Facultad de Veterinaria

UNIVERSIDAD DE MURCIA

TESIS DOCTORAL

Adicin de probiticos y prebiticos a

frmulas infantiles y su efecto sobre la
biodisponibilidad mineral

Daro Prez Conesa

Murcia 2003

1
NDICE

I. INTRODUCCIN................................................................................................................. 13
II. OBJETIVOS........................................................................................................................ 15
III REVISIN BIBLIOGRFICA............................................................................................. 16
1. LA ALIMENTACIN INFANTIL........................................................................................... 16
1.1. Recuerdo histrico.............................................................................................................. 16
1.2. Maduracin morfolgica y funcional del tubo digestivo del nio.............................................. 16
1.3. Alimentacin en la primera infancia...................................................................................... 18
1.4. Nutricin y metabolismo de los minerales............................................................................. 24
1.4.1. Necesidades nutricionales de los minerales........................................................................ 30
2. ALIMENTOS FUNCIONALES............................................................................................... 32
2.1. Concepto de alimento funcional........................................................................................... 32
2.2. Dianas que presentan un mayor inters en el desarrollo de nuevos alimentos......................... 33
2.3. Proclamas alimentarias reivindicativas de efectos beneficiosos para la salud (Health claims)..... 34
2.4. Oligosacridos no digeribles (OND) como ingredientes alimenticios funcionales....................... 35
3. BIFIDOBACTERIAS............................................................................................................ 37
3.1. Descubrimiento e historia.................................................................................................... 37
3.2. Morfologa, fisiologa, metabolismo y ecologa....................................................................... 37
3.3. Medios y parmetros de cultivo............................................................................................ 40
4. FLORA INTESTINAL HUMANA ........................................................................................... 43
4.1. Adquisicin de la microbiota del intestino por los neonatos.................................................... 44
4.2. Desarrollo de la flora intestinal y factores influyentes............................................................. 45
4.3. El colon humano................................................................................................................. 48
4.3.1. La microflora del colon..................................................................................................... 48
4.3.2. Efectos fisiolgicos de la microflora del colon..................................................................... 49
4.3.3. Bifidobacterias y sus efectos beneficiosos en la salud humana............................................. 49
4.3.4. Caractersticas de la fermentacin en el colon humano....................................................... 50
4.3.5. El colon y la accin de su microbiota en la infancia............................................................. 53
5. BENEFICIOS DE LA LECHE MATERNA ............................................................................... 54
5.1. Oligosacridos no digeribles (OND) de la leche humana......................................................... 55
6. PROBITICOS.................................................................................................................... 59
6.1. Definicin y evolucin del trmino probitico......................................................................... 59
6.2. Criterios que deben cumplir los probiticos........................................................................... 59
6.3. Microorganismos utilizados comnmente como probiticos.................................................... 61
6.4. Valoracin in vitro de cepas bacterianas como potenciales probiticos.................................... 62
6.4.1. Resistencia a la acidez gstrica.......................................................................................... 62
6.4.2. Resistencia a los cidos biliares......................................................................................... 62
6.4.3. Adherencia de los aislados bacterianos del leon a las lneas celulares humanas.................... 63
6.5. Efectos de los probiticos.................................................................................................... 63
6.6. Eficacia y seguridad de los probiticos.................................................................................. 66
7. PREBITICOS.................................................................................................................... 68

2
7.1. Definicin y criterios que debe cumplir un prebitico............................................................. 68
7.2. Oligosacridos (OS) y Oligosacridos no digeribles (OND)...................................................... 68
7.2.1. Propiedades de los OS...................................................................................................... 69
7.2.2. Tipos de OS..................................................................................................................... 70
7.3. Efecto fisiolgico de los OND a nivel sistmico...................................................................... 73
7.4. Galactooligosacridos (GOS)................................................................................................ 76
7.4.1. Produccin y propiedades de los GOS................................................................................ 76
7.4.2. Efectos de los GOS sobre la salud humana......................................................................... 76
7.5. Efecto de los OND en la absorcin mineral............................................................................ 80
7.5.1. Estudios en animales........................................................................................................ 81
7.5.2. Estudios en humanos....................................................................................................... 88
7.6. Mtodos para evaluar el potencial de los prebiticos.............................................................. 90
7.7. Empleo de oligosacridos (OS) frente a la fibra diettica (FD)................................................ 91
7.8. Dosis y efectos secundarios................................................................................................. 92
8. SIMBITICOS.................................................................................................................... 93
9. OLIGOSACRIDOS (OS) EN LA ALIMENTACIN INFANTIL............................................. 94
IV. MATERIAL Y METODOS.................................................................................................... 96
1. DISEO EXPERIMENTAL................................................................................................... 96
2. MATERIALES...................................................................................................................... 98
2.1. Alimentos problema............................................................................................................ 98
2.1.1. Frmulas infantiles........................................................................................................... 98
2.1.2. Dieta de mantenimiento para animales de laboratorio......................................................... 100
2.2. Bifidobacterias.................................................................................................................... 100
2.3. Oligosacridos no digeribles (OND)...................................................................................... 100
3. METODOLOGA EXPERIMENTAL Y ANALTICA................................................................ 102
1er ESTUDIO
3.1. Evaluacin in vitro del crecimiento de bifidobacterias y del cambio de pH del medio de cultivo,
en presencia de diferentes oligosacridos (OS)............................................................................ 102
2 ESTUDIO
3.2. Evaluacin del grado de viabilidad de las bifidobacterias en las frmulas infantiles................... 105
3.3. Composicin flora intestinal de bebs alimentados con frmula infantil probitica.................... 107
3er ESTUDIO
3.4. Anlisis nutricional de las dietas empleadas en el presente estudio......................................... 114
3.4.1. Determinacin de la humedad........................................................................................... 114
3.4.2. Determinacin de la protena bruta.................................................................................... 115
3.4.3. Determinacin de la grasa bruta........................................................................................ 117
3.4.4. Determinacin de las cenizas............................................................................................ 118
3.4.5. Determinacin de la fibra diettica total (FDT).................................................................. 118
3.4.6. Determinacin de los hidratos de carbono.......................................................................... 120
3.4.7. Valor energtico............................................................................................................... 121
3.4.8. Determinacin de la composicin mineral (Ca, Mg y Fe)...................................................... 121
3.4.9. Determinacin de fsforo (P) total..................................................................................... 124

3
3.5. Estudio in vivo con ratas del efecto de los probiticos, prebiticos y simbiticos en frmulas
infantiles sobre la absorcin mineral........................................................................................... 126
3.5.1. Animales......................................................................................................................... 126
3.5.2. Dietas............................................................................................................................. 127
3.5.3. Pauta de recogida de datos y toma de muestras................................................................ 127
3.5.3.1. Ingesta de alimento, toma de peso en vivo, recogida de heces y orina.............................. 127
3.5.3.2. Anestesia y diseccin .................................................................................................... 129
3.5.4. Preparacin de muestras.................................................................................................. 131
3.5.5. Determinacin de parmetros hematolgicos..................................................................... 133
3.5.6. Determinacin de parmetros bioqumicos......................................................................... 133
3.5.7. Recuento de bifidobacterias fecales de las ratas................................................................. 135
3.5.8. Determinacin del contenido mineral................................................................................. 137
3.5.9. Determinacin del contenido mineral en la fase lquida y slida de los contenidos del ciego y
del colon................................................................................................................................... 138
3.5.10. Anlisis histolgico del epitelio de la pared del ciego y colon.............................................. 139
3.5.11. Clculos realizados para la evaluacin del balance mineral................................................ 143
3.5.12. Validacin de la determinacin mineral............................................................................ 143
4. ANLISIS ESTADSTICO.................................................................................................... 144
V. RESULTADOS Y DISCUSIN.............................................................................................. 145
1er ESTUDIO
1. Evaluacin in vitro del crecimiento de bifidobacterias y del cambio de pH del medio de cultivo,
en presencia de diferentes oligosacridos no digeribles (OND)...................................................... 145
2 ESTUDIO
2. Evaluacin del grado de viabilidad de las bifidobacterias en las frmulas infantiles...................... 153
3. Composicin de la flora intestinal de bebs alimentados con frmula infantil probitica............... 157
3er ESTUDIO
4. Estudio in vivo con ratas del efecto de los probiticos, prebiticos y simbiticos en frmulas
infantiles sobre la absorcin mineral........................................................................................... 165
4.1. Efecto sobre las medidas fisiolgicas y tasa de crecimiento de las ratas.................................. 165
4.2. Parmetros hematolgicos y bioqumicos en las ratas............................................................ 170
4.3. Recuento microbiolgico total y de bifidobacterias fecales en heces de ratas........................... 174
4.4. Balances minerales............................................................................................................. 176
4.4.1. Balance mineral del calcio................................................................................................. 176
4.4.2. Balance mineral del magnesio........................................................................................... 181
4.4.3. Balance mineral del fsforo............................................................................................... 185
4.4.4. Balance mineral del hierro............................................................................................... 188
4.5. Efecto sobre el ciego y el colon de las ratas.......................................................................... 192
4.5.1. Peso y valor de pH del ciego y del colon y sus contenidos................................................... 192
4.5.2. Distribucin de los minerales en la fase lquida y slida del contenido del ciego y del colon.... 195
4.5.3. Morfologa de la mucosa del ciego y del colon.................................................................... 198
4.6. Efecto sobre la mineralizacin del fmur y la tibia de las ratas................................................ 201
4.7. Relacin entre las variables morfolgicas y pH del intestino grueso, la biodisponibilidad

4
mineral y la mineralizacin sea................................................................................................. 204
4.7.1. Efecto del peso inicial de las ratas en los pesos de los rganos diana (ciego, colon, fmur y
tibia)........................................................................................................................................ 204
4.7.2. Estudio de correlacin entre los diferentes parmetros morfolgicos y pH del intestino
grueso, la biodisponibilidad mineral y la mineralizacin sea......................................................... 204
4.7.3. Estudio de regresin entre la absorcin mineral, los parmetros morfolgicos y el pH del
intestino grueso......................................................................................................................... 209
4.7.4 Anlisis factorial................................................................................................................ 214
VI. CONCLUSIONES............................................................................................................... 221
VII. RESUMEN........................................................................................................................ 223
VIII. SUMMARY...................................................................................................................... 225
IX. BIBLIOGRAFA ................................................................................................................. 227
X. Addition of probiotics and prebiotics to infant formulas and their effect on mineral
bioavailability....................................................................................................................... 252
I. INTRODUCTION................................................................................................................. 253
II. OBJECTIVES..................................................................................................................... 255
III. MATERIAL AND METHODS.............................................................................................. 256
Experimental schedule............................................................................................................... 256
1st STUDY
In vitro evaluation of bifidobacteria growth and pH variation of the culture broth with different
non-digestible oligosaccharides (NDO)........................................................................................ 258
2nd STUDY
Infant formulas......................................................................................................................... 259
Viability of bifidobacteria in commercial powder infant formula..................................................... 261
Composition of faecal microflora in infants fed control or probiotic formula during the first year of
life............................................................................................................................................ 262
3rd STUDY
Nutritional composition of the experimental diets......................................................................... 263
In vivo study with rats of the effect of follow-up infant formulas containing probiotics, prebiotics
and synbiotics on mineral absorption.......................................................................................... 265
Animals.................................................................................................................................... 265
Diets......................................................................................................................................... 265
Collection and processing of samples.......................................................................................... 266
Determination of the haematological and biochemical parameters................................................. 268
Enumeration of total bacteria and bifidobacteria in faeces of rats.................................................. 269
Determination of the mineral content.......................................................................................... 270
Determination of the mineral content in the solid and liquid phases of the content s of cecum and
colon........................................................................................................................................ 270
Histologist study of the epithelium of the wall of cecum and colon................................................ 271
Calculations for the evaluation of mineral balance........................................................................ 272
Validation of mineral determination............................................................................................. 272
Statistical analysis...................................................................................................................... 272

