no se podría identificar la especie debido a que se tendría que hacer
un aislamiento de los medios sin embargo el que si esta presente es Clostridium
perfringens.

4. ¿Cuál es el principio básico de la coloración Gram?

Los fundamentos de las bacterias están basadas en las diferencias entre las paredes
celulares de las bacterias Gram + y Gram -, las paredes celulares de las bacterias
Gram + poseen una capa de péptido glúcidos además de 2 clases de ácidos. Anclato
en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática se encuentra
el ácido lipoteicoico, y es más en la superficie el ácido teicoico que está anclado
solamente en el péptido glucano, también conocido como mureina, por el contrario la
capa peptidoglucano de las Gram – es delgada y se encuentra unido a una segunda
membrana plasmática exterior (de composición interna distinta), por medio de
lipoproteínas, tiene una capa delgada peptidoglucano unido a una membrana exterior
por lipoproteínas, la membrana externa por lipopolisacáridos. Por tanto ambas
bacterias se tiñen distintas debido a estas diferencias constitutivas de su pared la
clave es el peptidoglucano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared
celular bacteriana, y las Gram positivas lo posee en mucho mayor proporción que las
Gram negativas, la diferencia se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a
que la membrana externa de las Gram – es soluble en compuesto orgánicos.

X. BIBLIOGRAFIA

 Alcazar J (20002) “Diccionario Técnico de Industrias Alimentarias”

2da Edición, Lima-Perú.
 Campos Y (2005) “Guía de Prácticas de Microbiología General”
C.P. Ing Agroindustrial-Sub Sede Andahuaylas-UNAMBA.
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1ra Edición, Lima-Perú.
 Harwey D (2002) “Química Analítica”
Volumen I Editorial Mc Graw Hill, México.
 ICMSF (2000) “Microorganismos de los Alimentos”
2da Edición, Editorial ACRIBIA S.A, Zaragoza-España.
 Jay J (2002) “Microbiología Moderna de los Alimentos”
4ta Edición, Editorial ACRIBIA S.A, Zaragoza-España.
 Mendo M (2000) “Medios de Cultivo en Microbiología”
5ta Edición, Editorial San Marcos, Lima – Perú.

 Mossel D.A (2003) “Microbiología de los Alimentos”

2da Edición, Editorial ACRIBIA S.A, Zaragoza-España.
 Http: //www.auxilab.es/espanol/catalog/porce.htm
 Http: //www.wikipedia.org