Compilado Genética
Compilado Genética
Compilado Genética
Toda esta tecnología de DNA recombinante tiene que ver con que se tenga la capacidad
de poder aislar el DNA, purificarlo, identificarlo y poder recombinar y amplificar estos
genes. Para expresar se puede usar el mismo huésped de donde es el DNA o en un
huésped que sea heterologo (que sea distinto).
Por ejemplo si uno tomara un genoma humano uno podría virtualmente expresarlo en un
sistema bacteriano. A esto se refiere cuando dice a un huésped homologo o heterologo.
Homologo cuando coincide con el mismo organismo donde se crearon estos genes y
heterologo cuando se utiliza otro organismo.
(3)
com ose procede a esto.
A ese procedimiento uno normalmente lo que esta haciendo es clonación, y la clonación
a la que nos vamos a referir es una clonación de genes.
Ese procedimiento requiere de etapas.
1. Purificar y obtener este DNA. de buena calidad, ojala obtener DNA no
fragmentado y degradado, tener un DNA limpio sin proteínas ni otras moléculas.
una vez obtenido este DNA
2. Obtención de moléculas de DNA recombinantes. si queremos manipular este
DNA hay que hacerlo a través de poder cortar estas moléculas y unirlas con otra
molécula de DNA a través de un diseño prefijado. Una vez que tenemos esa
combinación de genes nuevos tenemos que introducir ese DNA a la célula.
3. Introducción del DNA a la célula. Hay que tener un buen método para que esto
ocurra. Hay que tener en cuenta que no todas las células recibirán este DNA por
eso hay que saber cuales lo reciben y cuales no. Una ve que tengamos algún
procedimiento para introducir el DNA debemos llegar a la etapa de
4. Selección de clones de interés. Donde hay que ver cual es la célula que tiene el
DNA que nosotros queremos.
(4)
Veremos como obtener este DNA híbrido.
Para obtener moléculas de DNA recombinantes se debemos usar los siguientes métodos
1. cortar, cortar secuencias que son específicas, no se corta en cualquier parte. Una vez
que esas secuencias están en fragmentos hay que
2. pegar, ver que estos fragmentos se puedan unir en una molécula continua.
3. copiar, una vez que tengamos esa molécula continua de DNA la célula debe copiar en
las células muchas veces.
Aquí tenemos las funciones básicas para obtener moléculas de DNA recombinantes.
(5)
¿Cómo cortar el DNA?
El DNA se puede cortar de muchas maneras. Hay buenas y malas
maneras, a que se refiere con esto a que por ejemplo si se aísla el
DNA el procedimiento de purificación hace que este se rompa por
fractura mecánica.
También se puede tratar con DNasas, que no tiene una
especificidad en el corte por lo tanto cada vez que se hagan estos
cortes tendremos fragmentos que no serán reproducibles. Por lo tanto este
procedimiento no nos sirve.
Una forma de hacerlo en utilizando enzimas que también son endonucleasas como las
enzimas de Restricción. En la metodología del DNA recombinantes para hacer cortes
específicos depende de la utilización de este tipo de enzimas por que los cortes que
realizan estas enzimas son en ciertas regiones definidas dentro de la molécula. El corte
lo hace reconociendo una secuencia, entonces si el DNA tiene la secuencia de
reconocimiento la enzima va a cortar a ese DNA y por lo tanto obtendremos fragmentos
reproducibles.
(6)
Estas enzimas que se llaman en forma genérica enzimas de restricción son
endonucleasas.
En el cuadro se ve una secuencia que tiene
una particularidad donde tenemos la primera
endonucleasa descrita que fue EcoRI.
Se ve esta secuencia
CAATTC
GTTAAG
Esta secuencia tiene una simetría de rotación y esta es la que se reconoce para cortar, el
corte es siempre en la misma posición dentro de esa secuencia.
El corte será donde se indica en las flechas, entre G y A. entonces cada vez que
tengamos esta secuencia tendremos un corte en el DNA.
La enzima de restricción corta en enlace.
Estas enzimas de restricción se caracterizan por que reconocen estas secuencias, pero
estas enzimas tienen una función dentro de la célula.
Para la célula esta enzima esta en una parte de una función que se llama Restricción-
Modificación. Primero que todo, ya se dijo que estas endonucleasas son sitios
especifico, que formen parte del sistema Restricción-Modificación significa que;
supongamos una bacteria de E. coli que tiene su genoma que produce esta enzima
EcoRI pero no cortan su propio DNA por que tienen un sistema de protección que se
llama Modificación. La bacteria modifica la secuencia de su DNa y la modifica
poniendo un grupo metilo en la secuencia, metila a esta adenina y al metilar ya no puede
ser cortado este DNA. El DNA que entra a la bacteria no esta metilado y por lo tanto lo
puede cortar.
La función de Modificación y de restricción están en la misma molécula, una parte de la
enzima hace modificación y otra parte la de restricción. Este es un problema para las
empresas que venden esta enzima, uno necesita que estas funciones estén separadas. Las
enzimas que se usan para este sistemas de DNA recombinantes tienen enzimas de
restricción en las cual las dos funciones (metilacion (modificación) y restricción) están
separadas. Lo que a uno le venden en un catalogo de enzimas en la función de
restricción.
¿es la misma enzima? No son dos distintas que forman parte del mismo sistema.
Una tiene actividad de endonucleasas y la otra la actividad de metilasa, juntas son el
sistema de Restricción-Modificación.
Estas enzimas son conocidas como enzimas de tipo II y son las mas útiles en sistemas
de trabajar de DNA recombinantes porque las dos funciones están separadas en
moléculas distintas y se pueden purificar independientemente una de la otra.
(7-8-9)
Entonces la enzima una vez que reconoce la secuencia la corta en dos sitios, el
DNA se separa y quedan dos colitas de hebra simple una para cada hebra. Estas
colitas son complementarias y son los que se llamas terminales pegajosos o
cohesivos.
Así que no solamente produce un corte específico sino que además produce un
Terminal cohesivo. Generalmente reconocen secuencias entre 4 a 8 pares de bases.
Vemos en el cuadro unos ejemplos de enzimas donde
cada enzima siempre reconoce el mismo número pares de
bases y cortan siempre en el mismo lugar (indicado en la
figura con flechas). Todas estas secuencias tienen una
simetría rotacional.
Una cosa que puede ocurrir es que cuando se tienen dos enzimas por
ejemplo SmaI y Xma I que reconocen la misma secuencia pero hacen
cortes distintos se le llaman isoesquizomeros.
También puede ocurrir que se produzca un extremo compatible, en este
ejemplo dos secuencias que no son idénticas. Si cortamos con enzimas
distintas cortaran en lugares distintos pero si nos fijamos en los
nucleótidos que hay en el medio vemos que son iguales, entonces estas
dos enzimas dejaran las mismas colas al cortar y si vemos el detalle nos
daremos cuenta que estos extremos se pueden pegar o son compatibles.
(10)
Ahora vamos a pegar el DNA cortado.
Tenemos dos situaciones, moléculas lineales. Una molécula A y
otra molécula B. tenemos el sitio de reconocimiento para una
enzima de restricción, las dos moléculas deben tener la misma
enzima de restricción por que si no es así no serán compatibles,
se forman los extremos pegajosos o compatibles. Y ahora, en el
tubo de ensayo se podrá hibridar, se podrán pegar. Estos
extremos no están unidos covalentemente, para poder sellar hay
que ligar con la DNA ligasa y ahí tendremos unido covalentemente esas dos moléculas
de DNA. Hay que dejar a estas dos moléculas para que se formen los puentes de
hidrogeno y se pueda sellar, para luego tener el
recombinante.
(11)
Copiar el DNA significa hacer varias copias de las secuencia.
Habíamos hablado que un DNA dentro de la célula tiene ciertas señales para que se
replique. La manera de que tenga estas señales el DNA que queremos copiar varias
veces conviene colocarle un vector que es una molécula que para el caso de este
ejemplo en una molécula circula, insertarle ahí el DNA de interés. Este vector de interés
puede ser un plasmidio, el plasmidio es un replicon por lo que cualquier cosa que lleve
este plasmidio se va a replicar.
Es importante saber como elegir estos vectores. Estos vectores deben tener la
particularidad de llevar y amplificar, replicarse y replicar el DNA que llevan. Y este
DNA que llevan es un DNA exógeno a este vector y a la célula.
Este vector puede ser plasmidios, fago o virus, o también recombinaciones (mezclas
entre fagos y plasmidios) que estén funcionando como vector.
(12)
Veremos el protocolo genérico, es la forma en la cual uno debería
trabajar.
Debemos tener nuestro DNA, y queremos hacer clones de mi DNA de
interés para eso lo corto con una enzima de restricción y lo inserto en un
vector. Para insertarlo con la misma enzima de restricción y colocarlo en
el mismo tubo de ensayo.
(13)
Aquí tenemos lo que estaría sucediendo exitosamente, tenemos el
vector (azul y nuestra secuencia que queremos insertar. Vemos
los extremos compatibles de hebra simple donde ocurrirá la
hibridación molecular.
Esto es la Reacción de ligamiento. Tiene una particularidad la
reacción de ligamento, es que de partida se necesita la enzima
para que liguen estos sitios. Para que esto ocurra se debe poner
en muy bajas temperatura para favorecer el ligamiento, la
temperatura se baja de tal forma que la enzima aun este
funcional (10-12ºC).
(14)
Ahora veremos como no se recirculariza el vector, lo que
se hace es que al vector se trata con una fosfataza para
evitar que se recircularse. Se les saca los extremos 5
prima fosfatos con una fosfatasa y queda como grupos
OH.
Una vez que el DNA esta pegado a un vector hay que como ingresa este vector a la
célula.
(15)
Ahora como entra el DNA recombinante a la célula. Nosotros tenemos
nuestro vector recombinante con el DNA exógeno que queremos
replicar. Tenemos plasmidios y células competentes a las cuales vamos a
introducir este plasmidio. Pero estas células son competentes artificiales.
Una forma de introducir este DNA es mediante un shock térmico
durante un par de minutos y el DNA entraba.
Ahora lo que más se usa es la electroporacion. Se le da un pulso
eléctrico que permite reorientar las moléculas y cuando se reorientan se
producen poros en la membrana por donde penden entrar estos DNA.
Entonces estas mezclas de ligamientos se ponen en contacto con la
célula competente y lo que uno espera que en algunas de estas células
ingrese este DNA.
Ahora el siguiente desafió es que pasa cuando tenemos células donde
han ingresado el plasmidio pero este no tienen el inserto que yo quiero
replicar. Hay que ser capaces de reconocer cuales tienen el inserto y
cuales no.
(16)
En eucariótico como tenemos células más grandes se puede ingresar
el DNA a través de un campo eléctrico, mediante una micro
inyección. También se pueden bombardear las células en que
tenemos micro esferas que se recubren con DNA.
Estos métodos por lo general están hechos para eucariontes, en
bacterias lo que se da generalmente es la electroporacion.
(17)
Cuando el DNA entra se utiliza el vector con un gen que permita rastrearlo en aquellas
células que lo tienen, por ejemplo rastrearlo mediante un gen de resistencia a algún
antibiótico. Aquellas células que integraron el plasmidio llevaran la resistencia al
antibiótico y las otras como no lo tienen morirá.
Tengo que ver donde puedo colocar el inserto, aquí juegan un rol importante los sitios
de restricción. A mi me convienen tener solo un sitio de restricción en el vector pero
tengo que ver como sigo estos sitios y ver cual tiene el inserto.
Por ejemplo si tenemos un plasmidio en el cual tenga dos resistencia por ejemplo a
ampiciliona y a tetraciclina. La célula que no lleva vector será sensible. Por lo tanto si
pongo a las dos células con antibióticos me deshago de las que no tengan el vector.
Entonces si yo tengo las dos resistencias y pongo el inserto entremedio del gen de la
tetracilcina ya no se podrá expresar esta resistencia y por lo tanto tendré que esta
bacteria será resistente a ampicilina pero como tengo el inserto de DNA en el gen de
tetracilcina será tetraciclina sensible, de esta forma las podré seleccionar.
Si pongo las cepas en medio mínimo con ampicilina tendré todas las cepas que tienen el
vector integrado junto con el DNA. En la segunda placa yo pongo a crecer en medio
mínimo junto a ampicilina y además junto a tetraciclina y encuentro todas las células
que son resistente a tetraciclina, si embargo yo quiero encontrar las células que tienen
integrado el vector y en el cual el gen que yo integre este entre el gen de tetraciclina y
por lo tanto no lo este expresando. Así que la colonia que me crezca en la palca 2 no me
sirve. Pero como yo ya conozco las células que no integraron el gen de DNA entre la
tetracilcina yo selecciono ahora las que no crecieron en la placa 2 y las pongo en un
medio mínimo con ampicilina y esas serán las que tienen el gen que yo quería integrar.
Placa 2 Placa 3
Placa 1
Los círculos son las colonias que crecieron, los círculos con una barra no las colonias
que no crecieron.
Los palsmidios que interesan son los que son pequeños. Estos
plasmidios pueden entrar por conjugación o por transformación.
Casi todo el DNA recombinante entra por transformación.
(20)
Aquí tenemos un plasmidio llamado pUC18/19. El tamaño es
pequeño. Mientras más pequeño es mucho más fácil de manipular. Tenemos el ori y un
gen de resistencia y un fragmento de DNA lacZ . Este gen expresa β-galactosidasa,
además en el inicio del gen hay una regio azul que es un sitio de clonación múltiple, este
pedazo se a colocado para que tenga sitios de restricción para muchas enzimas y estos
sitios sean únicos.
