FACULTAD

DE
CIENCIAS LABORATORIO DE ANÁLISIS
EXACTAS Y INSTRUMENTAL
NATURALES Informe de trabajo final

DETERMINACIÓN DE RIBOFLAVINA EN LECHE Y BEBIDAS DE IMITACIÓN

DE LECHE NO LÁCTEA POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIENCIA.

LUIS FERNANDO LOZANO CORTÉS, ANDRÉS FELIPE ORTIZ ZAPATA

Fecha de presentación 09/06/2015

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RESUMEN

La riboflavina (B2) es una vitamina hidrosoluble del complejo B, cuyo aporte

nutricional es imprescindible para el buen funcionamiento del organismo. La leche
es una de las principales fuentes de riboflavina en la dieta humana, sin embargo, en
la mayoría de los alimentos se degrada durante los procesos térmicos
convencionales y en el almacenamiento. En el presente trabajo se determinó el
contenido de riboflavina en leche entera UHT y bebidas de imitación de leche no
láctea (Leche de soya). Se prepararon 5 patrones de concentración desde 0.006
mg/ml hasta 0.01 mg/ml utilizando riboflavina pura y agua tipo I. Para la preparación
de las muestras de soluciones de leche y leche de soya se vertieron 25 ml de las
bebidas de leche y de leche de soya cada una en un beaker, se realizó una solución
de acetato de plomo 10% peso/volumen, y se tituló usando ácido acético hasta
ajustar el pH a 3.2. Una porción de esta solución (5 ml) se transfirió a cada uno de
los beaker de 2.5 ml cada uno. Las muestras se llevaron a centrifugación y
posteriormente se filtraron utilizando papel filtro, las muestras se guardaron en
beaker y se taparon con papel aluminio para protegerlos frente a la luz, en la
cuantificación para la determinación de riboflavina por cromatografía líquida de alta
eficiencia (HPLC) con detección por UV-visible dando como resultado 0,0057 mg/ml
en la leche y 0.0068 mg/ml en las bebidas de imitación de leche no láctea (Leche
de soya).

