1 INTRODUCCIN

En los ltimos aos se ha desarrollado un gran nmero de biosensores microbianos para

aplicaciones medioambientales, alimentarias y biomdicas. Estos biosensores son dispositivos
analticos que surgen de la combinacin de un microorganismo en contacto ntimo con un
transductor fsico adecuado, en el que se genera una seal medible proporcional a la
concentracin de analito/s. En ellos se utilizan, como sustitutos de las enzimas libres, tanto
clulas no viables, preparadas por mtodos diversos, p.ej. permeabilizacin, como clulas
completas de las que se aprovechan las enzimas periplsmicas, pudiendo ser monitorizadas
todas aquellas especies que acten como sustratos o inhibidores de los procesos implicados en
las funciones respiratoria y metablica de la clula. Los biosensores microbianos pueden
clasificarse en biosensores de medicin de respiracin o de metabolitos. Los primeros se basan
en la inmovilizacin de microorganismos aerbicos sobre un electrodo de oxgeno. Cuando un
sustrato, que puede ser metabolizado por el microorganismo, se encuentra en una disolucin
saturada de O2, ocurre una reaccin metablica con consumo de oxgeno, por lo que puede
llevarse a cabo la determinacin de esa especie por la disminucin de la presin de este gas.
Mediante el uso de estos biosensores pueden determinarse, por ejemplo, parmetros de calidad
de las aguas, como la demanda bioqumica de oxgeno (DBO), y llevar a cabo la cuantificacin
de diversas sustancias, como glucosa, cido actico o alcoholes en alimentos.

Los biosensores microbianos de medicin de metabolitos son capaces de detectar el metabolito

producido por una reaccin catalizada por el microorganismo inmovilizado. Usando distintos
tipos de sensores de gases o de iones, pueden monitorizarse los analitos de inters. Por ejemplo,
se han utilizado electrodos de clula de H2 para determinar cido frmico, electrodos de CO2
para cido glutmico y lisina, y electrodos de pH para cefalosporina y cido nicotnico. Tambin
existen biosensores hbridos basados en la combinacin de un biosensor microbiano y una
membrana con enzimas inmovilizadas. Un ejemplo es el biosensor de urea basado en la
combinacin de una membrana de ureasa y un sensor microbiano de NH3 usando bacterias que
causan nitracin. Este sensor resulta ventajoso frente al convencional potenciomtrico de
amonio ya que se minimizan interferencias inicas o de compuestos voltiles como las aminas.
2 HISTORIA Y EVOLUCIN DE LOS BIOSENSORES

Los biosensores, al igual que cualquier otro tipo de ensayo, han evolucionado a lo largo de la
historia. Anecdticamente se podra decir que los primeros biosensores fueron pjaros, ya que
estas aves se utilizaban antiguamente en las minas de carbn para detectar gases txicos. Los
pjaros ms utilizados en Espaa fueron canarios (Serinus canarius), stos se mueren antes que
las personas en presencia de monxido de carbono o metano y como suelen estar cantando la
mayora del tiempo, el hecho de que no lo hicieran se converta en una alarma sonora.

Al margen de este hecho anecdtico, se puede decir que el primer biosensor, tal y como hoy lo
entendemos, fue un electrodo para medir oxgeno construido y desarrollado por Clark en 1956.
Unos aos ms tarde se dise el primer biosensor enzimtico (Clark et al, 1962), en el que se
combinaba la actuacin de una enzima inmovilizada (glucosa oxidasa) con un detector
electroqumico (electrodo de oxgeno). Este biosensor permita relacionar directamente la
concentracin de glucosa con la disminucin de la concentracin de oxgeno.

Posteriormente, se desarrollaron electrodos potenciomtricos inmovilizando otras enzimas

como ureasas sobre electrodos selectivos de amonio y analizadores de glucosa basados en
detecciones amperomtricas de perxido de hidrgeno (H2O2) (Guibault & Lubrano, 1973)
stos fueron los primeros biosensores a la venta de los muchos que se comercializaran ms
adelante.

En esta misma dcada se utilizaron por primera vez bacterias enteras vivas como biosensores
para medir la cantidad de alcohol en una muestra (Divis, 1975), y se empezaron a utilizar
transductores trmicos (termal enzyme probes) y termistores enzimticos (enzyme
thermistors) (Mosbach & Danielsson, 1974). Con posterioridad se han desarrollado biosensores
basados en fibra ptica (Lubbers & Opitz, 1975), que han dado lugar al grupo de biosensores
denominados optode utilizados para la determinacin de CO2 y O2. Al mismo tiempo se
construy un biosensor de glucosa en un pncreas artificial que se comercializ con el nombre
de Biostator (Clemens et al, 1976) y otro basado en la inmovilizacin de la lactato
deshidrogenasa, que ha sido muy til tanto para mediciones clnicas como en determinaciones
en pruebas deportivas.

En esta misma dcada y al mismo tiempo, se utilizaron anticuerpos inmovilizados junto a

transductores piezoelctricos o potenciomtricos, aunque fue en la dcada de los 80 cuando
Liedberg los comercializ con xito (Liedberg et al, 1983). En 1987 mediante la utilizacin de
mediadores electroqumicos inmovilizados en electrodos enzimticos serigrafiados se
consigui construir el bolgrafo para el seguimiento personal de glucosa en la sangre,
comercializado por MediSense. Hoy en da, las compaas Abbott, Boehringer Mannheim y
Bayer dominan las ventas de ste bolgrafo, lo que da lugar a unos ingresos del orden de varios
cientos de millones de dlares y est desbancando casi totalmente a los mtodos
convencionales de medicin de la glucosa.