22) Además de los plasmidios se pueden usar otros vectores y estos pueden ser
bacteriófagos. Se ejemplificara esto con el fago lamda. El fago lamda posee una cabeza
icosaedrica una cola y “patitas”. El fago lo que hace es que infecta a coli, inyectando el
DNA en la bacteria y este posteriormente puede seguir el ciclo litico o el ciclo
lisogénico, el cual es un sistema que involucra a los genes del DNA viral. Este es un
genoma bastante grande comparado con algunos plasmidios vistos en la clase (este
posee alrededor de 50kb).
Vamos a ver como se genera este vector desde el bacteriófago lamba. Lo que se quiere
en esta clase es que ese entienda como es el ciclo, no en sus particularidades, sino que
ver que propiedades hacen que este bacteriófago sirva como vector.
23) Este es el genoma de lamba y la zona marcada dice cos. Cuando el fago infecta a la
celula, el DNA que esta al interior de la cabeza del fago es lineal, dentro de la cápside;
cuando ingresa a la célula, posee extremos cohesivos, por lo cual se circularías, y esto se
completa; a esto se les llaman sitios cos, los cuales son secuencias complementarias los
cuales permiten la circularizacion del fago. Nos interesa en esta clase ver el ciclo lítico.
Este fago va a replicar y cuando replique este genoma va a hacerlo mediante el modelo
del circulo rodante y se van a hacer muchas copias en forma de concatemeros
(secuencia genomicas completas juntas, con sitios cos en los extremos y separando las
repeticiones). Cuando el genoma viral se empaqueta en al cápside en el ciclo lítico ¿que
es lo que reconoce para saber que ingreso un genoma completo? R= reconoce el sitio
cos, el cual posee una endonucleasa que corta. Después que se completa la cabeza se le
agrega la cola. Reflexionemos; ¿que es lo que reconoce el fago para encapsidar el DNA
viral? R= el sitio cos, nada mas. Esa es una posibilidad de usar un vector a partir de
sitios cos. También se podría usar el fago lamba en su forma lineal. El sito cos es solo
un sitio de corte, ni siquiera es el sitio por donde se inserta el fago. Supongamos que
usaremos este vector como vector de clonación, este es un fago lineal (en la actualidad
no se usa).
Se puede insertar un fragmento de DNA en el DNA viral. Lo que se hacia es que este
DNA se insertaba en la parte medial, este es un DNA lineal que posee un extremo
derecho y uno izquierdo y estos se proporcionaron por separado (uno estaba hecho y el
otro fue agregado artificialmente).El DNA para ingresar a la cápside posee una
limitación de tamaño. Entonces lo que se hacia es que mirando el genoma, y lo que se
hacia era reemplazar los genes líticos por el segmento genómico que uno quería agregar.
Uno podría hacer algo mejor: reemplazar todo el genoma, dejando solo los sitios cos, lo
cual es relevante para la encapsidacion.
26, 27)Cosmidios: segmento genómico con sitios cos. Es un plasmidio pequeño que
posee un origen de replicación. Uno puede realizar enpaquetamiento de DNA in Vitro,
poseyendo todos los componentes estructurales virales. Esto posee una enorme ventaja
para hacer una librería genética, porque aquí hay una gran cantidad de DNA que puede
ser incorporado en estos sistemas. Aquí esta lo del sitio cos. Se muestra el empaque en
condiciones naturales e in Vitro. En condiciones naturales, el fago hace una precabeza
abierta para ingresar el DNA, hace la cola,( partes) y las patitas. Por lo tanto existe un
sistema de ensamblaje para tener el genoma completo. Si tengo el DNA las cabezas y la
enzima que ingresa el DNA a la cabeza ¿que DNA se va a empacar? R= Aquel que
posea los sitios cos a una cierta distancia que sea la distancia a la cual originalmente se
encontraba en el fago y con eso se puede empacar cualquier DNA.
Se tienen los sitios cos, este es un cosmidio con un inserto de DNA aquí y un cosmidio
en el otro extremo (bastaría solo con tener los sitios cos), y se encapsida al interior del
fago y ahora este fago infecta a la célula y para infectar lo único que necesita es tener la
estructura necesaria. Adentro el DNA lineal se circularíza ya que posee extremos
cohesivos cos y se comienza a replicar. Cada uno de estos fagos va a recibir un clon
distinto y va a concebir un clon diferente. Nosotros podemos encontrar colonias
resistentes a un antibiótico (ej tetraciclina) que poseen muchos plasmidios. Todas las
células que son resistentes a tetraciclina poseen el inserto.
28) Lo que se tiene aquí son los tamaños del genoma haploide desde las bacterias hasta
los mamíferos. Se ve que para hacer genotecas se necesitan mas clones en los
genomas de mamíferos, los genomas de bacterias necesitan menos clones. Depende del
vector la cantidad de inserto que puede soportar el sistema.
Un plasmidio convencional puede aceptar tamaños mas grandes de DNA ≈ 90kb, pero
va tender a ser menos eficiente cuando uno haga una genoteca.
Se muestran los rangos de tamaño de segmentos de genoma que acepta cada plasmidio.
Aquí están los cosmidios, “los YAC”: vectores que soportan cantidades mucho mas
grandes de DNA, son plasmidios, en realidad son cromosomas artificiales de levadura,
pero derivados de plasmidios de levadura.
29) Entonces como uno construye una genoteca representativa? R= Este es el genoma,
ustedes lo fraccionan y lo insertan en un vector, se inserta a la célula y se espera que las
colonias que crecen tendrán inserto el plasmidio con el segmento de interés, cada una de
las colonias va a representar un clon con una de estas moléculas recombinantes. Si este
genoma es muy grande se necesitaran muchos clones. Depende del tamaño del genoma
(del inserto) el numero de clones que se va a necesitar (mas pequeño-mas clones).Uno
puede hacer una estimación de cuantos clones necesita para que sea exitoso. Se puede
dar el caso que uno tenga la gran mayoría de la genoteca en clones pero no tener el gen
de interés (ej. si son genes de una sola copia, puede que no estén en algún clon). Hay
métodos para hacer que esto resulte.
30) Esta es una formula que nos dice cuanto clones se necesitan para poder realizar una
genoteca que sea representativa, y la mejor probabilidad con la que puedo encontrar un
gen es XXXX. Por lo tanto yo me impongo esa condición para saber cuantos clones se
necesitan para realizar la genoteca. Esto también depende del fragmento que voy a
clonar, si es un fragmento pequeño necesita muchos clones, y depende del tamaño del
genoma que voy a clonar, si voy a hacer la genoteca de un genoma muy grande se
necesitaran mas clones y si el genoma es pequeño se necesitaran menos clones. Por lo
tanto se necesita conocer el tamaño del genoma y el tamaño del inserto promedio.
31)Que mas se necesita para realizar esta clonación?. Cuando uno quiere clonar un gen
de interes, un gen especifico ej. De una cierta ruta metabólica de un cierto genoma.
Hay dos posibilidades: una es que se hace la genoteca y se busca el gen de interes y otra
es buscar otra alternativa para obtener el gen de interes. Se pueden hacer fragmentos
genómicos a partir de productos de PCR. En es casop de la genoteca, se puede hacer una
sonda la cual se inserta en los distintos clones y ver cual de ellas se encuentra el gen de
interés, pero para hacer esto se necesita conocer algo del gen. Para saber algo se buscan
genes homólogos u ortólogos en las bases de datos existentes por alineamiento (se
buscan secuencias compartidas por linajes distintos). También se podría buscar un gen
que se estuviese expresando en una célula de forma magnificada. (Gran cantidad de
mensajero). Cuando son genes de una copia la célula puede hacer que estos magnifiquen
su expresión. Por lo cual uno puede hacer un cDNA que es complementaria a esa copia,
y con eso se tiene el gen
32) Se pueden hacer cortes con enzimas de restricción de lo que a uno le interesa, y no
hacer un tratamiento de corte inespecífico. Se corre un gel (ver figura) y se ven las
bandas. El DNA debe estar bien arriba comparado a los marcadores de peso molecular.
En las bandas se ve DNA lineal.
Para poder aislar no se puede tomar todo lo que se clono, ya que lo que se va a obtener
son fragmentos pequeños y estos se van a insertar eficientemente en sus plasmidios,
estos plasmidios van a transformar en la bacteria y vamos a tener una colección de
fragmentos chicos. Entonces hay que deshacerse del plasmidio; lo que se hace es extraer
el fragmento y sacar del gel el fragmento que le interesa (se selecciona por tamaño).
33)Si por el contrario se tiene información del gen y se pueden realizar partidores, uno
puede hacer PCR. Se tiene partidor forward (directo) y reverse (inverso) para poder
amplificar esto, que es la zona que flanquean los partidores, como resultado se tendrán
muchas copias de este gen. Se tiene una forma distinta de copiar, ya que se esta
amplificando selectivamente una región del genoma, pero esta región solo puede ser
mantenida en el tiempo en una bacteria.
36) Esto se puede clonar, para lo cual estas deben poseer terminales y si no tienen se le
ponen los terminales para clonarlo en un vector especifico (colocarle colas de poli A y
al vector colocarle en sus extremos lo complementario a esto para que se una el
fragmento al vector y asi poder clonarlo), o se puede colocar una DNA transferasa la
cual va adicionando nucleotidos, generando una cola. Otra cosa es agregarle al cDNA
en los extremos algo que se conoce como linker (los bloques que se ven en la figura).
Son secuencias muy cortas donde adentro de esto esta la secuencia de reconocimiento
de una enzima de restricción, estas se adhieren a los extremos con DNAligasa, esta es
capaz de catalizar el alineamiento de moléculas romo, se pueden pegar 1,2 3.. etc.
Pero cuando esto lo digieren con la enzima de restricción, nos vamos a quedar con lo
que quedo ligado, lo demás se digiere. Con esto se logra tener un fragmento de DNA
con los extremos cohesivos para insertarse en un vector. Porque s bueno obtener el
cDNA?= no solo porque uno puede obtener el mensajero, ej. Si se tiene un gen
eucariótico el cual se quiere clonar en una bacteria, la bacteria hay cosas que no hace,
no puede procesar el gen, si se coloca un gen que posee intrones, no se puede procesar,
por lo cual es bueno colocar el cDNA ya que con esto se tiene a la vez el mensajero
procesado, con lo cual se obtendrá un producto génico funcional.
37) Como se selecciona, se tiene que conocer algo de la secuencia especifica, con lo
cual se puede hibridar inmediatamente el gen y detectarlo en clones. Si se coloca el
segmento de DNA en un vector de expresión, se puede replicar, transcribir y obtener un
producto genico del gen. Al tener la proteína se puede utilizar un anticuerpo o antisuero
específico (monoclonal o policlonal, este ultimo reconoce el producto génico) ó se
puede realizar una complementación. Supongamos que buscamos un gen de leucina, lo
tenemos clonado (eso es lo que se cree) y yo ahora tengo mi celula, muchas celulas con
muchos plasmidios y uno de ellos posee el gen de leucina (es una genoteca), nosotros
debemos seleccionar esto, o sea, identificar el clon. Entonces se transforma esta célula,
pero a esta celula se le hace el siguiente supuesto: que este gen es capaz de expresarse al
interior de este huésped. Si se coloca esto en un medio sin leucina uno ve que si esto
complementa, esto crece, si esto no complementa porque tiene eso entonces no va a
crecer. Lo que se esta haciendo aquí es que el producto génico que esta aquí
complementa la función deficiente que acá esta mutada. Esta es otra manera de poder
seguir estos clones. Si eso no ocurre, si yo no tengo esta construcción, yo podría seguir
porque el producto génico igual se va a formar acá, y voy a tener en alguna parte una
proteína, a la cual puedo rastrear. El gen, si solamente se replica y no se expresa, puedo
rastrear la proteína si se expresa, os i tengo la suerte de que ocurra la complementacion,
aunque se deben hacer las pruebas para ver si esto ocurre.
38)Ustedes tienen aquí las colonias, los clones, cada uno formando una colonia en una
placa, entonces uno hace una copia de eso en una membrana, vale decir, se coloca la
membrana arriba y se transfiere, con tal que la colonia quede pegada y luego uno la lisa,
transferida, y se filtra el DNA. Por lo tanto se tiene el DNA fijo a la membrana y uno lo
que hace es realizar una prueba radioactiva (una sonda de DNA, por lo cual previamente
se conoce algo de la secuencia que uno busca). Uno espera que la sonda se pegue al
DNA, por lo cual previamente debo desnaturalizar el DNA para dejarlo de hebra simple
para que asi sea reconocido por la sonda. La sonda buscara el sitio con el cual ella
hibridiza. Se lava todo lo que no se haya pegado y lo voy a poner sobre una placa de
radiografía, para que me deje una marca (ya que son isótopos radioactivos) para asi
saber en que colonia se encuentra la secuencia que busco (se coloca un punto de
referencia en la placa radiográfica, para saber que es qué y compara con el original).
