PROCESO ANALITICO DE PROTEINAS TOTALES

Departamento de Versin N 01 -15

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Bioqumica

NOMBRE DEL DETERMINACION DE FECHA: 30 de Septiembre 2016

PROCEDIMIENTO PROTEINAS TOTALES CODIGO: PRT-DIDAP-.
Descripcin cuantitativa, qumica de muestras sanguneas, utilizando
OBJETIVO
procedimientos estandarizados generando resultados comparables y
confiables.
PROPSITO Estandarizar el proceso de protenas totales.

Debe ser cumplido por el personal Tecnlogo Mdico de la Seccin de

Qumica clnica del Servicio de Bioqumica del Instituto nacional de Salud del
ALCANCE
Nio.

1. DL N1161, Ley de Organizacin y funciones MINSA

2. Ley N 26642 Ley General de salud
MARCO LEGAL 3. Ley N 27657 Ley del ministerio de Salud
4. NTS N 072 MINSA/DGSP Norma Tcnica de Salud de la Unidad
Productora de Servicios de Patolgica.

INDICES DE PERFORMANCE
UNIDAD DE
INDICADOR FUENTE RESPONSABLE
MEDIDA

Porcentaje de resultados Porcentaje (%) Personal Tecnlogo

Registro de Solicitudes
patolgicos vs N de Mdico del rea
exmenes analizados Qumica clnica

NORMAS

1. Resolucin Ministerial N 526-2011 / MINSA, aprueba la Norma para la Elaboracin de

Documentos Normativos del Ministerio de Salud .
2. Resolucin Ministerial N 519 2006 / MINSA, aprueba el documento tcnico:
"Sistema de Gestin de la Calidad en Salud"

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DESCRIPCIN DEL PROCEDIMIENTO

1. INICIO: Recepcin de la muestra sanguinea considerando las condiciones adecuadas para su

proceso analtico. VER ANEXO..
2. Verificar los datos de la solicitud con la muestra del paciente.
3. Anotar la hora de recepcin de la muestra.
4. Centrifugar despus de 30 minutos de la flebotoma.
5. Separar el suero en alcuotas de 1militro y rotularlos.
6. Trasvasar las muestras sricas a las cubetas propias del Konelab.

EXAMEN MICROSCPICO : RECUENTO CITOLGICO Y DIFERENCIAL .

7. Para el recuento citolgico: Colocar 10 ul del colorante cristal violeta al 0.2% en un tubo plstico
de 2.5 ml y agregar 90 ul del fluido corporal (sin centrifugar),
8. Colocar 10ul del homogenizado en la cmara neubauer y dejar reposar 2 minutos y hacer el
recuento.
9. Centrifugar las muestras a 2500 rpm x 3 minutos. (ver Gua de Uso de la Centrifuga).
10. Describir las caractersticas fsicas de la muestra, sobrenadante (aspecto, color) y el sedimento.
11. Recuento diferencial: colocar una gota de azul de metileno al sedimento, homogenizar y esperar
10 minutos para la coloracin de los leucocitos.
12. Cargar en una lmina portaobjeto y colocar una lmina cubreobjetos de 22x22 mm.
13. Leer la coloracin con un aumento de 100x para la cuantificacin de Polimorfos y
Mononucleares. ( ver Gua de Uso del Microscopio de Cabezales)
14. Utilizar el sobrenadante para analizar las pruebas bioqumicas: protenas, glucosa y los analitos
que requiera el medico solicitante, ( ver manual de control de calidad e instructivo del equipo
automatizado CT 600i)
15. FIN validacin analtica y emisin del resultado.

ENTRADAS
NOMBRE FUENTE FRECUENCIA TIPO
CPA CPA Diaria Proceso analtico

SALIDAS
NOMBRE DESTINO FRECUENCIA TIPO
Reporte de Resultado Historia clnica Diaria Proceso analtico
analtico validado

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ANEXOS:
1. ANEXO DE RECEPCION DE MUESTRAS
2. Anexo N1: Descripcin Macroscpica de los Fluidos Corporales
3. Anexo N2: Descripcin Microscpica de los Fluidos Corporales
4. Anexo N3: Descripcin Qumica de los Fluidos Corporales.
5. Anexo N4: Descripcin del procedimiento para Liquido Sinovial
6. Anexo N5:Flujograma
7. Anexo N 6: Cuadros comparativos de fluidos biolgicos
.

