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c a P t u l o

Enzimas: cintica
Peter J. Kennelly, PhD y Victor W. Rodwell, PhD

IMPORTANCIA BIOMDICA y B. Por ende, la designacin de un reactivo particular como sustra-

to o producto es un poco arbitraria porque los productos para
La cintica enzimtica es el campo de la bioqumica que se encarga una reaccin descrita en una direccin son los sustratos para la re-
de la medicin cuantitativa de los ndices de reacciones catalizadas accin inversa. Sin embargo, el trmino producto a menudo se usa
por enzimas, y del estudio sistemtico de factores que afectan estos para designar los reactivos cuya formacin es favorecida desde el
ndices. Un conjunto completo y balanceado de actividades enzi- punto de vista termodinmico. Las reacciones para las cuales los
mticas tiene importancia fundamental para el mantenimiento de factores termodinmicos favorecen de manera significativa la for-
la homeostasis. De este modo, una comprensin de la cintica enzi- macin de los productos hacia los cuales apunta la flecha, a menudo
mtica es importante para entender de qu modo los estados de se representan con una flecha nica como si fueran irreversibles:
estrs fisiolgico, como la anoxia, la acidosis o alcalosis metablica,
las toxinas y los agentes farmacolgicos afectan ese equilibrio. El A+B P+Q (2)
anlisis cintico puede revelar el nmero y orden de los pasos indi-
viduales mediante los cuales las enzimas transforman sustratos en Tambin se usan flechas unidireccionales para describir reacciones
productos. Junto con la mutagnesis dirigida hacia sitio y otras tc- en clulas vivas en las cuales los productos de la reaccin (2) son
nicas que sondean la estructura de protenas, los anlisis cinticos consumidos de inmediato por una reaccin subsiguiente catalizada
revelan detalles del mecanismo cataltico de una enzima dada. La por enzima. Por ende, la eliminacin rpida del producto P o Q im-
participacin de las enzimas en casi todos los procesos fisiolgicos pide de manera efectiva la reaccin inversa, lo que hace a la ecua-
hace de ellas los mejores objetivos para frmacos que curan o ami- cin (2) irreversible desde el punto de vista funcional en condi-
noran la enfermedad en seres humanos. La cintica enzimtica ciones fisiolgicas.
aplicada representa el principal recurso mediante el cual los cient-
ficos identifican y caracterizan agentes teraputicos que inhiben de
manera selectiva los ndices de procesos catalizados por enzima
especficos. De este modo, la cintica enzimtica desempea una LOS CAMBIOS DE LA ENERGA LIBRE
funcin crucial en el descubrimiento de frmacos y en la farmaco- DETERMINAN LA DIRECCIN
dinmica comparativa, as como en la dilucidacin del modo de Y EL ESTADO DE EQUILIBRIO
accin de los frmacos.
DE REACCIONES QUMICAS
El cambio de energa libre de Gibbs G (tambin llamado la energa
LAS REACCIONES QUMICAS SE libre o energa de Gibbs) describe tanto la direccin en la cual tende-
DESCRIBEN USANDO ECUACIONES r a proceder una reaccin qumica, como las concentraciones de
BALANCEADAS reactivos y productos que estarn presentes en equilibrio. La G
para una reaccin qumica es igual a la suma de las energas libres de
Una ecuacin qumica balanceada lista las especies qumicas ini- la formacin de los productos de la reaccin GP menos la suma
ciales (sustratos) presentes y las nuevas especies qumicas (produc- de las energas libres de formacin de los sustratos Gs. G0 denota
tos) formadas para una reaccin qumica particular, todas en sus el cambio de energa libre que acompaa a la transicin desde el
proporciones o estequiometra correctas. Por ejemplo, en la ecua- estado estndar, concentraciones uno molar de sustratos y produc-
cin balanceada (1) que aparece a continuacin se describe la tos, hasta el equilibrio. Un trmino bioqumico ms til es G0 , que
reaccin de una molcula, cada una, de sustratos A y B, para formar define el G0 a un estado estndar de 107 M protones, pH de 7.0
una molcula, cada una, de productos P y Q. (cap. 11). Si la energa libre de formacin de los productos es ms
baja que la de los sustratos, los signos de G0 y G0 sern negativos,
A+B P+Q (1) lo que indica que la reaccin como est escrita se favorece en la
direccin de izquierda a derecha. Esas reacciones se denominan es-
Las dobles flechas indican reversibilidad, propiedad intrnseca de pontneas. El signo y la magnitud del cambio de energa libre de-
todas las reacciones qumicas. De este modo, para la reaccin (1), si terminan qu tan lejos proceder la reaccin. En la ecuacin (3) se
A y B pueden formar P y Q, estos ltimos tambin pueden formar A ilustra la relacin entre la constante de equilibrio Keq y G0,

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 captulo 8 Enzimas: cintica 63

G0 = RT ln K eq (3) A + B

O +
donde R es la constante gaseosa (1.98 cal/molK u 8.31 J/molK) y E O -o P O
T es la temperatura absoluta en grados Kelvin. Keq es igual al pro-
HO
ducto de las concentraciones de los productos de la reaccin, cada
uno elevado a la potencia de su estequiometra, dividido por el pro- O
ducto de los sustratos, cada uno elevado a la potencia de su este- E O P O
quiometra.
-o
Para la reaccin A + B P+Q OH

[P][Q] O
K eq = (4) E
[A ][B] O P O
o
OH
y para la reaccin (5)
P + Q
A+A P (5)
FIGURA 8-1 Formacin de un intermediario de estado de
transicin durante una reaccin qumica simple, A + B P + Q. Se
[P] muestran tres etapas de una reaccin qumica en la cual un grupo
K eq = (6)
[A ]2 fosforilo se transfiere desde el grupo L que sale hacia el grupo E que
G0 puede calcularse a partir de la ecuacin (3) si se conocen las entra. Arriba: el grupo E de que entra (A) se acerca al otro reactivo,
L-fosfato (B). Note cmo los tres tomos de oxgeno enlazados por las
concentraciones molares de sustratos y productos presentes en
lneas triangulares y el tomo de fsforo del grupo fosforilo forman una
equilibrio. Si G0 es un nmero negativo, Keq ser mayor que la uni-
pirmide. Centro: a medida que E se aproxima al L-fosfato, empieza a
dad, y la concentracin de productos en equilibrio exceder la de los formarse el nuevo enlace entre E y el grupo fosfato (lnea punteada)
sustratos. Si G0 es positiva, Keq ser menor que la unidad, y se fa- a medida que el que enlaza L al grupo fosfato se debilita. Estos enlaces
vorecer la formacin de sustratos. parcialmente formados estn indicados por lneas punteadas. Abajo: la
Note que, dado que G0 est en funcin exclusivamente de los formacin del nuevo producto, E-fosfato (P), ahora est completa a
estados inicial y final de las especies que estn reaccionando, slo medida que el grupo L (Q) que sale, egresa. Note cmo la forma del
puede proporcionar informacin acerca de la direccin y el estado de grupo fosforilo difiere entre el estado de transicin y el sustrato o
equilibrio de la reaccin. G0 es independiente del mecanismo de la producto. Vea la manera en que el fsforo y tres tomos de oxgeno que
reaccin y, por ende, no proporciona informacin acerca de ndices ocupan los cuatro ngulos de una pirmide en el sustrato y el producto
se hacen coplanares, como se recalca por el tringulo, en el estado de
de reacciones. En consecuencia y como se explica ms adelante,
transicin.
aunque una reaccin puede tener una G0 o G0 negativa grande,
puede, sin embargo, tener lugar a un ndice insignificante.

ilustracin ms detallada del estado de transicin intermedio for-

LOS NDICES DE REACCIONES ESTN mado durante la transferencia de un grupo fosforilo.
DETERMINADOS POR SU ENERGA Cabe considerar que la reaccin (7) consta de dos reacciones
DE ACTIVACIN parciales; la primera corresponde a la formacin (F) y la segunda a
la descomposicin (D) subsiguiente del intermediario de estado de
Las reacciones proceden por estados transicin. Al igual que para todas las reacciones, los cambios carac-
tersticos de la energa libre, GF y GD se relacionan con cada re-
de transicin accin parcial.
El concepto de estado de transicin es fundamental para entender
las bases qumica y termodinmica de la catlisis. En la ecuacin (7) E+RL E R L GF (8)
se describe una reaccin de transferencia de grupo en la cual un
grupo E que est entrando desplaza a un grupo L que est saliendo,
ERL E R + L GD (9)
en un inicio fijo a R.

