Universidad de Jaén: Tesis Doctoral
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TESIS DOCTORAL
NUEVAS CONTRIBUCIONES AL
ANLISIS POR INYECCIN EN FLUJO
CONTINUO CON DETECCIN
ESPECTROSCPICA EN FASE SLIDA
PRESENTADA POR:
ANTONIO RUIZ MEDINA
DIRIGIDA POR:
DR. D. ANTONIO MOLINA DAZ
DRA. D MARA LUISA FERNNDEZ DE CRDOVA
ISBN 84-8439-011-X
NUEVAS CONTRIBUCIONES AL ANLISIS POR INYECCIN EN FLUJO
CONTINUO CON DETECCIN ESPECTROSCPICA EN FASE SLIDA
Ruiz Medina
Antonio
I.S.B.N 84-8439-011-X
Centro Facultad de Ciencias Experimentales
Departamento Qumica Fsica y Analtica
Nombre y apellidos del autor
Fecha de lectura
25 DE MARZO DE 1999
Direccin de la Tesis Dr. D. Antonio Molina Daz y Dra. D M Luisa Fernndez de Crdova
Presidente/a del Tribunal Dra. D Concepcin Snchez Pedreo
Vocales
Calificacin obtenida
SOBRESALIENTE CUM LAUDE
Resumen
ISBN: 84-8439-011-X
Los Directores:
A Pilar Ortega y Mara Jos Ayora, por ayudarme en todos los problemas
laborales del da a da que surgen en el laboratorio. Adems de compaeras son
amigas. No puedo olvidar tampoco a Juana Escudero y Natividad Ramos, por su
confianza, amistad y muestras de apoyo en todo momento.
A todos, gracias.
NDICE
OBJETO DEL TRABAJO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
CAPTULO I. INTRODUCCIN
1. Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2. Disoluciones e instrumentacin utilizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
3. Espectros de absorcin en solucin acuosa y fase slida . . . . . . . . . . 57
4. Configuracin FIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
5. Estudio de las variables experimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
6. Calibracin de los sensores. Parmetros analticos . . . . . . . . . . . . . . . 74
7. Interferencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
8. Aplicaciones analticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
9. cido acetil saliclico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
10. Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
i
CAPTULO III. SENSORES MONOPARMETRO PARA AMOXICILINA
Y EPINEFRINA
1. Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
2. Disoluciones e instrumentacin utilizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
3. Espectros de absorcin en solucin acuosa y fase slida . . . . . . . . . 117
4. Configuracin FIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
5. Estudio de las variables experimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
6. Calibracin de los sensores. Parmetros analticos . . . . . . . . . . . . . . 130
7. Interferencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
8. Aplicaciones analticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
9. Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
1. Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
2. Disoluciones e instrumentacin utilizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
3. Espectros de absorcin en solucin acuosa y fase slida . . . . . . . . . 151
4. Configuracin FIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153
5. Estudio de las variables experimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
6. Calibracin del sensor. Parmetros analticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
7. Interferencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
8. Aplicaciones analticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
9. Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
1. Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177
2. Disoluciones e instrumentacin utilizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
3. Espectros de absorcin en solucin acuosa y fase slida . . . . . . . . . 179
4. Configuracin FIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
5. Estudio de las variables experimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182
6. Calibracin del sensor. Parmetros analticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189
ii
7. Interferencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
8. Aplicaciones analticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
9. Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202
1. Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
2. Disoluciones e instrumentacin utilizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210
3. Espectros en disolucin de cafena, cido acetil saliclico
y paracetamol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211
4. Configuracin FIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
5. Estudio de las variables experimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
6. Funciones de calibracin de los componentes individuales . . . . . . . 220
7. Resolucin de la mezcla mediante regresin
por mnimos cuadrados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222
8. Determinacin simultnea de cafena, cido acetil saliclico
y paracetamol en mezclas sintticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232
9. Determinacin simultnea de cafena, cido acetil saliclico
y paracetamol en preparaciones farmacuticas . . . . . . . . . . . . . . . . 234
10. Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237
1. Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 243
2. Disoluciones e instrumentacin utilizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246
3. Espectros de excitacin y emisin en solucin acuosa y fase slida 247
4. Configuracin FIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252
5. Estudio de las variables experimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253
6. Calibracin del sensor. Parmetros analticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262
7. Interferencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 264
8. Aplicaciones analticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266
9. Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270
iii
CAPTULO VIII. SENSOR BIPARMETRO PARA CIDO SALICLICO Y
SALICILAMIDA
1. Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273
2. Disoluciones e instrumentacin utilizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274
3. Espectros de excitacin y emisin en solucin acuosa y fase slida 275
4. Configuracin FIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 280
5. Estudio de las variables experimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282
6. Calibracin del sensor. Parmetros analticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291
7. Interferencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294
8. Aplicaciones analticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296
9. Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301
APNDICE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307
iv
OBJETO DEL TRABAJO
Objeto del trabajo
3
CAPTULO I
INTRODUCCIN
Introduccin
7
Captulo I
El FIA (anlisis por inyeccin en flujo) es una modalidad del anlisis en flujo
continuo (CFA). Se trata de un apartado de los Mtodos Automticos de Anlisis,
pero que presenta una diferencia importante en relacin con el conjunto de los
mismos, la cual consiste en su diseo para el anlisis de muestras inyectadas
manualmente. Los rasgos esenciales del FIA son los siguientes:
8
Introduccin
3.- La trayectoria del flujo debe ser fcilmente reprogramable para realizar
una amplia variedad de ensayos y adems los laterales de la corriente deben
conectarse al flujo principal de forma fcil y reproducible.
4.- El flujo a travs del detector debe dar una respuesta instantnea y
9
Captulo I
Cabe hacer una distincin general entre sistemas de deteccin FIA que miden
directamente una propiedad de la especie disuelta en la muestra inyectada, que est
limitada slo a casos favorables en que se pueden aplicar mtodos potenciomtricos
o absorcin atmica, y aquellos en que debe existir una reaccin adicional que
origina un producto de reaccin detectable. De esta manera el FIA puede aplicarse a
especies activas o inactivas segn su comportamiento en relacin con el sistema de
deteccin. De ah que puedan considerarse las tcnicas FIA clasificadas de acuerdo
con:
10
Introduccin
Los sistemas de deteccin ms usados en FIA abarcan los mas variados tipos
existentes dentro de los mtodos analticos: pticos (espectroscpicos y no
espectroscpicos) y electroqumicos (amperomtricos, potenciomtricos,
conductimtricos, coulomtricos, etc.).
11
Captulo I
Los detectores electroqumicos pueden clasificarse como detectores de
propiedades de la disolucin (como son los conductimtricos) y detectores de las
propiedades del soluto (amperomtricos, coulomtricos y potenciomtricos). Los
detectores de propiedades electroqumicas de la disolucin tienen la ventaja de no
ser destructivos y ser ms o menos universales. Su sensibilidad es moderada y su
rango lineal dinmico es limitado. Los basados en propiedades electroqumicas de
los solutos son en general muy sensibles y especficos. Su especificidad difiere
frecuentemente de la de los detectores pticos. Algunos de estos detectores son
parcialmente destructivos. En principio estos detectores son reactores
electroqumicos. En los electrodos tienen lugar oxidaciones o reducciones. Una
importante caracterstica de estos detectores es que la seal que suministra el
detector viene determinada por la concentracin o actividad del compuesto, medida
en las proximidades de la superficie del electrodo de trabajo. Es por tanto muy
importante que exista una relacin inambigua entre la concentracin promedia en la
seccin transversal de la clula de flujo del detector y la concentracin en o muy
cerca de la superficie del electrodo de trabajo. Este aspecto reactivo de los
detectores de propiedades del soluto es la diferencia esencial con los detectores de
propiedades pticas del soluto, en los cuales se mide un parmetro fsico.
