DISEÑO DE MEDIOS DE FERMENTACIÓN

I. INTRODUCCION

La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es

una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos los
componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza
química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir
con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además
suministrar energía para la síntesis de metabolitos y para el mantenimiento
celular. No obstante que los microorganismos varían considerablemente
respecto delos nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distinción
de las siguientes categorías de componentes:

a. Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que están

representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg.
b. Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn,
Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos
o microgramos por litro.
c. Factores de crecimiento, que están constituidos generalmente por
componentes orgánicos suministrados en baja concentración y que no son
sintetizados ni metabolizados por las células, sino incorporados a
estructuras celulares y de función metabólica específica, como vitaminas,
algunos aminoácidos, ácidos grasos no saturados, etc.

Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza química de los

componentes, en medios sintéticos o medios químicamente definidos, y medios
complejos en cuya composición intervienen sustancias de origen animal o
vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz, harina de
soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero que
son químicamente indefinidas y de composición variable.
 En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer
lugar el diseño para tratar a continuación la formulación y optimización de los
mismos.

II. OBJETIVOS:

 Determinar los parámetros cinéticos y las condiciones de operación del

cultivo.
 Elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la
formación de productos correspondientes al proceso a desarrollar.

III. MATERIALES:

 Pipetas
 Matraces
 Tubos de ensayo
 Balanza analítica
 Papel metálico
 Estufa
 Campana

A. Reactivos para medio de activación:

 Glucosa
 Extracto de levadura
 Extracto de malta
 Solución de sales

B. Reactivos para medio de fermentación:

 Glucosa
  Extracto de levadura
 NH4 SO4
 MgSO47H2O
 Solución de sales
 Tampón citrato pH=4

IV. PROCEDIMIENTOS:

1. ELABORACIÓN DE CARPACHOS
 Método Analítico

El método se basa en el aumento de la turbidez del medio al

incrementarse la concentración de microorganismos esto puede --- a 640
nm para esta determinación es necesario que previamente se elabore
una curva de calibrado para lo cual las concentraciones de
microorganismos en el medio son determinadas por peso seco.

Con papel aluminio 12

ARMAR
carpachos.

Los carpachos en la estufa

COLOCAR
t= 2 horas
En la campana de gauss
COLOCAR
T= 20 min

PESAR En la balanza analítica.

2. CONFECCIÓN DEL TAPÓN PARA MATRACES

 Para la confección de los tapones se cortará un pedazo de gasa, el cual

debe de ser doble para obtener una buena consistencia del tapón.
 Se hundirá con algodón en la boca del matraz hasta que cubra el cuello
del matraz.
  Luego se hace nudos para que nos permita sujetar bien el algodón e
impedir la caída y así mismo servirá para poder manipular el tapón.

Fig 01. Primer pasado Fig 02. Segundo pasado

Fig 03. Tercer pasado Fig 04. Cuarto pasado

3. ESTERILIZACIÓN DE PIPETAS

 Se lavan las pipetas con cuidado y se dejan secar por un lapso de

tiempo en la estufa.

 Se coloca algodón en la boquilla de las pipetas a esterilizar.

 Luego se agrupan las pipetas y al mismo tiempo envolverlas con papel

aluminio, tratando de cubrir todas las pipetas y marcando la sección en
donde está colocado el filtro de la pipeta para que así al manipularlas no
se contaminen.

 Se introducirán las pipetas a la estufa a 120 C por 2 horas.

  Pasado este tiempo se sacarán de la estufa.

4. MEDIO DE ACTIVACIÓN:

Activación g/L 25 ml
Glucosa 10 gr 0.25 ml
Extracto de levadura 3 gr 0.075 gr
Extracto de malta 5 gr 0.125 gr
Solución de sales 5 ml 0.125 ml
H2O 4.875 ml

 El extracto de levadura y extracto de malta se esterilizan por separado

en un tubo de ensayo, la glucosa en un matraz de 125 ml y las sales en
otro tubo de ensayo. Se completa en total un volumen de 25ml.

