DETERMINACIÓN DE ETANOL EN BEBIDAS ALCOHÓLICAS POR EL MÉTODO DEL

ESTÁNDAR INTERNO

LABORATORIO DE QUÍMICA ANALÍTICA

JUEVES 10AM – 1PM

NRC: 62663

STEVEN GUTIÉRREZ GARCÍA

DANIEL YESSID LANDINEZ CASTELLANOS

CAMILA PÉREZ BAÑOL

ERWIN RAMÍREZ MUÑOZ

UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

MEDELLÍN, 24 DE MAYO

2018
 OBJETIVOS

• Determinar el contenido de etanol en bebidas alcohólicas por el método de estándar

interno.

• Preparar adecuadamente un estándar interno que cumpla las condiciones necesarias para
ser utilizado junto con la muestra.

MARCO TEÓRICO

La cromatografía es un método físico de separación en el cual los compuestos de la mezcla

a separar se distribuyen entre dos fases: una de ellas es un lecho fijo de gran área
superficial, llamado fase estacionaria y la otra es un fluido, llamado fase móvil, que atraviesa
continuamente la fase estacionaria.
En la cromatografía de gases la fase estacionaria es una columna dentro de la cual hay un
compuesto químico que ejerce retenciones selectivas sobre cada uno de los compuestos
de la mezcla a resolver (separar). La fase móvil es un gas inerte llamado gas portador y es
el encargado de transportar los compuestos de la muestra a través de todo el sistema
cromatográfico.
La cromatografía de gases es una de las técnicas cromatográficas más utilizadas y se
caracteriza porque la muestra es volatilizada e inyectada en la cabeza de una columna
cromatográfica. Los componentes de la muestra son arrastrados por el flujo de un gas inerte
(fase móvil) para que se distribuyan entre la fase móvil y la fase estacionaria y eluyan a
diferentes velocidades de acuerdo con la afinidad que tengan con la fase estacionaria

Figura 1. Diagrama de un cromatógrafo.

