Artículo Científico

Ossa, J.A.; Vanegas, M.C.; Badillo, Á.M.: Sustrato crecimiento Lactobacillus sp.

EVALUACIÓN DE LA MELAZA DE CAÑA COMO

SUSTRATO PARA EL CRECIMIENTO DE
Lactobacillus plantarum

EVALUATION OF CANE MOLASSES AS SUBSTRATE

FOR Lactobacillus plantarum GROWTH
Juliana Andrea Ossa1, María Consuelo Vanegas 2, Ángela María Badillo3

1
Microbióloga Agrícola y Veterinaria. Estudiante de Maestría de Ciencias Biológicas de la Universidad de Los Andes,
Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos, LEMA. 2 Microbióloga M.Sc. Profesora asociada, Directora del
Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos, LEMA, Universidad de Los Andes. [email protected].
3
Microbióloga. Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos, LEMA, Universidad de Los Andes. Carrera 1 N°
18A 10J-209. Bogotá-Cundinamarca, Colombia. Correspondencia: [email protected]

Rev. U.D.C.A Act. & Div. Cient. 13 (1): 97-104, 2010

RESUMEN SUMMARY

La importancia de bacterias acido lácticas (BAL), Due the importance of lactic acid bacteria (LAB) in
como los Lactobacillus sp. en Colombia y en el Colombia and worldwide, it has been necessary to
mundo, hace necesario encontrar métodos óptimos optimize the culture conditions using different kind of
para su crecimiento, utilizando sustratos diferentes substrates to increase growth. In this research, cane
para su desarrollo. Se empleó melaza de caña como molasses was exploited as an indicator substrate to
sustrato iniciador para el incremento de L. plantarum. determinate Lactobacillus plantarum growth. Different
Se evaluaron condiciones y variables que afectan conditions and variables that affect the microbial
el crecimiento microbiano. Se manejó como cepa development were evaluated. L. plantarum (WS417)
control L. plantarum WS417 y se inocularon diferentes was used as a control strain, inoculating diverse
concentraciones de melaza estéril a diferentes valores de sterile molasses concentrations at different pH values,
pH, temperatura y agitación. El crecimiento, se determinó temperature and agitation. The strain growth was
con microbiología tradicional utilizando recuentos evaluated by traditional microbiology, direct bacteria
directos en placa, con agar MRS. La interpretación count, seeded in MRS agar plates. Relationships between
de resultados, se realizó con un análisis de varianza biomass and effectiveness of different culture conditions
factorial, observando interacciones de las variables, were estimated by factorial variance analysis, showing
respecto al recuento microbiológico. Las condiciones the results as optimal growth conditions the content of
óptimas para el crecimiento de L. plantarum fueron 20% 20% cane molasses, 30±1°C for 24 hours, pH 5,2±0,1,
concentración, 30±1°C durante 24 horas, 5,2±0,1 (pH) and 100rpm with counts of 43x109UFC/mL. It was
y 100rpm, donde se obtuvo un recuento de 43x109UFC/ concluded that cane molasses could be employed as
mL. Se concluyó que la melaza de caña podría ser usada growth substrate for Lactobacillus sp.
como sustrato para el desarrollo de Lactobacillus sp.
Key words: Cane molasses, substrate, lactic acid
Palabras clave: Melaza de caña, sustrato, bacterias ácido bacteria.
lácticas.

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INTRODUCCIÓN europeos y Japón, lo que implica costos de adquisición.

Adicionalmente, si las empresas comercializadoras de
Los Lactobacillus spp. son bacterias ácido lácticas alimentos fermentados (95%) del mercado nacional,
(BAL) que se caracterizan por los diferentes usos e trabajaran con la búsqueda de cultivos y condiciones
importancia a nivel industrial y, en ocasiones, utilizadas que proporcionen la obtención de mayores densidades
como fermentadores de alimentos cárnicos, lácteos del microorganismo (>107 UFC/g), generaría un mayor
y vegetales, además del uso en biopreservación, para impacto en el desarrollo de estas bacterias, a partir de un
incrementar la vida útil de los productos o como potencial medio no láctico para ampliar sus aplicaciones a otros
probiótico en la industria. Desde el siglo pasado estos alimentos (Vargas et al. 2004), ya sea para consumo
microorganismos han demostrado múltiples efectos humano o animal, biopreservación, probióticos, entre
positivas en la salud de animales y del hombre (Silveira et otros, con la correspondiente reducción de costos para los
al. 2003; Cabeza, 2006; Vásquez et al. 2009; Gálvez et al. consumidores, lo cual seria un gran aporte a la industria
2007; Castellano et al. 2008; Fiorentini et al. 2001). nacional en la producción de bacterias ácido lácticas.

