Guía de Práctica - Microbiologia USMP 2017

DEPARTAMENTO ACADMICO
DE CIENCIAS BSICAS
GUA DE PRCTICAS DE
MICROBIOLOGA
SEGUNDO AO
2017 - II
LIMA PER
1
PROPIEDAD INTELECTUAL: Departamento Acadmico de Ciencias Bsicas- USMP
RESPONSABLE DE LA ASIGNATURA: Dr. Arturo Pareja Cruz
COORDINADOR DE LA ASIGNATURA: Lic. Cesar Correa Arellano
LIMA - PER
2017-II
2
Introduccin
El Manual de Prcticas de Microbiologa tiene como objetivo orientar a los alumnos

a un mejor conocimiento y aplicacin de los procedimientos de identificacin y
aislamiento de la variada flora microbiana de importancia en medicina humana. La
microbiologa es una disciplina que estudia la biologa de los microorganismos capaces
de producir enfermedad.
Desde que se describiera por primera vez la morfologa de las bacterias

(Leeuwenhoek. Siglo XVII), luego el aislamiento y diagnstico de distintos
microorganismos sobre todo en las dos ltimas dcadas del Siglo pasado en la que se
inicia la denominada poca dorada de la bacteriologa esta ha evolucionado
tremendamente. Continuamente se describen procesos infecciosos, as como
situaciones nuevas en los pacientes motivando ello la disponibilidad de informacin
cientfica relacionada con la microbiologa clnica y la infectologa.
Los avances tecnolgicos con aumento de la automatizacin, el desarrollo de la

biologa molecular, la qumica de los cidos nucleicos, los avances en inmunologa
clnica y los conocimientos de la patogenicidad microbiana hacen necesario la revisin
continua de los textos de microbiologa.
Tenemos el convencimiento que esta orientacin acadmica proporcionar a los

alumnos de la Asignatura de Microbiologa los recursos para preveer el inicio del
padecimiento, as como la base para la orientacin teraputica y la prevencin de las
enfermedades infecciosas.
Se da una relacin concisa de los mtodos de laboratorio empleados en el estudio

de las bacterias, hongos, rickettsias y virus. Con tal motivo sern expuestos conceptos
y ejercicios fundamentales, con lo que esperamos uniformar criterios acordes con la
actualizada tecnologa.
Los trabajos de laboratorio se han ordenado metodolgicamente a fin de facilitar la

aplicacin de los conceptos bsicos y as llegar al diagnstico de los diferentes
procesos infecciosos en humanos.
El objetivo de estas prcticas consiste en familiarizar al alumno con algunas de las

tcnicas ms comnmente utilizadas en los laboratorios de Microbiologa y permitir la
observacin experimental de los conceptos aprendidos durante las clases tericas.
Debemos dejar establecido que el presente Manual de Prcticas, no es una

compilacin amplia del tema, sino un Manual que contiene los requerimientos bsicos
y orientacin, adecuando los recursos y procedimientos que contribuirn a cimentar la
formacin integral del mdico humano.
Como docentes, nos sentiremos satisfechos si al final del curso se han cumplido
los objetivos, utilizando los elementos y procedimientos de diagnstico en el proceso
enseanza aprendizaje.
3
PRCTICA N 1
Informacin general
Formacin de grupos de trabajo
Generalidades
El estudio de las bacterias y de su estructura es particularmente difcil,

debido al tamao que presentan, siendo ste entre 1 y 6 micras. Para su
observacin se requiere el empleo del microscopio de luz , el cual , no
proporciona el suficiente poder de resolucin que permite observar las
diferentes estructuras de las bacterias lo que hace necesario el uso del
microscopio electrnico.
Para la observacin y estudio de las bacterias se utilizan diversos mtodos.

El ms simple de ellos consiste en la observacin en fresco, de esta manera se
visualizan caractersticas someras que proporcionan una idea del tamao,
forma y en ciertas especies la movilidad; estos aspectos pueden mejorarse con
el empleo del microscopio de contraste de fase.
Otra tecnologa que permite observar con mayor claridad a las bacterias, lo
constituyen los mtodos tintoriales, que facilitan el estudio de la forma ,
agrupamiento, y afinidad a diversos colorantes. Entre las tcnicas de mayor
utilidad destaca la tincin de Gram, la cual permite clasificar a las bacterias
segn su afinidad tintorial en Gram positivas y Gram negativas.
Existen grupos bacterianos que para su observacin requieren otras

tcnicas como la de Ziehl-Neelsen, la cual identifica a las bacterias cido-
alcohol resistente. Algunas bacterias poseen ciertas estructuras importantes
que pueden ser evidenciadas mediante tcnicas de coloracin especial como,
por ejemplo, para observar cpsula, esporas, flagelos.
Para realizar el diagnstico de hongos y virus existen tcnicas particulares,

las mismas que sern descritas en los captulos correspondientes.
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PRCTICA N 2
Bioseguridad y uso de equipos de seguridad biolgica
Normas de Bioseguridad
Disposiciones Generales
En general en todo laboratorio deben seguirse normas que garanticen la

calidad de las tcnicas y asimismo, la seguridad en el trabajo. En el caso
particular del Laboratorio de Microbiologa donde se trabaja con materiales
susceptibles de contaminacin accidental, se recomienda la adopcin rigurosa
de normas de seguridad e higiene a fin de evitar el riesgo de infeccin de las
personas que en l trabajan.
Con tal motivo, en el Laboratorio de Microbiologa se consideran cuatro niveles

de seguridad biolgica, segn los microorganismos con los que se trabaja:
Nivel 1 : Microorganismos no patgenos y patgenos oportunistas

Nivel 2 : Microorganismos o muestras con un potencial de riesgo moderado
Nivel 3 : Microorganismos y muestras de alto riesgo; los trabajos se realizan
en cabinas de seguridad , nunca en las mesas.
Nivel 4 : Microorganismos de altsimo riesgo , solo se hacen en laboratorios
de experimentacin y no en laboratorios de microbiologa clnica . Se requiere
este nivel cuando se maneja microorganismos de riesgo, especialmente virus,
tambin con algunas bacterias y hongos.
De toda forma durante las prcticas se recomienda seguir las siguientes

recomendaciones:
1. No ser permitido ingresar a la Sala de Prcticas sin el respectivo mandil.

Como medida de precaucin no dejar sobre las mesas de trabajo prendas de
vestir o cualquier otro objeto diferente al material asignado para el ejercicio.
2. Observar en todo momento las medidas de asepsia con el material de

trabajo . Los profesores de cada grupo les indicarn la metodologa a seguir.
3. Est prohibido comer, beber y/o fumar durante las clases prcticas, as
como llevarse los dedos , el lpiz o cualquier otro objeto a las proximidades de
la boca y ojos.
4.La evaluacin de los alumnos de las asignaturas correspondientes al

Departamento de Ciencias Bsicas se regir segn el Reglamento de
Evaluacin de Estudiantes de Pregrado , Perodo Lectivo 2011.
5. Por razones de seguridad, ningn material de prcticas saldr de la sala de

trabajo. En caso que se rompa algn material de vidrio con cultivo bacteriano ,
avisar de inmediato al profesor para que disponga la inmediata desinfeccin y
limpieza.
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6. Uno de los instrumentos de trabajo , el asa o mango de Kolle , terminado el
ejercicio programado deber ser esterilizado mediante flameado , de acuerdo
con las instrucciones dadas por el profesor.
7. Todo material de trabajo como son: lminas portaobjetos, laminillas o

pipetas, debern ser depositadas en los bocales de vidrio con solucin
desinfectante, los que estarn a la vista en cada mesa. Si fuera material de
desecho , como restos de algodn , papel, etc. , depositarlos en los recipientes
para la basura, nunca en la mesa de trabajo o en el suelo . Los tubos, placas
de Petri o frascos de cultivo se dejarn en canastillas o depsitos destinados
para ser esterilizados.
8. Los profesores estarn en todo momento atentos para orientar y/o resolver
cualquier duda que se presente en el desarrollo de las prcticas.
9. Cada alumno debe disponer obligatoriamente del Manual de Prcticas, el

que deber ser estudiado con anterioridad a cada ejercicio, de forma tal que
tenga conocimiento previo de los ejercicios que se van a presentar.
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Material y Equipo bsico en las prcticas de
Microbiologa
En el campo de la microbiologa mdica se requieren de conocimientos

bsicos, indispensables para facilitar el estudio de los diferentes
microorganismos ; por tal motivo es necesario que el alumno se familiarice
desde el principio con el material y equipos empleados en el aislamiento e
identificacin de los microorganismos
(bacterias, hongos y virus) . Ellos deben ser debidamente preparados y
posteriormente esterilizados para asegurar que los ejercicios renan los
requisitos exigidos para el trabajo microbiolgico. A continuacin se describen
algunos de ellos:
Asa y aguja de siembra : Muy usada en la prctica microbiolgica, hecha de

alambre de platino o de otro material , se inserta en un mango que facilita su
manejo. El alambre puede ser recto o terminar en forma de pequeo anillo.
Autoclave : Aparato para esterilizacin por vapor bajo presin , provisto de

manmetro y una llave que regula la presin y la temperatura a la que desea
esterilizar.
Cabina de Flujo laminar : Equipo que proporciona rea estril , para los
trabajos microbiolgicos, en especial en cultivos , evitando la interferencia de
los microorganismos de contaminacin ambiental.
Centrfuga : Aparato diseado para acelerar la separacin de partculas

slidas suspendidas en lquidos.
Contador de colonias : Sirve para contar electrnicamente y de forma exacta

las colonias de microorganismos.
Crioviales : Pequeos tubos cnicos de polipropileno resistentes a muy bajas

temperatura (- 4C). Usados para guardar muestras en la congeladora.
Ejemplo: suero, cepas virales.
Estufa : Aparato de dimensiones diversas , donde se incuban los cultivos,

generalmente a 37C.
Filtros esterilizantes : Para dejar libre de contenido microbiano a productos

en estado lquido, los que por su naturaleza no pueden ser sometidos a la
accin del calor en sus diferentes modalidades.
Gradilla : Soporte para tubos de ensayo.
Jarra de anaerobiosis : Instrumento til para el aislamiento de bacterias

anaerobias ya que permite un cierre hermtico no dejando ingresar oxgeno.
Lmina portaobjetos : Lmina de vidrio que se utiliza para preparar frotis

bacterianos.
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Matraces y balones : Recipientes volumtricos de gran utilidad para la
preparacin y almacenamiento de soluciones, colorantes , reactivos , medios
de cultivo , etc. Los balones se diferencian de los matraces por tener una base
esfrica con fondo plano. En ambos los cuellos terminan en un discreto
reborde lo que les confiere resistencia.
Mechero de Bunsen : Mechero de gas , en el que ste se mezcla con aire

antes de producir la flama. Se utiliza para esterilizar el asa de siembra.
Medios de cultivo : Mezcla de nutrientes esenciales para el crecimiento de

microorganismos .En su composicin se incluye un nmero balanceado de
nutrientes y un determinado volumen de agua. De acuerdo con su
consistencia pueden ser lquidos, semislidos y slidos. Se presentan en forma
deshidratada.
Microscopio : Instrumento ptico utilizado para la observacin de

microorganismos que no son visibles a simple vista.
Pipetas : Son tubos cilndricos de diversos materiales, pueden ser graduadas

y sirven para medir volumen conocido de lquido. Otras no son graduadas y se
utilizan para la transferencia de lquidos.
Pipetas Pasteur : Varillas de vidrio de 4 mm de dimetro y de 20 a 30 cm de

longitud. Se les emplea para la toma de pequeos inculos de siembra.
Pipeteadores automticos : Pipetas que absorben de forma automtica sin

necesidad de uno aspirar, pequeos volmenes (1l a 1 000 l ) de muestras.
Placa de Petri : recipiente de vidrio o plstico que , en general se usa para

contener medio de cultivo y proporciona una suficiente rea para el
crecimiento bacteriano.
Autoclave Cabina de Flujo laminar
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PRCTICA N 3
OBTENCIN Y MANEJO DE MUESTRAS CLNICAS
OBJETIVOS
Realizar los procedimientos adecuados para asegurar las medidas de

bioseguridad apropiadas.
Conocer las tcnicas de toma de muestra y manejo de las diferentes
muestras clnicas para su ptimo procesamiento.
Conocer las precauciones para el manejo y transporte de muestras clnicas.
INTRODUCCIN
En trminos de la efectividad del Laboratorio de Microbiologa , nada es ms

importante que la apropiada seleccin , coleccin y transporte de las muestras
clnicas. Estos procedimientos quedan inutilizados muchas veces por falta de
cuidado y mtodos defectuosos usados en la recoleccin y manejo de las
muestras.
Independientemente del hecho que algunos tipos de muestras requieren
metodologa de recoleccin muy especiales, podemos enumerar algunos
aspectos generales que deben ser tenidos en cuenta al coleccionar las
muestras clnicas :
La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso.
Cuando se va a proceder a tomar un espcimen clnico, es importante evitar

la contaminacin con microorganismos saprofitos del rea. Esta flora normal
puede interferir con la interpretacin del cultivo y enmascarar la presencia del
verdadero agente etiolgico de la enfermedad.
Seleccionar el lugar anatmico correcto de donde se obtendr el espcimen y

utilizar la tcnica apropiada y los instrumentos o elementos adecuados para
su obtencin . Especialmente en el caso de investigar microorganismos
anaerobios.
Nunca refrigerar una muestra por anaerobios.
Coleccionar un apropiado volumen de la muestra.

Insuficiente material puede ser causa de resultados falsos negativos.
Junto con la muestra se debe enviar una solicitud de anlisis en la que debe
figurar el nombre del paciente, nmero de identificacin personal,
procedencia, tipo de muestra, fecha y hora de coleccin, especificar regin
anatmica, diagnstico clnico, duracin de la enfermedad, terapia antibitica
, prueba requerida e iniciales del funcionario que tom la muestra.
El paciente debe ser informado en forma clara y sencilla de acuerdo a su

grado de instruccin sobre los procedimientos a realizar.
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Obtener en lo posible muestras antes de administrar antibiticos o agentes
antimicrobianos. Si se han administrado, informar de ello al laboratorio. A
menudo un lquido cefalorraqudeo no revela patgenos bacterianos en frotis
ni cultivo, cuando se ha tomado un antibitico en las 24 horas anteriores.
Colocar la muestra en un recipiente estril y adecuado para su transporte

como cajas, gradillas, bandejas, llevando en la base papel absorbente
embebido en desinfectante , con el fin de asegurar la sobrevivencia del posible
agente infeccioso, evitar derrame del espcimen y mantener medidas de
bioseguridad apropiadas.
Ordenar siempre un frotis para tincin o coloracin de Gram, para los

especmenes que procedan de cavidades aspticas y anotar su inters en
determinado microorganismo.
CRITERIOS DE RECHAZO DE UNA MUESTRA
Hoja de solicitud de anlisis no llenada correctamente

Muestras sin rotular o inadecuadamente rotuladas
Muestras sin medios de transporte adecuado, en contenedores quebrados,
rotos o
con derrames
Muestras secas o con contaminacin obvia
Muestras sin preservacin adecuada
Las muestras ms frecuentes en los estudios microbiolgicos son :
ORINA :
En las muestras de orina se pueden realizar diferentes anlisis como : examen

microscpico de orina, urocultivo, determinacin de algunos residuos de
medicamento (doping) e investigacin de microorganismos especiales como
Leptospira. El xito de estos exmenes depender de la tcnica con que se
tome la muestra y sobre todo del tiempo transcurrido entre la toma de la
muestra y el anlisis, ya que el proceso de descomposicin que se sucede en la
orina por accin de las bacterias all presentes , modifica el parmetro de los
componentes y muy especialmente altera la carga microbiana.
Procedimiento
Lavarse las manos

Las pacientes mujeres deben realizar previamente el lavado de los genitales
externos con agua y jabn y de adelante hacia atrs, mientras que los
hombres solo lo realizarn en el caso de solicitarse cultivos.
Secarse con un apsito estril
Las muestras deben colocarse en un frasco de boca ancha y tapa de rosca
estriles, depositar aproximadamente entre 30 y 40 ml de preferencia la
primera muestra de la maana a travs del chorro medio (miccionar una
buena cantidad en el inodoro y luego en el envase).
En mujeres la miccin debe ser separando los labios mayores de la vulva.
En hombres se hace la retraccin del prepucio de manera que el chorro de
orina salga directamente .
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Tapar el frasco con precaucin , evitando contaminar la muestra y/o
derramarla.
En casos de nios pequeos utilizar bolsas colectoras adheridas a los
genitales.
La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio. En caso de no
ser posible refrigerarla no ms de 4 horas.
HECES :
Las muestras de heces se solicitan para examen bacteriolgico, virolgico,

bioqumico y para la bsqueda de parsitos.
Las muestras de heces de un paciente sospechoso de enfermedades diarreicas
deben colectarse antes de la administracin de cualquier antibitico.
Procedimiento
Muestra evacuada : La persona debe defecar en un recipiente limpio y seco,

teniendo cuidado de no miccionar para que sta no se mezcle con orina.
Hisopado rectal : La muestra se obtiene con un hisopo de algodn estril , el
cual se desenvuelve y se lubrica antes de su uso, introducindolo en el medio
de transporte , de preferencia Cary Blair, y luego se introduce en el recto ,
unos 3 cm, mediante movimientos de rotacin.
El hisopo con la muestra se introduce hasta el fondo del tubo que contiene el
medio de transporte (Cary Blair o Amies).
El frasco con la muestra o tubo con el medio de transporte se pueden
conservar a temperatura ambiente hasta su procesamiento o envo al
laboratorio, no ms de 12 horas.
No se debe refrigerar la muestra.
HEMOCULTIVO :
La sangre de los individuos sanos es estril. Una afluencia repentina de

bacterias habitualmente es eliminada del torrente circulatorio en un perodo
de tiempo corto de minutos a horas, excepto cuando existe una infeccin
masiva o est presente un foco intravascular infectado. Bsicamente cuando
las bacterias se multiplican a tasas que exceden el sistema retculoendotelial
para eliminarlas , se habla de BACTERIEMIA. El trmino FUNGEMIA se
utilizar para designar la presencia de hogos en sangre.
Siempre que exista una razn para sospechar de una bacteriemia se debe
practicar el cultivo de la sangre o hemocultivo.
Procedimiento
Los hemocultivos se obtendrn antes de iniciar la terapia antibitica, el

incumplimiento de este punto puede dar lugar a resultados falsamente
negativos, pudiendo comprometer la vida del paciente.
Los microorganismos de la piel pueden contaminar la sangre durante la
extraccin, dificultando la interpretacin de los resultados. Adems algunos
contaminantes actan como patgenos oportunistas , por lo que se debe ser
muy cuidadoso durante la extraccin.
La toma debe realizarse por venopuncin y para ello se debe hacerse :
Lavado de manos y utilizacin de guantes estriles
Limpiar con jabn lquido o alcohol el lugar de la puncin
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Aplicar durante un minuto povidona yodada, dejar secar
Desinfectar los tapones de los frascos
Efectuar la extraccin
No airear los frascos
Nunca debe hacerse la extraccin a travs de catteres , salvo en aquellas
circunstancias en que se indica especficamente.
Cuando la extraccin se realice con adaptador , se debe esterilizar o ser de
un solo uso.
MUESTRAS FARINGEAS Y AMIGDALARES :
Ms del 70 % de procesos estn ocasionados por virus : rinovirus ,

coronavirus, adenovirus(3,4,7,14,21), parainfluenza, virus de la gripe, virus
coxsakie A y otros enterovirus, virus Epstein-Barr y virus herpes simple tipo I
Entre el 10 y 20 % de la faringitis agudas en nios de 5 a 10 aos, estn
ocasionados por Streptoccoccus pyogenes. Otras bacterias patgenas son :
Streptococcus grupos C o G, Corynebacterium diphteriae, Neisseria
gonorrhoeae, Haemophilus influenzae .
Procedimiento
Las muestras de exudado faringo-amigdalar se obtienen con la ayuda de un

depresor lingual, tocando con la torunda todas las partes con exudados,
membranas o zonas de inflamacin. Se deben frotar las criptas tonsilares y la
faringe posterior.
No se requieren medidas especiales para su transporte y conservacin.
La toma de muestra de la epiglotitis , debido al riesgo de complicaciones, se
hace por un especialista en las condiciones adecuadas.
Es recomendable realizar hemocultivos.
MUESTRAS NASALES :
Procedimiento
La muestra se obtiene introduciendo una torunda para cultivo, previamente

embebida en suero fisiolgico estril, unos 2 cm en la nariz y girando
suavemente contra la mucosa de la superficie nasal.
CATTERES :
El estudio bacteriolgico de los catteres , nos va a permitir en ocasiones

conocer el agente causal de una bacteriemia relacionada con el catter y
prevenir que aparezca dicha bacteriemia. Para valorar su importancia
podemos decir que de una u otra forma el 82 % de las bacteriemias
nosocomiales se relacionan con la presencia de catteres.
Vas de infeccin : a. Piel y catter : en los catteres perifricos y de corta
duracin
b. Endoluminal : en las vas centrales tunelizadas.
Procedimiento
Desinfectar con alcohol al 70 % una zona de la piel de unos 10 cm

correspondientes a la zona de entrada del catter
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Retirar el catter con la mxima asepsia, con la ayuda de pinzas y tijeras
estriles, cortar los 5 cm distales del catter que corresponde a la porcin
intravascular.
Introducir el segmento del catter en un recipiente estril correctamente
identificado
La muestra debe ser enviada al laboratorio en un perodo de tiempo menor
de 30 minutos. Cuando no sea posible deber ser guardada en refrigeracin a
4 C
LQUIDOS ESTRILES :
El fundamento es la bsqueda de agentes patgenos u oportunistas, que

pueden estar presentes en los lquidos o fluidos orgnicos . En este grupo
incluimos lquidos producidos , ya sea de forma espontnea o bien provocada
a nivel de las serosas, en las que habitualmente no existen microorganismos y
son presumiblemente estriles. Su buen manejo presenta un triple inters por
:
La trascendencia de esta patologa por su elevada morbilidad o mortalidad
Dificultad de diferenciar patgenos y oportunistas como consecuencia de
cuidados teraputicos instaurados o prtesis aplicadas previamente.
Posibilidad de contaminacin exgena, sea en la obtencin o en su
manipulacin, siendo por ello muy importante extremar las medidas de
asepsia, de recogida y procesamiento.
Muestras
Lquido asctico o peritoneal
Lquido articular o sinovial
Lquido pericrdico
Lquido pleural
Procedimiento
La obtencin de estos lquidos es un procedimiento mdico

