UNIVERSIDAD NACIONAL

AGRARIA LA MOLINA

INFORME 7

Ttulo: Tcnicas de cultivo de microorganismos

Integrantes:
20150447-NIQUEN CURO, Jorge Alberto
20150449-ORDOEZ RUIZ, Jean Carlo
20150451-OTERO CHUNGA, Sthefany Margarita
20150465-VILCAPOMA TORRES, Rodrigo Amador

N DE MESA: 4

GRUPO DE PRCTICA: Jueves 11-1, E*

2016
INTRODUCCION

Los microorganismos sin seres vivos que solo pueden visualizarse con el microscopio, se
encuentran en todos lados; en el suelo, agua, superficies corporales, alimentos e incluso en el
aire. La mayora son unicelulares; sin embargo tambin existen microorganismos multicelulares
como algunas algas u hongos, cabe mencionar que tambin los virus forman parte de los
microorganismos en el campo de estudio de la microbiologa aunque no son considerados seres
vivos.

Muchos microorganismos no son prejudiciales y juegan un papel muy importante en la vida de

diferentes especies, por eso que se debe hacer un adecuado cultivo de estos. La supervivencia
y crecimiento continuo de microorganismos depende de un suministro adecuado de nutrientes
y un ambiente favorable para su crecimiento.

Existen varios mtodos de siembra de microorganismos, para nuestra utilizamos el mtodo de

siembra por estras en placa y el mtodo de siembra por diluciones; lo cual nos ayuda a separar
colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismos utilizando tcnicas de
aislamiento. El mtodo por estras es el ms fcil y el ms utilizado para obtener cultivos axnico,
para ello con un asa se toma una muestra de la poblacin mixta y a continuacin se hacen estras
sobre la superficie.

El mtodo por diluciones se puede evaluar diferentes grupos bacterianos segn el medio de
cultivo que contenga el frasco. La tcnica de dilucin por extincin consiste en inocular una serie
de frascos tipo antibitico que contienen 9 ml del medio de cultivo apropiado segn el tipo de
bacteria que se quiera evaluar.
Se obtiene 1 ml de la muestra usando una jeringa descartable, estril, de 1 o 2 ml de capacidad.
Se inocula el primer frasco, sin retirar la aguja se agita el mismo, se invierte y se retira 1 ml que
se inocula en el 2 frasco.

Con una nueva jeringa, se retira 1 ml del frasco N 2, previamente agitado, y se inocula el frasco
N 3 y as sucesivamente, utilizando una nueva jeringa para cada frasco.

A partir de colonias separadas suficientemente, es posible obtener un cultivo puro de cada uno
de los tipos de bacterias presentes en la muestra original. El xito del asilamiento, depende de
la superficie sobre la que se ha distribuido la muestra.
 OBJETIVOS

Al finalizar la prctica, debemos haber aprendido a observar las caractersticas de crecimiento

de los microorganismos al trasplante en medio de cultivo lquido y slido (Ejercicio 1) y separar
colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismos utilizando tcnicas de
aislamiento (Ejercicio 2).

MARCO TEORICO

Tcnicas para obtener cultivos puros segn (Hernndez, 2003)