 Esterilizar a 121ºC por 15 minutos

 Mezclar todo en un matraz el mismo matraz de 125ml, en un ambiente

aséptico

Pesar Cada nutriente como se indicó en

la Tabla

En matraz de 125 ml En tubo de ensayo En tubo de ensayo

Agregar Agregar Agregar

Glucosa ext. Levadura y ext. Malta sol. Sales

Agregar Agregar Agregar

25 ml de agua
destilada

En autoclave a 121°C
Esterilizar
T: 15 min
 Mezclar En matraz de 125 ml

En Shaker en 30 °C
Colocar
T: 24 h

5. MEDIO DE FERMENTACIÓN:

Concentración de nutrientes para un medio de fermentación inicial de 100 ml. (PARA

UNA CONCENTRACIÓN FINAL = 2 G/L)

ELEMENTO NUTRIENTE % EN CÉLULA % EN Y X/S (G/G) S`0 (G/L) S0 (G/L) PESAR (GR)
NUTRIENTE

C Glucosa 45 40 0,53 3,77 5.655 0.56

(C6H12O6)

N Sulfato de Amonio 9 21,21 2,3567 0,84 0.084 0.084

(NH4)2SO4

Mg Fosfato Potasico 0,4 9.273 24,352 0,082 0,123 0.0123

(KH2PO4)

S Sulfato de Magnesio 0.25 24.24 96.96 0.021 0.031 0.0031

Heptahidratado
(MgSO4.7H2O)

K Sulfato de Magnesio 0,5 28.67 57.34 0.035 0,052 0.0052

Heptahidratado
(MgSO4.7H2O)

P Fosfato Potasico 2 22,79 11,395 0.175 0,262 0.026

(KH2PO4)

Fermentación g/L 100 ml

Glucosa 5.56 0.56
Extracto de levadura 1.8 0.18
(NH4)SO4 0.84 0.084
(MgSO4)7H2O 0.123 0.0123
Solución sales 10 1
Tampón citrato pH=4,2 100 10
  Disolver completamente cada compuesto con agua destilada:
 Esterilizar las diluciones por separado.
 Terminada la esterilización dejar enfriar y guardar en refrigeración.

5.1. INOCULACIÓN AL MEDIO DE FERMENTACION

 Se esterilizó un día antes todas las pipetas (11 pipetas) y se secaron
los viales (10 viales) en la estufa

 Se activó por 30minutos las células contenidas en el medio de

activación, ya que estaban refrigeradas 1 semana

 Se cogen 5 ml del mismo y se agregan al medio de fermentación. Se

tapa el medio de fermentación. Todo hacerlo cerca del mechero

5.2. ACTIVACIÓN CELULAR Y DESARROLLO DEL INOCULO

 En condiciones asépticas, para la inoculación partimos con la cepa

incubada en medio sólido Saccharomyces cerevisiae.
  Se toma una azada y se inocula en el matraz con los 30 ml del medio de
activación.
 Tapamos con un tapón de gasa y algodón.
 Llevamos al shaker a 150 rpm, temperatura de 30 ºC y un tiempo de
24 horas, hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente, evidenciado
por el incremento en la turbidez del medio.
 El procedimiento de inoculación se hará por duplicado es decir 2
azadas.

Pesar Cada nutriente como se indicó en

la Tabla

En matraz de 500 ml En tubo de ensayo En tubo de ensayo

Agregar Agregar Agregar

Glucosa ext. Levadura

Agregar Agregar Agregar

14 ml de agua
20 ml de agua destilada+ 1 ml de 55 ml de agua
destilada sol. Sales destilada

Esterilizar

Enfriar

Colocar Al Shaker A 150 Rpm,

Temperatura De 30 ºc Y T: 24 h
 EJECUCIÓN DEL PROCESO GENERAL:

M de activación y M de fermentación Los medios en un matraz

Mezclar de 250 ml.
25 ml y 100 ml

M de activación y M de fermentación Al Shaker A 150 Rpm,

Dejar
Temperatura De 30 ºc Y

M, activación + M. fermentación
Extraer En tubos de ensayo
5 ml

Leer A 640 nm

En una olla con agua hirviendo

Calentar
T: 3min

Centrifugar A 150rpm T: 10 min

El sobrenadante Eliminar

Tampón citrato Al tubo con el sólido

Añadir de la solución.

