TÉCNICAS MOLECULARES PARA LA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE

PATÓGENOS EN ALIMENTOS
Las enfermedades transmitidas por alimentos, ocasionadas por microorganismos
patógenos, constituyen un grave problema de salud pública a nivel mundial. Los métodos
microbiológicos utilizados comúnmente en la detección de estos patógenos, de origen
alimentario, son laboriosos y consume mucho tiempo. Esta situación, aunada a la
demanda por resultados inmediatos y a los avances tecnológicos, ha conducido al
desarrollo de una amplia gama de métodos rápidos en las últimas décadas. La literatura
reciente reporta un número significativo de técnicas moleculares, alternativas, sensibles y
selectivas para la detección, enumeración e identificación de microorganismos patógenos
en alimentos, siendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) la plataforma más
popular, mientras que la secuenciación de alto rendimiento se perfila como una técnica de
gran aplicabilidad a futuro. Sin embargo, aun con todas las ventajas que ofrecen estas
novedosas metodologías, no se deben pasar por alto sus limitaciones. Así, por ejemplo,
los métodos moleculares no constituyen protocolos estandarizados, lo que dificulta su
utilización en algunos casos. Por esta razón se debe trabajar arduamente para superar
tales limitaciones y mejorar la aplicación de estas técnicas en matrices tan complejas
como los sistemas alimenticios.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
La PCR múltiple ha sido desarrollada para la detección simultánea de dos o más agentes
patógenos asociados a alimentos. Se han desarrollado métodos de PCR para detectar
genes que codifican toxinas o factores de virulencia (lo que convierte a las bacterias en
patógenas). La PCR en tiempo real se ha desarrollado para patógenos de origen
alimentario, ofreciendo una detección rápida, sensible y específica de una serie de
agentes patógenos, tras el cultivo de enriquecimiento, así como su cuantificación. Las
ventajas de estos ensayos, junto con su facilidad de uso y la susceptibilidad a la
automatización los hacen muy atractivos para su aplicación en alimentos, con el fin de
superar la larga etapa de cultivo de enriquecimiento.
AMPLIFICACIÓN BASADA EN LA SECUENCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Aunque menos desarrollada que la PCR, hay una serie de reportes en la literatura sobre
los ensayos de amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA),
incluyendo algunos que utilizan la metodología de tiempo real, para detectar ARNm de
patógenos asociados a alimentos. Otros informes sobre el uso de esta tecnología para la
detección de patógenos en alimentos se prevén con mucho interés, debido a su
capacidad para detectar organismos viables.
MICROARREGLOS
Los microarreglos consisten en un gran número de sondas (clones de ADN, productos de
la PCR u oligonucleótidos sintéticos) inmovilizadas sobre una superficie sólida. Tras los
pasos de hibridación y lavado, el ácido nucleico enlazado a las sondas genera un patrón
de fluorescencia que es entonces registrado y analizado utilizando un escáner. Con el
rápido desarrollo de la tecnología de microarreglos se ha producido una acumulación de
datos sin precedentes, recogidos por instituciones académicas y organizaciones
industriales.
PIROSECUENCIACIÓN 454: UNA NUEVA HERRAMIENTA PARA LA DETECCIÓN DE
PATOGENOS EN ALIMENTOS Y MEDIOAMBIENTE
La tecnología de secuenciación de ácidos nucleicos ha dado pasos increíbles en los
últimos cinco años, con el desarrollo y comercialización de microrreactores para la rápida
secuenciación de alto rendimiento, también conocido como pirosecuenciación 454. Con
estas nuevas tecnologías, los genomas pueden ser completamente secuenciados en
semanas (incluso en horas), en lugar de años, debido a que esta metodología no requiere
bibliotecas de ADN, ni clones, solo el ácido nucleico aislado. Esta secuenciación ha
ampliado el repertorio de los genomas bacterianos secuenciados, incluyendo múltiples
cepas patógenas, y ha ayudado a identificar los agentes potenciales, bacterianos,
protozoarios o virales, asociados con enfermedades de etiología desconocida.
Las técnicas de diagnóstico molecular representan una alternativa prometedora en el
campo de los alimentos, debido a su rapidez, elevada sensibilidad y eficiencia para la
detección temprana de microorganismos patógenos. Por ello, el número de métodos
moleculares con potencial de utilidad en el área de microbiología de alimentos se ha ido
incrementando y diversificando, cada uno con sus respectivas fortalezas y debilidades, las
cuales deben tomarse en cuenta a la hora de cumplir con los objetivos planteados. La
PCR destaca como el método de diagnóstico molecular más aplicado en el área de
alimentos y, recientemente, variaciones de este, como la PCR en tiempo real, han
sumado ventajas adicionales a esta técnica, entre las que se destaca una mayor
velocidad en la obtención de resultados. Sin embargo, los equipos y reactivos resultan
más costosos que aquellos empleados en los métodos tradicionales de cultivo. Esta
desventaja es característica en la mayoría de las técnicas moleculares descritas. La
secuenciación de alto rendimiento, por su parte, se vislumbra como una herramienta
novedosa con un futuro prometedor para la industria de los alimentos, debido, entre otras
ventajas, a su rapidez y alta precisión. No obstante, la complejidad de la bioinformática
requerida constituye una de las limitantes más notorias. Por último, se debe acotar que los
esfuerzos de estandarización y normalización de estos métodos son un requisito
indispensable para lograr la aplicación práctica y rutinaria de estas técnicas en la
detección e identificación de microorganismos patógenos transmitidos por alimentos.