En la siguiente dcada, basndose en la utilizacin de mediadores electroqumicos para

favorecer la transferencia de electrones desde el centro redox de una enzima a la superficie del
electrodo, se construyeron lo que constituy la nueva generacin de biosensores
electroqumicos. En la actualidad existen multitud de biosensores en los cuales se combinan la
amplia diversidad de componentes biolgicos (enzimas, cidos nucleicos, receptores celulares,
anticuerpos y clulas intactas) con los diferentes tipos de transductores (electroqumicos,
pticos, piezoelctricos, termomtricos). Presentan mltiples aplicaciones tanto en sanidad
(anlisis clnico), alimentacin (tecnologa de alimentos), vigilancia del medio ambiente
(contaminantes), defensa y seguridad (Ming-Hung, 2008).

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivos General:

El estudio de los biosensores caractersticas, usos y aplicaciones en diferentes

especialidades.

3.2 Objetivos Especficos:

Estudiar los biosensores utilizados en cada campo de accin.

Comprender el proceso de fabricacin de dispositivos que hacen posible su inclusin
para sus fines especficos.

4 MARCO TERICO

4.1 Definicin de Biosensor

Un biosensor es un dispositivo que hace uso de reacciones bioqumicas especficas que se

producen en receptores biolgicos para detectar compuestos qumicos, bacterias o virus,
transformando el resultado de dichas reacciones en seales elctricas.

Fig. 01: Partes de un biosensor.

Un biosensor consta de dos partes, el biorreceptor, sensible a parmetros biolgicos, y el
transductor que transforma esos cambios en una seal elctrica. El biorreceptor est
inmovilizado y en contacto con el transductor. Acta como un filtro extremadamente selectivo
comparado con cualquier sensor qumico, por lo que constituye una herramienta de gran valor
para anlisis altamente especficos. A los biosensores con molculas inmovilizadas les afectan
las condiciones fsico-qumicas en las que operan (pH, temperatura y contaminantes).

4.2 Caractersticas de un biosensor

Un biosensor se compone de tres elementos:

El sensor biolgico: puede ser un tejido, un cultivo de microorganismos, enzimas,

anticuerpos, cadenas de cidos nuclicos, etc. El sensor puede ser tomado de la
naturaleza o ser un producto de la biologa sinttica.
El transductor: acopla los otros dos elementos y traduce la seal emitida por el sensor.
El detector: puede ser ptico, piezoelctrico, trmico, magntico, etc..

En la figura 02 se pueden observar los principales componentes que lo conforman. En el cuadro

I, se presentan las caractersticas de un biosensor ideal, a las cuales deben sumarse el ser
porttiles, sencillos de manejar, automticos y susceptibles de ser usados como dispositivos
remotos (Alcal 2002, Farr et al. 2005).

Cabe sealar que, si bien es deseable que no ocurra la inmediata prdida estructural del
elemento biolgico, es posible que dicha prdida constituya precisamente la seal a detectar.

Los elementos biolgicos de reconocimiento (biorreconocimiento) pueden dividirse en dos:

1) biocatalticos, los que comprenden enzimas aisladas, microorganismos, clulas completas o

tejidos, que al llevar a cabo reacciones de catlisis con el analito generan un producto detectable
y medible, dando origen a los denominados biosensores catalticos.

2)bioligandos, tales como anticuerpos, cidos nucleicos, pptidos y lectinas, los cuales se
caracterizan por tener una reaccin de afinidad con el analito, conformando los biosensores de
afinidad (Gooding 2006).

En cuanto a los sistemas de transduccin, se encuentran principalmente los de tipo

electroqumico, ptico, piezoelctrico y trmico (Castillo et al. 2004).

En los cuadros II y III, se presenta una clasificacin de biosensores de acuerdo con los criterios
de tipo de interaccin, forma de deteccin, elemento de biorreconocimiento y sistema
transductor (Rumayor et al. 2005).
Fig. 02: Esquema que muestra los principales componentes que

conforman un biosensor.
4.3 Tipos de biosensores

Entre los ms relevantes se encuentran los siguientes:

Biosensores conductimtricos: son sistemas que emplean dos pares de pequeos

electrodos de conductividad en configuracin plana. Entre uno de los pares se coloca
una membrana, la cual contiene una enzima que ha sido inmovilizada, mientras que en
el segundo par de electrodos se coloca una membrana blanca (carente de enzima). El
aparato mide la conductividad, a travs de cada par de electrodos con una frecuencia
fija. En presencia del sustrato enzimtico es posible registrar cambios de conductividad
en la vecindad de la membrana que contiene a la enzima, lo cual depender de la
concentracin del sustrato. Midiendo la diferencia de respuesta entre ambos pares de
electrodos se puede compensar la conductividad propia de la muestra biolgica, usando
para ello el electrodo blanco como referencia.
Biosensores redox: la clave en la construccin de biosensores redox es facilitar la
transferencia de los electrones generados por una enzima xido-reductasa (o un
sistema enzimtico) a la superficie de un electrodo. Se ha demostrado que
intermediarios naturales como los citocromos, promueven el paso de los electrones. El
tiempo de respuesta de estos biosensores puede ser del orden de segundos cuando est
presente ferroceno o sus derivados. Con el desarrollo de semiconductores orgnicos
ms eficientes (usualmente por tcnicas de doping), es posible obtener una asociacin
todava ms ntima entre la enzima empleada y la superficie del electrodo, lo cual hace
factible la miniaturizacin de este tipo de biosensores.