E+RL ER+L (7) E+RL E R + L G = GF + GD (10)

El resultado neto de este proceso es transferir el grupo R desde L Para la reaccin general (10), G es la suma de GF y GD. Al igual
hacia E. A la mitad del desplazamiento, el enlace entre R y L se ha que para cualquier ecuacin de dos trminos, es imposible inferir a
debilitado pero todava no se ha roto por completo, y el nuevo enla- partir de G el signo o la magnitud de GF o GD.
ce entre E y R hasta ahora est formado de manera incompleta. Di- Muchas reacciones comprenden mltiples estados de transi-
cho intermediario transitorio en el cual no existe sustrato ni pro- cin, cada uno con un cambio relacionado de energa libre. Para
ducto libre se denomina el estado de transicin, ERl. Las estas reacciones, la G general representa la suma de todos los cam-
lneas punteadas representan los enlaces parciales que estn pa- bios de energa libre relacionados con la formacin y la descompo-
sando por formacin y rotura. En la figura 8-1 se proporciona una sicin de todos los estados de transicin. por ende, a partir de la

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 64 SEccIN I Estructuras y funciones de protenas y enzimas

G general es imposible inferir el nmero o el tipo de estados de ende, la frecuencia con la cual chocan. Esta combinacin de cho-
transicin a travs de los cuales procede la reaccin. Dicho ques ms frecuentes y ms energticos y productivos, aumenta el
de otra manera, la termodinmica general no dice nada acerca de la ndice de reaccin.
cintica.

Concentracin de reactivo
La GF define la energa de activacin La frecuencia con la cual las molculas chocan es directamente
Al margen del signo o la magnitud de G, la GF para la mayora de proporcional a sus concentraciones. Para dos molculas diferen-
reacciones qumicas tiene un signo positivo, de modo que la forma- tes, A y B, la frecuencia con la cual chocan se duplicar si se dupli-
cin de intermediarios de estado de transicin requiere superar ba- ca la concentracin de A o de B. Si las concentraciones tanto de A
rreras de energa. Por esta razn, la GF para llegar a un estado de como de B se duplican, la probabilidad de choque aumentar cua-
transicin a menudo se denomina la energa de activacin, Eact. La tro veces.
facilidad y por ende, la frecuencia con la cual esta barrera se Para una reaccin qumica que procede a una temperatura cons-
supera se relaciona de manera inversa con Eact. De este modo, los tante que comprende una molcula, cada una, de A y B,
parmetros termodinmicos que determinan la rapidez con la cual
procede una reaccin, son los valores GF para la formacin de los A+B P (12)
estados de transicin a travs de los cuales procede la reaccin. Para
una reaccin simple, donde significa proporcional a, el nmero de molculas que poseen energa cintica suficiente para
superar la barrera de energa de activacin ser una constante. Por
ndice e Eact / RT (11) ende, el nmero de choques con suficiente energa para producir el
producto P ser directamente proporcional al nmero de choques
La energa de activacin para la reaccin que est procediendo en la entre A y B y, as, y a sus concentraciones molares, denotadas por
direccin opuesta a la trazada es igual a GD. corchetes.

ndice [A ][B] (13)

MUCHOS FACTORES AFECTAN
EL NDICE DE REACCIN De modo similar, para la reaccin representada por

La teora cintica tambin llamada la teora de la coalicin de A + 2B P (14)

cintica qumica declara que para que dos molculas reaccionen,
deben: 1) aproximarse dentro de la distancia formadora de enlace de que tambin puede escribirse como
la otra, o chocar, y 2) poseer suficiente energa cintica para ven-
cer la barrera de energa para alcanzar el estado de transicin. Por A+B+B P (15)
ende, resulta que cualquier cosa que aumente la frecuencia o energa
el ndice de expresin correspondiente es
de colisin entre sustratos aumentar el ndice de la reaccin en la
cual participan. ndice [A ][B][B] (16)

o
Temperatura
Aumentar la temperatura incrementa la energa cintica de las mo- ndice [A ][B]
2
(17)
lculas. El nmero total de molculas cuya energa cintica excede
la barrera de energa Eact (barra vertical) para la formacin de pro- Para el caso general, cuando n molculas de A reaccionan con m
ductos aumenta desde temperaturas bajas (A), pasando por inter- molculas de B,
medias (B) hasta altas (C) (fig. 8-2). El aumento de la energa cin-
tica de molculas tambin aumenta su rapidez de movimiento y, por nA + mB P (18)

el ndice de expresin es

ndice [A ] [B] (19)

n m
Barrera de energa

Remplazar el signo de proporcionalidad con signos de igual al in-
A B C troducir una constante de ndice k caracterstica de la reaccin en
Nmero de
molculas

estudio da las ecuaciones (20) y (21), en las cuales los nmeros 1 y

1 se refieren a las reacciones hacia adelante e inversa, respectiva-
mente.
0
ndice1 = k1 [A ] [B]
n m
(20)
Energa cintica

FIGURA 8-2 La barrera de energa para reacciones qumicas.

(Vase la exposicin en el texto.) ndice 1 = k 1 [P ] (21)

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 captulo 8 Enzimas: cintica 65