• Un cromatógrafo de gases funciona de la siguiente forma:
El gas portador fluye continuamente a través del inyector, la columna y el detector. La
velocidad de flujo de este gas se mantiene controlada para asegurar que los tiempos de
retención de los compuestos analizados sean reproductibles.
La muestra se introduce en el sistema de inyección que se encuentra a alta temperatura
para vaporizarla inmediatamente y poder ser llevada por el gas portador hasta la columna.
Allí, cada compuesto se distribuye entre la fase estacionaria y la fase móvil según la
solubilidad relativa en la fase estacionaria y sus presiones de vapor relativas. Como
consecuencia de la diferente movilidad de los componentes en función de su diferente
afinidad por las fases, éstos se separan en bandas que van eluyendo de la columna
cromatográfica en tiempos diferentes.
A la salida de la columna, el gas portador y cada compuesto ya separado pasan a través
de un detector el cual mide la variación de alguna propiedad física de la fase móvil, originada
por la elución de los solutos, y genera una señal eléctrica proporcional a la cantidad del
componente presente. Esta señal se transmite a un sistema de registro e integración, el
cual genera un cromatograma que representa el registro del análisis. Generalmente, el
sistema integra automáticamente el área bajo cada pico, realiza los cálculos e imprime un
reporte con los resultados cuantitativos y los tiempos de retención.
PARTES DE UN CROMATÓGRAFO
• Gas portador: El gas portador debe ser de muy alta pureza (calidad cromatográfica) e
inerte y no interactuar químicamente con la muestra ni generar señal en el detector. La
pureza del gas portador debe ser de un 99.9995 %.
• Inyector: El sistema de inyección es la parte del cromatógrafo en donde se introducen las
muestras para que sean volatilizadas y así poderlas analizar. Tanto la inyección como la
volatilización de la muestra deben realizarse en el menor tiempo posible para poder obtener
separaciones eficaces, reproducibles y con picos cromatográficos sin ensanchamiento.
Existen sistemas de inyección para muestras gaseosas y para muestras líquidas, los cuales
se presentan a continuación:
- Válvula muestreadora de gases: Las muestras gaseosas se introducen
generalmente en la columna cromatográfica usando válvulas rotatorias y bucles o
loop de volumen conocido. Los bucles son intercambiables y sus volúmenes están
entre 0.1 y 10.0 ml. El sistema está diseñado para minimizar las fluctuaciones de
presión que se puedan presentar cuando la válvula se cambia de la posición
"llenado" a la posición de "inyección"
- Inyector estándar para muestras líquidas: El modo de inyección estándar más
utilizado en las columnas empacadas es la inyección directa. La muestra es
inyectada con una jeringa a través de un tapón de caucho de silicona autosellable
llamado séptum o septa, a una cámara de vaporización de vidrio contenida en un
bloque metálico y una vez vaporizada es llevada por el gas portador hasta la
columna. Para que la columna tenga una mayor capacidad de separación, deben
utilizarse muestras pequeñas inyectándolas de tal forma que llegue un “paquetico
compacto” del vapor de la muestra a la entrada de la columna. Una inyección lenta
 de grandes cantidades de muestra causará el ensanchamiento de las bandas
cromatográficas y una pérdida de la resolución.
- Inyección Split (División de flujo): La muestra es vaporizada en el inyector a alta
temperatura. La muestra vaporizada se divide (split) para que sólo una parte
conocida de ella entre a la columna. Normalmente se utiliza una relación de partición
entre 20:1 y 200:1. Se puede regular fácilmente la relación de partición abriendo o
cerrando una válvula y controlando los valores de flujo. Esta modalidad de inyección
es adecuada para el análisis de muestras en las que la dilución con un solvente es
imposible debido a la co-elución.
- Inyección Splitless (Sin división): Otra forma de inyectar la muestra para
columnas capilares es la técnica de “splitless injection”. En el modo Splitless el Split
Vent del inyector está cerrado durante la primera parte de la inyección; es decir, la
mayor parte de la muestra vaporizada entra a la columna capilar aumentándose de
esta forma la sensibilidad del método.
- Inyección on-column: Cuando se tienen muestra que se descomponen al
calentarlas por encima del punto de ebullición, es más conveniente utilizar una
inyección on-column. Este modo de inyección directa se utiliza en columnas
empacadas cuando los compuestos son inorgánicos o cuando se tiene un rango
amplio de puntos de ebullición.
• Columna: La columna es la parte vital de un cromatógrafo de gases puesto que es allí
donde se efectúa la separación de los compuestos de la muestra inyectada. Está constituida
por un tubo largo (de acero inoxidable, vidrio o polyimida) dentro del cual hay un compuesto
químico llamado fase estacionaria, cuyo oficio es ejercer retención selectiva sobre cada uno
de los compuestos de la mezcla a resolver (separar). Existen dos tipos:
- Columnas empacadas: Están constituidas por un tubo de vidrio o de acero
inoxidable con una longitud entre 1 y 6 metros y con un diámetro interno entre 4 y 6
mm. La columna se empaca con un sólido finamente dividido (como la alúmina o los
polímeros porosos) el cual tiene dos opciones: ser activo y servir como fase
estacionaria en la llamada cromatografía gas-sólido o de adsorción. El sólido
también puede ser inactivo y servir como soporte y estar recubierto por una fina
película de un líquido no volátil de polaridad variable, en la llamada cromatografía
gas- líquido o de partición.
- Columnas capilares: se fabrican de sílice fundida (SiO2) y se recubren en el
exterior una capa de polyimida para darle mayor flexibilidad y poderla doblar en
espiral. Los tubos capilares tienen entre 0.10 y 0.53 mm de diámetro interno y entre
30 y 100 m de longitud (McNair M., 2011)
Una de las características de la cromatografía de gases es su eficiencia para separar los
compuestos de la mezcla inyectada. Esta eficiencia se puede expresar en forma de tres
términos: el número de platos teóricos, N, la altura equivalente a un plato teórico, HETP o
H, y la resolución, R.
• Detectores: El detector produce una señal eléctrica proporcional a la cantidad de materia
a medida que cada compuesto separado fluye a través de él. Esa señal es enviada al
integrador que realiza un gráfico de la señal del detector en función del tiempo, llamado
cromatograma.
La temperatura del detector depende fundamentalmente del tipo de detector empleado. Sin
embargo, como regla general la temperatura del detector y la de su conexión a la salida de
la columna, deben ser suficientemente altas como para evitar la condensación de los
compuestos de la muestra. Si la temperatura es muy baja y ocurre condensación, se
producirá un ensanchamiento de los picos o la ausencia total de los mismos
Los principales detectores utilizados en Cromatografía Gaseosa son:

