CICLO CELULAR

Burke & Ellenberger, Nature Rev. MCB 2002

 El ciclo celular consiste en la repetición de una secuencia de eventos
o fases: G1, S, G2 y M
El período comprendido por las fases G1, S y G2 se conoce como interfase y es en el cual la célula
adquiere el estado para distribuir el material genético y citoplasmático, que ocurre durante la mitosis.

G1 G2

Las células pueden detener el ciclo

celular temporalmente (quiescencia),
o permanentemente (p. ej. neuronas y M
células del cristalino) en un estado
dentro de la fase G1 denominado G0.

Existe un límite en la capacidad proliferativa de las células (“Hayflick limit”). El arresto permanente
del ciclo celular inducido por el acortamiento telomérico se denomina senecencia replicativa.
 En levaduras se demostró que el ciclo celular es regulado por
factores externos que promueven el crecimiento

Si el ciclo celular ocurriera en tiempos prefijados e invariables, y no estuviera coordinado con el crecimiento de la célula (panel
A), se esperaría que en ausencia o restricción de nutrientes el tamaño de las células disminuyera en cada división. Sin
embargo, esto no se observa, las células mantienen su tamaño a lo largo de las generaciones (panel B) debido a su capacidad
de modular la duración del ciclo celular. Esto revela que los procesos de crecimiento y división celular están acoplados.

La restricción de nutrientes o factores de crecimiento inducen el arresto del ciclo celular en G1.

Alberts et al., BMC 2002

 En los organismos pluricelulares la proliferación celular
es un proceso estrictamente regulado
En epitelios, las células madre (stem cells) permanecen en un estado de quiescencia en G0 (a, en rojo). La ruptura del epitelio
estimula la proliferación de las células madre (b, en verde). Las células nuevas se diferencian en diversos tipos celulares y
reparan el daño (c), restaurando un nuevo estado estacionario del epitelio (a). Los daños permanentes o crónicos de los
epitelios promueven la activación persistente de las células madre y aumentan la probabilidad de aparicióon de mutaciones
oncogénicas que auto-perpetuen la proliferación y la formación de tumores (d y e).

b d,e

Beachy et al., Nature 2004

 Diversas señales extracelulares regulan la proliferación y apoptosis
en los tejidos.
Secciones de glándula mamaria de ratones
Hormonas (ej. prolactina), factores paracrinos (ej. HGF, Wnt, TGFβ, etc) y en el período de lactancia. En marrón se
la matriz extracelular controlan la proliferación y diferenciación en la visualiza la expresión de TGFb. A: normal;
glándula mamaria durante la pubertad, embarazo y la lactancia. Cuando la B y C: animal donde se previene la succión.
lactancia finaliza, el epitelio alveolar involuciona por apoptosis de las células Las flechas en C indican células apoptóticas.
secretoras. El TGFb, p.ej, inhibe tubulogénesis y promueve la apoptosis.
A
La prolactina es una hormona que activa la vía de JAKSTATs. Las STATs inducen
la transcripción del gen de b-caseína, una de las principales proteínas de la leche.

B
prolactina,
Wnts, EGF,
HGF, etc

oxitocina
 Las células madre poseen un potencial replicativo ilimitado y
son una fuente de renovación celular en los tejidos adultos

Skin epithelium

stem cells

Paneth cells

transit
amplyfing cells

Goblet cells

enteroendocrine
cells

enterocyte

Las células madre (stem cells) localizadas en el epitelio se dividen y originan células de tránsito que mientras se desplazan
lateralmente se dividen activamente y amplifican la población. En la epidermis, cuando llegan a la base de las papilas, estas
células se disocian del estrato basal, y migran hacia estratos superficiales a la vez que se diferencian en diferentes células.
En el epitelio intestinal, las células de tránsito se diferencian durante su desplazamiento hacia el ápice de las vellosidades.
 El nivel de proliferación celular de un tejido puede estudiarse
determinando la incorporación de BrdU

La capacidad replicativa de las células epiteliales epidérmicas

correlaciona directamente con la expresión de b1 integrinas.
control knock out del gen de β1

La bromodeoxiuridina (BrdU) es un análogo de timina que se incorpora en el DNA cuando las células entran en fase S.
En la figura se muestran secciones de folículos pilosos de ratones control (A) y knock out (B) para b1-integrinas teñidos con
anti-BrdU. Note que los folículos normales presentan mayor cantidad de núcleos marcados (puntos en marrón) que los
del ratón deficiente en beta 1 integrinas (asteriscos y flechas en B).
 La incorporación de 3H-timidina y la citometría de flujo son otras
técnicas experimentales para evaluar la proliferación celular

La citometría de flujo revela el

La incorporación de 3H-timidina ocurre en las células que están en
contenido de DNA de una población
fase S (flecha). (A) Autoradiografía. La determinación de la radioactividad
celular y permite calcular el porcentaje
incorporada permite cuantificar las células en estado proliferativo (B).
de células en fase G1, S y G2/M.