12
Introduccin
3.- Cuando est situado en lugares diferentes a los anteriores, tales como by-
pass del sistema de inyeccin, tubo de salida de la clula, etc.
13
Captulo I
14
Introduccin
III.2.1. Fotometra
15
Captulo I
para este fin. Los dos tipos ms comunes de estas clulas son: a) Tipo en U
fabricado en cuarzo o vidrio ptico especial, dependiendo de la zona del espectro
donde se mida, y con caras negras, existiendo dos rendijas por clula situadas en
caras opuestas (el flujo entra y sale por la parte superior); b) Tipo en Z, donde el
flujo entra por la cara inferior, saliendo por la superior. Es un modelo bastante
menos utilizado, ya que es ms difcil de adaptar a los espectrofotmetros usuales.
III.2.2. Fluorimetra
16
Introduccin
III.2.3. Quimioluminiscencia
III.2.4. Infrarrojo
17
Captulo I
ZnSe. Asimismo, tambin han sido determinados frmacos tales como ibuprofeno
[27], dimenhidrinato [28], paracetamol [124], y la mezcla de cafena y cido acetil
saliclico [125].
III.2.5. Refractometra
18
Introduccin
IV.1. Sensibilidad
En general los mtodos FIA son algo menos sensibles que las tcnicas
manuales por dos razones: a) cuando se hace uso de reacciones derivatizadoras, al
ser el tiempo de reaccin corto, se consiguen rendimientos parciales de reaccin; b)
al existir una dispersin fsica o dilucin de la muestra en el portador, no se alcanza
la mxima seal posible (bolo sin diluir). Debido a las numerosas posibilidades que
ofrece esta tcnica son diversas las modificaciones que pueden hacerse en los
montajes FIA para paliar esta caracterstica negativa:
19
Captulo I
del analito a partir del bolo de muestra. Esto ser lo que haremos en el desarrollo de
esta Memoria.
IV.2. Selectividad
IV.3. Precisin
IV.4. Rapidez
20
Introduccin
IV.5. Sencillez
Al ser el FIA una tcnica sencilla y simple, se caracteriza por su bajo coste,
en claro contraste con otras metodologas automticas, tanto continuas
segmentadas, como discontinuas. Adems, el carcter modular de un sistema FIA
permite su adaptacin a las diferentes necesidades que hoy en da tiene la sociedad
y cuya resolucin compete a la Qumica Analtica. La sustitucin de cualquiera de
sus componentes y la incorporacin de otros es tarea sencilla si se tiene en cuenta la
ausencia de altas presiones que complicaran estas operaciones. La optimizacin de
un nuevo montaje preparado en pocos minutos es fcil de llevar a cabo.
21
Captulo I
22
Introduccin
23
Captulo I
24
Introduccin
25
Captulo I
26
Introduccin
27
Captulo I
28
Introduccin
Los dispositivos que integran estos pasos en una clula de flujo segn las
modalidades 2, 3 y 4 se pueden considerar sensores, pues poseen los principales
requisitos exigibles a stos.
29
Captulo I
Por otra parte, tambin se usa con frecuencia una doble inmovilizacin
cuando el reactivo previamente inmovilizado retiene al analito y origina una
alteracin detectable (color, fluorescencia, etc) de la microzona sensora. En este
caso ocurren simultneamente la reaccin, la separacin y la deteccin [106, 107].
30
Introduccin
31
Captulo I
Son pocos los sensores pticos de flujo que han sido aplicados a molculas
orgnicas de inters farmacolgico (Tabla I-5). Los sensores ms recientemente
desarrollados para determinacin de principios activos a partir de su fijacin en un
soporte slido y posterior deteccin en la microzona activa, son de vitaminas,
concretamente, tiamina [113] y riboflavina [114]. Dada la escasez de sensores de
este tipo, y puesto que presentan caractersticas tan importantes como sencillez,
economa, sensibilidad, reproducibilidad, selectividad, as como fcil manejo, en el
desarrollo de esta Memoria se han estudiado sensores pticos de flujo aplicados a
principios activos farmacolgicos, en donde se produce directamente la fijacin del
analito sobre el soporte slido cuando el bolo de muestra alcanza la zona sensora
sin necesidad de realizar ninguna reaccin derivadora previa de ste para su
posterior deteccin fotomtrica o fluorimtrica.
32
Introduccin
Sephadex
Tiamina Fotom. 247 0.8-13 g ml-1 1.8 14 114
CM C-25
Sephadex
Piridoxina Fotom. 290 1-10 g ml-1 0.84 32 120
SP C-25
VII.4. MULTISENSORES
33
Captulo I
34
Introduccin
35
Captulo I
H2
C
CH CH
CH
C
H2
Unidos al anillo aromtico, se hallan los grupos cambiadores, que pueden ser
de cido fuerte o de cido dbil para los cambiadores catinicos (tipo Dowex 50) y
de base fuerte o dbil para los cambiadores aninicos (tipo Dowex 1):
36
Introduccin
O CH2
O
OH
OH O CH2
OH O
OH
OH O CH2
OH O
O CH2
O OH
OH
O OH
OH
OH
37
Captulo I
Al igual que las resinas tipo Dowex, estn formadas por cadenas de
poliestireno entrecruzadas por molculas de divinilbenceno, pero carecen de grupos
cambiadores de iones. Dado que no poseen grupos inicos hidroflicos, se afectan
por las caractersticas del medio de reaccin en mucha menor medida que las
resinas cambiadoras de iones. Estos soportes permiten retener numerosos reactivos
aromticos, manteniendo intacta su capacidad formadora de complejos, dado que la
retencin se efecta por adsorcin sobre el esqueleto aromtico del soporte,
quedando libres los grupos inicos activos de los reactivos.
38
Introduccin
Para que el sensor sea reutilizable es necesario que una vez desarrollada la
seal, la microzona activa se regenere y quede dispuesta para un nuevo anlisis. El
procedimiento ms simple de regeneracin de un sensor se da en aquellos casos en
los que la propia disolucin portadora acta como eluyente, desplazando al analito
(o producto de reaccin) de los sitios activos del soporte. Esto es lo que ocurre en la
mayora de los sensores desarrollados en esta Memoria.
39
Captulo I
VIII. BIBLIOGRAFA
40
Introduccin
41
Captulo I
42
Introduccin
43
Captulo I
44
SENSORES
ESPECTROFOTOMTRICOS
EN FLUJO EN FASE SLIDA
CAPTULO II
SENSORES MONOPARMETRO
PARA CIDO ASCRBICO,
MINOXIDIL Y CIDO SALICLICO
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
1. INTRODUCCIN
CH2OH
CHOH
O
O
HO OH
49
Captulo II
50
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
Reactivo ,
Rango lineal Referencias
(l mol-1 cm-1) (:g ml-1)
TPTZ: 2,4,6-tripiridil-s-triazina; Absortividad molar aparente
51
Captulo II
1.2. Minoxidil
H2N N
N
N
O
NH2
52
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
minoxidil usan derivacin [32-36] y todos ellos son menos sensibles que el mtodo
propuesto en esta Memoria, el cual ha sido aplicado a numerosos preparados
farmacuticos.
1.3 Salicilatos
Los salicilatos forman dos grandes clases que son los steres del cido
saliclico, obtenidos por sustitucin en el grupo carboxilo, y los steres salicilato de
cidos orgnicos, en los que el grupo carboxilo del cido saliclico se conserva y la
sustitucin se hace en el grupo OH. Por ejemplo, la aspirina es un ster del cido
actico. Los salicilatos actan normalmente en virtud de su contenido en cido
saliclico.