La toma se realiza por puncin percutnea (toracocentesis, paracentesis,
puncin pericrdica o puncin articular)
Para el estudio bacteriano se requerir de 1 a 10 ml; para lquido de dilisis
peritoneal se requerir de un volumen superior a 100 ml.
Para evitar la coagulacin de algunos lquidos se utilizar heparina sin
conservantes, ya que otros anticoagulantes podran tener accin
antibacteriana.
Los recipientes idneos son los viales de transporte para anaerobios
Los frascos de hemocultivo tambin son tiles para cultivar lquidos
biolgicos estriles. Si se sospecha de anaerobios colocar la muestra luego de
ser extrada en un frasco para anaerobios.
LQUIDO CFALORRAQUIDEO (LCR)

La meningitis es un proceso inflamatorio del Sistema Nervioso Central, que
afecta a las leptomeninges y al lquido cefalorraqudeo . Se trata de una
urgencia mdica y requiere un diagnstico y tratamiento precoz . Su
morbimortalidad , en meningitis agudas bacterianas , se relaciona
directamente con el retraso en el inicio de la teraputica.
Los casos espordicos de meningitis agudas bacterianas , se relacionan
directamente con el retraso en el inicio de la teraputica, aparecen en edades
extremas de la vida, ocurriendo el 75 % de los casos en menores de 1 ao.
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Muestra
La toma de la muestra la realiza el mdico tratante o el patlogo clnico del

laboratorio.
Se obtendr antes de instaurar cualquier terapia antimicrobiana , siempre
que las condiciones lo permitan.
LCR se obtiene por puncin lumbar
Generalmente se obtendrn dos tubos, el primero se enviar para el estudio
bioqumico, el segundo para el estudio microbiolgico con el mayor volumen
posible.
El tubo ms turbio se enviar a Microbiologa.
Se debe solicitar simultneamente hemocultivos, porque las meninges suelen
ir acompaadas de un proceso bacterimico
El volumen mnimo para el estudio bacteriolgico rutinario es 1 ml, aunque
es preferible disponer de volmenes superiores. Para hongos o micobacterias
se necesitarn al menos 2 ml adicionales por cada uno de los estudios, siendo
deseable llegar a los 10 ml.
La muestra debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues algunos
agentes etiolgicos como Streptococcus pneumoniae pueden lisarse
rpidamente a partir de la primera hora de su recogida
Si no fuera posible se mantendr en estufa entre 35 a 37C y una parte se
incubar
en frasco de hemocultivo, que se mantendr en idnticas condiciones.
Si no se dispone de estufa se mantendr a temperatura ambiente. Nunca se
refrigerar pues se afectar la viabilidad de Neisseria meningitidis y H.
influenzae.
Procesamiento del lquido cefalorraqudeo
Centrifugar a 1 500 hasta 3 000 revoluciones durante 15 a 20 minutos.

En caso de lquidos muy purulentos no ser necesario centrifugar.
Recoger el sobrenadante con pipeta de Pasteur estril y conservarlo a 4C en
frigorfico.
Sembrar el sedimento con pipeta de Pasteur en : agar Sangre a 35 - 37C,
atmsfera de CO2 ,agar Chocolate a 35 - 37C atmsfera de CO2 ,caldo
Tioglicolato o caldo Infusin Cerebro Corazn BHI a 35 - 37C por 72 horas.
Se realizarn tres extensiones para tincin : tincin de Gram, Azul de
metileno, Wright.
EXTRACCIN DE SANGRE PERIFRICA :
1. Colocar sobre la mesa de trabajo todo el material que se necesitar para

ejecutar la obtencin de la muestra.
2. Lavarse las manos previamente a la extraccin de la sangre y si es preciso
colocarse guantes.
3. El paciente deber sentarse cmodamente de manera que el brazo quede
colocado paralelamente a la mesa de trabajo , donde se realizar la extraccin
de sangre.
4. Apoyar el brazo del paciente sobre un pequeo cojn bajo el codo. Con la
palma de la mano hacia arriba.
5. Con la mano izquierda tirar del extremo de la ligadura, cruzndolo y a
continuacin introducir este extremo por debajo de la parte principal de la
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ligadura aproximadamente dos dedos por encima de la flexin del codo. sta
se deber ajustar solo lo suficiente para aminorar la corriente sangunea y
dilatar la vena, sin apretar tanto que reduzca el paso de la sangre por las
arterias.
6. Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la
dilatacin de las venas.
7. Con el dedo ndice de la mano izquierda palpar la vena en la que se
introducir la aguja.
8. Desinfectar la zona de la piel donde se realizar la puncin con un pedazo
de algodn embebido en alcohol yodado.
9. Tomar la jeringa con la mano derecha, colocar la yema del dedo ndice sobre
la base de la aguja.
10. Colocar la aguja sobre la vena con el bisel hacia arriba, introducir la aguja
en el centro de la vena sin titubeos., de 1 a 1,5 cm aproximadamente.
11. Luego de extraer la sangre por puncin venosa, retirar la aguja de la
jeringa y colocarla en un depsito de metal ( para autoclavar o incinerar);
verter lentamente la sangre en un tubo o en el caldo de cultivo.
EVALUACIN
1. Por qu una muestra de lquido cefalorraqudeo no debe ser refrigerada , si

no se enva de inmediato al laboratorio?
2. Cules son los agentes etiolgicos de la meningitis aguda en neonatos,

nios y adultos?
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3. En qu casos se debe tomar una muestra de aspirado bronquial?
4. Cul es el volumen se sangre requerido para realizar un hemocultivo en un

neonato, nio y en un adulto?, cules son los agentes etiolgicos ms
frecuentes de una septicemia en cada caso?
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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COLORACIONES BACTERIANAS SIMPLES
OBJETIVOS
Explicar la coloracin Azul de metileno.

Identificar la diferencia entre coloracin simple y coloracin diferencial
INTRODUCCIN
Debido al pequeo tamao de los microorganismos , se requiere de un

microscopio ptico, ya sea de campo claro (lo ms usado) o de campo oscuro,
para hacer la descripcin morfolgica de estos. La observacin de los frotis
teidos es lo ms recomendable. El frotis se prepara haciendo una extensin
de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual se fijan y
se tien los microorganismos.
Las coloraciones son tcnicas que permiten observar microorganismos en

funcin de la capacidad de los mismos para retener (o no), determinadas
sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la clula y del colorante.
Estos colorantes pueden ser de distintos tipos:
Catinicos : sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de
las clulas y las tien. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina.
Aninicos : Con carga negativa, no penetran en el interior de la clula, de
modo que no tien las clulas sino el entorno. En este caso se habla de tincin
negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina.
Liposolubles: se mezclan con los lpidos celulares y los tien. Ejemplo: Negro
sudn.
Los colorantes aumentan el contraste combinndose qumicamente con el

protoplasma microbiano y permiten localizar estructuras especficas del
microorganismo y diferenciarlos en su forma, tamao, agrupacin y afinidad a
ciertos colorantes . Las bacterias pueden presentar las siguientes formas
esfricas (cocos), estos a su vez disponerse en cadenas (estreptococos) , en
pares (diplococos), o en racimos (estafilococos), sarcinas, en forma alargadas
cilndricas (bacilos) y espirales (espiroquetas y espirilos).
De acuerdo al nmero de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se
pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son :
Simples : Utilizan un solo colorante. Las clulas presentan una composicin

qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de
forma distinta frente a un colorante . El colorante tie las clulas como en el
caso de : Azul de metileno, Safranina o no la tie : Nigrosina.
Diferenciales : Los diferentes tipos de clulas presentan distinta composicin
qumica y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo
que permite clasificar a los microorganismos en diferentes grupos, segn su
capacidad de tincin. Ejemplos: tincin de Gram y Ziehl-Neelsen, ambas
utilizan ms de un
colorante.
Selectivas: Distintas estructuras celulares tienen diferente composicin
qumica de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Ejemplos:
tincin de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpsculos
metacromticos. Pueden utilizar uno o ms colorantes.
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COLORACIN AZUL DE METILENO
Es una coloracin simple que permite observar presencia o ausencia de

microorganismos y distinguir algunas formas bacterianas : cocos, bacilos ,
espirilos.
Se utiliza el Azul de metileno, el cual se agrega sobre la extensin por un
minuto , luego del cual se enjuaga , se deja secar a temperatura ambiente y se
observa al microscopio con la lente de mayor aumento.
MATERIALES
Guantes quirrgicos estriles

Hisopos estriles
Lminas portaobjetos
Mechero de alcohol
Jeringa de 10 cc
Algodn y alcohol yodado
Ligadura
METODOLOGA
HISOPADO FARNGEO
1. El profesor, con la colaboracin de un alumno, ensear a tomar una

muestra de exudado farngeo. El paciente ( en este caso el alumno), se sentar
cmodamente de frente al profesor , el rea debe tener buena iluminacin para
que permita visualizar adecuadamente el sitio anatmico a examinar.
2. Indicar abrir la boca y con ayuda del bajalengua deprimir la lengua para
favorecer que la faringe quede expuesta, con un hisopo estril frotar
firmemente la pared posterior de la faringe y las amgdalas, particularmente
en donde existan puntos blancos o reas que presenten signos de inflamacin
o sangrado.
3. Cuando el paciente no tenga amgdalas, la muestra se obtendr del fondo
de las fosas amigdalinas. Al retirar el hisopo tener la precaucin de no hacer
contacto con ninguna otra rea de la boca.
4. A partir de la muestra tomada, se realizar el aislamiento por el mtodo de
aislamiento en estra en placa, se utilizarn placas de agar sangre , agar
chocolate y agar manitol salado.
5. Antes de eliminar el hisopo , realizar una extensin para preparar un frotis,
fijar la muestra y teir con una tincin simple (Azul de metileno) para
observar:
Morfologa de la bacteria
Agregacin o tipo de distribucin bacteriana.
18
RESULTADOS
Frotis de hisopado farngeo :
Hisopo
Lmina
portaobjeto
s
Aislamiento en estra
Coloracin simple : Azul de Metileno
Cubrir el frotis con colorante Azul de metileno por un minuto

Lavar con agua corriente
Dejar secar a temperatura ambiente
1. Cubrir con 2. Lavar con

Azul de metileno agua
Graficar lo observado al microscopio
19
EVALUACIN
1. Cules son las estructuras celulares o molculas que pueden ser

observadas cuando se emplea la tincin simple?. Ejemplos de dos (2)
colorantes que podran utilizarse para realizar una tincin simple.
2. Cules son las desventajas o limitaciones de la tincin simple ?
20

21
PRCTICA N 4
COLORACIONES BACTERIANAS COMPUESTAS
COLORACIN DE GRAM
OBJETIVOS
Explicar el fundamento de la coloracin de Gram.

Ejecutar la tcnica de coloracin ms usada en bacteriologa : coloracin de
Gram.
Establecer la diferencia entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
INTRODUCCIN
Descrita por Christian Gram en 1884, permitiendo dividir a las bacterias en

dos grupos taxonmicos : Gram positivas y Gram negativas.
En esta tcnica se deben tener en cuenta tres aspectos fundamentales :
Las bacteria Gram positivas retienen firmemente el colorante inicial
Al aadir el mordiente se forma un complejo molecular de gran tamao
La penetracin est condicionada por la permeabilidad de la pared celular.
Los mecanismos antes mencionados se relacionan con la composicin qumica

de la pared de las bacterias. Las bacterias Gram positivas contienen una
mayor cantidad de murena, cido teicoico, pocas protenas y algunas
contienen polisacridos.
Las bacterias Gram negativas poseen poca murena, una elevada cantidad de
lpidos, protenas y polisacridos y no contienen cido teicoico.
La murena en las bacterias Gram positivas impide que el complejo cristal

violeta-yodo sea eliminado por el decolorante alcoholacetona, ya que es
insoluble en alcohol. El alto contenido de lpidos en la pared de las bacterias
Gram negativas ocasiona que el complejo cristal violeta yodo sea eliminado o
disuelto por el decolorante.
Al finalizar la coloracin las bacterias Gram positivas quedan teidas con el

cristal violeta : morado y la bacterias Gram negativas quedan teidas con el
colorante de contraste : safranina : rojo.
MATERIALES
Cultivos en medio lquido de Escherichia coli y Staphylococcus sp.
Asa bacteriolgica
Equipos de coloracin para tincin de Gram
Mechero, portaobjetos y puentes para tincin
Microscopio
METODOLOGA
Preparar un frotis de cada uno de los cultivos de Escherichia coli y
Staphylococcus sp
Preparacin del frotis para la tincin
22
Trabajar en un rea aproximadamente de 10 cm de distancia de la llama del
mechero ( zona considerada estril ), flamear el asa, hasta el rojo vivo y
dejarla enfriar por 30 segundos
Con un lpiz graso identificar cada una de las lminas portaobjetos donde se
van a realizar las preparaciones.
Destapar el tubo con el cultivo, empleando para el propsito los dedos anular
y meique , introducir el asa, tomar una pequea muestra de cultivo.
Depositar el material en el centro de una lmina portaobjetos y extenderlo en
un rea aproximadamente de 0,5 cm.
Cuando se trata de cultivos de medio slido , colocar una gota de agua
destilada sobre la superficie , descargar la muestra y homogeneizar. Dejar que
la preparacin seque espontneamente al aire libre.
Fijar la preparacin pasndola rpidamente sobre la llama del mechero ,
evitando un calentamiento excesivo para evitar que el material se carbonice.
Con un lpiz graso identificar cada una de las preparaciones.
Para la realizacin de un buen frotis se deben cumplir las siguientes

condiciones :
Utilizar lminas limpias y en perfecto estado, libre de rayones y de manchas,
deben ser previamente pasadas por la llama del mechero para eliminar trazas
de grasa y no se deben tocar con las yemas de los dedos .
Debe ser delgado, translcido y homogneo para que, durante el proceso de
tincin, reciba en toda su superficie el mismo tratamiento con las diferentes
sustancias qumicas y se debe usar para la preparacin la tcnica asptica.
Utilizar un mnimo de cultivo cuando es un medio slido.
Cuando se trabaja a partir de un medio lquido debe tomarse suficiente
cantidad : una muestra con el asa de siembra.
Tcnica de coloracin de Gram :

Cubrir las preparaciones con cristal violeta , durante un minuto, lavar
ligeramente con agua corriente.
Cubrir con lugol durante un minuto, lavar ligeramente con agua corriente.
Decolorar con la mezcla alcohol acetona , escurrir de 5 a 6 gotas y lavar
con agua corriente
Cubrir con safranina durante 30 segundos , lavar con agua corriente y dejar
secar.
Colocar sobre la coloracin una gota de aceite de inmersin .
Observar al microscopio con la lente de mayor aumento.
1. Cubrir con
cristal violeta 2. Lavar con
(1 minuto) agua corriente
23
3. Cubrir con lugol 4. Lavar con
(1 minuto) agua corriente
5. Decolorar con 6. Lavar con agua

alcohol acetona corriente
(5 a 6 gotas)
7. Cubrir con
safranina 8. Lavar con
(30 segundos) agua corriente
Bacteria Gram
positiva
24
Bacteria Gram
negativa
RESULTADOS
Graficar lo observado al microscopio
EVALUACIN
1. Cules son las principales precauciones del manejo del microscopio y por
qu se debe utilizar el aceite de inmersin al hacer el estudio microscpico de
las bacterias ?
25

2. Cules son las fuentes de error ms frecuentes en la preparacin de un

frotis?
26
PRCTICA N 5
MEDIOS DE CULTIVO
MTODOS DE SIEMBRA
OBJETIVOS
Comprender la utilidad de los medios de cultivo en el trabajo microbiolgico.

Diferenciar los distintos medios de cultivo de acuerdo a su consistencia y
funcin.
INTRODUCCIN
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y

otros componentes, que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de
los microorganismos. Debido a que la diversidad metablica de los
microorganismos es muy amplia, la variedad de los medios de cultivo tambin
lo es. La mayora de los medios de cultivo se comercializan en forma de
liofilizados , que es preciso rehidratar La preparacin de un medio de cultivo
se reduce a pesar la cantidad del medio y disolverlo en agua destilada ( libre
de inhibidores de crecimiento), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las
sustancias termolbiles se esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los
componentes previamente esterilizados en la autoclave.
CONDICIONES GENERALES
Presentar todos los elementos necesarios, en sus proporciones y/o

cantidades necesarias.
pH adecuado
Condiciones osmticas adecuadas
Estril y preservado de cualquier contaminacin.
Medio fresco ya que se desecan y pierden humedad, concentrndose el resto
de los componentes.
COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CUTIVO
Agua : destilada o desionizada

Agar : se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se obtiene
de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo.
Azcares : son una fuente de carbono para los microorganismos. Los ms
empleados son : glucosa, lactosa y sacarosa.
Extractos : son preparados de ciertos rganos o tejidos animales o vegetales,
obtenidos con agua y calor. Ejemplo : extracto de carne , de levadura, de
malta.
Peptonas : son protenas hidrolizadas , se obtienen por digestin qumica o
enzimtica de protenas animales o vegetales.
Fluidos corporales : sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguneo, son aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos
microorganismos patgenos.
27
Sistemas amortiguadores : son sales que se aaden al medio para mantener
el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Ejemplo : fosfatos
bisdicos o bipotsicos.
Indicadores de pH : son indicadores cido-base que se aaden para detectar
cambios de pH en el medio.
Agentes reductores : sustancias que se aaden al medio para crear
condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o
anaerobios. Ejemplo : cistena, tioglicolato.
CLASIFICACIN
Por su consistencia
Medio de cultivo lquido: caldo Nutritivo, caldo Selenito, caldo Peptonado

Medio de cultivo semislido: agar Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM), agar
Movilidad, Indol y Ornitina (MIO)
Medio de cultivo slido: agar Sangre, agar Mac Conkey, agar Manitol salado.
Por su funcin o fines especiales
Medios nutritivos (simples): con nutrientes mnimos para que las bacterias
poco exigentes desarrollen . Ejemplo: caldo y agar Nutritivo.
Medios nutritivos enriquecidos: son medios simples a los que se aaden

ciertos productos a manera de suplemento nutritivo que permiten el aporte de
factores de crecimiento. Ejemplo: agar Sangre, agar Chocolate.
Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que por su composicin

qumica favorecen o permiten la multiplicacin de unos microorganismos,
inhibiendo parcialmente la de otros. Ejemplo: caldo Selenito, caldo Peptonado
alcalino.
Medios selectivos: permiten el crecimiento slo de la especie que se desea

aislar, para lo cual se les agrega colorantes bacteriostticos: Azul de metileno,
Verde de malaquita, Verde brillante. Ejemplos: agar Mac Conkey, agar
Salmonella-Shigella (SS), agar Manitol salado.
Medios diferenciales: contienen sustancias nutritivas y un indicador de pH

que permite detectar las reacciones bioqumicas especficas de los
microorganismos. Ejemplo: agar Triple azcar (TSI),agar rea, agar Citrato de
Simmons.
Medios de transporte: permite mantener viables a los microorganismos

durante el traslado al laboratorio. Ejemplo: caldo Hafna, Cary Blair, Stuard.
MATERIALES
Caldo nutritivo : en matraz y tubos

Agar nutritivo en matraz ,placas y tubos
Agar Mac Conkey, agar Salmonella-Shigella, agar Manitol salado, agar
Chocolate, agar Triple azcar (TSI), agar rea, agar Citrato de Simmons, agar
SIM.
28
METODOLOGA
Observar y diferenciar los medios de cultivo proporcionados en la prctica.
Medios Simples:
Medios Enriquecidos:
29
Medios Selectivos:
Medios Selectivos:
30
EVALUACIN
1. Qu medios de cultivo utilizara para cultivar una secrecin abdominal en

la que se sospecha de bacterias anaerobias?
2. Qu medios de cultivo se utilizan cuando se sospecha de ? :
Vibrio cholerae :
Clostridium botulinum :
Brucella spp :
Campylobacter jejuni :
3. Qu precauciones se deben tener antes de sembrar en medios para

anaerobios?
31
32
MTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO
OBJETIVOS
Conocer y realizar las diferentes tcnicas de siembra y aislamiento

bacteriano.
Observar el desarrollo de bacterias aisladas a partir de un cultivo puro.
INTRODUCCIN
En Microbiologa se entiende como siembra al proceso mediante el cual se

lleva una porcin de una poblacin de microorganismos (inculo), de un
cultivo crecido a un medio nutritivo para su crecimiento. Todo este proceso
hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios previamente esterilizados y
siguiendo las instrucciones de los profesores de prctica. La principal
advertencia consiste en trabajar siempre prximos a la llama del mechero que
, debido a las corrientes de conveccin verticales que genera es capaz de crear
un ambiente estril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama.
Para realizar un cultivo de microorganismos es necesario que el nmero de

clulas bacterianas (inculo) sea transferido (inoculado) a un medio de cultivo
estril. Al querer aislar una especie en particular a partir de una mezcla de
microorganismos deben emplearse tcnicas de aislamiento lo que permite,
obtenerlas en forma pura. Esto implica la utilizacin de medios tanto simples
como especiales , mayormente slidos de acuerdo a la naturaleza del
microorganismo.
Las tcnicas de cultivo se realizan por siembra o diluciones sucesivas :
Por siembra : es el procedimiento por el cual se pone en contacto al

microorganismo con un medio de cultivo, para que en condiciones ptimas de
temperatura y tiempo de incubacin , pueda desarrollar y multiplicarse in
vitro. La finalidad es el
aislamiento para tener un cultivo puro de bacterias a partir de una muestra
problema (orina, heces, secreciones, agua servida).
La siembra puede ser :