5
IV. RESULTS AND DISCUSSION............................................................................................ 274
1st STUDY
In vitro evaluation of bifidobacteria growth and pH variation of the culture broth with different
non-digestible oligosaccharides (NDO)........................................................................................ 274
2nd STUDY
1. Viability of bifidobacteria in commercial powder infant formula.................................................. 281
2. Composition of faecal microflora in infants fed control or probiotic formula during the first year
of life........................................................................................................................................ 284
3rd STUDY
In vivo study with rats of the effect of follow-up infant formulas containing probiotics, prebiotics
and synbiotics on mineral absorption.......................................................................................... 292
1. Effect on physiological measurements and growth ratio of rats................................................. 292
2. Haematological and biochemical parameters in rats.................................................................. 295
3. Enumeration of total bacteria and bifidobacteria in faeces of rats.............................................. 296
4. Mineral balances.................................................................................................................... 299
4.1. Balance of calcium.............................................................................................................. 299
4.2. Balance of magnesium........................................................................................................ 303
4.3. Balance of phosphorous...................................................................................................... 305
4.4. Balance of iron................................................................................................................... 309
5. Effect on cecum and colon of rats........................................................................................... 312
5.1. Cecal and colonic parameters (weight and pH)...................................................................... 312
5.2. Mineral distribution in the liquid and solid phase of cecal and colonic contents........................ 314
5.3. Epithelial cell proliferation in cecal and colonic mucosa of rats................................................ 315
6. Effect on mineral content of the femur and tibia in rats............................................................ 319
7. Relationship among morphology variables and pH of the large intestine content, mineral
bioavailabilty and bone mineralization......................................................................................... 321
7.1. Effect of initial body weight on the weight of target organs (cecum, colon, femur and tibia)..... 321
7.2. Correlation study among morphology parameters, pH of the large intestine content, mineral
bioavailability and bone mineralization........................................................................................ 322
7.3. Regression study among mineral absorption, morphological parameters and the pH of the
large intestinal content............................................................................................................... 323
7.4. Factorial analysis................................................................................................................ 325
V. CONCLUSIONS ................................................................................................................... 331

ndice de Tablas

REVISIN BIBLIOGRFICA
Tabla 1. Composicin de la leche humana y de la leche de vaca.................................................. 21
Tabla 2. Recomendaciones para la elaboracin de una frmula de continuacin............................ 23
Tabla 3. Recomendaciones diarias de minerales en los tres primeros aos de vida........................ 30
Tabla 4. Especies del gnero Bifidobacterium en funcin de su origen.......................................... 38
Tabla 5. Medios de cultivo bsicos y no selectivos para bifidobacterias en productos lcteos.......... 41

6
Tabla 6. Medios de cultivo selectivos para el recuento de bifidobacterias presentes en muestras
fecales (MF) y en productos lcteos (PL)..................................................................................... 42
Tabla 7. Oligosacridos de la leche humana............................................................................... 56
Tabla 8. Seleccin de criterios para las cepas probiticas............................................................ 60
Tabla 9. Especies bacterianas empleadas como probiticos......................................................... 61
Tabla 10. Efectos de probiticos descritos sobre el sistema digestivo........................................... 64
Tabla 11. Efectos de los probiticos sobre el sistema inmunitario................................................ 65
Tabla 12. Clasificacin de los principales hidratos de carbono de la dieta..................................... 69
Tabla 13. Nombre y estructura qumica de los oligosacridos (OS).............................................. 71
MATERIAL Y MTODOS
Tabla 14. Ingredientes de Leche 2 de continuacin y Leche 2 de continuacin probitica.............. 98
Tabla 15. Bifidobacterias utilizadas para la evaluacin de diferentes oligosacridos....................... 100
Tabla 16. Substratos utilizados para el crecimiento de las bifidobacterias..................................... 100
Tabla 17. Preparacin e interpretacin de la escala de MacFarland.............................................. 103
Tabla 18. Diseo del estudio de la viabilidad de las bifidobacterias aadidas a las frmulas
infantiles en funcin de la pauta de administracin indicada por el fabricante................................ 107
Tabla 19. Alimentacin de los bebs participantes en el estudio de la flora fecal infantil durante el
primer ao de vida.................................................................................................................... 110
Tabla 20. Condiciones de cultivo de los microorganismos investigados de la flora fecal infantil...... 111
Tabla 21. Substratos incluidos en cada uno de los 50 pocillos de la galera enzimtica para
bacterias cido-lcticas api 50 CH............................................................................................... 112
Tabla 22. Dietas empleadas en el estudio in vivo con ratas del efecto de los probiticos,
prebiticos y simbiticos en frmulas infantiles la absorcin mineral.............................................. 114
Tabla 23. Condiciones instrumentales establecidas para la determinacin de los minerales (Ca,
Mg y Fe) investigados................................................................................................................ 122
Tabla 24. Clculo de las concentraciones de los minerales (Ca, Mg y Fe) analizados en las
diferentes muestras................................................................................................................... 123
Tabla 25. Concentraciones de los patrones utilizados, ecuaciones de las rectas de calibrado y
coeficientes de linealidad (R2) para las rectas patrn cada uno de los minerales determinados........ 123
Tabla 26. Clculo de las concentraciones de fsforo (P) analizado en las diferentes muestras........ 126
Tabla 27. Composicin nutricional de las dietas empleadas en el presente estudio de
investigacin............................................................................................................................. 127
Tabla 28. Medios de cultivo empleados en el recuento de las bifidobacterias y de flora total
aerobia y anaerobia intestinal en ratas........................................................................................ 137
RESULTADOS Y DISCUSIN
Tabla 29. Anlisis de varianza del pH del medio de cultivo y del crecimiento de 4 especies de
bifidobacterias (expresado en DO y log ufc/mL) utilizando como fuente de variacin el substrato,
el tiempo de incubacin y la interaccin entre ambos................................................................... 145
Tabla 30. Valores finales de crecimiento de bifidobacterias expresado como densidad ptica (DO)
y de pH del caldo de cultivo obtenidos al 7 da de incubacin...................................................... 149
Tabla 31. Anlisis de varianza del recuento de bifidobacterias en las frmulas infantiles durante el
periodo de consumo por el lactante (6 y 14 das)........................................................................ 154

7
Tabla 32. Anlisis de varianza de los recuentos de la microbiota fecal infantil y del pH a lo largo
del 1er ao de vida entre los grupos alimentados con frmula control y frmula probitica.............. 158
Tabla 33. Recuento microbiolgico en muestras fecales infantiles a lo largo del 1er ao de vida..... 159
Tabla 34. Valor de pH de las muestras fecales infantiles a lo largo del 1er ao de vida................... 160
Tabla 35. Anlisis de varianza de los recuentos de la microbiota fecal infantil a diferentes edades
entre los grupos alimentados con frmula control y frmula probitica.......................................... 161
Tabla 36. Patrn de fermentacin de las bifidobacterias aisladas de las muestras fecales infantiles
mediante la galera api 50CH...................................................................................................... 164
Tabla 37. Anlisis de varianza de los parmetros peso final, ganancia de peso, ingestin de
alimento y eficiencia alimentaria debido a las dietas objeto de estudio, y estudio del efecto del
peso inicial de los animales en la variacin de estos parmetros................................................... 166
Tabla 38. Crecimiento y eficiencia alimentaria............................................................................ 167
Tabla 39. Medidas fisiolgicas de las ratas................................................................................. 171
Tabla 40. Valores hematolgicos y bioqumicos de las ratas alimentadas con diferentes dietas
durante 30 das......................................................................................................................... 173
Tabla 41. Recuento microbiolgico de aerobios, anaerobios y bifidobacterias en heces de ratas..... 175
Tabla 42. Balance mineral del calcio.......................................................................................... 178
Tabla 43. Balance mineral del magnesio.................................................................................... 184
Tabla 44. Balance mineral del fsforo........................................................................................ 187
Tabla 45. Balance mineral del hierro.......................................................................................... 191
Tabla 46. Peso y pH del ciego y su contenido en ratas................................................................ 192
Tabla 47. Peso y pH del colon y su contenido en ratas................................................................ 193
Tabla 48. Distribucin de los minerales en las fases lquida y slida del contenido del ciego y del
colon........................................................................................................................................ 197
Tabla 49. Morfologa de la mucosa del colon y del ciego de las ratas........................................... 200
Tabla 50. Mineralizacin del fmur en ratas............................................................................... 202
Tabla 51. Mineralizacin de la tibia en ratas............................................................................... 203
Tabla 52. Estudio del efecto del peso inicial de los animales en la variacin de los pesos de los
rganos diana........................................................................................................................... 204
Tabla 53. ndices de correlacin entre el pH del contenido del ciego y colon con los parmetros
histolgicos en la mucosa del ciego y colon................................................................................. 205
Tabla 54. Coeficientes de correlacin entre la absorcin aparente mineral y los parmetros
medidos en el intestino grueso................................................................................................... 206
Tabla 55. Coeficientes de correlacin entre la retencin mineral y los parmetros medidos en el
intest ino grueso......................................................................................................................... 206
Tabla 56. Estudio de correlacin establecido entre el contenido mineral del fmur y los balances
minerales y parmetros medidos en el intestino grueso................................................................ 207
Tabla 57. Estudio de correlacin establecido entre el contenido mineral de la tibia y los balances
minerales y parmetros medidos en el intestino grueso................................................................ 208