REGISTROS:

1.-Solicitud de anlisis

DEFINICIONES:

Fluido Corporal : Todas las secreciones o Lquidos Biolgicos, Fisiolgicos o Patolgicos que se
producen en el organismo .
Cmara de Neubauer: Son instrumentos de precisin para medicin ,se usa para el recuento
clulas en un medio lquido, que puede ser; lquido cefalorraqudeo, lquido sinovial y otros fluidos
corporales.
Validacion Analitica: La validacin de un mtodo analtico es el proceso por el cual se establece,
mediante estudios de laboratorio, que las caractersticas de desempeo del mtodo cumplen con
los requisitos para las aplicaciones analticas previstas (Referencia: USP 31 NF 26, Captulo
General Validacin de mtodos farmacopicos).

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ANEXO N1

DESCRIPCIN MACROSCPICA DE LOS FLUIDOS CORPORALES

PROCESAMIENTO DE TODO FLUIDO BIOLGICO:

Cualquier fluido que llega al servicio de bioqumica debe procesarse antes de los 30 minutos de su
extraccin, realizando primero el examen macroscpico, luego el examen citolgico, examen
qumico, validacin analtica y reporte final.

Examen Macroscopico:
A continuacin los parmetros de descripcin macroscpica de los fluidos biolgicos.
Aspecto: Transparente, ligeramente turbio, turbio, muy turbio, purulento, etc.
Color: Incoloro, blanquecino, ligeramente blanquecino, xantocrmico, amarillo, amarillo
claro, etc.
Grumos: Se reportar como cruces de 1+ a 3+; etc.
Retculo: Se reportar como cruces 1+ a 3+; etc. (al microscopio se observar como una
malla)
Fibrina: Se reportar como cruces 1+ a 3+; etc.
Volumen: Cantidad remitida.
Parmetros para la determinar la turbidez : Para determinar la turbidez emplear papel
blanco con letras negras
Transparente: Al colocar el frasco delante del papel se reconoce fcilmente las letras.
Una manera ms prctica es observar el frasco con el fluido biolgico frente a una ventana
de vidrio presentando una perfecta claridad.
Ligeramente turbio: Se observar que hay letras en el papel pero sern un poco difcil de
reconocer.
Turbio: Las letras son difciles de reconocer, se vern como manchas negras.
Muy turbio: cuando no deja pasar la luz y no se observan las letras.

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Trminos usados en el laboratorio para la descripcin de los Fluidos Corporales :

ASPECTO COLOR CENTRIFUGADO (Sedimento )

I : Incoloro B Bq : Botn blanquecino

T : Transparente
Tu : Turbio
X : Xantocromico Pb Bq : Peq. botn blaquecino.
L Tu : Lig. Turbio LX : Lig. Xantocromico. B Hem : Botn hemtico
Pur : Purulento Amar : Amarillo Pbh : Peq. botn hemtico.
L Pur : Lig. Purulento A Cl : Amarillo Claro H Bq : Halo blanquecino
Hem : Hemtico Bq. : Blanquecino
L Hem : Lig. Hemtico
Hemorr : Hemorrgico
L Bq : Lig. Blanquecino.
M Tu : Lechoso

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ANEXO N2:

DESCRIPCIN MICROSCPICA DE LOS FLUIDOS CORPORALES

Recuento Citolgico

Debe efectuarse en forma rutinaria dentro de la primera media hora de extraccin, mientras las
clulas permanezcan en suspensin y antes que se formen cogulos o fibrina que atrapen los
leucocitos y den falsos negativos, para ello es muy importante homogenizar bien la muestra. El
examen citolgico debe hacerse con toda exactitud especialmente cuando el nmero de clulas
esta aumentado, como sucede con los lquidos ligeramente turbios, turbios, etc.