Biosensores optoelectrnicos: el desarrollo inicial de los mismos se atribuye a Lowe

en el ao de 1980 (Gimeno y Hueta 1997). Son biosensores basados en principios
pticos que cuentan con un componente biolgico inmovilizado, por ejemplo, una
enzima ligada a un cromforo, el cual a su vez est ligado a una membrana. Un cambio
de pH, originado por una reaccin enzimtica, cambia el color del complejo
cromforo/membrana. El sistema transductor consiste en un diodo
electroluminiscente, con una longitud de onda correspondiente al pico de absorcin del
cromforo y un fotodiodo acoplado. Al ser la cmara de flujo extremadamente estable,
permite generar una seal aceptable (Gimeno y Hueta 1997). De manera particular, el
desarrollo de un biosensor ambiental, basado en el uso de anticuerpos especficos, con
sistema de transduccin electroqumica, e interaccin biocataltica con deteccin
indirecta, permitira la deteccin y cuantificacin de contaminantes descargados al
ambiente. Por ejemplo, en Espaa, se desarroll a finales de la dcada de los noventa,
un inmunosensor conformado con anticuerpos del 4-nitrofenol que puede detectar
especficamente este contaminante, adems de otros cinco similares, a un nivel de
sensibilidad de hasta 0.1 microgramos/L de fenoles, siendo de 0.5 microgramos/L la
concentracin mxima permitida en el agua potable. Es importante sealar que los
fenoles son compuestos contaminantes persistentes, que provienen fundamentalmente
de los residuos generados por la industria qumica, cuya descarga en ros y lagos se
encuentra fuertemente regulada a nivel mundial debido a los efectos negativos que
pueden ejercer sobre los organismos acuticos.
FETs: Durante los ltimos aos se han realizado esfuerzos para producir un biosensor
electroqumico miniaturizado, usando unos dispositivos electrnicos convencionales
llamados transistores de efecto de campo (FETs), ISFETs (dispositivos ion-selectivos)
o CHEMFET (sensores qumicos que miden la energa de reaccin con molculas
simples). Sin embargo, todava no se han resuelto los problemas fundamentales en la
construccin de este tipo de biosensores. Las tecnologas requeridas de inmovilizacin
y fabricacin necesitan un mayor desarrollo. La estabilidad trmica y qumica del
elemento sensible tiene que ser investigada. En concreto, la encapsulacin se ha
convertido en un problema crucial mientras que las propiedades de conduccin de la
superficie del material sensor, tal como nitruro de silicio, se han demostrado que son
difciles de superar. Estos "chips" sensores (aproximadamente 30 m m de dimetro) son
similares a los usados en los ordenadores excepto que la puerta metlica que controla
la corriente del transistor es reemplazada por un material orgnico o biolgico. El
material sensible responde a un cambio en el medio circundante, bien sea gaseoso o
lquido. La respuesta ejerce un efecto de campo sobre la corriente de fuente a sumidero
en el FET. Usualmente esta corriente se mantiene constante mientras se registra la
tensin de fuera necesaria para lograrlo.

Biosensores tipo termistor: Es una clase interesante de biosensores introducida en

los aos 70. Utilizan un dispositivo termistor capaz de registrar las pequeas
diferencias de temperatura producidas por las reacciones bioqumicas. A menudo se
obtiene una respuesta lineal la temperatura, en el rango de 0.01 a 0.001C. Los grupos
americanos y suecos fueron pioneros en el anlisis trmico enzimtico en forma de
sondas o sistemas de flujo, pero la miniaturizacin de los dispositivos todava es
esencial para obtener un biosensor de formato aceptable.
4.4 Ventajas de los biosensores microbianos.

Desde un punto de vista general, los aspectos ventajosos que presentan los biosensores
microbianos frente a los convencionales de enzimas aisladas derivan principalmente del
empleo de microorganismos como elemento de reconocimiento. Por un lado, los
microorganismos estn presentes por todas partes y son capaces de metabolizar una amplia
variedad de compuestos qumicos.

Por otro lado, el empleo de microorganismos como fuente de enzimas intracelulares evita los
procesos caros y laboriosos que se requieren para su aislamiento y purificacin, adems de
preservar las enzimas en su entorno natural, evitando los problemas de regeneracin de
cofactores o de disminucin de la actividad enzimtica al operar en ambientes in vitro. As las
enzimas quedan protegidas de la inactivacin por txicos externos, como metales pesados, lo
que mejora la estabilidad y el tiempo de vida til de los biosensores resultantes.

Adems, los microorganismos, con una gran capacidad de adaptacin a condiciones adversas,
hacen posible la fabricacin de biosensores menos susceptibles de inhibirse por solutos y ms
tolerantes a ambientes de pH sub ptimo. Hay que tener en cuenta, tambin, que los
Microorganismos pueden producirse masivamente a travs de cultivos celulares y que las
clulas microbianas son fcilmente manipulables y tienen mejor viabilidad y estabilidad en
ambientes in vitro, lo que simplifica enormemente la fabricacin de estos biosensores y mejora
su rendimiento.

4.5 Tcnicas de inmovilizacin

Con el fin de transformar de manera efectiva la respuesta bioqumica en una seal fsica, las
clulas microbianas que sirven como elemento de reconocimiento en el biosensor, deben estar
asociadas ntimamente con el transductor. Por lo tanto, la inmovilizacin de los
microorganismos en los transductores tiene un papel esencial en la fabricacin de los
biosensores microbianos y condiciona de manera significativa su funcionamiento y estabilidad.
La seleccin de la tcnica y/o el soporte de inmovilizacin dependen de la naturaleza del
biomaterial (clulas viables o no viables) y del sustrato y la configuracin del transductor
empleado. Por lo general, la inmovilizacin covalente, estrategia empleada frecuentemente para
la inmovilizacin de enzimas y anticuerpos, no es til para la inmovilizacin de clulas viables.
Uno de los principales problemas de esta tcnica es que las clulas estaran expuestas a
potentes grupos reactivos y a otras condiciones de reaccin severas que comprometen su
viabilidad. Con este tipo de inmovilizacin tambin puede haber un deterioro de la integridad
estructural de la clula durante el uso continuado, lo que conlleva a la prdida de las enzimas
intracelulares. Sin embargo, las tcnicas de entrecruzamiento con agentes bifuncionales,
utilizando reactivos como el glutaraldehdo, se han empleado con xito para la inmovilizacin
de clulas en varios soportes (gelatina, albmina, clara de huevo). A pesar de que esta
metodologa evita algunas de las limitaciones de la unin covalente, los reactivos qumicos de
entrecruzamiento utilizados frecuentemente, tambin afectan a la viabilidad celular. As estas
tcnicas resultan tiles para la inmovilizacin de clulas no viables que contienen enzimas
activas intracelulares. Por otro lado, las tcnicas de atrapamiento y adsorcin resultan ms
tiles cuando se emplean clulas viables. Un enfoque comn consiste en retener las clulas en
las proximidades de la superficie del transductor mediante membranas como las de dilisis. En
general, dichas membranas deben ser qumica y mecnicamente estables, con un espesor de
10-15 nm y un tamao de poro de 0,1-1,0 nm. Especialmente adecuadas para este propsito son
las membranas porosas de policarbonato o poliftalato. Se ha utilizado tambin una gran
variedad de geles de polmeros sintticos o naturales para la inmovilizacin de clulas
microbianas para su aplicacin en transformaciones industriales. Entre los polmeros sintticos
destacan la poliacrilamida, los hidrogeles basados en poliuretano, las resinas
fotoentrecruzables y el alcohol polivinlico; los naturales incluyen el alginato, el carragenano, la
agarosa de bajo punto de fusin o el quitosano, entre otros procedimientos. Sin embargo, la
mayor limitacin del empleo de polmeros sintticos es la posible prdida de viabilidad de la
clula, mientras que los polmeros naturales son muy tiles en la obtencin de sistemas viables
de clulas inmovilizadas.