Los probióticos tienen diferentes efectos en el ser Actualmente, en Colombia la industria de lácteos es las
humano, es así que modifican la microflora intestinal, que más utiliza probióticos (Vargas et al. 2004). La venta
influyen directa e indirectamente en el estado de la de productos probióticos importados es distribuida a
salud, a través de producción de vitaminas y ácidos un grupo de industrias limitado, debido al costo y al
grasos de cadena corta, colaboran con la degradación valor comercial, tales como Alpina, Parmalat, Corpoica,
de sustancias alimenticias no digeridas, estimulan entre otras (Castro & Rodríguez, 2005; www.alpina.com.
la respuesta inmune y dan protección frente a co). Entre los años 2000 y 2005, se ha incrementado el
microorganismos enteropatógenos (Lee & Salminen, dinamismo del sector lácteo en un 8,1% de leche y de
1995; Holzapfel, 2001). un 7,3% de otros productos lácteos (DANE-Agrocadenas,
2006).
Según, Vargas et al. (2004), cerca del 65% de los
alimentos que participan en el mercado mundial son El mercado de alimentos que aprovecha BAL continua
productos con probióticos y los Lactobacillus son una creciendo mundialmente y en Colombia es necesario
de las bacterias más empleados en el mercado nacional. contar con sistemas de producción, de métodos y de
Las cepas mundiales consideradas como probióticos medios de cultivos adecuados para dicho objetivo;
y utilizadas como ingredientes del producto, son las se genera la búsqueda de condiciones y factores que
siguientes: L. acidophilus, L. bulgaricus, L. lactis, permitan la producción de BAL, como una necesidad
L. casei, L. plantarum, L. rhamnosus, L. reuteri, L. de la industria colombiana, para así poder producir
paracesei, L. fermentum, L. helveticus, Bifidobacterium, microorganismos iniciadores de alimentos fermentados
B. adolescentis, B. angulatum, B. bifidum, B. breve, como cárnicos, yogures, quesos, entre otros, sino,
B. catenulatum, B. dentium, B. infantis, B. longum, también para ser utilizados como ingredientes o aditivos
B. pseudocatenulatum, B. infantis, L. acidophilus prebióticos, para aumentar los beneficios del cliente por
NCFM (Rhodia, EE.UU.) L. acidophilus NCFB 1748.L. consumo de dichos productos y, de esta manera dotarles
acidophilus LA1 (al cual se lo renombró como L. de un valor agregado.
johnsonii LJ1 -comercializado por Nestlé, Suiza). L.
casei Shirota (Yakult, Japón). L. casei CRL431 (Chr. Estudios anteriores muestran que el MRS (Man, Rogosa
Hansen, EE.UU.). L. fermentum RC-14 (Urex, Canadá). y Sharpe) es un medio de cultivo adecuado para la
L. casei DN114 (Danone, Francia).L. crispatus CTV05 recuperación de Lactobacillus sp. en condiciones
(Gynelogix, EE.UU.). L. reuteri MM53 (BioGaia, Suecia). de laboratori, y su costo se hace elevado para el uso
L. rhamnosus GG (Valio, Finlandia). L. rhamnosus GR-1 industrial en grandes cantidades (Vargas et al. 2004).
(Urex, Canadá). L. plantarum 299V (producto de Probi, En la industria se han evaluado diferentes sustratos para
Suecia) (Shah & Lankaputhra, 2002; Mantello, 2007). el crecimiento de BAL, como el medio de cultivo agar
leche y leche descremada, que favorece el aislamiento
En Colombia, las bacterias que se manejan para de Lactobacillus sp. (Cogan et al. 1997; Simova et al.
productos probióticos son cepas importadas de países 2002). Poca es la información disponible de sustratos