TCNICAS PARA OBTENER

CULTIVOS PUROS

La siembra en placas de Petri por La siembra en placa vertida Las diluciones en serie
rayado
En esta tcnica se hacen crecer los Esta tcnica se aplica cuando
Est tcnica se basa en la microorganismos en tubos, cada uno con se conoce de antemano que
separacin de los microorganismos una concentracin diferente, y se evala el microorganismo de inters
al dispersar-por rayado sobre agar- el tubo en el que las colonias crecieron en se encuentra en mayor
una muestra que los contiene. Para forma separada. cantidad que los dems. Para
llevar a cabo la disgregacin, se llevarla a cabo, se preparan
Primero, se separan suspensiones de la varias diluciones de la
recoge una porcin de la muestra
muestra en diversas diluciones y se coloca muestra y se incuban en el
con un asa bacteriolgica y se raya
cada uno en un tubo con agar fundido. medio de cultivo adecuado
sobre una seccin de una placa de
Luego, se mezcla homogneamente el para que crezca este
Petri; luego se repite el rayado en
contenido de cada tubo y se vierte en una microorganismo; as, se logra
tres secciones ms de la placa.
placa de Petri. Se incuba cada placa, a la que en alguna de las
temperatura y el tiempo recomendados, y diluciones solo l aparezca. Es
se selecciona la dilucin en la que se haya necesario reconfirmar su
obtenido una mayor separacin de las presencia, utilizando el
Los microorganismos dispersos en colonias. Por ltimo, de esta dilucin, se mtodo de siembra en placa
la placa se incuban a la toma una muestra de una de las colonias de Petri por rayado.
temperatura y el tiempo y se siembra en una placa de Petri, por
recomendados; al crecer, forman rayado, para confirmar si el cultivo est
colonias separadas una de otras en puro.
alguna de las secciones del rayado.
Clasificacin de los medios de cultivo por su aspecto fsico segn (Negroni, 2009)

Se denominan comnmente caldos, estn

constituidos por nutrientes en solucin acuosa
Lquidos y son semejantes a un caldo casero filtrado y
esterilizado. Por lo general, se los utiliza para el
mantenimiento de los microorganismos.

Llamados generalmente agar, obtienen

aadiendo a un medio de cultivo lquido una
sustancia gelificante como el agar. Para su
manipulacin en laboratorio estos medios deben
colocarse en cajas de Petri o en tubos de ensayo.
Por su estado fsico Slidos
En estos ltimos, el medio de cultivo puede
dejarse solidificar con un tubo inclinado para
obtener una mayor superficie de siembra o
dejarse enfriar con el tubo en posicin vertical.
Se utilizan para aislar e individualizar los distintos
tipos de microorganismos presentes en una
muestra.

Son medios de cultivo lquidos con el agregado

Semislidos de agar al 0,3 o 0,5%. Puede utilizrselos para
determinar la motilidad de los grmenes.
Caractersticas de agar inclinado, agar vertical y caldo nutritivo (Patricia Moreno)

a) Crecimiento en estras sobre agar inclinado

Cantidad Escasa, moderada o abundante

Distribucin en la superficie Uniforme o irregular

Forma de crecimiento Arborescente, equinulado, rizoide, filiforme,

difuso, etc.

Consistencia del crecimiento Butiroso, viscoso, fibroso

Pigmentacin Coloracin del cultivo

b) Crecimiento en agar vertical por picadura profunda

-Limitado a la lnea de inoculacin o picadura

Crecimiento -Con propagacin fuera de la lnea de

inoculacin

-Superficial o en profundidad o ambas a la vez.

c) Crecimiento en caldo nutritivo

Cantidad Escasa, moderada o abundante

-Turbidez, aparicin de opacidad en el medio

 -Sedimento, depsito de clulas en el fondo
del tubo; si el tubo se agita el sedimento se
Apariencia o tipo resuspende en el caldo

-Formacin de pelcula, masa de clulas en la

superficie del caldo

-Mucosidad, depsito de clulas que

permanecen adheridas y no disgregan an si
el tubo se agita.

MATERIALES Y METODOS

- Asa de Kolle: Consiste de dos piezas: el mango de Kolle y el asa, de bronce cromado y
mango con bakelita. Son de un material inoxidable. Sirve para tomar muestras
y poder realizar el cultivo en las placas Petri.