A Microscopía de una sección de epitelio B

control

concentración
(B).Células estimuladas a dividirse con
insulina fueron incubadas en presencia de
un péptido inhibidor de la MAPK Erk o un
péptido control. Observe que la
incorporación de 3H-timidina disminuye
con la ccion del péptido inhibidor.

insulin  IR  Grb10  Erk  Ciclinas D

péptido inhibidor
 PRINCIPIOS GENERALES
DEL CICLO CELULAR
 unidireccionalidad (secuencia temporal unívoca de eventos encadenados)
 adaptabilidad (ajustable a las condiciones ambientales)
robustez (mantiene la fidelidad del proceso aun en condiciones variables)
Mecanismos de control o “checkpoints” monitorean las condiciones
requeridas para la transición de una fase a la siguiente

Mecanismos irreversibles, de “switch”,

o de “todo o nada” controlan 3
transiciones críticas del ciclo:

1- G1/S ( duplicación del ADN)

2- G2/M (formación del huso mitótico)
3- Metafase-Anafase (distribución de
los cromosomas)
Complejos heterodiméricos formados por quinasas y ciclinas
controlan los principales eventos moleculares de cada fase

Whi5

Lodish et al., MBC 2004

Los niveles de expresión de las diferentes ciclinas
varían de manera periódica durante el ciclo celular
 Experimentos pioneros con embriones de erizos de mar y almejas
permitieron identificar las ciclinas mitóticas

Durante el desarrollo embrionario temprano de estos organismos las células se dividen sincrónica y
rápidamente alternando fases de S y M. El análisis en geles de poliacrilamida de extractos proteicos de
embriones, preparados a distintos tiempos, revela variaciones cíclicas en los niveles de ciclinas mitóticas
(ciclinas B), con un pico máximo al comenzar cada mitosis que correlaciona con la máxima actividad de MPF.

ciclina B

ribonucleótido
reductasa

La desaparición de las ciclinas al finalizar la mitosis ocurre por su degradación en proteosomas.

Adaptado de Hunt et al, JCB 1992

Los complejos de ubiquitinación SCF y APC regulan transiciones
entre fases del ciclo

activating subunit
El complejo APC se activa por fosforilación y por la unión
de los cofactores Cdc20 y Cdh1 durante la mitosis.
Ubi Cdc20 y Cdh1 además determinan la especificidad de los
ligase substratos. APC reconoce motivos específicos (degrones)
en las ciclinas de las fases S y M.
degrón

En contraste, el complejo SCF esta siempre activo y la

Ubi ligase
regulación ocurre a nivel de los substratos. SCF
reconoce a los substratos solo cuando son fosforilados
en secuencias específicas (fosfodegrones).

APC: Anaphase Promoting Complex

Alberts et al., BMC 2008
SCF: Skp1/Cullin/F-box protein)
 SCF y APC, promueven la degradación de ciclinas e
inhibidores del ciclo celular

inhibidores de G1  S (ej. p21, p27, Sic1 y ciclinas de G1 y G1/S son degradadas por SCF)
inhibidores de metafase  anafase (ej. Wee es degradada via SCF; securina es degrada por APC-Cdc20)
inhibidores de anafase  telofase/citokinesis (ej. ciclinas mitóticas (B) son degradadas por APC-Cdh1)

ciclinas
de G1/S

APC: Anaphase Promoting Complex

SCF: Skp1/Cullin/F-box protein) Reed, NRMCB 2003
 Las Cdks se activan transitoriamente y promueven
transiciones y el desarrollo de fases del ciclo.
Mientras que los niveles de expresion de las ciclinas oscilan durante el ciclo celular, los niveles de Cdk
son relativamente constantes. La expresión de ciclinas es regulada a nivel transcripcional y post-
traducción. Al final de la mitosis las ciclinas son degradadas en proteosomas.

SCF
Activity of CDKs

activity

La actividad de CDK-ciclinas y APC/C se regulan mutuamente

 Cdk es una Ser/Thr quinasa que depende de
la unión a una ciclina para activarse
(a) La Cdk no unida a ciclina está autoinhibida por un bucle flexible (T-loop=activation loop) y una hélice
alfa que bloquean el acceso del substrato al sitio activo unido al ATP. (b) La unión de la ciclina a la Cdk
induce cambios conformacionales que exponen el sitio activo al solvente y permite la unión del substrato.

Las ciclinas cumplen dos funciones básicas:

1) activan las Cdks
2) determinan la especificidad por los substratos

Lodish et al., MBC 2004

 La fosforilación de Cdk constituye otro nivel de regulación
de su actividad

La kinasa CAK fosforila la treonina 160 en el bucle flexible (T-loop) del dominio catalítico de
Cdk1 y Cdk2 lo cual incrementa su afinidad por el substrato y potencia ~ 150 veces su actividad.

(CAK)
Cdk-Activating Kinasa

Lodish et al., MBC 2016

 La fosforilación de sitios inhibidores bloquea la actividad de
los complejos Cdk/ciclinas
Antes de comenzar la mitosis, las Cdk1 es fosforilada en un sitio activador (Thr160) por la kinasa CAK, y en uno o dos sitios
inhibidores (Thr14, Tyr15) por la kinasa Wee1. En este estado la Cdk tiene muy baja afinidad por el substrato y es inactiva. Al
final de la fase G2, Cdk1 es activada por la fosfatasa dual Cdc25 que remueve el fosfato del sitio inhibidor. Un mecanismo
similar regula a Cdk2.

MPF (Mitosis Promoting Factor) = Cdk1-ciclinas B

CAK: Cdk-Activating Kinase
 Otro mecanismo que regula negativamentge la actividad de Cdks es la
expresión de inhibidores

CKI: Cdk Kinase Inhibitors

Cdk4/6

Los inhibidores (CKI) se unen a la Cdk o al complejo CDK-ciclina y emplean diversos mecanismos para inhibir
la actividad de la Cdk: ej. bloqueo del acceso del dominio catalítico al substrato, cambios estructurales del
sitio activo de la Cdk, bloqueo de la interacción con la ciclina, etc. Hay inhibidores que actúan sobre diferentes
Cdks (ej. p16, p21, p27, p57, Sic1) y otros que son específicos (ej. p16/INK4a inhibe Cdk4 y 6 en G1).

Alberts et al., BMC 2002

Las Cdk integran señalización de varias vías (“inputs”),
que regulan de manera positiva y negativa la actividad.