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utilizados para el cultivo de bacterias ácido lácticas, a Evaluación del crecimiento microbiano a diferentes
nivel industrial, pero tradicionalmente, se ha utilizado concentraciones de sustrato: Según el protocolo
la miel o melaza “blackstrap”, que es un líquido denso, con modificaciones de Ortiz et al. (2008), se utilizó un
viscoso de color oscuro y que contiene sales y otros Erlenmeyer de 250mL con 50mL de melaza estéril a
compuestos solubles en álcali; es un producto final diferentes concentraciones (5%, 10%, 20%, 25% y 30% p/v)
de la fabricación o refinación de la sacarosa, glucosa pH 5,2+/-0,1, los cuales, fueron inoculados con 1mL de
y fructosa procedente de la caña de azúcar; además, un cultivo overnight de L. plantarum WS417 e incubados
contienen sustancias no fermentables y melanoidinas (a a 30±1ºC a 100rpm, durante 24 horas. La concentración
base de nitrógeno), derivados a partir de la condensación inicial del inoculo en los erlenmeyer fue de 102 UFC/
del azúcar y aminocompuestos (Honig, 1974; Swan & mL. Para cada ensayo, el crecimiento fue determinada
Karalazos, 1990). Este subproducto es comúnmente realizando recuentos de Unidades Formadoras de Colonia
destinado para la producción de alimentos concentrados (UFC) en superficie, a las 48 horas.
de animales y como suplemento alimenticio para el
hombre, a pesar que, en la actualidad su costo depende Evaluación del crecimiento a diferentes pH: Para cada
de otros factores, como el tema de biocombustibles, por concentración de melaza (20% y 25%, 30%, p/v), se
ejemplo. Ello hace necesario analizar las condiciones que ajustó el pH de los erlenmeyer a 5,2±0,1, 6,0±0,1 con
suministra el sustrato a estos microorganismos (Leeson KOH y HCl al 40%, los cuales, fueron inoculados con
& Summers, 2000; ICONTEC, 1994). 1mL de un cultivo overnight de L. plantarum WS417
(102 UFC/mL) en cada tratamiento. Se incubaron a
Es así, como se debe explorar alternativas con otras 30±1ºC a 100rpm durante 24 horas y se determinó el
materias primas, como la melaza de caña, que contiene crecimiento, por medio de recuentos en placa.
componentes esenciales que favorecen el crecimiento
de las BAL y proporcionan alternativas de relación Evaluación del crecimiento a diferentes temperaturas:
costo-beneficio, a nivel de producción y de rentabilidad, El crecimiento fue evaluado mediante recuentos
incrementando la proliferación del microorganismo celulares en placa, sometiendo los tratamientos
rápidamente, valiéndose de sustratos disponibles (diferentes concentraciones de sustrato a diferentes pH),
para su uso; aunque pueden existir otros sustratos a temperaturas de 25±1ºC, 30±1ºC y 35±1ºC, por 24
más económicos, un primer acercamiento a evaluar horas, en agitación constante (100rpm).
las condiciones favorables para el incremento de L.
Análisis estadísticos: Cada uno de los ensayos fue
plantarum en melaza de caña puede generar nuevas
realizado por duplicado (Tabla1). Los datos se analizaron
iniciativas de alcance para producción (Vargas et al.
usando modelos lineales, como el análisis de varianza
2004; Ortiz et al. 2008).
factorial, con el programa de Statistix 8,0 (1985-2003
Analytical Software), para observar interacciones de las
El objetivo principal de este estudio fue evaluar las
variables respecto al recuento microbiológico en placa.
condiciones óptimas, bajo las circunstancias de la
investigación actual, de crecimiento de L. plantarum
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
en melaza de caña, como sustrato.
Crecimiento en diferentes concentraciones de
MATERIALES Y MÉTODOS sustrato: Respecto al crecimiento evaluado con
diferentes concentraciones, se observó que el crecimiento
Conservación de la cepa: La cepa de Lactobacillus de L. plantarum fue de 109 en 20% y 25% y se obtuvo
plantarum WS417, donada por el Instituto Zentralinstitut recuentos más bajos de 106 y 107, con las demás
für Emährungs und Lebensmittelforschung (Ziel), de la concentraciones (5%, 10%, 30%). Se debe tener en
Universidad München, Freising (Alemania), fue sembrada cuenta que la concentración inicial del inoculo estaba en
en agar Man Rogosa y Sharpe (MRS) (Sharlau, España) 102 UFC/mL. Los recuentos finales de los tratamientos
e incubada a 30ºC±0,1, por 48 horas sin agitación y en al ser incubados presentaban exponentes de 109, lo que
aerobiosis. La cepa fue conservada en tubos inclinados indica, que se incrementaba siete unidades el crecimiento
de MRS a 4±1ºC y en caldo MRS, con 30% de glicerol bacteriano, en 24 horas, inoculando la melaza de caña
a -80ºC. al 20% y 25% (Tabla 1, Figura 1 y 2).

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Tabla 1. Tratamientos utilizados para evaluar concentraciones de sustrato (melaza de caña), pH inicial de la melaza (5,2±0,1), temperatura (30ºC)
y tiempo de incubación (24h) y agitación (100rpm).