Por inoculacin
Por estras simples
Por dispersin o agotamiento
Por puntura
Por diluciones sucesivas : consiste en hacer diluciones seriadas de la

muestra o del
inculo, sta se utiliza cuando se tienen muestras lquidas ( orina, agua ) , se
realiza
haciendo diluciones a las muestras : 1 :100, 1:1 000, 1:10 000 etc. Luego se
siembra cada dilucin en placas de Petri con medios de cultivo.
Una vez obtenidos los cultivos, se puede proceder al examen macroscpico :
morfologa de las colonias, actividades bioqumicas o caractersticas
inmunolgicas
33
de los microorganismos aislados.
Tomado de Microbiologa Tomo II de Granados 2 edicin
Tcnica de siembra por diluciones sucesivas
MATERIALES
Asa de siembra en aro y en punta

Tubos de vidrio de 16 x150mm
Tubos de caldo Nutritivo con cultivo mixto bacteriano : Staphylococcus
aureus y Escherichia coli
Placas con agar Nutritivo, agar Sangre y agar Manitol salado
Tubos con caldo y agar Nutritivo
Suero fisiolgico estril
Mechero de Bunsen
METODOLOGA
Manejo del asa bacteriolgica o de siembra :

El profesor demostrar el manejo adecuado del asa y explicar las
precauciones que se deben tener en la toma de la muestra :
Esterilizar el asa y dejarla enfriar para evitar quemar a las bacterias
34
Sumergir el asa hasta el fondo del cultivo lquido, ya que en este lugar se
encuentra una mayor concentracin de microorganismos.
Observar que al retirar el asa del tubo est cubierta por una pelcula lquida.
El asa de siembra se
toma del
mango como si fuera un
lpiz
El tapn del tubo se

toma
con el dedo meique
de la mano derecha
La boca del tubo se

flamea despus de
abrirlo
y antes de cerrarlo
Mtodo de siembra por agotamiento : aislamiento a partir de un cultivo

mixto
Con un lpiz graso marcar por detrs de la placa que contiene el agar , las
lneas como est indicado en la figura N 1, por lo que quedarn tres sectores :
el sector uno (1) el ms pequeo de los otros dos , servir para descargar el
asa.
Esterilizar el asa y obtener una asada de cultivo del medio lquido , cerrar el
tubo y colocarlo en la gradilla.
Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la placa de Petri y
sembrar trazando una serie de lneas en zigzag muy cerradas a todo lo ancho
del sector uno (1) . Esto mismo se puede hacer colocando la placa de Petri
sobre la mesa y con la palma de la mano , hacer un movimiento rpido para
levantar el fondo que contiene el medio de cultivo, como lo indicar el profesor.
Esterilizar el asa en el mechero. Girar la caja 90 grados , hasta que el sector
uno (1) quede a la izquierda y el sector dos (2) hacia arriba. Sin volver a tomar
el inculo, trazar un zigzag un poco ms abierto en el sector dos (2),
invadiendo el sector uno (1) en las primeras lneas del zigzag , pero no en las
ltimas.
Girar nuevamente la placa 90 grados , ahora el sector dos (2) estar a la
izquierda y el sector tres (3) hacia la derecha.
Hacer un nuevo zigzag en el sector tres (3), invadiendo el sector dos (2) . Este
paso puede repetirse sembrando un cuarto sector.
Incubar las placas a 37 C durante 24 horas. Las placas ya sembradas
debern colocarse con la tapa hacia abajo y la parte que contiene el agar
sembrado hacia arriba.
35
1 1
2
2 3
3
Figura N 1 Figura N 2
Mtodo de siembra en caldo de cultivo
Coger el asa de siembra en aro , esterilizarla al mechero al rojo vivo y dejarla

enfriar por unos segundos.
Abrir la placa que contiene el agar con el crecimiento bacteriano y con la
ayuda del asa de siembra coger una colonia bien aislada (figura N 1) .
Luego destapar un tubo con caldo de cultivo (figura N 2), coger la torunda,
que est dentro de este con el dedo meique de la mano con que se est
cogiendo el asa de siembra con la colonia
Introducir el asa de siembra en el tubo y agitar suavemente hasta que se
desprenda la colonia del asa de siembra.
Introducir la torunda, tapar el tubo, llevar a esterilizar el asa de siembra y
homogeneizar bien el caldo.
Llevar a incubar a 37 C por 12 horas.
36
Figura N1
Figura N2
Transcurrido el tiempo de incubacin, observar el desarrollo bacteriano en los

medios de cultivo lquido y slido
Medio lquido : la turbidez indica desarrollo

Medio slido : presencia de colonias
RESULTADOS
Realizar la lectura, observar y graficar los resultados.
Staphylococcus aureus
Agar Nutritivo Agar Sangre Agar Manitol

Salado
37
Escherichia coli
Agar Nutritivo Agar Sangre Agar Manitol

Salado
EVALUACIN
1. Qu mtodo de siembra usara en cada uno de los casos siguientes?
Cultivo de heces :
Cultivo de lquido cefalorraqudeo :
Contaje de colonias en urocultivo :
2. Por qu el agar Nutritivo es un medio de uso general para el cultivo

bacteriano? Qu sustancias se le pueden agregar para hacerlo enriquecido
para bacterias Gram positivas?
38
3. Cul es la importancia de un cultivo puro?
39
PRCTICA N 6
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO : ANTIBIOGRAMA
OBJETIVOS
Entender el fundamento del antibiograma , el modo en que se realiza y las

principales fuentes de error.
Conocer los principales mtodos de susceptibilidad a un antimicrobiano.
Evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibiticos de una bacteria
de
crecimiento rpido aislada en prcticas anteriores. El mtodo utilizado es el
de
difusin en agar o de Kirby-Bauer.
INTRODUCCIN
La actividad de los antimicrobianos (antibiticos y quimioterpicos) debe ser

evaluada in vitro para obtener la informacin que permitir decir si un
microorganismo es susceptible o resistente a determinado producto.
Los antimicrobianos actan produciendo toxicidad selectiva , no actan
directamente sobre el husped, sino que se combinan qumicamente con
determinados sistemas de los microorganismos , enfocando as la accin sobre
los microorganismos ms que sobre el husped.
La determinacin de la mnima concentracin inhibitoria (MIC) nos
proporciona la dosis mnima necesaria del quimioterpico para impedir el
desarrollo bacteriano, lo que permite hacer estudios de uso clnico y detectar
mutantes resistentes.
Dos son los procedimientos empleados para conocer sta informacin, el
mtodo del tubo dilucin y el del disco difusin en agar, a ste ltimo se le
denomina : antibiograma.
Accin de los antibiticos

La actividad antimicrobiana in vitro determina:
a. La potencia de un agente antibacteriano en solucin
b. Su concentracin en los lquidos del cuerpo o en los tejidos
c. La sensibilidad de un microorganismo a concentraciones conocidas del
medicamento.
Inhibicin de sntesis de pared celular: Penicilina, Cefalosporinas,
Bacitracina, Vancomicina, Novobiocina.
Alteracin de la permeabilidad de la membrana celular: Anfotericina B,
Colistina, Nistatina, Polimixina.
Inhibicin de la sntesis proteica : Aminoglucsidos ( Kanamicina, Amikacina
,
Estreptomicina ), Tetraciclinas, Cloramfenicol, Macrlidos ( Eritromicina ),
Lincomicinas.
Inhibicin de sntesis de cidos nucleicos : cido Nalidxico, Novobiocina,
Sulfonamidas, Trimetropin, Rifampicina.
40
Medicin de la actividad antimicrobiana
Esta se determina mediante los mtodos de dilucin o difusin, utilizando un
microorganismo standard y una cantidad conocida del antimicrobiano. Para
ello se utilizan las pruebas de dilucin en tubos y el mtodo de difusin.
Prueba de dilucin
En ste ensayo se incorporan cantidades conocidas de antimicrobianos en
medios lquidos, se inoculan despus con las bacterias en prueba y se
incuban. El punto final se toma cuando la cantidad de sustancias
antimicrobiana es capaz de inhibir el crecimiento o de matar a las bacterias en
prueba.
Mtodo de difusin
Preparacin del inculo

La tcnica del antibiograma slo es aplicable a especies bacterianas en cultivo
puro. Por ello previamente se proceder, si es preciso, a hacer un aislamiento
en placa.
Cultivar la bacteria aislada en un tubo con medio lquido apropiado (caldo
Nutritivo, Infusin cerebro corazn) o preparar una suspensin directa a partir
del cultivo en placa usando el siguiente mtodo:
a. Tomar una colonia aislada con el asa y resuspender en el tubo de solucin
salina frotando en la pared del tubo.
b. Homogeneizar bien y ajustar la densidad ptica con un patrn de turbidez
N 0,5 de Mac Farland : 0,5 ml de cloruro de bario 0,048 M a 99,5 ml de cido
sulfrico 0,36 N 0,18 M. Esto equivale a 108 clulas/ml . Diluir si es necesario
la suspensin o aadir ms inculo.
c. Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez, sumergir una
torunda estril en la suspensin, rotar la torunda estril varias veces.
Presionando firmemente sobre la pared interior del tubo por encima del nivel
del lquido, para remover el exceso de inculo.
d. Inocular la superficie seca de la placa con agar Mueller Hinton estriando
con una torunda en tres direcciones mediante rotacin de la placa, para
asegurar una distribucin uniforme del inculo, dejar secar la placa a
temperatura ambiente por 3 a 5 minutos para que cualquier exceso de
humedad superficial sea absorbido.
e. Colocar los discos sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinza
estril (o con un aplicador automtico) presionando suavemente sobre cada
disco para asegurar un contacto completo son la superficie del agar.
Distribuir los discos uniformemente de modo que estn a una distancia de 15
mm del borde de la placa y a 25 mm uno del otro (el dimetro de los discos
segn las normas de la Organizacin Mundial de la Salud debe ser de 6 mm),
no deben colocarse ms de 6 discos en una placa.
La dificultad de ste mtodo est en las diferentes velocidades de crecimiento
para los diversos microorganismos.
El uso de un disco para cada antibitico estandarizado , permite dar el
informe de S (sensible), I (intermedio) y R (resistente)
Factores que pueden afectar la actividad antimicrobiana in vitro :

El pH del medio, ya que algunos antibiticos son ms activos a pH cido
(Nitrofurantona), otros a pH alcalino (Aminoglucsidos , Sulfonamidas)
Los componentes del medio, en este caso las protenas sricas fijan a las
penicilinas desde 40 % para la Meticilina y 98 % para la Dicloxacilina.
41
Estabilidad de los medicamentos , a la temperatura de la incubadora varios
agentes antimicrobianos pierden su actividad.
Cuanto ms grande sea el inculo bacteriano, ms baja ser la sensibilidad
del microorganismo.
Cuanto ms tiempo se prolonga la incubacin, mayor es la oportunidad de
presentarse las mutantes resistentes , igualmente los microorganismos que
crecen rpido y activamente son ms sensibles a la accin de los
antibacterianos que aquellos que se encuentran en fase de reposo.
Dilucin en tubo
Se obtiene un resultado cuantitativo , destacando dos caractersticas
importantes :
Concentracin mnima inhibitoria (CMI) : es la concentracin mnima de

antimicrobiano que inhibe el crecimiento de un microorganismo.
Concentracin mnima bactericida (CMB) : es la concentracin que mata a
los microorganismos.
Normalmente la CMI es suficiente para combatir una determinada infeccin,
ya que los mecanismos inmunitarios se encargan de eliminar al
microorganismo.
MATERIALES
Caldo de cultivo con suspensin bacteriana a la escala de turbidez de N 0,5

de Mc Farland
Placas de Petri con agar Mueller Hinton
Torundas estriles
Discos impregnados con diferentes antibiticos
Pinzas estriles.
METODOLOGA
Sumergir la torunda en caldo tripticasa de soya con cepa bacteriana ,

presionar firme sobre las paredes del tubo y extender uniformemente en la
superficie de la placa de agar Mueller Hinton.
Colocar con la ayuda de pinzas, los discos impregnados con diferentes
antibitico sobre la superficie del agar.
Los discos deben quedar a una distancia de 25 mm entre ellos.
Incubar a 37C durante 24 horas.
42
Realizar la lectura, observar y anotar los resultados.
Lectura de los discos de sensibilidad

El dimetro de la zona de inhibicin se mide con una regla milimetrada,
colocada debajo de la placas de Petri.
El lmite del rea de inhibicin est dado por la inhibicin completa del
desarrollo, tal como se puede apreciar a simple vista.Los milmetros de la
lectura sern llevados a la tabla correspondiente para traducir su
interpretacin en los trminos : Sensible (S), Intermedio (I) ,Resistente (R).
Tomado del Manual de laboratorio

para la identificacin y prueba de
susceptibilidad a los antimicrobianos
de patgenos bacterianos de
importancia para la salud pblica en
el mundo en desarrollo. Organizacin
Mundial de la Salud 2004.
Sensible
Resistente
Lectura de lo halos de Inhibicin de los discos de sensibilidad
Quimioterpico Concentracin del Halo de Inhibicin

Disco mcg Sensible Intermedio Resistente
Ampicilina AM 10 ug +17 14-16 -13
Amikacina AK 30 ug +17 -15
Ac. Nalidxico AN 30 ug +19 14-18 -13
Cefalotina CF 30 ug +18 15-17 -14
Cefoxitina CTX 30 ug +21 16-10 -15
Ceftriaxona CRO 30 ug +21 14-20 -13
Cloranfenicol C 30 ug +18 15-18 -14
Kanamicina K 30 ug +18 14-17 -13
Nitrofurantoina FD 300 ug +17 15-16 -14
Sulfatrimetoprim SXT 231,2 ug +16 11-15 -10
Ciprofloxacino CIP 5 ug +21 16-20 -15
43
Antibitico S I R
Antibitico S I R
EVALUACIN
1. Qu importancia clnica tiene el antibiograma?
2. Mencione cuatro (4) posibles causas de error en el procesamiento o lectura

del antibiograma.
44

3.. En qu casos es necesario realizar la concentracin mnima inhibitoria?
45
PRCTICA N 7
DIFERENCIACIN BIOQUMICA DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS
OBJETIVOS
Reconocer las caractersticas morfolgicas y en los cultivos de las bacterias

Gram
positivas
Identificar bioqumicamente las diferentes bacterias Gram positivas de
importancia
clnica.
INTRODUCCIN
Existen una gran variedad de bacterias Gram positivas de importancia clnica

con forma de cocos como Staphylococcus aureus, especies de Streptococcus ,
principalmente S. pneumoniae y cocos anaerobios : Peptostreptococcus.
Entre los bacilos Gram positivos patgenos ms comunes tenemos Bacillus

anthracis, Clostridium, Gardnerella, Listeria , Corynebacterium.
Todas esta bacterias se encuentran causando procesos infecciosos en los seres
humanos y en algunos casos estas se encuentran colonizando alguna parte
del cuerpo junto con bacterias de la flora normal. Por eso se hace necesario
para su aislamiento e identificacin realizar toma de muestras y
procesamiento bacteriolgicos correctos.
Dentro de los Gram positivos, los cocos y en especial las especies de

Streptococcus y los Staphylococcus son los ms fciles de aislar e identificar
mediante observacin de hemlisis, pruebas bioqumicas o diferenciales
especficas como la prueba de catalasa para diferenciar Staphylococcus de
Streptococcus , la prueba de coagulasa para diferenciar Staphylococcus
patgenos de los no patgenos, la reaccin de Quellung para distinguir
neumococos etc.
MATERIALES
Cultivos de Streptococcus pneumoniae en agar Sangre

Cultivo de Staphylococcus aureus en agar Manitol salado y agar Sangre
Tubos con plasma (1ml ) y pipetas graduadas de 1 ml estriles
Reactivo de perxido de hidrgeno
Equipo para la coloracin de Gram
Lminas portaobjetos
Asas bacteriolgicas
Mecheros
Microscopios
METODOLOGA
Pruebas bioqumicas para Staphylococcus y Streptococcus

Observar el tipo de hemlisis que presentan las placas de agar Sangre
46
Realizar la prueba de catalasa con una colonia de la placa de agar Sangre y
con una de Manitol salado.
Para la prueba de coagulasa , en dos tubos con un ml de plasma cada uno,
depositar en uno 0,5 ml del cultivo de Staphylococcus aureus y en otro un ml
de Streptococcus epidermidis . Incubar 30 minutos a 37 C.
Preparar un frotis con las colonias que han desarrollado en el agar Sangre y
en agar Manitol salado.
Preparacin de Frotis :
1. Con el asa de siembra

tomar una colonia de la
placa de Petri
2. Extender la muestra sobre la

lmina portaobjetos
3. Fijar el extendido con la

llama del mechero
47
METODOLOGA
La identificacin de Staphylococcus y Streptococcus, se basa en la morfologa

de las colonias que se observan en los cultivos primarios y en el tipo de
hemlisis en agar Sangre. Sin embargo para evitar errores de interpretacin ,
se emplean pruebas bioqumicas como :
Prueba de Catalasa
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin de perxido de

hidrgeno en agua y oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los
microorganismos aerobios y anaerobios facultativos excluyendo los
estreptococos.
La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida
con desprendimiento de burbujas : la enzima catalasa convierte el perxido de
hidrgeno , en agua y oxgeno molecular. Esta prueba se emplea para
diferenciar los gneros Micrococcus y Staphylococcus : catalasa positivo del
gnero Streptococcus : catalasa negativo.
negativo.
Con el asa de siembra se toma
una colonia del cultivo del
microorganismo y se coloca en la
lmina
Perxido de
hidrgeno
Figura N 1
Figura N 2
(+) BURBUJEO: Staphylococcus
(-) NO BURBUJEO: Streptococcus
Figura N 3
48
Tomado de Diagnstico Microbiolgico de Bailey y Scott 11 edicin
POSITIVO NEGATIVO
Fermentacin del manitol
El agar Manitol salado es un medio altamente selectivo para el aislamiento de

Staphylococcus patgenos en cultivos mixtos, ya que se aprovecha la
capacidad de los Staphylococcus de desarrollar en presencia de Cloruro de
sodio (Na Cl) al 7,5 % y la de fermentar manitol, en este caso se observar la
formacin de un halo amarillo en el agar circundante a las colonias.
Coagulacin del plasma
Staphylococcus aureus produce una protena llamada coagulasa , capaz de

aglutinar el plasma tratado con oxalato, citrato o heparina en presencia de un
factor contenido en el suero.
Este factor srico reacciona con la coagulasa , activando el fibringeno y
produciendo un cogulo o trombo de fibrina. La coagulasa se presenta en
forma unida (adherida a la clula) y en forma libre. El estudio de la actividad
coagulasa se puede llevar a cabo en un tubo de ensayo (para coagulasa libre) y
en portaobjetos (coagulasa nido), tambin llamado factor de agregacin , la
prueba en tubo se hace poniendo un ml de plasma al que se le agrega una
asada de un cultivo nocturno de S. aureus. Se incuba la mezcla a 37 C
durante 4 horas y se considera positivo ante cualquier grado de
coagulacin.
49
(+) PRUEBA POSITIVA
Formacin de cogulo
(-) PRUEBA NEGATIVA