Cdk
 Los complejos Cdk-ciclinas fosforilan proteínas que controlan eventos específicos de las fases del
ciclo celular. Por ej. durante la fase M, Cdk1-ciclinas M fosforilan substratos requeridos para la
condensación de la cromatina, ruptura de la membrana nuclear, ensamble del huso mitótico, etc.

Alberts et al, MBC 2015

 EXPERIMENTOS QUE
PERMITIERON IDENTIFICAR
REGULADORES CLAVES
DEL CICLO CELULAR
 Experimentos de fusión de células revelaron la existencia de
factores difusibles que controlan el ciclo celular

Experimentos que revelan la actividad

de las Cdk de fase S Experimento que revela la actividad de las Cdks de fase M

El citoplasma de células en fase S induce a núcleos en

G1 (A) y no de G2 (B) a iniciar la replicación del DNA.
(C) El núcleo en G2 no se modifica y el núcleo de G1
entra en fase S de acuerdo a su propio ritmo.

La fusión de una célula en fase M con otra en fase G1 induce eventos

en el núcleo de G1 característicos de las primeras fases de la mitosis.
 Experimentos en Xenopus permitieron aislar un factor que promueve
la maduración de ovocitos (MPF, Maturation Promoting Factor)
El MPF identificado en Xenopus es el equivalente molecular al complejo de CDK-ciclinas M

La microinyección del citoplasma de huevos maduros en ovocitos arrestados en G2 induce la mitosis y la

maduración a huevo sin necesidad de progesterona (b). El factor fue aislado y se denominó “Maturation Promoting
Factor” o MPF. Cuando el MPF es inyectado en células somáticas en interfase promueve la mitosis (c).

release from the ovary

(ovulation)
mitosis

Ovocito arrestado Huevo

arrestado
en G2
en meiosis II
bajos niveles de altos niveles de
actividad MPF actividad MPF (b) microinyección
de citoplasma (c) microinyección de MPF

mitosis mitosis

Ovocito arrested célula en

en G2 interfase

Lodish et al, MBC2004

La actividad del MPF es máxima durante la profase y metafase
de cada división

Perfil de actividad del MPF durante la maduración de oocitos de Xenopus, la fertilización y las
etapas iniciales del desarrollo embrionario.

huevo

ovocito

↑Wee1,
↓Cdc25, ↓Wee1,
↑Cdc25, cytostatic factor
↑Ca 2+
APC ↑APC
tiempo
primer segundo
arresto arresto
Lodish et al, MBC2004
 Los factores que controlan el ciclo celular pueden identificarse
mediante el análisis genético en levaduras

La levadura S. cerevisiae (budding yeast) es unicelular, tienen un genoma relativamente

pequeño, tiempo de duplicación corto (~90 min) y posee un estado de reproducción haploide.
Los genes cuyas mutaciones arrestan el ciclo celular se denominan “cell division cycle” genes
o cdc genes. Solo las mutaciones condicionales permiten la propagación de las células.

Cdc gene mutant

Las mutaciones sensibles a la temperatura resultan típicamente de cambios “missense” (cambio de aminoácido).
Usualmente mantienen la función normal de la proteína a una temperatura baja o permisiva. En esta condición las
células se pueden propagar. El fenotipo de la mutación se manifiesta restringiendo el crecimiento de la levadura a
una cierta temperatura denominada no permisiva o restrictiva.
 Estudios genéticos en S. pombe permitieron identificar la única Cdk
de estas levaduras: Cdc2
Las células de S. pombe se dividen por fisión del citoplasma (A). Las mutantes recesivas para el gen cdc2
(cdc2-) no se dividen y se alargan (B). En contraste, mutantes de ganancia de función (cdcD, dominantes)
entran prematuramente a la mitosis, sin crecer lo suficiente (C).

A
cepa salvaje,
tamaño normal

cdc2+

B
mutante
recesiva

cdc2-

C
mutante dominante

Sergio Moreno
cdc2D
Cdc2 de S. pombe es equivalente a Cdc28 de S. cerevisiae

Lodish et al, MBC2004

Estudios genéticos en S. pombe también permitieron identificar genes
reguladores de la actividad de Cdc2: Wee1 y Cdc25

Fenotipos mutantes en S. pombe

modelo de
interpretación de
los resultados (cdc2-ciclB)

inhibidor activador

Lodish et al, MBC2004

 Modelo de acción de los principales reguladores de
la actividad del MPF en S. pombe

Estudios genéticos permitieron identificar 4 proteínas reguladoras de Cdc2: la ciclina mitótica Cdc13,
equivalente a la ciclina B de vertebrados; la quinasa Wee1, que fosforila el sitio inhibidor (Y15) en Cdc2; la
kinasa CAK, que fosforila el sitio activador T161; y la fosfatasa Cdc25, que defosforila Y15 y activa el
complejo Cdc2-Cdc13 .

(Cdc13)
defosforilación del
sitio inhibidor

(Cdc2)
sitio sitio
inhibidor activador

* La treonina Thr161 de Cdc2 es homóloga a la Thr160 de la Cdk1 de vertebrados.

Lodish et al, MBC2004

 EVENTOS DE LA FASE G1
- Reconocimiento del origen de replicación (OR). Los complejos ORC se
unen a los ORs y marcan los sitios de inicio de la duplicación del ADN.

- Licenciamiento del origen. Los adaptadores Cdc6 y Cdt1 son requeridos

para reclutar la helicasa Mcm al complejo ORC, formando el complejo de pre-
replicación que habilita al origen a iniciar la duplicación del ADN. Este proceso
solo ocurre en G1 y es bloqueado en el resto de las fases.