Centrifugar A 150rpm T: 10 min

El sobrenadante Eliminar

Agua destilada El
Agregar sobrenadante
 La solución Añadir A los capachos

En la estufa Los
Colocar capachos

Pesar Los capachos

 DNS

Los viales con solución

Sacar De la refrigeradora

Muestra y agua
Calentar En tubos de ensayo
1 ml y 2 ml


Disolver Diluciones de 1/3 Desde
viales To a T5. Solo de las
concentradas

Muestra y agua Agitar Los tubos con T: 3

min
1 ml y 2 ml
De las diluciones de
Diluciones Extraer cada tubo.
0.5 ml

 PROTOCOLO PARA ANALISIS

PESAR Cada nutriente como se indicó en

la Tabla

En tubos de ensayo Cada nutriente

AÑADIR
como se indicó en la Tabla ,
 Reactivo DNS
AÑADIR En cada tubo de ensayo.
1 volumen

Glucosa y DNS En cada tubo.

MEZCLAR

En baño maría hasta

CALENTAR ebullición. T: 5min

Agua en hielo

ENFRIAR Tiempo: 3min

Agua destilada
AÑADIR
10 volúmenes

LEER Absorbancia a 540 nm

CURVA DE CALIBRADO DE GLUCOSA:

1. Sacar los viales del refrigerador y descongelar.

2. Hacer en tubos diluciones de 1/3 (1 ml de muestra y 2 ml de agua) a los
primeros viales (T0 – T5).
3. Luego realizar prueba de DNS a todas las muestras.
a) Agregar en tubos 0.5 ml de muestra (de los tubos en que se hizo
diluciones y de los viales a los cuales no se hizo).
b) Luego adicionar en los tubos 0,5 ml de DNS.
c) Colocar los tubos en baño de agua 100º C durante 5 min.
d) Inmediatamente, colocar los tubos en agua fría por 3min.
e) Posteriormente, añadir a cada tubo 10 volúmenes de agua (5ml).
f) Finalmente, llevar al espectrofotómetro a 540 nm.

CURVA DE BIOMASA

1. Con los 10 ml separados del medio de activación, hacer diluciones de:

CURVA DE BIOMASA
DILUCIÓN MUESTRA TAMPÓN
CITRATO
1:2 2,5 ml 2,5 ml
1:3 1,7 ml 3,3 ml
 1:5 1 ml 4 ml
1:7 0,7 ml 4,3 ml
1:10 0,5 ml 4,5 ml

2. Después medir la absorbancia a 640 nm.

3. Centrifugar durante 10 min a 250 rpm.
4. Votar el sobrenadante y luego agregar agua destilada hasta completar los
5ml.
5. Volver a centrifugar por 10 min a 250 rpm.
6. Votar el sobrenadante y colocar lo restante en los capachos.
7. Llevar los capachos a la estufa a 80ºC hasta secar.
8. Finalmente pesar los capachos.

V. RESULTADOS:

1. DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO

A la hora de diseñar un medio de cultivo no sólo hay que tener en cuenta

los nutrientes sino también las condiciones físicas que permitan el
crecimiento de los microorganismos, asimismo nos interesa cuánto de
biomasa se desea producir.

 Estado: Medio líquido

 Volumen del medio: 10 – 30 % del volumen del matraz
 Temperatura: 35°C
 pH: 4.2 (ajustar pH con tampón citrato)
 Velocidad de agitación: 250rpm en el agitador orbital (shaker)

Se utilizó como fuente de carbono y energía:

 “Glucosa”

2. MUESTREO Y REGISTRO DE DATOS

N° Hora Tiempo Absorbancia Observaciones Multiplicar por la

(640 nm) dilución
01 8:15 0 TO= 0.044
TO= 0.111
02 9:15 1 0.696 0,696
03 10:15 2 0.901 0,901
04 11:15 3 1.176 1,176
05 12:15 4 1.393 1,393
06 13:15 5 1.462 1,462
07 14:15 6 0.845 Se hicieron diluciones 2,53
(1/3)
08 15:15 7 0.674 Se hicieron diluciones 3,37
09 16:15 8 0.648 Se hicieron diluciones 3,24
10 17:15 9 0.646 Se hicieron diluciones 3,23
11 18:15 10 0.556 Se hicieron diluciones 2,78

A continuación, mostramos la curva de biomasa:

y = 0,335x + 0,2091

Dónde: y = Absorbancia; x = Conc. Celular

La cinética de cultivo de Saccharomyces Cerevisiae en el medio de

fermentación, los mismos comenzaron a dividirse activamente
empleando los nutrientes que le aporto el medio de cultivo; glucosa
como fuente de carbono, concentración de extracto de levadura, entre
los demás nutrientes y sales.

