ANLISIS CON ENZIMAS DE RESTRICCIN DE LAS VARIANTES DEL

FACTOR DE TRANSFORMACIN DE CRECIMIENTO TGF-B

Diego Jimnez, Carolina Ordoez, ngela lvarez, Ginna Solarte.

Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Nario
Entregado 03 de octubre de 2017

Resumen
Se realiz el anlisis de las variantes 1, 2, 3 y 4 del gen TGF-B, utilizando las enzimas de restriccin Acu I,
Alw I, Ban II, Bce AI y BsiHKAIra, con las cuales se generaron mapas de restriccin para verificar que una
misma enzima de restriccin genera cortes distintos en diferentes variantes de un mismo gen, para este
anlisis se utiliz el software pDRAW32 en el cual se generaron los mapas de restriccin y se determin las
enzimas a utilizar, con este anlisis se concluy que efectivamente la secuencia de DNA de las variantes del
gen son diferentes entre s.
Palabras clave: enzimas, restriccin, pDRAW32, gen, TGF-B

INTRODUCCIN.
El descubrimiento y la purificacin de las enzimas de restriccin son invaluables en los avances logrados por
los bilogos moleculares durante los ltimos aos. Puesto que es muy frecuente que una secuencia particular
de cuatro a seis nucletidos se produzca por casualidad, cualquier tipo de DNA es susceptible a la
fragmentacin por estas enzimas. El uso de las enzimas de restriccin permite disecar el DNA del genoma
humano, o de cualquier otro organismo, en un conjunto bien definido de fragmentos especficos (Karp,
2014).
Una vez que el DNA de un individuo particular se digiere con una de estas enzimas, los fragmentos
obtenidos pueden seccionarse con base en su longitud por electroforesis en gel. Las diferentes enzimas
separan la misma preparacin de DNA en conjuntos distintos de fragmentos y los sitios dentro del genoma
que las diversas enzimas separan pueden identificarse y ordenarse en un mapa de restriccin. (Karp, 2014)
Estos conceptos bsicos de corte y digestin por enzimas de restriccin son llevados a la bioinformtica para
analizar secuencias especficas de manera in silico, como por ejemplo el factor de crecimiento , este es una
citoquina multifuncional, que participa en la regulacin del desarrollo y de la reparacin de tejidos. Son
protenas dimricas y, en mamferos existen 3 isoformas distintas (1, 2 y 3). La regulacin de la expresin de
los genes del TGF- implica la transcripcin de factores como el complejo AP-1 y la expresin de proto-
oncogenes c-fos y c-jun (Roberts & sporn, 1990). Adems est implicada en la patognesis de muchas formas
progresivas de enfermedad renal, que incluye la nefropata diabtica que se da cuando se sobre expresa
TGF1 desencadenando en fallas renales progresivas.
Mediante el uso de software se muestra la utilidad de la aplicacin de enzimas de restriccin en 4 variantes
del gen TGBRF y TGBRF2 importantes receptores implicados en la predisposicin gentica de los
individuos que desarrollan nefropata diabtica.
Objetivo general

Analizar las secuencias genmicas de los sitios de corte por enzimas de restriccin de TGFBR Y
TGFBR2 presentes en TGF 1
Objetivos especficos.
Realizar cortes por enzimas de restriccin en las secuencias establecidas, mediante el uso del
software pDRAW32.
Identificar variantes genmicas que puedan ocasionar alteraciones y expresin de la enfermedad.
Materiales y mtodos.
1. Consecucin y almacenamiento de las secuencias del DNA.
Se us el motor de bsqueda del NCBI (National Center for Biotechnology Information), para realizar la
bsqueda en la base de datos del GenBank para buscar las secuencias completas de nucletidos de los mRNA
del gen TGFBR 1, 2, 3, 4 y se descargaron las secuencias correspondientes a NM_003242, NM_004612,
NM_000660.5, NM_003239.2, respectivamente.

Imagen1. Motor de bsqueda NCBI, del gen TGFBR NM_003239.2.

Usando el formato FASTA se descargaron las secuencias en un folder especfico y se les asigno el nombre
correspondiente a cada una de estas.
2. Seleccin de las enzimas de restriccin y generacin de los mapas de restriccin.
Para la generacin de las enzimas de restriccin se tuvo en cuenta algunos criterios, como por ejemplo, los
sitios de corte en las secuencias de inters deben ser al menos dos y las enzimas a seleccionar deben tener
sitio de corte en todas las secuencias que se va a analizar.
Posteriormente se hizo uso del software pDRAW 32, en donde se abri uno de los archivos que contiene la
secuencia de la variante, como se muestra en la imagen 2.
Posterior a esto se procedi a seleccionar las enzimas de corte, teniendo en cuenta las enzimas seleccionadas
por defecto por el programa, por lo cual se procedi a des- seleccionarlas, utilizando la opcin: settings/
Enzyme selection y en el cuadro Select Restriction Enzymes- se dio clic en el recuadro explicitly select y
posteriormente en la opcin Deselect all.