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ndice de Figuras

REVISIN BIBLIOGRFICA
Figura 1. Distribucin de las principales especies bacterianas en el aparato digestivo.................... 43
Figura 2. Cambios de la flora intestinal desde el nacimiento hasta la vejez................................... 46
Figura 3. Diferencias regionales en la funcin del intestino grueso humano.................................. 48
Figura 4. Esquema general de la fermentacin por la flora bacteriana del colon............................ 51
Figura 5. Representacin esquemtica de la formacin de AGCC en la fermentacin de la
bacterias del colon..................................................................................................................... 52
Figura 6. Estructura tpica de un oligosacrido........................................................................... 61
Figura 7. Esquema que representa los procesos de produccin de los oligosacridos (OS)............. 72
MATERIAL Y MTODOS
Figura 8. Representacin grfica del diseo experimental del presente estudio de
investigacin............................................................................................................................. 97
Figura 9. Estructura qumica de los componentes mayoritarios de los OND utilizados para el
crecimiento selectivo de las bifidobacterias.................................................................................. 99
Figura 10. Diagrama de flujo de la elaboracin de Leche 2 de continuacin y Leche 2 de
continuacin probitica.............................................................................................................. 101
Figura 11. Representacin de la recta de calibrado para la escala MacFarland.............................. 104
Figura 12. Galera enzimtica (metabolismo de hidratos de carbono) api 50 CHL para bacterias
cido-lcticas............................................................................................................................ 113
Figura 13. Representacin de la recta de calibrado para el fsforo (P)......................................... 125
Figura 14. Diseo experimental del estudio in vivo con ratas del efecto de los probiticos,
prebiticos y simbiticos en frmulas infantiles sobre la absorcin mineral..................................... 130
Figura 15. Metodologa seguida en el estudio in vivo con ratas.................................................... 131
Figura 16. Imagen de las criptas epiteliales del colon proximal de ratas....................................... 142
RESULTADOS Y DISCUSIN
Figura 17. Grficos de medias obtenidas para la interaccin del tiempo de incubacin con el
substrato, donde se muestra el crecimiento de las bifidobacterias (Bifidobacterium bifidum, B.
breve, B. infantis, B. longum) mediante la medicin de cambios en la DO y log ufc/mL.................. 147
Figura 18 Grficos de medias obtenidas para la interaccin del tiempo de incubacin con el
substrato, donde se muestran los cambios de pH en el caldo TPY (glucosa, FOS cc, inulina,
oligofructosa y 4-GOS) incubado con bifidobacterias (Bifidobacterium bifidum, B. breve, B.
infantis, B. longum)................................................................................................................... 148
Figura 19. Viabilidad de las bifidobacterias aadidas a la frmula infantil durante el periodo de
consumicin del bote (6 das) y humedad de la frmula durante dicho periodo.............................. 154
Figura 20. Viabilidad de las bifidobacterias aadidas a la frmula infantil durante el periodo de
consumicin del bote (14 das) y humedad de la frmula durante dicho periodo............................ 155
Figura 21. Recuento de bifidobacterias en los grupos alimentados con frmula control y frmula
probitica durante el 1er ao de vida........................................................................................... 162
Figura 22. pH de las heces infantiles en los grupos alimentados con frmula control y frmula
probitica durante el 1er ao de vida........................................................................................... 162

9
Figura 23. Representacin grfica de la relacin lineal entre la absorcin de Ca y la altura de las
criptas del colon distal................................................................................................................ 209
Figura 24. Representacin grfica tridimensional de la relacin entre la absorcin de Mg, la
densidad celular del colon distal y la altura de las criptas del colon proximal.................................. 210
Figura 25. Representacin grfica tridimensional de la relacin entre la absorcin de Mg, la
densidad celular del colon distal y el pH del contenido del ciego.................................................... 211
Figura 26. Representacin grfica tridimensional de la relacin entre la absorcin de Mg, el pH
del contenido del ciego y del colon.............................................................................................. 212
Figura 27. Representacin grfica tridimensional de la relacin entre la absorcin de Fe, el pH del
contenido del colon y la altura de las criptas del colon proximal.................................................... 214
Figura 28. Anlisis de componentes principales (ACP) para el calcio............................................ 216
Figura 29. Anlisis de componentes principales (ACP) para el magnesio...................................... 217
Figura 30. Anlisis de componentes principales (ACP) para el fsforo.......................................... 218
Figura 31. Anlisis de componentes principales (ACP) para el hierro............................................ 219

10
ABREVIATURAS

%................. Porcentaje h................. Hora

................... Ms menos H2................ Hidrgeno
g................. Microgramos H2O2............ Perxido de hidrgeno
L................. Microlitros H2S.............. cido sulfhdrico
aa................. Aminocidos H2SO4.......... cido sulfrico
AA................. Absorcin aparente H3BO3.......... cido brico
AAP.............. American Academy of Pediatrics H3PO4.......... cido fosfrico
Abs............... Absorbancia Hb............... Hemoglobina
ACP............... Anlisis de Componentes Principales HCl.............. cido clorhdrico
ADN.............. cido Desoxirribonucleico HCO3-.......... Bicarbonato
ADP.............. Adenosin-difosfato HDL............. Lipoprotenas de alta densidad
AG................ cidos Grasos HNO3........... cido ntrico
AGCC............ cidos Grasos de Cadena Corta Ht................ Hematocrito
AGCR............ cidos Grasos de Cadena Ramificada ID................ Intestino delgado
AMP.............. Adenosn Monofosfato Ig................ Inmunoglobulina
ANOVA......... Anlisis de Varianza unifactorial IOS............. Isomaltooligosacridos
AOAC............ Association of Official Analytical Chemist K................. Potasio
APTG............ Agua de Peptona Tamponada y kcal............. Kilocaloras
Glucosada
ARN.............. cido ribonucleico k-Da............ Kilodaltons
ARNr............ cido ribonucleico ribosomal kg................ Kilogramos
ATP.............. Adenosn-Trifosfato kJ................ Kilojulios
BAL............... Bacterias cido Lcticas L.................. Litros
BBE............... Bacteroides Bilis Esculina LaCl3........... Cloruro de lantano
Ca................. Calcio LDL............. Lipoprotenas de baja densidad
CBA.............. Columbia Base Agar Log.............. Logaritmo decimal
CECT............. Coleccin Espaola de Cultivos Tipo LSRO........... Life Sciences Research Office
CH4............... Metano M................. Molaridad
Cl................. Cloro Mb............... Mioglobina
cm................ Centmetros mEq............. Miliequivalentes
CO2............... Dixido de carbono Mg............... Magnesio
COL............... Colesterol mg.............. Miligramos
col................ Colaboradores Min.............. Minutos
Cu................. Cobre mL............... Mililitros
DO................ Densidad ptica mm............. Milmetros
DT................. Disacridos Transgalactosilados MOS............ Maltooligosacridos
EAA............... Espectrofotometra de Absorcin N................. Nitrgeno
Atmica
ESPGAN....... European Society of Pediatrics Na............... Sodio
Gastroenterology and Nutrtition
F6PPK........... Fructosa 6-Fosfato Fosfoketolasa NaCl............ Cloruro sdico
FAO.............. Food and Agriculture Organization of the NaOH............ Hidrxido sdico
United Nations
FD................. Fibra Diettica NCR.............. National Council Research
FDA.............. Food and Drug Administration NH 3............... Amoniaco
Fe................. Hierro NH 4+ ............. Amonio
FL................. Fase Lquida nm............... Nanmetros
FOS cc.......... Fructooligosacridos de Cadena Corta N................. Nmero
FOS............... Fructooligosacridos NS................ No Significativo
FOSHU.......... Foods for Specified Health Use O2................. Oxgeno
o
FS................. Fase Slida C................. Grado centgrado
g................... Gramos OMS.............. Organizacin Mundial de la Salud
G+C.............. Guanina ms citosina OND.............. Oligosacridos no digeribles
GES............... Gentioligosacridos OS................ Oligosacridos
GI................. Gastrointestinal P................... Fsforo
GLDH............ Glutamato deshidrogenasa p................... Nivel de significacin estadstico
GOS.............. Galactooligosacridos Pa................. Para anlisis
GP................ Grado de Polimerizacin PCR.............. Reaccin en Cadena de la
Polimerasa
GRAS............ Generally Recognized As Safe Pf.................. Peso fresco
GUS............. Glucooligosacridos Pi.................. Fsforo inorgnico

11
Pm................ Peso molecular
POS.............. Palatinosaoligosacridos
p/p............... Peso/peso
Ppm.............. Partes por milln
PS................. Polisacridos
Ps................. Peso seco
p/v............... Peso/volumen
r................... Coeficiente de correlacin
R2................. Coeficiente de linealidad
RB................ Rafinosa Bifidobacterium
RDR.............. Raciones Dietticas Recomendadas
RGR.............. Recuento de Glbulos Rojos
rpm.............. Revoluciones por minuto
RPS.............. Solucin de Pptona Fisiolgica
Reducida
SCF............... Scientific Committee on Food
Seg............... Segundos
Sem.............. Semanas
SOS.............. Sojaoligosacridos
SSF............... Solucin Salina Fisiolgica
TG................. Triglicridos
TIBC............. Capacidad total de fijacin del hierro
TOS.............. Transgalactooligosacridos
TSC............... Triptosa Sulfito Cicloserina
ufc................ Unidades formadoras de colonias
UI................. Unidades Internacionales
v/v............... Volumen/volumen
VLDL............. Lipoprotenas de muy baja densidad
x g................ Fuerza de la gravedad
XOS.............. Xilooligosacridos
4-GOS.......... 4-Galactosil-lactosa
6-GOS.......... 6-Galactosil-lactosa
Zn................. Zinc