Temperatura Concentración sustrato

Tratamientos pH inicial Tiempo (horas)
ºC %p/v
1 5,32 30±1 20 24
2 4,52 30±1 20 24
3 5,31 25±1 20 24
4 4,48 25±1 20 24
5 5,30 30±1 25 24
6 4,49 30±1 25 24
7 5,31 25±1 25 24
8 4,50 25±1 25 24
9 5,20 30±1 30 24
10 4,49 30±1 30 24

Lo anterior puede ser atribuido a la transformación de la A concentraciones de melaza más elevadas (30%), las
sacarosa a monómeros de azúcar (glucosa y fructosa) bacterias alcanzan la fase estacionaria más rápido,
por la enzima invertasa, que puede disminuir su actividad antes de consumir todo el sustrato, lo que hace que
a concentraciones altas de sustrato, a determinadas el microorganismo no produzca más biomasa, por
temperaturas y pH, permitiendo el aumento de la velocidad el estado de saturación del sustrato, respecto a la
de crecimiento (Kazuhiko & Kozo, 1995). En contraste, concentración microbiana.
se obtuvo que a bajas concentraciones de melaza (5%,
10%) hay una deficiencia de carbono, que se refleja en la Crecimiento a diferentes pH. Se demostró que
disminución de los recuentos (Ortiz et al. 2008). empleando un pH de 4,5±0,1 y 6,0±0,1, los recuentos

Figura 1. Efecto de los tratamientos sobre el recuento directo en placa de agar MRS.

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Figura 2. a) Lactobacillus plantarum con tinción de Gram, donde se observan bacilos cortos Gram positivos, posterior a la inoculación de los
Erlenmeyer con melaza, además de la confirmación y pureza del cultivo, determinada por la apariencia microscópica. b) recuentos (48h) en placa
en superficie en agar MRS de L. plantarum, en tratamiento de 30±1ºC, 20%, 100rpm, pH inicial 5,2, 24 horas post-inoculación en el Erlenmeyer,
en diluciones 107, 108, 109.

se disminuían respecto a un pH inicial de 5,2±1 (pH inicial mejoró la homogenización de nutrientes y aumentó la
de la melaza), entre una o dos unidades logarítmicas, velocidad de transferencia de productos metabólicos
dependiendo de la concentración del sustrato. La de las células hacia el medio. Se registró un aumento
agitación demostró mejorar el crecimiento bacteriano en el recuento de tres unidades logarítmicas, cuando
respecto a tratamientos que se evaluaron sin exponer los los tratamientos eran sometidos a agitación constante
erlenmeyer en shaker termostatado (Ortiz et al. 2008). (109), respecto a los que no recibieron el tratamiento
(106).
Por otro lado, se midió el pH final de los Erlenmeyer
inoculadas de los diferentes tratamientos y se observó Crecimiento a diferentes temperaturas: En placa
una disminución de, aproximadamente, una unidad en para la determinación del crecimiento en los diferentes
el rango de acidez, presentando valores del pH final en tratamientos mostraron que a temperaturas de 25±1ºC
4±0,1, cuando se trabajaba con pH inicial de 5,0±0,1, lo y 35±1°C, los recuentos de las BAL fueron menores que
cual, evidenció la actividad metabólica de la bacteria. a 30±1°C, en cualquiera de las condiciones evaluadas.
El consumo de los sustratos de la melaza, como son
Las bacterias ácido lácticas crecen adecuadamente bajo azúcares, fósforo, nitratos, se consumen más rápido
condiciones microaerófilicas con cantidades de oxígeno, a temperaturas altas, pero se evidencia incremento de
entre un 2 y 10%; además, en pH, donde los medios los recuentos a temperaturas menores (30±1ºC) (Ortiz
son ligeramente ácidos, en un rango de 4,5 a 6,4, bajo et al. 2008).
condiciones de temperatura entre 30 y 40°C. Cuando
un medio de cultivo alcanza la alcalinidad o neutralidad, Por lo anterior, se podría afirmar que se lleva a cabo el
el crecimiento de las bacterias tiende a disminuir (Ortiz proceso conocido como inversión de la sacarosa; la
et al. 2008). presencia de esta enzima depende de las concentraciones
de glucosa, de la temperatura de 30±1°C, donde se
Por otro lado, la agitación incrementó la velocidad de evidencia mayor actividad de la enzima invertasa (Ortiz
transferencia de nutrientes del medio a las células, et al. 2008), que está directamente relacionada con la