Palabras Clave: riboflavina, cromatografía liquida de alta eficiencia, leche, leche de soya
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INTRODUCCIÓN y funcionamiento óptimo del cuerpo
humano (3). Las funciones que
La cromatografía es un método de desempeñan las vitaminas son
separación ampliamente utilizado en diversas, actúan como coenzimas,
análisis químico, esta es, antioxidantes, en la regulación
probablemente, la herramienta más genética y en funciones
potente y versátil a disposición del especializadas (4). Las vitaminas se
analista moderno; en un solo proceso dividen en dos grupos, hidrosolubles y
se puede separar una mezcla en sus liposolubles. Dentro de las
componentes individuales y hidrosolubles se encuentran las
proporcionar al mismo tiempo la vitaminas del complejo B formado por
estimación cuantitativa de cada la tiamina, riboflavina, niacina,
componente. Las muestras pueden piridoxina, ácido pantoténico, biotina,
ser gaseosas, liquidas o sólidas y cobalamina y ácido fólico (5).
puede variar en complejidad desde
una simple mezcla de dos analitos a La sustancia matriz de los compuestos
una mezcla de múltiples componentes de la familia de la riboflavina es la 7,8-
con amplia variabilidad química. dimetil-10 (1 '-ribitil) isoaloxacina y a
Además, el análisis puede llevarse a todos los derivados se les aplica el
cabo, en un instrumento muy costoso nombre de flavinas (FIGURA 1) (6).
y complejo, o sobre una placa de capa Generalmente, se encuentra
fina, simple y de bajo costo (1). fosforilada integrando las coenzimas
flavin mononucleótido y flavin adenín
La cromatografía liquida de alta dinucleótido; las cuales funcionan
eficiencia (CLAE o HPLC) es la técnica como coenzimas de numerosas
en la que se utiliza una fase enzimas flavina-dependientes que
estacionaria sólida, la cual al catalizan diversos procesos de
interaccionar con la fase móvil liquida, oxidación-reducción (7). Ambas se
genera diferentes fuerzas que convierten fácilmente en riboflavina
permiten la separación de los diversos por la acción de las fosfatasas
analitos que componen la muestra. presentes en los alimentos y en el
Con este tipo de cromatografía se aparato digestivo. Esta vitamina es
puede trabajar una gran variedad de sintetizada solamente por
muestras, dado que no tiene microorganismos y vegetales, los
limitaciones por estabilidad térmica ni animales no pueden sintetizarla. La
volatilidad de la muestra; por tal razón, riboflavina es esencial para la
se pueden ver aplicaciones diversas, prevención de queilosis, dermatitis
tales como, separaciones de: seborreica, vascularización cornea,
macromoléculas, productos naturales, entre otras.
carbohidratos, vitaminas, pesticidas,
contaminantes, saborizantes,
colorantes, entre muchos otros. (2)
Las vitaminas son un grupo de
compuestos orgánicos que se
encuentran en pequeñas cantidades
en muchos alimentos, las que son
esenciales para lograr un crecimiento
 muy buena fuente de aminoácidos
esenciales, muy necesario para el
crecimiento y desarrollo por lo tanto
contiene una buena cantidad de
proteína superior en calidad a la
proteína animal. La diferencia es que
la proteína de soya no contiene
colesterol e inhibe el proceso de
descalcificación que provoca el azufre
que tiene la proteína animal. También
protege contra los cánceres en
especial el de mama.
Debido a las altas concentraciones de Es buena fuente de proteínas y
vitaminas del complejo B presentes en vitaminas. En el mercado
carnes y leche, estos alimentos son encontramos algunas marcas de leche
considerados como las mejores de soya que pueden o no tener azúcar
fuentes naturales de riboflavina en la y se presentan en diferentes
dieta del hombre en todo el mundo (8). sabores. (11)
Existe una amplia gama de productos
alimenticios obtenidos a partir de la
leche, algunos de ellos implican el uso
de la leche entera y otros sólo
porciones de ésta separadas
mediante distintas operaciones.
Existen muchas razas de bovino que
se destinan a la producción de leche
en todo el mundo. Las leches
disponibles en el mercado para
consumo directo pueden ser de vida
útil corta (leche pasteurizada, estable
de 3-5 días bajo refrigeración) y larga FIGURA 2: CROMATOGRÁFO HPLC
(leche ultra pasteurizada, estable THERMOSCIENTIFIC ULTIMATE
durante meses a temperatura 3000 Y MUESTRAS DE LECHE
ambiente) (9). ENTERA UHT MARCA COMERCIAL
Sin embargo, una pérdida ‘CELEMA’ Y LECHE DE SOYA UHT
considerable de riboflavina ocurre MARCA COMERCIAL ‘SOY PLUS’.
cuando el alimento es expuesto a la
luz. La foto degradación de la
riboflavina en productos lácteos
depende de diversos factores, tales
como, intensidad de la luz, tiempo de METODOLOGÍA
exposición y tipo de contenedor (10).
La leche de soya se obtiene triturando Para encontrar la determinación de
los granos de la soya. En el mercado riboflavina por cromatografía líquida
se encuentra en polvo y líquida en
envase de cartón. La leche de soya es
de alta eficiencia se realizó el proceso HORNO: Temperatura ambiente,
que se menciona a continuación: FASE MOVIL: H2O-Ácido acético,
Metanol (70-30%), FLUJO: 1 ml/min,
Para un primer método se prepararon TIEMPO DE CORRIDA: 20 min,
seis soluciones estándar de riboflavina VOLUMEN DE INYECCIÓN: 10 uL,
con diferentes concentraciones a DETECTOR DE ULTRAVIOLETA-
partir de unas soluciones madres de VISIBLE: 270 nm. Después se abrió
riboflavina pura y agua tipo I desde la válvula de purga de la bomba desde
una concentración de 0.0005 mg/ml el software y se le indicó la función de
hasta 0.005 mg/ml. Luego para la purga, y después se limpiaron las
preparación de las muestras de líneas donde trabajan los solventes
soluciones de leche y leche de soya se con el fin de evitar interferencias o
vertieron 25 ml de las bebidas de leche trazas de otros sistemas que fueron
y de leche de soya cada una en un utilizados anteriormente.
beaker, se realizó una solución de
acetato de plomo 10% peso/volumen, Se registró en la ventana donde se
y se tituló usando ácido acético hasta realizó el cromatográma si el equipo
ajustar el pH a 3.2. Una porción de podía empezar el trabajo, se chequeó,
esta solución (5 ml) se transfirió a cada se creó la secuencia con el nombre de
uno de los beaker de 2.5 ml cada uno. la muestra, la posición de los viales
Las muestras se llevaron a que contenía las muestras y los
centrifugación y posteriormente se patrones y se le dio la orden al inyector
filtraron utilizando papel filtro, las para que comenzara la corrida
muestras se guardaron en beaker y se cromatográfica.
taparon con papel aluminio para
protegerlos frente a la luz. Cómo en la corrida cromatográfica no
Se depositaron aproximadamente hubo lectura de patrones, solo se
entre 10 y 15 ml de las muestras en presentaron picos de ruido
dos viales pequeños de vidrio, cromatográfico, se realizaron 5
después se filtró la muestra a través nuevos patrones de concentración
de un filtro desechable de 0.45 µm de para un segundo método con una
poro con la finalidad de extraer concentración más alta siguiendo los
partículas sólidas en la muestra y pasos anteriores con riboflavina pura y
finalmente se guardó la muestra en un agua tipo I desde 0.006 mg/ml hasta
vial específico para cromatografía 0.1 mg/ml. Se guardaron en los viales
liquida de alta eficiencia (HPLC). específicos para HPLC y se realizó
una nueva corrida cromatográfica con
Antes de indicarle al equipo que las especificaciones anteriores.
realice la separación cromatográfica
se encendió el detector de ultravioleta Después se construyó la curva de
visible, el inyector automático y la calibración concentración VS área,
bomba. Después se creó el método a previamente analizados los patrones y
trabajar en el software cromatográfico la muestras en el equipo, para así
Chromeleon Chromatography Data hallar las concentraciones de
System el cual fue: COLUMNA: riboflavina en las muestras de leche y
Restek C18, TEMPERATURA DEL leche de soya.
RESULTADOS