Absorbancia vs Tiempo
4.000
3.500 y = 0.335x + 0.2091
R² = 0.8946
3.000
ABSORBANCIA

2.500
2.000
Absorbancia
1.500
Linear (Absorbancia)
1.000
0.500
0.000
0 5 10 15
TIEMPO
 Tiempo Absorbancia Concentración
0 0,440 0,69
0 0,411 0,60
1 0,696 1,45
2 0,901 2,07
3 1,176 2,89
4 1,393 3,53
5 1,462 3,74
6 2,530 6,93
7 3,370 9,44
8 3,240 9,05
9 3,230 9,02
10 2,780 7,67

Concentración vs Tiempo
10
9
8
7
Concentración

6
5
4 Concentración
3
2
1
0
-2 0 2 4 6 8 10 12
Tiempo

3. PESO DE CAPACHOS:

Nº Sin Biomasa Con Biomasa Biomasa

B1 -1 0,1554 0,1845 0,029
B1 -2 0,1589 0,1815 0,023
B1 -3 0,1493 0,1668 0,018
B1 -4 0,1612 0,1913 0,030
B1 -5 0,1653 0,1753 0,010
B1 -6 0,158 0,1881 0,030
B1 -7 0,1717 0,1821 0,010
B1 -8 0,1743 0,1832 0,009
 B1 -9 0,1692 0,1795 0,010
B1 -10 0,1618 0,1672 0,005
B1 -11 0,175 0,1985 0,024
B1 -12 0,1672 0,1876 0,020

4. CURVA DE CALIBRADO DE SACAROSA POR

ESPECTROFOTOMETRÍA CON EL MÉTODO DNS

Tubo MUESTRA DNS ABS(540 OBSERV.

nm)
0,5 ml 0,5 ml 1,591 La muestra anteriormente fue diluida en
T0-1
1/3(1 de muestra + 2 de agua destilada)
0,5 ml 0,5 ml 1,574 La muestra anteriormente fue diluida en
T0-2
1/3(1 de muestra + 2 de agua destilada)
0,5 ml 0,5 ml 1,731 La muestra anteriormente fue diluida en
T1
1/3(1 de muestra + 2 de agua destilada)
0,5 ml 0,5 ml 1,621 La muestra anteriormente fue diluida en
T2
1/3(1 de muestra + 2 de agua destilada)
0,5 ml 0,5 ml 1,543 La muestra anteriormente fue diluida en
T3
1/3(1 de muestra + 2 de agua destilada)
0,5 ml 0,5 ml 1,485 La muestra anteriormente fue diluida en
T4
1/3(1 de muestra + 2 de agua destilada)
0,5 ml 0,5 ml 1,397 La muestra anteriormente fue diluida en
T5
1/3(1 de muestra + 2 de agua destilada)
0,5 ml 0,5 ml 1,152
T6
0,5 ml 0,5 ml 0,568
T7
0,5 ml 0,5 ml 0,590
T8
0,5 ml 0,5 ml 0,507
T9
0,5 ml 0,5 ml 0,413
T10
CONSUMO DE SUSTRATO

Se diluyó la muestra inicial en 1/3 es decir se colocaron en casa tubo de ensayo

1ml de muestra (sobrenadante) + 2ml de H2O destilada. Luego se siguió con el
proceso indicado para determinar Azúcares Reductores por el Método DNS.