- Expresión de ciclinas de fase G1

- Expresión de ciclinas G1/S

- Inhibición de los complejos Cdk-S

 El complejo de pre-replicación se ensambla en el origen y en G1,
una sola vez por ciclo
ORC es un complejo hexamérico que se asocia al OR. Posteriormente los factores Cdc6 y Cdt1 se unen al ORC y reclutan a la
helicasa Mcm formando el complejo de pre-replicación o pre-RC que habilita o “licencia” a los OR para iniciar la duplicación en
la fase S. Dos mecanismos inhiben el licenciamiento en el resto de las fase: 1) Geminina es un inhibidor de Cdt1 que bloquea el
reclutamiento de Mcm; 2) los complejos Cdk-M y Cdk-S fosforilan e inactivan a Cdc6 y Cdt1. Al final de la mitosis y al comienzo
de la fase G1, el complejo APC/Cdh1 degrada a Cdk-M y Cdk-S y a la proteína geminina permitiendo el ensamble del pre-RC.

Complejos Cdk-M,
Geminina Cdt1

↑APC/Cdh1
Cdt1

Mcm

OR: Origin of Replication Cdc6

ORC: Origin Recognition Complex (formado por 6 proteínas, ORC1-6).
Mcm: Mini chromosome maintenance (formado por 7 proteínas, Mcm1-7). Lodish et al, MBC 2004; Sclafani & Holzen, ARG 2007
 La expresión de ciclinas D es regulada por una red compleja
de factores de transcripción

Lasa ciclinas D son las principales ciclinas de G1 en vertebrados. Diversos factores extracelulares activan vías de señalización
que regulan la expresión/función de factores de transcripción que interaccionan con el promotor. del gen de ciclina D.

Klein & Assoian, JCS 2008

 La vía ras  MAPK induce la expresión de factores de transcripción
que luego inducen la expresión de la ciclina D

En respuesta a la estimulación de
la vía de ras-Erk ocurre la
expresión de una primera oleada
de genes denominados de
expresión temprana, que incluyen a
los factores de transcripción c-fos-
c-Jun y ATF. Estos regulan la
expresión de genes de expresión
ej. c-fos gene tardía, como por ej. ciclina D.
ej. cyclin D

ej. c-fos y c-jun genes

ERK  TCF  c-Fos↑

c-Jun/c-Fos (AP-1)  ciclina D  ↑Cdk 4/6
ECM  integrins JNK  c-Jun↑
cdk inhibitors
 TRANSICIÓN G1  S
Esta transición requiere de la inactivación de inhibidores de Cdk-ciclinas
de fase G1/S y pasaje del punto “Start” o “Restriction point”

Cdk-ciclinas de fase S Cdc28-Ciclinas B5/6 en S. cerevisiae

Cdk2-ciclinas E/A en vertebrados

Sic1 Cdc28-Clb5/6 (S. cerevisiae)

Whi5 SBF (S. cerevisiae)

p21/p27 Cdk2-E/A (vertebrados)

rb E2Fs  ciclinas E (vertebrados)
 Mecanismos de retroalimentacion positiva promueven una
transición abrupta de G1  S
De estudios realizados
en S. cerevisiae

Whi5 es un represor
transcripcional que inhibe a los
factores de transcripción SBF.
SBF induce la transcripción de
ciclinas de G1/S. Los complejos
Cdk-G1 fosforilan e inactivan
Whi5.

Sic1 es un inhibidor de complejos

Cdk-S. La fosforilación de Sic1 en
9 sitios por complejos Cdk-G1 es
necesaria para ser reconocidos y
ubiquitinados por el complejo
SCF, y posteriormente
degradados en proteosomas.
Como consecuencia, los
complejos de Cdk-ciclinas S
acumulados durante G1 se
desbloquean abruptamente y
simultaneamente disparan la
masiva duplicación del DNA.
 La transición abrupta de G1  S depende de mecanismos
de retroalimentacion positiva o doble negativa

Red de circuitos que regulan la transición G1S en levaduras.

Las ciclinas de G1 son resistentes a la degradación mediada por el complejo APC-Cdh1, el cual es activo en G1.

SBF: Swi4-Swi6 cell cycle box Binding Factor

La síntesis de ciclinas D en vertebrados activa un mecanismo de feedback
positivo que promueve la transición G1S

Las células estimuladas con factores de crecimiento progresan en G1 hasta superar un estado o
punto de no retorno o “restriction point”, a partir del cual adquieren la capacidad para duplicar el
DNA, y a partir del cual ya no son necesarias la ciclinas D.

G1

Experimento que muestra el requerimiento de ciclinas D

para inducir la fase S. Células fueron estimuladas con
factores mitogénicos. A distintos tiempos post-estímulo,
fueron microinyectadas con anti-ciclina D (barras rojas) o
con IgG control (barras celestes) e incubadas con
bromodeoxiuridina (BrdU) para detectar las células que
están en la fase S. Note que el anti-ciclina D bloquea la
fase S cuando es inyectado antes de las 14 h pero pierde
su efecto para las 16 h, indicando que el sitio de no
retorno ya se superó.
 La transición abrupta de G1  S en vertebrados depende de
mecanismos de retroalimentacion positiva o doble negativa

Rb es funcionalmente equivalente a Whi5 de levaduras. Rb inhibe a los factores de transcripción E2Fs por dos
mecanismos diferentes: 1) interacción directa y bloqueo estérico de los factores E2Fs, 2) reclutamiento de la
histona deacetilasa HDAC al promotor de E2F inhibiendo su transcripción. Cdk4/6-ciclinas D de G1 fosforilan e
inactivan Rb, permitiendo pasar el punto de no retorno, en el cual se activan mecanismos de retroalimentación
positivos y doble negativos que aseguran la expresión y activación de los factores E2Fs, y las ciclinas A y E.