39) Supongamos que esto se expresa, uno toma el mensajero o el DNA total, uno hace
un gel con el RNA con el DNA, este gel se transfiere a una membrana de nylon, se fija,
y ahora en vez de colocar ese molde que se tenia equivalente en la placa, se coloca la
copia que tenia el primer gel, se incuba con la sonda radioactiva, el cual se va a unir
solo a un sector de este gel, por lo tanto en esa colonia se va a estar expresando el gen
(si se hace sonda de RNA) o va a estar presente el gen (si se hace sonda de DNA). Si se
hace el tratamiento con DNA el Sourthen Blot y si es con RNA Northen blot. También
existe el Western blot para el caso de las proteínas.
40) Se puede hacer la replica de los clones en una placa en una membrana, se va a
romper las células y después incubar con un anticuerpo para saber donde se expresa una
proteína en particular. Y la unión del anticuerpo a una colonia va a ser observada por un
ensayo enzimático o por fluorescencia.
44) Secuenciamiento: Antes se hacia con dideoxinucleotidos para las cuatro bases (A-
G-T-C), los cuales al agregarse se detenía la reacción de replicación con lo cual uno
hace un mapa para saber que nucleotido se agrego en una posición.
45 y 46) Ahora lo que se puede hacer son cuatro reacciones en uno utilizando
terminadores marcados por fluorescencia ( nucleotidos A-T-C-G marcados
fluorescentemente), cada fragmento terminal lo que va a poseer es un color, que es la
fluorescencia que tiene en el nucleotido terminador fluorescente, entonces lo que se
hace es medir con el láser el cual lo que ve es la fluorescencia y a medida que va
corriendo va viendo tamaño. La diferencia es que detecta la diferencia entre una base y
otra, cosa que no es capaz de detectar un gel, que también es una electroforesis.
Transposones
1-Se observan los pétalos manchados y
también granos de maíz con fenotipo
moteado. También es posible ver un placa
de con E. coli en la cual la mitad de las
colonias tienen un color y la otra mitad tiene
otro diferente. Así estos fenotipos peculiares
son producidos por un tipo de
recombinación especial, diferente a la que
ya hemos visto (recomb. Homologa). Estos
fenotipos se deben a una recombinación
sitio específico, que la diferencia de la
recomb. Homologa, puede ocurrir por ejemplo tanto en cepas Rec A+ como en cepas Rec A- por
lo cual esta recombinación sitio especifica es independiente de Rec A. Así esta recombinación
puede ocurrir incluso en cepas que están privadas de poder hacer recombinación homologa.
Los elementos responsables de esta recombinación son los llamados elementos genéticos
transponibles (EGT), dentro de los cuales encontramos por ejemplo las secuencias de
inserción y también los transposones. Los EGT primero se conocían como “genes saltadores”.
4- La transposición comenzó a ser descrita en la mitad del siglo pasado por Barbara
McClintock. Ella trabajo con granos de maíz con fenotipo moteado (foto). Al comienzo no le
creyeron el hecho de que existieran genes saltadores razón por la cual gano el Nobel muchos
años después cuando se confirmo que era cierto. Sus estudios se basaron en las típicas
proporciones en las descendencias, viendo los patrones de herencia obtenidos de los
respectivos cruces, llegando a la conclusión de que los genes encargados para ese fenotipo
tenían la capacidad de saltar por el genoma.
6-¿Qué experimentos se
deben hacer para
demostrar que realmente
estas mutaciones se deben
a la inserción de piezas
discretas de DNA? Si ocurrió
una inserción de segmentos
de DNA en un DNA blanco,
uno esperaría que este DNA
con la mutación
desconocida aumentara su
tamaño o complejidad en
comparación al DNA no
mutado. Así el grupo de
investigadores de los que
hablábamos recién, estudiaron esto trabajando con mutaciones en el operon gal para lograr
demostrar la existencia de los EGP en estas mutaciones. Entonces ellos tenían varias cepas con
distintas mutaciones en el operon gal (S101, S104, etc), las que eran sospechosas de ser
mutantes causadas por transposición ya que reunían todas las características que vimos en la
diapo 5. Lo primero que hicieron fue construir un bacteriófago transductor (capaz de
insertarse en un genoma blanco y luego escindir y llevarse parte del genoma bacteriano). Este
bacteriófago posee el operon gal silvestre y se denomino λdgal+. Entonces lo que se hizo fue
infectar con este fago, bacterias que presentaban la mutación en operon gal (E coli gal-). De
este modo si la mutación de esta bacteria gal- era causada por los EGT, se esperaría que el fago
λdgal+ con el que infectamos esa célula, tenga ahora un genotipo E coli gal-/ λdgal-, es decir,
la bacteria gal- le traspaso la mutación al fago λdgal+, o mejor dicho, le traspaso ese gen
“saltarin”, lo que demostraría la presencia de estos EGT como causantes de la mutación. Para
demostrar esto se hicieron análisis del tamaño o complejidad del DNA del λdgal-,
comparándolo con el fago λdgal+ (parental), encontrando que el λdgal- es de mayor tamaño
que el λdgal+. Para esto se tomaron ambos tipos de fagos y se centrifugaron en una gradiente
de cloruro de cesio y luego se compararon las densidades de los respectivos genomas (como se
ve en el grafico de patrón de bandeo) observando que el fago λdgal- es más denso que el fago
parental. Esto permitió demostrar que el fago λdgal- adquirió una pieza de DNA. A la vez se
hizo otra prueba para comprobar esto, la que consistió en tomar el fago λdgal+ y mutarlo con
luz UV, pero al realizar las pruebas de densidades de DNA del mutante obtenido, se observo
que el DNA de este tiene la misma densidad que el DNA del fago parental. Esto demostró que
la mutación que se estudiaba no era causada por múgatenos. En cambio cuando se ponía el
fago λdgal+ con las bacterias con las mutaciones S101, S104,etc los fagos mutantes obtenidos
si presentaban el cambio de densidad en su DNA lo que da más apoyo a la idea de la existencia
de los EGP. La última prueba realizada fue la de usar revertantes para el fago λdgal- ,
obteniendo densidades de DNA que bandearon igual que los parentales. Todas estas pruebas
permitieron concluir con total certeza que las mutaciones en las cepas de E coli S101, S104,
etc eran provocadas por la presencia de EGS.
7- ¿Cómo se puede hacer para lograr diferenciar ese segmento de DNA insertado causante de
la mutación? Se hace VIENDO,
con el uso de la microscopia
electrónica. Lo que se hizo fue
aislar el DNA del fago parental
λdgal+ y también del fago con
el supuesto EGT, el fago λdgal-
. Se separan sus hebras de
DNA y luego se permite que
los DNA se reasocien
formando en muchos casos “heteroduplex” (DNA doble hebra hibrido con una hebra del fago
λdgal+ y con la otra hebra del fago λdgal-). Cuando se formaban estos heteroduplex se
observaba la formación de un loop en el DNA, lo cual indicaba claramente la presencia de la
pieza de DNA transponible. Luego se hizo la misma prueba pero ahora con el fago parental
λdgal+ con fagos mutados con luz UV, pero los heteroduplex obtenidos no presentaban el
loop. Otro experimento fue hacer una transcripción in vitro, para lo cual se toma el DNA del
fago λdgal- y se permite su transcripción, obteniendo su RNA el cual sólo hibridaba con el DNA
λdgal- y no con λdgal+. Posteriormente a estos EGT causantes de estas mutaciones se les
denomino secuencias de insercion (IS) que eran diferentes para cada mutación.
8- Las IS se pueden insertar en una dirección o también en la otra. ¿Cómo demostrar que esta
inserción es independiente de la orientación? Para esto se toma el DNA del fago λdgal- y se
desnatura. Luego se toma otro DNA de otro fago λdgal- el cual se sospecha que tiene la IS pero
en la otra dirección y se desnatura también. Luego se toma la hebra (+) de ambos DNA (H en la
diapo) y se
permite que
se
reasocien.
Al hacer
esto se
obtienen
regiones de
DNA que no
se pueden
aparear
(hebras
simples)
pero hay
una región
de DNA que
si puede
aparearse, y
es esa zona
de doble
hebra la
que es
exactamente la IS. Así se tienen por ejemplo los mutantes 1 y los mutantes 2 que tienen sus
secuencias de inserción en diferentes orientaciones pero al hacer este experimento de separar
sus hebras y luego juntar sus hebras (+), se obtiene de todos modos esa región de doble hebra,
lo que indica que la IS se inserta independiente de la orientación.
9- ¿Qué experimento se haría para poder aislar la IS del resto del genoma del huésped? Se
usaron enzimas de restricción S1 que tienen la capacidad de degradar todo lo que sea DNA de
hebra simple, pero no el DNA de doble hebra, con lo cual si lo acoplamos al experimento
anterior, es posible aislar estas IS. Así se pudieron estudiar las distintas IS como por ejemplo la
IS-1 la que contiene 768 pb y aproximadamente 30 pb en sus extremos son repetidos
invertidos. Para demostrar la presencia de estos repetidos invertidos se separan las hebras de
este IS-1 y luego se permite su reasociacion y si realmente se encuentran estas secuencias de
repetidos invertidos, observamos unas formas de “lolipop” (las típicas horquillas). También se
observaron en las IS la presencia de regiones parecidas a promotores u operadores las que
interrumpen la normal acción de la RNA polimerasa lo que explica el efecto polar de las
mutaciones causadas por las IS en genes adyacentes. Por último se han observado algunos
codones sin sentido en estas IS en los tres marcos de lectura produciendo proteínas truncas,
las cuales varían en tamaño dependiendo a qué distancia del promotor del gen se inserto la IS.
10- Tabla de los distintos IS. Tienen distintos números de copias en el genoma y también
difieren en su tamaño y en el de sus extremos repetidos invertidos. Así fueron caracterizadas
esas secuencias saltarinas de las que hablaba Barbara McClintock.
11- Esta es la IS-1 y su estructura. Se ven sus extremos terminales de invertidos repetidos
(verde) adyacentes a zonas llamadas invertidos repetidos directos (morados) que son del DNA
del huésped. Este invertido repetido directo se produce a causa de la transposición y su largo
depende de que IS sea y de su mecanismo de transposición. Las IS codifican para la
transposasa que les permite la transposición y la capacidad de “saltar” en el genoma. Es la
presencia de esta transposasa la que explica la independencia a Rec A de este tipo de
recombinación.
12- Otros EGT son los llamados transposones. Estos se descubrieron en Japón con una
epidemia llamada “disentería” , la que tenía resistencia a muchos antibióticos. Al estudiar las
cepas causantes de esta enfermedad se encontró algo muy curioso, que era que al cultivar esa
cepa resistente a antibióticos con cepas normales, estas cepas normales luego adquirían esas
resistencias que antes no tenían, es decir había una transferencia. Posteriormente se
demostró que esas resistencias a antibióticos se encontraban en estas piezas móviles de DNA,
siendo denominadas como transposones (Tn). Los Tn al igual que las IS poseen todos los
elementos comunes para la transposición, pero a diferencia de las IS poseen resistencia a
antibióticos y también en algunos casos a metales pesados. Así se encontró que por ejemplo el
gen que confiere resistencia a ampicilina β-lactamasa (β-la) reside en un segmento de DNA de
aprox. 3 MDa que es transferible de un replicón a otro, independiente de recA (un
transposon). Uno de los Tn más estudiados es el TnA o Tn3 el cual posee genes que dan
resistencia a ampicilina (β-la). Los plásmidos que han adquirido TnA, muestran una inserción
de 3.2 Mda (4.95Kb), el cual está flanqueado por invertidos repetidos (IR). Al igual que las IS,
los Tn producen mutaciones con las mismas características que se vieron en la diapo 5.
13- Para demostrar la existencia de las IS se trabajaron con varios plasmidios los cuales
confieren resistencia a varios antibióticos (ver tabla). Estos pueden ser conjugativos o no. Si
son conjugativos, es porque el transposon que confiere la resistencia puede saltar a otra
bacteria entregándole una resistencia que esta no tenia. Lo que se quiso demostrar fue si la
resistencia a ampicilina era capaz de saltar de un plasmidio a otro cuando estos coexistían en
una célula.
14- Al hacer este experimento se encontró que al hacer coexistir plasmidios que poseen la
resistencia a ampicilina con los plamidios que no la poseen, estos últimos eran capaces de
adquirir la resistencia a ampicilina. Esto se demostró al centrifugar estos plasmidios y observar
su densidad, comprobando que estos aumentaban de tamaño. Así se comprobó que la
resistencia a ampicilina (alojada en un transposon) era capaz de saltar a otros plasmidios, en
un evento independiente de recA.
17- Se encontró que según el lugar de inserción del Tn varia el tipo de mutación. Esto porque
porque según el lugar donde se inserte el Tn será el grupo de transformante obtenido. Así por
ejemplo si el Tn se inserta justo donde había una resistencia a Sm, obtendremos
transformantes del grupo II, los que son sensibles a Sm, pero ahora resistentes a ampicilina.
18- Transposon TnA. PM= 3.2 MDa = 4.95 Kb. IR = 140 ± 38 pb. Sus características también se
determinaron con ayuda de la nucleasa S1. En su estructura se pueden ver las secuencias de
invertidos repetidos (IR) en sus extremos. También se puede ver su resistencia a ampicilina.
También posee dos genes. Uno codifica para el regulador de la expresión de otro gen, que
codifica para la transposasa y también se regula a sí mismo para poder codificar la resolvasa.
Tiene además un centro llamado sitio de resolución interno (IRS) que es un punto de quiebre y
reunión de las moléculas para la resolución de un cointegrado que se produce en el proceso de
transposición.
19- Se ven los lolipop que indican la presencia de los IR.