BIOLOGIA MOLECULAR Y SU IMPORTANCIA EN LA CALIDAD DEL ALIMENTO
La Biotecnología alimentaria aprovecha el desarrollo de la microbiología y la biología
molecular para innovar en la producción de alimentos de calidad. En la producción de
alimentos, ya sea a escala artesanal o industrial, requiere el establecimiento de una serie
de mecanismos de control que garanticen la calidad, la salubridad y la autenticidad de los
productos que llegan al mercado. Algunas de estas nuevas tecnologías moleculares se
pueden emplear en el control de la calidad de los alimentos, como por ejemplo la técnica
llamada reacción en cadena de la polimerasa, utilizada hoy de forma cotidiana en multitud
de áreas, y desde hace unos años en la industria de alimentación para identificar
organismos alterantes o patógenos presentes en cantidades mínimas.
En la industria alimentaria las técnicas moleculares que se usan con mayor frecuencia en
el control de la calidad de alimentos son las técnicas inmunológicas, técnicas basadas en
PCR (Reacción en cadena de la polimerasa), y técnicas basadas en micromatrices de
ADN.
MÉTODOS INMUNOLÓGICOS
Los métodos inmunológicos pueden adoptar varios formatos, pero los más utilizados en el
análisis de alimentos son los ensayos de tipo ELISA (por la sigla en inglés de «enzyme-
linked immunosorbent assay»). Los ensayos ELISA se llevan a cabo normalmente en
placas con decenas de pocillos, lo que permite realizar muchos ensayos
simultáneamente, además de facilitar la automatización del ensayo. En la técnica
conocida como ELISA Sándwich, por ejemplo, un primer anticuerpo se adsorbe
previamente a las paredes de cada pocillo, de modo que al introducir la muestra o
extracto en el pocillo, si ésta contiene el antígeno de interés, aquel quedará retenido.
Después de un lavado para eliminar todo lo que no ha quedado retenido por los
anticuerpos, se añade un segundo anticuerpo, que ha sido previamente marcado. Una de
las formas más habituales de marcaje es unir el anticuerpo a otra proteína que posee
actividad enzimática. En condiciones apropiadas esta actividad enzimática dará lugar a la
formación de un compuesto coloreado o fluorescente fácil de detectar, permitiendo
además estimar la cantidad producida, que se podrá relacionar con la cantidad de
antígeno de la muestra. De esta manera, después de otro lavado para eliminar el
anticuerpo que no ha interaccionado con su antígeno, es posible detectar e incluso
cuantificar (es decir, determinar la cantidad existente) el antígeno de interés.
MÉTODOS BASADOS EN PCR
La enumeración de patógenos transmitidos por alimentos es un aspecto principal del
diagnóstico molecular microbiológico, especialmente si quiere utilizarse para la evaluación
cuantitativa del riesgo. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la técnica de
diagnóstico molecular más ampliamente utilizada debido a su protocolo rápido y de fácil
uso. Por lo general, 2-3 h son necesarias para completar una PCR, pero hoy en día se
están desarrollando sistemas de PCR más avanzados para generar un resultado en
cuestión de minutos.
Existen muchas pruebas de PCR que se han descrito para patógenos relacionados a
alimentos (Salmonella, E. coli O157, L. monocytogenes, Campylobacter y varios otros).
Estas se encuentran disponibles comercialmente (certificado por la FDA y AOAC). Para
Campylobacter spp se han desarrollado distintas investigaciones en alimentos, utilizando
la técnica PCR dirigida a los genes flaA, CadF, ceuE y cdt y la región 16S del ARNr. De
esta manera, una única célula de Campylobacter jejuni en leche y en muestras de agua
(utilizada para el lavado del pollo) fue identificada a través de la PCR, en conjunto con una
técnica de separación inmunomagnética (IMS). El tiempo de ensayo fue de 8 h, sin el
enriquecimiento de la muestra. Una PCR-ELISA fue empleada para la detección de C.
jejuni en muestras de aves de corral. Este ensayo, dirigido al gen ceuE, fue aplicado
directamente sin el paso de enriquecimiento previo, reportándose un límite de detección
de 40 ufc/Ml. Así mismo, se han utilizado pruebas basadas en la PCR para la
identificación de Listeria spp y L. monocytogenes en distintas muestras de alimentos,
leche y productos lácteos.
MÉTODOS BASADOS EN MICROMATRICES DE ADN
Los experimentos con micromatrices son experimentos de hibridación de ADN y tienen su
fundamento en la complementariedad entre las bases nitrogenadas. La micromatriz
contiene cientos o miles de clases diferentes de moléculas de ADN, todas ellas de
secuencia conocida y localizadas en posiciones claramente identificadas. Al realizar un
experimento de hibridación, los ácidos nucleicos de la muestra que se pretende analizar,
que han sido previamente marcados con una molécula fluorescente, quedarán retenidos
en todas aquellas posiciones de la micromatriz en las que haya moléculas de ADN con la
secuencia complementaria.