/A
retroalimentación
p27 positiva

Punto de
restricción
superado
(independiente
gen activo de ciclinas D)
HDAC función inhibida,
promotor
HDAC
inactivo
Los factores de transcripción
Mid G1 Late G1 E2F promueven la expresión de
genes involucrados en la fase S,
como ciclinas A y E. También
estimulan su propia expresión.
Las ciclinas D son resistentes a la degradación mediada
por el complejo APC-Cdh1, el cual es activo en G1.
EVENTOS DE FASE S

 Activación de complejos Cdk-S

 Activación de OR y duplicación del ADN
 Inactivación de factores de licenciamiento
- Apertura del ADN. Las quinasas de fase S, CDK y DDK, activan la helicasa Mcm y
comienza el desenrrollamiento del ADN. Este proceso solo ocurre en fase S.

- Copia del ADN. Ensamble del replisoma.

(2, 3) La fase S se dispara cuando Cdk-ciclinas S y la kinasa
(DDK) fosforilan componentes del pre-RC, evento necesario
Fosforilación para reclutar el factor iniciador Cdc45. Los complejos Cdk-S
activos fosforilan e inactivan a Cdh1, causando la inhibición
de APC/Cdh1. Esto permite la acumulación de Geminina.

(3) Cdc45 activa la helicasa Mcm y recluta el replisoma,

formandose la burbuja de replicación. La fosforilación de Cdt1
y Cdc6 por Cdk-S induce su disociación del complejo.
Geminin Activación Geminina se asocia Cdt1 y lo inhibe por el resto del ciclo.

(3, 4) Cdc45 recluta proteínas del replisoma (polimerasas,

primasas, ligasas, topoisomerasas, etc) y las proteínas Rpa
que protegen las hebras simples del DNA de la degradación
por nucleasas.

Cdk-S y Cdk-M fosforilan a los factores de iniciación Cdc6 y

Cdt1 impidiendo su re-asociación al ORC. Cdc6 y Cdt1
fosforilados son ubiquitinados por SCF y degradados o
exportados al citoplasma. Cdt1 es además inhibido por
Geminina. Estos mecanismos redundantes aseguran que
cada origen de replicación dispare la síntesis del DNA una
sola vez por ciclo.

La degradación de las ciclinas S/M y Geminina por APC-

Cdh1 al final de la mitosis y la actividad de fosfatasas
durante G1, permiten que los factores de iniciación de la
replicación ensamblen un nuevo pre-RC en el siguiente ciclo.
DDK: Dbf4-Dependent Kinase
 Replisoma y duplicación bidireccional del ADN

El replisoma constituye un
complejo de proteínas
asociado a las horquillas de
replicación. Formado por
polimerasas (, , ),
adaptadores (RFC, PCNA,
GINS) y diferentes enzimas
y reguladores (GINS, Cdc45,
microscopía electrónica primasas, etc).
E. coli tiene un solo OR para
duplicar el ADN (replicón). Los
cromosomas eucariotas
tienen varios ORC/replicones,
aproximadamente unos 300
en la levadura S. cerevisiae.

Lodish et al, MBC2004;

Leman & Noguchi, Genes 2013
 Las cromátides duplicadas se mantienen unidas por
complejos proteicos denominados cohesinas
Las cohesinas son complejos formados por 4 proteínas principales, dos subunidades, Smc1 y 3, pertenecen
a la familia de proteínas SMC (Structural Maintenance of Chromosomes), se asocian por los extremos
formando una estructura con forma de abrazadera que envuelve las dos cromátides. Las proteínas Scc1 y 3
cierran y estabilizan la estructura. Scc1 y 3 son degradadas por APC-Cdc20 al comienzo a la Anafase.

cohesinas

(bisagra)

Anafase

Alberts et al, MBC 2015

TRANSICIÓN DE LA
FASE G2  M

 Activación de complejos Cdk-M

Cdc28-Ciclinas B1-4 (S. cerevisiae)

Cdk1-ciclina B (vertebrados)
 Cdc25 activa complejos Cdk-M al final de G2 y dispara la mitosis

La fosfatasa Cdc25 es activada por las quinasas Polo y Cdk-M generando un circuito de retroalimentación
positivo. Cdk-M además fosforila e inhibe a la quinasa inhibidora Wee1 (circuito de retroalimentación doble
negativo). Como consecuencia al final de G2 se produce un aumento abrupto de la actividad de Cdk-M.

ciclina
M
Tyr
CAK
incrementa expresión
en G2, activación

↑Polo kinase
Thr

Cdk1 (stress
~ Cdc28 signaling)
~ Cdc2 p38
↑Polo kinase P

inhibición,
ubiquitinación
y degradación
en proteosoma

ATM, ATR,
chk1 & 2

MPF activo
DNA no replicado
y/o dañado
Retroalimentación positiva y doble negativa asegura la amplificación de la
actividad de los complejos Cdk-M
 EVENTOS CONTROLADOS
POR CDK-M EN MITOSIS
fosforilación de laminas  desensamble de la lámina nuclear

fosforilación de nucleoporinas  desensamble de poros nucleares

eventos
nucleares fosforilación de proteínas de anclaje de la cromatina a la membrana
 desestabilización de la envoltura nuclear y de la cromatina
fosforilación de condensinas  empaquetamiento de la cromatina

Cdk-M

eventos fosforilación de MAPs  incremento del dinamismo de los MTs

citoplasmáticos fosforilación de proteínas del RE y Golgi  inhibición del tráfico
y fragmentación del Golgi y RE.
Fosforilación de las laminas y
ruptura de la envoltura nuclear

Los complejos Cdk-M fosforilan las laminas A, B y C evento

que conduce a la depolimerización de los filamentos
intermedios y al desensamble de la lámina nuclear. La lamina
B fosforilada permanece anclada a la membrana nuclear
interna por un ácido graso. La fosforilación de nucleoporinas
provocan el desensamble parcial de los poros nucleares.

microscopía de barrido de la lámina nuclear

Cdk-M
MPF
 Activación de condensinas y empaquetamiento de la cromatina

Las condensinas son complejos multi-proteicos que

se asocian al DNA e inducen su empaquetamiento
complejo de dependiente de hidrólisis de ATP. Esta función es
condensinas promovida por la fosforilación de Cdk-M.