TABLA #1: BARRIDO ESPECTRAL PARA LA DETECCIÓN DE RIBOFLAVINA

EN ESPECTROFOTOMETRÍA DE ULTRAVIOLETA VISIBLE

LONGITUD ABSOR LONGITUD ABSORB LONGITUD ABSORB

DE ONDA BANCIA DE ONDA ANCIA DE ONDA ANCIA

190 nm 0.559 270 nm 0.235 350 nm 0.144

195 nm 0.442 275 nm 0.242 355 nm 0.162
200 nm 0.429 280 nm 0.233 360 nm 0.181
205 nm 0.347 285 nm 0.219 365 nm 0.199
210 nm 0.229 290 nm 0.199 370 nm 0.221
215 nm 0.278 295 nm 0.179 375 nm 0.204
220 nm 0.265 300 nm 0.162 380 nm 0.187
225 nm 0.244 305 nm 0.144 385 nm 0.176
230 nm 0.218 310 nm 0.130 390 nm 0.161
235 nm 0.195 315 nm 0.112 395 nm 0.143
240 nm 0.185 320 nm 0.096 400 nm 0.123
245 nm 0.177 325 nm 0.078 405 nm 0.110
250 nm 0.175 330 nm 0.095 410 nm 0.096
255 nm 0.181 335 nm 0.102 415 nm 0.081
260 nm 0.185 340 nm 0.113 420 nm 0.071
265 nm 0.216 345 nm 0.132 425 nm 0.071

TABLA #2: ÁREA DE LOS PATRONES DE CONCENTRACIÓN PARA LA

DETERMINACIÓN DE RIBOFLAVINA

PATRONES CONCENTRACIÓN ÁREA

(mg/ml)
RIBOFLAVINA 0.0005 -------------------
RIBOFLAVINA 0.001 -------------------
RIBOFLAVINA 0.002 -------------------
RIBOFLAVINA 0.003 -------------------
RIBOFLAVINA 0.004 -------------------
RIBOFLAVINA 0.005 -------------------
NOTA: Cómo los primeros patrones de concentración no mostraron lectura se
prepararon unos nuevos patrones de concentración con una concentración más
alta.

TABLA #3: ÁREA DE LOS NUEVOS PATRONES DE CONCENTRACIÓN PARA

LA DETERMINACIÓN DE RIBOFLAVINA

PATRONES CONCENTRACIÓN ÁREA TOTAL

(mg/ml) TIEMPO DE ÁREA
RETENCIÓN
2.357 min 2.453 min
RIBOFLAVINA 0.006 2.2863 2.2986 4.5849
RIBOFLAVINA 0.007 10.1495 9.4774 19.6269
RIBOFLAVINA 0.008 13.6882 12.7445 26.4327
RIBOFLAVINA 0.009 15.7172 14.9209 30.6381
RIBOFLAVINA 0.01 97.2498 105.4421 202,6919

NOTA: Se suman las áreas a los diferentes tiempos de retención ya que los picos
que arrojaba la gráfica tenían hombros que tomaban áreas en dicho tiempo de
retención por lo tanto se procede a sumarlas en dichos tiempos de retención.