- Detector de ionización de llama (FID): Es el detector más utilizado en

cromatografía de gases. Es un detector destructivo que responde a aquellos
compuestos que posean carbonos orgánicos en su estructura. Los compuestos que
emergen de la columna se queman en una llama de H2/Aire la cual rompe las
moléculas orgánicas produciendo un flujo de iones el cual es conducido mediante
un campo eléctrico hacia un colector donde la corriente generada es amplificada
para producir una señal la cual aparece como un pico en el cromatograma. Este
detector tiene la desventaja de que destruye la muestra.
- Detector de captura de electrones (ECD): Consta de dos electrodos y una fuente
radiactiva, normalmente Ni, emisora de partículas β. Las colisiones de las partículas
β con el gas portador lo ionizan produciéndose así un flujo de electrones que son
atraídos hacia el ánodo, generando así una corriente eléctrica que se registra.
Cuando de la columna emerge un compuesto que tenga afinidad electrónica,
captura parte de los electrones del flujo, disminuyendo así la corriente que llega al
ánodo. Esta disminución es proporcional a la concentración del compuesto eluído.
La magnitud de la señal es proporcional al tipo y número de átomos electronegativos
que posea la estructura del compuesto
- Detector de conductividad térmica (TCD): Su funcionamiento se basa en los
cambios en la conductividad térmica de la corriente del gas portador producidos por
el compuesto que eluye de la columna

• CALIBRACIÓN POR EL MÉTODO DEL ESTÁNDAR INTERNO

La calibración por el método del estándar interno se utiliza con frecuencia en el análisis
cuantitativo para compensar posibles errores derivados de la manipulación de la muestra.
Este método consiste en esencia en añadir una cantidad conocida de un compuesto patrón
a la muestra a analizar antes de realizar con ella cualquier manipulación; en el
cromatograma, aparecen los picos correspondientes al analito y al patrón añadido. De la
relación entre el área de ambos, se calcula la cantidad de analito existente en la muestra.
Para efectuar el calibrado en este método, se presentan disoluciones de concentración
creciente del compuesto a analizar a las que se añade una cantidad idéntica en todos los
casos del patrón; tras obtener los correspondientes cromatogramas, se representa la
concentración del etanol a cuantificar en función de la relación de los picos etanol/2-butanol,
con lo que se obtiene una gráfica en la que es posible interpolar la relación de los dos picos.
Un producto para ser utilizado como patrón interno debe dar un pico totalmente resuelto de
los de la mezcla a analizar, el pico del compuesto patrón debe estar situado en el
cromatograma en las proximidades de los picos de interés, a lo largo de todo el proceso de
análisis, debe tener un comportamiento similar al de los compuestos a cuantificar, debe ser
químicamente estable, frente a los componentes de la muestra como frente a los
compuestos que se puedan utilizar durante el proceso del análisis (Museo Natural de
Ciencias Naturales, (s.f))
 PROCEDIMIENTO Y DATOS EXPERIMENTALES

En la realización de la práctica para la determinación de etanol en bebidas alcohólicas

mediante el método de estándar interno, se inició preparando cinco estándares en matraces
de 25 mL con un volumen fijo de 0,5 mL del estándar interno (2-butanol) para todos los
matraces y luego adicionando un volumen de etanol que inicialmente era de 0,5 mL y se
fue aumentando 0,5 mL para cada una de las soluciones estándar, y el volumen final se
aforó con agua destilada, en cada uno de estos procesos se purgó toda la vidriería utilizada.