No hay formacin de cogulo No se forma
Cogulo Staphylococcus epidermidis cogulo
POSITIVO NEGATIVO
RESULTADOS DE LAS PRUEBAS BIOQUMICAS
Streptococcus
Hemlisis Fermentacin
del manitol
50
Prueba de catalasa
Fermentacin Prueba de Prueba de

del manitol catalasa coagulasa
Staphylococcus epidermidis
Fermentacin Prueba de Prueba de

del manitol catalasa coagulasa
EVALUACIN
51
1. Mencione dos (2) pruebas bioqumicas que permitan diferenciar:
Streptococcus pneumoniae :
Streptococcus pyogenes :
2. Realice un flujograma para la identificacin de bacteria Gram positivas
52
53
PRCTICA N 8
IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS
PSEUDOMONAS
OBJETIVOS
Conocer los procedimientos de identificacin bioqumica de las principales

bacteria
Gram negativas.
Interpretar los resultados de las pruebas bioqumicas y correlacionarlas con
la
diferentes especies de bacterias Gram negativas.
INTRODUCCIN
Las bacterias Gram negativas pueden presentarse como bacilos o cocos siendo
los primeros los ms abundantes tanto en el hombre como en los animales.
Varios de estos microorganismos pertenecen a la flora intestinal normal ,
algunos estn asociados a infecciones entricas y a procesos infecciosos
(especialmente cuando stas bacterias invaden otros rganos o sistemas).
Es posible que las infecciones procedan de un reservorio animal , de un
portador sano o de la diseminacin endgena de la bacteria en una persona
susceptible, pudindose ver afectado cualquier rgano del cuerpo.
Familia de bacilos entricos
Esta familia Enterobacteriaceae, incluye a varios patgenos que causan

sndromes diarreicos . Un gran nmero de ensayos han sido desarrollados a
manera de identificar rpidamente al patgeno, para que posteriormente el
mdico, con base en el reporte, indique el tratamiento adecuado o para que los
epidemilogos puedan localizar la fuente de infeccin. Dentro de los bacilos
Gram negativos , las enterobacterias son responsables del 30 a 35 % de todas
las septicemias, ms del
70 % de todas las infecciones del tracto urinario y muchas infecciones
intestinales.
Dentro de las especies de enterobacterias que son los agentes etiolgicos de

infecciones entricas tenemos : Salmonella , Shigella, y Escherichia coli. Estas
pueden producir cuadros diarreicos e infeccin sistmica , que son procesos
infecciosos que se diseminan generalmente por va sangunea o linftica.
Medios de aislamiento primario
Son medios selectivos porque permiten el desarrollo de algunas bacterias e

inhiben el desarrollo de otras. Esta capacidad puede ser moderada (agar
Eosina azul de metileno (EMB) y Mac Conkey) y alta (agar Salmonella-Shigella,
Desoxicolato y Citrato) o completamente especfica (Sulfato de bismuto y Verde
brillante).
Algunos de los medios selectivos contienen lactosa y un indicador de pH, lo
que permite desde el principio tener colonias aisladas de bacterias
54
fermentadoras como Escherichia coli y no fermentadoras de la lactosa :
Salmonella, Shigella.
Medios diferenciales : Pruebas Bioqumicas
Son aquellos en los que se pone de manifiesto las propiedades metablicas de

los microorganismos frente a diferentes sustratos. Existen medios que
permiten observar una, dos o ms caractersticas metablicas de la bacteria
inoculada . Entre los ms utilizados estn :
Agar Triple Azcar (TSI): medio slido que contiene glucosa, sales de hierro
y un indicador de pH. Permite conocer la capacidad de la bacteria para
fermentar los carbohidratos. Se detecta la produccin de sulfuro de hidrgeno
(H2S), as como de gas. El tubo se siembra por picadura y en estra por lo que
se debe observar tanto el fondo como la superficie del medio
Agar Lisina Hierro (LIA) : medio slido que contiene lisina, sales de hierro,
glucosa y un indicador de pH. Se determina la descarboxilacin y
desaminacin oxidativa de la lisina, la produccin de cido sulfhdrico o
sulfuro de hidrgeno (H2S) y la fermentacin de glucosa. Se siembra por
picadura y estra.
Medio para Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM) : medio semislido, se utiliza

en la produccin de sulfuro de hidrgeno, la formacin de Indol y movilidad.
Se inocula con una nica puncin con asa de siembra recta a travs del
centro, hasta una profundidad de unos dos tercios del medio.
Agar Citrato de Simmons : medio slido que contiene citrato de sodio,

compuesto que puede ser utilizado como nica fuente de carbono, por algunas
bacterias. Se siembra por picadura y estra
Agar rea (Mtodo de Christensen) : medio slido, se utiliza para determinar

la capacidad de un organismo para producir la enzima ureasa, que hidroliza la
rea . La hidrlisis de la rea produce amonaco y anhdrido carbnico. La
formacin de amonaco alcaliniza el medio y el cambio de pH se detecta por el
cambio de color del rojo fenol de naranja plido a magenta.
Existen ms pruebas bioqumicas que pueden utilizarse como complemento a

las ya descritas como son : rojo de metilo, Voges Proskawer, utilizacin de
malonato, las cuales ayudan a determinar la especie del microorganismo
aislado. En ocasiones a pesar de recurrir a diversas pruebas metablicas, no
se consigue la identificacin , siendo necesario realizar reacciones
inmunolgicas para llegar al diagnstico definitivo.
BACTERIAS PIGENAS GRAM NEGATIVAS
Otro grupo menos abundantes en especies pero de gran importancia clnica

son las bacterias pigenas Gram negativas, que pueden ser cocos o
cocobacilos . Las enfermedades que producen por lo general incluyen la
acumulacin de abundantes cantidades de pus y afectan frecuentemente el
aparato genital o respiratorio. Dichas enfermedades comprenden : uretritis
purulenta (gonococo) , meningitis , neumonas , bronquitis, sinusitis, otitis
media, conjuntivitis, epiglotitis etc.
Las bacterias pigenas Gram negativas patgenas en humanos son : Neisseria,
Haemophilus, Bordetella, Moraxella.
55
Las bacterias del gnero Neisseria son diplococos Gram negativos inmviles,
cuyos lados adyacentes son aplanados y ligeramente cncavos. Slo dos
especies de este gnero son patgenas exclusivamente de humanos : Neisseria
gonorroheae o gonococo, agente causal de la enfermedad de transmisin
sexual, la gonorrea y la
N .meningitidis o meningococo productos comensales para el hombre y que
habitan principalmente el tracto respiratorio superior.
Espordicamente se pueden comportar como patgenos oportunistas N. sicca
y N. mucosa.
El diagnstico definitivo de una infeccin gonoccica se hace por el

aislamiento en cultivo de N. gonorrhoeae.
Para el diagnstico del gonococo, el lugar de la toma de la muestra depender
de la edad, sexo y de las caractersticas de la infeccin.
La tincin de Gram es el mtodo de eleccin para el examen directo de las
muestras. Son oxidasa positiva.
Para los cultivos , el medio debe ser de preparacin reciente, bien hidratado y
precalentados. Se utilizan medios selectivos como agar Thayer Martin
modificado. Se debe utilizar un medio no selectivo ya que algunas cepas
pueden inhibirse por los antimicrobianos contenidos en los medios selectivos.
Debe estar adems en una atmsfera que contenga de 3 a 5 % de CO2.
El diagnstico de la infeccin meningoccica, se hace con el aislamiento de N.
meningitidis a partir de lquido cefalorraqudeo, sangre, lquido sinovial,
pleural o pericrdico. Las ms utilizadas son las dos primeras.
Con la tincin de Gram se observan como diplococos Gram negativos, crecen

en los medios de cultivo enriquecidos y su crecimiento se favorece con una
atmsfera de CO2. Son oxidasa positivo y fermentan los carbohidratos.
MATERIALES
Placas con agar Eosina azul de metileno sembradas con cepas problemas.
Placas con medio Mac Conkey, Eosina azul de metileno (EMB) y Salmonella-
Shigella
Tubos con medio TSI, Citrato de Simmons, LIA, REA, SIM, sin sembrar y
sembrados con cepa problema
Asas de siembra
Reactivo de Kovacs
Lminas fijadas con frotis de lquido cefalorraqudeo con tincin de Gram.
Microscopio
Aceite de inmersin
Placas de cultivo con agar Chocolate.
METODOLOGA
Enterobacterias
En las prcticas se harn los trabajos de laboratorio que nos permitan
observar las caractersticas de cultivo y con ello su identificacin
A partir de uno de los tubos problema, tomar con el asa de siembra
previamente esterilizada una muestra y sembrar por estras en los medios
Eosina azul de metileno y Salmonella Shigella. Incubar a 37C por 24 horas.
Transcurrido el tiempo de incubacin , observar la morfologa de las colonias
de las placas sembradas (Mac Conkey, EMB y S-S).
56
Seleccionar una colonia y realizar cultivos en los tubos de TSI, Citrato de
Simmons, LIA y SIM. Esto se hace por puntura en los medios y luego en
estras en la parte de inclinacin (pico de flauta) como lo indicar el profesor
en cada medio. Llevar a incubar a 37C por 18 a 24 horas.
Hacer la lectura de las pruebas bioqumicas, interpretar y realizar la
identificacin del microorganismo proporcionado.
Interpretacin Bioqumica
Agar Triple Azcar (TSI):

Fermentacin de glucosa : en la picadura (fondo del tubo) el medio vira a
color amarillo. Es una reaccin dbil.
Fermentacin de sacarosa : en todo el tubo el medio cambia a amarillo,
principalmente en el fondo, donde se intensifica el color debido a la reaccin
de la glucosa.
Fermentacin de lactosa : en la superficie el medio vira a amarillo.
Debido a la fermentacin puede hacer produccin de gas, lo que se
manifiesta por la presencia de burbujas en el medio.
Produccin de cido sulfhdrico o sulfuro de hidrgeno (H2S): por
degradacin enzimtica de aminocidos que contienen azufre originan un
precipitado de color negro. La produccin de H2S tiene lugar en ambiente
cido, de ah que el precipitado negro se concentre en el fondo del tubo, donde
se generan cidos a partir de la glucosa. As , un fondo negro indica que existe
acidez en el fondo del tubo, aunque el color amarillo se haya enmascarado con
el precipitado negro.
Agar Lisina Hierro (LIA) :

Descarboxilacin de lisina : el medio se alcaliniza y se observa lila o
ligeramente morado en la superficie.
Fermentacin de la glucosa : en el fondo del tubo el medio vira a amarillo.
Desaminacin de la lisina : vira a color rojizo en la superficie del medio. Es
caracterstico de Proteus y Providencia.
Produccin de H2S : precipitado de color negro ( por el mecanismo citado
anteriormente).
Agar Citrato de Simmons :

Utilizacin de citrato como fuente de carbono : el medio vira a color azul.
Agar rea :
Los microorganismos que hidrolizan la rea producen un cambio de color en
el pico de flauta de naranja plido a magenta.
Medio para Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM) :

Motilidad: Los cultivos mviles muestran un crecimiento difuso o turbidez
lejos de la lnea de inoculacin , por lo que observando si el crecimiento est
solo en la picadura o se extiende a los lados de ella, se puede determinar si el
microorganismo es inmvil o mvil.
Indol : la aparicin transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo
en la interfase entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol y, por
lo tanto , la prueba se considera positiva. El indol es capaz de reaccionar con
el grupo aldehdo del reactivo originando un complejo de color rojo.
Produccin de H2S: precipitado de color negro ( por el mecanismo citado
anteriormente).
57
Escherichia
coli
Klebsiella
Salmonella
58
Shigella
59
RESULTADOS
Realizar la lectura e identificacin de los microorganismos, observar y anotar

los resultados.
Escherichia coli :
TSI LIA Citrato de rea SIM

Simmons
Klebsiella sp

Simmons
60
Proteus sp
TSI LIA Citrato de SIM

rea
Simmons
Salmonella sp

Simmons
Shigella sp

Simmons
61
PSEUDOMONAS
Las especies pertenecientes al gnero Pseudomonas son ubicuos, se

encuentran en la tierra, materia orgnica en descomposicin, en la vegetacin,
en el agua. Tambin podemos encontrar estos microorganismos en el ambiente
hospitalario, en lugares hmedos, como comida, baos, respiradores. No
forman parte de la flora normal del ser humano con excepcin de los pacientes
hospitalizados y en pacientes ambulatorios inmunodeprimidos.
Debido a las sencillas necesidades de crecimiento y a la versatilidad
nutricional , se logra su amplia distribucin ambiental, siendo capaces de
utilizar un gran nmero de compuestos orgnicos como fuentes de carbono y
nitrgeno.
Son bacilos Gram negativos mviles rectos o ligeramente curvos, que son
aerobios estrictos, la mayora de las cepas son mviles por medio de uno o
ms flagelos polares; utilizan glucosa y otros hidratos de carbono de manera
oxidativa; y suelen ser citocromo oxidasa positivos
El gnero Pseudomonas se divide en cuatro grupos : Grupo fluorescente,
Grupo Stutzeri, Grupo Alcalgenes y Grupo con pigmento amarillo.
Grupo fluorescente : Pertenecen a este grupo las especies : Pseudomona
aeruginosa, Pseudomona fluorescens y Pseudomona putida , las cuales se
caracterizan por la produccin de un pigmento pioverdina hidrosoluble que da
fluorescencia blanca a verde azulada bajo luz ultravioleta de longitud de onda
larga (400 nm). Slo una especie, Pseudomona aeruginosa , produce el
pigmento hidrosoluble azul llamado piocianina.
Pseudomona aeruginosa produce un aspecto caracterstico cuando crece
en una placa de agar sangre , se pueden observar grandes colonias grises y
presenta beta hemlisis. Las colonias tienen un aspecto de piel de caimn y
con brillo metlico.
La exudacin de pus azulado, con olor similar a las uvas , por la
produccin de piocianina es caracterstico en las heridas infectadas por este
microorganismo. La piocianina es un antibitico que puede permitir que la
Pseudomona aeruginosa exista en la naturaleza, tambin puede desempear
un papel en la nutricin , al funcionar como una forma de adquirir fosfatos
inorgnicos. Se puede realizar una identificacin rpida de Pseudomona
aeruginosa si se observan las siguientes caractersticas : morfologa tpica de
las colonias, produccin de pigmentos difusibles, olor a fruta y positividad en
la prueba de oxidasa.
CARACTERSTICAS DEL GRUPO FLUORESCENTE :
PRUEBA Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas

aeruginosa fluorescens putida
PIOVERDINA + + +
PIOCIANINA + - -
MATERIALES
Placas con agar Nutritivo sembrada con cepa problema.

Asas de siembra
62
Pseudomonas
aeruginosa
piocianina
RESULTADOS
EVALUACIN
1.Cules son las principales enterobacterias causantes de cuadros diarreico?
63
2. Realizar un flujograma para la identificacin de bacterias Gram negativas.
64
PRCTICA N 9
IDENTIFICACIN Y AISLAMIENTO DE MYCOBACTERIUM
COLORACIN DE ZIEHL-NEELSEN
OBJETIVOS
Conocer los riesgo y precauciones durante el procesamiento de muestras con

micobacterias.
Conocer el procesamiento de las muestra para el estudio de micobacterias.
Explicar el fundamento de la coloracin de Ziehl-Neelsen.
Ejecutar la tcnica de coloracin de Ziehl-Neelsen.
INTRODUCCIN
El gnero Mycobacterium est integrado por ms de 100 especies, presentan

alto contenido de cidos miclicos en su pared que retienen las anilinas
utilizadas como colorantes : fucsina , auramina, aun despus de ser tratadas
con alcohol-cido de modo que todas las especies se presentan como cido-
alcohol resistentes (BAAR).
El complejo Mycobacterium tuberculosis comprende varios agentes etiolgicos
de tuberculosis M.tuberculosis , M.africanum y M.canetti , los cuales son
primariamente patgenos en el hombre.
M.tuberculosis y M.africanum son las especies de micobacterias ms
importantes por ser altamente patgenas para el hombre y muy transmisibles
de persona a persona por aerosoles expulsados por la tos de pacientes con
lesin pulmonar.
La muestra ms examinada en la investigacin de Mycobacterium tuberculosis

es la de esputo debido a que la tuberculosis pulmonar es la ms frecuente, sin
embargo dado que la enfermedad puede manifestarse en cualquier rgano ,
con menor frecuencia puede requerirse la investigacin de muestras como
orina, lquido cefalorraqudeo, lquido pleural, lquido asctico, sangre, pus de
cavidades abiertas, biopsias, las cuales deben procesarse tambin para
cultivo.
La muestra de esputo mucopurulenta proveniente del rbol bronquial que se

obtiene despus de un esfuerzo de tos, es la que asegura mayor probabilidad
de que se puedan observar bacilos, debe tener un volumen aproximado de 3 a
5 ml .Se recomienda analizar 2 3 muestras de cada sintomtico respiratorio.
La primera muestra debe obtenerse en el momento de la consulta y la segunda
al da siguiente al despertar por la maana. Puede obtenerse una tercera
muestra al momento de entregar al laboratorio la segunda muestra. El envase
debe ser de boca ancha y con tapa de rosca.
Si la muestra de esputo no va a ser procesada el mismo da, se debe introducir

cada envase en una bolsa de polietileno y anudar la bolsa por encima de la
tapa , se conservarn en refrigeracin a 4 C, para impedir la proliferacin de
la flora secundaria, preferentemente dentro de una caja de plstico.
65
Para manipular las muestras y sobre todo los pasajes a otros medios de
cultivo es importante hacerlos en la cabina de seguridad.
Para que la baciloscopa sea positiva es preciso que la muestra contenga entre
5 000 y 10 000 bacilos por ml de muestra.
Las micobacterias se multiplican con ms lentitud que otras bacterias
patgenas para el hombre a causa de su pared celular hidrfoba, que las hace
agruparse e inhibe la permeabilidad celular a los nutrientes
El medio de cultivo ms conocido es el Lwenstein-Jensen. La temperatura

ptima de crecimiento es de 37C. Los cultivos se revisarn diariamente hasta
un total de 60 das , pasados los cuales si no hay crecimiento se considerarn
negativos.
Lectura de los extendidos

Observar cada campo microscpico en superficie y profundidad , moviendo el
tornillo micromtrico antes de desplazarse al siguiente campo; seguir un
recorrido en lneas rectas, para recorrer el extendido evitando repetir la lectura
de los campos , ejemplo : de izquierda a derecha. El nmero mnimo de
campos a examinar es de 100 , los cuales pueden ser ledos por un
microscopista experimentado en cinco .
Los bacilos se observarn como bastoncillo delgados , ligeramente curvos, rojo
fucsia, destacndose claramente contra en fondo azul. Pueden presentarse
aislados, apareados o agrupados.
Escala semicuantitativa para los extendidos examinados por tincin Ziehl-

Neelsen
Resultado del examen microscpico Informe

No se encuentran BAAR en 100 campos No se observan bacilos cido-alcohol
observados resistentes
Se observan de 1 a 9 BAAR en 100 campos N exacto de bacilos en 100 campos
observados
Se observan entre 10 y 99 BAAR en 100 campos Positivo (+)
observados
Se observan de 1 a 10 BAAR en 50 campos Positivo (++)
observados
Se observan ms de 10 BAAR en 20 campos Positivo (+++)
observados
Tincin de Ziehl-Neelsen
La cido-alcohol resistencia es la propiedad que tienen las micobacterias de

captar en su pared fucsina fenicada y retenerla aun con la accin de los
decolorantes como la mezcla de cido y alcohol . Esta caracterstica se debe al
alto contenido lipdico fundamentalmente fosfolpidos, ceras y cidos
miclicos.
MATERIALES
Muestras de esputo inactivadas (autoclavadas) de pacientes Bk positivos
Frotis fijos de Mycobacterium tuberculosis a partir de esputos
Tubos con medios de cultivo Lwestein-Jensen mostrando colonias de
micobacterias
Equipo de coloracin para tincin de Ziehl-Neelsen
66
Mecheros
Lminas portaobjetos
Microscopios
METODOLOGA
Preparacin y fijacin del extendido
1. Ordenar las muestras

2. Numerar las lminas portaobjetos
3. Tomar la muestra y la lmina portaobjetos y colocarlas por detrs del
mechero, de manera que la llama quede entre el operador y el frasco
4. Destapar con cuidado el envase
5. Partir un aplicador en dos. Tomar una parte del aplicador con la mano
izquierda y la otra con la mano derecha entre el pulgar y el ndice y con los
extremos irregulares seleccionar la partcula ms densa o purulenta de la
muestra
6. Colocar las partculas seleccionadas sobre la lmina portaobjetos y
extenderla con movimientos suaves . Dejar secar el extendido a temperatura
ambiente
7. Desechar el aplicador en un frasco que contenga una solucin de
hipoclorito de sodio al 1 %.
8. Cerrar el envase de la muestra
9. Cuando el extendido haya secado, pasarlo sobre la llama del mechero por
tres (3) o cuatro (4) veces para fijarlo.
Tincin de Ziehl-Neelsen
1. Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina bsica fenicada

2. Con la llama de un hisopo embebido de alcohol calentar suavemente por
debajo de los extendidos, con movimientos de vaivn, hasta observar que se
desprenden los primeros vapores blancos
3. En el trmino de 5 minutos calentar tres veces hasta la emisin de vapores.
No dejar hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y
colorearse mal.
4. Dejar enfriar y enjuagar con abundante agua
5. Cubrir todo el extendido con la solucin decolorante y dejar actuar por tres
minutos. Enjuagar con abundante agua
6. Cubrir todo el extendido con solucin de Azul de metileno, dejar actuar por
un minuto
7. Enjuagar con abundante agua
8. Dejar secar al medio ambiente
67
1. Cubrir con fucsina 2. Calentar suavemente con
bsica fenicada ayuda del hisopo (5 minutos)
4. Cubrir con solucin

