BIOSINTESIS DEL PEPTIDOGLICANO Y LA ENDOTOXINA BACTERIANA.

INTRODUCCION

La gran mayoría de bacterias poseen una pared celular, y auque existen

diferencias entre Gram negativas y Gram positivas, éstas tienen en común que
están compuestas por peptidoglicano o mureína, que es considerada una
barrera física que se opone a la presión hidrostática interna de la célula y evita
la ruptura de la membrana celular.
En las bacterias Gram positivas esta pared en gran proporción está
conformada por una red gruesa de cadenas de peptidoglicano (alrededor de 50
nm), externas a la membrana citoplasmática; en las bacterias Gram negativas
la capa de peptidoglicano es delgada (2 nm aprox.) y se encuentra ubicada por
encima de la membrana citoplasmática pero por debajo de una membrana
externa, cuya composición es una típica bicapa lipídica que además posee una
molécula glucolipídica anclada en su parte más superficial, el Lipopolisacárido
(LPS), que juega un papel muy importante en la patogénesis, interacción con el
hospedero y su sistema de defensa.
La síntesis de estos componentes de las paredes bacterianas constan de una
serie de pasos y reacciones principales (glicosilaciones y transpeptidaciones)
que tienen lugar en diferentes espacios de la arquitectura celular, pero que en
general se pueden resumir de la siguiente forma: producción y ensamble
primario de la materia prima en el citoplasma, acoplamiento y translocación en
las membranas e incorporación a estructuras preexistentes en el superficie
exterior de la membrana por medio de diferentes vías, según el caso.

PEPTIDOGLICANO

El peptidoglicano o mureína es un gran polímero compuesto por la unión de

sub-unidades de dos aminoazúcares que se alternan: N-acetilglucosamina
(NAG) y ácido N-acetilmurámico (NAM), por medio de un puente β(1-4) y una
cadena peptídica de cinco aminoácidos D- y L- intercalados (excepto D-Ala,D-
Ala posición 4 y 5) conectada a un grupo carboxilo del extremo D-láctico del
ácido N-acetilmurámico Esta cadena incluye un aminoácido dibásico que
permite la formación de los enlaces intercatenarios (ejemplo la L-Lisina en
Gram positivos o ácido meso- diaminopimélico en Gram negativos),. El puente
interpeptídico se forma gracias a una actividad transpeptidasa que une la D-
Ala(4) de una subunidad de mureína con el grupo amino libre, por ejemplo del
m-DAP(3) o L-Lys(3) de otro pentapéptido en paralelo, según género. En Gram
positivos como el Staphylococcus aureus este puente es aminoacídico y se
compone de 5 glicinas.
 N-Acetilglucosamina N-Acetilmur疥ico
L-Alanina

D-Glut疥ico

ﾁcido m-
diaminopim駘ico

(diamino當ido)
D-Alan ina

Figura 1. Estructura de una molécula de peptidoglicano de una bacteria Gram negativa.

Modificado de

BIOSÍNTESIS DEL PEPTIDOGLICANO

La biosíntesis de peptidoglicano se puede dividir en 4 etapas:

Primera etapa: Síntesis de precursores en el citoplasma.

1. La enzima UDP-NAcGlc fosfoenolpiruvil transferasa (codificada por el gen
murA), cataliza la reacción de condensación de fosfoenolpiruvato (PEP) y
UDP-Nacetilglucosamina (UDP-NAcGlc).
2. La enzima UDP-NAc enolpiruvilglucosamina reductasa (codificada por el
gen murB,), cataliza la reducción del intermediario UDP-N-acetil-3-O-
enolpiruvilglucosamina (UDP-NAcGlc-3-EP) al ácido UDP-N-acetilmurámico
(UDP-NAcMur), en una reacción dependiente de NADPH.
3. Anexo secuencial de cinco aminoácidos: L-Ala, D-Glu, m-DAP (o L-Lys) y D-
Ala-D-Ala a la unidad UDP-NAcMur, dando como resultado UDP-NAcMur-
 pentapéptido, en las que intervienen cuatro enzimas con actividad mureín-
ligasa, las cuales síntetizan un enlace peptídico con aporte de energía
mediante la hidrólisis de ATP; respectivamente a cada reacción: MurC,
MurD, MurE y MurF (codificadas por los genes del mismo nombre en cada
ligasa, localizados en la agrupación génica dcw: division cell wall),
caracterizadas por una alta especificidad respecto del sustrato con lo cual
se asegura que no se altere el orden de la secuencia de aminoácidos.