La muestra se preparó diluyéndola con agua a un 6% de concentración en volumen de

etanol, adicionando 0,5 mL del estándar interno y aforando con agua.

Como consiguiente se introdujo una alícuota de cada uno de los estándares anteriormente
preparados y de la solución con la muestra en viales limpios, estos se llevaron al
cromatógrafo para su análisis. Posteriormente se obtuvieron las áreas del estándar interno
y el analito. Estas áreas se reportan en la tabla 1.

Matraz Área del STD Área del Etanol

1 2792979 1215567
2 2182840 2317040
3 4616044 4177639
4 6341589 14223968
5 7802835 15018040
Muestra 3564801 4083935
Tabla 1. Áreas bajo la curva del estándar y del etanol.

CÁLCULOS Y RESULTADOS

La disolución de la muestra se hizo con el objetivo de evitar la saturación de la solución y

que esta se saliera de la linealidad del modelo por tener una concentración tan alta de
analito (29% v/v), se deseaba llegar a una concentración del 6% v/v y para esto se utilizaron
en los siguientes cálculos:

𝐶1 𝑉1 = 𝐶2 𝑉2

(0.29) × 𝑉1 = (0.06)(25 𝑚𝐿)

𝑉1 = 5,17 𝑚𝐿

Como no se podían medir 5,17 mL de muestra con los materiales volumétricos disponibles,
se aproximó a 5,2 mL y se halló la concentración real de esta:

(0.29)(5,2 𝑚𝐿) = 𝐶2 × (25 𝑚𝐿)

𝐶2 = 0,06032 ≈ 6,032%𝑣/𝑣
Por el uso del estándar interno puede realizarse una curva de calibración que relaciona el
área bajo la curva del analito y de los estándares con la concentración del analito (etanol),
de esta forma se obtiene la gráfica 1, a partir de los datos representados en la tabla 2.

Relación de
Matraz %v/v Etanol
áreas
1 0,435222392 2
2 1,06147954 4
3 0,905025819 6
4 2,242965919 8
5 1,924690193 10
Muestra 1.145627764 Desconocido
Tabla 2. Relación de áreas y concentraciones.

2.5
Área del EtOH/ Área del 2-

2
Butanol

1.5

0.5

0
0 2 4 6 8 10 12
Concentración del EtOH

Gráfica 1. Relación de áreas vs Concentración de etanol.

Se observa que la gráfica tiene puntos muy desfasados y no lleva un comportamiento lineal,
por lo que se opta por eliminar uno de los puntos más alejados de la línea de tendencia
para mejorar el coeficiente de relación que dio un valor de 0.773 y hacer más preciso el
modelo de cálculo.

Se omitieron los datos de la solución estándar 4 y se construyó la gráfica 2, con la cual se

percibe el aumento más notable en cuanto al coeficiente de correlación que aumentó hasta
0.886.
 2.5

Área del EtOH/Área del 2-

2

Butanol 1.5

0.5

0
0 2 4 6 8 10 12
Concentración del EtOH

Gráfica 2. Relación de áreas vs Concentración de etanol (corregida).

La ecuación de la gráfica 2 se utiliza para encontrar el porcentaje de etano de la muestra

de la siguiente manera:

𝑅á𝑟𝑒𝑎𝑠 = 0,1714 × [𝐸𝑡𝑂𝐻] + 0,139

Donde:

Ráreas: Es la relación (división) entre el área del etanol y el área del estándar interno.

[EtOH]: Concentración de etanol en %v/v.

Despejando la variable de interés que es la concentración de etanol y posteriormente

reemplazando en Ráreas el valor de la relación de la muestra se obtiene:
𝑅á𝑟𝑒𝑎𝑠 − 0,139
[𝐸𝑡𝑂𝐻] =
0,1714
1,145628 − 0,139
[𝐸𝑡𝑂𝐻] = = 5,873%
0,1714
Según este cálculo la concentración de la muestra diluida es de 5,873% y ahora se busca
la concentración real de la bebida alcohólica multiplicando por el factor de dilución.