Imagen3. Seleccin de las 3 enzimas de corte.

A continuacin se seleccionaron las 3 enzimas de corte teniendo en cuenta los parmetros antes mencionados,
se procedi a seleccionar el recuadro Explicitly selected enzymes only como se muestra en la imagen 3 y
posteriormente se seleccionaron las enzimas: (). Finalmente se dio clic en Apply/ Ok.
3. Visualizacin de fragmentos generados por electroforesis en gel de agarosa.
Se utiliz la opcin view/ Agarose Gel electrophoresis para generar el mapa electrofortico en donde se
aplic un marcador de peso que se distribuya homogneamente y sea comparable con la muestra analizada.
Resultados y discusin

Secuencias de ADN
Las secuencias completas de los nucletidos de los mRNA de la protena TGF-B 1, 2 Y 3 fueron obtenidas de
la base de datos del GENBANK (imagen 4) estas secuencias se descargan en formato fasta que es el que
contiene la secuencia de nucletidos de los mRNA a partir de los cuales se codifican las protenas de los
factores de crecimiento transformante beta (TGF-B) y sus variantes 1, 2, 3 y 4, las variantes de TGF-B poseen
una notable conservacin de nueve residuos de sisteina de las cuales 1, 2 y 3 han sido aisladas de mamferos
con una homologa del 70% aproximadamente.
el m
 Imagen 4. Secuencia de nucletidos del gen TGF-B1 en la base de datos genbank.

Generacin de mapas de restriccin

La generacin de los mapas de restriccin se realiz con el programa pDRAW32. Para generar estos mapas
de restriccin se escogi 5 enzimas de restriccin, las mismas para las 4 variantes de gen TGF-B. Para
escoger las enzimas se tuvo en cuenta que generaran como mnimo 2 cortes y mximo 10.

En el programa pDRAW32 podemos observar cuantas enzimas de corte hay para cada variante del gen TGF-
B y cuantos sitios de corte tiene (imagen 5)

Imagen 5. Enzimas y sitios de corte en el DNA del gen TGF-B1

- Gen TGF-B1: 72 enzimas de restriccin, 102 sitios de corte

- Gen TGF-B2: 82 enzimas de restriccin, 109 sitios de corte
- Gen TGF-B3: 59 enzimas de restriccin, 98 sitios de corte
- Gen TGF-B4: 65 enzimas de restriccin, 107 sitios de corte

Como se puede observar cada variante del gen tiene una cantidad distinta de enzimas de restriccin.

Para generar los mapas de restriccin se escogi las enzimas Acu I, Alw I, Ban II, Bce AI y BsiHKAIra
realizar los cortes en el DNA de las 4 variantes del gen TGF-B, de acuerdo a los mapas de restriccin
generados (imagen 6, 7, 8 Y 9) con las enzimas nombradas anteriormente se puede observar que para cada
variante del gen las enzimas de restriccin realizan diferentes cortes, esto puede explicar que aunque un
mismo gen codifica para la protena TGF-B este dar lugar a varios polimorfismos que pueden ser el resultado
de mutaciones en la cadena de ADN.
Imagen 6. Mapa de restriccion del gen TGF-B1 con las enzimas de restriccin Acu I, Alw I, Ban II, Bce AI y
BsiHKAIra

Imagen 7. Mapa de restriccion del gen TGF-B2 con las enzimas de restriccin Acu I, Alw I, Ban II, Bce AI y
BsiHKAIra

Imagen 8. Mapa de restriccion del gen TGF-B3 con las enzimas de restriccin Acu I, Alw I, Ban II, Bce AI y
BsiHKAIra
Imagen 9. Mapa de restriccion del gen TGF-B3 con las enzimas de restriccin Acu I, Alw I, Ban II, Bce AI y
BsiHKAIra

En gel de electroforesis (imagen 10) se puede observar mucho ms claro las diferencias en los cortes que
realizan las diferentes enzimas en cada una de las variantes del gen TGF-B, por lo cual se habla de genes con
polimorfismos ya que la alteracin de su secuencia resulta en la expresin de una protena diferente a la
protena que se esperara que se genere en un caso normal, adems estas protenas al cambiar su estructura
tambin cambian su funcin de este modo TGF-B1 es una protena de secrecin que lleva a cabo diversas
funciones en la clula, como el control del crecimiento celular, proliferacin celular, procesos de
diferenciacin y apoptosis, TGF-B2 regula la proliferacin y diferenciacin de diferentes tipos de clulas,
TGF-3, por medio del receptor de TGF-beta 3, regula las molculas involucradas en la adhesin celular y la
formacin de la matriz extracelular durante el proceso de desarrollo del paladar. Sin TGF-3, los mamferos
desarrollan una deformidad conocida como labio leporino, entonces como se puede observar cada variante del
gen cumple una funcin distinta.