12
INTRODUCCIN

Hay muy buenas razones para estudiar la nutricin y el crecimiento durante la infancia,
puesto que es el periodo de la vida donde la velocidad de crecimiento y las demandas
nutricionales son mayores. Los nios triplican el peso e incrementan su longitud en un 50%
durante el primer ao. De hecho, este proceso se hace ms evidente durante el primer mes de
vida, cuando el crecimiento es especialmente rpido, ya que ganan unos 200 g de peso e
incrementan su longitud en 1 cm cada semana. Paralelamente, los rganos crecen y maduran a
un ritmo elevado. Estudios con animales han demostrado que deficiencias en la dieta durante
los periodos sensibles a edades tempranas pueden tener consecuencias metablicas a largo
plazo (Sultan y Barker, 1994), especialmente sobre el desarrollo del individuo, pudiendo ser
origen de ciertas enfermedades (Lucas y col., 1990).
La alimentacin a pecho tiene un papel muy especial en la alimentacin de los bebs y
se considera superior a la alimentacin con frmula desde el punto de vista cualitativo
(Standing Committee on Nutrition of the British Paediatric Association, 1994). Es la alimentacin
natural durante la primera infancia la ms importante desde el punto de vista nutricional. Sin
embargo, y aunque dos terceras partes de los nios sanos del todo el mundo son inicialmente
alimentados a pecho, sta cantidad se reduce considerablemente durante el periodo de
lactancia. Consecuentemente, una gran poblacin de nios sanos es alimentada con lactancia
artificial mediante el uso de frmulas infantiles comerciales. Esto crea el reto de proporcionar
los nutrientes y otros factores bioactivos que estimulen el desarrollo de una microbiota que
promueva el desarrollo gastrointestinal y la salud. Este desafo es mayor cuando se consideran
casos de cuidados crticos, tales como nios que nacen de forma prematura y otros nios que
requieren una nutricin entrica o parenteral. Claramente, la nutricin infantil proporciona una
razn muy importante y prctica para el entendimiento del desarrollo ecolgico del intestino del
neonato (Gaskins y Lien, 1999).
Aunque la alimentacin a pecho es considerada hoy en da como el mtodo natural y
preferible para alimentar a los nios, no siempre se ha pensado as. En el ao 1500 las mujeres
aristcratas de Inglaterra pensaban que amamantar a un nio era un inconveniente y que
envejeca a las madres de forma prematura. Por tanto, se lleg a establecer que la alimentacin
a pecho deba ser realizada por parte de madres sustitutivas. Las mujeres de clase alta de
cualquier parte del mundo a menudo tenan de 12 a 20 nios, incluso 30 no era inusual, y el
empleo de amas de cra era la nica alternativa segura y responsable (Udall y Kilbourne, 1988).
La tecnologa moderna introdujo un cambio en la alimentacin infantil, la frmula
basada en la leche de vaca. El desarrollo de esta frmula fue promovido por el descubrimiento
de la pasteurizacin de la leche y la mejora de la digestibilidad de la leche de vaca tras el
tratamiento trmico. La primera frmula basada en leche de vaca se comercializ en 1867 por
el qumico alemn Von Liebig. El xito comercial de sta frmula engendr un producto
substituto de la leche humana entre finales del siglo XIX y principios del XX. Esta frmula podra

13
ser dividida en lneas generales en tres tipos: leche de vaca desecada combinada con un cereal
azucarado, alguna forma de hidrato de carbono malteado y cereales usados con leche de vaca
fresca (Anderson y col., 1982). Como los requerimientos nutricionales del nio fueron estimados
durante las dcadas siguientes, el valor nutricional de la frmula humanizada mejorada y su
composicin empezaron a imitar con detalle la composicin de la leche humana.
La produccin y distribucin de la frmula infantil se ha convertido en un propsito
complejo durante el siglo XX. Ello comprende el conocimiento de los requerimientos
nutricionales y la fisiologa de la digestin y absorcin de nutrientes, la tecnologa de la
produccin de frmulas y la economa de producir frmulas infantiles nutritivas y saludables a
un precio razonable. Hoy en da se sabe que la dieta, entre otros factores ambientales y
genticos, tiene un importante papel sobre el estado de salud y de enfermedad del individuo.
Tambin hay una evidencia cada vez ms creciente de que la microbiota del colon humano
puede contribuir de forma positiva sobre la nutricin y salud del hospedador. As pues, la
capacidad de modular la dieta ha sido propuesta como un factor importante para mejorar la
salud del intestino humano, especialmente durante un periodo de vida tan sensible como la
infancia (Mountzouris y col., 2002).
Numerosos autores han descrito la existencia de diferencias en la composicin de la
microflora del intestino y en la incidencia de infecciones entre los bebs alimentados con
lactancia materna y lactancia artificial. Aunque el desarrollo de frmulas infantiles ha avanzado
mucho desde el inicio de su comercializacin, hay determinados componentes de la leche
humana que no pueden ser duplicados en la frmula infantil y que podran posiblemente ser la
causa de estas diferencias. Sin embargo, existen varios ingredientes alimenticios funcionales
como los oligosacridos, prebiticos, protenas y probiticos que s pueden ser aadidos a las
frmulas infantiles y que podran modificar beneficiosamente la composicin y las actividades
de la microflora de los nios (Gibson y Roberfroid, 1995).

14
OBJETIVOS

Los objetivos planteados en la presente Tesis Doctoral han sido:

1.- Evaluar el crecimiento in vitro de diversas especies de bifidobacterias con diferentes

oligosacridos no digeribles como substratos, con el fin de seleccionar el ms adecuado para
una posible utilizacin como prebitico en frmulas infantiles.

2.- Estudiar la viabilidad de las bifidobacterias presentes en una frmula infantil durante el
periodo de consumo de la misma.

3.- Evaluar el efecto del consumo de una frmula infantil probitica sobre la flora fecal infantil
durante el primer ao de vida.

4.- Conocer el efecto que tiene la administracin de siete dietas compuestas por frmulas
infantiles enriquecidas con bifidobacterias y/o galactooligosacridos sobre la biodisponibilidad in
vivo de calcio, magnesio, fsforo y hierro, con ratas Sprague-Dawley recin destetadas
mediante un balance mineral.

5.- Determinar la influencia de los probiticos y prebiticos aadidos a frmulas infantiles sobre
el epitelio intestinal de ciego y colon de ratas.

6.- Determinar la influencia de los probiticos y prebiticos aadidos a frmulas infantiles en la

absorcin de calcio, magnesio, fsforo y hierro en el ciego y colon de ratas.

7.- Determinar la influencia de los probiticos y prebiticos aadidos a frmulas infantiles en el

depsito de calcio, magnesio, fsforo y hierro en el fmur y tibia de ratas.

15
REVISIN BIBLIOGRFICA

1. LA ALIMENTACIN INFANTIL

1.1. Recuerdo histrico

Hasta comienzos del siglo XX la lactancia materna se prolongaba hasta los dos aos de
edad e incluso ms tarde, y en ocasiones se enriqueca mediante la administracin de cereales
y algunas semillas. Sin embargo, es a partir del momento del destete cuando la alimentacin ha
estado y est en dependencia del contexto sociocultural de cada pas (Snchez y Olivera, 1990),
aunque durante el siglo XX ha sufrido un gran nmero de modificaciones con los objetivos de
cubrir las necesidades de mantenimiento y asegurar la energa y nutrientes que exige el
crecimiento, evitando tanto los excesos como las carencias nutritivas (Cervera y col., 1993). Fue
la revolucin industrial, con la incorporacin de la mujer al trabajo, la que caus una
disminucin en la lactancia materna. La sustitucin de sta por productos heterlogos condujo
a un aumento paralelo de la mortalidad infantil. A finales del siglo XIX se comenzaron a utilizar
preparados como el babeurre (alimento de origen holands), que consista en una leche
fermentada y parcialmente desengrasada. Fue el inicio de lo que podra llamarse la era
cientfica de la alimentacin infantil. Ms tarde, durante la primera guerra mundial, comenzaron
a preparase leches albuminosas obtenidas a partir de caseinatos y babeurre (Snchez y
Olivera, 1990).
Sin embargo hasta 1941 no aparecieron las leches acidificadas, propuestas por Marriot,
seguidas ms tarde de las leches humanizadas o maternizadas. Posteriormente a partir de 1977
este trmino se sustituy por el de frmulas adaptadas, una vez que el Comit de Nutricin
de la Sociedad Europea de Gastroenterologa Peditrica (ESPGAN) estableci las normas para su
composicin.

1.2. Maduracin morfolgica y funcional del tubo digestivo del nio

Al nacimiento, la diferencia anatmica ms llamativa con el individuo adulto en el

sistema digestivo es la ausencia de dientes, que no aparecen hasta el 5-6 mes, lo que indica
que antes de esta fecha el nio slo est preparado para recibir alimentos lquidos que no
necesitan masticacin (Herbst, 1995).
Entre las diferencias funcionales que existen en el lactante y el adulto, hay que destacar
la falta de madurez de la actividad motora del estmago que facilita un vaciamiento rpido del
estmago. La actividad peristltica comienza en las etapas finales del desarrollo fetal y se
completa en el 8 mes de embarazo, en consecuencia el prematuro tiene una actividad
peristltica incompletamente coordinada y menos eficiente que el beb nacido a trmino
(Hernndez Rodrguez, 1999).

16
 En los neonatos, aunque que el grado desarrollo de la mucosa y de las glndulas
gstricas no se ha completado, su maduracin es mayor que la de la musculatura, que es
todava deficiente. El factor intrnseco es el que madura ms deprisa, alcanzndose valores
normales a partir del tercer mes. En cambio, tanto la secrecin de cido clorhdrico (c.
clorhdrico) como de pepsina, solamente son similares a los del adulto a partir de los dos aos.
Este menor grado de acidez, condiciona una insuficiente digestin gstrica de las protenas, que
durante las primeras semanas es ms acentuada y facilita la absorcin de protenas intactas
(Chevalier, 1997). Sin embargo, el c. clorhdrico secretado por dichas glndulas es suficiente
para que se aumente la formacin de complejos solubles de hierro (Fe), facilitando la absorcin
intestinal de este elemento. La pepsina coagula la leche e inicia la hidrlisis de la casena, a la
que desdobla en albumosas y polipptidos, que a su vez son potentes estmulos para la
secrecin gstrica y pancretica, pero no intervienen sobre la lactoalbmina ni sobre la
lactoglobulina. El bajo nivel de produccin de cido y ppsingeno por el estmago en las
primeras etapas de la vida, puede ser importante para que no se inactiven las inmunoglobulinas
(Ig) ingeridas con la leche materna y para que los antgenos sean reconocidos en el tubo
digestivo favoreciendo el desarrollo inmunitario. La lipolisis gstrica representa el 10-30% y
puede compensar los bajos niveles de lipasa pancretica en el recin nacido. Las
concentraciones de gastrina circulante son muy altas en el periodo neonatal, lo que
probablemente contribuya a la maduracin de la funcin gastrointestinal (GI) y participe en la
aceleracin del crecimiento de la mucosa (Molina y Maldonado, 1993).
En general se puede afirmar, que el intestino del recin nacido puede absorber todas
las sustancias que necesitan hidrlisis en la membrana (oligopptidos, oligo y disacridos) as
como las que son transferidas directamente: mono, di y tripptidos, aminocidos (aa) y
monosacridos. Por el contrario, la enteroquinasa, enzima importante para la digestin proteica,
es deficitaria en los primeros meses y no alcanza valores de adulto hasta los cuatro aos
(Chevalier, 1997).
En los primeros estadios de la lactancia el 50% de la amilasa intraduodenal es de
origen salival, su maduracin espontnea se completa entre el segundo y tercer ao. Su
produccin es muy escasa por la carencia de almidn en la dieta; sin embargo la leche humana
y especialmente el calostro compensan esta deficiencia ya que son ricos en esta enzima, y en el
intestino hay glucoamilasa responsable de la hidrlisis de los polmeros de glucosa (Molina y
Maldonado, 1993).
Las enzimas proteolticas y lipolticas aparecen precozmente en la vida fetal, pero su
desarrollo no se ha completado al nacimiento. El jugo pancretico est compuesto
fundamentalmente de diferentes proteasas como la tripsina I y II, quimotripsina, elastasa,
carboxipeptidasa A y B y fosfolipasa A, que intervienen en la hidrlisis de las protenas dando
lugar a aa y oligopptidos. Estas enzimas tienen una actividad escasa durante las primeras
semanas, debido no slo a la inmadurez pancretica sino tambin a la deficiente secrecin de