OCOCH3 OH
COOH COOH
53
Captulo II
54
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
55
Captulo II
56
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
57
Captulo II
58
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
3.2. Minoxidil
59
Captulo II
60
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
4. CONFIGURACIN FIA
61
Captulo II
62
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
Se opt en todos los casos por un soporte tipo Sephadex, ya que la naturaleza
aromtica de los cambiadores inicos tipo Dowex los hace tan poco transparentes
en la regin UV que resultan incompatibles con este tipo de deteccin. Se probaron
para cada analito resinas aninicas y catinicas fuertes y dbiles: SP C-25, CM C-
25, QAE A-25 y DAE A-25.
63
Captulo II
64
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
65
Captulo II
Figura II-8.1. Influencia del pH del portador Figura II-8.2. Influencia del pH del portador
para el cido ascrbico para el minoxidil
66
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
67
Captulo II
68
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
Figura II-9.1. Efecto de la concentracin del Figura II-9.2. Efecto de la concentracin del
portador/eluyente para cido ascrbico portador/eluyente para minoxidil
69
Captulo II
5.3.1. Caudal
Figura II-10.1. Influencia del caudal para c. Figura II-10.2. Influencia del caudal para
ascrbico minoxidil
70
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
Una vez fijados todos los parmetros anteriores, slo nos resta obtener el
volumen de muestra a inyectar. Para dicho estudio se insertan en el sistema
bucles de muestra de volmenes variables, permaneciendo constante la
concentracin de analito que se inyecta. Las Figuras II-11.1, II-11.2 y II-11.3
muestran el efecto de esta variable sobre la seal analtica, para unas
concentraciones de 5, 2 y 10 :g ml-1 de cido ascrbico, minoxidil y cido
saliclico, respectivamente.
71
Captulo II
Figura II-11.1. Volumen de muestra para c. Figura II.11.2. Volumen de muestra para
ascrbico minoxidil
72
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
Para conseguir por una parte buena frecuencia de muestreo, y por otra,
buena sensibilidad y amplios mrgenes de calibracin, se han escogido para cada
sistema tres volmenes de inyeccin con los que se ha calibrado cada sensor. Para
el cido ascrbico y el cido saliclico se han calibrado volmenes de 300, 600 y
1000 :l; mientras que para el minoxidil, se calibraron volmenes de 600, 1000 y
2000 :l.
73
Captulo II
Figura II-12.1. Rectas de calibrado para c. Figura II-12.2. Rectas de calibrado para minoxidil
ascrbico 1) 2000 :l 2) 1000 :l 3) 600 :l
1) 1000 :l 2) 600 :l 3) 300 :l
74
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
Tcido ascrbico
OVolumen: 300 :l A = 0.013 + 0.056 c r=0.9998
OVolumen: 600 :l A = 0.002 + 0.116 c r=0.9997
OVolumen: 1000 :l A = 0.014 + 0.186 c r=0.9999
TMinoxidil
OVolumen: 600 :l A = 0.028 + 0.143 c r=0.9998
OVolumen: 1000 :l A = 0.026 + 0.229 c r=0.9995
OVolumen: 2000 :l A = 0.024 + 0.430 c r=0.9997
Tcido saliclico
OVolumen: 300 :l A = 0.021 + 0.022 c r=0.9999
OVolumen: 600 :l A = 0.029 + 0.035 c r=0.9998
OVolumen: 1000 :l A = 0.037 + 0.051 c r=0.9998
donde :
A: absorbancia
c: concentracin de analito (:g ml-1)
r: coeficiente de correlacin
75
Captulo II
0 # A # Ab+3F
donde:
Ab: absorbancia media obtenida para el blanco
F: desviacin estndar para el blanco
AL = Ab + 3F
76
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
AQ= Ab + 10F
donde:
AQ: absorbancia correspondiente al lmite de cuantificacin.
Ab: absorbancia obtenida para el blanco.
F: desviacin estndar para el blanco.
Los parmetros analticos de cada uno de los sensores, para cada volumen de
muestra inyectado, se muestran en las Tablas II-2.1, II-2.2 y II-2.3.
77
Captulo II
Cada sensor tiene una vida media operacional superior a 250 inyecciones de
muestra. Asimismo, la frecuencia de muestreo para todos sensores es relativamente alta
si tenemos en cuenta que estamos trabajando en fase slida.
78
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
7. INTERFERENCIAS
79
Captulo II
80
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
81
Captulo II
82
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
8. APLICACIONES ANALTICAS
En cada caso los resultados se compararon con los obtenidos con un mtodo
de referencia. Como tal elegimos el mtodo oficial de la AOAC [52], realizando
una comparacin estadstica entre ste y el mtodo propuesto.
83
Captulo II
Fexp = F12/F22
84
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
En los casos en que texp < t ter no habr diferencia significativa entre los
valores de las medias obtenidas por ambos mtodos, por lo que podremos afirmar
en tal caso que ambos mtodos arrojan el mismo resultado para una probabilidad
del 95%.
En aquellos casos en los que se comprob que no exista efecto matriz, como
es el caso de todas las preparaciones farmacuticas en estudio as como en los
caramelos, se obtuvo la concentracin de cido ascrbico por el mtodo de
calibracin directa para un volumen de 600 :l. Para la orina, dada la existencia de
un pequeo efecto matriz, se aplic el mtodo de adicin de patrn usando
igualmente un volumen de inyeccin de 600 :l.
85
Captulo II
86
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
87
Captulo II
88
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
89
Captulo II
90
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
8.1.4.2. En caramelos
91
Captulo II
8.1.4.3. En orina
1 Determinacin
0 0.230
1 0.330
A = 0.227 + 0.107c
2 0.446 2.12 1060
r= 0.9996
3 0.540
5 0.765
2 Determinacin
0 0.229
1 0.331
A = 0.226 + 0.106c
2 0.442 2.14 1069
r= 0.9997
3 0.537
5 0.760
3 Determinacin
0 0.233
1 0.327
A = 0.227 + 0.107c
2 0.447 2.11 1055
r= 0.9995
3 0.542
5 0.768
92
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
6x 1061 1050
Desviacin estndar F 7.09 4.32
F2 50.26 15.66
Desviacin de la media Fm 4.09 2.49
C.V.(%) 0.67 0.41
Er(%) 1.66 1.02
93
Captulo II
- 2.12 0.03 -
1 3.07 0.04 98.4
2 4.11 0.02 99.8
3 5.06 0.03 98.8
8.2. MINOXIDIL
94
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
bidestilada (usando etanol de 96% v/v para que el contenido final en etanol fuese
del 5%).
En todos los casos se comprob que no exista efecto matriz, de modo que se
obtuvo la concentracin de minoxidil por el mtodo de calibracin directa para un
volumen de 1000 :l.
95
Captulo II
a
Loniten 10.0 9.8 98 1
b
Lacovin 20.0 20.6 103 1
b
Pilovital 20.0 20.5 103 1
b
Regaine 20.0 20.3 101.7 0.8
b
Riteban 20.0 19.8 99.0 0.9
a
por comprimido; b por ml; c media de tres determinaciones
96
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
Lacovin 1c 101 1
2c 99.8 0.8
Pilovital 1c 102 1
2c 100 1
97
Captulo II
En todos los casos se comprob que no exista efecto matriz, excepto para
uno de los frmacos Isdn Antiverrugas (al que se aplic el mtodo de adicin de
patrn), de modo que para todos los dems se obtuvo la concentracin de cido
saliclico por el mtodo de calibracin directa para un volumen de 600 :l.
98
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
a
Callix-D 150.0 146.8 98.0 2.1
a
Diprosalic 30.0 30.0 100.1 0.6
b
Acnosn 1200.0 1207.6 100.6 1.4
c a
Isdn 167.0 170.1 102.3 3.2
a
por gramo; b por litro; c mtodo de adicin de patrn
99
Captulo II
a
Isdn 100b 99 1
200b 99.2 0.9
a
mtodo de adicin de patrn; b mg/gramo; c mg/l
100
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
T del bao. Se hace confluir una disolucin de 60 :g ml-1 de AAS con una
disolucin de NaOH 2 mol l-1, a travs de un reactor de 5 metros de longitud, y se
prueban diferentes temperaturas del bao termostatizado comprendidas entre 40 y
100 C. Se observa una seal mxima para valores de T igual o superiores a 60 C.
Elegimos dicho valor como ptimo para el desarrollo del sensor en flujo.