TABLA #4: ÁREA DE LAS MUESTRAS PROBLEMA PARA LA

DETERMINACIÓN DE RIBOFLAVINA

MUESTRAS CONCENTRACIÓN ÁREA TOTAL

(mg/ml) TIEMPO DE RETENCIÓN ÁREA
2.357 min 2.453 min
LECHE DE CONC1 9.5985 4.3231 13.9216
SOYA UHT
LECHE CONC2 0.9045 3.0369 3.9414
ENTERA UHT

NOTA: Se suman las áreas a los diferentes tiempos de retención ya que los picos
que arrojaba la gráfica tenían hombros que tomaban áreas en dicho tiempo de
retención por lo tanto se procede a sumarlas en dichos tiempos de retención.
CURVA DE CALIBRACIÓN CONCENTRACIÓN VS ÁREA RIBOFLAVINA

AREA
35
30.6381
30
26.4327

25
19.6269
20
ÁREA

15 AREA
Linear (AREA)
10
4.5849
5

0
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01
CONCENTRACIÓN (mg/ml)

NOTA: Se realiza la curva de calibración con 4 datos ya que en el último valor el

área no es proporcional porque en el tiempo de retención el área es muy grande,
por lo tanto se decidió hacerlo con los primeros 4 datos de concentración.

CONCENTRACIÓN DE RIBOFLAVINA POR REGRESION LINEAL

TABLA #5: CONCENTRACIÓN Y ÁREA PARA DETERMINACIÓN DE

RIBOFLAVINA

CONCENTRACIÓN AREA
0.006 mg/ml 4.5849
0.007 mg/ml 19.6269
0.008 mg/ml 26.4327
0.009 mg/ml 30.6381
LECHE DE SOYA UHT 13.9216
LECHE ENTERA UHT 3.9414
R^2= 0.9597
A= 0.00529
B= 0.000108
Y= B * X + A
CONC1= [(Y – A) / B]
CONC1= [(13.9216–0.00529) / 0.000108]
CONC1= 0.0068 mg/ml
CONC2= 0.0057 mg/ml

CONCENTRACIÓN DE RIBOFLAVINA EN LECHE UHT: 0.0057 mg/ml

CONCENTRACIÓN DE RIBOFLAVINA EN LECHE DE SOYA UHT: 0.0068 mg/ml

ANÁLISIS DE RESULTADOS (tabla#2); luego se realizó una

segunda lectura en la cual si se
evidencio la presencia de la
 Se realizó un barrido espectral misma; con esto y otros análisis
para conocer la longitud de realizados anterior mente que
onda a la que se lee la dio un resultado similar, se
riboflavina. Cuando se realizó concluyó que el cromatógrafo
el análisis de este barrido se tenía problemas a la hora de
observó que no había inyectar las muestra y patrones.
estabilidad a la hora de medir la
absorbancia de los patrones, ya  Se realizó la curva de
que cuando se observó los calibración con cuatro patrones
resultados del blanco de calibración ya que en el
fotométrico (agua tipo I) daban último valor el área no es
resultados negativos proporcional porque en el
esperando que esta tiempo de retención el área es
absorbancia fuera cero. muy grande.

 Cuando se realizó una primera  En la curva de calibración

lectura en el cromatógrafo dio realizada se observó una
como resultado que no había relación lineal entre el área y la
presencia de riboflavina en los concentración con un
patrones, ni las muestras
 coeficiente de correlación (r2) CONCLUSIONES
de 0.9597.

 Al analizar el área de la muestra  Se puede concluir que a la hora

de leche entera UHT se de preparar las muestras que
observó que este valor no contengan riboflavina es de
estaría dentro de la curva de suma importancia tener el
calibración, y esto pudo ocurrir almacenamiento adecuado y
porque se pudo deteriorar la protegerlas de la luz en su
riboflavina presente en la leche preparación ya que al contacto
ya que es una sustancia se directo con la luz la riboflavina
destruye con facilidad bajo la se destruye.
acción de la luz.
 Se concluyó al trabajar en el
 Con esta práctica y con la cromatógrafo liquido de alta
búsqueda de bibliografía se eficiencia que habían fallas en
llegó a conocer que los el inyector porque a la hora de
tratamientos UHT determinan leer el cromatográma se
perdidas del contenido en observaba que la muestra no
riboflavina inferiores al 10%. En inyectaba al principio y en la
envases que protegen de la luz, gráfica solo había presencia de
no se detectan perdidas ruido cromatográfico
sensibles del contenido en
riboflavina en la leche UHT.(12)  Se concluyó que la técnica
instrumental de cromatografía
 Para hallar la concentración de liquida de alta eficiencia es muy
la leche entera UHT se útil a la hora de cuantificar y
determinó que el área de dicha determinar vitaminas ya que las
muestra no cabía en la curva de detecta y es un método fácil de
calibración y se halló la usar e interpretar
concentración con los datos de
la curva extrapolando dando  Para obtener los beneficios de
como resultado 0.0057 mg/ml. esta vitamina en la leche y en
Lo cual era de esperarse ya que las bebidas de imitación de
el contenido de riboflavina en la leche no láctea es
leche es menor que el recomendable consumir estos
contenido de riboflavina en las alimentos en el menor tiempo
leches de imitación no láctea. posible ya que después de un
tiempo sus niveles se van
reduciendo.
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