Segunda etapa: Ensamblaje parcial y traslocación de los precursores a través

de la membrana citoplasmática.
Como las membranas celulares son barreras hidrofóbicas se hace necesario
utilizar un transportador lipídico al cual unirse covalentemente, que en este
caso se hace común para la ruta de biosíntesis de todos los poliazúcares de la
pared celular, el Bactoprenol (C55-isoprenil-fosfato o undecaprenil-fosfato)
1. El UDP-NAcMur-pentapéptido es transferido al bactoprenol en una reacción
catalizada la enzima Translocasa I (transferasa codificada por el gen mraY),
dando como producto el compuesto undecaprenil-P-P-NAcMur-
pentapéptido o Lípido I.
2. Por medio de la actividad de una enzima de la membrana interna celular: la
Traslocasa II (NAcGlc transferasa, codificada por el gen murG), se cataliza
la transglicosilación del Lípido I a partir de UDP-NAcGlc, dando lugar al
Lípido II (undecaprenil-P-P-NAcMur-pentapéptido-NAcGlc).
3. Translocación del precursor por medio de una translocasa o flipasa
específica. FtsW o RodA hacia sus correspondientes HMW-PBPs,
implicadas en la última fase de síntesis de pared celular.
Figura 2. Biosíntesis citosólica, tránsito del precursor disacárido-pentapéptido a través de la
membrana citoplásmica y síntesis de pared celular en E. coli indicando las enzimas implicadas.
Tomado de:

Tercera etapa: incorporación de subunidades sintetizadas en el peptidoglicano

previamente ensamblado en la pared celular. Este proceso final se realiza en
determinadas zonas de la superficie celular por la acción de las denominadas
HMW-PBPs, que presentan actividades transglicosilasas para permitir la
formación de los enlaces glicosídicos.
Figura 3. Incorporación de peptidoglicano recién Figura 4. Liberación de bactoprenol. Tomdo:
formado al preexistente. Tomado de:

1. Transglicosilación: el extremo reductor de NAcMur del peptidoglicano en

crecimiento es transferido al carbono C-4’ de la NAcGlc precursora.
2. Liberación de pirofosforil-undecaprenol.
3. Desfosforilación del pirofosofril-undecaprenol para conseguir nuevamente
bactoprenol.

Cuarta etapa: Transpeptidación

1. Por acción de una acil-serina transferasa se corta el enlace D-Ala-D-
Ala, liberándose la última D-Ala, y la energía necesaria para la
transpeptidación.
2. El grupo amino libre del diaminoácido central (o del último aminoácido
del puente peptídico si este existe) es esterificado al grupo - carboxílico de
la subunidad sucesora, formándose un enlace peptídico entre ellos.

Figura 5. Liberación del último aminoácido del pentapéptido por intermediación de una acil-
serin transferasa y formación del puente peptídico intercatenario entre la D-Ala y el
diminoácido. Tomado de:
LIPOLISACARIDO

El lipopolisacárido (LPS) es una molécula glucolipídica anclada en la cara

superficial de la membrana externa de la mayoría de las bacterias Gram
negativas, que consiste en una porción polisacarídica unida covalentemente al
lípido A (endotoxina). La parte polisacarídica consta de dos regiones, el núcleo
y el antígeno O, molécula que es uno de los factores de virulencia más
complejos de comprender. Desempeñan una importante función en la
activación del sistema inmune al constituir el antígeno superficial más
importante de este tipo de bacterias, pues el lípido A, provoca la activación de
los macrófagos, induce la respuesta inflamatoria y tiene un efecto pirógeno; y
la presencia de las cadenas polisacarídicas del antígeno O facilitan el proceso
inicial de adhesión y confieren resistencia a la bacteria contra la actividad
bactericida del suero no inmune.
Además de lo anterior El LPS es indispensable para la supervivencia de las
bacterias Gram negativas, puesto que juega un papel fundamental en el
mantenimiento y la organización de la membrana externa de estas bacterias.
Figura 6. Estructura del lipopolisacárido. Tomado de

BIOSINTESIS DEL LIPOPOLISACÁRIDO

La biosíntesis del LPS incluye una serie de pasos que se efectúan en

diferentes lugares en la célula depende del dominio que se esté sintetizando,
comenzando con la producción de precursores en el citoplasma, traslocación a
través de la membrana, polimerización en el periplasma y trasporte y ubicación
hacia la membrana externa.