𝐶1 × (5,2 𝑚𝐿) = (0,05873)(25 𝑚𝐿)

𝐶1 = 0,2824 ≈ 28,24 %𝑣/𝑣

De la etiqueta del empaque del Aguardiente antioqueño, que fue de donde se tomó la
muestra, se obtiene el valor teórico de concentración de etanol del 29 %v/v y con este se
realiza el porcentaje de error para posteriores análisis de resultados.
 |0,29 − 0,2824|
%𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = × 100% = 2,63%
0,29

ANÁLISIS DE RESULTADOS

El desarrollo la cromatografía de gases, se debe a su gran sensibilidad, a su polivalencia y

a las posibilidades de automatización, en esta los compuestos deben estar en estado
gaseoso, por lo que el análisis de la muestra líquida de aguardiente implicó que esta se
pudiera transformar en vapor por calentamiento. Se ha demostrado además que uno de los
métodos más eficientes para el estudio de la identificación de alcoholes es la cromatografía
de gases, debido a que los componentes del alcohol son compuestos volátiles y de bajo
peso molecular (Vega V. & Muños R., 2014).

La calibración por el método del estándar interno se utiliza con frecuencia en el análisis
cuantitativo para compensar posibles errores derivados de la manipulación de la muestra,
sin embargo, observando la relación de áreas obtenidas y las concentraciones de etanol se
puede decir que no fue óptimo este análisis y probablemente los errores se dieron en la
preparación de las soluciones estándar y la dilución de la muestra. De esta forma se obtuvo
un porcentaje de error del 2,63% aún después de haber tratado de mejorar el modelo
matemático por el cual se hizo el cálculo de la concentración de etanol, se debe tener en
cuenta que los instrumentos volumétricos utilizados no estaban en las mejores condiciones
y a pesar de haberse realizado purgas en el procedimiento se podían observar impurezas
en las soluciones de donde se tomaron las alícuotas de etanol y 2-butanol, también una de
las buretas utilizadas tenía sólidos desconocidos que no se lograron sacar antes de hacer
las medidas y no se sabe qué tipo de contaminantes o cómo pudo afectar esto a la medición
y a las medidas de las áreas en la cromatografía.

En cuanto a la concentración a la que se deseaba llegar de la muestra en dilución que era

del 6,032% se determinó experimentalmente con la curva de calibración que en realidad
era de 5,873%, sin embargo, este es un valor que tiene confiabilidad del 88,6%, además no
se conocía la concentración real de las soluciones de donde se tomaron las alícuotas del
2-butanol y el etanol, y lo más probable es que estos no estuviesen totalmente puros sin
mencionar las posibles contaminaciones por malas prácticas de laboratorio. Todos los
contaminantes y errores se vieron reflejados en las áreas dadas por el cromatógrafo que se
encontraba configurado a una alta sensibilidad, lo que acrecentaría el más mínimo error y
contaminante durante el procedimiento.