Materiales y reactivos:
Cmara de Neubauer.
Pipeta automatizada de 5 a 40 ul
Pipeta automatizada de 40 a 200 ul
Colorantes de Tincin

Cristal violeta al 0.2%.
Azul de metileno al 0.1%.
Procedimiento:
En un tubo de plstico colocar 10 L del colorante cristal violeta al 0.2%.
Agregar 90 L del fluido biolgico, previamente mezclado, y homogenizar bien. Dejar
reposar por 10 minutos.
Colocar 10L del homogenizado en la cmara de Neubauer, dejar reposar 2 minutos .
Realizar el recuento de glbulos blancos con el objetivo de 10 x.

Clculos para el recuento celular

Se contabilizan los leucocitos en los 9 cuadrados de la cmara neubauer . El nmero de leucocitos
total por mm3 es igual al nmero de leucocitos en los 9 cuadrados multiplicado por 1.23.
El factor 1.23 se obtiene de la siguiente manera:

() = 1 1
= 3 3
= 92
() =
= 92 0.1

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= 0.93
Para obtener el nmero de leucocitos en un mm 3, se busca un nmero que multiplicado por 0.9mm 3
nos resulte 1mm3. (Regla de tres simple)
1
= 1.11 0.93 1.11 = 13
0.9
Segn frmula:
NLeucocitos/3 = 1.11
10
NLeucocitos/mm3 = 1.11
9
NLeucocitos/mm3 = .
Con esta frmula se encuentra el nmero real de leucocitos por mm3.

OBSERVACION:

Hay que notar que los leucocitos cuando estn dentro de los valores normales casi el 100% son
linfocitos.
Cuando el fluido biolgico es turbio o muy turbio con una pleocitosis marcada con elementos
celulares iguales o mayor que en sangre, para el recuento se emplearn las diluciones , diluyendo
la muestra problema en 1/10; 1/20 con lquido de dilucin Turk. El nmero de leucocitos contados
en los 4 cuadrantes se multiplica por 25 o 50 segn la dilucin empleada.
Adems es de rutina realizar un examen directo en fresco para informar el porcentaje de leucocitos
aglutinados, porcentaje de leucocitos degenerados si lo hubiera, presencia de detritus celular,
hemates por campo, etc.
Cuando el fluido biolgico es hemorrgico o ligeramente hemtico antes de realizar el recuento
citolgico se har un examen directo en fresco sin cubreobjetos para reportar hemates por campo
y porcentaje de crenados si los hubiera.

1) Recuento de leucocitos de rutina con cristal violeta al 0.2%.

2) Recuento de hemates: con solucin Dacie, se realiza con la finalidad de corregir el contaje
de leucocitos, pues la sangre vertida en el lquido desfigura el contenido celular real. (segn
grfico).

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3) Tener presente la siguiente relacin: Por cada 700 hemates corresponde un leucocito
adicional. Entonces la cantidad de leucocitos contados en el fluido biolgico es:

= . .
Este tipo de correccin es vlido cuando el paciente tiene en sangre cifras normales de hemates
y leucocitos. No es vlido en pacientes anmicos ni leucmicos.
Otra frmula es:
() ()
=
()
Donde:
Leucocitos adicionales: Leucocitos adicionados al LCR a partir de una puncin traumtica.
Leucocitos (s): Recuento de leucocitos en sangre perifrica.
Hemates (o): Recuento de hemates en LCR.
Hemates (s): Recuento de hemates en sangre perifrica.

*Otro procedimiento:
Leucocitos:
380L de lquido de Turk.
20L de muestra (dilucin 1/20).

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Factor final es 50.

Hemates:
495L de reactivo de Dacie.
5L de muestra (dilucin 1/100).
Factor final es 5000.