101
Captulo II
102
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
120 :g ml-1, obtenindose una recta de calibrado lineal que responde a la siguiente
ecuacin (Fig. II-17):
103
Captulo II
- Cafena: 50 mg
Dolvirn - 399 1 -
100 499 2 100
200 602 2 101
Aspirina - 496 3 -
100 597 4 101
200 697 3 101
Vegann - 250 2 -
100 350 2 100
200 451 4 101
Dolmen - 489 5 -
100 592 5 103
200 694 4 102
a
por comprimido
104
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
Los resultados obtenidos para cada preparacin farmacutica as como los del
estudio de recuperacin de diferentes cantidades de cido acetil saliclico sobre
cada frmaco se muestran en la tabla anterior (Tabla II-16). Estos resultados son en
ambos casos estupendos, lo que pone de manifiesto la utilidad del sensor propuesto.
105
Captulo II
10. BIBLIOGRAFA
106
Sensores monoparmetro para cido ascrbico, minoxidil y cido saliclico
107
Captulo II
108
CAPTULO III
SENSORES MONOPARMETRO
PARA AMOXICILINA Y
EPINEFRINA
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
1. INTRODUCCIN
1.1. Amoxicilina
H 2N H
H
N
S
CH3
O
N CH3
HO O
O OH
111
Captulo III
112
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
113
Captulo III
1.2. Epinefrina
OH
H
HO N
CH3
HO
114
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
y beta, y por ello sus efectos sobre los rganos efectores son complejos. Tienen
particular preponderancia las acciones sobre el corazn y el msculo liso vascular
y otros. La epinefrina es una de las drogas vasopresoras ms potentes que se
conocen. En rpida administracin intravenosa produce un efecto caracterstico
sobre la presin sangunea, que sube pronto hasta un mximo proporcional a la
dosis. El aumento de la presin sistlica es ms grande que el de la diastlica, de
modo que hay un aumento de la presin de pulso. La presin media cae entonces
por debajo de la normal antes de volver al nivel de control. El mecanismo del
aumento de la presin sangunea debido a la epinefrina es triple: estimulacin
directa del miocardio que aumenta la fuerza de la contraccin ventricular, mayor
frecuencia cardaca, y lo vasoconstriccin en muchos lechos vasculares,
especialmente en los vasos de resistencia precapilares de la piel, mucosas y rin,
junto con marcada constriccin de las venas.
115
Captulo III
116
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
3.1. Amoxicilina
117
Captulo III
3.2. Epinefrina
118
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
Las longitudes de onda de trabajo para estos dos sensores son, pues, 248 y
287 nm respectivamente, para amoxicilina y epinefrina.
4. CONFIGURACIN FIA
119
Captulo III
120
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
121
Captulo III
Se opt por los cambiadores tipo Sephadex por las mismas razones indicadas
en el Captulo II. Se probaron para cada analito resinas aninicas y catinicas
fuertes y dbiles: QAE A-25, DAE A-25, SP C-25, y CM C-25.
122
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
Durante el estudio de las variables qumicas se mantienen fijas las variables FIA:
O Amoxicilina
Caudal: 0.82 ml min-1; Volumen de inyeccin: 600 :l
O Epinefrina
Caudal: 1.20 ml min-1; Volumen de inyeccin: 600 :l
123
Captulo III
Figura III-6.1. Efecto del pH del portador Figura III-6.2. Efecto del pH del portador
para amoxicilina (Vi=600 :l) para epinefrina (Vi=600 :l)
124
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
125
Captulo III
126
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
5.3.1. Caudal
127
Captulo III
Figura III-8.1. Influencia del caudal para Figura III-8.2. Influencia del caudal para
amoxicilina epinefrina
128
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
Para conseguir por una parte buena frecuencia de muestreo, y por otra
buena sensibilidad, se han escogido para la amoxicilina tres volmenes de
inyeccin: 300, 600 y 1200 l. En cambio, para la epinefrina, dado que no hay
posibilidad de incrementar linealmente la sensibilidad con empleo de volmenes
grandes de muestra, slo se estudia un nico volumen de inyeccin de 600 l.
129
Captulo III
Amoxicilina Epinefrina
(nm) 248 287
Soporte slido Sephadex QAE A-25 Sephadex QAE A-25
Nivel de soporte (mm) 12 12
Portador NaCl 0.1M (pH=12.5) NaCl 0.05M (pH=12)
Eluyente NaCl 0.5M (pH=12.5) NaCl 0.7 M (pH=12)
pH de la muestra 3-13 2-13
Caudal (ml min-1) 0.82 1.20
Volumen de muestra (l) 300, 600 y 1200 600
130
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
Amoxicilina
Volumen: 300 ml A = 0.025 + 0.020 c r=0.9993
Volumen: 600 ml A = 0.019 + 0.040 c r=0.9997
Volumen: 1200 l A = 0.040 + 0.066 c r=0.9990
Epinefrina
Volumen: 600 l A = 0.002 + 0.032 c r=0.9996
donde :
A: absorbancia
c: concentracin de analito (g ml-1)
r: coeficiente de correlacin
131
Captulo III
132
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
7. INTERFERENCIAS
133
Captulo III
134
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
8. APLICACIONES ANALTICAS
8.1. AMOXICILINA
135
Captulo III
- Excipientes c.s.p.
136
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
- Amoxicilina: 250 mg
- Acetilcistena: 100 mg
- Sacarina: 4 mg
- Sacarosa: 4.5 g
Los valores obtenidos concuerdan con los indicados por el fabricante, ya que
la recuperacin se encuentra comprendida en todos los casos entre el 99.2 y el
100.6%. La desviacin estndar relativa ()r) se realiz para tres determinaciones.
Para chequear la exactitud del mtodo propuesto se llev a cabo un estudio de
recuperacin de distintas cantidades de analito adicionadas sobre algunos de los
frmacos anteriores (Tabla III-7), obtenindose porcentajes de recuperacin entre
98.8 y 101.1%.
137
Captulo III
138
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
8.2. EPINEFRINA
139
Captulo III
- Epinefrina: 1 mg
Los resultados obtenidos (Tabla III-9) para todos los frmacos analizados
nos dan valores muy satisfactorios respecto a los indicados por el fabricante, lo cual
testifica la posible aplicabilidad de este sensor para controles de rutina.
140
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
141
Captulo III
9. BIBLIOGRAFA
142
Sensores monoparmetro para amoxicilina y epinefrina
143
CAPTULO IV
SENSORES BIPARMETRO
PARA SALICILAMIDA Y
PARACETAMOL
Sensor biparmetro para salicilamida-paracetamol
1. INTRODUCCIN
1.1. Paracetamol
El paracetamol fue usado por primera vez en medicina por Mering en 1893,
pero su popularidad data slo de 1949, cuando se descubri que era el principal
metabolito activo de la acetanilida y la fenacetina. Puede adquirirse sin prescripcin
mdica, y presenta la siguiente estructura:
H
N CH3
HO
147
Captulo IV
Los derivados del p-aminofenol se absorben por todas las vas, incluyendo la
digestiva, siendo bases muy dbiles; se absorben algo en el estmago y muy
rpidamente en el intestino. Una vez absorbido el paracetamol pasa a la sangre en la
que se alcanza una concentracin plasmtica mxima a la hora o las dos horas
despus de la ingestin. Con las dosis normales puede recuperarse entre el 90-100%
de la droga en la orina del primer da, pero prcticamente nada se excreta sin
cambio, ya que la mayor parte lo hace en forma conjugada con cido glucurnico,
sulfrico o cistena.