La captura pasiva de clulas en los poros o la adhesin superficial de membranas de celulosa u

otras membranas sintticas ha sido tambin ampliamente utilizada. La principal ventaja de este
mtodo es que las clulas inmovilizadas por adhesin estn en contacto directo con la fase
lquida que contiene el sustrato, aunque la clula y la fase lquida estn claramente separadas,
por lo que se reducen los problemas de transferencia de masa asociados comnmente con los
mtodos de atrapamiento en gel. Sin embargo, una limitacin bsica de la captura pasiva o de
la adhesin es la posibilidad de la prdida de la clula durante el lavado continuo. Adems de
estos mtodos, comunes tambin a otros tipos de biosensores, se han explorado otras
estrategias novedosas de inmovilizacin de microorganismos, con objeto de mejorar el
rendimiento analtico y la estabilidad de almacenamiento de los biosensores microbianos. As,
por ejemplo, Song et al. desarrollaron una estrategia hbrida de atrapamiento- encapsulacin
que combina las ventajas de ambas metodologas. Yu et al. describieron un mtodo totalmente
acuoso para el atrapamiento de clulas de Moraxella sp. donde todos los procedimientos de
inmovilizacin se llevanna cabo bajo condiciones suaves empleando como precursor silicato de
sodio, evitndose de este modo la produccin de alcohol que puede ser perjudicial para los
microorganismos.

Flemming et al. fabricaron un canal microfludico para el empaquetamiento controlado y la

inmovilizacin de clulas de levadura, proporcionando una mayor densidad de clulas activas
y una menor resistencia a la difusin inherente a la tcnica de compresin tradicional.

Tambin se ha propuesto el uso de una red de silicato preparada por la tcnica sol-gel, que
proporciona una prometedora plataforma para la inmovilizacin de microbios, permitiendo
controlar el tamao de los poros de los materiales de atrapamiento, lo que favorece la difusin
de los analitos En el caso de los biosensores microbianos electroqumicos, es muy interesante
la inmovilizacin de los microorganismos en polmeros conductores electrnicos debido a las
propiedades de estos materiales.
En la Figura 03 se han representado varias micrografas electrnicas de barrido electrnico que
muestran la inmovilizacin de clulas de Brevibacterium ammoniagenes sobre un polmero de
sulfonato de poli(estireno)-polianilina (PSS-PANI). Se utiliza un electrodo de platino sumergido
en una disolucin de anilina en presencia del polmero y del material biolgico, y se procede a
su electrodeposicin aplicando un potencial constante de +1,2 V vs SCE.

En dicha figura se aprecian las clulas adsorbidas sobre la superficie del electrodo de platino
(a), los primeros grnulos de polmero (b) y su crecimiento alrededor de las clulas (c y d), y
sobre ellas (e y f). Se ha observado que las clulas se encuentran efectivamente atrapadas en el
polmero y que pueden mantenerse vivas bajo ciertas condiciones experimentales.

Fig. 03: Micrografas electrnicas de barrido de Brevibacterium

ammoniagenes atrapadas en un polmero de sulfonato de
poli(estireno)-polianilina (PSSPANI).

4.6 Biosensores microbianos electroqumicos

La mayor parte de los biosensores microbianos electroqumicos son amperomtricos, que

operan a un potencial fijo aplicado entre un electrodo de trabajo que contiene las clulas del
microorganismo, y uno de referencia. En estos biosensores, la variacin de corriente generada
por la reduccin u oxidacin de un producto electroactivo metablico o un intermedio en la
superficie del electrodo de trabajo se correlaciona con la concentracin de los compuestos de
inters. Debido a la sensibilidad intrnseca de las medidas electroqumicas, es posible
desarrollar fcilmente biosensores microbianos amperomtricos ultrasensibles. El uso de
microorganismos como microrreactores para lograr la deteccin bioelectroqumica de
compuestos de inters elimina la necesidad de aislar las enzimas individuales y permite a los
biomateriales activos trabajar en condiciones muy prximas a su ambiente natural, logrando
entonces una alta estabilidad. Sin embargo, el principal problema es la falta de eficiencia del
proceso de transferencia electrnica entre el sistema biocataltico microbiano y el electrodo.
Aunque la comunicacin entre la clula y la superficie del electrodo no es fcil, algunos ejemplos
ponen de manifiesto la existencia de transferencia electrnica directa entre ambos sistemas.
Uno de ellos es el del microorganismo Rhodoferax ferrireducens, capaz de transferir electrones
a un electrodo de grafito durante la oxidacin de la glucosa. Por otro lado, es posible facilitar el
transporte de electrones utilizando especies capaces de actuar como alambres de
comunicacin entre las enzimas de los microorganismos y los electrodos. Por ejemplo, las
deshidrogenasas dependientes de la pirroloquinolina quinona (PQQ) contenidas en la
membrana periplsmica de la Gluconobacter oxydans son eficaces para lograr la oxidacin de
una gran variedad de sustratos, pero su eficacia bioelectro-qumica mejora enormemente
cuando se utilizan mediadores redox del tipo del ferricianuro, los violgenos o las quinonas.

