Guía de Laboratorio 01 IBT611 2017-2
Guía de Laboratorio 01 IBT611 2017-2
Guía de Laboratorio 01 IBT611 2017-2
IBT611 - ENZIMOLOGÍA
Ingeniería en Biotecnología
Presentación
La presente Guía para Prácticas de Laboratorio ha sido desarrollada para que los
estudiantes de la asignatura de Enzimología dispongan de la información necesaria para la
realización de las prácticas correspondientes de acuerdo a los temas, objetivos y
resultados de aprendizaje definidos. En este documento se incluye el proceso en el
laboratorio de experimentación e investigación, con los respectivos recursos y resultados
esperados, para que el estudiante pueda desarrollar su práctica-taller y la elaboración de
sus respectivos informes o cualquier otra evidencia de aprendizaje, que serán evaluadas
con las rúbricas que constan en los anexos.
1.- OBJETIVO
General:
- Obtener tres curvas de calibración que relacionen la concentración de una solución patrón
con la absorbancia de dicha solución, mediante espectrofotometría.
Específicos:
Materiales:
Reactivos:
Equipos:
- Espectrofotómetro
- Balanza
4.- METODOLOGÍA
Finalmente se lee la absorbancia a 420 nm. Se usa como blanco la solución tampón
fosfato-acetonitrilo (Tpn NaPA). Los valores obtenidos se correlacionan con sus
respectivas concentraciones, y se obtiene así, por regresión lineal, el coeficiente
de extinción molar, siendo este la pendiente resultante.
Solución stock de glucosa (1g/L, 50 mL): Pese 0,05 gramos de glucosa y disuelva en 50 mL de agua
destilada. A partir de esta solución stock, prepare diluciones según indica en la Tabla 2.
Una vez preparadas las diluciones de glucosa, tomar 250 µL de dilución, mezclar con 1 mL de
reactivo DNS, y calentar a 95°C por 5 minutos. Dejar enfriar la mezcla, trasvasarla a una celda
espectrofotométrica y medir la absorbancia a 540 nm.
NOTA: Para elaborar la curva de calibración recalcule la concentración de glucosa de esta nueva
solución (C1V1 = C2V2) y elabore la curva de calibración, donde el eje “Y” es absorbancia y el eje “X”
es la nueva concentración de glucosa.
A partir de una solución de albumina 200000 µg/mL prepare 100 µL de stock de albúmina
20000 µg/mL.
Descripción de la actividad:
El paranitrofenol es una sustancia de color amarillo y sensible a la luz a 420 nm, utilizado en
métodos espectrofotométrico como indicador de pH. Su sensibilidad a la luz tiene una relación
directamente proporcional con la concentración de esta sustancia en dilución, es decir, a mayor
concentración de paranitrofenol en dilución, mayor es su absorbancia. Sin embargo, es incolora
cuando está asociada a ácidos grasos.
En enzimología es útil ya que existen compuestos, tales como el paranitrofenil-butirato que son
incoloros. La actividad lipasa rompe el enlace éster que une al paranitrofenil con el butirato,
liberándose de este modo el paranitrofenil y coloreando el medio de reacción. Para utilizar este
método es necesario primero contar con una curva de calibración que contenga solo el colorante
en concentraciones conocidas.
La determinación de la actividad enzimática de la lipasa se realizará mediante el método de
Fukudama (1996) modificado, en el que se utiliza como sustrato el p-nitrofenil-butirato (pNFB) el
cual es esterificado por la acción catalítica de la enzima a p-nitrofenol (pNF).
Las curvas de calibración de azúcares sirven para determinar actividades de amilasas, o
enzimas cuya actividad den como producto azúcares.
Las curvas de calibración de proteínas ayudan a determinar cuantificaciones de proteínas
como consecuencia de la actividad enzimática con proteínas involucradas (proteasas, por
ejemplo).
Fukudama K., Kuwahata O., Kiyokawa Y., Yanagiuchi, T., Wakai Y., Kitamoto K., Inoue Y., Kimura,
A., (1996), “Molecular cloning and nucleotide sequence of the isoamyl acetatehydrolyzong
esterase gene (EST2) from Saccharomyces cerevisae”, Journal of fermentation and bioengineering,
82: 8-15.
La rúbrica para los informes de laboratorio se encuentra subida al aula virtual, al igual que el
formato de presentación de informes.