La síntesis del LPS se divide en dos procesos claramente diferenciados: por un

lado la formación del lípido A y del núcleo del LPS, y por otro la síntesis del
antígeno O. Una vez sintetizados estos dos componentes tiene lugar la unión
de los mismos, su modificación y su transporte hacia la membrana externa.
Figura 7. Gráfica resumen de la forma como se realiza la biosíntesis del lipopolisacárido. El
Lípido A y el núcleo se sintetizan de forma secuencial, mientras que el antígeno O lo hace por
otro camino, para al final unirse y ser transportados en la superficie de la membrana. Tomado
de:

Lípido A
El lípido A (endotoxina) es el que confiere las propiedades endotóxicas al LPS.
Es la parte hidrofóbica y más interna de la molécula, por lo tanto la porción
de unión del LPS a la membrana externa. La unidad básica consiste en
un disacárido de glucosamina ligado mediante un enlace  (1-6), que se
encuentra fosforilado en las posiciones 1 y 4’ y acilado con residuos R-3-
hidroximiristato en las posiciones 2, 3, 2’ y 3’. Los grupos hidroxilo de de los
acilos en las posiciones 2’ y 3’ se encuentran esterificados, respectivamente,
con otros dos grupos acilo de laureato (12C) o miristato (14C). El Lípido A
está unido a residuos de Kdo del núcleo interno, en la posición 6’.

 Biosíntesis:
1. El primer paso en la biosíntesis del lípido A es la formación de UDP-
GluNAc catalizado por una enzima codificada por el gen glmU.
2. La UDP-N-acetilglucosamina-O- aciltransferasa (codificada por el gen
 lpx A) reconoce el grupo OH del carbono 3 de la hexosa UDP-GluNAc e
incorpora un R-3-miristoil-ACP.
3. La UDP-3-O-acil-N-acetilglucosamina desacetilasa (codificada por el
gen lpxC), quita un acetato del compuesto anterior, en la posición 2, dando
lugar a UDP-3-acil-glucosamina (primera reacción irreversible del proceso
de biosíntesis del lípido A).
4. Una acil transferasa codificada por el gen lpxD permite la transferencia
de un segundo grupo R-3-hidroximiristoil en posición 2, desde la proteína
transportadora de grupos acil (ACP) hasta la molécula de UDP-3-acil-GlcN ,
dando lugar a UDP-2,3-diacil-GlcN, precursor inmediato del lípido A por su
extremo distal no reducido.

5. Subsecuentemente una pirofosfatasa (codificada por el gen lpxH) rompe

el enlace pirofosfato, dando origen al 2,3-diacil-GlcN-1-P, o lípido X, que es
el monosacárido precursor del lípido A por su extremo proximal reducido.
6. Una enzima LpxB (codificada por el gen del mismo nombre) cataliza la
unión de los últimos dos productos formados, UDP-2,3-diacil-GlcN y el
Lípido X, para formar una unidad disacárido 1 fosfato.
7. Una quinasa codificada por el gen lpxK, añade un grupo fosfato a la
posición 4’, formando así el Lípido IV A, primer producto que muestra
 propiedades biológicas de endotoxina.

Parece ser que la presencia de este grupo fosfato en la posición 4’ es

indispensable para la posterior transferencia a la molécula de dos residuos de
Kdo, que ya forman parte del núcleo interno. Esto indica que existe una
estrecha relación entre la síntesis del lípido A y del núcleo interno del LPS. El
primer residuo se une a la GlcN mediante un enlace α (2-6), y el segundo,
mediante un enlace α (2-4), al primer Kdo. Estos dos enlaces se forman a
partir de dos moléculas de CMP- Kdo por la acción de una Kdo-transferasa
bifuncional codificada por el gen waaA

Núcleo del polisacárido.