La suma de las proporciones molares de los reactivos define el or- 4. El valor numrico de la constante de equilibrio Keq puede
den cintico de la reaccin. Considere la reaccin (5). El coeficiente calcularse a partir de las concentraciones de sustratos y
estequiomtrico para el reactivo nico, A, es dos. Por ende, el ndice productos en equilibrio o a partir de la proporcin k1/k1.
de produccin de P es proporcional al cuadrado de [A], y se dice que
la reaccin es de segundo orden respecto del reactivo A. En este caso,
la reaccin general tambin es de segundo orden. Por ende, k1 se LA CINTICA DE LA CATLISIS
denomina una constante de ndice de segundo orden.
ENZIMTICA
En la reaccin (12) se describe una reaccin de segundo orden
simple entre dos reactivos diferentes, A y B. El coeficiente estequio-
Las enzimas disminuyen la barrera de
mtrico para cada reactivo es uno. Por ende, mientras que el orden
general de la reaccin es dos, se dice que es de primer orden respecto energa de activacin para una reaccin
de A, y de primer orden respecto de B. En el laboratorio, el orden Todas las enzimas aceleran los ndices de reaccin al disminuir la
cintico de una reaccin respecto de un reactivo particular, al cual GF para la formacin de estados de transicin. Sin embargo,
se hace referencia como el reactivo variable o sustrato, puede deter- pueden diferir en la manera en que esto se logra. Cuando el meca-
minarse al mantener la concentracin de los otros reactivos a una nismo o la secuencia de pasos qumicos en el sitio activo es, en
concentracin constante, o fija, en un gran exceso sobre el reactivo esencia, equivalente al que ocurre para la misma reaccin que est
variable. En estas condiciones de seudoprimer orden, la concentra- procediendo en ausencia de un catalizador, el ambiente del sitio
cin del (o los) reactivo(s) fijo(s) permanece casi constante. De este activo disminuye la GF al estabilizar los intermediarios de esta-
modo, el ndice de reaccin depender de manera exclusiva de la do de transicin. En otras palabras, la enzima puede imaginarse
concentracin del reactivo variable, a veces tambin llamado el como unida al intermediario de estado de transicin (fig. 8-1) de
reactivo limitante. Los conceptos de orden de reaccin y condicio- manera ms estrecha que a sustratos o productos. La estabiliza-
nes de seudoprimer orden no slo se aplican a reacciones qumicas cin puede comprender: 1) grupos acidobsicos colocados de ma-
simples, sino tambin a reacciones catalizadas por enzimas. nera idnea para transferir protones hacia o desde el intermedia-
rio de estado de transicin, 2) grupos cargados o iones metlicos
colocados de manera idnea, que estabilizan cargas que se estn
Keq es una proporcin de constantes formando, o 3) la imposicin de tensin estrica sobre sustratos
de ndice de modo que su forma se aproxima a la del estado de transicin
Si bien todas las reacciones qumicas son hasta cierto grado reversi- (cap. 7). La proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana
bles, en condiciones de equilibrio las concentraciones generales de (VIH) (fig. 7-6) ilustra la catlisis por una enzima que disminuye
reactivos y productos permanecen constantes. Por ende, en equili- la barrera de activacin al estabilizar un intermediario de estado
brio, el ndice de conversin de sustratos en productos, es igual al de transicin.
ndice al cual los productos se convierten en sustratos. La catlisis por enzimas que procede por medio de un meca-
nismo de reaccin singular tpicamente ocurre cuando el interme-
ndice1 = ndice 1 (22) diario del estado de transicin forma un enlace covalente con la
enzima (catlisis covalente). El mecanismo cataltico de la serina
Por ende, proteasa quimotripsina (fig. 7-7) ilustra la manera en la cual una
enzima utiliza catlisis covalente para proporcionar una va de
k1 [A ] [B] = k 1[P ] (23)
n m
reaccin nica.

k1 [P] LAS ENZIMAS NO AFECTAN LA Keq

= (24)
k 1 [A ]n [B]m Si bien las enzimas pueden pasar por modificaciones transitorias
durante el proceso de catlisis, siempre salen sin cambios cuando
La proporcin de k1 a k1 se denomina la constante de equilibrio Keq. se completa la reaccin. por ende, la presencia de una enzima no
Es necesario tener en mente las propiedades importantes que siguen tiene efecto sobre la G0 para la reaccin general, que est en
de un sistema en equilibrio: funcin slo de los estados inicial y final de los reactivos. En la
ecuacin 25 se muestra la relacin entre la constante de equilibrio
1. La constante de equilibrio es una proporcin de las para una reaccin y el cambio de energa libre estndar para esa
constantes de ndice de reaccin (no los ndices de reaccin:
reaccin).
2. En equilibrio, los ndices de reaccin (no las constantes de G0 = RT ln K eq (25)
ndice) de las reacciones hacia adelante y hacia atrs son
iguales. Este principio quiz se ilustra con mayor facilidad al incluir la pre-
3. El equilibrio es un estado dinmico. Aunque no hay cambio sencia de la enzima (Enz) en el clculo de la constante de equilibrio
neto de la concentracin de sustratos o productos, para una reaccin catalizada por enzima:
molculas individuales de sustrato y producto
continuamente se estn interconvirtiendo. A + B + Enz P + Q + Enz (26)

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 66 SEccIN I Estructuras y funciones de protenas y enzimas

Dado que la enzima a ambos lados de las dobles flechas est presen- X
te en igual cantidad y forma idntica, la expresin para la constante 100

de equilibrio
SH+ E
[P][Q][Enz ]
K eq =
[A ][B][Enz ] (27) %

reduce a una a idntica a la que procede para la reaccin en ausencia

de la enzima:
0

[P][Q]
Bajo Alto

K eq = (28) pH
[A ][B]
FIGURA 8-3 Efecto del pH sobre la actividad de enzima. Considere,
Por ende, las enzimas carecen de efecto sobre Keq. por ejemplo, una enzima con carga negativa (E) que se une a un
sustrato que tiene carga positiva (SH+). Se muestra la proporcin (%) de
SH+ [\\\] y de E [///]como una funcin del pH. Slo en el rea
MLTIPLES FACTORES INFLUYEN cuadriculada tanto la enzima como el sustrato portan una carga
apropiada.
SOBRE LOS NDICES DE REACCIONES
CATALIZADAS POR ENZIMA
geno. Casi todas las enzimas intracelulares muestran actividad p-
Temperatura tima a valores de pH entre 5 y 9. La relacin entre actividad y
El aumento de la temperatura incrementa el ndice de reacciones concentracin de ion hidrgeno (fig. 8-3) refleja el equilibrio entre
tanto no catalizadas como catalizadas por enzima al aumentar la la desnaturalizacin de enzima a pH alto o bajo, y los efectos sobre
energa y la frecuencia de choque de las molculas que estn reac- el estado cargado de la enzima, los sustratos o ambos. Para enzimas
cionando. Sin embargo, la energa calorfica tambin aumenta la cuyo mecanismo comprende catlisis acidobsica, los residuos com-
energa cintica de la enzima hasta un punto que excede la barrera prendidos deben estar en el estado de protonacin apropiado para
de energa para alterar las interacciones no covalentes que mantie- que la reaccin proceda. La unin y el reconocimiento de molculas
nen su estructura tridimensional. La cadena polipeptdica empieza de sustrato con grupos disociables tpicamente tambin compren-
entonces a desdoblarse, o desnaturalizarse, con una prdida acom- den la formacin de puentes salinos con la enzima. Los grupos car-
paante de la actividad cataltica. El rango de temperatura en el cual gados ms frecuentes son grupos carboxilato (negativos) y aminas
una enzima mantiene una conformacin estable, competente desde protonadas (positivos). La ganancia o prdida de grupos cargados
el punto de vista cataltico, depende de y, por lo general, excede de cruciales afecta de manera adversa la unin a sustrato y, as, retrasa-
manera moderada la temperatura normal de las clulas en las r o suprimir la catlisis.
cuales reside. Las enzimas de seres humanos, por lo comn, mues-
tran estabilidad a temperaturas de hasta 40 a 55C. En contraste, las
enzimas de los microorganismos termoflicos que residen en ma- LAS VALORACIONES DE REACCIONES
nantiales calientes volcnicos u orificios hidrotrmicos submarinos, CATALIZADAS POR ENZIMA POR LO
pueden ser estables hasta 100C o incluso ms. GENERAL MIDEN LA VELOCIDAD INICIAL
El Q10, o coeficiente de temperatura, es el factor por el cual el
ndice de un proceso biolgico aumenta para un incremento de En casi todas las mediciones de los ndices de reacciones catalizadas
10C de temperatura. Para las temperaturas en las cuales las enzi- por enzima se emplean periodos hasta cierto punto breves, condicio-
mas son estables, los ndices de casi todos los procesos biolgicos nes que se aproximan a las condiciones de velocidad inicial. En estas
tpicamente se duplican para un aumento de temperatura de 10C condiciones, slo se acumulan trazas de producto, lo que hace insig-
(Q10 = 2). Los cambios de los ndices de reacciones catalizadas por nificante al ndice de la reaccin inversa. De este modo, la velocidad
enzima que acompaan a un aumento o disminucin de la tempera- inicial (vi) de la reaccin es en esencia la del ndice de reaccin hacia
tura corporal constituyen una caracterstica de supervivencia pro- adelante. En las valoraciones de actividad enzimtica casi siempre se
minente para formas de vida de sangre fra como lagartos o peces, emplea un exceso molar grande (103 a 107) de sustrato sobre enzima.
cuya temperatura corporal est dictada por el ambiente externo. Sin En estas condiciones, vi es proporcional a la concentracin de enzi-
embargo, para mamferos y otros organismos homeotrmicos, los ma. Por ende, la medicin de la velocidad inicial permite estimar la
cambios de los ndices de reaccin de enzimas con la temperatura cantidad de enzima presente en una muestra biolgica.
slo asumen importancia fisiolgica en circunstancias como fiebre
o hipotermia.
LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO
Concentracin de ion hidrgeno AFECTA EL NDICE DE REACCIN
El ndice de casi todas las reacciones catalizadas por enzima mues- En lo que sigue, las reacciones enzimticas se tratan como si slo
tra una dependencia importante de la concentracin de ion hidr- tuvieran un sustrato nico y un producto nico. Para enzimas con