La Figura 04 muestra un modelo esquemtico de la oxidacin cataltica de un sustrato S en

presencia de un aceptor de electrones Mox por una enzima deshidrogenasa DH, en la membrana
de un microorganismo.

Figura 04. Esquema de la oxidacin del sustrato S catalizada por la

enzima DH en la membrana de un microorganismo. Mox y Mred son
las formas redox del mediador.
 Figura 05. Configuracin y funcionamiento de un biosensor microbiano
para la deteccin de glucosa.

La preparacin de biosensores microbianos por combinacinde los microorganismos con

mediadores redox que faciliten las reacciones de transferencia electrnica entre el
compuesto en estudio y la superficie del electrodo, ha sido una estrategia utilizada para la
deteccin de diferentes analitos como glucosa o fenol, en ausencia de oxgeno. Debido a la
eficiencia en el transporte de electrones, la sensibilidad que se alcanza es elevada. Las
bacterias Gluconobacter oxydans, Pseudomonas putida ATCC 126633 y Pseudomonas
fluorescens son algunas de las utilizadas en combinacin con polmeros redox de osmio. En
la Figura 05 se ha representado un esquema de la preparacin de un biosensor microbiano
basado en la fabricacin de una monocapa de cisteamina sobre un electrodo de oro seguido
de la incorporacin de un polmero de osmio y del microorganismo, as como el mecanismo
de la posible reaccin enzimtica y la obtencin de la seal electroqumica en el caso de la
deteccin de glucosa sobre el electrodo modificado Ms recientemente se han desarrollado
configuraciones similares basadas en el empleo de electrodos de pasta de carbono
preparados con una pequea cantidad de nanotubos de carbono (CNTs).

La adicin de CNTs al material del electrodo amplifica el efecto del mediador, prolongando
tambin la estabilidad del biosensor, aunque se observan corrientes de fondo elevadas
debido al aumento de la corriente capacitiva. Esta estrategia fue seguida para la preparacin
de biosensores basados en el uso de Pseudomonas putida DSMZ 50026 como material
biolgico y del polmero como mediador. La bacteria se cultiva en medios salinos ricos en
glucosa o en fenol, con el fin de desarrollar, respectivamente, un biosensor de glucosa, con
 respuesta lineal en el intervalo de 0,05 a 2,0 mM, y un biosensor de fenol, con un intervalo
lineal de 0,54,0 mM, que result adecuado para el anlisis de aguas residuales.

Se han descrito tambin diversos biosensores microbianos potenciomtricos basados en la

dependencia de la concentracin de la especie en estudio con la diferencia de potencial
medida entre un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia. Los transductores
empleados comnmente para estos biosensores son electrodos sensibles a gases o a
iones1,17 y condicionan la sensibilidad y selectividad del biosensor resultante.

Estas configuraciones requieren un electrodo de referencia muy estable y preciso, a veces

difcil de mantener, lo que puede limitar su aplicacin. En el grupo de los biosensores
microbianos electroqumicos se suelen incluir tambin los dispositivos conductimtricos,
en los que se relaciona la concentracin del analito con los cambios de conductividad (o de
resistividad) asociados a la produccin o el consumo de especies inicas durante la
actividad metablica de los microorganismos. Con los instrumentos sofisticados modernos,
la medida de conductancia es extremadamente rpida y sensible, lo que hace que estos
biosensores sean muy atractivos analticamente.

Adems, se trata de dispositivos fcilmente miniaturizables, puesto que no se requiere la

presencia de un electrodo de referencia en el sistema. Sin embargo, debido al carcter
universal de las medidas, en muchos casos la selectividad de los biosensores
conductimtricos es escasa.4 Finalmente, las clulas de combustible microbianas
convierten la energa qumica en energa elctrica por medio de las actividades metablicas
de los microorganismos.

Puesto que tanto el consumo microbiano de los compuestos de inters como la inhibicin
de la actividad metablica de los propios microorganismos por compuestos txicos, pueden
alterar el funcionamiento de las clulas, stas se pueden aplicar como biosensores para el
anlisis in situ y la determinacin de analitos.

5 APLICACIONES DE LOS BIOSENSORES

5.1 Anlisis ambiental

El mayor campo de aplicacin de los sensores microbianos electroqumicos es el anlisis

ambiental, utilizndose principalmente microorganismos con actividad enzimtica para la
deteccin de pesticidas, productos industriales y otros contaminantes de las aguas. Los
nitrocompuestos aromticos del tipo del nitrobenceno, los nitrotoluenos y nitrofenoles se
utilizan en la fabricacin de explosivos, pesticidas, colorantes, plastificantes y productos
farmacuticos, y son contaminantes ambientales frecuentes de las aguas naturales y la
atmsfera. El uso de biosensores enzimticos para la deteccin sensible e in situ de estos
compuestos ha sido, desde hace algunos aos, un objetivo prioritario de la Qumica Analtica,
habindose descrito tambin varios diseos de biosensores microbianos basados en
microorganismos modificados genticamente con actividad organofosforo-hidrolasa, capaces
de detectar txicos organofosforados como Paraoxn, Metil Paratin, Paratin, Fenitrotin y
etil p-nitrofenol tiobenceno fosfonato. Por ejemplo, la bacteria Moraxella sp. posee un complejo
sistema enzimtico capaz de degradar especficamente el p-nitrofenol a hidroquinona (HQ), y
adems es adecuada para estudios de degradacin in situ, porque sobrevive en ambientes
contaminados durante largos periodos de tiempo. Esta capacidad se ha aprovechado para la
construccin de varios biosensores microbianos electroqumicos.

Por ejemplo, se prepar un biosensor amperomtrico para la deteccin altamente especfica,

sensible y rpida de p-nitrofenol, que se basa en la medida de la corriente de oxidacin de la HQ
sobre un electrodo de pasta de carbono que contiene las clulas, y que puede relacionarse con
la concentracin del fenol (Figura 06).