FUENTE: https://www.google.com.pe/search?q=ASA-KOLLE
biw=1517&bih=735&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwjsm92ZpPrPAh
UCTSYKHUHoDHAQ_AUIBigB&dpr=0.9#imgrc=jOiqrr6Nv5smUM%3A
- Mechero de alcohol: Es una fuente de calor, de baja intensidad, que funciona con alcohol
etlico. Como un accesorio de seguridad se utiliza una pieza que en caso de accidente,
cubre la entrada de oxgeno, de manera que el fuego se sofoca. Se utiliza en laboratorio
para hacer combustin.

FUENTE:https://www.google.com.pe/search?q=MECHERO&biw=1
517&bih=735&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwjsm9
2ZpPrPAhUCTSYKHUHoDHAQ_AUIBigB&dpr=0.9#imgrc=jOiqrr6

- Placas PetriNv5smUM%3A
estriles: Es un recipiente redondo, de cristal o plstico, con una cubierta de
la misma forma que la placa, pero algo ms grande de dimetro, para que se pueda
colocar encima y cerrar el recipiente, aunque no de forma hermtica
 FUENTE: PROPIA
- Agar nutritivo inclinado: Se realizan llevando el agar a punto de ebullicin y vertindolo
en un tubo de ensayo. Antes de que el agar se enfre y solidifique, el tubo de ensayo se
coloca inclinado sobre un lado. Una vez que el agar se enfra, el tubo puede volver a
colocarse en posicin vertical y el agar que se encuentra en su interior se ver inclinado.

FUENTE: PROPIA

- Agar nutritivo vertical: Se disuelve calentando y agitando hasta ebullir, se ajusta el pH a

7,2, distribuyndose en tubos aproximadamente 10 ml, se esteriliza en autoclave a 120
durante 20 minutos, dejamos que solidifique en posicin vertical.

FUENTE: PROPIA
- Caldo nutritivo: Es un medio lquido, que es apropiado para que crezcan bacterias y se
reproduzcan. Hay muchos caldos de cultivos diferentes, de acuerdo al tipo de bacterias
que quieras que crezcan y se reproduzcan, pero en s, es un medio liquido enriquecido
con sustancias necesarias para la vida de las bacterias

FUENTE: PROPIA
- Escherichia Coli: Es tipo de bacteria que vive en el intestino. La mayora de las E. coli no
causan problemas. Pero, algunos tipos pueden producir enfermedades y causar diarrea.
Uno de ellos causa la diarrea del viajero. El peor tipo de E. coli causa una diarrea
hemorrgica y a veces puede causar insuficiencia renal y hasta la muerte

FUENTE: PROPIA

- Placas para la dilucin para Agar nutritivo y Agar Mac Conkey:

FUENTE: PROPIA FUENTE: PROPIA

RESULTADOS

EJERCICIO N1: Tcnicas de cultivo de microorganismo: Caractersticas de crecimiento en

medio de cultivo

Caldo de cultivo Agar inclinado Agar vertical

EJERCICIO N2: Tcnicas de cultivo de microrganismos: aislamiento y recuento en placas

POR ESTRIAS

POR DILUCIONES
 DISCUSIONES

Agar nutritivo vertical

En el caso de las bacterias Bacillus sp., el crecimiento, adems de observarse en la
cicatriz de la aguja, tambin se observ en la superficie del agar alrededor de la zona
donde fue realizada la puncin.
Caldo nutritivo
Se coloc bacterias del gnero Bacillus sp. se observ un desarrollo de burbujas en la
superficie del lquido, donde tambin se apreci una especie de pelcula formada, y
nuevamente un precipitado en el fondo del tubo.

Aerbicos Aerbicos Anaerbicos Anaerbicos

Microaerfilos
estrictos facultativos estrictos aerotolerantes

Efecto del Solo crecen los Crecen tanto Solo crecen los Solo crecen los Solo crecen los
oxgeno sobre aerbicos, aerbicos como anaerbicos; el anaerbicos pero el aerobios; requieren
el crecimiento requieren anaerbicos; el crecimiento crecimiento oxgeno en bajas
oxgeno. crecimiento es cesa en continua en concentraciones.
mayor en presencia de presencia de
presencia de oxgeno. oxigeno
oxgeno.