El núcleo del LPS consiste en un oligosacárido heterogéneo unido

directamente al lípido A en la posición 6’, que se encuentra presente en
todas las bacterias Gram negativas estudiadas hasta el momento. El núcleo
del LPS no se considera un factor de virulencia en sí mismo, aunque algunos
estudios han descrito su relación con la adhesión de ciertas bacterias a
células del hospedador y con un aumento de la actividad biológica de la
endotoxina. De forma indirecta sí que está implicado en la virulencia
bacteriana, dado que sirve de anclaje al antígeno O, el cual es un importante
factor de virulencia en muchas bacterias, y es esencial para el mantenimiento
de la membrana externa.

 Biosíntesis:
El inicio de la síntesis del núcleo se intercala con el final de la biosíntesis del
lípido A, puesto que en los pasos finales de esta última se requiere la unión
de dos residuos de Kdo. Para la formación del Kdo activado (CMP- Kdo) es
necesaria la participación de dos enzimas: la Kdo-8-fosfato sintasa, codificada
por el gen kdsA, que cataliza la condensación de D-Arabinosa y
fosfoenolpiruvato para dar lugar a Kdo-8-P; y la CMP-Kdo sintasa,
codificada por el gen kdsB, que, tras la actuación de una fosfatasa específica
para el Kdo, forma CMP- Kdo.

La proteína responsable de la transferencia de los residuos de Kdo al lípido A

es la Kdo transferasa, codificada por el gen waaA, que tiene una actividad
bifuncional en E. coli. En otras bacterias se han descrito núcleos con tres
residuos de Kdo o con uno sólo y se ha sugerido que, en estos casos, la Kdo
transferasa puede tener una actividad tri o monofuncional, respectivamente.

El lípido A-Kdo2 completo servirá de aceptor para la síntesis del núcleo del
LPS. Las reacciones posteriores llevan, en muchos de los oligosacáridos
estudiados hasta ahora, a la adición de residuos de heptosa, para lo cual es
necesaria su síntesis previa.

La ruta biosintética de la L, D-Hep, configuración en la que más comúnmente

se halla la heptosa en el núcleo, se inicia mediante la acción de una
isomerasa. Esta isomerasa cataliza la conversión de la sedoheptulosa 7-
fosfato a D,D-heptosa-7-fosfato. Posteriormente, una enzima bifuncional
denominada HldE fosforila la heptosa produciendo D,D-Hep 1,7-bisfosfato,
que a su vez será defosforilada para dar lugar a D,D-Hep 1-fosfato por la
fosfatasa GmhB. Seguidamente, de nuevo la enzima HldE actúa generando
ADP-D,D-Hep mediante su segunda función. Por último, la epimerasa HldD
dará lugar a ADP-L, D-Hep.
El núcleo del LPS se ensambla mediante transferencia secuencial de los
distintos residuos a partir de precursores activados con nucleótidos. El
proceso se lleva a cabo por la actuación de una serie de glicosiltransferasas
de forma coordinada en la cara citoplasmática de la membrana interna, lugar
donde se encuentran disponibles tanto el aceptor como los precursores
activados. Las heptosiltransferasas codificadas por los genes waaC y waaF
son las encargadas de transferir la L, D-HepI y la L, D-HepII a la cadena
principal del núcleo del LPS.

La unión covalente del antígeno O al núcleo del LPS representa la parte final
del proceso de biosíntesis y se produce en la cara periplasmática de la
membrana interna.
La proteína MsbA es un transportador tipo ABC esencial para la supervivencia
de la bacteria que parece estar involucrada en el transporte del núcleo-lípido
A al periplasma y/o en el exporte del LPS completo a la membrana
externa, aunque queda por determinar mecanismo por el cual se produce
este transporte y si hay más proteínas que intervienen en él. Por otro lado,
tampoco ha sido completamente caracterizado el mecanismo exacto de
ligación del antígeno O al núcleo, aunque parece ser que el producto del gen
waaL es la única enzima requerida para el proceso. Esta enzima es una
proteína integral, con ocho o más dominios transmembrana, que varía
bastante entre las diversas especies bacterianas en las que se ha
secuenciado.