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 captulo 8 Enzimas: cintica 67

mltiples sustratos, los principios que se comentan a continuacin los aumentos adicionales de [S] no pueden aumentar el ndice de la
se aplican con igual validez. Ms an, al emplear condiciones de reaccin. En estas condiciones de saturacin, la vi depende slo de
seudoprimer orden (vase antes), los cientficos pueden estudiar la y, de este modo, est limitada por la rapidez con la cual el pro-
dependencia del ndice de reaccin en un reactivo individual por ducto se disocia de la enzima de modo que logre combinarse con
medio de la seleccin apropiada de sustratos fijos y variables. En ms sustrato.
otras palabras, en condiciones de seudoprimer orden, la conducta
de una enzima con mltiples sustratos imitar a la de otra que cuen-
ta con un solo sustrato. Sin embargo, en estas circunstancias, la LAS ECUACIONES DE MICHAELIS-
constante de ndice observada estar en funcin de la constante de MENTEN Y DE HILL MODELAN
ndice de k1 para la reaccin, as como la concentracin del (o los)
sustrato(s) fijo(s).
LOS EFECTOS DE LA CONCENTRACIN
Para una enzima tpica, a medida que la concentracin de sus- DE SUSTRATO
trato aumenta, vi se incrementa hasta que alcanza un valor mximo
Vmx (fig. 8-4). Cuando los aumentos adicionales de la concentra- La ecuacin de Michaelis-Menten
cin de sustrato no aumentan ms la vi, se dice que la enzima est La ecuacin de Michaelis-Menten (29) ilustra en trminos matem-
saturada con sustrato. Note que la forma de la curva que relaciona ticos la relacin entre la velocidad de reaccin inicial vi y la concen-
la actividad con la concentracin de sustrato (fig. 8-4) es hiperbli- tracin de sustrato [S], que se muestra de manera grfica en la figu-
ca. A cualquier constante dada, slo las molculas de sustrato que se ra 8-4.
combinan con la enzima como un complejo ES pueden transfor-
marse en producto. En segundo lugar, la constante de equilibrio Vmx [S]
vi = (29)
para la formacin del complejo de enzima-sustrato no es infinita- K m + [S ]
mente grande. Por ende, aun cuando el sustrato est presente en
exceso (puntos A y B de la fig. 8-5), slo una fraccin de la enzima la constante Km de Michaelis es la concentracin de sustrato a la
puede estar presente como un complejo ES. Por tanto, de los puntos cual vi es la mitad de la velocidad mxima (Vmx/2) alcanzable a
A o B, aumentar o disminuir [S] aumentar o disminuir el nmero una concentracin particular de enzima. De este modo, Km tiene
de complejos ES con un cambio correspondiente de vi. En el punto las dimensiones de la concentracin de sustrato. La dependencia
C (fig. 8-5), en esencia toda la enzima est presente como el comple- de la velocidad de reaccin inicial de [S] y Km puede ilustrarse al
jo ES. Dado que no queda enzima libre disponible para formar ES, evaluar la ecuacin de Michaelis-Menten en tres condiciones.
1. Cuando [S] es mucho menor que Km (punto A en las figs. 8-4
y 8-5), el trmino Km + [S] es en esencia igual a la Km. El remplazo
mx
de Km + [S] con Km reduce la ecuacin (29) a
mx
Vmx [S] Vmx [S] Vmx
vi = vi [S ] (30)
K m + [S ] Km Km
mx
donde significa aproximadamente igual a. Dado que tanto Vmx
como Km son constantes, su proporcin es una constante. En otras
palabras, cuando [S] est muy por debajo de Km, vi es proporcional
FIGURA 8-4 Efecto de la concentracin de sustrato sobre a k[S]. Por ende, la velocidad de reaccin inicial es directamente
la velocidad inicial de una reaccin catalizada por enzima. proporcional a [S].

=S

=E

A B C

FIGURA 8-5 Representacin de una enzima en presencia de una concentracin de sustrato que est por
debajo de Km (A), a una concentracin igual a Km (B), y a una concentracin bastante por arriba de Km (C). Los
puntos A, B y C corresponden a esos puntos en la figura 8-4.

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 68 SEccIN I Estructuras y funciones de protenas y enzimas

2. Cuando [S] es mucho mayor que Km (punto C en las figs. 8-4

y 8-5), el trmino Km + [S] es en esencia igual a [S]. Remplazar Km +
[S] por [S] reduce la ecuacin (29) a

Vmx [S] Vmx [S]

vi = vi Vmx (31)
K m + [S ] [S ]
De este modo, cuando [S] excede con mucho a Km, la velocidad
de reaccin es mxima (Vmx) y no est afectada por aumentos adi-
cionales de la concentracin de sustrato. FIGURA 8-6 Grfico del doble recproco o de Lineweaver-Burk de
3. Cuando [S] = Km (punto B en las figs. 8-4 y 8-5). 1/vi en contraposicin con 1/[S] usado para evaluar la Km y Vmx.

Vmx [S] Vmx [S] Vmx

vi = = = (32)
K m + [S ] 2 [S ] 2
b 1
La ecuacin (32) declara que cuando [S] es igual a Km, la velo- 0 = ax + b; por tanto, x = = (36)
cidad inicial es de la mitad del mximo. La ecuacin (32) tambin a Km
revela que Km es y puede determinarse la manera experimental a
partir de la concentracin de sustrato a la cual la velocidad inicial De este modo, Km se calcula con mayor facilidad a partir de la inter-
es la mitad del mximo. seccin x negativa.
La mayor virtud del grfico de Lineweaver-Burk reside en la
facilidad con la cual puede usarse para determinar los mecanismos
Una forma lineal de la ecuacin cinticos de inhibidores de enzima (vase ms adelante). Sin embar-
de Michaelis-Menten se usa go, al usar un grfico del doble recproco para determinar constan-
para determinar Km y Vmx tes cinticas, es importante evitar la introduccin de sesgo por la
agrupacin de datos a valores bajos de 1/[S]. Para lograr esto, se
La medicin directa del valor numrico de Vmx, y, por consiguiente, prepara una solucin de sustrato cuya dilucin hacia una valoracin
el clculo de Km, a menudo requiere concentraciones altas poco producir la concentracin deseada mxima de sustrato. Ahora se
prcticas de sustrato para alcanzar condiciones de saturacin. Una utiliza el mismo volumen de soluciones preparadas al diluir la solu-
forma lineal de la ecuacin de Michaelis-Menten evita esta dificul- cin madre por factores de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, etc. Los datos entonces
tad y permite extrapolar Vmx y Km desde de datos de velocidad ini- caern en el eje 1/[S] a intervalos de 1, 2, 3, 4, 5, etc. De manera al-
cial obtenidos a concentraciones de sustrato menores que las que ternativa, para minimizar la agrupacin puede usarse un grfico del
producen saturacin. Se empieza con la ecuacin (29), recproco nico, como el de Eadie-Hofstee (vi contra vi/[S]) o de
Vmx [S] Hanes-Woolf ([S]/vi contra [S]).
vi = (29)
K m + [S ]
La constante cataltica, kcat
se invierte
Es factible usar varios parmetros para comparar la actividad relati-
1 K m + [S ] va de diferentes enzimas o de diferentes preparaciones de la misma
= (33) enzima. La actividad de preparaciones de enzima impuras por lo
vi Vmx [S]
general se expresa como actividad especfica (Vmx dividida entre la
se factoriza concentracin de protena). Para una enzima homognea es posible
calcular su nmero de recambio (Vmx dividida entre los mol de en-
1 Km [S ] zima presentes). Sin embargo, si se conoce el nmero de sitios acti-
= + (34)
vi Vmx [S] Vmx [S] vos presentes, la actividad cataltica de una enzima homognea se
expresa mejor como su constante cataltica, kcat (Vmx dividida entre
y se simplifica el nmero de sitios activos, St).
1 Km 1 1 Vmx
= + (35) kcat = (37)
vi Vmx [S] Vmx St