3. Enjuagar con decolorante (3 minutos)
abundante agua
5. Enjuagar con 6. Cubrir con Azul de

abundante agua metileno (1 minuto)
68
7. Enjuagar con
abundante agua
Bacilos cido-alcohol
resistentes
Medio de cultivo
Lwenstein-Jensen
Crecimiento de
Mycobacterium tuberculosis
RESULTADOS
Realizar la observacin microscpica de las lminas y graficar los resultados.
69
BACTERIAS ANAEROBIAS
Las bacterias anaerobias han sido encontradas en infecciones que

comprometen todos los rganos y regiones anatmicas del cuerpo. Los
abscesos ms profundos y las lesiones necrosantes que involucran anaerobios
son polimicrobianos y pueden incluir aerobios obligados, anaerobios
facultativos, microaerfilos como microorganismos acompaantes. Estos
microorganismos, de forma conjunta con el trauma, la stasis vascular o la
necrosis tisular, reducen la tensin de oxgeno y el potencial de
oxidoreduccin en los tejidos y proveen las condiciones favorables para la
multiplicacin de los anaerobios obligados.
En las ltimas dcadas , las infecciones anaerobias se han vuelto ms
comunes, para lo cual existen dos probables explicaciones : a) el aislamiento
por parte del laboratorio de las bacterias anaerobias ha mejorado de modo
que las infecciones endgenas no son ms mal diagnosticadas o pasan
inadvertidas , b) una proporcin mayor de pacientes est recibiendo frmacos
inmunosupresores por neoplasias u otras enfermedades , lo que deriva en la
resistencia del husped inmunodeprimido. Las infecciones anaerobias
primarias se establecen fcilmente en reas de tejido daado y la bacteriemia,
diseminacin metastsica de las bacterias con formacin de abscesos
distantes y una cadena progresiva de eventos , pueden suceder a veces con
un desenlace mortal. Es importante el aislamiento e identificacin de las
bacterias anaerobias debido a que estas se asocian a una elevada
morbimortalidad y a que el tratamiento vara segn la especie implicada.
Aislamiento de bacterias anaerobias
Seleccin de las muestras para el cultivo :
Debido a que los anaerobios
residentes a menudo estn presentes en grandes cantidades como flora
normal en las superficies de las mucosas , incluso la contaminacin mnima
de una muestra puede dar resultados errneos. Todos los materiales recogidos
de lugares que carecen de flora natural como lquidos corporales que no sea
orina, exudados de abscesos profundos, aspirados con aguja fina y biopsias de
tejidos pueden ser cultivados para bacterias anaerobias.
Recoleccin y transporte de las muestras:
70
Al tomar muestras de piel o mucosas, se debe se descontaminar la
superficie, para lo cual se debe utilizar jabn, alcohol etlico al 70 % y tintura
de yodo por un minuto ( en crculos concntricos comenzando por el centro),
tambin se puede utilizar yodopovidona al 10 % , luego de lo cual se espera al
menos 2 minutos antes de la extraccin de la muestra . El material para el
cultivo anaerobio se obtiene mejor por biopsia de tejidos o por puncin y
aspiracin . El empleo de hisopos no es una alternativa adecuada debido a la
exposicin excesiva de la muestra a los efectos de la desecacin , la posibilidad
de contaminacin durante la recoleccin y a que los microorganismos pueden
quedar retenidos dentro de las fibras del hisopo. Si se utiliza un hisopo, este
debe provenir de un sistema de transporte exento de oxgeno.
Un factor crucial para la viabilidad de los cultivos anaerobios es el
transporte de las muestras; el efecto letal del oxgeno atmosfrico debe ser
nulo hasta que la muestra pueda procesarse en el laboratorio. Ya no se acepta
tapar de nuevo una jeringa ni el transporte de la aguja y la jeringa al
laboratorio debido a los problemas secundarios a lesiones por puncin . Por lo
tanto incluso los aspirados deben inocularse en el mismo tipo de tubo o frasco
ampolla libre de oxgeno. La muestra (pus,lquidos corporales u otro material
lquido) se inocula a travs del tapn de goma despus de extraer todo el aire
de la jeringa y la aguja. Si slo se puede obtener una muestra con hisopo, se
requiere de un dispositivo especial para la recoleccin con una atmsfera libre
de oxgeno. Cuando se reinserta el hisopo, debe de tenerse cuidado de no
inclinar el recipiente , lo que provocara la salida y el desplazamiento del
anhdrido carbnico o el nitrgeno libre de oxgeno al aire ambiental.
El tejido puede colocarse en una pequea cantidad de lquido para preservarlo
de la desecacin y luego colocarlo en una bolsa para anaerobiosis.
Todas las muestras deben mantenerse a temperatura ambiente hasta su
procesamiento en el laboratorio, dado a que la refrigeracin puede oxigenar la
muestra. Todas las muestras deben ser remitidas al laboratorio lo antes
posible.
Examen directo de los materiales clnicos :

El anlisis macroscpico de las
muestras es importante para establecer la presencia de anaerobios, datos
orientadores sern el hallazgo de un olor ftido, el aspecto purulento de
muestras lquidas, as como el hallazgo de tejido necrtico y gas.
En los portaobjetos preparados para la tincin de Gram, es ms til la fijacin
con metanol que el calor; se deben observar caractersticas celulares y el fondo
del frotis y en la tincin de Gram , observar la forma, tamao, disposicin de
las bacterias y registrar el nmero de microorganismos presentes . Observar
caractersticas morfolgicas distintivas como : presencia de esporas,
ramificaciones, filamentos con corpsculos esfricos, formas granulares. La
tincin de Gram permite determinar caractersticas celulares, las tinciones de
Wright y Giemsa a veces pueden revelar informacin adicional. Las tinciones
de naranja de acridina son las ms tiles para detectar bacterias en
hemocultivos, lquido cefalorraqudeo, lquido pleural, lquido articular y
exudados.
Procesamiento de las muestras

Las muestras para cultivos anaerobios pueden procesarse en la mesa
de trabajo comn con incubacin en jarras o bolsas para anaerobiosis o en
una cmara anaerobia.
71
Jarras para anaerobiosis : el sistema que ms se utiliza para crear una
atmsfera anaerobia es la jarra para anaerobiosis; para lo cual se utiliza una
jarra plstica transparente ( disponible en el comercio) con una tapa que se
cierra para hacerla hermtica. Las condiciones de anaerobiosis pueden
obtenerse mediante el uso de un sobre que se adquiere en el comercio,
generador de hidrgeno y CO2, que se activa con el agregado de agua o con la
humedad proveniente de las placas de agar. La anaerobiosis se alcanza luego
de 1 a 2 horas.
Bolsas plsticas anaerobias : Es una bolsa de plstico transparente , de

varios tamaos, con capacidad para una a tres placas de Petri de 100 mm de
dimetro, un generador de gas H2-CO2 que produce una atmsfera cuando se
le agrega agua, partculas de catalizador de paladio fro y resazurina como
indicador. La bolsa se sella con calor luego de la activacin del generador para
permitir el mantenimiento de las condiciones anaerobias.
Incubacin de los cultivos

En la mayora de los casos, la temperatura adecuada es de 35 a 37C, para el
aislamiento primario de bacterias anaerobias a partir de muestras clnicas.
Las placas inoculadas en las mesas de trabajo y colocadas en las jarras de
anaerobiosis deben incubarse al menos 48 horas y reincubarse por otros 2 a 4
das para permitir que los microorganismos de crecimiento lento formen
colonias; algunos anaerobios como ciertas especies de Actinomyces y
Eubacterium, crecen ms lentamente y las colonias no pueden detectarse si las
jarras se abren antes. Si las jarras se abren pronto, algunos de los
microorganismos de crecimiento lento pueden morir debido a la exposicin de
oxgeno. Debe evitarse la exposicin prolongada de las placas recin
inoculadas al aire ambiental, ciertos anaerobios encontrados en muestras
clnicas como Peptostreptococcus anaerobius , pueden no crecer o mostrar un
retraso prolongado en el desarrollo cuando las placas recin inoculadas se
mantienen en el aire ambiental.
CUADRO N1 : Incidencia de anaerobios como flora normal de los seres

humanos
GNERO Piel
Tracto Intestino Genitales Uretra Vagina
Respiratorio externos
Superior
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
Bacteroides 0 +/- 2 +/- +/- +/-
Prevotella 0 2 2 1 +/- 1
Porphyromonas 0 1 1 D D +/-
Fusobacterium 0 2 1 D D +/-
Veillonella 0 2 1 0 D 1
BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Finegoldia magna 1 2 2 1 +/- 1
Micromonas 1 2 2 1 +/- 1
micros
Clostridium +/- +/- 2 +/- +/- +/-
Actinomices 0 1 1 0 0 +/-
Bifidobacterium 0 1 2 0 0 +/-
Eubacterium 0 1 2 D D 1
72
Lactobacillus 0 1 1 0 +/- 2
Propionibacterium 2 1 +/- +/- +/- 1
D:Desconocido; 0: No se encuentra o raro; +/-: irregular; 1: por lo comn
presente; 2 : Presente en grandes cantidades
CUADRO N2 : Muestras que no deben cultivarse en medios para anaerobios
HISOPADOS FARNGEOS O NASOFARNGEOS

Hisopados gingivales
Muestras broncoscpicas o esputo
Contenido gstrico, contenido de intestino delgado, heces, hisopados rectales,
fstulas colonocutneas
Superficies de lceras por decbito, hisopados de muestras de costras de
abscesos, revestimientos mucosos
Materiales adyacentes a la piel o las mucosas
Orina de miccin espontnea
Hisopados cervicales o vaginales
MATERIALES
Placas con agar Chocolate
Jarra anaerobia
RESULTADOS
EVALUACIN
1. Qu personas son ms susceptibles a la contaminacin con Mycobacterium

tuberculosis?
73

2. A quines se les llama multidrogorresistentes?
3. En qu casos se hace necesario realizar una prueba de susceptibilidad

antibitica a los pacientes con tuberculosis?
74
PRCTICA N 10
CULTIVO DE MUESTRAS CLNICAS: UROCULTIVO Y COPROCULTIVO
OBJETIVOS
Conocer el procedimiento para el cultivo de una muestra clnica.
Identificar los microorganismos ms frecuentes causantes de patologas
clnicas.
Conocer las condiciones para una adecuada toma de muestra para cultivo de
una
muestra clnica.
CULTIVO DE ORINA: UROCULTIVO
La infeccin del tracto urinario (ITU) , se define como la presencia y

multiplicacin de microorganismos en el tracto urinario con invasin de
tejidos adyacentes. La presencia de leucocitos en la orina , indica una
respuesta inflamatoria del tracto urinario, la mayora de las veces debido a
una invasin tisular por bacterias. Por lo general la piuria, est presente en
las ITU , por lo que se le considera un criterio diagnstico para sta
enfermedad.
La mayora de las ITU son causadas por bacilos Gram negativos de las
enterobacterias , siendo la Escherichia coli y Klebsiella sp, los ms
frecuentemente aislados , en infecciones no complicadas. Tambin pueden ser
causa de ITU otros bacilos Gram negativos como Proteus sp , Enterobacter sp y
Pseudomona aeruginosa sobre todo en pacientes sometidos a instrumentacin,
portadores de catteres urinarios, con anomalas anatmicas o funcionales del
tracto urinario y en pacientes hospitalizados.
Entre las bacterias Gram positivas pueden estar Staphylococcus epidermidis y

Enterococcus sp. En la mayora de las ITU , se recupera un nico
microorganismo en la orina. La presencia de ms de una especie bacteriana
puede deberse a una contaminacin de la muestra o pacientes con infecciones
complicadas como por ejemplo litiasis , abscesos renales o sondaje
prolongado.
El diagnstico definitivo de la ITU se hace mediante el cultivo de orina :

urocultivo . Hay que considerar que por cuidadosa que sea la tcnica de toma
de muestra ( salvo puncin suprapbica) , es difcil excluir la contaminacin
de la orina con las bacterias del tramo distal de la uretra , lo que puede causar
interpretaciones erradas.
La orina de miccin media es la ms recomendable para el urocultivo. En

pacientes femeninas es recomendable el lavado de genitales externos, en el
paciente masculino retraer la piel del prepucio. La primera parte de la miccin
casi siempre ests contaminada con la flora bacteriana uretral, por lo cual se
debe descartar . La miccin media debe recogerse en un envase estril. Se
recomienda obtener la primera muestra de orina de la maana , donde se
encuentra mayor nmero de bacterias.
75
El cultivo de orina se realizar para identificar y cuantificar el nmero de
bacterias presentes por mililitro en la orina, lo que se expresa en unidades
formadoras de colonias (UFC) . La muestra de orina debe enviarse el
laboratorio en el plazo mximo de 2 horas a temperatura ambiente, puesto
que la orina es un buen medio de cultivo para muchas bacterias y la
multiplicacin de los grmenes entre el momento de la toma de muestra y el
cultivo, alterar los resultados.
Es recomendable que en todas las muestras de orina para urocultivo , se

realice un examen microscpico cuantitativo , para determinar el nmero de
leucocitos por milmetro cbico.
MATERIALES
Frasco estril de 100 ml

Asa de siembra calibrada 0,01ml
Pipetas graduadas de 1ml estriles
Placas con agar Mac Conkey y Eosina azul de metileno
Lminas portaobjetos , laminilla
Equipos de coloracin para tincin de Gram
Centrfuga y microscopio
METODOLOGA
Evitar la contaminacin de la muestra, utilizando equipos estriles: frascos,

pipetas, placas de Petri, tubos de pruebas estriles.
Examen directo:
Centrifugar aproximadamente 10 ml de orina por tres (3) minutos a 3 000
rpm y luego decantar el sobrenadante y observar el sedimento al microscopio
a lente de 40X
Cultivo
Con el asa de siembra calibrada : 0,01 ml, previa agitacin de la muestra ,
tomar una muestra con el asa y sembrar por estras en agar Mac Conkey,
previamente dividida en cuatro cuadrantes , empezando las estras por el
primer cuadrante y sin esterilizar el asa continuar la siembra en el segundo,
tercer y cuarto cuadrante.
Rotular la placa e incubar 24 horas a 37 C.
76
RESULTADOS
Realizar la lectura de la placa y a partir de una colonia bien aislada realizar

las pruebas bioqumicas para la diferenciacin.
Realizar el contaje de colonias para obtener el recuento total de UFC/ml.
Sedimento urinario Agar Mac Conkey
TSI Citrato LIA SIM
CULTIVO DE HECES: COPROCULTIVO
La diarrea puede definirse como el proceso de eliminacin frecuente de heces,

disminucin de su consistencia o ambas cosas. El diagnstico etiolgico se
77
realiza mediante el cultivo de los microorganismos presentes en la materia
fecal : Coprocultivo , realizndose primero el aislamiento y luego la
identificacin de las bacteria presentes en las heces.
Las bacterias causantes de diarreas ms frecuentes son : Salmonella, Shigella

y Escherichia coli enteropatgena .Tambin puede producirse cuadros
diarreicos por : Campylobacter sp, Yersinia enterocoltica ,Vibrio cholerae,
Staphylococcus aureus y Clostridium difficile.
Para realizar este procedimiento se requiere que la muestra se colecte en el

curso de la enfermedad, antes de iniciar tratamiento y que se deposite en un
frasco estril, procurando no mezclarla con la orina. Si esto no es posible es
conveniente conservar la muestra en un medio de transporte adecuado
manteniendo en refrigeracin hasta su siembra.
Muestras inaceptables:
Muestras no conservadas de ms de 4 a 6 horas.
Muestras mltiples el mismo da
Muestras contaminadas con orina.
METODOLOGA
Examen Directo
El examen microscpico directo de las heces permite la observacin de
polimorfonucleares, lo que sugiere la infeccin de por un patgeno invasivo.
Examen en fresco y/o tincin de Azul de metileno de Loeffler.
Tincin de Gram : permite observar polimorfonucleares y flora predominante.
Inoculacin
El coprocultivo se realiza a partir de muestras recin emitidas de preferencia,
de las cuales se inoculan los medios de cultivo.
Medios diferenciales
Para diferenciar a los bacilos entricos fermentadores de lactosa (L+) de los no
fermentadores de lactosa (L -), e inhibir el crecimiento de la flora Gram
positiva aerobia: agar Mac Conkey, agar Eosina azul de metileno, agar Endo.
Medios selectivos
Para inhibir el crecimiento de la mayora de las enterobacterias y permitir el
crecimiento de Salmonella spp y Shigella spp : agar Xilosa-lisina-desoxicolato
(XLD) y agar Salmonella Shigella (SS)
Medio lquido
Utilizar medio Selenito F para suprimir el crecimiento de la flora normal
durante las horas iniciales de incubacin. Se resiembran en medio slido a
partir de las 6 horas. Este medio de cultivo es fundamental para el estudio de
portadores asintomticos.
Medios especiales
Vibrio spp
Medio de enriquecimiento: agua peptonada alcalina a partir de 6 horas ,
subcultivar en agar Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sucrosa (TCBS)
Medio selectivo :TCBS
Campylobacter medio selectivo : medio CAMP
78
MATERIALES
Muestra de heces
Placas de Petri con agar SS, EMB
Tubos con caldo Selenito
Lminas portaobjetos y laminillas
Asas de siembra
Tubos con medios diferenciales o bioqumicos.
RESULTADOS
Realizar la lectura de los medios de cultivo y las colonias sospechosas ,

realizar las pruebas bioqumicas para diferenciar las especies de
enterobacterias.
TSI Citrato LIA SIM
79
CULTIVO DE SANGRE: HEMOCULTIVO
Mielocultivo
La deteccin de microorganismos viales en muestras de sangre tiene gran

importancia diagnstica.
Cuando bacterias u hongos se multiplican a una razn que supera la
capacidad del sistema retculoendotelial del torrente sanguneo , se produce
bacteriemia y fungemia. Bacteriemia persistente o crnica ocurre cuando no
se ha podido localizar o drenar adecuadamente, el foco de la infeccin.
La entrada directa de bacteria al torrente sanguneo ocurre en infecciones

intravasculares como : endocarditis, fstulas arteriovenosas, aneurismas
micticos, flebitis supurativas, catteres intravenosos infectados y arteriales
permanentes. Es importante comprender las circunstancias en que puede
desarrollar una bacteriemia para planificar los mtodos de diagnstico as
como la interpretacin de los resultados. Las fuentes de bacteriemias son :
sistema genitourinario 25 %, sistema respiratorio 20 % , abscesos 10%,
heridas quirrgicas 5 % , otros sitios conocidos 10 % y sitios desconocidos
25 %.
Siempre que exista una razn para sospechar de bacteriemia se debe practicar
el cultivo de la sangre, perifrica o medular. Ya que en muchas ocasiones solo
se puede establecer el diagnstico mediante este procedimiento. El aislamiento
de un microorganismo de los hemocultivos es transcendente porque establece
el diagnstico etiolgico de la bacteriemia y permite la eleccin del
tratamiento.
Sepsis agudas, osteomielitis, meningitis , neumona , pielonefritis: en estos

casos el hemocultivo debe considerarse un procedimiento de urgencia.
Bacteriemia continua de origen intravascular como endocarditis, infecciones
asociadas a catteres , de origen desconocido, con sospecha de fungemia e
inmunodeprimidos, la muestra se puede tomar en cualquier momento.
Bacteriemias intermitentes: lo ideal es realizar la prueba cuando el paciente
presenta escalofros o poco despus o durante del pico febril. Entre el 14 y 25
% de los pacientes hospitalizados, tienen sospecha de bacteriemia y en un 14
% de los casos esta prueba establece el diagnstico.
INDICACIONES
Fiebre alta aunque en neonatos y ancianos la bacteriemia puede cursar con
hipotermia y deterioro general, shock no explicado, infecciones localizadas,
leucopenia, leucocitosis o trombopenia no relacionada con procesos
hematolgicos .
Siempre se deben realizar en un mnimo de dos (2) horas.
Nunca debe refrigerarse antes de su envo , puede conservarse en estufa.
MATERIALES
Cultivos en medios Ruz -Castaeda
METODOLOGA
Se observarn los medios usados para hemocultivo.
80
RESULTADOS
Grafique lo observado en la prctica.
EXUDADOS VAGINALES (exocervicales)

La mucosa vaginal tiene una flora microbiana normal , cuyo crecimiento y
consideracin son importantes para el estudio microbiolgico de las
infecciones vaginales. Se pueden considerar tres situaciones :
Conocer cuando se altera el equilibrio de esta flora colonizante
Bsqueda de agentes exgenos , trasmitidos normalmente por va sexual
Deteccin de portadoras de determinados microorganismos
La mayora de las situaciones clnicas que pueden ser objeto de estudios

microbiolgicos para el aislamiento o visualizacin del agente etiolgico son :
Vulvovaginitis : agentes etiolgicos ms frecuentes : Cndida spp ,

principalmente C. albicans; Trichomonas vaginalis y virus Herpes simple.
La presencia de un cultivo puro de otros microorganismos observados en
tincin de Gram con leucocitos , puede tener significacin.
Vaginosis : desde el punto de vista microbiolgico se caracteriza por la

ausencia o disminucin de la flora mixta compuesta por Gardnerella vaginalis,
anaerobios (Mobilluncus, Bacteroides, cocos anaerobios) y Mycoplasma
hominis.
Infeccin gonoccica : la endocervicitis gonoccica cursa con leucorrea , el

exudado vaginal no es la muestra adecuada para el diagnstico por lo que se
recomienda la obtencin de exudado endocervical.
Tipos de estudios microbiolgicos

Cultivo bacteriano
Cultivo de levaduras
Despistaje de Streptococcus agalactiae
Cultivo de virus Herpes simple ya que requiere de toma de muestra y medio
de transporte y cultivos especiales, se realiza por peticin expresa del clnico.
81
Toma de muestra
No debe usarse antisptico previo a la toma de la muestra . Si se utiliza

espculo, lubricar con agua caliente.
Se recomienda tomar dos (2) hisopados .
Se introduce un hisopo estril en la vagina y se recoge la muestra de la zona
de mayor exudado o en su defecto del fondo del saco vaginal posterior. Se
introduce el hisopo en el medio de transporte.
El envo de la muestra al laboratorio debe de ser de inmediato siempre que
sea
posible. Cuando no se pueda procesar la muestra de inmediato, se
mantendr en
refrigeracin o a temperatura ambiente.
Si se sospecha de infeccin gonoccica, no refrigerar la muestra.
Tiempo mximo de procesamiento con medio de transporte : 24 horas.
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
Uno de los hisopos se emplear para el examen microscpico y el otro para el

cultivo.
Examen microscpico : es el nico mtodo aceptado para el diagnstico

microbiolgico de la vaginosis bacteriana. Se har una extensin del hisopo en
lmina y tincin de Gram.
Cultivo : se pueden establecer diferentes combinaciones de medios en funcin

de la orientacin diagnstica : agar Sangre en atmsfera de CO 2 , agar
Chocolate en atmsfera de CO2, Mac Conkey, agar Thayer Martin en atmsfera
de CO2, medio para Gardnerella en atmsfera de CO2 , Sabouraud con
antibitico u otro medio para Cndida, caldo para cultivo de Trichomona
vaginalis.
Examen de la muestra
Examen microscpico : en el exudado vaginal normal se observar flora

regional con predominio de morfotipo Lactobacillus sp y clulas epiteliales
Presencia de leucocitos
Presencia de levaduras o pseudohifas
Presencia nica o abundante , de cualquier otro microorganismo
Exudado caracterstico de vaginosis bacteriana