Crecimiento
bacteriano en
un tubo que
contiene medio
de cultivo
solido
Explicacin de El crecimiento El crecimiento El crecimiento El crecimiento El crecimiento
los patrones de sucede solo es mejor donde sucede solo sucede de manera sucede solo donde
crecimiento donde se hay mayor donde no hay uniforme; el se difunden
difundieron cantidad de oxigeno oxgeno no tiene concentracin baja
concentraciones oxigeno pero se efecto de oxgeno en el
elevadas de produce en gran medio.
oxgeno en el parte del tubo
medio.

Explicacin de La presencia de La presencia de Carecen de La presencia de una Produce cantidades

los efectos del las enzimas las enzimas enzimas para enzima, SOD, letales de formas
oxgeno. catalasas y catalasa y SOD neutralizar las permite que solo se toxicas del oxgeno
superxidodismut permite que se formas nocivas neutralicen en si se exponen al
asa (SOD) permite neutralicen las del oxgeno; no parte las formas oxigeno atmosfrico
que se formas toxicas pueden tolerar toxicas del oxgeno, normal.
neutralicen las del oxgeno; oxgeno. toleran el oxgeno.
formas toxicas del pueden utilizar
oxgeno; pueden oxgeno.
utilizar oxigeno

Cuadro 1. Efecto del oxgeno sobre el crecimiento de diversos tipos de bacterias.

(Fuente: Tortora, 2007)

El gnero Bacillus sp. est formado por un grupo grande de bacilos Gram positivos, catalasa
positiva caracterizada por la capacidad para formar esporas en condiciones aerobias. Este
gnero abarca tanto microorganismos aerobios como anaerobios facultativos. Los
microorganismos aerobios obligados requieren oxgeno molecular como aceptor final de
electrones, que derivan en la formacin de agua y no obtienen energa por vas fermentativas.
(Koneman, 2008)

Las bacterias del genero Bacillus sp. solo pueden ser aerbicos o anaerbicos facultativos, y la
evidencia mostrada (mancha blanca en la base del tubo), no sera concordante para este
microorganismo.

En el tubo de agar vertical, se manifiesta tambin el carcter aerobio en la preferencia de estas

bacterias por crecer en la grieta de la aguja e incluso al abrirse paso hacia el exterior de la grieta
y desarrollar su crecimiento en la superficie del agar, donde pueden encontrar ms fcilmente
el oxgeno que necesitan.
En los tubos de agar nutritivo inclinado se pudo apreciar en qu forma se daba el crecimiento
de las bacterias a lo largo del rea donde se realiz la inoculacin. Para la clasificacin de la
forma tomada en cada tipo de bacteria estudiado, se utiliz una clasificacin explicada por
Rodrguez et al. (2005):

Figura XX: Tipos de crecimiento de bacterias en tubos de agar inclinado.

(Fuente: Rodrguez et al., 2005)