La ecuacin (35) es la ecuacin para una lnea recta y = ax + b, Dado que las unidades de concentracin se anulan, las unidades de
donde y = 1/vi y x = 1/[S]. Un grfico de 1/vi en el eje y, expresado kcat son tiempo recproco.
como una funcin de 1/[S] en el eje x, da una lnea recta cuya inter-
seccin en el eje y se define como 1/Vmx y la pendiente se define
como Km/Vmx. Ese grfico se conoce como grfico del doble rec- Eficiencia cataltica, kcat/Km
proco o de lineweaver-Burk (fig. 8-6). Establecer el trmino y de la Mediante qu medida se deben cuantificar y comparar la eficiencia
ecuacin (36) igual a cero y resolver para x, revela que la intersec- de enzimas diferentes, sustratos diferentes para una enzima dada,
cin x es 1/Km. y la eficiencia con la cual una enzima cataliza una reaccin en las

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 captulo 8 Enzimas: cintica 69

direcciones hacia adelante y hacia atrs? Si bien la capacidad mxi- y

ma de una enzima dada para convertir sustrato en producto es im-
portante, los beneficios de una kcat alta slo pueden obtenerse si la k1
[S ] = Kd (43)
Km es suficientemente baja. De este modo, la eficiencia cataltica de k 1
enzimas se expresa mejor en trminos de la proporcin de estas dos
constantes cinticas, kcat/Km. Por ende, 1/Km slo aproxima 1/Kd en condiciones en las cuales la
Para ciertas enzimas, una vez que el sustrato se une al sitio ac- asociacin y disociacin del complejo ES son rpidas en compara-
tivo, se convierte en producto y se libera con tanta rapidez como cin con la catlisis. Para las muchas reacciones catalizadas por en-
para hacer a tales eventos efectivamente instantneos. Para estos ca- zima para las cuales k1 + k2 no es aproximadamente igual a k1,
talticos tan eficientes, el paso limitante es la formacin del comple- 1/Km subestimar 1/Kd.
jo ES. Se dice que esas enzimas estn limitadas por difusin, o que
son perfectas desde el punto de vista cataltico, puesto que el ndice
de catlisis ms rpido posible est determinado por el ndice al cual La ecuacin de Hill describe la conducta
las molculas se mueven o difunden a travs de la solucin. Los de enzimas que muestran unin
ejemplos de enzimas para las cuales kcat/Km se aproxima al lmite de cooperativa de sustrato
difusin de 108109 M1s1 incluyen la triosafosfato isomerasa, anhi- Si bien casi todas las enzimas despliegan la cintica de saturacin
drasa carbnica, acetilcolinesterasa y adenosina desaminasa. simple descrita en la figura 8-4, y se describen de manera adecuada
La naturaleza a menudo sortea las limitaciones sobre kcat/Km mediante la expresin de Michaelis-Menten, algunas se unen a sus
impuestas por la difusin al montar grupos de enzimas relacionadas sustratos de una manera cooperativa, anloga a la unin de oxgeno
para formar complejos de mltiples enzimas. Las relaciones geom- por la hemoglobina (cap. 6). La conducta cooperativa es una propie-
tricas de las enzimas en estos complejos son tales que no se permite dad exclusiva de enzimas multimricas que unen sustrato en mlti-
que los sustratos y productos se difundan hacia la solucin de volu- ples sitios.
men sino hasta que el ltimo paso en la secuencia de pasos catalti- Para enzimas que despliegan cooperacin positiva en la unin
cos est completo. La cido graso sintetasa extiende este concepto de sustrato, la forma de la curva que relaciona los cambios en vi con
un paso ms all al fijar de manera covalente el sustrato a una cade- los cambios en [S] es sigmoidea (fig. 8-7). Ni la expresin de Mi-
na de biotina que rota un sitio activo a otro dentro del complejo chaelis-Menten ni sus grficos derivados pueden usarse para eva-
hasta que se completa la sntesis de una molcula de cido palmtico luar cintica cooperativa. Por ende, los enzimlogos emplean una
(cap. 23). representacin grfica de la ecuacin de Hill que en su origen fue
obtenida para describir la unin cooperativa de O2 por la hemoglo-
La Km puede aproximar una constante bina. La ecuacin (44) representa la ecuacin de Hill dispuesta en
una forma que predice una lnea recta, donde k es una constante
de unin compleja.
La afinidad de una enzima por su sustrato es la inversa de la cons-
tante de disociacin Kd para la disociacin del complejo de enzima- log v i
= n log [S] log k
sustrato ES. Vmx v i (44)

k

E+S 1
ES (38) La ecuacin (44) declara que cuando [S] es bajo en comparacin
k 1
con k, la velocidad de reaccin inicial aumenta como la ensima
potencia de [S].
k 1
Kd = (39)
k1

Dicho de otra manera, mientras menor es la tendencia a disociarse

de la enzima y su sustrato, mayor es la afinidad de la enzima por su
sustrato. Si bien la constante de Michaelis Km a menudo aproxima la
constante de disociacin Kd, esto de ningn modo siempre es as.
Para una reaccin catalizada por enzima tpica,
k

E+S 1
ES k
2
E+P (40) vi
k 1

el valor de [S] que da vi = Vmx/2 es

k 1 + k 2
[S ] = = Km (41)
k1
0 [S]
Cuando k1 >> k2, entonces
FIGURA 8-7 Representacin de una cintica de saturacin de
k 1 + k 2 k 1 (42) sustrato sigmoidea.