Presencia de clulas clue : clulas epiteliales recubiertas por bacilos o
cocobacilos Gram variables.
Ausencia o escasos leucocitos.
Flora mixta alterada.
Examen en medios de cultivo
El examen en medios de cultivo : examinar todos los medios a las 18 y 24

horas. Si no hay crecimiento de patgenos , incubar hasta la 48 horas , a
excepcin del cultivo en agar Mac Conkey que se descarta a las 18 horas. El
agar Thayer Martin se incubar hasta 72 horas si es negativo.
82
Agar Sangre : presencia de microorganismos en cantidad variable , en
especial
Streptococcus pyogenes o Streptococcus pneumoniae.
Agar Chocolate : presencia de microorganismos en cantidad variable , en
especial
Haemophilus sp.
Agar Mac Conkey : presencia de enterobacterias.
Agar Thayer Martin : presencia de colonias grises brillantes de distintos
tamaos,
oxidasa positivo, compatibles con gonococo.
Medio Gardnerella : presencia de colonias hemolticas puntiformes en gran
cantidad posiblemente Gardnerella vaginalis.
Agar Sabouraud : presencia de levaduras.
SECRECIN URETRAL
La uretritis es el sndrome ms comn dentro de las Enfermedades de

Transmisin Sexual (ETS), aunque muestra un claro descenso en las ltimas
dcadas en relacin con otras ETS, tanto en Espaa como en otros pases
desarrollados. Atendiendo a su etiologa se clasifican en uretritis gonoccica y
no gonoccica (UNG) , siendo estas ltimas las ms frecuentes en pases
desarrollados.
N. gonorrhoeae es responsable en nuestro medio de menos del 25 % de todos

los episodios de uretritis. Los restantes son causados por C. trachomatis,
Ureaplasma urealyticum y por un nmero variable de otros potenciales
patgenos en los que la asociacin causa-efecto con la uretritis est menos
aclarada . La asociacin de ms de un patgeno como causa de la uretritis es
ms que anecdtica y la ms frecuente de ellas es la asociacin de C.
trachomatis y N. gonorrhoeae. Un dato significativo es la presencia de T.
vaginales como nico agente encontrado hasta en un 4 % de las
uretritis no gonoccicas. Cuadros de uretritis pueden estar causados por la
presencia de condilomas intrauretrales.
La gonorrea usualmente se desarrolla a los 2 a 6 das tras la exposicin, en

tanto que la UNG es variable, desde 1 a 5 semanas. Tanto las uretritis
gonoccicas como las no gonoccicas producen supuracin uretral, disuria y
escozor.
El diagnstico de uretritis se establece si al menos se dan de los siguientes
supuestos
Sntomas : historia de secrecin uretral y/o disuria
Demostracin con tincin Gram : ms de 5 leucocitos polimorfonucleares
por campo de 1 000 aumentos en el examen directo de la secrecin uretral.
Los pacientes con sntomas de uretritis, sin secrecin, visible, deben ser
examinados, pidindoles que no miccionen en las 4 a 8 horas previas a la
toma de muestra . Se obtienen los 5 a 10 primeros ml de orina y tras la
centrifugacin a 400 rpm se examinan al microscopio de 400 aumentos. La
presencia de ms de 15 leucocitos polimorfonucleares por campo confirma el
diagnstico de uretritis.
Los sntomas de la uretritis gonoccica puede permanecer hasta ms de 7
das, por ello la uretritis postgonoccica se suele diagnosticar despus de
transcurrido este perodo. En el examen con tincin de Gram, la presencia de
83
diplococos Gram negativos (DGN) intracelulares , establece el diagnstico de
uretritis gonoccica. La presencia de clulas inflamatorias en el exudado
uretral en ausencia de diplococos Gram negativos y cultivo negativo para
establecer el diagnstico de UNG.
El xito del diagnstico microbiolgico de la uretritis gonoccica depende de la

correcta obtencin, transporte y procesamiento de muestras. En cada muestra
deben emplearse dos hisopos, uno para el cultivo y otro para la extensin del
exudado uretral para realizar la tincin de Gram. Las muestra para cultivo
debern inocularse en medios selectivos (Thayer Martin modificado, Martin-
Lewis ) e incubarse de modo inmediato a 35 a 37C durante 72 horas en una
atmsfera de 3 a 10 % de CO2 y humedad. Cuando esto no sea posible , es
necesario inocular las muestras en medio de transporte (Stuart o Amies ) .
Examen microscpico : en la secrecin uretral se debe observar presencia de

clulas y bacterias, en especial diplococos Gram negativos intra y
extracelulares.
Evaluar : presencia de leucocitos polimorfonucleares.
Examen en medios de cultivo : examinar, todos los medios a las 18 y 24

horas. Si no hay crecimiento de patgenos , incubar hasta la 48 horas. El agar
Thayer Martin se incubar hasta 72 horas si es negativo.
Agar Sangre : Streptococus pyogenes o Streptococus pneumoniae
Agar Chocolate : Haemophilus sp, Thayer Martin ,gonococo.
Pruebas bioqumicas : a las colonias sospechosas realizar las pruebas

bioqumicas : Prueba de oxidasa y fermentacin de carbohidrato para
Neisseria.
EVALUACIN
1. Esquematizar un flujograma de urocultivo
84
2 .Cules son los agentes bacterianos ms frecuentes, que se aislan en los
cultivos de catteres intravenosos?
3. Esquematizar un flujograma de secrecin de herida.
REFERENCIA BIBLIOGRFICAS
85
PRCTICA N 11
DIAGNSTICO MICOLGICO: HONGOS AMBIENTALES
OBJETIVOS
Conocer las tcnicas para la toma de muestra en el diagnstico micolgico.

Identificar los productos patolgicos de donde se pueden aislar los agentes
etiolgicos de las micosis humanas.
Conocer las caractersticas de los exmenes directos, como de los cultivos de
hongos.
INTRODUCCIN
La mayora de los hongos tienen un hbitat saproftico, presentan una

variedad de morfologa, desde las levaduras hasta los hongos filamentosos.
Los hay comestibles, de inters para la industria alimentaria, qumica
farmacutica y los venenosos. Del gran nmero de especies estudiadas hasta
la fecha (ms de 250 000) muy pocas son capaces de colonizar al ser humano
inmunocompetente, produciendo en stos casos las enfermedades
denominadas micosis.
Los hongos que producen micosis en el ser humano se encuentran en dos
estados morfolgicos bsicos: levaduras y mohos.
Levadura
Puede definirse como un hongo unicelular, redondo u ovalado que se
reproduce por gemacin o fisin binaria. Una levadura tambin puede ser el
estadio morfolgico en el ciclo biolgico de una especie filamentosa se
denomina a esto dimorfismo.
Mohos
Son hongos multicelulares cuya estructura filamentosa se forma por el
crecimiento continuo a partir de una espora .El elemento tubular que emerge
de denomina hifa, el que sigue creciendo y ramificndose llegando a formar
un conjunto entrelazado al que se denomina micelio o talo. Parte de las
hifas se introducen en el sustrato y forman el micelio vegetativo y las que se
proyectan hacia el exterior constituyen el micelio areo, muchas levaduras en
determinadas circunstancias y dependiendo de la especie , pueden producir
pseudohifas.
El micelio areo muestra macroscpicamente diferentes caractersticas, lo cual

contribuye a la identificacin primaria; puede ser algodonoso, velloso,
arrugado, polvoriento, cerebriforme, pigmentado o no, etc. En l se producen
los elementos de propagacin, las esporas y los conidios. Los micelios tienen la
capacidad de germinar un nuevo sustrato y as producir un nuevo elemento.
Este conjunto de caractersticas observadas sobre el medio de cultivo se
denomina colonia.
Los hongos como clulas eucariticas poseen ncleo, nucleolo, retculo

endoplasmtico, ribosomas, mitocondrias, vacuolas, cuerpos lipdicos y otras
inclusiones. Rodeando el citoplasma existe una membrana y una pared celular
con caractersticas muy definidas. Se multiplican a travs de estructuras
86
que pueden ser asexuales o sexuales previa fusin del protoplasma y ncleo
de clulas distintas. Tambin lo hacen mediante crecimiento vegetativo
expansivo como ocurre de rutina en el laboratorio con levaduras o fragmentos
de micelio.
Como en otras enfermedades infecciosas , las micosis se diagnostican en el

laboratorio siguiendo el esquema clsico : examen directo, cultivos e
inmunodiagnstico.
Examen directo
El examen microscpico de la muestra patolgica, escamas de piel, pelos,
fragmentos de uas, exudado purulento, LCR o biopsias, permite observar las
caractersticas hifas, esporas , levaduras ,etc.
Se hace una preparacin en la lmina portaobjetos con una gota de hidrxido

de potasio al 10% (KOH al 10 %). Para la cpsula de Criptococcus neoformans
(LCR), se adiciona una gota de tinta china para visualizar la cpsula. En los
exudados purulentos se recomienda realizar una tincin de Gram, Giemsa, y
tambin Wright. Si se trata de cortes histolgicos hacer una preparacin con
hematoxilina y eosina.
Cultivos
El medio ms utilizado en micologa clnica es el descrito por Sabouraud. A
este medio base se le aade una cantidad superior de glucosa (40 X 100),
denominndose as agar glucosado de Sabouraud (SGA) , al cual
posteriormente se le han adicionado antibiticos con el fin de evitar la
contaminacin bacteriana y cicloheximida (actidiona) , para inhibir los hongos
saprofitos.
La incubacin en micologa mdica es siempre en aerobiosis, oscilando el

tiempo desde 2 a 3 das para levaduras y especies saprofitas. La temperatura
de incubacin es 32 C ; los dermatofitos y otros causantes de micosis
cutneas a 25 a 30 grados centgrados (temperatura ambiental)
El producto patolgico y la tcnica de toma de muestra se elegir de acuerdo

con el tipo de micosis por investigar.
MATERIALES
Tubos de prueba conteniendo agar glucosado de Sabouraud (SGA)
Cultivos de especies ambientales : Penicillum , Alternaria , Aspergillus,
Hormodendrum
Frasco con KOH al 10 %
Asa de siembra
METODOLOGA
Observar macroscpicamente y realizar preparaciones con Azul de lactofenol
para su observacin microscpica.
87
Penicillum
Aspergillus
fumigatus
Aspergillus
niger
Rhizopus
88
RESULTADOS
Observar al microscopio (10X y 40X) las muestras directas.
89
90
EVALUACIN
1. Elaborar un cuadro comparativo de caractersticas morfolgicas ,

nutricionales y sensibilidad a antibiticos de hongos y bacterias.
91
2. Mencionar y explicar brevemente las tcnicas de diagnstico directas e
indirectas para hongos.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.
92
PRCTICA N 12
DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTNEAS
OBJETIVOS
Describir las caractersticas de las colonias de hongos causantes de las
micosis
superficiales y cutneas en cultivos con agar glucosado de Sabouraud y
microscpicamente.
INTRODUCCIN
La colonizacin e invasin en mayor o menor grado de una especie fngica se

denomina micosis. Dentro de las micosis superficiales se incluyen las
causadas por hongos que colonizan la superficie queratinizada de la piel o
pelo. Varios son los agentes etiolgicos que pueden colonizar la piel.
Las infecciones cutneas incluyen una variedad de procesos en los que se

encuentran afectados piel y anexos (pelo y uas). La infeccin puede estar
limitado a la capa crnea o llegar a los estratos ms profundos , sin invasin
linftica. Producidos por los hongos denominados dermatofitos y las
enfermedades por ellos producidas dermatofitosis. La dermatomicosis incluye
a cualquier proceso mictico de la piel y el de dermatofitosis se reserva para
los producidos por hongos dermatofitos.
MICOSIS SUPERFICALES
Piedra Negra
Se caracteriza por la presencia de ndulos en la porcin extrafolicular del pelo,
ptreos y de color negro. El agente causal es Piedra hortae
Piedra blanca
Muestra ndulos blanco-grisceos , que son masas agrupadas de hifas y
pueden encontrarse en la parte distal o central de pelo axilar , pubiano y
crural. Agente causal : Trichosporum cutaneo o T. beigelii.
Tia negra
Es una infeccin superficial de la piel debido a la colonizacin de Hortaea
werneckii. Se caracteriza por la presencia de manchas negro-marronceas, no
descamativas e indoloras , frecuente en las palmas , dedos y plantas , que en
otro lugar de la piel.
Pitiriasis versicolor
Caracteriza lesiones furfurceas a veces papulomatosas o eritematosas,
confluentes con pigmento variable (hipo o hiperpigmentadas). Tiene como
agente causal a Malassezia furfur, se localiza preferente en el tronco sobre
todo hombros y espalda . Al examen microscpico detectan los grupos de
levaduras con hifas
93
MICOSIS CUTNEAS
Dermatomicosis
Micosis producida por Cndida albicans, hongo oportunista. Agente causal de
intertrigos (submamario o inguinal) , eczema de paales, onicomicosis con
paroniquia y granuloma candidisico., Adems de C. albicans tambin pueden
presentar onicomicosis Cndida stellatoidea, C.tropicalis, C. guillermondi y C
parapsilosis.
Las preparaciones teidas con Gram , muestran levaduras Gram positivas

redondas u ovales , con brotes de blastosporas de 3 a 4 m acompaadas de
pseudohifas de 3 a 10 micras de longitud.
La mayora de los medios de cultivo bacterianos son satisfactorios para el

aislamiento de Cndida; de todas las formas se recomienda efectuar la
siembra en medio de Sabouraud con antibiticos (cloranfenicol).Los medios
que contienen actidiona (cicloheximida) inhiben el crecimiento de algunas
especies .
La incubacin se realiza a temperatura ambiente (25 a 30 C) cuando se trata

de medios con inhibidores y a 37C en el caso de medios enriquecidos exentos
de sustancias inhibidoras. Al cabo de 24 a 48 horas se puede observar las
colonias
caractersticas de color blanco o crema, opacas, elevadas, lisas, brillantes o
mates de 1 a 3 mm de dimetro. La prueba de filamentacin y produccin de
clamidosporas caractersticas , son muy sencillas y tiles para la
identificacin de C. albicans.
Dermatofitosis
Es una infeccin fngica de los tejidos queratinizados (piel, pelo, uas) que
ocurre en los seres humanos y animales producida por un grupo de hongos
estrechamente relacionados denominados dermatofitos.
Los agentes etiolgicos de las dermatofitosis se clasifican en tres gneros :

Epidermophyton , Microsporum y Trichophyton. El diagnstico se puede hacer
mediante :
Examen directo
Para el estudio micolgico se procede a tomar la muestra, que en este caso
sera , pelos, escamas de la piel o muestras ungueales que se toman con
pinzas o bistur estril del centro o borde de la lesin y se colocan en una
lmina. Se transportan entre dos lminas portaobjetos limpias y se observan
directamente al microscopio, con una gota de hidrxido de potasio al 10 %
(KOH ) cubierto con una laminilla.
Al microscopio se pueden observar las artroconidias dentro del pelo (endotrix)
o en forma de vaina alrededor del pelo (ectotrix).
Cultivo
Las muestras se siembran en SGA adicionando cicloheximida, que inhiben los
hongos saprofitos. La identificacin se hace sobre la base del aspecto
macroscpico de las colonias entre ellos la produccin de pigmento. Luego las
caractersticas microscpicas , observacin de macroconidias y microconidias
y elementos accesorios sirven para definir cada gnero y especie.
94
Observar el desarrollo de los hongos en estudio y anotar las caractersticas de
sus colonias desarrolladas en SGA.
MATERIALES
Tubos sellados de SGA con cultivos de :
Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans
Microsporum gypseum, Microsporum canis
Preparaciones en lminas portaobjetos coloreadas con azul de lactofenol.
Cndida
albicans
Trichophyton
mentagrophytes
Trichophyton
rubrum
95
Trichophyton
tonsurans
Microsporum
gypseum
METODOLOGA
Examinar al microscopio las lminas preparadas y esquematizar sus
observaciones.
96
EVALUACIN
1. Qu caractersticas morfolgicas en los cultivos presentan los siguientes

hongos?
Epidermophyton flocosum :
Trichoporum cutaneum :
97
2. Cules son las manifestaciones clnicas de las micosis producidas por :
Malassezia furfur :
Piedra hortae :
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.
98
PRCTICA N 13
DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTNEAS, SISTMICAS Y

OPORTUNISTAS
OBJETIVOS
Identificar microscpicamente los agentes etiolgicos de las micosis

subcutneas
Describir las caractersticas morfolgicas de las colonias de los hongos
causantes de
las micosis subcutneas.
INTRODUCCIN
Se consideran en este grupo las infecciones fngicas que afectan el tejido

subcutneo, dermis y epidermis, causadas por hongos exgenos, saprofitos ,
cuyo hbitat es el suelo y las plantas. Las infecciones ms frecuentes son :
La esporotricosis debida al Sporotrix schencki, que se produce habitualmente

por la penetracin en la piel de astillas, espinas o tierra contaminada; una vez
establecida la infeccin tiende a permanecer localizada en el tejido subcutneo
y a ser muy persistente. Se caracteriza por una lesin ulcerada en el punto de
inoculacin , que va seguida de la formacin de ndulos y abscesos mltiples
que siguen las vas de drenaje de los linfticos superficiales.
La cromomicosis (cromoblastomicosis), debido a Fonsecaea pedrosoi,

Cladosporium carrionii y Phialophora verrucosum, que se caracteriza por el
desarrollo de una ppula en el sitio de la inoculacin, que ms tarde se
extiende formando lesiones verrugosas o tumorales , semejantes a una coliflor,
puede haber infeccin secundaria y ulceracin . Las lesiones , por lo general,
estn limitadas a los pies y las piernas, pero pueden afectar la cabeza, la cara,
el cuello y otras superficies del cuerpo; tambin puede haber abscesos
cerebrales.
El micetoma (maduromicosis), debido a Nocardia y Streptomyces, que se

caracteriza por lesiones destructivas localizadas, granulomatosas y
supuradas, que habitualmente se localizan en los pies y las manos. Las
lesiones se caracterizan por edema, coloracin purprea y deformacin
tumoral del tejido subcutneo, con la presencia de surcos sinusales que
drenan pus, que contiene grnulos amarillentos o negros. La infeccin
progresa gradualmente, atacando los huesos , los msculos y otros tejidos
adyacentes, hasta que por ltimo obliga a la amputacin, a veces se produce
la invasin ms extensa afectando el cerebro y otros rganos internos .
MATERIALES
Tubos sellados de SGA con cultivos de:
Sporotrix schenki
Phialophora verrucosum
99
Preparaciones en lminas coloreadas con azul de lactofenol.
Microscopio
METODOLOGA
Examinar al microscopio las lminas preparadas y esquematizar sus
observaciones.
100
DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SISTMICAS Y OPORTUNISTAS
OBJETIVOS
Identificar microscpicamente los agentes etiolgicos de las micosis
subcutneas
Describir las caractersticas morfolgicas de las colonias de los hongos
causantes de
las micosis subcutneas
INTRODUCCIN
Las micosis sistmicas, son infecciones fngicas que afectan varios rganos y
tejidos. Se dividen en dos grupos :
las producidas por especies consideradas patgenas con carcter endmico,
este tipo de micosis se transmite por inhalacin, ingesta o traumatismos .
Blastomicosis y Paracoccidioidomicosis
las producidas por especies oportunistas . Estas patologas se dan en
huspedes inmunodeprimidos (con transtornos endocrinos, inmunodefiencias,
enfermedades oncohematolgicas, alteraciones metablicas y anatmicas ,
drogadictos endovenosos, pacientes bajo tratamiento prolongado con
corticoides o citostticos , sometidos a ciruga, dializados , quemados
transplantados y cateterizados) , son causadas por hongos saprofitos del
ambiente o comensales del cuerpo humano. Por ejemplo Cndida y
Criptococcus
La infeccin se adquiere por inhalacin de conidios en la fase micelial ,

desarrollndose en el husped un foco pulmonar primario.
En caso del que paciente presente inmunodeficiencia puede producirse una
diseminacin sistmica.
El diagnstico de laboratorio se realiza mediante la observacin de la fase

levaduriforme en los siguientes productos : expectoracin, secrecin de
lesiones mucocutneas y material de biopsia. La fase levaduriforme se puede
obtener en cultivos enriquecidos, incubados a 37C. Estas pueden ser:
Blastomicosis : Blastomyces dermatitidis

La infeccin comienza habitualmente en los pulmones y se difunde por va
hematgena causando lesiones destructivas focales en los huesos, piel,
prstata y vsceras, en general no se afecta el tubo digestivo.
Las lesiones cutneas son particularmente manifiestas , parecen originarse

como metstasis a partir de las lesiones pulmonares primarias que se abren a
la superficie cutnea causando lesiones ulceradas y encostradas. Las lesiones
se caracterizan por inflamacin granulomatosa, microabcesos y progresiva
destruccin de los tejidos, las calcificaciones son raras.
Paracoccidioidomicosis o blastomicosis sudamericana (Paracoccidioides

brasiliensis)
Las primeras lesiones aparecen en las mucosa de la boca, o de la nariz y se
difunden por expansin directa, es decir a travs de los lmites cutneo-
mucosos, afectan la cara, en ocasiones , la diseminacin se produce a travs
de los tejidos linfticos incluyendo el bazo.
101
En el tubo digestivo las lesiones comienza en el tejido linfoide submucoso y
puede originar formacin de lceras e incluso perforaciones; pueden formarse
abscesos subcutneos que por extensin a la superficie cutnea , puede
producir lesiones deformantes de gran tamao, encrostadas o ulceradas. Las
lesiones cutneas constituyen abscesos pigenos y lesiones inflamatorias
granulomatosas.
Histoplasmosis : Histoplasma capsulatum