Para Bacillus sp, el crecimiento en la base de la lnea realizada durante la inoculacin fue efuso,
pero en el resto de la superficie el crecimiento fue semejante al filiforme.
Placa Petri con el Agar Mac Conkey
Luego del cultivo de una mezcla de microorganismos en una placa Petri con Agar Mac Conkey,
se observ cmo resultados despus de 24 horas el crecimiento de un microorganismo con
caractersticas particulares: pigmentacin rojiza, un crecimiento fuera de la lnea de inoculacin.
El agar Mac Conkey es un medio de cultivo con carcter diferencial y selectivo simultneamente,
nos indica que existe la presencia en la mezcla de algunas bacterias Gram negativas lacto
fermentadoras; al cultivar una mezcla de microorganismos se reconoce la presencia tanto de
bacterias Gram positivas como Gram negativas, sin embargo el cristal violeta, componente del
Agar Mac Conkey, acta como un bacteriosttico para las Gram positivas, siendo as el
componente selectivo de este Agar ya que inhibe el crecimiento de stas; otro componente del
agar Mac Conkey es el indicador rojo de metilo que tiene un viraje de rojo a un pH 4.4 por la
presencia de cido lctico en el agar como un producto del metabolismo de bacterias lacto
fermentadoras ya que son capaces de producir lactasa, obteniendo energa a travs de
compuestos qumicos, como la lactosa que acta como un componente diferencial en el agar
Mac Conkey; con esta tcnica no solo se asla una especie, ms bien se logra el mantenimiento
del individuo y su descendencia, por ello es que al observar el agar despus de 24 horas, se
puede llegar a conocer las caractersticas de crecimiento de bacterias lacto fermentadoras: con
pigmentacin rojiza y forma difusa, con una propagacin fuera de la lnea de inoculacin. Segn
Steiner et al (2005), el mtodo de siembra por estra, tiene como objetivo que el inoculo se vaya
diluyendo progresivamente con cada estra sucesiva, de tal manera de que si las estras iniciales
crecen de una manera confluente a lo largo de la siembra se vayan desarrollando colonias bien
aisladas, lo que se observ en los resultados, que las bacterias crecieron confluentemente en
una zona y luego de manera difusa fueron formando colonias aisladas y en menor nmero en la
zona terminal de la siembra.

Placa Petri con el Agar Manitol

Luego de cultivar la mezcla de microorganismos en el Agar Manitol, se observ cmo resultados

luego de 24 horas, el crecimiento de un microorganismo con caractersticas especiales: con una
coloracin anaranjado-amarillento y crecimiento en la lnea de inoculacin, esporulado; el
crecimiento de bacterias en el agar manitol tienen la caracterstica de fermentar manitol, que
es un componente de carcter diferencial en este tipo de agar, segn Garca et al. (2000) las
bacterias Staphylococcus sp, son fermentadoras del manitol con una coloracin amarilla o
anaranjada, caracterizando el equipo enzimtico diferente de las colonias blancas de las dems
especies. Es por ello que se deduce que en la mezcla de bacterias se encontraban bacterias Gram
negativas fermentadoras de manitol.
Los resultados en el Agar Manitol, concuerdan con las caractersticas descritas, se observ
colonias muy juntas en la zona de inicio de la inoculacin, y al final las colonias se observan
separadas por ende se deduce que cada colonia procede de una bacteria progenitora, cuyos
individuos son de una sola especie. Una colonia que se desarroll separada de las otras, al ser
transferida a un medio de cultivo nuevo, dar lugar a un cultivo puro, es decir un conjunto de
individuos de una sola especie.

Aislamiento por diluciones sucesivas.

En la primera dilucin, las colonias que crecieron, son muchas hay un estimado de 40 pero son
pequeas, pero si podemos utilizar estas placas para el recuento ya que para este procedimiento
se usan las placas que contienen entre 30 y 300 colonias. (Prescott 2009)
El nmero total de colonias es igual al nmero de microorganismos viables de la muestra que
son capaces de crecer en el medio empleado. Adems las colonias que crecen en la superficie
pueden usarse para inocular medios frescos y obtener cultivos puros. (Prescott 2009).
En el laboratorio solo realizamos dos diluciones sucesivas pero generalmente la muestra original
es diluida varias veces para reducir suficientemente la poblacin. Las muestras ms diluidas son
vertidas en placas Petri; entonces las clulas aisladas crecen y dan lugar a colonias, que pueden
usarse para iniciar cultivos puros, las colonias de la superficie de la placa son circulares, mientras
que las colonias inmersas en el agar son leticulares (con forma de lenteja). (Prescott 2009).