Recuento Diferencial :

Consiste en clasificar los leucocitos en polimorfonucleares (PMN) o mononucleares (MN) hasta

llegar a un total de 100 leucocitos, luego se indica el porcentaje de cada uno de ellos. Si
encontramos clulas que no se diferencian en PMN o MN, la muestra debe ser enviada al
laboratorio de Patologa o indicar al mdico que lo enve para su correcta identificacin. En el
reporte se debe describir detalladamente las caractersticas de las clulas

Coloracin supravital: Es sencilla y fcil. Permite observar ntidamente los elementos y

diferenciarlos.
Tcnica: Despus de la centrifugacin en el sedimento se adiciona 1 gota de azul de
metileno, se homogeniza y se deja en bao mara aprox. 1 a 2 min si es LCR y 10 a 15 min
si es liquido pleural.
Con una micropipeta se extrae 20 ul y se coloca en una lmina portaobjetos y se cubre con
laminilla. Se observa en el microscopio con objetivo de 40x o 100x con aceite de inmersin.
Nota: Esta tcnica nos permite observar los leucocitos degenerados que se colorean ms
rpido que los leucocitos intactos.

ANEXO N3: DESCRIPCIN QUMICA DE LOS FLUIDOS CORPORALES

Para el examen qumico utilizamos el sobrenadante de los fluidos corporales.

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DETERMINACIN DE PROTENAS
Procedimiento:
1) Prueba cualitativa:
- En una lmina portaobjeto colocar 20L de cido sulfosalicilico al 10% (reactivo
precipitante).
- Agregar 20L del lquido biolgico. Mezclar y observar el grado de turbidez que nos guiar
para realizar la dilucin respectiva (1/2; 1/3; 1/5; 1/10; etc.).
- Los lquidos pleurales, asctico y pericrdico se procesan por el mtodo de Biuret, para
protenas totales.

2) Prueba cuantitativa: en Equipo Automatizado CT600i

FUNDAMENTO DEL METODO - Proti U/LCR

Las protenas presentes en la muestra reaccionan en medio acido con el complejo Rojo Pirogalol-
Molibdato originando un nuevo complejo coloreado que se cuantifica espectrofotomtricamente a
600nm.
* Linealidad: 150mg/dL. Cifras mayores diluir la muestra con agua destilada.

Sensibilidad del Mtodo

Puede ser usado en lquidos biolgicos tales como orina y lquido cefalorraqudeo donde la
concentracin de protenas con respecto a la del plasma baja como para determinarla por mtodos
empleados habitualmente para suero.

Mtodo de Control de Calidad

Procesar 2 niveles de un material de control de calidad (Proti U/LCR Control 2 niveles) con
concentraciones conocidas de protenas, con cada determinacin.

DETERMINACIN DE GLUCOSA:

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La concentracin de glucosa en todo fluido biolgico depende de su nivel en sangre, de la presencia

de grmenes pigenos y de la presencia de hemates.

FUNDAMENTO DEL MTODO:

Glucosa oxidasa enzimtica

LA glucosa es oxidada enzimticamente por la glucosa oxidasa en cido glucnico con liberacin
de perxido de hidrgeno. En una segunda reaccin la enzima peroxidasa cataliza la oxidacin de
un aceptor incoloro de oxgeno (cromgeno reducido) por el perxido de hidrgeno producido,
formando un producto coloreado (cromgeno oxidado). La intensidad de la reaccin de color es
directamente proporcional a la concentracin de glucosa.

* Linealidad: 500mg/dL. Cifras mayores diluir la muestra con agua destilada.

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ANEXO N4: DESCRIPCIN DEL PROCEDIMIENTO PARA LQUIDO SINOVIAL

TOMA DE MUESTRA:
Para la colecta de la muestra se necesita:
1. Tubo simple para el anlisis qumico e inmunobiolgico.
2. Tubo heparinizado con EDTA (cido etilendiaminotetracetico) u otros anticoagulantes
para el recuento celular.

EXAMEN MACROSCOPICO: Describe lo siguiente:

1. Volumen
2. Aspecto (puede leerse letra imprenta a travs de la muestra )
3. Color: amarillo plido o incolora.
4. Coagulo de fibrina: Examinar el lquido del tubo 1 despues de una hora para ver si se ha
formado coagulo.
Ausencia de coagulo= NORMAL
Cogulos eventuales se describen de 1 a 4 cruces, esto refleja dao de membrana
celular (inflamatorio) que permite el ingreso del fibringeno al espacio articular.
5. Viscosidad: Hacer que el lquido gotee de una jeringa , con cada gota forme un hilo
pegajoso , si es:
Por lo menos de 4cm = V.NORMAL
Menor de 4 cm = V.DISMINUIDA
Menor de 1 cm = V.MUY DISMINUIDA (indica disminucin de hialuronato)
6. Coagulacin de mucina: Aadir 0.1 ml del lquido del tubo 1 a 2 ml de cido actico al 5%
en un Becker , podr formarse:
Coagulo rodeado por solucin clara = BUENO
Coagulo blando en solucin turbia = REGULAR
Coagulo frgil en liquido nebuloso = DEFICIENTE (No formacin de coagulo con
escamas en suspensin)