17
enteroquinasa y a una respuesta deficiente a la pancreozimina-colecistoquinina (Hernndez
Rodrguez, 1999).
Respecto a la actividad lipoltica, la lipasa pancretica para poder actuar sobre los
triglicridos (TG) de cadena larga precisa de la emulsin previa de las grasas por medio de los
cidos biliares y de la presencia de colipasa, que se segrega paralelamente a la lipasa a partir
del primer ao, y que es ms activa sobre los substratos insolubles emulsionados. En el anterior
proceso tambin interviene la esterasa carboxilasa pancretica, de mayor accin sobre los
substratos micelares o solubles. Ambas tienen una actividad reducida en los recin nacidos y
sobre todo en los prematuros, alcanzando valores semejantes a los de los adultos hacia los seis
meses de vida (Molina y Maldonado, 1993; Hernndez Rodrguez, 1999).
En el jugo intestinal, tiene gran inters la existencia de disacaridasas, que situadas en
el borde en cepillo de las vellosidades intestinales completan la hidrlisis de los azcares: la
lactasa acta sobre la lactosa, la sacarasa sobre la sacarosa y la maltasa sobre la maltosa. En
las clulas intestinales existen adems oligopeptidasas para hidrolizar pptidos de bajo peso
molecular, especialmente dipptidos, en sus aa constituyentes, y tambin lipasas que hidrolizan
los monoglicridos absorbidos (Molina y Maldonado, 1993).
Los cidos biliares intervienen en la digestin intraluminal emulsionando las grasas,
favoreciendo as la accin de la lipasa y sobre todo solubilizan los cidos grasos (AG) de cadena
larga, los monoglicridos, el colesterol (COL) y las vitaminas liposolubles. En el intestino parte
de estos cidos biliares conjugados son deconjugados por la flora bacteriana y algunos adems
pierden hidroxilos y forman el cido deoxiclico. El 90% de estos cidos son absorbidos de
nuevo en el leon terminal y por va porta llegan al hgado donde son de nuevo conjugados con
glicina o taurina (circulacin entero-heptica). En el recin nacido existe una inmadurez de esta
circulacin entero-heptica debido a diversos factores y como consecuencia, la digestin de la
grasa en el neonato es difcil. La absorcin intestinal tiene lugar en todo el intestino delgado
(ID), preferentemente en su porcin terminal (Molina y Maldonado, 1993).
En el intestino grueso se absorbe gran cantidad de agua y sales biliares y se forman
jabones. Se producen fenmenos fermentativos sobre los restos de hidratos de carbono no
absorbidos, y de putrefaccin sobre los restos de las protenas no absorbidas en tramos
superiores, que originan distintos gases: indol, escatol, amoniaco (NH3), etc. La motilidad del
colon consiste fundamentalmente en movimientos de segmentacin, el flujo es lento y potentes
contracciones peristlticas desplazan las heces hacia el recto. El principal estmulo fisiolgico de
la motilidad del colon parece ser la ingestin de alimentos y probablemente est mediada por
sustancias colinrgicas y encefalinas (Molina y Maldonado, 1993).

1.3. Alimentacin en la primera infancia

La infancia constituye probablemente el perodo de vida con una mayor demanda

nutricional, pues el peso corporal del nio se duplica entre el 4 y el 6 mes de vida y se triplica

18
al finalizar el ao (Milner, 1990). Por ello, los nios, desde un punto de vista diettico,
constituyen uno de los segmentos ms vulnerables de nuestra sociedad. La investigacin debe
orientarse hacia una mejora de la salud y la calidad de vida de los nios, no slo para la
obtencin de unos beneficios inmediatos sino para conseguirles una nutricin ptima (Splett y
Story, 1991). Las decisiones con respecto a la alimentacin del nio durante el primer ao de
vida suponen una oportunidad nica e irrecuperable para alcanzar un crecimiento y desarrollo
ptimo y una larga vida saludable (Johnson, 1997).
Segn Bueno y Prez (1986) y Tojo y col. (1987a), la alimentacin que recibe el nio
desde el nacimiento hasta el 2 ao de edad se puede dividir en tres perodos:

1- Perodo lcteo: se extiende desde el nacimiento hasta aproximadamente los cuatro y seis
meses de edad. Al nacer el lactante presenta los reflejos de succin y deglucin, pero an
no ha desarrollado la capacidad de digerir ciertas protenas o de soportar cargas osmolares
excesivas a nivel renal, siendo la leche el nico alimento que puede tomar el nio (Casado
de Fras y col., 1993). El alimento unnimemente reconocido como ideal durante este
perodo de la vida es la leche materna. No obstante, en ocasiones la madre no puede
alimentar al nio con la leche especialmente diseada para l por la naturaleza. En estos
casos la leche de vaca modificada, en preparaciones denominadas frmula adaptada
puede ser un buen alimento sustitutivo, puesto que trata de aproximarse al mximo a la
composicin de la leche materna (Martnez y Hernndez, 1993).

2- Perodo de transicin o diversificacin progresiva: este perodo est comprendido desde los
seis meses al ao de edad. Es la fase de introduccin paulatina de alimentos no lcteos, de
tal forma que no se altere el ritmo de maduracin digestiva, renal y el desarrollo
neuromuscular. Adems, en esta fase el nio va a empezar a conocer los alimentos, a
masticar y a distinguir las caractersticas organolpticas de los mismos (Cervera y col.,
1993). La alimentacin complementaria est representada principalmente por alimentos
homogeneizados, granulados en pequeas partculas que no son precisos masticar, o bien
con una textura ms gruesa y con mayores partculas para estimular la masticacin del
nio antes de tragar (FAO/OMS, 1989).

3- Perodo de maduracin digestiva: comprende desde el 1er hasta el 2 ao de edad. Se

produce una maduracin fisiolgica e inmunitaria que permitir llegar a una diversificacin
completa de la alimentacin. Los alimentos que se pueden administrar en esta fase son los
mismos que en el adulto, aunque modificados en cuanto a su textura y condimentacin
(Cervera y col., 1993).

19
 Pocas veces en la vida la dieta es tan montona y tan continuada en el tiempo como en
los primeros meses de vida. As, el consumo de leche materna o de frmula cinco seis veces
al da durante cuatro, cinco o seis meses satisface las necesidades nutritivas del lactante, pero
prolongar este tipo de alimentacin puede dar lugar a una disminucin de algn nutriente, ya
que a partir de los cuatro meses los requerimientos de nutrientes se ven cada vez menos
cubiertos por una alimentacin exclusivamente formada por leche (Lnnerdal, 1989).
La leche humana y la leche de vaca en la alimentacin del lactante. La leche humana es
el alimento ideal durante los cuatro seis primeros meses, ya que cubre todas las necesidades
nutritivas del lactante y evita riesgos innecesarios. Sin embargo, en situaciones de alteraciones
anatmicas o graves enfermedades que entraen un riesgo para la madre o el nio est
indicada la lactancia artificial. En estos casos, el empleo de leches industriales destinadas al
lactante elaboradas a partir de leche de vaca constituyen un sustituto adecuado, pero debido a
que son sensiblemente diferentes a la leche materna, es necesario modificarlas para hacerlas
similares al modelo humano (Tojo y col., 1995).
Las diferencias existentes entre ambos tipos de leche, humana y de vaca, afectan a casi
todos sus componentes (Tabla 1). La leche humana experimenta variaciones en el curso de la
lactacin y alguno de sus componentes est influenciado por la alimentacin materna y en
menor grado por el estado nutritivo de la madre (Butte y col., 1984; Nommsen y col., 1991).
La leche humana tiene un menor contenido proteico y mineral que la leche de vaca
debido a la menor velocidad de crecimiento del recin nacido humano. La relacin
albmina/casena, mayor en la leche humana, tiene como consecuencia una mejor
digestibilidad de la leche, ya que la casena produce una masa de cuajo mal digerido en el
estmago del lactante. As mismo, la leche materna tiene un contenido llamativamente superior
en nitrgeno no proteico que la de vaca debido a una mayor presencia de nuclesidos y
nucletidos, sustancias de especial importancia en la maduracin del intestino y desarrollo
inmunitario (Kunz y Lnnerdal, 1992; Blanco y Tellera, 1995). La leche de vaca tiene un
contenido muy escaso de AG esenciales, una cantidad menor de AG monoinsaturados (oleico y
palmitoleico) y la estructura de los TG tambin es diferente. Esto hace que el coeficiente de
absorcin de las grasas de la leche de vaca sea menor del 60% en la primera semana y menor
del 90% en etapas ulteriores, mientras que en la leche humana es siempre mayor del 90%. El
mayor contenido de COL de la leche humana hace que los nios alimentados al pecho tengan
unas cifras de colesterolemia superiores a las de los nios que reciben frmulas (Van Biervliet y
col., 1992). La leche humana tiene un contenido mayor en lactosa para mantener el equilibrio
osmtico y hacerla isotnica con el plasma sin aumentar el contenido en sales minerales;
adems tiene otros hidratos de carbono que apenas existen en la de vaca.