1.2. Salicilamida
148
Sensor biparmetro para salicilamida-paracetamol
CONH 2
OH
149
Captulo IV
150
Sensor biparmetro para salicilamida-paracetamol
151
Captulo IV
En medio bsico, por otro lado, para ambos analitos se produce un ligero
efecto batocrmico as como un incremento en la sensibilidad al pasar de
espectrofotometra convencional a espectrofotometra en fase slida (pasamos de
una clula de flujo de 1-cm a otra de 1-mm de paso ptico). Adems se comprueba
experimentalmente cmo a una 8=300 nm se produce aditividad en los valores de
absorbancia de ambos analitos (medio bsico). Si a esto sumamos que el mximo de
la salicilamida en fase slida para valores de pH cido tambin aparece a esta
misma 8, escogeremos la longitud de onda de 300 nm para el desarrollo del sensor
propuesto.
152
Sensor biparmetro para salicilamida-paracetamol
4. CONFIGURACIN FIA
153
Captulo IV
154
Sensor biparmetro para salicilamida-paracetamol
155
Captulo IV
156
Sensor biparmetro para salicilamida-paracetamol
O Salicilamida y Paracetamol
Caudal: 1.60 ml min-1; Volumen de inyeccin: 600 :l
157
Captulo IV
158
Sensor biparmetro para salicilamida-paracetamol
159
Captulo IV
160
Sensor biparmetro para salicilamida-paracetamol
5.3.1. Caudal
161
Captulo IV
162
Sensor biparmetro para salicilamida-paracetamol
Paracetamol-Salicilamida
8 (nm) 300
Soporte slido Sephadex QAE A-25
Nivel de soporte (mm) 12
Caudal (ml min-1) 1.6
Volumen de muestra (:l) 600
pH=5 pH=12
Portador/eluyente HAc/NaAc 0.045M NaCl 0.1M
pH de la muestra 3-10 3.5-13
163
Captulo IV
0.1M a pH=12 la que ponga la muestra (una segunda inyeccin) en contacto con la
microzona activa. Con esta nueva inyeccin obtenemos un valor de absorbancia AII
que corresponde a la absorbancia suma de la salicilamida y del paracetamol, dado
que a pH=12 se produce la fijacin de ambos analitos ocurriendo adems que los
valores de absorbancia de los dos analitos son aditivos. Por consiguiente, de las dos
inyecciones de muestra se obtienen del espectrofotmetro dos valores de
absorbancia: AI y AII.
AI=ASal
AII=ASal + APar (1)
Una vez realizada la calibracin para cada analito, mediante ajuste por
mnimos cuadrados se obtienen las siguientes ecuaciones de las rectas, que
aparecen representadas en la Figura IV-9.
164
Sensor biparmetro para salicilamida-paracetamol
TSalicilamida
O pH=5 A = 0.011 + 6.23 x 10-3 c r=0.9998
O pH=12 A = 0.015 + 11.1 x 10-3 c r=0.9990
TParacetamol
O pH=12 A = 0.006 + 25.7 x 10-3 c r=0.9998
donde :
A: absorbancia
c: concentracin de analito (:g ml-1)
r: coeficiente de correlacin
165
Captulo IV
AII=ASal + APar
APar=AII - ASal
En las Tabla IV-1 se muestran los parmetros analticos de cada una de las
calibraciones necesarias para el desarrollo del sensor.
166
Sensor biparmetro para salicilamida-paracetamol
7. INTERFERENCIAS
167
Captulo IV
8. APLICACIONES ANALTICAS
Con el fin de demostrar la utilidad del sensor propuesto, ste ha sido aplicado
al anlisis de salicilamida, paracetamol o la mezcla de ambos en:
168
Sensor biparmetro para salicilamida-paracetamol
169
Captulo IV
170
Sensor biparmetro para salicilamida-paracetamol
171
Captulo IV
Coricidin 190 - 99 1 -
Percutalin 170 - 99 2 -
172
Sensor biparmetro para salicilamida-paracetamol
173
Captulo IV
9. BIBLIOGRAFA
174
CAPTULO V
SENSORES BIPARMETRO
PARA CIDO ASCRBICO Y
PARACETAMOL
Sensor biparmetro para cido ascrbico-paracetamol
1. INTRODUCCIN
1.2. Paracetamol
177
Captulo V
178
Sensor biparmetro para cido ascrbico-paracetamol
Los espectros tanto en disolucin como en fase resina (Sephadex QAE A-25)
para paracetamol y cido ascrbico eran ya conocidos de los Captulos anteriores de
esta Memoria. En este caso se muestran los espectros del paracetamol en disolucin
acuosa y en fase resina a pH 12.5 a partir de disoluciones del mismo de una
concentracin de 6 :g ml-1 (Figura V-1). El espectro en fase resina se obtuvo
utilizando la configuracin FIA que se muestra en la Figura V-3, empleando como
portador NaCl 0.05M a pH = 12.5 y una clula (Hellma 138-QS) de 1-mm de paso
de luz. Se observa un desplazamiento del mximo de absorcin de 259 a 264 nm,
producido por la retencin sobre el soporte slido.
179
Captulo V
180
Sensor biparmetro para cido ascrbico-paracetamol
4. CONFIGURACIN FIA
181
Captulo V
182
Sensor biparmetro para cido ascrbico-paracetamol
Se estudi la respuesta del sensor para cada analito al variar el valor del pH
del portador, utilizando disoluciones de 5 :g ml-1 de cido ascrbico y de 6 :g ml
-1
de paracetamol, respectivamente. Se inyectaron 600 :l de muestra utilizando
como portador disoluciones ajustadas a diferentes valores de pH, mediante la
adicin de la cantidad necesaria de HCl o NaOH 0.1M, y conteniendo una
183
Captulo V
184
Sensor biparmetro para cido ascrbico-paracetamol
185
Captulo V
Figura V-6.1. Efecto de la concentracin del Figura V-6.2. Efecto de la concentracin del
portador para cido ascrbico en la mezcla portador para paracetamol en la mezcla
5.3.1. Caudal
186
Sensor biparmetro para cido ascrbico-paracetamol
187
Captulo V
Figura V-8.1. Influencia del volumen de muestra Figura V-8.2. Influencia del volumen de muestra
para cido ascrbico para paracetamol
188
Sensor biparmetro para cido ascrbico-paracetamol
cido ascrbico-Paracetamol
8 (nm) 264
Soporte slido Sephadex QAE A-25
Nivel de soporte (mm) 12
Caudal (ml min-1) 1
Volumen de muestra (:l) 300, 600 y 1000
pH=5.6 pH=12.5
Portador/eluyente HAc/NaAc 0.04M NaCl 0.05M
pH de la muestra 3-10 3-13
189
Captulo V
Tcido ascrbico
O Volumen: 300 :l A = 0.022 + 0.0558c r=0.9998
O Volumen: 600 :l A = 0.008 + 0.0979c r=0.9999
O Volumen: 1000 :l A = 0.011 + 0.1560c r=0.9998
TParacetamol
O Volumen: 300 :l A = 0.033 + 0.0391c r=0.9996
O Volumen: 600 :l A = 0.003 + 0.0814c r=0.9999
O Volumen: 1000 :l A = 0.020 + 0.0995c r=0.9995
donde :
A: absorbancia
c: concentracin de analito (:g ml-1)
r: coeficiente de correlacin
Figura V-9.1. Calibracin para cido ascrbico Figura V-9.2. Calibracin para paracetamol
1) 1000 :l 2) 600 :l 3) 300 :l 1) 1000 :l 2) 600 :l 3) 300 :l
190
Sensor biparmetro para cido ascrbico-paracetamol
191
Captulo V
Parmetro Paracetamol
7. INTERFERENCIAS
192
Sensor biparmetro para cido ascrbico-paracetamol
193
Captulo V
194
Sensor biparmetro para cido ascrbico-paracetamol
8. APLICACIONES ANALTICAS
195
Captulo V
196
Sensor biparmetro para cido ascrbico-paracetamol
- Codena: 30 mg
197
Captulo V
- Codena: 10 mg
- Cafena: 30 mg
198
Sensor biparmetro para cido ascrbico-paracetamol
Fludeten 500 - 99 1 -
Apiretal 100b - 98 1 -
Saldeva 500 - 98 1 -
199
Captulo V
200
Sensor biparmetro para cido ascrbico-paracetamol
201
Captulo V
9. BIBLIOGRAFA
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[13] L. F. Prescott, J. Pharm. Pharmac., 23 (1971) 11.
