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    Determinacion Gpo Amino (Sanger)

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    Este documento describe el método de Sanger para identificar el aminoácido alfa-amino terminal de la hemoglobina. La hemoglobina se derivatizó con DNFB para marcar el grupo amino terminal. Luego se hidrolizó la proteína y se extrajeron los derivados dinitrofenilados. Estos se analizaron mediante cromatografía, mostrando que el pico de la muestra problema coincidía con el de la DNP-valina, indicando que la valina es el aminoácido terminal de la hemoglobina.

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    Este documento describe el método de Sanger para identificar el aminoácido alfa-amino terminal de la hemoglobina. La hemoglobina se derivatizó con DNFB para marcar el grupo amino terminal. Luego se hidrolizó la proteína y se extrajeron los derivados dinitrofenilados. Estos se analizaron mediante cromatografía, mostrando que el pico de la muestra problema coincidía con el de la DNP-valina, indicando que la valina es el aminoácido terminal de la hemoglobina.

    Descripción original:

    Determinación de Grupo Amino Terminal por el Método de Sanger

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    Este documento describe el método de Sanger para identificar el aminoácido alfa-amino terminal de la hemoglobina. La hemoglobina se derivatizó con DNFB para marcar el grupo amino terminal. Luego se hidrolizó la proteína y se extrajeron los derivados dinitrofenilados. Estos se analizaron mediante cromatografía, mostrando que el pico de la muestra problema coincidía con el de la DNP-valina, indicando que la valina es el aminoácido terminal de la hemoglobina.

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    Este documento describe el método de Sanger para identificar el aminoácido alfa-amino terminal de la hemoglobina. La hemoglobina se derivatizó con DNFB para marcar el grupo amino terminal. Luego se hidrolizó la proteína y se extrajeron los derivados dinitrofenilados. Estos se analizaron mediante cromatografía, mostrando que el pico de la muestra problema coincidía con el de la DNP-valina, indicando que la valina es el aminoácido terminal de la hemoglobina.

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    DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS

    TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE


    (MÉTODO DE SANGER)

    OBJETIVOS Durante este proceso se debe mantener un pH alcalino


    (entre 8-9). Posteriormente se adiciono HCl al 3N, con la
    Identificar el aminoácido alfa-amino terminal de las finalidad de detener la reacción, ya que el ácido protona
    cadenas de la molécula de hemoglobina mediante el los grupos amino libre que hayan quedado sin protonar.
    método de Sanger.
    De inmediato se procedió a hacer 3 extracciones con éter
    RESULTADOS saturado y solución acuosa de FeSO4, el primero disuelve
    al DNFB al ser no polar, y el FeSO4 facilita la extracción
    MUESTRA Rf del DNFB. Posteriormente se desecharon los extractos
    DNP-Phe etéreos, después se colocó el tubo que contenía la
    0.5887
    proteína dinitrofenilada en un baño maría para evaporar
    DNP- Ala 0.6261 los residuos de éter, al termirar se procedió a centrifugar
    DNP- Val 0.6976 a 3000 rpm durante 15 minutos.
    DNFB 0.5214
    Al finalizar se agregaron 5 mL de HCl 6N y se calentó en
    PROBLEMA 0.7095
    autoclave durante 3 horas a 15 lb/in 2. Es aquí cuando se
    ha llevado a cabo la hidrolisis de la proteína.

    Posteriormente se adicionó 5 mL de agua destilada, y se


    procedió a realizar 3 extracciones del hidrolizado
    utilizando 5 mL de éter, cada extracción se trasladó a un
    vaso de precipitados limpio. Al finalizar, se evaporo el éter
    del vaso de precipitados con un calentamiento en un baño
    maría hasta llegar a la sequedad. Por último, el producto
    obtenido del calentamiento se disolvió con 0.5 mL de
    etanol.

    Posteriormente se preparó el cromatograma con las


    muestras de DNP-Phe, DNP- Ala, DNP- Val, DNFB y
    Imagen 1: Cromatograma. problema (derivado dinitrofenilado de la hemoglobina).
    Muestras de DNP-Phe, Después el cromatograma se colocó una cámara
    DNP- Ala, DNP- Val,
    previamente saturada con Citrato de sodio-ácido cítrico,
    DNFB y Problema. (De
    izquierda a derecha) se dejó saturar durante casi 1 día, al día siguiente se dejó
    correr a la fase móvil durante 5 horas aproximadamente.

    Después se obtuvieron los valores de Rf para cada


    DISCUSIONES muestra, en la tabla podemos observar que el Rf de la
    Se colocó en un tubo de ensaye 30 mg hemoglobina y se muestra problema (0.7095) es muy cercano al Rf de la
    adición bicarbonato de sodio al 4.2%, esto con el fin de DNP-Val (0.6976), de igual forma observamos en la
    desprotonar el grupo amino de la hemoglobina. imagen 1, que la mancha correspondiente a la muestra
    problema, se encuentra aproximadamente a la misma
    El nitrógeno con su par de electrones (grupo amino altura que la mancha de DNP-Val. También podemos
    desprotonado) le agregamos DNFB, la reacción que notar que una pequeña mancha de la muestra problema
    ocurre durante la agitación, es que el par de electrones coincide con la mancha del DNFB, esto nos quiere decir
    del grupo amino, ataca al carbono del DNFB que tiene al que en nuestra muestra encontramos pequeños residuos
    flúor pegado, por lo tanto este átomo de flúor sale del de DNFB.
    anillo aromático, y en su lugar queda unido al anillo el
    grupo amino.
    1
    CONCLUSIONES

     Se comprobó que la Valina corresponde al grupo


    amino terminal de la hemoglobina.
     Se encontraron pequeños residuos de DNFB en
    la muestra de hemoglobina.

    BIBLIOGRAFÍA

    1. Devlin Thomas, “Bioquímica con aplicaciones”,


    4ta, Edición, Editorial Reverté, 2004, España.

    2. E. Conn Eric, “Bioquímica fundamental”,


    Universidad de California, Editorial Limusa, 2001,
    México D.F.

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