20
 Tabla 1. Composicin de la leche humana y de la leche de vaca
Composicin Leche humana Leche de vaca
Energa (kcal/100 mL) 62-70 68
Protenas (g/100 mL) 0,89-1,1 3,5
Casena (%) 40 82
Protenas del suero (%) 60 18
Nitrgeno no proteico (%) 15-25 6
Grasas (g/100 mL) 3,5-4 3,7
c. linoleico (%) 7-14 2,2-2,3
Colesterol (mg/100 mL) 20-25 10-15
Hidratos de carbono (g/100 mL) 7,7 6,1
Lactosa (g/100 mL) 6-6,5 5
Oligosacridos y glicopptidos (g/100 mL) 1-1,2 0,1
Minerales
Calcio (mg/L) 340 1.200
Fsforo (mg/L) 140 920
Sodio (mEq/L) 7 22
Potasio (mEq/L) 13 35
Cloruro (mEq/L) 11 29
Magnesio (mg/L) 30 120
Azufre (mg/L) 140 300
Cromo (g/L) 0,3 8-13
Manganeso (g/L) 3-7 20-40
Cobre (g/L) 350 300
Zinc (mg/L) 2,4-3,5 3-5
Yodo (g/L) 30 47
Selenio (g/L) 13-50 5-50
Hierro (mg/L) 0,3-0,5 0,4
Vitaminas
Tiamina (g/L) 160 440
Rivoflabina (g/L) 360 1.750
Niacina (g/L) 1.470 940
Piridoxina (g/L) 100 640
Pantotenato (mg/L) 1,8 3,46
Folacina (g/L) 52 55
Cianocobalamina (g/L) 0,3 4
Vitamina A (UI/L) 1.898 1.025
Vitamina C (mg/L) 43 11
Vitamina D (UI/L) 22 14
Vitamina E (mg/L) 1,8 0,4
Vitamina K (mg/L) 15 60
Adaptado de Hernndez Rodrguez (1999)

Existe una gran confusin semntica respecto a la denominacin de los preparados

para lactantes (ESPGAN, 1990). La denominacin de frmula o frmula infantil sirve para
designar a todos los productos destinados a la alimentacin del lactante, que pueden sustituir
completa o parcialmente a la leche materna. Dentro de aquellas, los Comits Europeos de
Expertos en Nutricin (ESPGAN, CCE) han considerado conveniente proponer dos tipos de
frmula, una denominada frmula de inicio, para los primeros seis meses, y otra denominada
frmula de continuacin, para utilizarla a partir de esa edad (ESPGAN, 1990; Commission of the
European Communities, 1991). El Comit de Nutricin de la Asociacin Americana de Pediatra
en cambio considera que la diferencia de los requerimientos nutricionales no justifica la

21
existencia de dos frmulas distintas y propone un nico producto denominado frmula infantil
(Committee on Nutrition, 1989).
Sin embargo, en 1991 el Consejo de las Comunidades Europeas public una Directiva
relativa a los productos utilizados para la alimentacin de los lactantes (Commission of the
European Communities, 1991) basada en los informes tcnicos de la ESPGAN, del Codex
Alimentarius, de la AAP (American Academy of Pediatrics), y del Comit Cientfico para la
alimentacin humana (Scientific Committee on Food, SFC) de la propia Unin Europea
(Directiva de la Comisin de 14 de mayo 91/321/CEE relativa a los preparados para lactantes y
preparados de continuacin). Las innovaciones ms significativas son el cambio de nombre de
frmula de inicio por el de preparado para lactantes y el de frmula de continuacin por el de
preparado de continuacin. Adems, cuando los preparados sean elaborados exclusivamente a
partir de protenas procedentes de leche de vaca, pueden denominarse leche para lactantes y
leche de continuacin respectivamente.
Otro aspecto importante de la Directiva es que con el fin de aproximar y regular los
aspectos nutricionales de estos preparados en los pases de la Unin Europea, se estableci que
fueran autorizados para su comercializacin a partir de diciembre de 1992 los preparados que
se ajustarn a ella y prohibidos los que no la cumplieran a partir del 1 de junio de 1994
(Commission of the European Communities, 1991). A continuacin se detallan brevemente en
que consisten estos preparados.
Frmulas de inicio o preparados para lactantes. Este tipo de frmula est destinada a
lactantes nacidos a trmino y a prematuros con un peso al nacimiento superior a 2.500 g
(ESPGAN, 1977). Se caracterizan por cubrir todas las necesidades nutritivas del lactante durante
los primeros cuatro o seis meses de vida y pueden ser utilizadas junto con otros alimentos
hasta la edad de un ao.
Frmulas o preparados de continuacin. Son frmulas destinadas a la alimentacin del
lactante a partir de los cuatro o seis meses de edad, momento en que se inicia el paso
progresivo a la alimentacin diversificada (ESPGAN, 1981).
A partir de esta edad, los mecanismos homeostticos del organismo estn lo
suficientemente desarrollados como para permitir una mayor concentracin de los nutrientes.
La digestin, absorcin, las enzimas que intervienen en el metabolismo intermediario y la
funcin renal han alcanzado un grado de madurez suficiente para que el nio pueda recibir una
frmula menos compleja que la inicial. Sin embargo, para cubrir las necesidades nutricionales
del nio es necesario modificar la leche de vaca, especialmente su contenido en protenas y
minerales (calcio (Ca) y Fe) as como en hidratos de carbono y vitaminas (Hrnandez
Rodrguez, 1999).
Esta adecuacin es importante en aquellos nios que reciben esta frmula como nico
aporte lcteo a partir del 4 mes o cuando se utiliza para realizar el destete. A partir del 6
mes, las posibilidades de alimentacin son ms amplias y la leche de vaca entera esterilizada ya

22
puede ser utilizada, siempre y cuando la calidad y cantidad de los dems alimentos sea
adecuada (Hernndez Rodrguez, 1999).
En 1981, el Comit de Nutricin de la ESPGAN public unas recomendaciones para la
composicin de la formula de continuacin que fueron revisadas en 1990 y 1991. A su vez, la
Comisin de la Comunidades Europeas, en la Directiva final de 1991 (Directiva de la Comisin
de 14 de mayo 91/321/CEE relativa a los preparados para lactantes y preparados de
continuacin), modific los lmites de edad para el uso de estas frmulas (Commission of the
European Communities, 1991). Las diferencias ms importantes con la frmula de inicio son un
mayor valor energtico, de contenido proteico, (no siendo necesario modificar la relacin
lactoalbmina/casena), del contenido mineral de Ca, fsforo (P), Fe (en forma de sales
ferrosas), sodio (Na), potasio (K) y cloro (Cl), y puede contener polisacridos (PS) como la
dextrinomaltosa, el almidn o harinas adems de lactosa, aunque sta debe seguir siendo el
hidrato de carbono predominante. En la Tabla 2 se muestran las recomendaciones para la
elaboracin de una frmula de continuacin dadas por diferentes organismos oficiales.

Tabla 2. Recomendaciones para la elaboracin de una frmula de continuacin

Elementos ESPGAN1 COMISIN CE2 CODEX3
Energa (kcal/100 mL) 60-80 60-80 60-85
Protenas (g/100 kcal) 3-4,5 2,25-4,5 3-5,5
Grasas (g/100 kcal) 4-6 3,3-6,5 3-6
c. linoleico (g/100 kcal) 0,5-1,2 0,3 0,3
Hidratos de carbono (g/100 kcal) 8-12 7-14 -
Minerales y oligoelementos
Sodio (mg/100 kcal) 20-85 - 20-85
Potasio (mg/100 kcal) 80 - 80
Cloro (mg/100 kcal) 55 - 55
Calcio (mg/100 kcal) 90 - 90
Fsforo (mg/100 kcal) 60 - 60
Cociente Ca/P 1-2 2 -
Magnesio (mg/100 kcal) 6 - 6
Hierro (mg/100 kcal) 1-1,7 1-2 1-2
Yodo (g/100 kcal) 5 5 5
Zinc (g/100 kcal) 0,5 0,12 0,5
Vitaminas
A (UI) 250-750 200-600 250-750
D (UI) 40-120 40-120 40-120
E (UI) 0,7 0,7 0,7
K (g/100 kcal) 4 - 4
C (g/100 kcal) 8 8 8
Tiamina (g/100 kcal) 40 - 40
Riboflavina (g/100 kcal) 60 - 60
Piridoxina (g/100 kcal) 45 - 45
Cianocobalamina (g/100 kcal) 0,15 - 0,15
c. flico (g/100 kcal) 4 - 4
cido pantotnico (g/100 kcal) 300 - 300
Biotina (g/100 kcal) 1,5 - 1,5
1
Sociedad Europea de Gastroentrologa Pediatrca y Nutricin (ESPGAN), Comit de Nutricin 1977 (ESPGAN, 1977), 1990
(ESPGAN, 1990) y 1991 (ESPGAN, 1991).
2
Comisin de las Comunidades Europeas, Directiva de la Comisin de 14 de mayo 91/321/CEE (Commission of
the European Communities, 1991).
3
Comisin mixta FAO/WHO del Codex Alimentarius, 1976 (FAO/OMS, 1976) y 1989 (FAO/OMS, 1989).

23
1.4. Nutricin y metabolismo de los minerales

Los minerales pueden ser divididos en dos grandes grupos en funcin de la cantidad
presente en el organismo (Lindquist, 1987): elementos mayoritarios, que constituyen el 0,5-2%
del peso del organismo (calcio, fsforo, magnesio, sodio, potasio y azufre), y elementos
minoritarios (hierro, cobre (Cu), manganeso y zinc (Zn)), presentes en muy pequeas
cantidades en el organismo, pero esenciales para un buen funcionamiento y estado nutritivo. A
continuacin se detalla el metabolismo de los minerales estudiados en el presente trabajo de
investigacin.
Calcio. El Ca es el 5 elemento qumico por orden de abundancia en el organismo, y
alrededor del 99% de la cantidad total del mismo se encuentra en el esqueleto en forma de
hidroxiapatita, y que consiste en fosfato de Ca (Linder, 1988). Sin embargo, de este porcentaje
solamente el 1% se considera Ca fcilmente intercambiable y con capacidad para participar en
las actividades metablicas (Czajka, 1996). El 1% restante del Ca corporal se encuentra en los
lquidos extracelulares, las estructuras intracelulares (en una concentracin mucho menor que
la extracelular) y las membranas de las clulas. Este Ca extraesqueltico tiene un papel
fundamental en la conduccin nerviosa, la contraccin muscular, la coagulacin sangunea y la
permeabilidad de las membranas (NRC, 1991).
La concentracin de Ca en sangre est regulada por mecanismos homesostticos que
actan retirando o introduciendo Ca al torrente circulatorio procedente fundamentalmente del
tejido seo, o modulando la intensidad de reabsorcin renal. El mecanismo por el cual el hueso
cede Ca a la sangre est regulado por la hormona paratiroidea (PTH), la cual a su vez controla
la activacin de la vitamina D, actuando ambas de forma conjunta. Asimismo, la vitamina D
aumenta la reabsorcin tubular de Ca en la nefrona y tambin la absorcin intestinal de Ca. Por
otra parte, la funcin principal de la hormona calcitonina es la de reducir la concentracin de Ca
en el lquido extracelular favoreciendo la mineralizacin sea (Linder, 1988).
El proceso de cristalizacin sea implica la transformacin del fosfato clcico amorfo en
hidroxiapatita. Asimismo, en la superficie de los cristales de hidroxiapatita se encuentran
concentraciones diversas de citrato, Mg, carbonato y otros iones que pueden afectar a la
mineralizacin sea. Por otra parte, es muy probable que la formacin de fosfato de Ca a partir
de los iones Ca y P del hueso est controlada por la concentracin de fsforo inorgnico (Pi), y
a su vez puede depender de la intensidad a la que se libera este Pi, reaccin catalizada por la
fosfatasa alcalina de los osteoblastos (Krause y Mahan, 1979). Este mecanismo explicara las
altas actividades encontradas de esta enzima en lactantes y nios (Linder, 1988).
La absorcin de Ca en el ID tiene lugar por dos vas, una transcelular y otra paracelular.
El primero de ellos es un sistema de transporte activo, principalmente en el duodeno y yeyuno,
que es activo, saturable y mediado por la vitamina D que aumenta la captacin de Ca al
estimular la produccin de una protena que se une al Ca. El segundo es un mecanismo de
transporte pasivo, no saturable e independiente de la vitamina D que ocurre a todo lo largo del