Modelo de empaquetamiento de la cromátide

Los complejos de condensinas/cohesinas se unen a regiones específicas del

DNA denominadas SARs/MARs (scaffold/matrix-attachment regions).

Alberts et al 6th Ed
 Modelo de condensación de la cromatina

fibra de 11 nm
(hilera de
nucleosomas)

fibra de
cromatina
de 30 nm

en un cromosoma de metafase (~2 mm de largo)

la doble hebra del DNA (~1,5 cm de largo) se
empaqueta por un factor de ~7.500
Visualización de condensinas en cromosomas en metafase

En estas imágenes de fluorescencia los cromosomas estan teñidos con

anticuerpos contra condensinas (rojo) y el DNA esta teñido con Hoescht (azul)
Cdk-M promueve el incremento en el dinamismo de los microtúbulos
de metafase
Cdk-M fosforila catastrofinas y otras MAPs efecto que
incrementa la inestabilidad dinámica de los microtúbulos.

La vida media de microtúbulos

de interfase es ~ 5-10 min y
disminuye a < 1 min en mitosis.

Las catastrofinas se unen a los extremos (+) de los microtúbulos provocando la disociación de
monómeros e incrementando la frecuencia de catástrofes (transición de elongación  acortamiento).
 El Cdk-M y otras quinasas, ej Polo y Aurora, fosforilan componentes de
centrosomas y kinesinas, promoviendo el ensamble del aparato mitótico

La estructura y dinámica del aparato mitótico depende de la actividad

coordinada y combinatorial de diferentes motores.

Alberts et al 6th Ed
Cdk-M regula varios aspectos de mitosis: 1) duplicación y separación de centrosomas, 2) posicionamiento
y alineamiento del huso, 3) condensación y cohesión de los cromosomas, 4) orientación y función de los
cinetocoros, 5) elongación del huso y ensamble de la zona media en anafase.

3
4

Enserink & Kolodner, Cell Division 2010

2
El tráfico anterógrado vesicular es inhibido durante la mitosis

Fragmentación del Golgi durante la mitosis y su re-ensamble al final de la misma.

Se visualiza la distribución de GFP-GalNac-T2, una glicosil transferasa del Golgi.

El complejo Cdk-M fosforila e inactiva

a proteínas que estabilizan las
cisternas del Golgi, promoviendo la
desintegración del RE y Golgi.

Magnus et al MBC2004, Yeong, BioEssays 2013

 TRANSICIÓN DE
METAFASE  ANAFASE

 Fosforilación y activación de APC por complejos Cdk-M

 Unión del cofactor Cdc20 a APC
 Degradación de securinas y ciclinas mitóticas.
 APC ubiquitina y promueve la degradación de proteínas que inhiben la
transición Metafase/Anafase y también eventos de telofase y citoquinesis

Cdk1-cicl B
(vertebrados)
inactivo

Anafase tardía
fosforilación
Cdh1

activo
Metafase/Anafase
Cdc20
(securinas)
La destrucción de securina y cohesinas es requerida para iniciar la anafase

Las proteínas Scc1 y 3 cierran el anillo formado por las proteínas Smc sobre las cromátides duplicadas. Scc1
y 3 son substratos de la proteasa separasa. Separasa es inhibida en fases previas a la anafase por la
proteína securina. La activación de APC-Cdc20 promueve la ubiquitinación y degradación de securina en
proteosomas. La separasa activa degrada Scc1/3, permitiendo la separación de las cromátides en la Anafase.
APC-Cdc20 también inicia la degradación de ciclinas S y M.

proteosoma

Scc3 Smc3

Scc1 Smc1

Anafase

cromátides duplicadas
 La destrucción total del MPF es requerida para finalizar la mitosis

En la fase G1, la En la anafase tardía la fosfatasa Cdc14

fosforilación de Cdh1 defosforila Cdh1, y permite su unión al
por Cdk-ciclinas G1/S complejo APC. La unión del cofactor Cdh1 a
inhibe su unión a APC y APC es requerida para la ubiquitinación y
permite la acumulación degradación masiva de las ciclinas mitóticas,
de las ciclinas S y M. de fase S, Polo kinase, etc.

Secuencia reconocida por APC en las ciclinas mitóticas

Esta secuencia no está presente en las ciclinas de G1 y

G1/S, por lo tanto no son blanco de APC-Cdh1.
Cdh1: Cdc20 homology-1. Fosforilado en G1 por Cdk-ciclinas G1/S.
Lodish et al, MBC2004
La inactivación del MPF permite la descondensación de los cromosomas
y la reformación del núcleo
La inactivación del MPF permite la activación de
miosina y el desarrollo de la citoquinesis
 La acción de fosfatasas es requerida para la inactivación de Cdk-M
y la inducción de la citoquinesis
Durante interfase y mitosis temprana Cdc14 es una
normal
fosfatasa retenida inactiva en el nucleólo. Al final de
la anafase Cdc14 es liberada y defosforila al cofactor
Cdh1, permitiendo su unión y activación de APC.

kinasas nucleolo
(Cdc15) Cdc14
La fosfatasa Cdc14 defosforila substratos
necesarios para la formación de un
complejo multiproteico en la zona media, mutante de cdc14
Cdc14 que estabiliza microtúbulos polares anti-
paralelos (en verde), y que marca el sitio
Cdh-APC donde ocurrirá la citoquinesis.