Causada por la inhalacin de esporas que lo conduce a una infeccin
pulmonar, aparecen lesiones miliares distribuidas por todo el parnquima
pulmonar y aumento de tamao de los ganglios linfticos. La infeccin inicial
es benigna puede pasar completamente inadvertida o manifestarse como un
infeccin respiratoria autolimitada.
En un pequeo nmero de individuos la enfermedad progresa se disemina y

causa lesiones en prcticamente todos los tejidos y rganos, aparece fiebre y
postracin, as como el aumento del tamao de hgado , bazo y ganglios
linfticos simulando tuberculosis miliar ; en ocasiones puede evolucionar
como una enfermedad pulmonar crnica con cavitacin, simulando la
tuberculosis pulmonar crnica. Las lesiones de los tejidos se caracterizan por
la existencia de una inflamacin granulomatosa.
Coccidiomicosis : Coccidioides immitis

La infeccin se establece por inhalacin de esporas transmitidas por el aire
aproximadamente el 60 % se pone de manifiesto nicamente por la
adquisicin de una hipersensibilidad de tipo retardado frente a los antgenos
del hongo, en un 40 % se produce neumonitis aguda, acompaada con
frecuencia de pleuresa y varias erupciones cutneas, alrededor del 5 %
desarrollan una enfermedad pulmonar crnica con cavitacin que se asemeja
a la tuberculosis pulmonar y conduce ocasionalmente a la calcificacin; en
menos del 1 % aparece una diseminacin con lesiones granulomatosas
aspticas en muchos rganos y tejidos, entre ellos, la piel, huesos
articulaciones y meninges.
Las lesiones de la neumonitis aguda son histolgicamente semejantes a las

causadas por bacterias pigenas , pero en la enfermedad pulmonar crnica y
en las formas diseminadas , la inflamacin es granulomatosa.
Criptococosis
Esto ocurre en particular en sujetos con inmunodeficiencia de las clulas T y
se debe a Criptococus neoformans , este hongo se caracteriza por ser una
levadura encapsulada. Su hbitat es el suelo contaminado con materia fecal
de aves.
La criptococosis es una de las enfermedades que sirve para definir el estadio

SIDA en la enfermedad del virus de Inmunodeficiencia Humana. Dentro de las
formas clnicas existe : Criptococosis pulmonar, del SNC, diseminada ,
cutnea y mucocutnea.
El producto ms frecuente de analizar es el LCR , en el que se observan las

tpicas levaduras capsuladas que se destacan por contraste negativo mediante
emulsin con tinta china.
102
Candidiasis : Cndida spp
Las infecciones caudadas por Cndida son muy variadas, este hongo de tipo
levaduriforme puede llegar a ser patgeno en humanos y animales en los
cuales vive en estado saproftico . La cavidad bucal y es resto del tracto
gastrointestinal son los territorios preferentes donde C. albicans se encuentra
en el 20 % de las personas y en menor proporcin otras especies de Cndida.
Por lo menos cinco condiciones favorecen el surgimiento de candidiasis :
Cambios fisiolgicos como diabetes y embarazo

Uso prolongado de antibiticos o frmacos antitumorales e
inmunosupresores
Maniobras diagnsticas y teraputicas agresivas : cateterismo, sondajes
Debilidad general y/o desnutricin
Infeccin por el virus de la Inmunodeficiencia Humana y drogodependencia.
El diagnstico de la Candidiasis en el laboratorio incluye la demostracin

directa de Cndida mediante coloraciones Giemsa ,Gram en muestras clnicas
y cultivo
MATERIALES
Tubos de SGA con cultivos de :
Histoplasma capsulatum
Cndida albicans
Preparaciones en lminas con azul de lactofenol
Microscopio
METODOLOGA
Observar de las muestras macroscpicamente

Realizar preparaciones en lminas con azul de lactofenol y observar al
microscopio
(10x y 40x)
103
A) Estructura de un talo o micelio de mohos y levaduras. B) En la parte
inferior se aprecian dos formas poco frecuentes.
Fase micelial y de levadura con talo reproductor y vegetativo.
104
Modalidades de las hifas.
105
Gnero Trichophyton, esporas asexuadas.
106
Gnero Microsporum, esporas asexuadas
107
108
109
110
111
112
PRCTICA N 14
DIAGNSTICO VIROLGICO
OBJETIVOS
Familiarizar al estudiante con las diferentes tcnicas de aislamiento de virus

aprovechando las propiedades que presentan
Observar y caracteriza morfolgicamente clulas cultivadas
Explicar la importancia de las tcnicas de cultivo de tejidos en virologa y en
otras disciplinas cientficas.
La demanda de los servicios de los laboratorios de virologa clnica, han

aumentado en las ltimas dos dcadas debido a la disponibilidad comercial de
reactivos de alta calidad, el uso por parte de los mdicos de frmacos
antivirales especficos, el desarrollo de tcnicas de diagnstico rpido y la
aplicacin de los procedimientos de cultivo celular para virologa al diagnstico
de otras enfermedades como infeccin genital por Chlamydia.
Las enfermedades virales que requieren diagnstico de laboratorio son las
enfermedades de transmisin sexual, las diarreas, las enfermedades
respiratorias en nios y adultos, las meningitis aspticas, las enfermedades
congnitas y las infecciones en huspedes inmunodeprimidos.
CULTIVO CELULAR
Los cultivos celulares comenzaron a principio del siglo XX, con cultivos de
rganos completos y luego con mtodos de clulas individualizadas : cultivos
de clulas primarias (clulas somticas de un animal de experimentacin o
tomadas de un paciente humano (que pueden mantenerse en cultivo durante
un perodo breve de tiempo) o lneas celulares inmortalizadas, las cuales en
condiciones adecuadas pueden continuar creciendo en cultivo
indefinidamente.
En 1952 Renato Dulbecco fue el primero que cuantific virus animales,
utilizando un ensayo de placas de lisis, tcnica para la cual se preparan
diluciones del virus con las que se infectan clulas crecidas en monocapas,
que luego se recubren con agar blando para impedir la difusin del virus. ste
destruye las clulas en focos localizados que se observan al teirse la
monocapa.
MECANISMOS DE LESIN CELULAR
La infeccin viral origina una variedad de cambios que se detectan

mediante el examen visual o bioqumico de las clulas infectadas, estos
cambios se deben a la produccin de protenas y cidos nucleicos vricos, y a
las alteraciones biosintticas de las clulas. En las clulas infectadas por virus
se reconocen cambios fenotpicos comunes, denominados efectos citopticos
del virus , los cuales son :
Forma alterada : las clulas adherentes que normalmente estn pegadas a

otras clulas ( in vivo ) o a un sustrato artificial ( in vitro ) pueden adoptar una
morfologa redondeada diferente de su apariencia aplanada normal . Se
eliminan de la clulas los procesos de ampliacin implicados en la adhesin y
la movilidad.
113
Despegamiento del sustrato : para las clulas adherentes , esta fase de dao
celular sigue de la anterior. Ambos efectos son causados por la degradacin
parcial o la disrupcin del citoesqueleto, el cual se encarga de mantener la
forma de la clula.
Lisis : es el caso ms extremo, la clula entera se rompe, se pierde la

integridad de la membrana y la clula se puede hinchar por la absorcin de
lquidos extracelulares y finalmente estalla. ste es un caso extremo de dao
celular, no todos los virus causan este efecto, aunque pueden causar otros
efectos citopticos.
La lisis es beneficiosa para un virus ya que constituye un mtodo para liberar
nuevas partculas vricas de una clula infectada.
Fusin de membranas : las membranas de las clulas adyacentes se

fusionan originando una masa de citoplasma que contiene ms de un ncleo :
sincitio, o dependiendo del nmero de clulas que se fusionan : clula gigante.
Las clulas fusionadas tienen vida corta y luego se lisan.
Permeabilidad de membranas : diversos virus causan un aumento en la

permeabilidad de membranas, permitiendo la entrada de iones extracelulares
como el sodio. La traduccin de algunos ARNm vricos es resstente a altas
concentraciones de iones de sodio , permitiendo la expresin de genes vricos a
expensas de mensajeros celulares.
Cuerpos de inclusin : son reas de la clulas en las que se han acumulado

componentes vricos. Se trata frecuentemente de sitios de ensamblaje de
viriones y algunas inclusiones celulares consisten en acmulos cristalinos de
partculas vricas. No est claro si estas estructuras daan a la clula, pero
frecuentemente estn asociadas a virus que causan lisis celular , como los
herpesvirus.
Apoptosis : la infeccin vrica puede activar la apoptosis ( muerte clular

programada ), mecanismo implicado en el crecimiento normal y el desarrollo
de los organismos.
INMUNODIAGNSTICO
ENSAYO INMUNOENZIMTICO
La prueba de inmunoabsorcin ligada a enzimas (ELISA) o inmunoensayos

ligados a enzimas (EIAs) en la cual el antgeno o anticuerpo est adsorbido a
una fase slida , constituye uno de los primeros inmunoensayos enzimticos
primeramente descritos por Engvall y Perlmann en 1971 y luego aplicados al
diagnstico microbiolgico por Voller y colaboradores. ELISA tiene la ventaja
sobre las tcnicas de inmunofluorescencia (IF) de su mayor sensibilidad ya
que , la enzima acta catalticamente y de forma objetivable , por lo que es
posible medir la densidad ptica de la coloracin final. Las enzimas son
seguras, de bajo costo y estables, si se comparan con los radio-istopos
utilizados en radioinmunoensayo (RIA).
En la actualidad estas pruebas estn tomando un rol importante en los
laboratorios mdicos y de investigacin, porque brindan una alternativa
114
viable, mediante la cual es posible realizar la identificacin de muchos virus a
nivel de gnero. Estn reemplazando a los RIA en muchos laboratorios, por su
comparable sensibilidad sin los problemas de manejo, eliminacin y corto
tiempo de vida de los materiales radioactivos .
Debido a su objetividad, facilidad de automatizacin y posibilidad de trabajar
con un gran nmero de muestras, estos ensayos inmunoenzimticos estn
reemplazando parcialmente a tcnicas en el laboratorio como :
inmunofluorescencia y aglutinacin.
Estos ensayos presentan tres piezas constantes que originan distintos
tipos de EIA en funcin de cmo se combinen : el analito (antgeno {Ag} o
anticuerpo {Ac} ), el conjugado (de antgeno o de anticuerpo) y el sustrato.
Utilizan enzimas como marcadores inmunoqumicos que permiten valorar las
uniones antgeno-anticuerpo que se producen tras un periodo de incubacin,
con la adicin posterior de un sustrato.
Fundamento
La prueba de ELISA se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo, uno de los
cuales debe ser de reactividad conocida. El color se genera por la interaccin
de un sustrato cromognico y una enzima que ha sido acoplada al anticuerpo
detector. Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el antgeno en la fase slida,
como una capa de captura. Despus de la reaccin del antgeno con el suero
del paciente, la capa de deteccin puede ser un reactivo antiinmunoglobulina
clase especfica (IgM o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos clase
especficos
Dentro de los parmetros fisicoqumicos que intervienen en la unin del
antgeno con el anticuerpo tenemos:
Fuerzas de Van der Walls producidas por el movimiento de tomos en la

superficie de las molculas generado por un cambio elctrico. Son fuerzas
dbiles presentes cuando la proximidad del Ag y el Ac es grande.
Fuerzas electrostticas originadas por la fuerza de atraccin entre

molculas de carga inica opuesta, como sucede con los grupos NH3+
(amonaco)que reaccionan vidamente con el grupo COOH - (grupo carboxilo).
Uniones por puentes de hidrgeno son de carga energtica baja entre

tomos electropositivos de hidrgeno y tomos electronegativos de oxgeno o
nitrgeno.
Metodologa
Los mtodos de ELISA se dividen en :
ELISA directo : ensayo ELISA simple de dos capas

Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en
las que se sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos
marcados e indican la presencia de antgeno en la solucin analizada. Se debe
incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo de las
analizadas (sangre, orina) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia
del antgeno buscado y controles positivos (soluciones donde se encuentra el
antgeno buscado, o bien se le ha aadido).
ELISA indirecto
115
Las placas ELISA se preparan de igual forma que en el mtodo directo, los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea
dos anticuerpos : uno primario contra el antgeno, y uno secundario marcado
contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una
amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms anticuerpo secundarios
por cada primario.
ELISA sndwich : ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante

inmunocomplejos
Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un
primer anticuerpo anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se
aplica la muestra problema en la que se encuentra el antgeno, que ser
retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Despus de
un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solucin
con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada molcula de
antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo
anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad
y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo
anticuerpo.
Fijacin del Antgeno a la fase slida :

La reaccin inmunolgica tiene lugar en la fase slida, sta puede ser de
plstico, vidrio o nitrocelulosa. Los ms usados son los de plstico, dentro de
stos los de poliestireno gammairradiados y los de cloruro de polivinilo ya que
tienen mayor capacidad para formar enlaces estables que los de poliestireno
no tratados.
El antgeno diluido en buffer es adherido a la fase slida por enlaces

electrostticos entre los sitios activos del plstico y regiones de la protena
responsables de esta interaccin. El buffer puede ser carbonato a pH 9,6 o
buffer fosfato salino ( PBS 1X ) a pH 7,4.
La estabilidad de los enlaces electrostticos, el tiempo de incubacin y la

temperatura son factores importantes a tener en cuenta para evitar prdidas
de las protenas y que pueden afectar la sensibilidad del ensayo.
Reaccin con anticuerpo :
La reaccin del antgeno con el anticuerpo se debe realizar en condiciones

similares a las fisiolgicas : pH 7,4, temperatura de 37C y concentracin
salina equivalente a 0.15M de cloruro de sodio (NaCl). El tiempo puede variar
entre 1 a 3 horas.
Molculas no especficas en solucin pueden adherirse a la fase slida

afectando el resultado final del ensayo, para disminuir este riesgo se suele
agregar al medio de reaccin un exceso (0,1% a 1%) de una protena inerte
para que compita eficientemente por los sitios de unin inespecficos en la fase
slida. Esta protena puede ser seroalbmina bovina, casena, suero entero,
gelatina u otros.
Tambin es necesario aadir al medio Tween 20 (Monolaurato de polioxietileno

sorbitn { surfactante } )para evitar uniones inespecficas de macromolcula.
Por este motivo es agregado en los tampones de dilucin y de lavado.
116
Adicin del conjugado enzimtico :
El conjugado enzimtico se prepara por unin covalente de una enzima con el

anticuerpo; esta enzima puede ser peroxidasa de rbano (Horseradish
peroxidase { HRP } ), fosfatasa alcalina (Alcaline Phosphatase { AP } ) o beta-
galactosidasa. Los criterios a tomar en cuenta en la seleccin de la enzima
apropiada son su toxicidad, estabilidad, disponibilidad, viabilidad de
conjugarla eficazmente con el anticuerpo elegido, sensibilidad y costo.}
Las condiciones de reaccin entre el conjugado y el complejo formado por la

unin antgeno-anticuerpo son similares a las descritas en la etapa anterior.
Adicin del sustrato:
La eleccin del sustrato va de acuerdo con el tipo de enzima presente en el

conjugado. El sistema AP hidroliza al p-nitrofenil fosfato o p-nitrofenol
generando un producto soluble de color amarillo. El sistema HRP reduce al
sustrato perxido de hidrgeno produciendo oxgeno que oxida a otros
compuestos cromgenos tales como:
Tetrametilbenzidina (TMB) : la oxidacin genera un producto de color azul

oscuro.
o-phenylene diamine (OPD): es oxidado a un producto coloreado que puede

variar de color naranja a pardo oscuro.
cido azino-(3-etil)-benzo-sulfnico (ABTS) : la oxidacin genera un producto

que puede variar del color al azul.
La intensidad del color desarrollado es de acuerdo con la cantidad de enzima
presente en la reaccin.
La lectura se realiza en un espectrofotmetro a 405 nanmetros
PRUEBA RPIDA PARA VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA

Uno de los pilares bsicos de la lucha contra el Sndrome de
Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) es la deteccin precoz de las personas
infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). El diagnstico
precoz ofrece la posibilidad de beneficiarse de la terapia antirretroviral en las
etapas precoces de la infeccin, as como intentar modificar las conductas que
favorecen la transmisin del virus a otras personas.
Descripcin de las pruebas de deteccin rpida del VIH
Son ensayos de lectura visual que pueden realizarse con equipamiento mnimo
y generan un resultado en menos de 15 minutos en comparacin con la
prueba estndar de cribado con tcnicas de EIA, de las cuales no se dispone
del resultado hasta al cabo de unas horas o das. Tanto la prueba de deteccin
rpida como el EIA detectan anticuerpos especficos del VIH.
117
Se han establecido los diferentes criterios que debera cumplir una prueba de
deteccin rpida del VIH:
Presentar alta sensibilidad y especificidad (>99%)

Ser reproducible
Ser fcil de aprender, realizar e interpretar
Ser precisa
Ser de fcil almacenamiento
No requerir equipamiento adicional
No tener carcter invasivo
Durante la realizacin de las pruebas de deteccin rpida, se recomienda que

los pacientes reciban informacin y asesoramiento sobre la enfermedad y la
infeccin. Si la prueba es negativa, se considera un negativo definitivo a no ser
que haya posibilidades de que se encuentre en el perodo ventana de
exposicin (primeros 3 a 6 meses de post exposicin) . Si el resultado es
positivo, se considera un resultado preliminar que debe confirmarse con
tcnicas de EIA y con la prueba Western blot .
Los resultados indeterminados se deberan repetir en un mes. La mayora de
las pruebas de deteccin rpida del VIH se comercializan con un equipo o kit
que incluye todo lo necesario para realizar la prueba y no requiere un
equipamiento especializado. En general, disponen de un control de
procedimiento incorporado en el equipo o kit. Para la muestra, se puede
utilizar sangre entera (ms fcil de realizar), plasma o suero, y los resultados
se interpretan visualmente.
Capacidad diagnstica de las pruebas de deteccin rpida del VIH
Es difcil realizar una comparacin de la capacidad diagnstica de las

numerosas
pruebas de deteccin rpida comercializadas ya que son, muy distintas entre
ellas. Los principios de accin ms frecuentes en estas pruebas son la
aglutinacin, la inmunoconcentracin (flow through), la inmunocromatografa
(lateral flow) y la fase slida (solid phase).
El mtodo de produccin y de combinacin especfica de los antgenos vara
entre las distintas pruebas de deteccin. La mayora incluye uno o ms
antgenos del virus VIH-1 (gp41, gp120, gp160) y VIH-2 (gp36). Otros
incorporan el antgeno core (p24).
Actualmente, existe controversia en la duracin del perodo ventana entre 3
6 meses. En general, se recomienda el alta mdica a los 6 meses despus de
una actividad de riesgo de infeccin.
PRUEBA DE INMUNOFIJACIN DE DOT-BLOT

Prueba para la deteccin del VIH en la cual los antgenos virales se
encuentran unidos a una membrana de nitrocelulosa dentro de un contenedor
plstico. Los antgenos utilizados son recombinantes o sintticos. Se utilizan
conjugados de anti-inmunoglobulina ligados a una enzima que se fija al
anticuerpo del paciente. La adicin del sustrato permite la visualizacin del
color en el papel.
Su ventaja y principal indicacin es la posibilidad de identificacin entre los
dos tipos de virus . Las pruebas son rpidas y fciles de realizar, pero son
costosas. Muchas producen resultados en 5 15 minutos.
TCNICAS DE INOCULACIN EN ANIMALES DE LABORATORIO
118
Este fue el primer mtodo que se utiliz para el aislamiento de virus ,
demostrndose la reaccin positiva por la muerte y los cambios histolgicos o
clnicos. Existen factores negativos en el uso de animales de laboratorio : el
confinamiento de los mismos de tal manera que no se pueda impedir una
infeccin cruzada a otros animales y al personal de laboratorio, la presencia
de enfermedades vricas latentes en los animales de experimentacin que
pueden activarse por el mismo trauma que supone la inoculacin con la
consiguiente interferencia a la hora de la interpretacin de los resultados .
119
Fuentes de Informacin
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diagnstico serolgico de la Infeccin por el virus de la inmunodeficiencia
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deteccin rpida de la infeccin por VIH. AATRM Nm. 2007/3
Cristhopher Donats Cruz Malpica. Estandarizacin de la prueba de Ensayo
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farmacia y Bioqumica2001
http://sisbib.unmsm.edu.pe/Bibvirtual/tesis/Salud/Cruz_M_C/generalidade
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Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica.
Procedimientos en Microbiologa Clnica.
www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap6.htm
Moura AC Diversidade gentica, densidade populacional e potencial de
promoo de crescimento de rizobactrias associadas ao cacaueiro [Tesis
Maestra].Bahia :Universidade Federal do Renccavo ; 2007.
Chaves L Aspectos bioqumicos e moleculares de bacterias isoladas de terra
preta antropognica (TPA) na regio da Amaznia Brasileira.[Tesis Maestra]
Piracicaba : Universidade de So Paulo; 2007
120
GLOSARIO DE MICROBIOLOGA su genoma mitocondrial. El ADN
mitocondrial lo aporta el ovocito
cido-alcohol resistencia: Propiedad de Aerobio: Microorganismo que vive y crece

las especies del gnero Mycobacterium, por en presencia de oxgeno libre.
la que las clulas teidas con carbolfucsina Aerobio estricto: Microorganismo que no
caliente no se decoloran al tratarlas con puede crecer en ausencia de oxgeno.
alcohol cido.
Aerobio facultativo: Microorganismo
cido desoxirribonucleico (ADN): Gran capaz de crecer en condiciones anaerobias
molcula de cido mucleico que se pero que se desarrolla mas rpidamente en
encuentra principalmente en losc un media aerobio.
cromosomas de los ncleos celulares y que
es portadora de la informacin gentica de Agente antimicrobiano: Producto que
las clulas vivas. mata o inhibe el desarrollo de
microorganismos.
cido nucleico: Polmero de nucletidos.
Vase cido desoxirribonucleico y cido Agudo: En relacin a una enfermedad o
ribonucleico. sntoma que comienza bruscamente con
una intensidad marcada para desaparecer
cido ribonucleico (RNA): Polmero de despus de un perodo relativamente corto
nucletidos unidos por un esqueleto de de tiempo.
fosfato-ribosa. Interviene en la sntesis de
protenas. Amiloide. Que se vuelve azul con el yodo
Acidfilo: Organismo que crece de manera Anlogo: Sustancia qumica idntica a

ptima en un medio cido. Caracterstica otra, excepto en un grupo funcional.
de la clula u organismo celular que tiene
afinidad por los colorantes cidos. Anticuerpos: Protenas globulares que
aglutinan al antgeno. Poseen 2 sitios
Adherencia: Propiedad de las bacterias iguales para la fijacin del antgeno. Se
que les permite adherirse (pegarse) a las compone de 2 cadenas iguales livianas L de
superficies de la clula hospedadora. 220 aminocidos, (Low -molecular weight-
= bajo peso molecular) y 2 cadenas pesadas
cido desoxirribonucleico (ADN): Gran H de 440 aminocidos, (High molecular
molcula de cido nucleico que se weight = Alto peso molecular).
encuentra principalmente en los
cromosomas de los ncleos celulares y que Anaerobio: Microorganismo capaz de vivir
es portadora de la informacin gentica de y crecer en condiciones anaerobias.
las clulas vivas.
3: Marca el final de una cadena de una Anaerbico: Entorno carente de oxgeno.
molcula de ADN. El trmino 3 se refiere a Generalmente se refiere a un hbitat
la posicin de la base relativa a la molcula microbiano.
de azcar en la armazn del ADN.
Anafilaxia (choque anafilctico): Reaccin
5: Marca el principio de una cadena de alrgica violenta causada por una reaccin
una molcula de ADN. El trmino 5 se entre un antgeno y un anticuerpo.
refiere a la posicin de la base relativa a la
molcula de azcar en la armazn del ADN. Antibitico: Agente qumico producido por
un organismo que es daino para otros
cADN : biblioteca de secuencias de ADN organismos.
ADN mitocondrial: Contiene 16,569 bp de Antgeno: Sustancia que interacciona con