24
intestino (Coudray y col., 1997). Aunque la mayora del Ca se absorbe en el leon, tambin
puede absorberse en el colon (Czajka, 1996). La eficacia de la absorcin aumenta durante los
periodos con requerimientos fisiolgicos elevados. As, los nios pueden absorber hasta el 75%
de Ca ingerido, en comparacin con los adultos jvenes en los que estas cifras se reducen
hasta el 40 o incluso el 20% (NRC, 1991). Entre las sustancias favorecedoras de la absorcin
del Ca estn todas aquellas sustancias que forman sales solubles con este elemento, facilitando
su paso a travs de la mucosa intestinal, como por ejemplo la vitamina D, la lactosa, el citrato,
los hidrogeniones, ciertos aa, e incluso la sacarosa (Linder, 1988). Mientras que las sustancias
que forman complejos insolubles con el Ca en el intestino, tales como los fitatos, el cido
oxlico, cidos urnicos y fibra diettica (FD) (celulosa y hemicelulosa), reducen la
biodisponibilidad del mineral (Miller, 1993). En individuos con malabsorcin de grasas, la
absorcin de Ca disminuye debido a la formacin de jabones de Ca y AG (Czajka, 1996).
En el plasma, el Ca puede estar como in libre o ionizado (47%), quelado con
molculas no proteicas, formando complejos principalmente con el citrato, fosfatos y
bicarbonato (HCO3-) (6,5%), y unido a protenas, especialmente prealbmina (47%) (Avioli,
1988). Los iones de Ca libres son los que pueden ser directamente accesibles a las clulas, y
cuya concentracin est regulada por la PTH y la calcitonina. Las concentraciones de Ca en
plasma dependen tambin de la relacin de Ca/P en la dieta, que cuando es muy elevada se
produce un aumento de PTH, y consecuentemente se acelera el proceso de desmineralizacin
sea (Linder, 1988). Las concentraciones sricas de Ca no son indicadores tiles del estatus de
Ca, puesto que se hallan bajo control homeosttico y se mantienen muy constantes (Farr
Rovira y Frasquet Pons, 1999).
Cuando la ingestin o la absorcin del mineral es inadecuada se produce una
mineralizacin insuficiente del hueso en individuos jvenes, con la consiguiente disminucin de
la consistencia sea (NRC, 1991). El dficit en los nios de este importante mineral puede
producir signos de hipoparatiroidismo y baja mineralizacin sea, incluso puede inducir la
aparicin de raquitismo (Prentice y Bates, 1994). La estrategia nutricional ms comprometedora
para reducir el riesgo de osteoporosis consiste en asegurar una ingesta de Ca que permita
obtener la masa sea mxima, programada genticamente, durante los aos de crecimiento. Se
resalta la importancia de cubrir las raciones recomendadas a todas las edades, pero con
especial atencin a la ingesta durante la niez y hasta los 25 aos de edad (NRC, 1991).
Magnesio. Este mineral se encuentra en el organismo en menor cantidad que el Ca y P.
El 60% del Mg corporal se halla en el tejido seo en forma de cristalina, aunque no es
componente de la hidroxiapatita ni es fcilmente intercambiable con el Mg extracelular. Un 39%
se reparte de forma equitativa entre el msculo y los tejidos blandos no musculares, y el 1%
restante se halla en el fluido extracelular (Gibson, 1990; Czajka-Narins, 1992). Ms de 300
sistemas enzimticos requieren Mg para su funcionamiento, entre estos cabe destacar su
aportacin como componente del complejo Mg-ATP, esencial en los procesos de biosntesis,
gluclisis y formacin de AMP-cclico, tambin interviene en la actividad neuromuscular, en la

25
replicacin del ADN y sntesis de ARN, en la sntesis proteica, en la homeostasis del Ca y en el
metabolismo del esqueleto por mediacin de la PTH y vitamina D (Wester, 1989). El Mg y el Ca,
aunque con funciones semejantes, son en algunos casos antagnicos. As, el exceso de Mg
inhibe la calcificacin sea, y un exceso de Ca puede inducir signos de deficiencia de Mg
(Czajka-Narins, 1992).
El Mg se absorbe mayoritariamente en el ID, principalmente en el yeyuno, mediante un
proceso de difusin facilitada, pero no activa y que se satura a concentraciones intraluminales
bajas, y otro de difusin pasiva que funciona a concentraciones altas y que parece ser el
predominante. Segn Shils (1988) y Fairweather-Tait (1999), no parece existir una regulacin
hormonal de la absorcin de Mg. Aunque este mineral se absorbe principalmente en el ID, una
proporcin importante del Mg tambin se absorbe en el colon, segn se ha visto en estudios
realizados en humanos y con animales de experimentacin (Hardwick y col., 1991).
El intervalo de absorcin oscila entre el 10% para dietas ricas en Mg, y el 75% en el
caso de dietas restrictivas, estimndose un valor medio del 30%. Entre los elementos que
disminuyen su absorcin estn una ingesta elevada de Ca, vitamina D, Pi y cido ftico (c.
ftico), probablemente debido a la formacin de complejos de este mineral (Forbes, 1963;
Seeling, 1964). Tambin la absorcin de Mg depende de la cualidad y proporcin de las
protenas del alimento, del tipo y cantidad de grasas y de la cantidad de Ca y K existente en la
dieta (House y Van Campen, 1971; Lee y col., 1972).
El 75% del Mg se transporta en el plasma como iones libres y slo una pequea
fraccin forma complejos con el citrato, fosfato y protenas, principalmente la albmina. Los
valores de Mg inico se mantienen en un intervalo estrecho debido a la absorcin, excrecin y
flujo transmembranoso. El rin conserva el Mg de forma eficaz, en particular cuando la ingesta
es baja, excretndose slo un 4% del Mg filtrado, por lo que existen mecanismos renales de
reabsorcin, que adems tienden a variar inversamente con la del Ca (Czajka, 1996).
Fsforo. El P es un componente esencial del material seo, encontrndose el 85% del P
total del cuerpo adulto (700 g) como cristales de fosfato de Ca en el hueso. Las
concentraciones intracelulares de Pi son mucho ms altas que las extracelulares, convirtindolo
en uno de los principales sistemas amortiguadores del pH (H2PO4-/HPO4= ) de los lquidos
intracelulares (Linder, 1988). Adems, interviene en muchas y variadas reacciones del
organismo al ser constituyente de fosfolpidos de las membranas celulares as como de la
molcula de adenosn trifosfato (ATP), que supone la fuente principal de energa para la
actividad celular (Prieto y col., 1987).
El P es absorbido eficazmente por el ID en forma de Pi libre (Avioli, 1988). Aunque Ca y
P tienden a absorberse de forma paralela, el proceso de absorcin pasiva no saturable tiene
mayor importancia en el caso del P, siendo la absorcin funcin lineal de su concentracin en el
lumen. No se ha identificado en el intestino ninguna protena ligante especfica para el P,
aunque la elevada actividad de la fosfatasa alcalina en la absorcin de P parece indicar un
posible papel en el transporte activo de este elemento. No obstante, cuando la ingestin de P

26
es baja la accin de la vitamina D puede favorecer la absorcin transcelular de P. Solo el fosfato
de la dieta que se encuentra en forma de c. ftico o fitato (compuesto relativamente
abundante en las semillas de cereales, leguminosas y otros vegetales) no puede hidrolizarse en
el tracto GI y por tanto no puede ser utilizado por el organismo (Linder 1988), constituyendo el
P ftico parte del P no disponible de la dieta. Se ha observado que los lactantes absorben del 65
al 70% del P que se halla en la leche de vaca y del 85 al 90% del que se encuentra en leche
humana, mientras que los nios y adultos absorben del 50 al 70% del P presente en las dietas
normales y hasta el 90% cuando la ingesta es baja (LSRO, 1981).
La mayor parte del Pi circula en sangre como H2PO4- y HPO4= , una pequea cantidad
como complejo con Ca o Mg, y un 10% se une a protenas (Farr Rovira y Frasquet Pons,
1999). Aunque aproximadamente de 1/4 a 1/6 de la cantidad corporal de P se elimina por
heces, la mayor parte se realiza mediante la excrecin urinaria, que est sometida a variaciones
segn patrones de biorritmos diurnos, mostrando una correlacin positiva con la actividad fsica
del individuo. El rin desempea un importante papel en el mantenimiento de la fosforemia
mediante la reabsorcin tubular del 85-90% del P filtrado, a travs de un mecanismo activo y
saturable regulado por la PTH. No obstante, en los nios la hormona del crecimiento influye
ms que la PTH en el control renal del P srico. Si la concentracin de P tubular no agota la
capacidad mxima de transporte, se reabsorbe prcticamente todo el P y la excrecin por orina
es baja (Avioli, 1988).
De todas formas, el anlisis de P no debe considerarse de forma ajena al de Ca, ya que
es muy importante el mantenimiento de un buen cociente Ca/P para un correcto desarrollo y
metabolismo seo. As, la relacin Ca/P de la dieta debe ser 1,3 en los primeros 6 meses de
vida y de 1,2 desde los 6 meses al ao (NCR, 1991), y cuando sta es mayor de 1,5 comienzan
a aparecer efectos perjudiciales (Aranda y Llopis, 1993).
La deficiencia de P tiene consecuencias graves debido a las importantes funciones que
este elemento desempea, como prdidas de masa sea, presencia de bajos contenidos
intracelulares de fosfoglicerato y otros steres fosfato ricos en energa, cuya deficiencia altera el
aporte de oxgeno (O2) a los tejidos, produce fallos en la contractibilidad muscular, debilidad
muscular grave y fallos cardacos y respiratorios (Gibson, 1990).
Hierro. Es el elemento traza ms abundante en el organismo animal y en el ser humano
(Linder, 1988). Alrededor de 2,0-2,5 g estn contenidos en la molcula de hemoglobina (Hb), lo
que supone un 60-75% del Fe corporal. Tambin se encuentran cantidades traza de este metal
en sistemas enzimticos implicados en el transporte de electrones y en reacciones de
fosforilacin oxidativa de todas las clulas (0,5%), as como en algunos enzimas hepticos
(10%), en las molculas de mioglobina (Mb) de las fibras musculares (5%), unida a la
transferrina (0,1%), y el resto (30%) almacenado en el hgado, bazo y mdula sea en la
protena ferritina y en las molculas de hemosiderina, que posiblemente proviene del
fraccionamiento hidroltico de la propia ferritina (Linder, 1988; Villa Elzaga y col., 1999). La
principal funcin del Fe en el ser vivo es el transporte de O2 y la participacin en los procesos