[14] K. C. Wahl, T. A. Rejent, J. For. Sci., 23 (1978) 14.
[15] J. Grove, J. Chromatogr., 59 (1971) 289.
[16] M. Jeevanandram, B. Novic, R. Savich, E. Wagman, J. Anal. Tox., 4 (1980)
124.
[17] B. R. Manno, J. E. Manno, C. A. Dempsey, M. A. Wood, J. Anal. Tox., 5
(1981) 24.
[18] E. Michael, M. E. Kommos, M. E. Kamla, Talanta, 36 (1989) 678.
[19] J. L. Vilchez, R. Blanc, R. Avidad, A. Navaln, J. Pharm. Biomed. Anal., 13
(1995) 1119.
[20] H. Nakamura, Z. Tamura, Anal. Chem., 52 (1980) 2087.
[21] A. ztun, Sci. Pharm., 54 (1986) 111.
202
CAPTULO VI
1. INTRODUCCIN
205
Captulo VI
Los dos primeros mtodos (CLS y ILS) establecen relaciones entre los datos
espectroscpicos y las concentraciones basndose en la aditividad de las
absorbancias, determinada por el cumplimiento de la ley de Beer. La diferencia
entre ambos estriba en el diseo del modelo de calibracin; mientras que en el
modelo clsico (CLS) se expresa la absorbancia como una funcin de las
concentraciones, en el modelo de regresin inversa (ILS) son las concentraciones
las que se expresan en funcin de los datos espectrales. Sin embargo estos mtodos
estn muy limitados [5], especialmente por problemas en la lnea base, desviaciones
de la ley de Beer, interacciones entre los componentes y fuertes solapamientos
espectrales. Por ello, son los mtodos basados en el clculo de los llamados factores
o componentes principales los ms adecuados para resolver estos problemas.
206
Multisensor para cafena, cido acetil saliclico y paracetamol
Este mtodo fue introducido por H.Wold [13], adquiriendo gran aceptacin
en sus aplicaciones al anlisis qumico. Existen dos planteamientos distintos que se
conocen como PLS-1 y PLS-2. En el algoritmo PLS-2 se calibran todos los
constituyentes a un tiempo, lo que a veces supone cierta prdida de precisin,
especialmente para mezclas complejas; en cambio, en PLS-1 se asigna un factor a
cada constituyente y se optimiza la matriz de calibracin para cada uno de ellos,
obtenindose generalmente resultados ms precisos aunque el tiempo necesario es
algo mayor. En este trabajo hemos escogido PLS-1 ya que, como se ver ms
adelante, por la naturaleza del sistema no era aconsejable la calibracin para los tres
componentes a la vez, de modo que los intentos de aplicacin de PLS-2 no
arrojaron resultados satisfactorios.
207
Captulo VI
O CH3
H3 C
N
O N
CH3
208
Multisensor para cafena, cido acetil saliclico y paracetamol
209
Captulo VI
210
Multisensor para cafena, cido acetil saliclico y paracetamol
211
Captulo VI
4. CONFIGURACIN FIA
212
Multisensor para cafena, cido acetil saliclico y paracetamol
213
Captulo VI
Se estudi para cada uno de los tres analitos la influencia que la altura de
soporte slido ejerca sobre la seal. Los resultados se muestran en la Figura VI.4.
214
Multisensor para cafena, cido acetil saliclico y paracetamol
Empleando gel de slice C18 como soporte slido, se observa que CF y AAS
son fuertemente retenidos, mientras que el PCT se eluye con mayor rapidez por el
propio portador. En cada experiencia (trabajando con disoluciones individuales de
cada analito) se han registrado las seales a la longitud de onda del mximo de
absorcin de cada analito que son 275, 275 (hombro) y 250 nm para la CF, AAS y
PCT respectivamente. La medida se ha realizado una vez alcanzada la mxima
seal de cada analito en el fiagrama correspondiente (absorbancia frente a tiempo).
215
Captulo VI
216
Multisensor para cafena, cido acetil saliclico y paracetamol
5.2.2. pH de la muestra
217
Captulo VI
218
Multisensor para cafena, cido acetil saliclico y paracetamol
5.3.1. Caudal
219
Captulo VI
Se observa para los tres analitos, que existe una relacin lineal entre
absorbancia y volumen de muestra hasta un volumen correspondiente a 1500 :l, a
partir del cual dicho incremento deja de ser lineal.
220
Multisensor para cafena, cido acetil saliclico y paracetamol
siendo:
A: absorbancia
c: concentracin de analito expresada en :g ml-1
221
Captulo VI
Dado que se haban registrado para cada muestra patrn espectros a lo largo
del proceso de retencin-elucin, se construyeron 6 matrices de calibracin a
diferentes tiempos que contienen informacin diferente (25, 34, 42, 50, 55 y 59
segundos desde la inyeccin) con objeto de seleccionar la que conduzca a una
mejor resolucin de la mezcla. En las Figuras VI-11.1, VI-11.2 y VI-11.3, se
muestran ejemplos de tres inyecciones de CF, AAS y PCT respectivamente.
222
Multisensor para cafena, cido acetil saliclico y paracetamol
223
Captulo VI
224
Multisensor para cafena, cido acetil saliclico y paracetamol
225
Captulo VI
226
Multisensor para cafena, cido acetil saliclico y paracetamol
Esto sucede cuando se empiezan a incluir factores que contienen ruido, lo que se
conoce como sobreajuste. Para obtener el mejor modelo debera elegirse el nmero
de factores que proporciona el PRESS mnimo, aunque, en este caso ya suele
presentarse sobreajuste.
Una solucin a este problema fue propuesta por Haaland y Thomas [19].
Consiste en comparar los valores de PRESS, para cada nmero de factores, con el
mnimo valor de PRESS obtenido, seleccionando como ptimo el modelo con
menor nmero de factores, tal que su valor de PRESS no sea significativamente
mayor que el PRESS mnimo. Esta comparacin se realiza utilizando el parmetro
estadstico F, definido como la razn entre el valor ms pequeo obtenido para el
PRESS y los distintos valores obtenidos empleando otro nmero de factores. Como
nivel de probabilidad se selecciona el que Haaland y Thomas estimaron
empricamente como una buena solucin, el 75 %.
227
Captulo VI
228
Multisensor para cafena, cido acetil saliclico y paracetamol
La estimacin del grado de ajuste entre los valores tericos y los calculados
por un modelo se realiza a travs de distintos parmetros estadsticos. En la
presente Memoria se ha hecho uso de los siguientes:
229
Captulo VI
En las Tablas VI-3.1, VI-3.2 y VI-3.3, se recogen, para los tres componentes
(CF, AAS y PCT, respectivamente), los valores de los parmetros estadsticos
relacionados con la calidad del ajuste del modelo para las 6 matrices utilizadas,
indicndose tambin el nmero de factores ptimo en cada caso.