ADN, adems de 37 genes que codifican un receptor de las clulas T o con una
algunas protenas y molculas de ARN inmunoglobulina.
relacionadas con la funcin mitocondrial.
Este material se hereda por va materna. pice o apical. Extremo superior o punta
Cuando se forma el cigoto, el de una cosa..
espermatozoide aporta su genoma, pero no
121
Argenta. Plateada. Bacteriosttico: Sustancia con capacidad
para inhibir el crecimiento bacteriano, pero
Asca : Clula madre de los hongos sin matar a la bacteria.
Ascomycetes : Donde se encuentran las Brote: Aparicin de gran nmero de casos

esporas. de una enfermedad en un corto periodo de
tiempo.
Asexual : Reproduccin que no requiere la
unin de los ncleos. Cpside: Cubierta proteica de un virus.
Atenuacin : Seleccin de cepas de un Carcingeno: Sustancia que inicia la

microorganismo patgeno que no son formacin de un tumor.
virulentos, pero que mantiene intacta su
capacidad inmunitaria. CD4 Clulas T molculas superficiales,
cooperadoras/inductoras
Bacteria : Microorganismo unicelular de la
especie Esquizomicetos .El gnero presenta Clula: Unidad fundamental de los seres
variedades morfolgicas y sus componentes vivos. Con excepcin de la clula
pueden ser alargados (bacilos), bacteriana, todas las dems poseen ncleo,
redondeados (cocos), o en forma de coma citoplasma y diversos orgnulos que estn
(vibrios). La naturaleza de la enfermedad rodeados por una membrana
que producen es diferente en cada bacteria. citoplasmtica.
Basidio : Clula ms bien ancha y corta Clulas B: Linfocitos dependientes de la

que lleva en su exterior a las esporas de mdula sea; precursoras de las clulas
algunos hongos superiores. plasmticas, sintetizan y liberan
inmunoglobulinas.
Basidioesporas : Esporas propias de los
basidiomycetes. Clulas cooperadoras: Basfilos,
eosinfilos y mastocitos.
Basidiomycetes : Hongo superior cuyas
esporas se sitan en la parte exterior de los Clula Gram negativa: Clula procaritica
basidios. cuya pared celular contiene relativamente
poco peptidoglicano pero que tiene una
Basfilos : Producen y almacenan: membrana externa compuesta por
histamina, factor quimiotctico eosinfilo lipopolisacrido, lipoprotena y otras
anafilctico, y otras sustancias. Su funcin macromolculas complejas. Relativo a la
aparente es la hipersensibilidad rpida, coloracin rosada de la contratincin que
como el asma alrgica. La reagina IgE se se utiliza para teir microorganismos.
une fcilmente a la membrana y si un
antgeno especfico se aglutina a este Clula Gram positiva: Clula procaritica
complejo se libera histamina, heparina y cuya pared celular est formada
otros mediadores. Tambin tienen un rol en principalmente por peptidoglicano y que
las alergias por contacto. carece de la membrana externa de las
clulas Gram negativas. Relativo a la
Betalactamasa : Antibiticos del tipo de la coloracin, clula que conserva el color
penicilina, formados por una anillo violeta de la tincin que se utiliza en el
betalactmico heterocclico, con cuatro mtodo Gram para tedir microorganismos
tomos.
Clulas T: linfocitos dependientes del
Bactericida : Sustancia antimicrobiana Timo, responsables de la inmunidad
con capacidad para matar bacterias. celular.
Bacteriemia : Aparicin transitoria de

bacterias en sangre. Clamidospora : Clula hifal, encerrada por
una gruesa pared celular.
Bacterifago :Virus que infecta clulas
procariticas. Claviforme : En forma de clava.
122
por los linfocitos T. Su nivel aumenta en
Colonia: Grupo de microorganismos de un las infestaciones por parsitos, en
cultivo procedentes de una sola clula. reacciones alrgicas, en el asma y en
Tienen diferentes caractersticas alguna patologa del miocardio.
morfolgicas de tamao, forma y color.
Endmico (a): En relacin a una
Columnela : Parte central estril de la enfermedad o a un microorganismo propio
gleba de muchos Gasteromycetes y de una zona geogrfica o una poblacin.
Myxomicetes que en forma de columna sale
de la base del exoperidio. Endocitosis: Proceso en el que una
partcula es introducida intacta en una
Congnita, anomala: Anomala clula animal. La fagocitosis (incorporacin
generalmente estructural presente en el de cuerpos slidos) y la pinocitosis
momento del nacimiento que puede ser (incorporacin de sustancias lquidas) son
heredada , adquirida durante la gestacin dos tipos de endocitosis.
u ocasionada en el parto.
Enfermedad de transmisin sexual (ETS):
Congnita, enfermedad: Defecto fsico o Enfermedad que se transmite por contacto
mental presente en el momento del sexual.
nacimiento que puede ser heredada, o
causada por la influencia de factores Entrico: Referido al intestino.
ambientales durante el embarazo.
Enterotoxina : Toxina que afecta al
Conidio : Espora de origen asexual que no intestino Epidmico (a): Que afecta a un
se encuentra en el himenio. nmero significativamente grande de
personas al mismo tiempo. Se refiere
Conidiforo : Hifa que llevan los conidios. tambin a la enfermedad que se transmite
rpidamente en una poblacin que puede
Contagio: Transmisin de una oscilar entre un rea demogrfica
enfermedad, se refiere sobretodo a delimitada o cerrada.
infecciones.
Epidemia: Enfermedad que se presenta al
Contagioso: Que es transmisible. Por mismo tiempo en una gran cantidad de
contacto directo o indirecto. individuos de una poblacin.
Crateriforme : Que tiene forma de crter. Epidemiologa: Estudio de la incidencia,

distribucin y causa de las enfermedades
Crnico: Enfermedad o proceso que se en el hombre.
desarrolla lentamente y persiste por largo
tiempo, con frecuencia toda la vida. Espora : Corpsculo reproductor de las
plantas criptogmicas.
Dehiscente : Que tiende a abrirse por s
solo. Esporangio : Estructura a modo de saco
cuyo contenido protoplasmtico se
Desinfectante: Agente que mata convierte en gran cantidad de esporas.
microorganismos, pero que puede ser
tambin daino para los tejidos humanos. Esporocitos : Recipiente hueco: estructura
que contiene las esporas.
Dextrinoide : Se dice de las esporas que
con un reactivo yodado toman coloracin Esporulacin : Accin y efecto de
rojiza. esporular: producir esporas.
EBV: Epstein-Barr Virus, = VEB en Esterigma : Pequea rama o estructura

espaol = Virus de Epstein Barr. hifal que sostiene un esporangio, un
conidio o una basidispora.
Eosinfilos: Clulas producidos en la
mdulas sea , pueden aumentar su Exotoxina: Toxina que se libera al exterior
produccin si las clulas progenitoras son de la clula.
estimuladas por la interleucina 5 segregada
123
Fagocito Clula capaz de rodear engullir y completa (clara, transparente) debido a
digerir microorganismos y detritus una destruccin total de los eritrocitos
celulares. Los macrofagos y las clulas del
sistema reticuloendotelial son fagocitos no Hemoptisis: Expulsin de sangre de la vas
circulantes. Los leucocitos y los respiratorias con la tos.
macrfagos libres circulan en la sangre.
Hemorragia: Prdida externa o interna de
Falso negativo: Resultado incorrecto de una gran cantidad de sangre en un perodo
una prueba diagnstica que indica corto de tiempo.
equivocadamente la ausencia de la
enfermedad. Hialina. Transparente como el vidrio o
parecido a l.
Falso positivo: Resultado incorrecto de
una prueba diagnstica que indica la HTLV-1: Retrovirus asociado a la leucemia
existencia de la enfermedad. de clulas T .Endmico en el Caribe, Japn
y Sur-este USA.
Fiebre: Elevacin anormal de la
temperatura corporal por encima de Ictericia: Coloracin amarillenta de la piel,
37 C causada por una enfermedad. mucosas y conjuntivas ocasionada por
aumento de la bilirrubina.
Filiforme : Que tiene forma o apariencia de
hilo. Incubacin : Mantenimiento de
cultivos bacterianos en condiciones
Fotofobia: Sensibilidad ocular anormal a favorables para su desarrollo y
la luz. multiplicacin.
Fungemia: Presencia de hongos en la Infeccin : Invasin y multiplicacin

sangre. de microorganismos en un husped,
pudiendo progresar hacia una
Fngico : Relativo a los hongos. enfermedad. El trmino enfermedad
infecciosa se aplica cuando aparecen
Fusiforme : En forma de huso. signos y sntomas como resultado de la
infeccin.
Gangrena: Muerte o necrosis de un tejido
como consecuencia de isquemia, o invasin Infeccin intrahospitalaria (IIH) :
bacteriana, afecta con mayor frecuencia las Infeccin que se adquiere luego de 48
extremidades, pero puede desarrollarse horas de permanecer en el establecimiento
tambin en rganos internos (intestino, de salud y que el paciente no portaba a su
vescula biliar). ingreso. Se consideran tambin a aquellos
procesos infecciosos que ocurren hasta 30
Germen: Cualquier microorganismo, das luego del alta.
especialmente los patgenos.
Infeccin por gotitas: Infeccin adquirida
Hbitat. Lugar donde vive. por inhalacin de microorganismos
patgenos suspendidos en las partculas de
Hemlisis : Presencia de restos de lquidos procedentes de una persona
eritrocitos lisados alrededor de una infectada a travs del estornudo o la tos.
colonia desarrollada en una placa de
agar sangre de carnero. Inmunocompetente: Persona que
presenta un estado ptimo de su
Hemlisis alfa : Las colonias estn inmunidad, celular y humoral que le
rodeadas por una destruccin parcial permite resistir a un proceso infeccioso.
de los eritrocitos y prdida de algo de
hemoglobina en el agar lo que resulta Inmunodeficiente-inmunodeprimido:
en una coloracin verde (hemlisis Persona que en el que existe un estado
incompleta). anormal del sistema inmunitario, por lo
que la inmunidad humoral o celular o
Hemlisis beta : Las colonias estn humoral son inadecuadas y disminuyen la
rodeadas por una zona de hemlisis resistencia a las infecciones.
124
una tensin del 5% de oxgeno, 10% de
Inmunidad celular: Respuesta inmunitaria anhdrido carbnico y 85% de nitrgeno.
con ausencia de anticuerpos, se necesitan
linfocitos activos. Microorganismo viable: Es aquel que es
capaz de reproducirse.
Inmunidad humoral: Respuesta
inmunitaria caracterizada por la sntesis y Mitgeno : Sustancia que induce la
liberacin de anticuerpos. mitosis.
Inculo: Alicuota de una muestra que Monocitos : Leucocito mononuclear

es transferida a un medio de cultivo. producido en la mdula sea, fagoctico, en
trnsito por sangre perifrica.
Limpieza: Es la remocin mecnica de Tienen receptores Fc. Los monocitos con
toda materia extraa con el objeto de los macrfagos componen el sistema
disminuir el nmero de mononuclear fagoctico del sistema
microorganismos. Se realiza a travs reticuloendotelial. Segn el estmulo
del arrastre mecnico, sin embargo no pueden funcionar como clulas citotxicas.
se asegura la eliminacin de stos.
Necrosis : Muerte de una porcin de tejido
Linfocitos :Clulas bsicas de la como consecuencia de una enfermedad o
inmunidad adquirida. lesin.
Macrfago : Clula fagoctica del sistema Nucletidos, bases: Adenina (A),Timina

reticuloendotelial. (T),Guanina (G), Citosina (C)
Mcula : Mancha. Oncogn : gen que estimula la

reproduccin celular.
Medio de cultivo: Medio artificial de
sustancias nutritivas necesarias para Oxidacin: Reaccin qumica que
el crecimiento y multiplicacin de laa implica la prdida de electrones de los
bacterias in vitro, que puede tomos. Mezcla de una sustancia con el
encontrarse en estado slido, oxgeno y un aumento en la valencia.
semislido o lquido.
Paciente : Persona que recibe un cuidado
Meningitis : Infeccin o inflamacin de las sanitario, que esta hospitalizado o enfermo.
meninges que son las membranas que
recubren el cerebro y la mdula espinal. Plsmido : ADN de forma circular, situada
fuera del cromosoma, a veces porta
Metabolismo: Proceso de degradacin informacin gentica y se replica de modo
y biosntesis enzimtica que tiene independiente.
lugar dentro de una clula y por medio
del cual se mantienen las actividades Patgeno : Microorganismo capaz de
nutricionales y funcionales. producir enfermedad.
Micelial : Relativo al micelio o propio de Polimorfa: Que puede tener varias formas.
l.
Predisposicin: Estado de una persona de
Miclico : Perteneciente o tocante al ser susceptible a determinado estmulo.
micelio.
Prevalencia : Nmero de casos nuevos de
Micelio : Aparato nutritivo o talo de los una enfermedad durante un tiempo
hongos. Parte vegetativa del hongo formada determinado.
por el entrelazamiento de las hifas.
Reconstituir: Restablecer la forma
Micosis : Infeccin causada por un hongo. original de una sustancia previamente
alterada para su conservacin y
Microaeroflico: Organismo que crece almacenamiento, mediante la
y se reproduce mejor en la presencia de combinacin con un lquido adecuado.
125
Registro: Documento que provee la corriente sangunea
evidencias objetivas de las actividades
efectuadas o de los resultados Subcultivo : Pasaje de bacterias
obtenidos. viables derivadas de otro cultivo a un
medio de cultivo nuevo.
Riesgo : Estado de vulnerabilidad de una
persona o una poblacin frente a una Traduccin : Formacin de una secuencia
enfermedad. de aminocidos a partir de una secuencia
de bases de una molcula de ARNm.
Riesgo, factor de : Cualquier factor
(ambiental o fisiolgico) que produce en Transcripcin : Transferencia de la
una persona o poblacin un estado de informacin gentica del ADN por medio de
vulnerabilidad ante un suceso nocivo la sntesis de una copia de ARN de una
(enfermedad-infeccin). plantilla de ADN.
Secuencia : Orden que siguen las bases de Translocacin : Transferencia de un

nucletidos en una cadena de ADN. fragmento de un cromosoma a otro, y
tambin el desplazamiento del ARNm por el
Septicemia : Infeccin sistmica que se ribosoma durante la traduccin.
caracteriza por la aparicin de patgenos
en sangre circulante que provienen de una Traduccin : Segundo paso de la
infeccin localizada en cualquier lugar del expresin gentica: es la sntesis de
organismo. protenas a partir de un molde plantilla
de mARN, donde la secuencia de
Siembra primaria : Inoculacin de una aminocidos est determinada por la
muestra a un medio de cultivo simple, informacin contenida en el mARN
selectivo o de enriquecimiento.
UFC: Unidad formadora de colonia.
Shock : Estado fisiolgico anormal que se
caracteriza entre otras por disminucin del Vector: Portador capaz de transmitir una
gasto cardaco, aumento de la frecuencia enfermedad .Los vectores biolgicos son
cardaca, disminucin de la presin por lo general artrpodos en los cuales el
arterial. Es la primera fase de la reaccin microorganismo infectante completa su
del organismo frente a una lesin ciclo vital.
traumtica.
Shock sptico : Shock causado por la

septicemia debido a la liberacin de
endotoxinas bacterianas que estn en
126

Guía de Práctica - Microbiologia USMP 2017

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DEPARTAMENTO ACADMICO

El Manual de Prcticas de Microbiologa tiene como objetivo orientar a los alumnos

Desde que se describiera por primera vez la morfologa de las bacterias

Los avances tecnolgicos con aumento de la automatizacin, el desarrollo de la

Tenemos el convencimiento que esta orientacin acadmica proporcionar a los

Se da una relacin concisa de los mtodos de laboratorio empleados en el estudio

Los trabajos de laboratorio se han ordenado metodolgicamente a fin de facilitar la

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Debemos dejar establecido que el presente Manual de Prcticas, no es una

El estudio de las bacterias y de su estructura es particularmente difcil,

Para la observacin y estudio de las bacterias se utilizan diversos mtodos.

Existen grupos bacterianos que para su observacin requieren otras

Para realizar el diagnstico de hongos y virus existen tcnicas particulares,

Bioseguridad y uso de equipos de seguridad biolgica

En general en todo laboratorio deben seguirse normas que garanticen la

Con tal motivo, en el Laboratorio de Microbiologa se consideran cuatro niveles

Nivel 1 : Microorganismos no patgenos y patgenos oportunistas

De toda forma durante las prcticas se recomienda seguir las siguientes

1. No ser permitido ingresar a la Sala de Prcticas sin el respectivo mandil.

2. Observar en todo momento las medidas de asepsia con el material de

4.La evaluacin de los alumnos de las asignaturas correspondientes al

5. Por razones de seguridad, ningn material de prcticas saldr de la sala de

7. Todo material de trabajo como son: lminas portaobjetos, laminillas o

9. Cada alumno debe disponer obligatoriamente del Manual de Prcticas, el

En el campo de la microbiologa mdica se requieren de conocimientos

Asa y aguja de siembra : Muy usada en la prctica microbiolgica, hecha de

Autoclave : Aparato para esterilizacin por vapor bajo presin , provisto de

Centrfuga : Aparato diseado para acelerar la separacin de partculas

Contador de colonias : Sirve para contar electrnicamente y de forma exacta

Crioviales : Pequeos tubos cnicos de polipropileno resistentes a muy bajas

Estufa : Aparato de dimensiones diversas , donde se incuban los cultivos,

Filtros esterilizantes : Para dejar libre de contenido microbiano a productos

Gradilla : Soporte para tubos de ensayo.

Jarra de anaerobiosis : Instrumento til para el aislamiento de bacterias

Lmina portaobjetos : Lmina de vidrio que se utiliza para preparar frotis

Mechero de Bunsen : Mechero de gas , en el que ste se mezcla con aire

Medios de cultivo : Mezcla de nutrientes esenciales para el crecimiento de

Microscopio : Instrumento ptico utilizado para la observacin de

Pipetas : Son tubos cilndricos de diversos materiales, pueden ser graduadas

Pipetas Pasteur : Varillas de vidrio de 4 mm de dimetro y de 20 a 30 cm de

Pipeteadores automticos : Pipetas que absorben de forma automtica sin

Placa de Petri : recipiente de vidrio o plstico que , en general se usa para

Autoclave Cabina de Flujo laminar

OBTENCIN Y MANEJO DE MUESTRAS CLNICAS

Realizar los procedimientos adecuados para asegurar las medidas de

En trminos de la efectividad del Laboratorio de Microbiologa , nada es ms

La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso.

Cuando se va a proceder a tomar un espcimen clnico, es importante evitar

Seleccionar el lugar anatmico correcto de donde se obtendr el espcimen y

Nunca refrigerar una muestra por anaerobios.

Coleccionar un apropiado volumen de la muestra.

El paciente debe ser informado en forma clara y sencilla de acuerdo a su

Colocar la muestra en un recipiente estril y adecuado para su transporte

Ordenar siempre un frotis para tincin o coloracin de Gram, para los

CRITERIOS DE RECHAZO DE UNA MUESTRA

Hoja de solicitud de anlisis no llenada correctamente

Las muestras ms frecuentes en los estudios microbiolgicos son :

En las muestras de orina se pueden realizar diferentes anlisis como : examen