Figura . transferasas implicadas en la biosíntesis del núcleo de E.coli

Antígeno O
El polisacárido O es el dominio hidrofílico e inmunodominante del LPS, es un
oligosacárido de unidades repetidas que se proyecta desde el núcleo hacia el
exterior de la superficie bacteriana. El antígeno O posee una cadena
polisacárida que puede variar en su longitud, llegando hasta 40 unidades
repetidas de di-desoxi-hexosas. Se sabe que por lo menos 20 diferentes
moléculas de azúcar pueden constituirlo, las cuales raramente se encuentran
en la naturaleza, estos componentes son característicos de cepa. El antígeno
O es extremadamente variable inter e intraespecie y la variabilidad recae en la
naturaleza, orden y unión de los diferentes azúcares.
El antígeno O es la parte inmunodominante del LPS y por lo tanto es el blanco
más importante para la respuesta humoral por parte del huésped, por esta
razón es la base de la tipificación serológica de las bacterias Gram negativas.
El antígeno O es reconocido por la respuesta inmune innata y participa en la
activación del Complemento y en la inhibición de la formación del complejo de
ataque a la membrana.
  Biosíntesis
Algunos de los precursores necesarios para la síntesis de la cadena
polisacarídica del antígeno O se obtienen del metabolismo central de la
bacteria. Este es el caso de la UDP-glucosa, de la UDP-galactosa o de la
UDP-N-acetilglucosamina, que, o bien se incorporan directamente al
polímero en formación, o bien servirán de intermediarios para la síntesis de
otros monosacáridos activados, entre los que se encuentran la GDP- manosa,
la TDP-ramnosa y otros azúcares presentes exclusivamente en los diversos
antígenos O. Estos precursores activados derivan generalmente de la
glucosa-1-P y de un nucleótido trifosfato.
A pesar de la gran diversidad que caracteriza a las cadenas laterales O, los
mecanismos implicados en su síntesis conservan una serie de rasgos
bastante conservados. En el ensamblaje de los antígenos O, los precursores
activados no son transferidos directamente sobre una molécula de LPS, sino
que, en lugar de ello, el antígeno O es sintetizado separadamente sobre un
transportador lipídico denominado undecaprenil fosfato (und-P). La biosíntesis
se produce, gracias a una serie de glicosiltransferasas, en la cara interna de
la membrana plasmática de la bacteria, pero el antígeno O es posteriormente
transferido y unido covalentemente al lípido A-núcleo en la cara
periplasmática de la membrana plasmática, de forma que el mecanismo de
biosíntesis debe incluir un sistema de exporte que transporte al antígeno O
sintetizado hacia el periplasma. Las tres rutas conocidas hasta ahora para
la biosíntesis del antígeno O se distinguen por sus respectivos mecanismos
de exporte y se denominan: Wzy-dependiente, transportador ABC-
dependiente y, con una distribución mucho más limitada, sintasa-dependiente.
A pesar de sus diferencias en el sistema de exporte, las tres vías poseen
similares reacciones de iniciación y se completan con el mismo proceso de
ligación del antígeno O al lípido A-núcleo del LPS.