230
Multisensor para cafena, cido acetil saliclico y paracetamol
231
Captulo VI
232
Multisensor para cafena, cido acetil saliclico y paracetamol
233
Captulo VI
234
Multisensor para cafena, cido acetil saliclico y paracetamol
235
Captulo VI
1 - - - 50 48.9 98 4 - - -
2 - - - 300 272.6 91 3 - - -
3 - - - - - - 100 94.6 95 2
236
Multisensor para cafena, cido acetil saliclico y paracetamol
10. BIBLIOGRAFA
237
SENSORES
ESPECTROFLUORIMTRICOS
EN FLUJO EN FASE SLIDA
CAPTULO VII
SENSOR MONOPARMETRO
PARA PIRIDOXINA
Sensor monoparmetro para piridoxina
1. INTRODUCCIN
H3C N
R: CH2OH (piridoxina);
CHO (piridoxal);
CH2NH2 (piridoxamina)
La piridoxina es la 4,5-di(hidroximetil)-3-hidroxi-2-metilpiridina y se ha
llamado piridoxol. Su estructura se estableci a partir de pruebas qumicas y
espectroscpicas [2], en particular el espectro ultravioleta, que fue similar al de
diversas 3-hidroxipiridinas. La metilacin del grupo fenlico y la oxidacin con
243
Captulo VII
permanganato del producto al cido dicarboxlico sirvi para localizar los grupos
hidroximetileno sobre las posiciones 4 y 5, en base a un ensayo coloreado
caracterstico (FeCl2), que no dan las 2- ni las 6-carboxipiridinas. La sntesis del
dicido confirm el ensayo y localiz el grupo C-metilo sobre la posicin 2.
244
Sensor monoparmetro para piridoxina
245
Captulo VII
246
Sensor monoparmetro para piridoxina
247
Captulo VII
248
Sensor monoparmetro para piridoxina
249
Captulo VII
3.2. Topograma
250
Sensor monoparmetro para piridoxina
decir, los espectros de excitacin y de emisin), que son una representacin grfica
de la IFR frente a la longitud de onda (nm). Para poder comparar los espectros
obtenidos en disolucin con los obtenidos en fase slida, se registraron ambos
haciendo uso de la clula de flujo Hellma 176-QS (Figura VII-1). De este modo se
hace patente el incremento de sensibilidad que se produce al pasar de
espectrofluorimetra convencional a espectrofluorimetra en fase slida.
251
Captulo VII
4. CONFIGURACIN FIA
252
Sensor monoparmetro para piridoxina
253
Captulo VII
Dado que los distintos valores de velocidad de barrido, que fueron variados
entre 100 y 1000 nm min-1, no producen variacin en los espectros de emisin, se
utilizar una velocidad de 240 nm min-1, valor que el programa usa por defecto.
254
Sensor monoparmetro para piridoxina
En este apartado, aparte de estudiar las variables qumicas (pH del portador y
de la muestra, as como la naturaleza y concentracin del portador/eluyente),
tambin se va a estudiar una variable fsica de inters en fluorimetra, como es la
255
Captulo VII
O Piridoxina
Caudal: 1.55 ml min-1; Volumen de inyeccin: 200 :l
256
Sensor monoparmetro para piridoxina
257
Captulo VII
5.3.3. Temperatura
258
Sensor monoparmetro para piridoxina
5.4.1. Caudal
259
Captulo VII
Para el estudio de esta variable, se sigue la seal analtica (IFR) que origina
la inyeccin de volmenes crecientes de analito de la misma concentracin, que
en nuestro caso va a ser 0.2 g ml-1 de piridoxina. La Figura VII-12 muestra los
resultados obtenidos.
260
Sensor monoparmetro para piridoxina
261
Captulo VII
262
Sensor monoparmetro para piridoxina
aPiridoxina
Volumen: 200 l IFR = 16.40 + 0.547 c r=0.9995
Volumen: 1000 l IFR = 0.00 + 2.284 c r=0.9996
Volumen: 2000 l IFR = -0.74 + 4.729 c r=0.9998
donde :
A: absorbancia
c: concentracin de analito (ng ml-1)
r: coeficiente de correlacin
263
Captulo VII
En la Tabla VII-1 se muestran los parmetros del sensor para los diferentes
volmenes de inyeccin empleados en el desarrollo de ste.
7. INTERFERENCIAS
264
Sensor monoparmetro para piridoxina
Tolerancia (p/p)
Especie extraa
[interferente]/[analito]
265
Captulo VII
8. APLICACIONES ANALTICAS
266
Sensor monoparmetro para piridoxina
267
Captulo VII
De acuerdo con los resultados mostrados podemos decir que hay buena
concordancia entre los resultados obtenidos por el mtodo propuesto y los
indicados por el fabricante. Para chequear la exactitud del mtodo propuesto se
llev a cabo un estudio de recuperacin de distintas cantidades de analito
268
Sensor monoparmetro para piridoxina
269
Captulo VII
9. BIBLIOGRAFA
270
CAPTULO VIII
SENSOR BIPARMETRO
PARA CIDO SALICLICO
Y SALICILAMIDA
Sensor biparmetro para cido saliclico-salicilamida
1. INTRODUCCIN
1.2. Salicilamida
273
Captulo VIII
274
Sensor biparmetro para cido saliclico-salicilamida
Tanto para el registro de los espectros como para la construccin del sensor,
se utiliz una cubeta Hellma 176-QS (Captulo VII), que posee 1.5-mm de paso
ptico.
275
Captulo VIII
276
Sensor biparmetro para cido saliclico-salicilamida
3.2. Topogramas
277
Captulo VIII
278
Sensor biparmetro para cido saliclico-salicilamida
Para realizar las medidas de fluorescencia en fase slida fue elegida una
longitud de onda de excitacin de 260 nm ya que, a este valor, la seal de fondo de
la resina era mnima y adems las longitudes de onda de emisin mxima para el
cido saliclico y la salicilamida eran muy prximas, 415 y 410 nm,
respectivamente; la longitud de onda de emisin se fij por ello a 415 nm.
279
Captulo VIII
4. CONFIGURACIN FIA
280
Sensor biparmetro para cido saliclico-salicilamida
281
Captulo VIII
282
Sensor biparmetro para cido saliclico-salicilamida
283
Captulo VIII
poliestireno (Dowex 1x8). El soporte que produce una mayor retencin de los dos
analitos es la resina Sephadex QAE A-25, por lo que se elige sta para el
desarrollo del sensor en estudio.
284
Sensor biparmetro para cido saliclico-salicilamida
285
Captulo VIII
286
Sensor biparmetro para cido saliclico-salicilamida
5.3.3. Temperatura
287
Captulo VIII
5.4.1. Caudal
288
Sensor biparmetro para cido saliclico-salicilamida
289
Captulo VIII
290
Sensor biparmetro para cido saliclico-salicilamida
cido saliclico-Salicilamida
excitacin (nm) 260
emisin (nm) 415
Soporte slido Sephadex QAE A-25
Caudal (ml min-1) 1.55
Volumen de muestra (l) 1000
pH=2 pH=11
Portador/eluyente NaCl 0.025M NaCl 0.05M
pH de la muestra 1-10 3-13
Una vez realizada la calibracin para cada uno de los analitos, se calculan los
parmetros de fiabilidad de cada uno de ellos. Las variables qumicas y FIA se
mantuvieron fijas en los valores anteriormente optimizados.
291
Captulo VIII
IFRI=IFRACS
IFRII=IFRACS + IFRSal (1)
cido Saliclico
pH=2 IFR ACS = 28.15 + 693.84 c r=0.9997
pH=11 IFR ACS = 36.79 + 1155.34 c r=0.9996
Salicilamida
pH=11 IFR Sal = 36.31 + 2613.95 c r=0.9994
donde :
IFR: intensidad de fluorescencia relativa
c: concentracin de analito (g ml-1)
r: coeficiente de correlacin
292
Sensor biparmetro para cido saliclico-salicilamida
IFRII=IFRACS + IFRSal
IFRSal=IFRII - IFRACS
293
Captulo VIII
7. INTERFERENCIAS
294
Sensor biparmetro para cido saliclico-salicilamida
295
Captulo VIII
8. APLICACIONES ANALTICAS
Por ltimo, en todos los casos, el excipiente insoluble se separ por filtracin
a travs de filtro Millipore de 0.45 m, llevndose a un volumen final de 100 ml.