22- Tabla con distintos Tn, los cuales al igual que las IS, varían en longitud y en sus IR, pero
también varían en el antibiótico al cual son resistentes.
23- Aquí vemos que producto de la inserción de los Tn los plasmidios adquieren resistencia a
distintos antibióticos. Un plasmidio puede tener más de un transposon a la vez.
26- Como ocurre el mecanismo descrito. Tenemos primero un plasmidio con un Tn y otro con
el DNA blanco. Luego del reconocimiento se produce la inserción del plasmidio en el DNA
blanco mediante el Tn, formándose el denominado “cointegrado”. En este paso se forma una
copia del Tn y posteriormente hay un evento de resolución con intercambio de hebras dejando
finalmente una copia del Tn en el DNA blanco y manteniendo una copia del Tn en el plasmidio
parental.
27- Mas especifico, lo que ocurre es que primero la transposasa produce un quiebre en el DNA
blanco y en algunos también en el Tn (ya que en algunos caso el quiebre de este Tn es
producido por otras enzimas). Así quedan extremos 3’ OH libres en ambas partes (Tn y DNA
blanco). El
transposon se “pega”
uniéndose a los
extremos libres del
DNA blanco
quedando unas
hebras simples
hibridas (unión de Tn
y DNA blanco). Estos
luego son duplicados
por la DNA
polimerasa y sellado
por la ligasa. Por
último la resolvasa
determina la
resolución.
30- Se tiene el Tn10, con un
marcador “Z” que puede
ser Z+ o Z-. Lo que se quiere
saber es si la transposición
es replicativa o
conservativa. Para
demostrar esto se hace el
experimento desnaturar
estos transposones
separando las hebras de
DNA y luego se permite que
se reasocien.
31- Si se obtienen
heteroduplex (una
hebra Z+ y otra hebra Z-
) es porque la
transposición fue
conservativa, en cambio
si se obtienen
homoduplex (las dos
hebras Z+ o las dos
hebras Z-) es porque la
transposición fue
replicativa. La
transposición
conservativa es la que
explica porque en una
placa se obtienen la mitad de las colonias de un color y la otra mitad de otro. Así se demostró
que la transposición puede ser conservativa y también replicativa.
32- Los EGT en un cromosoma se pueden aparear entre ellos generando en algunos casos
deleciones.
34- Si estos apareamientos ocurren entre dos cromosomas, deja a un cromosoma duplicado y
a otro con una delación. Entonces se concluyo que los EGT los cromosomas pueden causar
fenómenos de delación, duplicación y también inversión.
35-38 Existen los denominados retrotransposones, como lo son los retrovirus en eucariontes,
los Ty1 en levaduras y los elementos de copia en drosofila. Estos tres son análogos en función
pero diferentes por el nivel de especie en el que se encuentran. (esto solo lo menciona, no
profundiza en esto).
39- Acá habla mostrando el video. Como no tengo el video :( tratare de escribir lo más
importante que pueda de lo q dijo el profe, aunque es casi lo mismo de los mecanismos vistos
antes.
La transposasa es codificada por el transposon y esta provoca los respectivos cortes iniciales.
Esta enzima reconoce las secuencias de invertidos repetidos del DNA blanco. Así se forma un
complejo llamado transpososoma. Una vez formado ese complejo (en el cual se producen los
cortes y quedan las hebras simples del Tn también del DNA blanco) se procede a la
recombinación sitio específica. Un aspecto importante es que la tranposasa corta el DNA
blanco y en algunos casos también corta el Tn, ya que en algunos casos otras enzimas son las
encargadas del nick inicial del Tn. Siguiendo con la recombinación sitio especifica, luego de que
se produjeron las hebras simples del Tn y del DNA blanco, estas se unen por los extremos
libres que había quedado y luego esta unión es replicada gracias a la DNA polimerasa, y se
sellan por la ligasa. Se asegura así una copia del Tn tanto en el plasmidio dador como en el
DNA blanco. Finalmente se debe separar el DNA dador del DNA blanco. La resolución del
cointegrado es la que permite que ambos se lleven una copia del Tn. El nick o corte del
cointegrado es producido por una serina recombinasa y la resolución es llevada a cabo por la
resolvasa.
FIN
Clase Recombinación: bloque 1
Primero que todo, a los que fueron a clases, si recuerdan los esquemas que usó
el profesor para explicar la recombinación, de holliday y la homóloga, tranquilidad los
he encontrado =). Estos son:
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/jhermoso/ch10_holliday.html
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/jhermoso/ch10_homologous.html
Comenzando la clase:
- Recombinación.
- 2 intermediarios de Holliday.
- Resolución
Dímero
La proteina RecA es una coproteasa, pero a medida que se van completando las
distintas etapas de purificación de la proteína RecA, está se va haciendo mas inactiva
como proteasa, esto se explica porque en las etapas iniciales de purificación había altas
concentraciones de contaminantes, principalmente un oligonucleotido, que haría que se
forme el complejo RecA – DNAss –DNTps que activan la actividad proteasica. Se
observó que a medida que la proteína RecA está más pura es capaz de interactuar con el
DNA, y esto se relaciona con la capacidad de recombinar. Se observo también que la
proteína RecA tiene una actividad ATpasa que es estimulada por la presencia de hebra
simple. Por lo tanto encontramos dos actividades de la proteina RecA: por una parte
tiene una actividad coproteasa y por otra parte una ATPasa.
Se observo que la proteína RecA tiene la propiedad de renaturar hebras
complementarias del DNA, y esto esta relacionado con la recombinación, pues esta
proteína comienza a juntar las hebras complementarias. Se puede considerar como una
fusión de genomas. Se ha observado que está proteína puede unir a DNA de hebra
simple y de doble hebra, pero une 100 veces mas fuerte DNAss. Si observamos los
modelos que ya ha mencionado, se ve que en general plantean que DNAss invade una
molécula de DNAds. La proteína se une mucho mas rápido a DNAss, pero se ha
observado también que la presencia de DNAss estimula la unión de la proteína RecA a
DNAds. Porl o tanto lo que la proteína está haciendo es uniendose a DNAss primero y
luego de es unida invade al DNAds y inserta el DNAss en el de doble hebra, por la
propiedad de fusión de genomas.
El DNAds sobreenrollado forma esta estructura D-loop, al cual se une la
proteína RecA-DNAss en presencia de ATP, y forman este complejo en el que se va
desplazando la hebra antigua por la hebra simple.
Tomando otro modelo más en detalle, de una DNAss circular y DNAds lineal +
proteína RecA mediante la hidrólisis de ATP, esta es capaz de unir DNAss circular al
DNAds y desplazar la hebra complementaria formando esta estructura de loop.
La proteína RecA tiene alta afinidad por union de DNAss, una vez unido es
capaz de formar un complejo ternario con la molécula de DNAds, en presenca de ATP,
por la hidrólisis de este la proteína RecA tiene la capacidad de cortar el DNAss y volver
a unir. La capacidad de cortar DNAss y volver a unir se a interpretado como una
actividad en busca de homología, busca la homologia entre la molécula de DNAss y
DNAds cuando la encuentra se produce el apareamiento y luego la fusión de genomas.
Se a observado también que la proteína RecA tiene la capacidad de denaturar DNAds,
esto se a probado tomando DNAds circular con un nick que esta relajado, cuando se
pone en presencia de proteína RecA esta se une, luego este nick del DNAds se sella con
una ligasa y no hay cambio en la movilidad electroforetica de esta proteína sellada en
relación a la no sellada. Ahora cuando se toma este mismo modelo de DNAds circular
con un nick, se pone proteína RecA y ATP, y luego se sella con DNA ligasa, y se pone
en electroforesis se observa que hay un cambio en la migración de este DNA.Esto se
interpreta que cuando la proteína RecA se une al DNAds con un nick es capaz de
desenrollar la molécula por la hidrólisis de ATP, y este grado de desenrollamiento se
sella con la ligasa y uno lo puede ver en la movilidad electroforetica. Por lo tanto acá
hay otra propiedad de la proteína RecA, que es capaz de desenrollar parcialmente
DNAds, y generar zonas de hebra simple.
La proteína RecA puede unirse a cualquier DNAss sin importar su origen, lo que
pasa es que en el genoma de E.coli, hay una secuencia que es reconocida por los
sistemas de recombinación y a partir de esa secuencia se genera un extremo 3´ acá es
donde es anclada la proteína RecA y donde empieza el proceso de recombinación.
Existen una serie de otras proteínas que juegan un papel en la recombinación una de
ellas son las proteínas de unión a hebra simple, la presencia de SSB hace que el DNA
permanezca como molécula de hebra simple. Se ha visto en ensayos in Vitro que la
presencia de SSB estimula formación del heteroduplex, en comparación a la reacción
sin ella, por lo que SSB es una proteína auxiliar de la proteína RecA en el proceso de
recombinación:
Hay una cantidad enorme de productos genicos distintos a RecA en E.coli que
participan en la recombinación. Por ejemplo: RecBCD, es una exonucleasa V que:
Como modelo tomemos una molécula de DNAds circular con un repetido directo de
DNA, este repetido puede ser resuelto y recombinado por varios modelos por ejemplo:
que actue RecE con su actividad exonucleasa DNAds 5´3´, generando extremos 3´de
DNA. También puede actuar RecQ que es una helicasa que denatura DNA en conjunto
con RecJ que es una exonucleasa DNAss en sentido 5´3´, generando un extremo 3´ de
hebra simple. Otro caso es que actuae es RecQ que es una helicasa que denatura DNA.
Luego RecA y RecT (proteína de unión) permite el apareamiento de las moléculas
complementarias y homologas. Finalmente en el caso que haya actuado RecQ actuaría
RecJ para degradar la otra hebra de DNA, y luego se repara la molécula por una DNA
ligasa.
Otro caso es como ocurre recombinación con una molécula circular y DNAds. Una
opción es que actúe RecBCD, que es una helicasa potente, aparte de ser una
exonucleasa, que va denaturando DNA en un dirección 3´5´ muy rápidamente y mas
lentamente va degradando DNA en una dirección 5´3´, generando un extremo 3´.
Otro caso es que actue RecE que degrada DNAds direcció 5´3´generando un extremo
3´libre. También puede actuar el producto del gen RecQ (helicasa) + RecJ
(exonucleasa), generando un extremo 3´libre. También puede actuar RecQ sola.
El extremo 3´libre en conjunto con recA va a invadir al DNAds, formando el
intermediario D-loop donde ocurre el intercambio de bases. Posteriormente se forma la
estructura de Holliday y la extensión del heteroduplex , por RuAB y RecG, que son los
motores que permiten el movimiento en el intermediario de holliday, finalmente la
estructura se resuelve en una o en otra dirección por RuvC.
El producto génico del gen recBCD, forma un complejo trimerico con 3 proteínas, que
reconocen una secuencia de extremos romos o cercanos a extremos romos, o sea puede
tener una cola de DNAss pero esta no se puede extender por más de 17 nucleótidos.
Reconoce la secuencia, se une y empieza a denaturar el DNA doble hebra a dos
velocidades, una que va denaturandola hebra 3´ muy rápidamente a causa de la proteina
recB, y otra que va denaturando la hebra 5´ mas lentamente, que esencialmente es una
translocasa (la proteina recC), la cual se va desplazando por el DNA.
.
A medida que va denaturando va degradando la secuencia 3´que se genera muy
rápidamente por su actividad exonucleasica 3´5´y además va degradando la hebra
5´con su actividad exonucleasa 5´3´ mas lentamente (esto no se ve en el dibujo pero
eso es lo que dijo hartas veces). Cuando llega a la secuencia chi, se detiene por 6 a 8 seg
¿?, y detiene su actividad exonucleasa 3´5´; luego avanza nuevamente y sigue
denaturando el DNA con su actividad helicasa pero a la mitad de la velocidad con la que
venía antes de chi. También sigue denaturando el DNAds con actividad exonucleasa
5´3´( porq esta no se detiene), o sea va degradando la hebra complementaria. Al
detener su actividad exonucleasa 3´5´va generando un extremo 3´libre de hebra
simple donde esta la secuencia chi, esta es reconocida por la proteína RecA la que se
une y comienza el proceso de invasión. (ver fig de abajo)
Ahora hay una competencia por la unión al DNA hebra simple entre RecA y SSB, esta
última tiene mayor afinidad por unión DNAss pero en presencia del complejo recBCD
la proteína recA aumenta su afinidad y gana la competencia. Se ha demostrado que el
complejo recBCD carga a la proteína recA en el extremo 3´ que posee chi, la cual
invade la doble hebra y logra la recombinación.
Cuando el complejo recBCD reconoce la secuencia chi, para estos 3 a 8 segundos y
luego, y hace su ultimo corte en la hebre 3´ 4 a 5 nucleotidos antes de la secuencia chi,
generando así la hebra simple 3´donde se va a cargar la proteína recA+DNAss para
comenzar la invasión.
La pregunta es ¿Cómo es reconocida la secuencia chi? , se hicieron una serie de
experimentos en los cuales se introdujeron mutaciones aquí y mutaciones aca¿?, si se
cambian todas las bases de la hebra complementaria a chi, pero se mantiene la secuencia
chi tal cual (generandose una doble hebra mal apareada), chi es reconocido, esto quiere
decir que no importa lo que haya en la hebra complementaria. Ahora si se muta la
secuencia chi, y se deja la secuencia de la hebra complementaria tal cual, no es
reconocido chi.O sea lo que importa es la secuencia chi en la dirección 3´5´.