El sistema Wzy-dependiente involucra la síntesis individual de las

subunidades repetidas O sobre la cara citosólica, seguido por su translocación
a la cara periplasmática de la membrana citoplasmática. Las subunidades en el
periplasma empiezan a polimerizarse y posteriormente el polisacárido se une al
oligosacárido del lípido A-núcleo con la liberación de undecaprenol fosfato
(Und-PP o bactoprenol). Esta vía es la preferencial en el antígeno O en
especial de los heteropolímeros. Los genes involucrados en la biosíntesis del
antígeno O por la vía dependiente wzy se encuentran generalmente en el locus
rfb del cromosoma bacteriano y se clasifican en tres grupos: 1) Los genes que
intervienen en la biosíntesis de azúcares de nucleótidos, 2) El grupo de genes
que codifican a las glicosiltransferasas y 3) Los genes que intervienen en el
procesamiento del antígeno O denominados wzx, wzy y wzz. Esta vía involucra
tres proteínas: la polimerasa Wzy, la translocasa Wzx y la proteína Wzz que
regula la longitud de la cadena del antígeno O. El antígeno O es sintetizado en
la cara citosólica de la membrana por la transferencia secuencial de sus
respectivos precursores, los azúcares de nucleótidos, al Bactoprenol. Las
unidades O son polimerizadas por la proteína Wzy y transportadas por la
translocasa Wzx. Por otra parte, el número de las unidades O que se unen al
lípido A-núcleo es regulado por la proteína Wzz. La proteína Wzz funciona
como un reloj molecular que modula la actividad de Wzy favoreciendo la
polimerización o la terminación de la cadena por acción de la ligasa WaaL. La
proteína Wzz parece ser un tetrámero con sitio de oligomerización que es
necesaria para la determinación de la longitud de la cadena y la región que
participa en la unión de los monómeros se localiza en el dominio
periplasmático. El antígeno O interactúa directamente con Wzz e induce
cambios en su conformación lo que sugiere un mecanismo molecular de Wzz
para regular la longitud de la cadena. Se ha propuesto que la translocación
final de la molécula completa de LPS a la superficie celular es mediada por un
complejo proteico de la membrana externa Imp/RlpB.
El sistema transportador ABC-dependiente es característico de la
biosíntesis de antígenos O homopolímeros. La extensión del polisacárido tiene
lugar por la adición progresiva de azúcares en el extremo no reducido de la
cadena. No requiere de una polimerasa específica y el polímero se completa
en la cara interna de la membrana citoplasmástica. El exporte de la cadena a
la cara externa para la posterior ligación al LPS se produce a través de un
transportador tipo ABC (ATP-binding cassette), por lo que tampoco actúa la
proteína Wzx. Un homólogo de WecA inicia la biosíntesis del antígeno O
colocando un residuo de GlcNAc en el Und- P, que actuara como ‘primer’
para la extensión de la cadena. En el paso siguiente, una glicosiltransferasa
específica añade un adaptador a la GlcNAc, antes de que se inicie la sucesiva
transferencia de residuos que formará la cadena. Tanto el residuo adaptador
como el iniciador pueden ser detectados normalmente en la región que une
el antígeno O al núcleo externo en la molécula final de LPS. Todo el
mecanismo requiere de la participación de una única molécula de und-P por
polímero, de forma que, al contrario que en el caso del sistema Wzy-
dependiente, el proceso es resistente a la bacitracina.
El transportador ABC encargado del Wzm
exporte de la cadena completa al
periplasma consta de dos componentes: una proteína integral de membrana,
Wzm, y una proteína hidrófila con un dominio de unión al ATP, Wzt. Se
ha sugerido que la hidrólisis del ATP produce un cambio conformacional en
Wzt que permite su inserción en la membrana mediante una interacción con
Wzm, introduciendo el polímero en el canal. Este modelo, sin embargo, no
está demostrado. En este tipo de mecanismo de síntesis la regulación de la
longitud de las cadenas polisacarídicas no requiere de una proteína
específica, tipo Wzz, y, según parece, se establece una competición entre la
exportación y la extensión de la cadena, de forma que el transportador ABC
podría jugar un papel importante en la determinación de la distribución de los
tamaños de la cadenas. Además se han hallado residuos específicos
terminales en algunos antígenos O que se sintetizan por este mecanismo, lo
cual puede indicar la presencia de algún sistema desconocido que altere el
proceso de elongación produciéndose la terminación de la cadena e
iniciándose el transporte de ésta.

El antígeno O: 54 de Salmonella entérica serovar Borreze es el único

ejemplo conocido hasta ahora de síntesis por el sistema sintasa-
dependiente. La síntesis de este homopolímero de N-
acetilmanosamina se inicia por la acción de WecA, que añade un residuo de
GlcNAc al und-P, y continúa por la adición de un residuo de ManNAc
mediante la transferasa WbbE. Una segunda transferasa específica,
WbbF, lleva a cabo la extensión de la cadena mediante la unión de más
residuos de ManNAc. WbbF es una proteína integral de membrana y
parece ser que actúa también como una sintasa, extendiendo la cadena
polisacarídica y exportando simultáneamente el polímero naciente a través
de la membrana plasmática para su posterior ligación al lípido A-núcleo.
Hasta ahora se desconoce el funcionamiento exacto del mecanismo de
transporte del polímero, así como el de la finalización de la transferencia de
residuos a la cadena polisacarídica.