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 70 SEccIN I Estructuras y funciones de protenas y enzimas

1 Los inhibidores competitivos tpicamente

vi semejan sustratos
0 Pendiente = n
Los efectos de los inhibidores competitivos pueden superarse al au-
mentar la concentracin de sustrato. Con mayor frecuencia, la inhi-
bicin competitiva del inhibidor (I) se une a la porcin de unin a
Log

1 sustrato del sitio activo, lo que bloquea el acceso por el sustrato. Por
ende, las estructuras de casi todos los inhibidores competitivos cl-
sicos tienden a asemejarse a las estructuras de un sustrato y, as, se
4 S50 3 llaman anlogos de sustrato. La inhibicin de la enzima succinato
Log [S] deshidrogenasa por el malonato ilustra la inhibicin competitiva
por un anlogo de sustrato. La succinato deshidrogenasa cataliza la
FIGURA 8-8 Representacin grfica de una forma lineal de la eliminacin de un tomo de hidrgeno de cada uno de los dos car-
ecuacin de Hill usada para evaluar S50, la concentracin de sustrato bonos metileno del succinato (fig. 8-9). Tanto el succinato como su
que produce la mitad de la velocidad mxima, y el grado de
anlogo estructural malonato (OOCCH2COO) pueden unir-
cooperacin n.
se al sitio activo de la succinato deshidrogenasa, lo que forma un
complejo ES o uno EI, respectivamente. Sin embargo, dado que el
malonato slo contiene un tomo de metileno, no puede pasar por
deshidrogenacin. La formacin y disociacin del complejo EI es
Un grfico de log vi/(Vmx vi) contra log[S] da una lnea rec-
un proceso dinmico descrito por
ta (fig. 8-8), donde la pendiente de la lnea n es el coeficiente de
Hill, y un parmetro emprico cuyo valor est en funcin del n- 1 k
E+I
mero, la clase y la fuerza de las interacciones de los sitios de unin
EI
k
(45)
1

a sustrato mltiples sobre la enzima. Cuando n = 1, todos los sitios para la cual la constante de equilibrio Ki es
de unin se comportan de manera independiente, y se observa
conducta cintica de Michaelis-Menten simple. Si n es de ms de 1, [E ][I] ki
se dice que la enzima muestra cooperacin positiva. La unin de Ki = = (46)
sustrato a un sitio aumenta entonces la afinidad de los sitios res-
[E I] k i

tantes para unin a sulfato adicional. Mientras mayor es el valor En efecto, un inhibidor competitivo acta al disminuir el nmero
para n, ms alto es el grado de cooperacin, y ms sigmoideo ser de molculas de enzima libres disponibles para unin a sustrato,
el grfico de vi contra [S]. Una perpendicular trazada desde el pun- esto es, para formar ES y, as, finalmente para formar producto,
to donde el trmino y log vi/(Vmx vi) es cero interseca el eje x en como se describe a continuacin:
una concentracin de sustrato llamada S50, la concentracin de
sustrato que da por resultado la mitad de la velocidad mxima. De
este modo, S50 es anloga a la P50 para la unin de oxgeno a hemo-
globina (cap. 6).

EL ANLISIS CINTICO DISTINGUE

ENTRE INHIBICIN COMPETITIVA Un inhibidor competitivo y sustrato ejercen efectos recprocos
sobre la concentracin de los complejos EI y ES. Dado que la forma-
Y NO COMPETITIVA cin de complejos ES elimina la enzima libre disponible para com-
Los inhibidores de las actividades catalticas de enzimas propor- binarse con el inhibidor, el aumento de [S] disminuye la concentra-
cionan tanto agentes farmacolgicos como recursos de investiga- cin del complejo EI y aumenta la velocidad de reaccin. El grado al
cin para estudiar el mecanismo de accin de las enzimas. La fuer- cual [S] debe aumentarse para superar por completo la inhibicin
za de la interaccin entre un inhibidor y una enzima depende de depende de la concentracin del inhibidor presente, su afinidad por
las fuerzas importantes en la estructura de protena y la unin la enzima, Ki, y la afinidad, Km, de la enzima por su sustrato.
de ligando (enlaces de hidrgeno, interacciones electrostticas, in-
teracciones hidrofbicas y fuerzas de van der Waals; cap. 5). Los
inhibidores pueden clasificarse con base en su sitio de accin en la
enzima, en si producen modificacin qumica de la enzima, o en
los parmetros de cintica sobre los cuales influyen. Los compues- H
tos que imitan el estado de transicin de una reaccin catalizada
COO COO
por enzima (anlogos de estado de transicin) o que aprovechan la H C 2H H C

maquinaria cataltica de una enzima (inhibidores basados en me-

OOC C H
Succinato

OOC C H
canismo) pueden ser inhibidores en particular potentes. Desde el H
deshidrogenasa
punto de vista cintico, se distinguen dos clases de inhibidores con Succinato Fumarato
base en si el aumento de la concentracin de sustrato supera o no
la inhibicin. FIGURA 8-9 Reaccin de succinato deshidrogenasa.

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 captulo 8 Enzimas: cintica 71

Los grficos del doble recproco facilitan Para la inhibicin no competitiva simple, E y EI poseen afini-
dad idntica por el sustrato, y el complejo EIS genera producto a un
la evaluacin de inhibidores
ndice insignificante (fig. 8-11). La inhibicin no competitiva ms
Los grficos del doble recproco distinguen entre inhibidores com- compleja ocurre cuando la unin del inhibidor afecta la afinidad
petitivos y no competitivos, y simplifican la evaluacin de constan- aparente de la enzima por el sustrato, lo que hace que las lneas se
tes de inhibicin. La vi se determina a varias concentraciones de intersequen en el tercero o cuarto cuadrantes de un grfico del do-
sustrato tanto en presencia como en ausencia de inhibidor. Para la ble recproco (que no se muestra). Si bien ciertos inhibidores mues-
inhibicin competitiva clsica, las lneas que conectan los puntos tran caractersticas de una mezcla de inhibicin competitiva y no
experimentales convergen en el eje y (fig. 8-10). Dado que la inter- competitiva, la evaluacin de estos inhibidores va ms all del obje-
seccin y es igual a 1/Vmx, este modelo indica que cuando 1/[S] se tivo de este captulo.
aproxima a 0, vi es independiente de la presencia de inhibidor. Sin
embargo, note que la interseccin en el eje x no vara con la concen-
tracin del inhibidor y que puesto que 1/Km es de menor tamao Grfico de Dixon
que 1/Km, Km (la Km aparente), se hace ms grande en presencia A veces se emplea como una alternativa para el grfico de Li-
de concentraciones cada vez mayores del inhibidor. De este modo, neweaver-Burk, para determinar constantes de inhibicin. La velo-
un inhibidor competitivo no tiene efecto sobre Vmx pero aumen- cidad inicial (vi) se mide a varias concentraciones de inhibidor, pero
ta Km, la Km aparente para el sustrato. Para la inhibicin competi- a una concentracin fija de sustrato (S). Para un inhibidor competi-
tiva simple, la interseccin en el eje x es tivo o no competitivo simple, un grfico de 1/vi contra la concentra-
cin del inhibidor [I] da una lnea recta. El experimento se repite a
1 [I] diferentes concentraciones fijas de sustratos. El conjunto de lneas
x = 1 + (47)
Km Ki resultantes interseca a la izquierda del eje y. Para inhibicin compe-
titiva, una perpendicular trazada hacia el eje x negativo desde el
Una vez que Km se ha determinado en ausencia de inhibidor, Ki punto de interseccin de las lneas da Ki (fig. 18-12, arriba). Para
puede calcularse a partir de la ecuacin (47). Los valores de Ki se inhibicin no competitiva la interseccin del eje x negativo es Ki
usan para comparar diferentes inhibidores de la misma enzima. (fig. 8-12, abajo). En las publicaciones farmacuticas a menudo se
Mientras ms bajo es el valor para Ki, ms eficaz es el inhibidor. Por emplean grficos de Dixon para evaluar la potencia comparativa
ejemplo, los frmacos estatina que actan como inhibidores compe- de inhibidores competitivos.
titivos de la HMG-CoA reductasa (cap. 26) tienen valores de Ki de
varios rdenes de magnitud ms bajos que la Km para el sustrato
HMG-CoA. IC50
Una alternativa menos rigurosa, pero de uso frecuente, para Ki
como una medida de la potencia inhibidora es la concentracin de
Los inhibidores no competitivos simples inhibidor que produce inhibicin de 50%, Ic50. Al contrario de la
disminuyen Vmx pero no afectan Km constante de disociacin de equilibrio Ki, el valor numrico de IC50
En la inhibicin no competitiva, la unin del inhibidor no afecta la vara en funcin de las circunstancias especficas de la concentra-
unin de sustrato, por ende, es factible la formacin de complejos cin de sustratos, etc., bajo la cual se determina.
tanto EI como EIS. Sin embargo, si bien el complejo inhibidor de
enzima an puede unirse a sustrato, su eficiencia para transformar
sustrato en producto, reflejada por Vmx, est disminuida. Los inhi- Inhibidores estrechamente unidos
bidores no competitivos unen enzimas en sitios distintos del sitio de Algunos inhibidores se unen a enzimas con afinidad tan alta, Ki
unin a sustrato y, por lo general, muestran poca o ninguna seme- 109 M, que la concentracin de inhibidor requerida para medir Ki
janza estructural con el sustrato. cae por debajo de la concentracin de enzima tpicamente presente