Cuando se hace un bloque en el cual se reemplazan 22 nucleotidos de la hebra
complementaria, creando una zona de buqle, chi es reconocido, esto demuestra que chi
es reconocido como hebra simple, por lo tanto va denaturando previamente a esta
secuencia. Es por esto que no importa lo que haya en la secuencia complementaria.(hay
una Diapo con las mutantes por si les interesa)
Se supone que quien carga la proteína RecA en el extremo 3´de la secuencia chi es recB
(del complejo recBCD), por una mutación que carece de recB se ha demostrado.
Hemos visto la herencia tradicional (mendeliana) en los cuales uno puede ver que
independiente del parental que uno tenga, con ciertas características, todos los
cruzamientos son recíprocos de tal manera que el resultado de esos análisis
posteriormente son los mismos. No importa el genotipo del parental masculino o
femenino, igual va a dar un resultado similar. Sin embargo, una de las características
que se observa en otro tipo de herencia, en la herencia extranuclear: que
correspondería a la herencia de genes que no están en el núcleo, es el patrón
variegado que indica que los genes responsables de esto no están en el núcleo (en los
cromosomas).
Hay una serie de DNA`s que están extracromosómicamente, por ejemplo, en los
organelos como mitocondrias y cloroplastos, en plásmidos en eucariontes. Ejemplo: en
saccaromyces cerevisiae, la levadura tiene algunos plásmidos que pueden encontrarse
en el núcleo o en el citoplasma, sin embargo son extracromosómicos porque no están
en los cromosomas, sino que son elementos cromosómicos independientes. Uno de los
más típicos es el DNA de 2 µ (“micra”), que permitió todo el desarrollo molecular. Es
un plásmido circular y su nombre se debe a que la medida en microscopía electrónica
es de 2 micra.
Neurospora crassa también posee
algunos plásmidos que se
encuentran extracromosómicos.
Uno de éstos se ubica incluso en
mitocondrias.
También existen plásmidos que son
construidos artificialmente (no
hablaremos de esto) y además
algunas secuencias de DNA que se
amplifican en un organismo y que
son parte de los genes que codifican
por RNA`s ribosomales.
Algunos de estos elementos que son
extracromosómicos derivan por
ejemplo de transposones eucariontes
o de secuencias tipo retrovirus que
están insertados en el genoma de los
eucariontes o bien de
retrotransposones que también están
en alguno de los cromosomas
eucariontes.
Si bien están en los cromosomas, éstos en algunas etapas se liberan, y ya sea por
transcripción y luego síntesis de DNA y circularización generan estas estructuras
circulares extracromosómicos. En algunos casos ocurre por recombinación.
¿Qué pasa con las células cuando uno quiere hacer un análisis genético? En la
siguiente figura, el color de cada una de las mitocondrias representa una característica
génica diferente. Si fusionamos dos células con mitocondrias distintas, lo que estamos
generando acá al separar estas mutantes es un heteroplasmón, hay una mezcla de
mitocondrias de distinto genotipo. Cuando segregan estas células igual segregan con
mitocondrias de dos características, que posteriormente por división y segregación al
azar pueden generar líneas celulares con sólo una de las características de las
mitocondrias y otras líneas con sólo otras características de las mitocondrias.
La mayor distribución es
monomérica, pero también se
observan dímerosa, trímeros
y tetrámeros.
La organización de esta pieza del DNA del macronucleo es más o menos esta: en la
hebra superior está la información de los RNA ribosomales 17 S y 25 S, lo mismo en la
hebra inferior. Como referencia, se muestran los sitios de corte con EcoRI.
Estas piezas de DNA se observan en el macronucleo, pero cuando la célula se está
diviendo muy lentamente el macronucleo deja de verse o de estar en la célula. Por lo
tanto, para el macronucleo se genera la información en el micronucleo (núcleo
germinativo). Por lo tanto estas piezas deben estar codificadas en el genoma del
organismo y en algún momento de su ciclo pasan a formar parte independiente de los
cromosomas.
¿Qué experimentos harían para ver como está en el cromosoma?
Básicamente en el cromosoma puede estar de varias formas: una, que la pieza esté tal
como está naturalmente, pero insertada. Esto es como está en el macronucleo (a),
están los cortes con la enzima de restricción y el centro de están las A y los extremos
Z. Si esto se corta con EcoRI vamos a tener un segmento que será doble A de
aproximadamente 10 (están todos * 104 daltons), y vamos a tener una duplicación de
este sector (Z) que es de 1,6. Como pueden ver en el núcleo puede estar en la misma
posición insertado (b). Si se corta con EcoRI se genera el segmento A (de 10) pero va
a generar un segmento, cuando encuentre un sitio de EcoRI en el genoma, que va a
ser mayor al tamaño de Z (mayor a 1,6) esto sería YZ y XZ (en ambos extremos). Si
está duplicado (c), vamos a tener lo mismo, pero con la diferencia que tendremos un
fragmento ZZ que será de 3,2. Si está solo la mitad de la secuencia (d), vamos a tener
un segmento YZ (mayor a 1,6) y un segmento AX (mayor que 5, un poco más grande
que la mitad del de 10), no tendremos el segmento AA de 10. Finalmente vamos a
tener un repetido en tándem (e) ZA y ZA, que tampoco me va a dar AA, pero me va a
dar un fragmento AZ de 6,6 (5 proveniente de una A más 1,6 proveniente de Z), un
fragmento YZ y un fragmento AX. Estas son las posibles ubicaciones de esta pieza
extracromosómica cuando está en el cromosoma.
Cuando se hace el experimento con mapeo de restricción e hibridación, se observa que
este fragmento está como la mitad del segmento en una posición ZA yendo de
izquierda a derecha (como en d). Cuando este DNA se escinde o se amplifica para ir al
macronucleo, se duplica formando un palíndrome.
Otro modelo: la pieza que está en el cromosoma sufriría un corte por algunos
repetidos, luego un rearreglo y esto sería la base para la replicación, generando una
estructura lineal de doble hebra.
Volvemos a la
variegación…
Se observó que
cuando se hace un
cruzamiento de estas
variedades de la planta,
en los cuales los óvulos
eran de un fenotipo, por
ejemplo blanca, y el
aporte del polen fuera
cualquiera, ya sea blancas
verdes o variegadas, el
fenotipo de la
descendencia era blanca.
El aporte femenino era el
que importaba. Si el
aporte femenino era
jaspeado, pueden haber
tres tipos de óvulos, uno
que lleva sólo cloroplastos
blancos, otro sólo verdes
y uno que lleva de los dos
(heteroplasmón). El
resultado es también
determinado por el aporte
femenino.
Cuando es variegado, la descendencia es variegada también, luego esta célula va a
mitosis y se producen células blancas y células verdes, teniendo el fenotipo variegado.
Una célula variegada que se divide, tiene que sufrir dos procesos: división nuclear
(mitosis) y el proceso hipotético llamado CSAR: por ejemplo las mitocondrias (o los
cloroplastos) de un tipo migran a un polo, y las del otro tipo migran al otro polo,
generando células con un solo tipo de mitocondrias (de heteroplasmón a
homoplasmón). Esta información genética entonces se debe a elementos
extracromosómicos.
Otro ejemplo: células de neurospora, mutantes llamadas Poky (de crecimiento lento)
que se caracterizan por ser protótrofas para adenina (ad+). Por otro lado se tienen
organismos normales pero que requieren de adenina (ad-). Cuando se hace un
cruzamiento, donde el protoperitecio (femenino que aporta mitocondrias) es poky y las
esporas son masculinas normales, se produce un diploide que rápidamente hace
meiosis, en la cual se generan 4 esporas ad- y 4 esporas ad+ con segregación 1:1 o
sea mendeliana, indicando que el carácter de requerimiento de adenina es nuclear; sin
embargo todas son mutantes poky, porque el aporte citoplasmático lo da la parte
femenina. Para el recíproco ocurre lo mismo (pero al revés), todas las esporas son de
crecimiento normal. Esto indica que el carácter poky es citoplasmático.
¿Cómo se demuestra esto? Se toman las cepas de crecimiento lento que es marcador
leu+ y se toman unas de crecimiento normal que es marcador leu- (son células del
mismo tipo de apareamiento), se fusionan y se obtiene un heterocarionte. En este tipo
de fusión, los núcleos no se funden, sino que sólo el citoplasma de las dos células con
mismo tipo de apareamiento, de manera que posteriormente se selecciona aquellos
que segregan de genotipo crecimiento lento y leu-. Aquí nunca va a ocurrir una
recombinación nuclear porque los núcleos no se funden. Recordando que las células de
crecimiento lento eran leu+, de manera que si se encuentran células de crecimiento
lento y leu-, quiere decir que el marcador de crecimiento era extranuclear y se
combinaron mitocondrias de este tipo con núcleos que son leu-.
En el caso de clamydomonas tenemos dos tipos de
apareamiento, mt+ y mt-. Cuando se hace un
cruzamiento con un marcador de resistencia a
estreptomicina, que es un marcador que supuestamente
se encuentra en la mitocondria, y se pone este en la cepa
mt+, se hace un cruzamiento y se genera en el cepto de
la clamidomona se genera tipo de apareamiento 1:1
tipico de marcador nuclear, sin embargo todas
resistentes a estreptomicina. Cuando se hace el
cruzamiento recíproco, donde el marcador de sensibilidad
a estreptomicina está en el tipo de apareamiento mt+,
ahora todos los descendientes son sensibles a
estreptomicina, indicando que es un marcador
extracromosómico.
Con esto, quería mostrarle que existen marcadores extranucleares con mucha
importancia dentro de la célula, de hecho hay muchas enfermedades que ocurren en el
genoma de las mitocondrias y producen graves alteraciones que afectan el músculo
esquelético y el cerebro, como la epilepsia.
GENÉTICA CUANTITATIVA
Todos los caracteres que se han estudiado en Genética Mendeliana caen dentro de clases
bien distintas o discretas ( semillas arrugadas o lisas, plantas altas o enanas, flores
blancas o violetas). Estas clases pueden utilizarse para predecir el genotipo de los
individuos. Por ejemplo si cruzamos una planta de arveja alta con plantas enanas y
observamos la F1 conocemos el genotipo de las plantas enanas y podemos dar un
genotipo general para las plantas altas. Además si conocemos el genotipo podemos
predecir el fenotipo de la planta. Este tipo de caracteres se denominan discontinuos y
son generalmente cualitativos.
En 1910 la mayoría de los genetistas pensaban que los caracteres heredables eran
discontinuos y por ende contrastantes (Color pelo, de ojos, liso-crespo, etc.) y que este
tipo de caracteres eran los mas influyentes en términos Evolutivos (caracteres tipo
mendeliano).
En esa época surgen dos corrientes las de los Biometristas y los Mendelianos. Los
primeros estudiaban caracteres continuos tales como la altura, la inteligencia, entre
otros. Por otro lado los mendelianos estudiaban caracteres discontinuos como los ya
descritos. Se creyó por mucho tiempo que ambos tipos de caracteres y sus análisis
obedecían a leyes distintas. Ya en 1918 Ronald Fisher integró ambas corrientes
demostrando que la variación cuantitativa (caracteres continuos) era una consecuencia
natural de la herencia mendeliana (caracteres discontinuos).
Suponiendo control
carácter por UN GEN
con 2 aleles SIN
DOMINANCIA
AyB Rojo
Ayb Blanco
De los dos supuestos anteriores se desprende que la variación de color puede ser
explicada por el numero de alelos que intervienen en su producción. En el caso de
donde hay solo 2 alelos las interacciones que estos pueden tener son mas restringidas
que en el caso de que haya un mayor numero de ellos.
Esto es como el
triangulo de pascal en
matemáticas xD.
Ahora la parte estadística del asunto
Cualquier individuo que se encuentre entre las dos flechas en (b) puede pertenecer a
cualquiera de los 3 genotipos, esto se debe al alto solapamiento de las distribuciones.
Con esto no se puede hacer ningún análisis mendeliano sencillo para descifrar el
fenotipo de los individuos. De esto se desprende que un carácter cuantitativo es aquel
para el cual las diferencias fenotípicas medias entre distintos genotipos son pequeñas
comparadas con las variaciones entre individuos de un mismo genotipo.
Todos los caracteres fenotipitos que tomen distintos valores cuantificables en diferentes
individuos y no siguen un patrón de herencia mendeliana simple caen dentro del
termino de Variación fenotípica cuantitativa
Heredabilidad de un carácter
El nombre tiene una importante desventaja: parece que su significado es evidente; y por
el contrario, se trata de un concepto un tanto abstracto y es con frecuencia mal
interpretado. La idea de Heredabilidad fue concebida en el contexto de la Mejora
Genética Animal; su objeto era determinar hasta qué punto los caracteres observables
constituyen una buena guía para predecir lo que ocurrirá en la descendencia. Así,
Heredabilidad se define como el porcentaje de la variación observada que es atribuible
a los genes. Veamos un ejemplo. La estatura es un carácter sujeto a una fuerte
determinación genética, tanto en animales como en el humano. No obstante, el ambiente
tiene influencia.
mide la proporción de la varianza fenotípica total que está determinada por la varianza
genética aditiva (Va) y, por tanto, excluye la contribución debida a la varianza
dominante y epistática. La heredabilidad en sentido estricto es la causa principal del
parecido fenotípico entre parientes, es el determinante principal de las propiedades
genéticas de una población y determina la tasa de cambio evolutivo del carácter en la
población; es decir, la respuesta a la selección.