A pesar de los errores obtenidos, se observa en otras prácticas de este tipo (González V.
& Umensa, 2012) (Rodas L., 2008), (Vega V. & Muños R., 2014) y (Freddy, Rios, &
Fernandez, 2013), que los resultados obtenidos de la concentración de etanol diferían en
la mayoría de los casos de los mostrados en las etiquetas de las bebidas alcohólicas
tomadas como muestras, de esta forma también se sabe que los porcentajes en las
etiquetas de las bebidas no son estrictamente exactos por lo que el error no es tan
considerable en este caso.
 CONCLUSIONES
• Para el análisis del etanol en el aguardiente que fue el tipo de muestra tomada, se
determinó que la cromatografía de gases es esencial para la cuantificación de este alcohol
en la muestra, arrojando resultados bastante cercanos a los teóricos.
• Al momento de preparar las soluciones estándar influyeron factores ligados a la medición
de los reactivos con los debidos instrumentos de laboratorio, es por ello que se tuvo que
hacer una modificación en el modelo matemático para lograr obtener un mejor ajuste a los
datos obtenidos experimentalmente
• Al analizar el error porcentual del (2,63%) al momento de determinar el contenido de etanol
en el aguardiente que fue de un 28,24%. y comparando con diferentes prácticas llevadas a
cabo para este tipo de sustancias, se afirma que los cálculos son buenos ya que este
porcentaje de etanol en las bebidas alcohólicas varía y la aproximación obtenida
experimentalmente parece bastante acertada.
• Al utilizar el método de estándar interno con el 2-butanol como el estándar interno, se
aseguró que este minimizara los errores derivados de la manipulación de la muestra, siendo
de gran ayuda en los resultados obtenidos por su estabilidad y similitud al componente
requerido a cuantificar, en este caso el etanol.

PREGUNTAS

¿Cuál es el fundamento del método de adición de estándares?

El método de adiciones de estándar es un método de análisis cuantitativo, que a menudo

se utiliza cuando la muestra de interés tiene varios componentes que resultan en efectos
de matriz, donde los componentes adicionales pueden reducir o aumentar las señales de
absorbancia del analito. Resulta en errores significativos en los resultados del análisis
(Bower, 2018).

Adiciones estándar se usan para eliminar efectos de matriz de una medición, puesto que
se asume que la matriz afecta a todas las soluciones igual. Además, se utiliza para corregir
la química fase separaciones realizadas en el proceso de extracción (Bower, 2018).

La preparación de las soluciones estándar

Se toman volúmenes iguales de la muestra a analizar, y a todas, menos a una de ellas, se

le adiciona concentraciones conocidas y crecientes del analito, y por último todas ellas se
diluyen al mismo volumen. De esta forma se tienen disoluciones con una misma
concentración de analito problema, a las que se añaden concentraciones distintas de patrón
(Espejo C., M, 2016).
Preparación de la muestra

Se toma un volumen fijo de muestra, al que se le adiciona un estándar (sustancia que se

desea medir en estado puro) muy concentrado (para añadir solo un volumen pequeño, del
orden de microlitros y así evitar el efecto dilución) (Espejo C., M, 2016).

¿Qué variables se grafican en la curva de calibración?

La etapa de calibración analítica se realiza mediante un modelo de línea recta que consiste
en encontrar la recta de calibrado que mejor ajuste a una serie de “n” puntos
experimentales, donde cada punto se encuentra definido por una variable “x” (variable
independiente, generalmente concentración del analito de interés) y una variable “y”
(variable dependiente, generalmente respuesta instrumental) (Dosal A., M, 2008).

REFERENCIAS

Bower, P. (2018). Jove. Obtenido de https://www.jove.com/science-

education/10201/mtodo-de-adicin-estndar?language=Spanish

Dosal A., M. (2008). Introducción a la metrología química: Curvas de calibración en los

métodos analíticos.

Espejo C., M. (2016). Importancia de la Calibración en los laboratorios de química

analítica. Sevilla: Universidad de sevilla.

Freddy, R. C., Rios, C., & Fernandez, D. (2013). Determinación de etanol en cerveza por
cromatografía de gases. Universidad del Valle.

González V., O., & Umensa, C. (2012). Determinación de alcoholes por cromatografía de
gases. Universidad del Valle.

McNair M., H. M. (2011). Basic Gas Cromatography. Hoboken: John Wiley & Sons.

Museo Natural de Ciencias Naturales. (f.f). Museo Natural de Ciencias Naturales.

Obtenido de
http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio//es_ES//investigacion/cromatografia/princ
ipios_de_cromatografia.pdf

Rodas L., K. (2008). Determinación de metanol en bebidas alcohólicas por cromatografía

de gases. San Salvador: Universidad de el Salvador.

Vega V., J., & Muños R., A. (2014). Determinación de etanol por cromatografía de gases.
Perú: Universidad Nacional del Santa.