CONCLUSIONES

Para poder cultivar una especie especfica a partir de una mezcla de microorganismos
se emplear tcnicas de aislamiento para su obtencin en forma pura. Para ello, nos
valdremos de diversas transferencias y de medios comunes o especiales, segn la
naturaleza del microorganismo.
Las tcnicas de cultivo por aislamiento pueden dividirse en aislamiento por agotamiento
de superficie, tambin conocido como aislamiento por estras y en aislamiento por
diluciones sucesivas.
El aislamiento por estras consiste en un plaqueo del agar, diseminar el microorganismo
en el agar, el cual est dispuesto en una placa. Para ello, en nuestro experimento
utilizamos una mezcla de E. coli, Staphylococcus sp. , Bacillus sp.; siendo esta mezcla
plaqueada en placas de Agar Mac Conkey y Agar Manitol salado. En el Agar Mac Conkey
crecer E. coli y en el Agar Manitol salado crecer Staphylococcus sp.
El aislamiento por diluciones sucesivas consiste en hacer diluciones seriadas de la
muestra original y traspasar las alcuotas de estas diluciones a placas Petri.
Tericamente se realizan un sinnmero de diluciones, siendo la extraccin de la muestra
de 1 mL y el Agar nutritivo licuado de 9ml. En este laboratorio lo que hicimos fueron 2
diluciones de la mezcla. De la placa de la primera dilucin se observar una gran
cantidad de microorganismos, no pudiendo ser diferenciados claramente; en cambio,
en la segunda dilucin, se podr observar colonias ms individuales.
Se realiz la observacin de caractersticas de crecimiento de los microorganismos
mediante el trasplante a medios de cultivos slidos y lquido. Realizndose el trasplante
a caldo nutritivo, Agar nutritivo inclinado y Agar nutritivo vertical.
Segn en la posicin donde creci el microorganismo pudimos tratar de clasificar su
crecimiento segn el efecto del oxgeno en: Microaerfilos, aerotolerantes, anaerobios
facultativos, anaerobios estrictos, aerobios.
CUESTIONARIO

EJERCICIO N1: Tcnicas de cultivo de microorganismo: Caractersticas de crecimiento en medio

de cultivo

1. Por qu algunos microorganismos se desarrollan en caldo un caracterstico

crecimiento tipo pelcula? Qu factores ambientales podran alterar la formacin de
una pelcula superficial?
Los biofilms se definen como comunidades de microorganismos que crecen embebidos
en una matriz de exopolisacridos y adheridos a una superficie inerte o un tejido vivo.
(Uzcudun). Cuando algunos tipos de bacterias o de levaduras patgenas crecen sobre
superficies forman biopelculas (biofilms) en los que las clulas se asocian entre s
mediante capas de polisacridos que forman una pelcula que recubre la superficie
sobre la que se encuentran las clulas. Los biofilms son importantes porque los
microorganismos que los forman resultan ms resistentes a antibiticos y al ataque de
clulas del sistema inmune y, por consiguiente, las infecciones que producen son ms
difciles de tratar. Adems, dentro de los biofilms (que pueden estar formados por
microorganismos de diferentes especies) se facilita la transferencia horizontal de genes
entre lo que facilita la dispersin de factores de virulencia o de resistencias a
antibiticos. (MICROBIOLOGA CLNICA, 2008 - 2009)

2. Cuando se utiliza tubos de agar inclinado para el estudio de las caractersticas de

crecimiento es preferible inocular con aguja de Kolle y no con asa. Por qu?
La aguja de Kolle facilita el sembrado del cultivo, si lo comparamos con el asa de Kolle,
ya que solo es necesario introducir una fina lnea dentro del agar al momento de la
inoculacin. Adems la cantidad de inculo debe ser relativamente pequea, en cambio
el asa recoge cantidades un poco mayores.