1
vi
r
do
bi

or
hi

dor id
In

bi b
inhi hi
+

1 No In r
K m mx +
hi bido
K1 1
No in
m Vmx
0 1 Vmx
[S]

FIGURA 8-10 Grfico de Lineweaver-Burk de inhibicin

competitiva. Note la completa distensin de inhibicin a [S] alta FIGURA 8-11 Grfico de Lineweaver-Burk para inhibicin no
(esto es, 1/[S] baja). competitiva simple.

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 72 SEccIN I Estructuras y funciones de protenas y enzimas

1 con un residuo esencial desde el punto de vista cataltico, y bloquea

vi
la funcin del mismo. La especificidad y la persistencia de inhibido-
res suicidas, que son tanto especficos para enzima como no reacti-
[S]
vos fuera de los confines del sitio activo de la enzima, los hacen
promisorios para la creacin de frmacos especficos para enzima.
El anlisis cintico de inhibidores suicidas est ms all del objetivo
de este captulo. Ni el mtodo de Lineweaver-Burk ni el de Dixon
son aplicables porque los inhibidores suicidas violan una condicin
Ki [I] limtrofe clave comn a ambos mtodos, a saber, que la actividad de
la enzima no disminuye en el transcurso de la valoracin.
1
vi

[S] CASI TODAS LAS REACCIONES

CATALIZADAS POR ENZIMA
COMPRENDEN DOS O MS SUSTRATOS
Si bien muchas enzimas tienen un sustrato nico, muchas otras tie-
Ki [I]
nen dos y a veces ms sustratos y productos. Los principios
fundamentales, antes comentados, si bien se ilustran para enzimas
FIGURA 8-12 Aplicaciones de los grficos de Dixon. Arriba: con un sustrato nico, tambin aplican a enzimas con mltiples sus-
inhibicin competitiva, estimacin de Ki. Abajo: inhibicin no tratos. Sin embargo, las expresiones matemticas utilizadas para
competitiva, estimacin de Ki. evaluar reacciones de mltiples sustratos son complejas. Aun cuan-
do un anlisis detallado del rango completo de reacciones de mlti-
ples sustratos va ms all del objetivo de este captulo, a continua-
en una valoracin. En estas circunstancias, una fraccin importante cin se consideran algunos aspectos comunes de conducta cintica
del inhibidor total puede estar presente como un complejo EI. De para reacciones de dos sustratos y dos productos (llamadas reaccio-
ser as, esto viola la suposicin, implcita en cintica de estado esta- nes Bi-Bi).
ble clsica, de que la concentracin de inhibidor libre es indepen-
diente de la concentracin de enzima. El anlisis cintico de estos
inhibidores muy unidos requiere ecuaciones cinticas especializa- Reacciones secuenciales
das que incorporan la concentracin de enzima para estimar Ki o o de desplazamiento nico
IC50, y para distinguir entre inhibidores competitivos y no competi- En reacciones secuenciales, ambos sustratos deben combinarse con
tivos estrechamente unidos. la enzima para formar un complejo ternario antes de que pueda pro-
ceder la catlisis (fig. 8-13, arriba). Las reacciones secuenciales a
veces reciben el nombre de reacciones de desplazamiento nico
Los inhibidores irreversibles envenenan porque el grupo que se est transfiriendo por lo general pasa de ma-
enzimas nera directa, en un solo paso, desde un sustrato hacia el otro. Las
En los ejemplos anteriores, los inhibidores forman un complejo di- reacciones Bi-Bi secuenciales pueden distinguirse ms con base en
sociable, dinmico, con la enzima; por ende, la enzima por comple- si los dos sustratos se agregan en un orden al azar o en uno forzoso.
to activa puede recuperarse con tan slo eliminar el inhibidor del Para reacciones de orden al azar, el sustrato A o el B puede combi-
medio circundante. Sin embargo, varios otros inhibidores actan de narse primero con la enzima para formar un complejo EA o uno EB
manera irreversible al producir modificacin qumica de la enzima. (fig. 8-13, centro). En reacciones de orden forzoso, A debe combi-
Estas modificaciones, por lo general, comprenden hacer o romper narse primero con E antes de que B pueda combinarse con el com-
enlaces covalentes con residuos aminoacilo esenciales para la unin plejo EA. Una explicacin para un mecanismo de orden forzoso es
a sustrato, catlisis o mantenimiento de la conformacin funcional que la adicin de A induce un cambio conformacional en la enzi-
de la enzima. Dado que estos cambios covalentes son hasta cierto ma que alinea residuos que reconocen B y se unen al mismo.
punto estables, una enzima que ha sido envenenada por un inhibi-
dor irreversible, como un tomo de metal pesado o un reactivo aci-
lante, permanece inhibida incluso despus de eliminar del medio Reacciones de ping-pong
circundante el inhibidor que resta. El trmino ping-pong aplica a mecanismos en los cuales uno o
ms productos son liberados desde la enzima antes de que se hayan
aadido todos los sustratos. Las reacciones de ping-pong compren-
Inhibicin basada en mecanismo den catlisis covalente y una forma transitoria, modificada, de la
Los inhibidores basados en mecanismo o suicidas son anlogos enzima (fig. 7-4). Las reacciones Bi-Bi de ping-pong son reacciones
de sustrato especializados que contienen un grupo qumico que de doble desplazamiento. El grupo que se transfiere primero es
puede transformarse mediante la maquinaria cataltica de la enzima desplazado del sustrato A por la enzima para formar productos P y
blanco. Despus de la unin al sitio activo, la catlisis por la enzi- una forma modificada de la enzima (F). La transferencia de grupo
ma genera un grupo muy reactivo que forma un enlace covalente subsiguiente desde F hacia el segundo sustrato B, que forma el pro-

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 captulo 8 Enzimas: cintica 73