EXAMEN MICROSCOPICO: Normal menos de 200 leucocitos x mm3.

Recuento Diferencial: 75% de MN, 25% o menos de PMN.
Los cristales se ven mediante luz polarizada.

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BIBLIOGRAFIA

1.-

2.-

3.-

4.-

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ANEXO N 5: Flujograma de Proceso Analtico para el procesamiento de Fluidos Corporales.

Verificacin Solicitar Nueva

solicitud- muestra Muestra

Si

No No
conforme Informar conforme
incongruencia
Si

Homogenizar y
alicuotar
muestra

Descripcin
Fsica (aspecto
y color)

Analisis
Bioquimico

Descripcion
Microscopica

Validacion
Analitica

Resultado Analtico
validado

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ANEXO N 6: CUADROS COMPARATIVOS DE FLUIDOS BIOLGICOS

VALORES REFERENCIALES EN L.C.R

RECUENTO
GRUPO ETAREO GLUCOSA PROTEINAS
CELULAR

RN Pretermino 0 25 / mm3 24 63 mg/dL 65 150 mg/dL

RN a Termino 0 22 / mm3 34 119 mg/dL 20 170 mg/dL
< 1 ao 0 30 / mm3
De 1 a 4 aos 0 20 / mm3
5 aos hasta
0 10 / mm3 40 80 mg/dL 5 40 mg/dL
Pubertad

Adulto 0 5 / mm3 50 80 mg/dL 15 45 mg/dL

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RECUENTO DIFERENCIAL DE L.C.R

RECUENTO RECIEN NACIDOS ADULTOS

DIFERENCIAL

Linfocitos 2-38% 6-99%

Monocitos 50-94% 3-37%

Neutrofilos 0-8% 0-2%

Referencia CLSI .Body fluids Analysis for Cellular composition Approved Guideline Document .H-
56 A .Vol 26 N26 Junio 2006.

CARACTERISTICAS DIFERENCIALES DE L.C.R SEGN PATOLOGIA

NORMAL MENINGITIS MENINGITIS MENINGITIS

PURULENTA TBC VIRAL
ASPECTO Claro Turbio Claro Claro
RECUENTO DE 0 - 10 500 10000 >250 <250
LEUCOCITOS (PMN) (Linfocitos) (Linfocitos)
(mm3)
GLUCOSA 45 80 <20 >40 50 80
(mg/dL)
PROTENAS 10 - 45 500 - 1200 50 - 500 30 - 50
(mg/dL)
CLORUROS 116 - 122 Normales o Disminuidos 116 122
(mmol/L) disminuidos

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RECUENTO DIFERENCIAL DEL LIQUIDO PLEURAL

PARAMETRO/ANALITO VALORES DE REFERENCIA

VOLUMEN 4 -12 mL

RECUENTO DIFERENCIAL:
Linfocitos 18-36 %
Neutrfilos 0-1%
Clulas Mesoteliales 0-2%

Referencia CLSI .Body fluids Analysis for Cellular composition Approved Guideline Document .H-
56 A .Vol 26 N26 Junio 2006.

VALORES NORMALES DE LIQUIDO PLEURAL

PARAMETRO/ANALITO VALORES DE REFERENCIA

PROTEINAS 1-2 g/dl
GLUCOSA
TRIGLICERIDOS
LDH < 50% del plasma

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REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS :

USP 31 NF 26, Captulo General Validacin de mtodos farmacopicos).

PAGINAS WEB :
http://celeromics.com/es/resources/docs/Articles/Conteo-Camara-Neubauer.pdf

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