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actividad metabólica, debido a que la enzima se encuentra Finalmente, en la industria láctea y cárnica colombiana
cerca de la superficie de la célula y puede actuar mejor podría existir una gran aceptación de nuevas alternativas
a estas condiciones (Zech & Gorish, 1995). y propuestas para el crecimiento de bacterias ácido
lácticas de uso comercial, debido a que se incrementaría
Análisis estadístico: En promedio, el crecimiento de el rendimiento y la calidad de la producción animal, la
L. plantarum evaluado con melaza de caña al 20% fue prevención de enfermedades y el uso indiscriminado
mayor que en la del 5% y 10%. Además, se evidenció de antibióticos y se mejoraría el aprovechamiento de
que no existe diferencia estadísticamente significativa los recursos agrícolas y la tecnología disponibles en el
(p > 0,05) en el recuento promedio, evaluado con las país; además, el contenido nutricional de alimentos de
concentraciones de melaza del 20 y 30%. Por lo tanto, consumo masivo estarían mejor suplementados con
se seleccionó la concentración de melaza de caña del cepas probióticas, se ampliaría la gama de aplicaciones
20% (p/v), que permite la reducción de costos y el de los probióticos a otros alimentos, ya sea para consumo
crecimiento óptimo del microorganismo (Ortiz et al. humano o animal y, finalmente, sería benéfico para el
2008). El tratamiento al 20%, 30±1°C de incubación consumidor, ya que los valores de los productos se
durante 24 horas, rango de pH de 5,2±0,1 y 100rpm, disminuirían por el ahorro en los costos de importación
obtuvo un recuento de 43x109UFC/mL. de los probióticos (Vargas et al. 2004).

Se observó una relación entre el aumento de la Se concluye, que esta investigación permitió evaluar
concentración de melaza con el recuento, por su algunos aspectos relacionados con las condiciones
óptimas de crecimiento de L. plantarum, en las
valor beta positivo; sin embargo, la variación no es
condiciones del estudio, utilizando un subproducto
estadísticamente significativa por un valor p=0,082,
de la industria azucarera, la melaza de caña, con la
resultado que concuerda con estudios previos,
cual, se logró incrementar el desarrollo microbiano de
según Ortiz et al. (2008), en donde han utilizado esta
bacterias ácido lácticas, a partir de medios no lácticos.
concentración para el incremento de levaduras, ya que
Los resultados hallados indican que el tratamiento que
en sustratos del 30% o más, la cantidad de sólidos
permitió el máximo crecimiento del microorganismo e
disueltos contribuyen con el estrés osmótico de las
incrementó los recuentos siete unidades logarítmicas a las
células en cultivo. 24 horas fue empleando sustrato al 20%. Se recomienda
la melaza de caña, como sustrato, para realizar más
Por otro lado, para los microorganismos, el crecimiento investigaciones a nivel de laboratorio y, posteriormente,
es la respuesta principal a las condiciones fisico-químicas poseer herramientas de acercamiento a planta piloto, para
del medio en el que se encuentran, de tal forma que el lograr proponer este sustrato, como un medio de trabajo
crecimiento es el resultado, tanto de la replicación como pertinente, que optimice la propagación de las bacterias
de los cambios, en el tamaño de la célula microbiana, ácido lácticas a nivel industrial.
debido a la extracción de los nutrientes proveídos por
el medio y, posteriormente, convertidos en compuestos AGRADECIMIENTOS: Los autores agradecen al Comité
biológicos, usados para la producción de energía y de Investigación de la Facultad de Ciencias Biológicas y
para la síntesis o la formación de productos. Cuando al Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos
se transfiere el inoculo al medio de fermentación, los LEMA, de la Universidad de Los Andes, Bogotá,
microorganismos toman los nutrientes necesarios Colombia, por el apoyo y financiación para la realización
para su metabolismo y los transforman en biomasa, de esta investigación. Conflictos de intereses: El
aunque este proceso puede durar de minutos a horas. manuscrito fue preparado y revisado con la participación
Se debe tener en cuenta que diversos factores, como de todos los autores, quienes declaramos que no existe
la temperatura, el pH y la concentración de sustrato, ningún conflicto de intereses que ponga en riesgo la
afectan significativamente los patrones de crecimiento y validez de los resultados presentados. Financiación: Este
la formación de productos asociados con el metabolismo estudio fue financiado por la Universidad de Los Andes,
del microorganismo, por eso, es necesario que el sustrato Comité de Investigación de la Facultad de Ciencias
a evaluar sea uno de los factores determinantes al realizar Biológicas, Laboratorio de Ecología Microbiana y de
un estudio comparativo de diferentes condiciones. Alimentos LEMA.

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Recibido: Marzo 26 de 2009
Aceptado: Marzo 8 de 2010

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