Imagen 10. Gel de electroforesis de los DNA de los genes TGF-1, TGF-2, TGF-3 y TGF-4 en orden
respectivamente, cortados con las enzimas de restriccin Acu I, Alw I, Ban II, Bce AI y BsiHKAIra
Para el gel de electroforesis se debe tener en cuenta que se debe utilizar el mismo marcador de peso para que
los datos obtenidos sean muy fiables a la hora de comprar y determinar las diferencias en los diferentes
polimorfismo de los genes.
En los geles de electroforesis se puede observar ms claramente las diferencias que hay entre las diferentes
variantes de los genes TGF-, por ejemplo; con la enzima Acu II, para el gen TGF-1 se generan 5
fragmentos de ADN pero para el gen TGF-2 solo se obtuvieron 3 fragmentos de DNA y para el gen TGF-3
se obtuvieron 2 fragmentos, esto indica que la secuencia de nucletidos para las secuencias de ADN de estos
genes no es la misma ya que las enzimas reconocen sitios especficos dentro de la cadena de ADN y aqu se
puede observar que esos sitios especficos no se encuentran en la misma posicin, esto induce a pensar que en
la secuencia de ADN pudo presentarse algn tipo de mutacin que alterara la secuencia normal del DNA,
pero tambin puede haber ocurrido por ejemplo procesos de splacing alternativo en donde el empalme de
exones no se hace de manera ordenada lo que hace que se altere la informacin de la cadena de DNA y se
produzcan diferentes protenas a partir de un mismo gen. (Telenti, A., et al. 2016)
Conclusiones
- Sobre esta prctica se puede concluir que para diferenciar genes se puede realizar un anlisis con
enzimas de restriccin ya que estas como poseen una secuencia especifica de corte permitir
diferenciar entre los distintos genes ya que estos van a generar cortes en diferentes sitios de su
secuencia utilizando las mismas protenas.
- Las mutaciones pueden afectar la produccin de protenas ya que por el principio de colinealidad
todo lo que ocurra en la molcula de DNA se ver reflejado en al final del proceso de traduccin en
las protena obtenida.
- Para los anlisis de los mapas de restriccin es muy til el uso del gel de electroforesis ya que este
permitir determinar cuntos fragmentos se generan y el tamao en pares de bases de estos, pero
siempre hay que igual las condiciones de la electroforesis en todos los genes de estudio por ejemplo
seleccionando el mismo marcador de peso molecular o colocando la misma cantidad de gel esto con
el fin de que no haya ms variables a considerar que no sea las diferentes enzimas de restriccin

Bibliografa.
- Karp G. Biologa Celular y Molecular, conceptos y experimentos. Sptima edicin. Mc Graw Hill
education. Pag 760.
- Roberts AB, Sporn MB: The transforming growth factor-bs. In: Sporn MB, Roberts AB, eds.
Handbook of experimental pharmacology: peptide growth factors and their receptors I (vol. 95/I),
New York: Springer Verlag 419-472, 1990.
- Telenti, A., et al. (2016). Deep sequencing of 10,000 human genomes. Proceedings of the National
Academy of Sciences, 201613365.
Cuestionario
1. Explique la diferencia entre haplotipo, alelo y variante de un gen.

Haplotipo Alelo Variante de un gen

Conjunto de variaciones del Un alelo es cada una de las dos o gen que es esencialmente igual
ADN, o polimorfismos, que ms versiones de un gen. Un que otro pero que posee
tienden a ser heredados juntos. individuo hereda dos alelos para diferencias debidas a
Haplotipo se puede referir a una cada gen, uno del padre y el otro mutaciones.
combinacin de alelos o a un de la madre.
conjunto de polimorfismos de
nucletido sencillo (SNPs) que
se encuentran en el mismo
cromosoma
 2. Ampliar los criterios para la seleccin de las enzimas de restriccin con las cuales se diferencian las
variantes de un gen.

Identificar los sitios de enzimas de restriccin en tu vector mirando un mapa de restriccin. El

mapa de restriccin te dir qu enzimas cortarn tu vector, y dnde.
Elegir una enzima de restriccin que tambin tenga un sitio presente en el inserto del gen, al
observar la secuencia del inserto. Asegrarse de que el sitio de restriccin est en una posicin
en la insercin que est fuera del gen de inters, por lo que no se pierde ninguna parte del gen.
Asegrarse de que no haya duplicados del sitio de restriccin en cualquier lugar de su insercin
gnica o vector. Esto provocar cortes mltiples en tu ADN y dar datos engaosos.
Elegir las enzimas de restriccin que cortan extremos cohesivos, en lugar de extremos romos.
Eligir una enzima de restriccin diferente para los dos extremos de tu insercin para asegurarte
de que se inserte en el vector en la orientacin adecuada y garantizar que el vector no vuelva a
adjuntarse a s mismo.
Trata de elegir dos enzimas de restriccin que funcionan bien en el mismo sistema tampn y
temperatura.
3. Cul es el origen genmico de una variante gnica
Pueden ser las mutaciones o el splicing alternativo
4. Qu consecuencias tiene la presencia de variantes gnicas para el desarrollo de las enfermedades

Estas variantes pueden ser inocuas o estar relacionadas con procesos patolgicos, respuesta a frmacos u otras
caractersticas.