Todas las disoluciones fueron diludas adecuadamente antes de ser inyectadas en la
corriente del portador. En ningn caso se comprob la existencia de efecto matriz,
de forma que se aplic directamente el mtodo de calibracin directa.
296
Sensor biparmetro para cido saliclico-salicilamida
297
Captulo VIII
298
Sensor biparmetro para cido saliclico-salicilamida
299
Captulo VIII
300
Sensor biparmetro para cido saliclico-salicilamida
9. BIBLIOGRAFA
301
CONCLUSIONES GENERALES
Conclusiones Generales
305
Conclusiones
3. El empleo de una resina intercambiadora de iones como soporte slido en la
misma zona de deteccin proporciona, en todos los casos: a) un gran incremento
en la sensibilidad; y b) una considerable exaltacin de la selectividad con
respecto al mtodo convencional en disolucin, como consecuencia de la
retencin selectiva y preconcentracin del analito en la zona de deteccin.
306
APNDICE
Apndice
309
Apndice
310
Apndice
311
Apndice
312
Apndice
313
Apndice
314
Apndice
[Epinefrina]enc
Determinacin A
(:g ml-1)
1 0.325 10.09
2 0.324 10.06
3 0.320 9.94
4 0.327 10.16
5 0.325 10.09
6 0.333 10.34
7 0.323 10.03
8 0.330 10.25
9 0.321 9.97
10 0.319 9.91
10.08
F 0.137
F2 0.019
Fm 0.043
t (0.05) 2.262
Fts 10.1 0.3
Fmts 10.1 0.1
C.V.(%)=(F/
)A100 1.36
Er(%)=(Fmts/
)A100 0.97
315
Apndice
N Blanco A
1 0.114
2 0.114
3 0.116
=0.115
4 0.115 F=1.82 x 10-3
5 0.116 cL=0.17 :g ml-1
6 0.115 cQ=0.57 :g ml-1
7 0.112
8 0.119
9 0.115
10 0.114
[Salicilamida]enc
Determinacin A
(:g ml-1)
1 0.570 90.00
2 0.573 90.49
3 0.569 89.83
4 0.572 90.33
5 0.570 90.00
6 0.570 90.00
7 0.579 91.48
8 0.575 90.82
9 0.568 89.67
10 0.569 89.83
316
Apndice
90.24
F 0.555
F2 0.308
Fm 0.176
t (0.05) 2.262
Fts 90.2 1.2
Fmts 10.1 0.4
C.V.(%)=(F/
)A100 0.61
Er(%)=(Fmts/
)A100 0.44
N Blanco A
1 -0.009
2 -0.010
3 -0.010
=-0.009
4 -0.009 F=7.36 x 10-4
5 -0.008 cL=0.35 :g ml-1
6 -0.009 cQ=1.22 :g ml-1
7 -0.010
8 -0.009
9 -0.009
10 -0.008
317
Apndice
[Salicilamida]enc
Determinacin A
(:g ml-1)
1 0.950 84.23
2 0.954 84.59
3 0.949 84.14
4 0.957 84.86
5 0.957 84.86
6 0.960 85.13
7 0.958 84.95
8 0.955 84.68
9 0.954 84.59
10 0.955 84.68
84.67
F 0.307
F2 0.094
Fm 0.097
t (0.05) 2.262
Fts 84.7 0.7
Fmts 84.7 0.2
C.V.(%)=(F/
)A100 0.36
Er(%)=(Fmts/
)A100 0.26
318
Apndice
N Blanco A
1 -0.027
2 -0.028
3 -0.028
=-0.028
4 -0.029 F=8.82 x 10-4
5 -0.029 cL=0.24 :g ml-1
6 -0.030 cQ=0.79 :g ml-1
7 -0.028
8 -0.029
9 -0.028
10 -0.028
[Paracetamol]enc
Determinacin A
(:g ml-1)
1 0.520 20.00
2 0.523 20.11
3 0.519 19.96
4 0.522 20.07
5 0.524 20.17
6 0.521 20.05
7 0.518 19.92
8 0.516 19.86
9 0.523 20.13
10 0.525 20.22
319
Apndice
20.05
F 0.568
F2 0.323
Fm 0.179
t (0.05) 2.262
Fts 20.0 1.3
Fmts 20.0 0.4
C.V.(%)=(F/
)A100 0.57
Er(%)=(Fmts/
)A100 2.02
N Blanco A
1 -0.014
2 -0.014
3 -0.015
=-0.015
4 -0.016 F=8.70 x 10-4
5 -0.016 cL=0.10 :g ml-1
6 -0.014 cQ=0.33 :g ml-1
7 -0.015
8 -0.015
9 -0.016
10 -0.014
320
Apndice
321
Apndice
322
Apndice
323
Apndice
324
Apndice
325
Apndice
326
Apndice
327
Apndice
328
Apndice
329
Apndice
330
Apndice
N Blanco IFR (200 :l) IFR (1000 :l) IFR (2000 :l)
1 2 5 8
2 2 6 9
3 3 5 9
4 3 6 8
5 4 6 8
6 2 6 9
7 3 5 8
8 3 5 9
9 2 6 9
10 3 6 8
[cido
Determinacin IFR Saliclico]enc
(:g ml-1)
1 510 0.695
2 513 0.699
3 515 0.702
4 518 0.707
5 515 0.702
6 512 0.698
7 520 0.709
8 507 0.691
9 505 0.688
10 514 0.701
331
Apndice
0.699
F 6.56 x 10-3
F2 4.30 x 10-5
Fm 2.07 x 10-3
t (0.05) 2.262
Fts 0.69 0.01
Fmts 0.699 0.004
C.V.(%)=(F/
)A100 0.94
Er(%)=(Fmts/
)A100 0.67
N Blanco IFR
1 10
2 8
3 11
=9.2
4 9 F=1.032
5 10 cL=4.46 ng ml-1
6 9 cQ=14.88 ng ml-1
7 8
8 8
9 9
10 10
332
Apndice
[cido
Determinacin IFR Saliclico]enc
(:g ml-1)
1 610 0.497
2 620 0.505
3 620 0.505
4 615 0.501
5 618 0.504
6 612 0.498
7 612 0.498
8 610 0.497
9 617 0.503
10 604 0.492
0.500
F 4.29 x 10-3
F2 1.84 x 10-5
Fm 1.35 x 10-3
t (0.05) 2.262
Fts 0.50 0.01
Fmts 0.500 0.003
C.V.(%)=(F/
)A100 0.86
Er(%)=(Fmts/
)A100 0.61
333
Apndice
N Blanco IFR
1 7
2 7
3 8
=7.8
4 8 F=0.788
5 9 cL=2.04 ng ml-1
6 7 cQ=6.82 ng ml-1
7 9
8 8
9 8
10 7
[Salicilamida]enc
Determinacin IFR
(:g ml-1)
1 560 0.201
2 555 0.198
3 559 0.200
4 562 0.202
5 560 0.201
6 551 0.197
7 569 0.204
8 565 0.202
9 564 0.202
10 570 0.204
334
Apndice
0.201
F 2.28 x 10-3
F2 5.19 x 10-6
Fm 7.22 x 10-4
t (0.05) 2.262
Fts 0.201 0.005
Fmts 0.201 0.002
C.V.(%)=(F/
)A100 1.13
Er(%)=(Fmts/
)A100 0.81
N Blanco IFR
1 7
2 7
3 8
=7.8
4 8 F=0.788
5 9 cL=0.90 ng ml-1
6 7 cQ=3.01 ng ml-1
7 9
8 8
9 8
10 7
335
Apndice
336
CONTRIBUCIONES CIENTFICAS
QUE FORMAN PARTE DE ESTA
TESIS DOCTORAL
Contribuciones cientficas
PUBLICACIONES
339
Contribuciones cientficas
COMUNICACIONES A CONGRESOS
340
Contribuciones cientficas
341