PRC1, kinesins
Cdk-M

citoquinesis

Cdc14  PRC1, kinesin  MTs del huso intermedio

PRC1: Protein Regulator of Cytokinesis, es una MAP que se une a microtúbulos anti-paralelos polares y estabiliza la zona media.
 Secuencia de eventos durante la citoquinesis en células animales

(a) Extremos (+) de microtúbulos Forminas

anti-paralelos polares se
superponen en la zona ecuatorial RhoA
del huso mitótico y son RhoK  myosin
estabilizados por Kinesins (KIF4)
y PRC1. Un complejo multi-
proteico define la zona media
donde se ensamblará el anillo
contráctil. El complejo recluta
activadores de RhoA a la
membrana.
(b) RhoA activa forminas y dirige el
ensamble de un anillo de actina y
miosina contráctil.
(c) Anillina y otras proteínas
“scaffold” anclan el complejo
contráctil a filamentos proteicos
de septinas asociados a la
membrana.
midbody
(d) (e) La fusión de las membranas
en el sitio de escisión requiere del
ensamble de filamentos de
proteínas ESCRT en las zonas
flanqueantes al cuerpo medio. La
escisión de las membranas
requiere de hidrólisis de ATP.

PRC1: Protein Regulator of Cytokinesis, PRC une a microtúbulos polares antiparalelos.

ESCRT: Endosomal Sorting Complexes Required for Transport Green et al Annu Rev Cell Dev Biol 2012
 REGULADORES POSITIVOS Y
NEGATIVOS DEL CICLO CELULAR
EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Una red compleja de interacciones funcionales opera en G1 y
determina el arresto o progreso de las células hacia la fase S

ECM
TGFβ

β-catenin p16
Tcf

cytokines
STATs

Johnson & Skotheim, 2013

En vertebrados, 2 familias de inhibidores bloquean Cdks y arrestan el ciclo

*cumplen una función similar

Cdk2-E al inhibidor Sic1 en S. cerevisiae
integrinas (-) SCF-ubiquitina

- p21CIP *
p53 - CIP/KIP - p27KIP1 Cdk2-E/A
(+)
- p57KIP2
TGF-b

caderinas

otro grupo de inhibidores de Cdks:

- INK4 (p16) Cdk4/6-ciclinas D

Proteínas reguladoras del ciclo celular

Alberts et al., BMC 2008

 Protein kinases and protein
Proteínas reguladoras phosphatases that modify Cdks

del ciclo celular

Cdk-activating phosphorylates an activating site in Cdks
kinase (CAK)
Wee1 kinase phosphorylates inhibitory sites in Cdks; primarily involved in
controlling entry into mitosis
Cdc25 removes inhibitory phosphates from Cdks; three family members
phosphatase (Cdc25A, B, C) in mammals; Cdc25C is the activator of Cdk1 at the
onset of mitosis

Cdk inhibitory proteins (CKIs)

Sic1 (budding suppresses Cdk activity in G1 ; phosphorylation by Cdk1 triggers its
yeast) destruction
p27 (mammals) suppresses G1/S-Cdk and S-Cdk activities in G1; helps cells to withdraw
from cell cycle when they terminally differentiate; phosphorylation by
Cdk2 triggers its ubiquitylation by SCF
p21 (mammals) suppresses G1/S-Cdk and S-Cdk activities following DNA damage in
G1; transcriptionally activated by p53
p16 (mammals) suppresses G1-Cdk activity in G1; frequently inactivated in cancer

Ubiquitin ligases and their activators

SCF catalyzes ubiquitylation of regulatory proteins involved in G 1 control,
including CKIs (Sic1 in budding yeast, p27 in mammals);
phosphorylation of target protein usually required for this activity
APC catalyzes ubiquitylation of regulatory proteins involved primarily in exit
from mitosis, including Securin and M-cyclins; regulated by association
with activating subunits
Cdc20 APC-activating subunit in all cells; triggers initial activation of APC at
metaphase-to- anaphase transition; stimulated by M-Cdk activity
Hct1/Cdh1 maintains APC activity after anaphase and throughout G1; inhibited by
Cdk activity

Gene regulatory proteins

Whi5. Yeast transcriptional repressor that binds and
inhibits the yeast transcription factor SBF. E2F promotes transcription of genes required for G1/S progression, including genes
SBF and MBF. Yeast transcription factors that induces the encoding G1/S cyclins, S-cyclins, and proteins required for DNA synthesis;
transcription of G1/S cyclins (Cln 1 y 2). stimulated when G1-Cdk phosphorylates Rb in response to extracellular mitogens
Rb. Mammal Retinoblastoma protein binds to and inhibits p53 promotes transcription of genes that induce cell cycle arrest (especially p21) or
E2F transcription factors. Functionally equivalent to Whi5. apoptosis in response to DNA damage or other cell stress; regulated by association
with Mdm2, which promotes p53 degradation
 Resumen de eventos en S. cerevisiae
La nomenclatura corresponde mayormente a reguladores identificados en levaduras (S.cerevisiae)

temprana
G1 tardía
S G2 M
anafase
telofase
APC fosforilado e inactivo activación
APC
inactivo
fosforilación activo
Cdh1
Wee Cdc28-Clb1
fosforilación Cdc28-Clb2 proteólisis
Cdc28-Cln1 CAK activas
Whi5 SBF,
↑transcripción Cdc28-Cln2 Cdc20 Cdh1
Cdc25
Cdc28-Cln3 fosforilación Cdc7=DDK4 inhibidor de
proteólisis kinasa la anafase
↑transcripción SCF Cdc28-Clb3
Cdc28-Clb4 Cdc28-Clb1
Sic1 activas síntesis complejos activos Cdc28-Clb2
del DNA
inactivación Cdc28-Clb5 Cdc28-Clb5 Cdc28-Clb3
Sic1
Cdc28-Clb6 Cdc28-Clb6 Cdc28-Clb4
inhibidor de inactivas activas Cdc28-Clb5
la fase S Cdc28-Clb6