EJEMPO
Norma de Reacción
E.coli tiene alrededor de 4279 genes, de estos genes, 2600 (60%) se expresan en
condiciones de laboratorio(condiciones optimas de nutrientes pH, temperatura etc.), de
los cuales 350 codifican para el 90% de las proteínas con funciones vitales, el resto de
estos genes se expresan solo en condiciones especiales, condiciones de stress o
condiciones especiales del ambiente. El hecho que existan genes que se expresen
solamente en ciertas condiciones habla de algún mecanismo de regulación. De este
modo logramos mantener una eficiencia metabólica al máximo posible, esto quiere
decir, que ciertas proteínas no se expresaran siempre, si tenemos suficiente carbono y
necesitamos crecer, la bacteria no se preocupara en adquirir fuentes de carbono y solo
crecerá, solo cuando se acabe el carbono volverá a expresar proteínas para la captación
de este, otros aspectos que se mantendrán controlados con la regulación de la expresión
génica, es el mantenimiento del balance metabólico, y la adaptación a diferentes
ambientes.
Hablando de la regulación propiamente tal, esta puede llevarse a cabo en
diferentes lugares de la célula, puede realizarse a nivel del Dna y su compactación
(histonas y cromatina), una determinada compactación del Dna ya puede ser síntoma de
que un dna debe o no transcribirse. La temperatura es fundamental en este aspecto, ya
que a temperaturas muy bajas el Dna se ve mas compactado, en cambio a temperaturas
mas elevadas el dna puede descompactarse y los promotores quedar más expuesto.
También puede haber regulación a nivel de la transcripción, este tipo d e regulación
es el mas común y el mas utilizado por la célula, también existe la regulación a nivel
del Rna, mas común en eucariontes, tiene que ver en como se procese este y
dependiendo de eso que tipo de información entregara. Otro tipo es la regulación a
nivel de la traducción, ya que existen variadas MODIFICACIONES (NUNCA
MUTACIONES) post transcripcionales, que van a ser los indicadores finales del
producto génico (atenuación). Finalmente tenemos regulaciones a nivel de la proteína ya
que esta puede activarse o inactivarse dependiendo de las interacciones que esta
presente.
Al hablar de regulación, nosotros nos enfocaremos a la cantidad de producto
génico que va a haber en la célula en algún momento determinado. Por esto es que nos
centraremos en dos pasos, el paso de dna a rna, la trascripción, y el paso de rna a
proteína, traducción. Esto dos pasos son los mas determinantes a la ora de la regulación.
Algunos conceptos:
- Genes constitutivos: genes que se expresan todo el tiempo y no son regulados.
Genes que se necesitan para que la célula sea célula, sin ellos no viven: Rnapol,
proteínas estructurales, etc.
- Genes regulados: Genes que se encuentran en ciertas condiciones específicas, a
menudo controlados a nivel de la trascripción.
- Genes estructurales: Codifican para proteínas usadas en biosíntesis, metabolismo
o rol estructural.
- Genes regulatorios: Genes que regulan la expresión de otros genes. A partir de la
interacción de sus productos génicos con secuencias especificas.
Repitiendo lo mismo, nosotros tenemos un gen que es una secuencia de dna que es
transcrita a una molécula de rna, y puede encontrarse transcribiéndose o no, las zonas no
transcritas son regiones en donde existen elementos regulatorios, estos elementos
afectan la expresión de la secuencia a la cual están unidos físicamente.
Por ejemplo, un gen requiere de una proteína reguladora de tipo activadora, solo así se
une la polimeraza y transcribe, sin embargo esta proteína reguladora no puede unirse sin
su efector, si el efector se une, la proteína cambia conformacionalmente y logra unirse al
dna y así la polimeraza también lo hace, el efector en este caso es un coactivador, ya
que activa al activador. En un caso contrario existe un regulador que esta unido al Dna
bloqueando el ingreso de la polimeraza, para ellos en necesario que un efector se una a
ese regulador, para que este salga del Dna, dejando el promotor descubierto y asi la
polimeraza podrá unirse. Este ligando es un inductor, inactiva al represor.
Ahora veremos específicamente, los dos tipos de regulación negativa y los dos tipos de
regulación positiva.
Con respecto a los dos tipos de regulación negativa tenemos, la negativa inducible y la
negativa reprimible.
- regulación negativa inducible: el regulador se encuentra activo unido al Dna , lo
que no permite que se una la polimeraza (negativo), es decir la transcripción esta
apagada, cuando llega el ligando que es el inductor este se une al regulador,
inhibiendo su acción, lo cual genera que este se libere del DNA y así la
polimeraza pueda transcribir. Ej: operon lactosa
Saber esto sirve para entender el motivo de todas estas regulaciones, sabemos que el
catabolismo, es la degradación de alguna fuente de carbono, para producir energía y
algún desecho u otro compuesto. El anabolismo de manera diferente es utilizar esa
energía y algunas moléculas pequeñas orgánicas o inorgánicas, para sintetizar productos
utilizables.
Desde el punto de vista del catabolismo, los genes implicados en su acción se
encuentran generalmente inactivos, hasta que aparezca un sustrato (célula muerta de
hambre que se come lo que aparece), operones reprimidos hasta que se necesiten. En el
anabolismo ocurre lo contrario ya que la célula se encuentra generalmente sintetizando
productos, es por eso que los operones del anabolismo se encuentran generalmente
activos, hasta que ya no se necesite mas de algún producto o se agote la energía.
Los puntos de interacción y las regiones en donde se une cada dimero Cap quedan bien
ilustrados en las imágenes.
Tarea para la casa es predecir que promotor es más débil y cual es menos débil.
Par finalizar existe un mecanismo de antiactivacion, en el cual una proteína se une al
sitio del dominio carboxilo de la subunidad alfa, por lo tanto impide el reclutamiento de
la polimeraza y así la transcripción no es activada de manera correcta. La proteína que
se intercala es la CytR fundamental en el metabolismo de purinas.
Regulación de la expresión génica en procariontes
Clase 2 Marcelo Baeza
Dentro de la regulación génica existe una regulación fina, que esta definida por la
cantidad de sustrato necesaria. Este es el caso de los operón lactosa (catabólico) y
triptófano (anabólico).
Se puede ver una curva de crecimiento diauxico, en donde se utiliza como primera
fuente de carbono la glucosa y luego se ocupa la lactosa. Se puede ver en el grafico que
ahí una fase exponencial de crecimiento, después hay una pequeña fase estacionaria y
luego, en vez de mantenerse la fase y proceder a la muerte se produce una nueva fase
exponencial. Esto se puede explicar por las fuentes de carbono que utiliza la bacteria,
para la primera cuerva exponencial se pudo apreciar que la cantidad de glucosa iba
disminuyendo pero que la lactosa se mantenía constante. Cuando la glucosa ya se acaba,
comienza a ocuparse la lactosa. Conclusión: E.coli utiliza dos fuentes de carbono,
pero no las ocupa las dos a la vez, primero glucosa y luego lactosa.
Otro gen involucrado es lacI, es el regulador que va a producir un represor que se une al
operador y bloquea la transcripción. El represor se une al operador que se encuentra al
lado del promotor y con esto entorpecer un poco al promotor, apantallando la región
promotora por lo que la polimerasa no se puede unir y no se inicie con esto la
transcripción.
Este paso es
independiente si el
operon esta
activado o
desactivado por la
proteína CAP, que
por mucho que se
una CAP al sitio
activador si el
represor esta unido
al operador, no
habrá transcripción
Se puede ver en el esquema a lacI con su promotor constitutivo, la producción de
represor por parte de lacI y la unión del represor al sitio operador (lacO) con lo que no
se puede producir la transcripción del operon. Este es el caso para la ausencia de
lactosa. Por mucho que haya cAMP y CAP unido al sitio activador, no se va a producir
transcripción si el represor esta unido al operador.
Si hay lactosa y no hay glucosa en el medio, se tiene que prender el operon. El represor
se inactiva porque la lactosa es capaz de unirse a el y con esto el represor no se puede
unir al sitio operador y se produce la transcripción de los genes estructurales. LacZ, lac
Y y lac A. Para que se produzca esto el sitio activador tiene que estar unido a la proteína
CAP, ya que esto demuestra que hay cAMP y por lo tanto, no hay glucosa.
Ahora cuando hay una baja concentración de trp, el ribosoma empieza a traducir pero
cuando llega a la zona de los 2 codones para trp, va a tener un pequeño retraso o pausa
en la traducción ya que ahora no hay trp disponible y va a dejar libre las zonas 2 y 3 que
se van a aparear y se llama esto secuencia de anti-terminación, esto quiere decir que
genera una estructura que no es de terminación de la traducción, ya que la zona 4 queda
apartando la cadena de U. El tallo que se forma queda fuera de la polimerasa por lo
tanto no es impedimento para ella y puede seguir normalmente para traducir el operon.
Este péptido líder se encuentra antes de los genes estructurales del operon, por lo cual
en el caso de alta [trp] no va a haber mensajero para traducir ya que la polimerasa fue
interrumpida y se “soltó”. En el caso de baja [trp] la polimerasa no se ve impedida y se
traducen sin dificultad los genes del operon. Este hecho es independiente si el operon
esta activo o inactivo porque es una regulación que viene después que se comenzó
la transcripción, se censa con respecto a la [ ] si se sigue o no.
1-. Control transcripcional: Ocurre antes de que se genere RNA y funciona en base a
mecanismos que provocan o inhiben la transcripción.
2-. Control del procesamiento del RNA: En eucariontes la región codificante esta
interrumpida por intrones. De esta manera, se controla que se produzca el splicing (corte
y empalme) para que el mRNA esté listo para salir al citoplasma. En otras palabras, se
controla la generación de RNA maduro.
3-. Control del transporte y localización de RNA: Como el mRNA debe salir del
núcleo al citoplasma cuando esta maduro, existe un control del transporte de la molécula
y su ubicación.
4-. Control de la traducción: una vez que el mRNA logró pasar y está en óptimas
condiciones para traducirse, aparece este control que da la aprobación para que se
produzca la traducción.
6-. Control de la actividad proteica: regula la inhibición de la traducción de una
proteína o permite su control.
5-. Control de la degradación del mRNA: Este mecanismo controla la cantidad de
mRNA que ha sido transcrito. Para la célula sale muy caro llevar a la traducción un
mRNA que no conduce; por ejemplo un mRNA que contiene codones de término de la
traducción prematuros (veremos mas adelante).
Degradación del mRNA con codones de término prematuros (PTC)
1-. Las levaduras presentan mRNA con baja cantidad de intrones y en su secuencia, se
destaca en particular la secuencia DSE. Observen que a diferencia del mRNA de
mamífero, el de levadura se encuentra íntegro. En el paso 1 en mamíferos, vemos trozos
de exones que darán origen a un mRNA maduro. El término PTC señala un codón de
término prematuro en ambos mRNA.
2-. En levaduras, el codón DSE será al cual se una la proteína llamada DCF, que
corresponde aun factor de unión. Cuando no está actuando la veremos de un color
anaranjado y cuando está actuando la veremos de color verde. En mamíferos sin
embargo, no existe esa secuencia, por lo que las DCF van a reconocer el sitio de unión
de los exones y es ahí donde se unirán al mRNA.
3-. Se observan el mRNA de levadura y el mRNA de mamíferos juntos, no es una doble
hebra. Ambos mRNAs se observan en orden 5’ a 3’. Esto se hace para simplificar la
observación pues los pasos a seguir son similares. Los sitios correspondientes a AUG,
PTC y Ter están a la misma distancia de los extremos en ambos mRNA.
4-. Una vez que DCF se une al mRNA, pueden ocurrir tres cosas:
a) Proceso natural: no hay PTC por lo tanto el ribosoma reconoce al factor de unión, el
cual permite que el ribosoma se ensamble y comience la traducción hasta el factor de
término Ter. No hay degradación del mRNA.
Si hay PTC pueden ocurrir dos cosas:
b) El mRNA no es reconocido por ningún ribosoma. Este permaneces en la célula y no
se degrada hasta que un ribosoma lo reconozca.
c) Un ribosoma reconoce a la DCF, la cual va a permitir el se ensamble y comience la
traducción. Esta sin embargo, llegará hasta el codón de término prematuro lo que va a
producir que queden codones sin traducir.
5-. Como se terminó la traducción antes quedaron DCF que no fueron reconocidos. En
este paso, el complejo upf va a reconocer DCF que no fueron traducidas producto de un
PTC, generando una señal.
6-. Comienza la degradación del mRNA al eliminar la cola de poli A de a través de
exonucleasas. Tras la eliminación de la cola de poli A se produce la eliminación del
CAP por la Dcp1.
7-. Inmediatamente aparece la exonucleasa Xrn1 que va degradar el mRNA desde el
extremo 5’ al 3’. Así, este mRNA no será traducido y no habrá gasto de energía.
Por ejemplo, tomando como modelo la levadura Saccharomyces, tenemos DNA que se
transcribe en un pre-mRNA que contiene intrones. Una vez que estos son removidos, va
a haber una serie de factores que se van a unir a este mRNA maduro (conformando el
DCF) y se muestran a continuación:
-Aly - Tap -DEK
-SRm160 -RNPS1
-hUpf3 -Y14
El nucleosoma que forma parte de los cromosomas esta conformado por un octámero de
proteínas histonas asociadas a una histona que los une que es la H1. Estas histonas
presentan dominios que son unas especies de colas cargadas positivamente y se
encargan de unir el DNA que está representado con un color verdoso. Estas colas
pueden ser modificadas agregando grupo metilos o bien acetilando. La inhibición de la
expresión o que se gatille esta, depende del grupo que agregue a estas colas.