A B P Q [S2]
en aumento

E EA EAB-EPQ EQ E

A B P Q

EA EQ 1
vi
E EAB-EPQ E

EB EP

B A Q P

A P B Q
1
[S1]
E EA-FP F FB-EQ E
FIGURA 8-14 Grfico de Lineweaver-Burk para una reaccin de
FIGURA 8-13 Representaciones de tres clases de mecanismos de
ping-pong de dos sustratos. Un aumento de la concentracin de un
reaccin Bi-Bi. Las lneas horizontales representan la enzima. Las flechas
sustrato (S1) mientras que de la del otro sustrato (S2) se mantiene
indican la adicin de sustratos y la salida de productos. Arriba: una
constante, cambia las intersecciones x y y, no as la pendiente.
reaccin Bi-Bi ordenada, caracterstica de muchas oxidorreductasas
dependientes de NAD(P)H. Centro: una reaccin Bi-Bi al azar,
caracterstica de muchas cinasas y algunas deshidrogenasas. Abajo: una
reaccin de ping-pong, caracterstica de aminotransferasas y serina
proteasas.
EL CONOCIMIENTO DE LA CINTICA,
EL MECANISMO Y LA INHIBICIN
ducto Q y regenera E, constituye el segundo desplazamiento (fig.
DE ENZIMAS, AYUDAN A LA CREACIN
8-13, abajo).
DE FRMACOS
Casi todas las reacciones Bi-Bi se conforman Muchos frmacos actan como inhibidores
a la cintica de Michaelis-Menten de enzimas
Casi todas las reacciones Bi-Bi se conforman a una forma un poco El objetivo de la farmacologa es identificar agentes que pueden
ms compleja de cintica de Michaelis-Menten, en la cual Vmx se 1. Destruir o alterar el crecimiento, la invasividad o el
refiere al ndice de reaccin que se alcanza cuando ambos sustratos desarrollo de agentes patgenos invasores
estn presentes a concentraciones que producen saturacin. Cada 2. Estimular mecanismos de defensa endgenos
sustrato tiene su propio valor Km caracterstico, que corresponde a 3. Suspender u obstaculizar procesos moleculares aberrantes
la concentracin que da la mitad de la velocidad mxima cuando el desencadenados por estmulos genticos, ambientales o
segundo sustrato est presente a concentraciones que producen sa- biolgicos, con trastorno mnimo de las funciones celulares
turacin. Al igual que para las reacciones de un solo sustrato, pue- normales del husped.
den usarse grficos del doble recproco para determinar Vmx y Km.
La vi se mide como una funcin de la concentracin de un sustrato En virtud de sus diversas funciones fisiolgicas y alto grado de se-
(el sustrato variable), mientras que la concentracin del otro sustra- lectividad de sustrato, las enzimas constituyen blancos naturales
to (el sustrato fijo) se mantiene constante. Si las lneas obtenidas para la creacin de frmacos que son tanto potentes como especfi-
para varias concentraciones de sustrato fijo se grafican en el mismo cos. Los frmacos estatina, por ejemplo, disminuyen la produccin
grfico, es posible distinguir entre una enzima ping-pong, que da de colesterol al inhibir la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A
lneas paralelas, y un mecanismo secuencial, que da un modelo reductasa (cap. 26), mientras que la emtricitabina y el tenofovir di-
de lneas que se intersecan (fig. 8-14). soproxil fumarato bloquean la replicacin del VIH al inhibir una
Los estudios de inhibicin del producto se usan para comple- inverso transcriptasa viral (cap. 34). La farmacoterapia de la hiper-
mentar anlisis cinticos y distinguir entre reacciones Bi-Bi ordena- tensin a menudo incluye la administracin de un inhibidor de la
das y al azar. Por ejemplo, en una reaccin Bi-Bi ordenada al azar, enzima convertidora de angiotensina, lo que disminuye la concen-
cada producto ser un inhibidor competitivo al margen de cul sus- tracin de angiotensina II, un vasoconstrictor (cap. 42).
trato es designado como el sustrato variable. Sin embargo, para un
mecanismo secuencial (fig. 8-13, arriba), slo el producto Q dar el
modelo indicativo de inhibicin competitiva cuando A es el sustrato
La cintica enzimtica define condiciones
variable, mientras que slo el producto P producir este modelo con de investigacin apropiadas
B como el sustrato variable. Otras combinaciones de inhibidor del La cintica enzimtica tiene un papel crucial en el descubrimiento
producto y sustrato variable producirn formas de inhibicin no de frmacos. El conocimiento de la conducta cintica de la enzi-
competitiva compleja. ma de inters se necesita, ante todo, para seleccionar condiciones

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 74 SEccIN I Estructuras y funciones de protenas y enzimas

de valoracin apropiadas que detectan con facilidad la presencia de concentracin de ion hidrgeno, la concentracin de enzima,
un inhibidor. La concentracin de sustrato, por ejemplo, debe ajus- la concentracin de sustrato y los inhibidores, afectan los ndices de
tarse de modo que se genere suficiente producto para permitir la reacciones catalizadas por enzima.
deteccin fcil de actividad de la enzima sin que sea tan alta que En la medicin del ndice de una reaccin catalizada por enzima por
enmascare la presencia de un inhibidor. Adems, la cintica enzi- lo general se emplean condiciones de ndice iniciales, para las cuales
mtica proporciona el medio para cuantificar y comparar la poten- la ausencia esencial de producto impide la reaccin inversa.
cia de diferentes inhibidores y definir su modo de accin. Los inhi- Las formas lineales de la ecuacin de Michaelis-Menten simplifican
bidores no competitivos son, en particular, deseables, porque en la determinacin de Km y Vmx.
contraste con los competitivos sus efectos nunca pueden supe- Una forma lineal de la ecuacin de Hill se usa para evaluar la cintica
rarse por completo mediante incrementos de la concentracin de de unin a sustrato cooperativa mostrada por algunas enzimas
sustrato. multimricas. La pendiente n, el coeficiente de Hill, refleja el nmero,
la naturaleza y la fuerza de las interacciones de los sitios de unin a
sustrato. Un valor de n de ms de 1 indica cooperacin positiva.
Muchos frmacos se metabolizan in vivo Los efectos de inhibidores competitivos simples, que por lo general
semejan sustratos, se superan al aumentar la concentracin del
La creacin de frmacos a menudo comprende ms que la evalua-
sustrato. Los inhibidores no competitivos simples disminuyen la Vmx
cin cintica de la interaccin de inhibidores con la enzima blanco. pero no afectan la Km.
Enzimas presentes en el paciente o en el agente patgeno actan Para inhibidores competitivos y no competitivos simples, la constante
sobre frmacos, dicho proceso se denomina metabolismo de fr- inhibitoria Ki es igual a la constante de disociacin de equilibrio para
maco. Por ejemplo, la penicilina y otros antibiticos -lactmicos el complejo de enzima-inhibidor relevante. Un trmino ms simple y
bloquean la sntesis de la pared celular en bacterias al envenenar de menos riguroso para evaluar la eficacia de un inhibidor es la IC50, la
manera irreversible la enzima alanil alanina carboxipeptidasa-trans- concentracin del inhibidor que produce inhibicin de 50% en las
peptidasa. Sin embargo, muchas bacterias producen -lactamasas circunstancias particulares del experimento.
que hidrolizan la funcin -lactmica crucial en la penicilina y fr- Los sustratos pueden aadirse en un orden al azar (cualquier sustrato
macos relacionados. Una estrategia para superar la resistencia al puede combinarse primero con la enzima) y en un orden forzoso (el
antibitico resultante es administrar de manera simultnea un inhi- sustrato A debe unirse antes que el sustrato B).
bidor de -lactamasa y un antibitico -lactmico. En reacciones de ping-pong, uno o ms productos se liberan a partir
Tambin se requiere transformacin metablica para convertir de la enzima antes de que se hayan aadido todos los sustratos.
un precursor farmacolgico inactivo, o profrmaco, en su forma La cintica enzimtica aplicada facilita la identificacin y
biolgicamente activa (cap. 53). El cido 2-desoxi-5-fluorouridli- caracterizacin de frmacos que inhiben de manera selectiva enzimas
co, un potente inhibidor de la timidilato sintasa, un blanco comn especficas. De este modo, la cintica enzimtica desempea una
de la quimioterapia de cncer, se produce a partir de 5-fluorouracilo funcin crucial en el descubrimiento de frmacos, en la
por medio de una serie de transformaciones enzimticas catalizadas farmacodinmica comparativa, y en la determinacin del modo de
por una fosforribosil transferasa y las enzimas de la va de salvamen- accin de frmacos.
to de desoxirribonuclesido (cap. 33). El diseo y la administracin
eficaces de profrmacos requieren conocimiento de la cintica y de
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