Para preparar el electrodo, se mezclan 15 mg de clulas por cada gramo de pasta de carbono, y
se utiliza un potencial de +0,3 V vs Ag/AgCl. Este mismo equipo dise un biosensor microbiano
para la determinacin de organofosfatos p-nitrofenil sustituidos (PNPs-OPs), consistente en un
electrodo de oxgeno disuelto modificado con la Moraxella sp. modificada genticamente. Se
utiliza la enzima organofsforo hidrolasa (OPH) en tndem con la maquinaria de oxidacin que
posee el microorganismo para degradar los PNPs-OPs, al tiempo que se monitoriza el consumo
de oxgeno, que es proporcional a la concentracin de analito. Las condiciones ptimas de
trabajo se alcanzan para una cantidad de 0,35 mg de clulas, que son capaces de detectar hasta
una concentracin 0,1 nM de Paraoxn, con una excelente selectividad frente a triazinas,
carbamatos y otros insecticidas organofosforados sin sustituyentes PNP. Adems, este
biosensor es estable durante una semana cuando se almacena a 4 C y su aplicabilidad se
demostr analizando agua de lago. Los biosensores microbianos tambin se han aplicado a la
determinacin de fenol y otros derivados fenlicos. La capacidad de degradacin del fenol por
parte de la bacteria Pseudomonas putida DSM 50026 es bien conocida. Esta propiedad la
convierte en un interesante componente biolgico de algunos biosensores basados en la
medida de la actividad respiratoria de las clulas. La preparacin del biosensor requiere que
las clulas crezcan en presencia de fenol como nica fuente de carbono. Para la construccin de
un biosensor basado en un electrodo de grafito y resina epoxi (GECE) modificado con este
microorganismo, las clulas crecidas durante 24 h se centrifugaron, y una capa del material
biolgico se deposit sobre la superficie del electrodo, inmovilizndola con ayuda de una
membrana de gelatina y por entrecruzamiento con glutaraldehdo. El biosensor microbiano
proporcion una respuesta lineal en el intervalo de 8 a 40 nM de fenol y fue aplicado con buenos
resultados al anlisis de aguas residuales.

Una de las tendencias ms recientes en esta rea es la basada en el empleo de microchips. As,
por ejemplo, usando una de estas plataformas se ha desarrollado un biosensor microbiano
micro-fludico para la determinacin de la toxicidad del agua. Se basa en clulas bacterianas
diseadas para generar una secuencia de reacciones bioqumicas que en presencia de agentes
genotxicos suministran una seal elctrica. El ensayo requiere un tiempo de induccin que
oscila entre 30 y 120 min. Se aade un sustrato enzimtico, p-aminofenilfosfato, que genera un
material electroactivo, p-aminofenol, slo cuando los txicos son detectados por la bacteria. Las
clulas se integran en un microchip manufacturado por la tecnologa MEMS que contiene varias
microcmaras con volumen entre 2,5 y 157 nL y radios electrdicos entre 37,5 y 300 nm (Figura
07). Este biosensor se ha probado con diferentes txicos: cido nalidxico (NA) y 2-amino-3-
metilimidazo-[4,5-f]quinolina (IQ), detectndose una concentracin mnima de 10 ng/mL y
0,31 nM para IQ.

Fig. 06: Esquema del proceso cataltico de la Moraxella sp. sobre

el p-nitrofenol y la deteccin electroqumica sobre el electrodo modificado.
 Fig. 07: a) Microchip de silicio formado por cuatro microcmaras
electroqumicas diferenciadas; b) vista interior de una microcmara
de tres electrodos; c) diagrama esquemtico de la unidad electroqumica.

Fig. 08: a) Sistema de flujo utilizado. La clula electroqumica est

equipada con tres electrodos (WE, RE y CE). El electrodo de trabajo
(WE) se irradia peridicamente con un LED rojo. b) Serie de seales
 obtenidas al iluminar durante 15 s (ON) seguido de oscuridad durante
45 s (OFF), y adicin de atrazina; E= 0,7 V vs Ag/AgCl. c) Electrodo
serigrafiado modificado con clulas de Chlorella vulgaris.

Otras aplicaciones medioambientales de estos biosensores incluyen la determinacin de

metales pesados. Como es sabido, estos metales, entre los que se encuentran Cu2+, Hg2+, Cd2+,
Zn2+ y Pb2+, estn distribuidos en el ambiente y son la causa de uno de los problemas de
polucin ms serios de nuestro tiempo. Proceden de fuentes antropognicas particulares, que
originan el aumento de la concentracin de alguno o de varios de ellos. Generalmente su
toxicidad deriva de la formacin de enlaces con los grupos tiol de las protenas.

Como ejemplo, puede citarse la preparacin de un biosensor amperomtrico basado en

Saccharomyces cerevisiae para la determinacin de Cu2+. Las clulas utilizadas contenan un
plsmido con el promotor inducible por el Cu2+ del gen CUP1 de S. cerevisiae fusionado al gen
lacZ de E. coli, respondiendo cuantitativamente a la presencia de Cu2+ mediante la sntesis de
b-galactosidasa, el producto del gen lacZ. La b-galactosidasa transforma la lactosa en glucosa y
galactosa, y el catabolismo de estos sustratos originan una disminucin de la concentracin de
oxgeno, que se mide en un electrodo.

Basndose en la actividad metablica de distintas bacterias adaptadas, tambin se han diseado

configuraciones para la deteccin de otros compuestos txicos. Entre ellos figuran benceno,
tolueno y etilbenceno, cido 2,4-diclorofenoxiactico, atrazina y 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-
dimetilurea (DCMU). En este ltimo caso se utilizaron electrodos serigrafiados sobre los que se
inmovilizaba una mezcla de clulas de Chlorella vulgaris, nanotubos de carbono y alginato
sdico, detectndose amperomtricamente el oxgeno generado fotosintticamente por la
microalga. En la Figura 08 se ha representado un esquema de la configuracin empleada, as
como el electrodo y el tipo de seales obtenido. La respuesta del biosensor a la presencia de
atrazina o de DCMU se mide como una seal de inhibicin de la corriente de reduccin del
oxgeno.