En el análisis de alimentos, las micromatrices aportan la ventaja de poder determinar la
presencia de material procedente de un número muy elevado de especies diferentes. Así,
por ejemplo se ha desarrollado ya un sistema comercial capaz de identificar, en una
muestra de alimento, si ésta contiene carne de hasta 33 especies diferentes de
vertebrados. En el campo de la microbiología de alimentos se están desarrollando
micromatrices que permiten detectar decenas de patógenos alimentarios (y otros) en un
único ensayo. Pero además, los sistemas de detección de microorganismos basados en
micromatrices pueden proporcionar información sobre la presencia de factores concretos
de virulencia, información que puede ser muy relevante para estimar el riesgo potencial
asociado a determinados alimentos, ya que no todos los microorganismos de la misma
especie son igualmente peligrosos, ya que la diferencia radica a veces en la presencia o
expresión de determinados genes conocidos como factores de virulencia.
Existen otros métodos moleculares utilizados para el control de la calidad alimentaria
como Electroforesis en gel de campo pulsado, técnica de FISH, Biosensores,
Microarreglos, Pirosecuenciación 454, que es una nueva herramienta para la detección de
patógenos en alimentos y medioambiente.
Las técnicas de diagnóstico molecular representan una alternativa prometedora en el
campo de los alimentos, debido a su rapidez, elevada sensibilidad y eficiencia para la
detección temprana de microorganismos patógenos. Por ello, el número de métodos
moleculares con potencial utilidad en el área de microbiología de alimentos se ha ido
incrementando y diversificando, cada uno con sus respectivas fortalezas y debilidades, las
cuales deben tomarse en cuenta a la hora de cumplir con los objetivos planteados. La
PCR destaca como el método de diagnóstico molecular más aplicado en el área de
alimentos y, recientemente, variaciones de este, como la PCR en tiempo real, han
sumado ventajas adicionales a esta técnica, entre las que se destaca una mayor
velocidad en la obtención de resultados.
BIOLOGÍA MOLECULAR Y MEJORAMIENTO EN LA PRODUCCIÓN ANIMAL
El objetivo de utilizar biotecnologías ganaderas en el área de la reproducción animal está
dirigido a intensificar el mejoramiento y la multiplicación de razas e individuos de calidad
genética superiores, que conlleve a un incremento en el progreso genético de la especie o
raza en cuestión. El empleo de técnicas moleculares permite la selección temprana y
específica de individuos superiores, la introducción rápida de genes beneficiosos en una
población particular y el mejoramiento genético basado en la selección de genes. Con el
uso de estas herramientas se puede comprobar la eficiencia de las técnicas de
reproducción, pues permiten verificar la efectividad de las pruebas de progenie y así como
la identificación de los individuos según su huella genética. Pueden utilizarse marcadores
moleculares del ADN para el mejoramiento genético, por medio de la selección con ayuda
de marcadores situados junto a los genes de interés, así como para caracterizar y
conservar los recursos zoogenéticos, con mucho éxito a través de la fertilización o
producción de embriones in vitro, y la clonación por transferencia nuclear. Además, el
desarrollo relativamente reciente de marcadores moleculares combinados con la
bioinformática, ha abierto la posibilidad de la identificación de la variación genómica así
como de genes mayores para el mejoramiento genético del ganado.
El mejoramiento genético implica la obtención de individuos más productivos que sus
progenitores, más resistentes a enfermedades o más tolerantes a condiciones
ambientales extremas, todo lo cual depende del objetivo trazado. Aquí los marcadores
moleculares constituyen una herramienta moderna y poderosa, que aportan información
valiosa sobre la estructura genómica de las diferentes especies y permiten conocer con
exactitud la localización de genes controladores de caracteres de interés para la
selección, por lo que se convierten en una herramienta fundamental para el análisis de
genotipos y la selección de los mejores individuos. A través de la biotecnología se pueden
caracterizar las poblaciones ganaderas y determinar los indicadores poblacionales de
interés (ej. estructura genética, índices de consanguinidad, distancias genéticas, etc.), que
constituyen la base para la realización de estudios de manejo y conservación de recursos
zoogenéticos.
En la actualidad se cuenta con marcadores genéticos confiables que son útiles para la
genotipificación y la detección de los individuos que son portadores de genes benéficos y
que son más productivos, a continuación se muestra una tabla donde se plasman algunos
ejemplos de marcadores moleculares que se encuentran disponibles en el mercado.
La selección animal asistida por marcadores moleculares o genéticos es factible de
aplicar en aquellas explotaciones comerciales dedicadas a la producción animal, por otro
lado las herramientas moleculares contribuyen significativamente al aumento en la
producción animal y brinda posibles soluciones a diferentes tipos de efectos
medioambientales adversos y enfermedades que puedan afectar la producción en el
sector pecuario.
BIBLIOGRAFÍA

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