ensamblaje de complejos inhibición del ensamblaje de nuevos

de pre-replicación complejos de pre-replicación

Whi5 es un represor transcripcional; SBF es un factor de transcrición

 Nomenclatura comparada y eventos críticos

S. cerevisiae vertebrados

ciclina Cdk ciclina Cdk función

mid G1 Cln 3 Cdc28 D (1-4) Cdk4/6 ↑E2F, ↑SBF, ↓Whi5, ↓Rb

G1/S Cln 1, 2 Cdc28 E Cdk2 ↓APC, ↓Sic1, ↓Cdh1

S B 3-6 Cdc28 A Cdk2 ↑replicación del DNA

M B 1-4 Cdc28 B Cdk1 ↑APC, ↑huso mitótico, ↑división nuclear

MPF ~ Cdc28-Clb ~ Cdc2-Cdc13 ~ Cdk1- cicl B

Xenopus S. cerevisiae S. pombe vertebrados

 CONTROL O "CHECKPOINTS"
EN EL CICLO CELULAR

señal  sensor  mediador o transductor  efector

 Sistema de respuesta al ADN dañado
(DNA Damage Response, DDR, system)

ATM: Ataxia Telangiectasia Mutated

ATR: ATM-Rad3-Related
Chk1/2: Checkpoint 1/2

Lodish et al
 Mecanismos de control o "checkpoints" aseguran la correcta duplicación,
integridad y distribución del DNA a las células hijas

ATM: Ataxia Telangiectasia Mutated

ATR: ATM-Rad3-Related
Chk1/2: Checkpoint 1/2

(fosfatasa)

(fosfatasa)
ATM y ATR son quinasas relacionadas a
PI3K; ATM sensa cortes de la doble hélice,
ATR sensa alteraciones que generan
cadenas simples (ej. horquillas de
replicación detenidas). ATM/ATR fosforilan y
activan a las Ser/Thr kinasas Chk1 y 2.
 Mecanismos de sensado y respuesta relacionados con alteraciones
en la molécula de ADN

Sensores: PARP sensan cortes del DNA

y marcan el daño mediante la síntesis
de cadenas de poly-ADP-ribosa sobre Sensors
histonas próximas al daño. El complejo
MRN luego recluta y activa ATM.

Transducers

Effectors

Maréchal & Zou, CSHPB2013

 p53 es un efector clave de la
respuesta al daño del ADN
“DNA Damage Response o DDR”

En condiciones normales, p53 es una proteína inestable,

ubiquitinada por la ubiquitina ligasa Mdm2 y degradada en
proteosomas. El daño del DNA activa quinasas (ATM, ATR,
Chk) que fosforilan a p53 y provocan su disociación de
Mdm2. De esta manera, p53 se acumula y activa la
transcripción de CKIs y factores de reparación del DNA.
 Mecanismos transcripcionales y modificaciones post-traducción inducen
el arresto del ciclo y la apoptosis

daño
del DNA

sensores &
transductores
inhibición de la actividad;
degradación en
activación P
proteosoma
de quinasas P
Chk1 y Chk2 Cdc25 Cdk1 G2/M

P
p53 p21CIP Cdk2 G1/S
estabilización
de p53
Cdk4/6 Rb E2F

↑ proteínas proapoptóticas:
Bax, receptores de Fas, etc
 Una red de proteínas controla el anclaje de los
microtúbulos polares al cinetocoro:
control “checkpoint” de metafase
prometafase, baja tensión
Bub y Mad2 activados en el cinetocoro

Cdc20
Mad active
sensors Bub
Bub, Mad

mediador El anclaje de los MTs a los cinetocoros de los

cromosomas duplicados genera tensión en los
Cdc20
cinetocoros. La actividad de quinasas como Aurora-B
Mad en cinetocoros no ocupados o con baja tensión 1)
Bub reclutan y activan proteínas de control que
secuestran al cofactor Cdc20, y 2) desestabilizan la
efector APC inactive unión de microtúbulos. De este modo, Cdc20 no
puede activar a APC. La ocupación de los
cinetocoros por los microtúbulos y la generación de
tensión bloquean la activación de Mad/Bub, y Cdc20
securina puede activar a APC. APC-Cdc20 ubiquitina al
inhibidor de la anafase y dispara la anafase.

MAD: Mitotic Arrest Deficient

BUB: Budding Uninhibited by Benzimidazole

Mussachio & Salmon NRNCB 2007

 La tensión en los cinetocoros controla el anclaje de los MTs al cinetocoro
“checkpoint” de metafase

La correcta segregación de cromosomas en anafase depende de mecanismos que detectan anclajes aberrantes de los
microtúbulos del huso al cinetocoro. La tensión generada por dichos anclajes es detectada por la quinasa Aurora-B, localizada
en la placa interior del cinetocoro. Tensión insuficiente en el cinetocoro promueve la fosforilación e inactivación de componentes
externos del cinetocoro que anclan a los microtúbulos (ej. el complejo Ncd80), facilitando la disociación de los extremos (+) de
los MTs. En condiciones de tensión normal, la ineficiente fosforilación de los substratos del cinetocoro externo incrementa su
afinidad por los extremos de los MTs y promueve un anclaje fuerte de los MTs a los cinetocoros.

Proteínas “scaffold” del cinetocoro reclutan a los componentes de señalización Bub y Mad en condiciones de baja tensión.

Alberts et al 6th Ed