La siguiente ecuación, se obtuvo de la Curva de Calibrado para el consumo de

sustrato
Multiplicar por el
Absorbancia Concentracion factor de dilución(3)
1,591 1,58
1,574 1,70
1,731 0,55
1,621 1,36
1,543 1,93
1,485 2,35
1,397 3,00
1,152 4,80
0,568 9,08
0,590 8,92
0,507 9,52
0,413 10,21

5. PESO DE LOS CAPACHOS PARA LA CURVA DE BIOMASA:

Nº Peso sin Con Biomasa

biomasa (g) biomasa(g)
B1 -13 0,1806 0,1854 0,0048
B1 -14 0,1671 0,1714 0,0043
B1 -15 0,1823 0,1841 0,0018
B1 -16 0,1735 0,1802 0,0067
B1 -17 0,1805 0,1834 0,0029

6. PESO DE LOS CAPACHOS PARA LA CURVA DE BIOMASA:

Capacho Biomasa Absor. (640 nm)
0,0048 1,111
B1 -13
 0,0043 0,776
B1 -14
0,0018 0,470
B1 -15
0,0067 0,351
B1 -16
0,0029 0,257
B1 -17

VI. DISCUSION:

En el medio de cultivo el extracto de levadura tiene un efecto estimulante sobre

el crecimiento porque hay una mayor actividad fermentativa (por Ej. mejor
degradación de azúcares) así también reportó Kurman (1988).

La temperatura corriente de cultivo de las levaduras se sitúa entre 25 y 36ºC

que permite efectivamente el crecimiento de la mayor parte de las levaduras.
Sin embargo estas temperaturas no son reguladas a las temperaturas óptimas
de crecimiento que las levaduras que se encuentran en su hábitat natural.
Siendo la membrana citoplasmática de las células cultivadas a temperatura
elevada más resistente a las desnaturalizaciones térmicas que la de las células
cultivadas a baja temperatura. (WALTON y PRINGLE 1980).

Los resultaron no fueron óptimos, una de las posibles causas es el hallazgo de

una punta de la micropipeta sumergida dentro del recipiente conteniendo el
reactivo DNS. Esta punta pudo contener muestra ajena a la nuestra.

VII. RECOMENDACIONES:

• Trabajar en asepsia, manteniendo el lugar de trabajo, como los materiales a

utilizar.
• En el trabajo de DNS tener cuidado al introducir todos los tubos juntos al
agua hirviendo, y de igual manera al sacarlos tiene que todo juntos, para
evitar errores en la posterior lectura en el espectrofotómetro.
• Esterilización de los materiales debe ser realizada adecuadamente con el
fin de evitar posteriores contaminaciones en el medio que puedan
arrojarnos datos erróneos o no deseados.
 • Toda lectura mayor a 1,500 nm no es recomendable continuar ya que la
muestra se encuentra muy concentrada es necesario realizar diluciones
(1:3, 1:5 ó 1:8)
• Se debe tener en cuenta, que la solución DNS es reactiva a la luz; por lo
tanto es necesario utilizar un recipiente ámbar o en su defecto cubrir el
Erlenmeyer con papel aluminio

VIII. CONCLUSION:

 Se diseñó diferentes medios de cultivo, medio de activación, fermentación,

estas deben tener la adecuada cantidad de fuente de N, fuente de carbono,
vitaminas (extracto de levadura) y sales usadas para que Saccharomyces
cerevisiae pueda desarrollarse adecuadamente.
 Se seleccionó de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y
la formación de productos correspondientes al proceso a desarrollar.
 El crecimiento microbiano se traduce en un incremento en la masa celular,
en donde la Velocidad de crecimiento, es el cambio en el número de
células o absorbancia (Abs).
 El incremento poblacional que resulta de la multiplicación celular, y con él
se asocian, tanto el crecimiento, como la generación metabólica; de hecho,
las bacterias son máquinas de duplicación constante en las que se incluyen
reacciones cuya finalidad es la formación de las macromoléculas
necesarias para el ensamblaje de las nuevas estructuras celulares de sus
descendientes
 Contaminación del reactivo DNS, en su recipiente se halló una punta de
micropipeta.

IX. BIBLIOGRAFÍA:

 Jagnow, G., David, W. Bitecnología. Introducción con experimentos. 1991. Editorial Acribia.
Zaragoza, España