3. Qu factores influenciaran en la abundancia del crecimiento en caldo, agar inclinado

y agar vertical?
- La disponibilidad de nutrientes en el medio
El medio de cultivo necesariamente deber contener carbono, nitrgeno, azufre,
fsforo y sales inorgnicas. En algunos casos se necesitaran factores de
crecimientos como vitaminas, entre otros. Se debe preparar el cultivo segn
la naturaleza y los requerimientos nutricionales del microorganismo.
- La disponibilidad de oxgeno y otros gases
Segn el efecto del oxgeno del oxgeno sobre los microorganismos, estos se ubicarn
en diversas posiciones dentro del tubo de ensayo con agar. Como ya se ha mencionado
previamente los microorganismos pueden ser clasificados segn su requerimiento de
oxgeno como: aerobios, anaerobios estrictos, anaerobios facultativos, aerotolerantes,
microaerfilos.
- El pH
Por lo general, la mayora de bacterias suelen desarrollarse en un pH neutro, resultando
inhibidas en el cultivo de hongos debido a su pH ligeramente cido
- Humedad
 - Luz ambiental
- Temperatura
Hay que tener en cuenta que tipo de microorganismo estamos cultivan, si bien son
mesfilos, psicrfilos o termfilos. Siendo necesario para los psicrfilos una
temperatura ptima de 15 C, para los mesfilos, 20 entre 40 C y por ltimo para los
termfilos, entre 50 a 65 C.

EJERCICIO N2: Tcnicas de cultivo de microrganismos: aislamiento y recuento en placas

1. Qu procedimiento seguir a continuacin del desarrollo en estos ejercicios para

obtener el cultivo puro de cada cepa contenida en la mezcla? Cmo podramos
comprobar que estas cepas obtenidas finalmente corresponden a las colonias
aisladas?
En primer lugar se debe hacer un proceso de aislamiento de colonias el cual consiste en
diseminar estos microorganismos en una placa de muestra de tal manera que puedan
desarrollarse de forma separada. Luego de muestra de tal manera que pueda
desarrollarse de forma separada. Luego se proceder a transportar con ayuda de un asa
de Kolle una muestra del microorganismo a un tubo con agar nutritivo para el
crecimiento del mismo.

2. Qu factores limitan el tamao de las colonias en una placa de cultivo?

El pH es una de los factores ms importantes, que determinan el tamao de las colonias
en una placa de cultivo; la humedad, tambin tiene influencia en la forma y tamao de
la colonia; el potencial de xido reduccin y el contenido nutricional presente en el
medio cultivo, son otros factores limitantes.

3. Suponga que recibe una muestra de leche en polvo y se le pide determinar el nmero
total de colonias por gramo. Plantee una metodologa cuantitativa basada en
diluciones sucesivas para resolver el problema.
Dado que la muestra es slida, debe licuarse 10 g de muestra con 90 ml de agua
destilada. Para luego transferir con una pipeta 1 ml de la suspensin inicial en un tubo
con 9 ml de diluyente estril.
Para una ptima precisin no introducir la pipeta ms de 1 cm en la suspensin
Inicial y evitar el contacto entre la pipeta que contiene el inculo y el diluyente estril.
Mezclar utilizando preferentemente un agitador mecnico durante 5 segundos a 10
segundos para obtener la dilucin. Despus de la incubacin por el perodo especificado,
seleccionar las placas que de ser posible, tengan menos de 300 colonias
Examinar las placas bajo una luz tenue. Se examinan los objetos dudosos
detenidamente, utilizando lentes de aumento si es necesario, para poder distinguir las
colonias de otros materiales.
4. En qu consiste la tcnica del nmero ms probable y que usos tiene?
La tcnica del Nmero Ms Probable (NMP), tambin conocido como el mtodo de
los ceros de Poisson, es una estrategia eficiente de estimacin de densidades
poblacionales especialmente cuando una evaluacin cuantitativa de clulas individuales
no es factible.
El mtodo se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de
atributos especficos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones
consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en la estimacin
de la densidad bacteriana por el mtodo estadstico de mxima probabilidad, utilizando
la teora de diluciones. El mtodo requiere la realizacin de una serie de diluciones en
serie de la muestra de cultivo, en un medio lquido adecuado para el crecimiento de
dicho organismo de un volumen diez veces mayor.
5. De qu manera se pueden preservar cepas puras por largos periodos?
Existen varios mtodos para la conservacin de los microorganismos-, todos buscan que
las clulas sufran el dao mnimo y se preserven por el mximo periodo posible. Los
cuatro procedimientos generales son:

La siembra
Este mtodo consiste en sembrar el microorganismo en determinado medio de cultivo
y, luego, conservarlo en refrigeracin. El procedimiento debe repetirse cada cierto
tiempo. Se lleva a cabo en tubos de ensayo con agar inclinado, o en botellas especiales
que contienen un medio de cultivo slido y estril. Una de las desventajas del mtodo
es que los tubos guardados en refrigeracin se deshidratan y, entonces el
microorganismo muere, por esta razn, es necesario repetir el procedimiento
peridicamente.

La desecacin
El mtodo consiste en remover el agua celular e impedir la rehidratacin de las clulas
de los microorganismos. Para llevarlo a cabo se inocula una muestra de cultivo en tierra
hmeda estril (material de soporte), se separa hasta que haya crecimiento (vatios das)
y, luego se seca con aire a vaco. Despus, el cultivo se guarda en una atmsfera seca o
en refrigeracin. Otros materiales de soporte pueden ser slica gel, discos de gelatina y
tiras de papel. Entre las ventajas del mtodo se puede mencionar que no necesita
equipo especial ni mucho personal para ejecutarlo y, si no sufre daos durante la
desecacin, el cultivo puede continuar viable por muchos aos

La congelacin
La congelacin es, al igual que la liofilizacin, uno de los mtodos de mantenimiento
ms utilizados, porque se logran los periodos de conservacin ms largos (superiores a
veinte aos, cuando se utiliza nitrgeno lquido).En el proceso de congelacin lo ms
importante es controlar la velocidad de disminucin de la temperatura, porque, si es
muy lenta, los cristales que se forman a partir del lquido contenido en las clulas sern
muy grandes y pueden romper la membrana celular.
 La liofilizacin
Es la remocin de agua de las clulas congeladas (slidas) a presin reducida
(sublimacin). Para llevar a cabo este procedimiento, se toma una muestra de cultivo
por conservar y se suspende en algn medio con crio protectores, como leche, suero o
glutamato de sodio. Se transfieren unas gotas de la muestra a una ampolla, se congela
y se somete a alto vaco hasta que el agua celular se sublima (pasa de estado slido al
gaseoso). Una vez liofilizada la cepa, la ampolla que la contiene se sella para impedir
que el microorganismo se altere por el contacto con el medio ambiente.

6. Qu tcnicas de cultivo se emplean para aislar microorganismos anaerbicos?

El aislamiento de microorganismos anaerbicas por mtodo de siembra, es un
aislamiento diferente a los dems ya que plantea problemas especiales. Siempre que los
microorganismos en cuestin no mueran muy rpido al ser expuestos al oxgeno, las
placas pueden preparase de la manera normal y luego incubarse en recipientes, de los
cuales se les tiene que eliminar el oxgeno. Para los anaerbicos ms sensibles al
oxgeno, es preferible una modificacin de este mtodo, denominado cultivo por
dilucin y agitacin. Un tubo con agar fundido y enfriado se inocula y se mezcla,
aproximadamente la dcima parte de su contenido se transfiere a un segundo tubo el
cual se mezcla a su vez y se utiliza para inocular un tercer tubo de la misma manera.
Despus de haber preparado de 6 a 10 disoluciones sucesivas, los tubos se enfran
rpidamente y se encierran hermticamente una forma es verter un capa de vaselina y
parafina, con el fin de evitar el acceso del aire a la columna de agar.

Bibliografa
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