Una de las modificaciones de estas proteínas histonas es la acetilación; la enzima acetil
transferasa cambia un grupo metilo por una grupo acilo, provocando un cambio en la
carga de estas colas, liberando el DNA y permitiendo la transcripción de los genes. Por
lo tanto, este proceso es un activador de la transcripción.
¿Cómo podemos determinar si un DNA está metilado o son solo secuencias las que se
metilan? Si observamos en la figura, hay una secuencia CCGG que cumple con la
condición 5’ CG 3’. Normalmente la metilación ocurre en la citosina que tiene cumple
con este requisito y en particular la podemos denominar Cp (citosina fosfato).
En un DNA independiente de la distancia, existen múltiples sitios CCGG susceptibles
de ser metilados y que además pueden ser reconocidos por enzimas de restricción. La
enzima Hpa II, por ejemplo, corta la secuencia en CC y GG solo cuando no está
metilada. Por otro lado, la enzima Msp I reconoce y corta todas las secuencias en CC y
GG, aun cuando estas se encuentren metiladas. De esta manera, al hacer una digestión
con Hpa II y luego con Msp I, nos permitirá determinar que tan metilado se encuentra el
DNA
Si tenemos una secuencia que esta metilada en sus dos hebras y se replica, se va a
generar una hebra complementaria con una secuencia que va a ser reconocidas por
enzimas que metilan, provocando posteriormente, dos secuencias de doble hebra con
cada una de ellas metiladas. La metilación del DNA es conocido también como la
memoria celular.
Este es el clásico modelo donde las hormonas son reconocidas por un receptor con el
cual pasan a formar el par hormona-receptor. Este viaja por la célula, entra al núcleo y
se une al DNA en la región GRE que son elementos de respuesta a hormonas
glucocorticoides. Esto gatilla la transcripción del gen.
¿Como actúa el receptor de hormonas esteroidales? Todos los receptores tienen un
dominio común que es el dominio de unión al DNA. Normalmente estos receptores
actúan como homodímero o heterodímero. Aquí vamos a poner solo un monómero
como ejemplo.
Como se puede ver, presenta varios elementos que son los moduladores de la expresión
en sus dos dominios, donde del 1-98 pb observamos un dominio de unión y del 768 al
881 encontramos un dominio de activación. Se ha observado que diversas mutaciones
en distintas zonas de Gal 4 pueden producir la inactivación de la transcripción o la
activación parcial dependiendo de que tan despejado esta el sitio de unión al DNA.
Procesamiento alternativo
Un ejemplo de esto son los genes que codifican para la preprotaquiquinina (PPT):
El gen de la PPT produce dos tipos de neuropéptidos y tiene una serie de intrones
(representados por I) que al ser procesados, permiten que la información quede
expresada en dos tipos de mRNA distintos. Hay dos exones, P y K, que van a
determinar el tipo de neuropéptido. Si en el mensajero solo encontramos el exón P,
entonces ese mRNA va a codificar para un neuropéptido del tipo P y se llamará mRNA
α-PPT. Por el contrario si en el mensajero encontramos tanto el exón P como el K, al
traducirse este mRNA dará origen al neuropéptido de tipo K y el mensajero se llamara
mRNA β-PPT. Notar que el primer mensajero es de menor tamaño que el segundo y el
tipo de mRNA que se va a formar depende del sistema que lo produzca y sus
necesidades.
Otro de los casos que se conoce bastante y que debemos haber visto en la determinación
genética del sexo es la determinación del sexo en Drosophila melanogaster (Figura en
la página siguiente). Esta determinación esta muy relacionada con la relación
autosoma/cromosoma sexual. Se supone que esta relación es uno; por dos autosomas,
debe haber dos cromosomas X. Cuando se da esta relación en la hembra, se activa la
transcripción del gen conocido como SxL. Este gen produce la proteína SxL que dirige
el procesamiento del gen tra el cual se traduce en una proteína Tra activa que ha
eliminado el exón 2. Esta última junto con la proteína Tra 2, van a encargarse de
procesar el mRNA proveniente de la transcripción del gen dsx (doble sexo), dejando
una secuencia que es específica para hembras. Esta secuencia se va a traducir y va a
generar una proteína que va a inhibir el desarrollo de los genes específicos del macho y
conduce a que el huevo se desarrolle como hembra.
Cuando la relación autosoma/cromosoma sexual es 0,5, no hay expresión del gen SxL y
por lo tanto no se produce la proteína SxL. Esta proteína por lo tanto no puede afectar el
procesamiento del gen Tra y al no ser afectado el gen Tra se procesa normalmente con
el exón dos, el cual tiene un PTC (codón prematuro de término), lo que genera una
proteína tra inactiva. De esta manera solo Tra 2 va a procesar el gen dsx generando un
mRNA específico de macho que al traducirse va a generar una proteína de macho,
gatillando que el huevo se desarrolle como macho.
A continuación se muestra el gen tra que marca la diferencia de sexo:
El exón numero dos lleva un codón de término prematuro. En machos, el gen tra se
transcribe en un mRNA que lleva el exón 2 y por lo tanto genera una proteína tra
inactiva. En hembras, el gen tra se transcribe en un mRNA que no contiene este exón
generando una proteína tra activa. Este procesamiento alternativo se debe a la presencia
de la proteína SxL.
Regulación por represores y activadores
En el caso de los genes Gal de Saccharomyces, cuando hay ausencia de galactosa en las
levaduras Gal actúa como Enhancer; activa la transcripción. Reconoce las secuencias
UAS que son intensificadores que están a mucha distancia del inicio de la transcripción
de los genes. El dominio de unión va a unirse a esta secuencia del DNA mientras que el
dominio de activación se unirá a la proteína GAL 80 que es un represor. De esta manera
Gal no puede unirse con las proteínas que van a unirse a la caja tata y no se puede
transcribir los genes regulados por Gal (Gal 1 y Gal 10). Cuando en el medio hay
Galactosa y el sistema está inducido, la galactosa (o inductor) va a unirse a la proteína
GAL 80, liberando el dominio de activación de Gal4. Este a su vez, se une a la proteína
de unión a la caja tata TBF, activando la maquinaria de transcripción.
Este sistema de expresión de genes también está regulado por glucosa a través de lo que
se conoce como represión catabólica. En este caso, hay un complejo llamado CRP que
impide que Gal 4 pueda unirse a UAS y por lo tanto, a pesar de que haya galactosa, no
se va a producir la expresión de los genes.
También existen otras secuencias u otros elementos que se les conoce como aisladores;
estos se encargan de inhibir el efecto de los enhancer al permitir que se les unan
proteínas que disminuyen el efecto. Recordemos que los enhancer pueden actuar en
ambas direcciones dependiendo de donde esta el gen que debe ser expresado. Muchos
genes tienen secuencias aisladoras que permiten disminuir la expresión de un gen.
¿Cómo se regula la actividad de los enhancer?
Una forma puede deberse a que el activador y el represor comparten parte de la
secuencia del DNA y por lo tanto compiten para unirse con el. Al ganar el lugar el
represor inhibe la acción del enhancer y por tanto no hay un excesivo aumento de la
expresión del gen.
Otra forma puede deberse a que tanto represor como activador tienen secuencias de
unión al DNA muy cercanas al enhancer. El represor puede presentar un dominio de
unión de la proteína activadora inactivándola y provocando así la inhibición de la
actividad del enhancer.
Finalmente, puede ocurrir que el represor se una tanto al sitio de unión del DNA como a
las proteínas de la maquinaria de transcripción, impidiendo que el activador pueda
unirse y se reprima la expresión de los genes.
La metalotioneina es una proteína que le permite a las células sobrevivir aún cuando hay
altas concentraciones de metales pesados. Este gen esta regulado por varios elementos.
En condiciones normales; es decir con pocos metales pesados, la RNA II transcribe el
gen en bajas cantidades. Sin embargo, en la región promotora existen elementos por
activación de metales que se encuentran en muchas copias; por ejemplo, hay 4 copias de
MRE (elemento de reconocimiento de metales). Estos elementos unen a unas proteínas
activadoras del MRE y aumentan la transcripción del gen. Existen además otros
elementos como el TRE que pueden ser reconocidos por la proteína AP1 aumentando
aún más la expresión del gen. Finalmente observamos un elemento GRE llamado
elemento de reconocimiento de hormonas glucocorticoides lo cuales unen al receptor de
la hormona, aumentando nuevamente la expresión. De esta manera, a altas
concentraciones de metales pesados hay muchos elementos que permiten la
sobreexpresión del gen.
RNA de interferencia
a) En general se general moléculas de RNA de doble hebra que son reconocidos por
Dicer, una proteína que lo procesa generando pequeños fragmentos de RNA se unen a
un complejo proteico llamado Risc. Este complejo junto al RNA se van a unir a un
mensajero y servirá como mensaje para que este mRNA se degrade. Este complejo
Risc- RNA de interferencia aparea de forma exacta pequeñas zonas del RNA con el
mensajero. Luego Risc se encarga de cortar en la mitad el DNA apareado con el RNA
lo que produce que los trozos de mRNA que queden sean degradados.
b) Una sola hebra de RNA puede doblarse y aparearse en si misma formando una doble
hebra y un loops. Los fragmentos de doble hebra van a ser reconocidos por Dicer quien
va a procesar esto generando RNAs de hebra simple que van, junto con risc a unirse al
mRNA. Como este fragmento de RNA de interferencia no aparea completamente al
DNA, no se va a producir degradación pero si va a haber inhibición de la transcripción.
¡Fin!
GENETICA DE POBLACIONES
Estudia las proporciones entre los diversos genotipos posibles, lo que se ha denominado, la
frecuencia relativa de los genes dentro de una población, de generación en generación.
Para predecir el destino de los genes, en las poblaciones, se debe tener conocimiento acerca de las
poblaciones y de los individuos como organismos aislados. El destino de muchos genes (las formas
alélicas de los genes) se define en las poblaciones de individuos.
Por ejemplo, la capacidad reproductora de los organismos portadores de un gen específico, puede
depender de la frecuencia de dicho gen. Un gen va a tener un efecto en la capacidad reproductora
de los individuos que lo llevan. También, va a depender del tamaño de la población, del genotipo
de los demás individuos de la población, y de otros factores que forman parte de la genética de
poblaciones.
Si bien los genes tienen eficiencia en la célula, obviamente que el destino de esos genes está en las
poblaciones de individuos (Cifuentes lo que quiere decir con esto, es que, por ejemplo, por mucho
que exista un gen, si la mayoría de la población no lo porta, a la hora de la reproducción este gen
podría ir desapareciendo con el paso del tiempo)
¿Qué el curso que está en la sala de clase?.. ¿Una población o un deme?.. Cifuentes dice que
somos más un deme que una población. Un deme es una parte de una población. Según internet
deme se define como Población natural definida genética y ecológicamente.
El tamaño de una población puede variar, pero generalmente se considera que corresponde a un
grupo total, por ejemplo, la población de Santiago, la población de Juan Gómez Millas, o la
población de la sala de clases. Ahora, en esta población, cada individuo tiene la misma
probabilidad de aparearse con cualquier otro individuo. Se define además, que esta población es
mendeliana, ya que la transmisión de los genes que hay en esta población entre los individuos, se
rige por las leyes de Mendel.
Las poblaciones tienen dos características importantes, sobre las cuales se ha desarrollado la
genética de poblaciones:
- Frecuencia génica: frecuencia con que se observa cada gen o alelo en esta población.
- El conjunto común de genes de esta población.
Por ejemplo se puede determinar en la población de la sala, una característica que se hereda. Por
ejemplo, se puede ver cuántos pueden poner la lengua como un canal. Existen dos alelos, uno que
permite poner la lengua así y otro que no. En esta población si quisiéramos ver la frecuencia
génica o alélica del gen que permite poner la lengua como canal, debemos determinar el número
total de individuos de la población, viendo cuántos de ellos pueden poner la lengua como canal.
Otro ejemplo es ver cuántos pueden mover las orejas, o cuantos tienen los lóbulos de la oreja
pegados. Para estos caracteres, se asume que es un solo gen el que afecta al carácter. Otro
ejemplo es la capacidad de degustar fenil-carbamida. La cual presenta un sabor amargo para
algunos y es insípida para otros. Otro carácter que involucra al sabor, es el benzoato, el cual se
relaciona con las coles.
Ejercicio
Tomemos un ejemplo, una población de 100 individuos, de los cuales 50 son AA, 20 Aa y 30 aa.
¿Cuántos genes tiene esta población?
AA=50
Aa=20
aa=30
La población tiene 200 genes, pues cada alelo es un gen, y como hay dos alelos por individuo,
existen 200 genes.
¿Cuál es la frecuencia (f) del alelo A?
f (A)
alelos A
50 2 (20 1) 0.6
Alelos Totales 200
f (a)
alelos a
30 2 (20 1) 0.4
Alelos Totales 200
f (A) f (a) 1
NOTACIÓN: Frecuencia génica = frecuencia alélica. Existen tantas frecuencias génicas o alélicas,
como alelos para un mismo carácter existan.