5.2 Demanda bioqumica de oxgeno (DBO)

La demanda bioqumica de oxgeno (DBO) ha sido utilizada durante mucho tiempo como un
ndice de la polucin orgnica en las aguas industriales o naturales. Con el fin de evitar el largo
tiempo de espera (cinco das) que requiere su determinacin por el mtodo convencional
(DBO5), desde hace algn tiempo se vienen desarrollando biosensores microbianos de diversos
tipos que permiten una estimacin precisa, aunque mucho ms rpida de este parmetro de
calidad de las aguas. En una configuracin reciente se emple un sistema basado en la eucariota
Saccharomyces cerevisiae, y un doble mediador, combinando el ferricianuro y la menadiona. El
ferricianuro es un mediador muy eficiente para transportar electrones desde el centro redox
de las enzimas bacterianas reducidas a la superficie del electrodo en presencia de compuestos
orgnicos, mientras que la menadiona es un mediador lipoflico que puede penetrar a travs de
la membrana externa de la clula, formndose un radical que transfiere el electrn al
ferricianuro. De este modo, el ferrocianuro formado alcanza el electrodo y es finalmente
reoxidado, generando la respuesta electroqumica. En resumen, el ferrocianuro se forma a
expensas de la materia orgnica que es asimilada por la clula en presencia de ferricianuro y
menadiona, y su concentracin puede relacionarse a travs de la seal electroqumica
generada, con la de la materia orgnica presente en la muestra. Se dise un sensor en la escala
de los nL con un volumen de 560 nL y dos electrodos de carbono (Figura 09). La respuesta
electroqumica se genera por cronoamperometra, aplicando un potencial de 900 mV al
electrodo de trabajo durante 3 s y tomando la respuesta final del cronoamperograma como
seal analtica. Este biosensor permite determinar DBO en el intervalo de 6,6 a 220 mg O2 /L
en 15 minutos, y es aplicable a distintos tipos de aguas dulces y marina.

Fig. 09:. a) Esquema y b) seccin transversal del biosensor microbiano

utilizado para la determinacin de DBO. PET, polietilentereftalato.

5.3 Anlisis de alimentos

Los biosensores microbianos han demostrado ser de gran utilidad en el campo del anlisis de
alimentos y en el seguimiento de procesos de fermentacin. Se han descrito varios diseos
basados en el consumo de oxgeno por la actividad respiratoria o metablica de los
microorganismos, para la determinacin de glucosa30 y de otros hidratos de carbono.

Para preparar este ltimo biosensor se utilizaron dos tipos diferentes de clulas: P. fluorescens
y P. putida inmovilizadas sobre un electrodo de grafito modificado con una mezcla de chitosan
y nanotubos de carbono. La respuesta se obtuvo midiendo la seal amperomtrica de reduccin
del oxgeno a un potencial de -700 mV vs Ag/AgCl. Se alcanzaron buenos resultados para la
determinacin de galactosa, manosa y xilosa, sin interferencia de otros hidratos de carbono
excepto la glucosa.

Entre las configuraciones descritas en la literatura para la determinacin de etanol, cabe

destacar un biosensor amperomtrico mediante inyeccin en flujo basado en un electrodo de
carbono vitrificado modificado con la bacteria Gluconobacter oxydans, que permite la
monitorizacin offline del etanol producido en la fermentacin alcohlica. La bacteria utilizada
se caracteriza por poseer una elevada cantidad de deshidrogenasas en su membrana
periplasmtica, una de las cuales es la alcohol deshidrogenasa PQQ-dependiente (PQQ-ADH).
Esta enzima es ms selectiva al etanol que el sistema NAD-ADH o la alcohol oxidasa (AOX). Un
inconveniente es que la bacteria tambin contiene una glucosa deshidrogenasa (PQQ-GDH), por
lo que existe selectividad cruzada entre ambas especies cuando se analizan muestras que
contienen etanol y glucosa. Es preciso, por tanto, realizar una determinacin aparte de la
concentracin de glucosa. En estas condiciones la respuesta a etanol es lineal en el intervalo de
10 nM y 1,5 mM, con un tiempo de respuesta de 3 minutos. El tiempo de vida del biosensor se
estim en 72 h de trabajo continuado.

Los antibiticos de la familia de las b-lactamas se utilizan para el tratamiento de la mastitis en

el ganado vacuno. Para la determinacin de residuos de estos antibiticos en leche se desarroll
un biosensor microbiano basado en la medida de CO2 cuya produccin est relacionada con el
crecimiento del microorganismo Bacillus stearothermophilus var. calidolactis. La presencia del
antibitico inhibe el desarrollo de este microorganismo y, consecuentemente, la produccin de
CO2. La determinacin se basa en la medida de la diferencia de concentracin de CO2 entre la
muestra de leche contaminada con b-lactamas y una muestra de control conteniendo b-
lactamas y una b-lactamasa de amplio espectro, que inactiva selectivamente a estos
antibiticos. En este caso, la diferencia de potencial entre los dos electrodos dispuestos en el
sensor de CO2 es la que se relaciona con la concentracin de analito.