Se puede calcular la frecuencia genotípica, que en este caso serían 3 frecuencias distintas (AA-Aa-
aa). Por lo tanto existen tantas frecuencias genotípicas, como combinaciones de alelos existan.
AA 50
f (AA)= 0.5 , AA+Aa+aa Genotipos Totales
AA+Aa+aa 100
20
f (Aa) 0.2
100
30
f (aa)= =0.3
100
Inferencia de la frecuencia génica a partir de la frecuencia genotípica.
1
f (A) f (AA) f (Aa)=0.5+0.1=0.6
2
1
f (a) f (aa) f (Aa)=0.3+0.1=0.4
2
Recapitulando conceptos:
-Frecuencia genotípica: frecuencia con que se observa un genotipo en la población.
-Frecuencia génica o alélica: frecuencia de los alelos en la población.
-Frecuencia fenotípica: Observación de un fenotipo en una población. El número de fenotipos
dependerá del grado de dominancia de los alelos. Así para una dominancia completa, sólo se
esperan dos fenotipos: el dominante y el recesivo.
Las propiedades genéticas de una población están influenciadas, por varios factores, en la
transmisión de los genes, de una generación a otra. Estos factores pueden cambiar la estructura
genética de una población. Con estructura genética de una población, se refiere a la frecuencia de
los alelos en dicha población, de cómo está estructurada esa frecuencia alélica en la población.
Tamaño población:
Los genes que pasan de una generación a la siguiente son una muestra de los genes de la
generación parental. Por lo tanto la frecuencia génica está sujeta a la variación debida al
muestreo, o sea a los individuos que se van a reproducir, siendo mayor esta variación mientras
menor es el tamaño de la población. Si aumento la población, menor es la variación de los genes
que van a pasar de los parentales a la descendencia. O sea si la población es muy pequeña, y
presentan una acumulación del 0,6 (A) y 0,4 (a), Si esta población es de 10 individuos y tienen esta
estructura genética. A la hora de reproducirse si sólo se reproducen (A), a la siguiente generación
ya desaparece el otro alelo (a). Pero si esa población es mucho más grande, tal que la probabilidad
de que el genotipo sea AA, Aa , aa, es mayor, por lo que la probabilidad de que los alelos se
mantengan en las generaciones aumenta, y la probabilidad de que se mantengan las frecuencias
génicas también es mayor.
A este cambio, causado por el número de individuos de la población se conoce como la deriva
génica. Esto se puede ver en los problemas de conservación de especies. Si existe una población
pequeña de individuos, el hecho de sacar animalitos de esa población, genera una variación muy
grande, pues el número se ve afectado mucho más…. (No es lo mismo sacar 10 si tienes 200, a
sacar 10 si tienes 20… se entiede jijij) Luego los poquitos animales que queden van a cambiar la
frecuencia génica.
Migración y Mutación:
La introducción de individuos, o el cambio de individuos de una población a otra y la mutación
génica, influyen obviamente en alterar la frecuencia génica.
Si tenemos la población Z y la W:
Se observa que en Z predominan los alelos A y que en W predominan los recesivos a. Por lo que la
migración de individuos desde Z a W va a cambiar la estructura genética de la población W y
viceversa. Por lo que las migraciones se dice que cambian la demografía de la población.
En tanto, suponga que en la población W un alelo a, muta a A1 y luego en otra generación otro
alelo muta a A2, esto también irá cambiando la estructura genética de la población. Esto porque
inicialmente, W tenía una frecuencia de A igual a uno. Pero después de esas dos mutaciones
tendrá una frecuencia de A igual a tres, y por tratarse de una mutación (o sea a se transformó en
A)la población W perdió alelos a, por lo que no sólo la frecuencia de A aumenta, sino que también
lo hace su frecuencia relativa..en relación al total.. no sé cómo explicarlo mejor =(
Selección:
La selección es la fuerza que hace que se afecte la eficacia biológica o adecuación de un individuo.
La selección es lo que hace que la eficacia biológica se vea disminuida. Es la capacidad que pueda
tener un individuo para perpetuar su especie, o es la viabilidad que tenga éste.
Si bien cuando estudiamos la estructura genética de una población, nos metemos a nivel de
genotipo, pues se estudia la frecuencia de los genes, sin embargo, no hay que olvidar el fenotipo
pues es donde actúa la selección. Si bien está codificado en el genotipo, la selección actúa en el
fenotipo, influenciando en dos características: La fertilidad y la viabilidad, de los individuos que se
están generando.
Por ejemplo en los individuos de una población donde hay ‘A’ y ‘a’ y los ‘a’ tienen una mayor
capacidad de reproducción, y además tiene una mayor viabilidad, su descendientes van a cambiar
la estructura de esta población, ya que los ‘a’ dejarán más descendencia que ‘A’.
Los gametos también pueden estar sujetos a selección, con una mayor o menor viabilidad o
capacidad de fecundarse.
Consideremos una población con un gen con dos alelos A, a, se tiene que:
f(A)=p
f(a)=q , tal que p+q=1
f(AA)=D
f(Aa)=H
f(aa)=R tal que D+H+R=1
Gametos
A a
(p) (q)
A AA Aa
Gametos
(p) P2 pq
a Aa Aa
(q) pq q2
Donde,
f(AA)=p2
f(Aa)=2pq
f(aa)= q2
¿Qué pasa con la población humana? En este sentido, hay que tener cuidado, pues si bien es una
población grande, muchas veces existe un predominio de con quién aparearse y con quién no.
También la población humana sufre mutaciones a lo largo de las generaciones. Hay que recordar
que para aplicar la ley, la población debe ser ideal.
Un ejemplo es un estudio en genética realizado por un médico chileno. Estudió las variaciones en
los grupos sanguíneos comparando el hospital san José y la clínica alemana, y vio que en Santiago,
existían dos poblaciones que no se mezclaban, sólo viendo las frecuencias génicas de los
individuos.
Sea
f(AA)=D p= D+ ½ H
f(Aa)=H q= R + ½ H
f(aa)=R
Gametos
AA Aa aa
(D) (H) (R)
AA D2 DH DR
(D)
Aa DH H2 HR
Gametos
(H)
aa DR HR R2
(R)
Genotipo y frecuencia
Cruce tipo f total AA Aa aa
AA x AA D2 D2 - -
AA x Aa 2DH DH DH -
AA x aa 2DR 2DR -
Aa x Aa H2 ¼ H2 ½ H2 ¼ H2
Aa x aa 2HR - HR HR
aa x aa R2 - - R2
Total 1**
Al sumar las frecuencias totales de cada cruce tipo, vemos que se comporta como el cuadrado de
un trinomio:
Talque
AA = D2 + DH + ¼ H2 = (D + ½ H)2 = P2
Aa = DH + 2DR + ½ H2 + HR = 2(D+ ½ H)(R + ½ H) = 2pq
aa = ¼ H2 + HR+ R2 = q2
(0,4)
tt 0,08 0,08 0,04
(0,2)
Si se especifican los tipos de cruzamientos, tenemos que:
Genotipo y frecuencia
Cruce tipo f total AA Aa aa
TT x TT 0.16 0.16 - -
TT x Tt 0.32 0.16 0.16 -
TT x tt 0.16 - 0.16 -
Tt x Tt 0.16 - 0.08 0.08
Tt x tt 0.16 0.04 0.08 0.04
tt x tt 0.04 - - 0.04
Total 1
Esto apunta a que si cambiamos las condiciones de equilibrio, y cambiamos a una frecuencia
genotípica distinta, cuando vuelvan las condiciones se va a restablecer el equilibrio. Más aun, si
nosotros cambiamos las condiciones y en realidad cambian las frecuencias génicas, se va a formar
una nueva generación cuando se establezca las condiciones de equilibrio, en la cual la
descendencia va a tener p2+ 2pq+ q2, el cual va a depender de la frecuencia alélica que estaba
justo antes de que cambiaran las condiciones. Por lo tanto va a corresponder a una frecuencia
génica determinada, que a la siguiente generación se va a mantener.
Talque q1 + q2 es distinto de 1, pues no se considera al resto de los alelos (recuerden que la suma
de todas las frecuencias es igual a 1, por lo que q1 + q2 + q3 +….+ qn =1
(p+q+r)2 = 1
A1 A2 A3
A1 p2 pq pr
A2 pq q2 qr
A3 pr qr r2
f(A1A1)= p2
f(A1A2)=2pq
f(A1A3)=2pr
f(A2A2)= q2
f(A2A3)=2qr
f(A3A3)= r2
Total = p2 + q2+ r2 + 2pq + 2pr + 2qr = (p+q+r)2 = 1
Ejercicio prueba:
Luego, dado que tenemos las frecuencias alélicas, reemplazamos estas de la siguiente forma:
ffA= p2 + 2pr = 0.53
ffB= q2 + 2qr = 0.13
ffAB = 2pq = 0.08
ffO = r2 =0.26 r = 0.26 =0.51
luego, para calcular p, utilizamos el truco matemático de que al sumar ffA + ffO, nos resulta un
cuadrado de binomio, donde p se hace muy fácil de despejar:
…Si bien hemos visto la ley de Harvey, en la realidad la frecuencia génica de la población puede
cambiar.. para que cambie es necesario las mutaciones, es decir serán las mutaciones quienes
generen un cambio en la frecuencia génica de un apoblación…
Cuando un gen muta en una población, tiene poca capacidad de sobrevivir en dicha población. Por
ejemplo: si AA Aa , Aa debe dejar descendencia para que la mutación persista.
Supongamos que el individuo Aa, deja un descendiente, existe ½ de probabilidad que su hijo deje
descendencia y ½ de que no lo haga. Por lo tanto, luego de una generación, la probabilidad de
permanencia de la mutación es ½. Consecuentemente, a la segunda generación la probabilidad
será de ¼.
Sea n el número promedio de hijos por familia, talque en este caso n=2, se tiene que, por una
distribución de piosson,
n 0 1 2 3 4 5
f Familias
e 2 2 e 2 22/2! e 2 23/3! e 2 24/4! e 2 25/5! e 2
Probabilidad
de eliminación 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32
del alelo
f familias x
Probabilidad
de eliminación e 2 e 2 1/2! e 2 1/3! e 2 1/4! e 2 1/5! e 2
Probabilidad total
de eliminación del = e 2 (1+1+ 1/2! +1/3! + 1/4! + 1/5! )= e 1 =0.3679
alelo nuevo
Probabilidad de
eliminación en la = e (1 0.3679) =0.5313
2ª generación
Probabilidad de
eliminación en la = e (1 0.5313) =0.6259
3ª generación.
Por lo que a media que pasan las generaciones aumenta la probabilidad de eliminar la mutación,
llegando a un 95% de probabilidad cuando han transcurrido 30 generaciones.
Note que después de n generaciones, la probabilidad de que sobrevida el alelo es de 2/n (en
verdad... no sé porqué)
Y a la segunda generación, lo que mute a ‘a’ será, una parte de lo que quedó de ‘A’ luego de la
primera generación, o sea:
Como el término 1- < 1 , entonces a mayor número de generaciones, éste término disminuye,
por lo que también lo hace fA.
A v a
Luego, inicialmente se tiene que:
fA= p0
fa = q0
Luego de la primera generación:
Debido a que ‘a’ se crea y se destruye (en términos simples), podemos decir que:
fa= x p0 - v x q0= q
Si lo que se crea de ‘a’ es lo mismo que lo que se destruye de ‘a’ (o se forma de ‘A’), entonces en
un equilibrio:
q= 0 = p0 - v q0
p0 = v q0 , recordando que p + q=1,
(1-q) = v q0
- q = v q0
=q0( + v )
v
q̂= p̂= , en equilibrio mutacional.
v v
Si =0.00005
v =0.00003
q̂ =5/8 =0.625
p̂ =3/8 = 0.375
Para que por mutación cambie la frecuencia génica de q de la forma; f =1/8 cambie a una
frecuencia de f =3/8, necesito 8664 generaciones.
Si el organismo tiene un periodo de reproducción de 10 años 86540 años, para que cambie la
frecuencia de la población.
Un ejemplo concreto de esto es que en drosophila se observa una predominancia de las moscas a
pasar de fenotipo silvestre a mutantes, pero aun así, la población de silvestres supera con creces a
la mutante.
Si los individuos portadores de ‘A’ tienen éxito superior en la reproducción que ‘a’, la frecuencia de
‘A’ será mayor que la de ‘a’.
1 s
Selección gamética
Genotipos Total
A a
Frec. Inicial p0 q0
Eficacia Biológica 1 1-s
Frec. Después de selección. p q(1-s) (1-s)q
A = p/(1-sq)
a= q(1-s)/(1-sq)
q= q1-q0= q(1-s) – q
(1-sq)
Genotipos
AA Aa aa Total f(a)
2 2
Frecuencia inicial p 2pq q 1 q
Valor adaptativo 1 1 (1- s)ª
2 2
Frecuencia post p 2pq 0 p + 2pq
selección
ª s =1 .
q= q -q = - q2 ?
1+q 1+q
¿Qué pasa cuando s no es letal?
AA Aa aa Total f(a)
2 2
f inicial p 2pq q 1 q
Valor 1 1 (1- s)
adaptativo
2 2 2
f post selección p 2pq q (1-s) 1-sq f(1-sq)
2
(1-sq )
q = -sq2(1-q)
2
(1-sq )
Si A es letal Si A no es letal
AA Aa aa AA Aa aa
Valor o o 1 1 1 (1-s)
Adapt.