5.4 Tendencias futuras

Aunque los biosensores microbianos se han estudiado ampliamente durante dcadas, su

comercializacin se ha visto limitada por las desventajas intrnsecas de emplear
microorganismos como elementos de reconocimiento (respuesta lenta, poca sensibilidad,
pobre selectividad y escasa estabilidad). De ah que las tendencias actuales y futuras vayan
encaminadas al desarrollo de tecnologas que permitan superar o minimizar estas limitaciones
y ampliar las aplicaciones de estos biosensores en el mercado. Afortunadamente, con el
desarrollo en los ltimos aos de la biotecnologa, la micro/nano-tecnologa, y estrategias
novedosas de inmovilizacin, los biosensores microbianos resultan cada vez ms poderosos
para la resolucin de problemas analticos prcticos. Con los avances en biologa molecular y la
disponibilidad de la secuencia genmica de ms tipos de clulas, se ha abierto un sinfn de
posibilidades de adaptar los microorganismos para mejorar la actividad de una enzima
existente, expresar protenas en organismos husped distintos o en distintas localizaciones,
sobreproducir enzimas microbianas de inters o desarrollar organismos capaces de trabajar en
condiciones extremas de temperatura y resistentes a txicos. La ingeniera gentica
(metablica) tambin puede aplicarse a la mejora de la selectividad de estos biosensores
mediante la activacin de ciertas vas metablicas de inters y la absorcin celular, a la vez que
se desactivan otras rutas indeseables. Desde el punto de vista de la respuesta, otra manera de
mejorar la selectividad es desarrollar redes de sensores microbianos. La introduccin del
analito de inters en estas redes genera un patrn de respuesta caracterstico que, combinado
con el anlisis de redes artificiales, posibilita su identificacin inequvoca. Por otra parte, con el
desarrollo de la nanotecnologa, los materiales nanoestructurados encuentran en estos
biosensores una enorme utilidad, al objeto de mejorar su sensibilidad, debido a su buena
biocompatibilidad, propiedades de transferencia electrnica mejoradas y mayor rea
superficial. Adems, con el desarrollo de la tcnica de Laboratorio-en-un-chip, la integracin de
microorganismos en un chip de microfludica seguramente proporcionar en el futuro, no slo
aspectos novedosos en la investigacin en el campo de los biosensores microbianos, sino
tambin caractersticas analticas mejoradas, ya que tales sistemas slo requeriran cantidades
mnimas de muestra y ofreceran una mayor rapidez de respuesta y una buena sensibilidad.

Desde el punto de vista comercial, tambin es deseable la puesta a punto de nuevas estrategias
de inmovilizacin sencillas que conduzcan a preparaciones de clulas inmovilizadas estables,
con un mejor almacenamiento y estabilidad operacional. En este sentido, la inmovilizacin
reversible bioespecfica de enzimas utilizando lectinas ofrece una alternativa prometedora
para la inmovilizacin de clulas microbianas y, por tanto, para la fabricacin de este tipo de
biosensores. Sin duda alguna, una fusin fructfera entre las ciencias biolgicas y otras
disciplinas contribuir a aprovechar todo el potencial de esta tecnologa en el futuro.

6 Importancia del uso de biosensores.

En general, los biosensores han adquirido gran importancia, principalmente en los aspectos
mdico y alimenticio, as como en lo referente al control de la contaminacin ambiental. En el
rea de la salud y de la medicina, actualmente es posible encontrar analizadores de glucosa que
slo requieren unas cuantas gotas de muestra para obtener el resultado del contenido de
glucosa en enfermos diabticos. Los sensores inmunolgicos tambin son usados en medicina
para detectar gonadotropina, hormona empleada en el diagnstico de embarazo. En la guerra
qumica y bacteriolgica han sido utilizadas para la identificacin del agente agresor. Asimismo,
han sido usados para la bsqueda de vida en Marte (Canh 1993). En lo referente a la agricultura
y alimentacin es posible la aplicacin de biosensores para la deteccin de contaminantes
txicos o de microorganismos patgenos.

En cuanto a la industria agroalimentaria, el uso de los biosensores se orienta hacia las reas de
seguridad, calidad alimentaria y control de procesos industriales (Rumayor et al. 2005), as
como en el seguimiento de los diferentes estados de la produccin y del control de calidad del
producto final. Adems de la vigilancia de aditivos alimenticios, contaminantes y presencia de
posibles toxinas (Canh 1993, Gonzlez et al. 2005a). Tambin se han realizado avances en lo
referente a la deteccin de sustancias prohibidas tales como los narcticos, lo que facilita su
localizacin. Cabe sealar que las nuevas aplicaciones clnicas tendientes al uso de biosensores,
son el anlisis rpido, directo y con poca cantidad de muestra para deteccin de enfermedades
como hepatitis B, virus, SIDA, entre otros.

Un gran nmero de biosensores ambientales y biomdicos se encuentran en proceso de ser

patentados, as como en investigacin y desarrollo, por lo que de momento no es factible
conseguir un precio de mercado (De la Rosa 2007). Otros biosensores empleados para la
deteccin de diferentes analitos se presentan en el cuadro lV.

7 CONCLUSIONES

Los biosensores han llegado a ser una opcin con gran selectividad, especificidad, amplio
espectro, mnimo de pre-tratamiento, pocas cantidades de muestra, fcil manejo,
porttiles y automatizables, entre otras caractersticas.

Los biosensores son de mucha utilidad en la vida moderna y significan una gran mejora en
las capacidades de prediccin y muestreo de la amplia variedad de usos y aplicaciones en
los diferentes campos cientficos.
 En el mbito ambiental, su relevancia es mayor, ya que representan un gran paso hacia el
control y la prevencin de los problemas ms preocupantes a los que actualmente nos
enfrentamos.

Finalmente el desarrollo de los biosensores es de gran utilidad, por esto las investigaciones
para mejorar las caractersticas de este dispositivo continan. De esta manera se pretende
ayudar al ser humano a lidiar con problemas como enfermedades, contaminacin del
medio ambiente, entre otros esfuerzos orientados hacia la mejora de la calidad de vida en
general.

8 REVISIN BIBLIOGRFICA

Altamirano M., Garca-Villada L., Agrelo M., Snchez-Martn L., Martn-Otero L., Flores-
Moya A., Rico M., Lpez-Rodas V., Costas E., 2004. Biosensors & Bioelectronics. 19:1319-
1323
Altamirano M., Garca-Villada L., Agrelo M., Snchez-Martn L., Martn-Otero L., Flores-
Moya A., Rico M., Lpez-Rodas V., Costas E., 2004. Biosensors & Bioelectronics. 19:1319-
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