27
redox que se dan en las reacciones de transferencia de electrones de la cadena respiratoria,
facilitando la fosforilacin oxidativa de ADP a ATP (Aranda y Llopis, 1993).
Al nacer la concentracin de Hb es normalmente mayor que en cualquier otro momento
de la vida como resultado de la adaptacin del feto al ambiente hipxico del tero. Adems, las
reservas de Fe almacenado son relativamente abundantes, y como consecuencia la mayora de
los recin nacidos estn bien provistos de Fe (Dallman, 1986). Hasta los 4 meses de edad
existen pequeos cambios en el contenido total de Fe y son pocas las necesidades de Fe
exgeno, ya que los abundantes almacenes de Fe neonatales ayudan a proveer de este Fe para
la sntesis de Hb, Mb y enzimas que contengan Fe. Despus de los cuatro meses de edad existe
un cambio gradual, en el que se pasa de una abundancia de Fe a reservas marginales que
caracterizan este periodo de rpido crecimiento. Esta modificacin es ante todo debida a la gran
cantidad de Fe requerida para mantener la concentracin media de Hb (12,5 g/dL) como
consecuencia de una expansin rpida del volumen de sangre. Por ello, desde los 4 a los 12
meses se crea la necesidad de un aporte exgeno de Fe, y una gran cantidad de este
oligoelemento debe ser absorbida de la dieta (Dallman, 1986).
Generalmente, el Fe diettico se clasifica en dos grandes categoras, Fe hemo y Fe no
hemo (Robert y Thomas, 1983). El Fe hemo, que representa slo el 5-10% del Fe de la dieta,
se absorbe hasta en un 25% en la forma de un complejo intacto de porfirina (Hallberg y col.,
1979). En cambio el Fe no hemo slo se absorbe en un 5%, y para ello es necesario que sea
disuelto por el cido gstrico y presentarse as en el duodeno y parte superior del yeyuno en
una forma soluble (Monsen y Cook, 1976). El factor ms importante que regula la absorcin de
Fe es la propia necesidad corporal del mineral, dependiendo la capacidad de la mucosa para
absorber Fe de la presencia de receptores del catin en la superficie celular. En la luz intestinal
el Fe inico o incluso en forma de quelatos se absorbe unindose a receptores especficos de la
membrana. Un modelo propuesto para explicar la absorcin del Fe no hemo est medido por la
transferrina que se secreta en la bilis y permite que el Fe entre en las clulas mucosas mediante
la endocitosis de un complejo receptor de transferrina-Fe-transferrina. La transferrina suele
saturarse en 1/3 de su capacidad total para unirse al Fe (TIBC), si no se necesita Fe sta se
mantiene saturada y se absorbe menos a partir de las clulas mucosas. Un modelo ms
reciente (Conrad y col., 1994) sugiere que el Fe se une a la mucina en el estmago, donde el
pH es cido, de esta manera el Fe no precipita en el intestino. La mucina libera el Fe a una
glucoprotena en la membrana celular, que a su vez lo libera a la mobilferrina en el citosol del
enterocito. Una vez fijado, se transfiere al interior de los enterocitos por transporte activo, en el
citoplasma se libera de la protena y se encuentra posiblemente formando quelatos con citrato,
fructosa y aa y en equilibrio con el Fe contenido en las molculas de ferritina. A continuacin se
desplaza hacia la regin serosal del enterocito, donde el Fe se fija a la transferrina y de esta
forma se transporta al plasma. El Fe del enterocito que no se transfiere al plasma queda
retenido en el interior de la clula como ferritina, hasta que llega el momento de la
descamacin de estas clulas y el Fe vuelve de nuevo a la luz intestinal (Linder, 1988). En el

28
caso del Fe hemo, ste atraviesa la membrana celular del enterocito sin necesidad de
transportador y en su interior forma la hemo-oxigenasa (Hallberg, 1981).
Junto a estos mecanismos de absorcin, la dieta desempea un papel importante ya
que determinados componentes de sta pueden actuar como inhibidores o promotores de su
absorcin. El c. ftico es uno de los principales inhibidores de la absorcin de Fe en los
alimentos de origen vegetal (Hallberg y Rossander-Hulthen, 1993). Existen ciertos componentes
de la fibra como la hemicelulosa y la lignina que poseen un marcado efecto inhibitorio en la
absorcin de Fe (Gillooly y col., 1983 y 1984). Otros compuestos con efecto inhibidor son los
taninos, cuyo mecanismo de accin se debe a la formacin de complejos poco solubles con el
Fe, disminuyendo de este modo su biodisponibilidad (Gillooly y col., 1983 y 1984). Ciertos
minerales tambin son inhibidores de la absorcin del Fe, tal es el caso del Ca (Hallberg y
Rossander-Hulthen, 1993), del Mn que compite con el Fe en su absorcin por las clulas de la
mucosa intestinal (Lnnerdal, 1989), y tambin se ha observado que niveles excesivos de Zn en
la dieta impiden la utilizacin del Fe, y por lo tanto causan anemia (ODell, 1989).
En cuanto a los compuestos que mejoran la absorcin de Fe, el cido ascrbico (c.
ascrbico) es quiz el promotor ms conocido de la absorcin de Fe no hemo, que adems se
ve pote nciado por efecto de la vitamina E (Greenberg y col., 1979), sin embargo no posee
ningn efecto sobre el Fe hemo (Hallberg, 1981). El origen de las protenas determina un efecto
positivo o negativo sobre la absorcin de Fe (Barber y Farr, 1992), por ejemplo la casena
parece aumentar la absorcin de Fe (Peters y col., 1992), la fosfovitina del huevo reduce su
absorcin, mientras que las protenas de la carne y pescado tambin la aumentan (Barber y
Farr, 1992). Igualmente se ha observado que pequeas cantidades de c. ctrico, mlico,
tartrico y lctico, pueden aumentar sustancialmente la absorcin de Fe (Craig, 1994), as como
la fructosa, que forma complejos con el Fe, incrementa tambin su absorcin (Pollack y col.,
1965).
El mecanismo de intercambio del Fe comienza cuando los eritrocitos viejos son
fagocitados principalmente en el bazo e hgado, transfirindose el Fe procedente de las
molculas de Hb a la transferrina para ser transportado hacia la mdula sea y resintetizar la
Hb (Siimes y Dallman, 1974). Parte del Fe procedente de los propios eritrocitos pasa a formar
parte de las molculas de ferritina (y hemosiderina) en el interior de las clulas del retculo
endotelial, en los hepatocitos y tambin en la mdula sea. Para que el Fe contenido en la
ferritina sea movilizado hacia los tejidos hematopoyticos debe reducirse a la forma ferrosa, ser
quelado, y luego transferirse al plasma, donde para ser transportado por la transferrina, debe
ser reoxidado a la forma frrica. Se ha descrito que la protena plasmtica ceruloplasmina
puede tener un importante efecto en estos procesos de transferencia de Fe. Por otra parte, los
iones de Fe que los eritrocitos puedan perder en el torrente sanguneo son transportados
gracias a la capacidad fijadora de dos protenas plasmticas, la haptoglobina (que fija Hb) y
hemoxipexina (que fija anillos porfricos). Ambas en el hgado ceden los iones de Fe a la
ferritina de los hepatocitos (Linder, 1988).

29
 La deficiencia de Fe infantil est reconocida como la ms comn en todo el mundo
(Craig, 1994) afectando a miles de nios tanto de pases industrializados como subdesarrollados
(Haschke y Nosheen, 1991). En un estadio avanzado, la deficiencia de Fe da lugar a una
anemia ferropnica, que cuando es grave se caracteriza por ser microctica e hipocrmica (Yip y
Dallman, 1988; NRC, 1991). Adems, va acompaada de un aumento de la concentracin de
transferrina circulante y consecuentemente por una mayor capacidad srica de fijacin de Fe, y
de una reduccin de la concentracin srica de ferritina (Linder, 1988). Actualmente se sabe
que la carencia de Fe sin anemia puede dar lugar a una reduccin de la capacidad fsica para
realizar esfuerzos, reduccin de la actividad mental y por consiguiente del rendimiento escolar
en los nios, incremento del riesgo de prematuridad, disminucin de las defensas frente a
gentes infecciosos y alteracin de la estructura y funcin GI (Lozoff y Brittenham, 1986; Lozoff
y col., 1991). Aunque los nios raramente desarrollan deficiencia de Fe antes de los 6 y 8
meses de edad (Dallman y col., 1986), si durante un periodo corto de tiempo existe una ligera
deficiencia entre los 6 y 12 meses, sta puede originar consecuencias negativas a largo plazo
para la salud y el desarrollo escolar, ya que coincide con el rpido crecimiento y diferenciacin
del cerebro (Volpe, 1987).

1.4.1. Necesidades nutricionales de los minerales

El organismo humano contiene aproximadamente un 4% de minerales que deben ser

aportados por la dieta (Linder, 1988). Las necesidades de elementos minerales durante el
primer ao de vida son muy importantes ya que juegan un papel esencial en la mineralizacin
sea y el desarrollo fsico y mental. Es necesario establecer los requerimientos nutricionales del
nio para evitar las enfermedades que derivan de una insuficiencia mineral, tanto a corto plazo
como en la edad adulta (Moya y col., 1990). En la Tabla 3 se pueden observar las necesidades
de los distintos minerales en los primeros tres aos de vida, segn las raciones diarias
recomendadas (RDR) del NRC (1991).

Tabla 3. Recomendaciones diarias de minerales en los tres primeros aos de vida

EDAD
0-6 meses 6-12 meses 1-3 aos
Calcio (mg/da) 400 600 800
Fsforo (mg/da) 300 500 800
Magnesio (mg/da) 40 60 90
Hierro (mg/da) 6 10 10
Zinc (mg/da) 5 5 10
Yodo (mg/da) 40 50 70
Selenio (g/da) 10 15 20
Cobre (mg/da) 0,4-0,6 0,6-0,7 0,7-1
Manganeso (mg/da) 0,3-0,6 0,6-1 1-1,5
Adaptado del NRC (1991)

30
 Calcio y Fsforo. En los lactantes alimentados a pecho, la leche materna aporta
alrededor de 300 mg de Ca al da, de los que se absorbe el 75%, mientras que en los
alimentados con lactancia artificial puede descender hasta un 20%, dependiendo entre otros
factores, de la clase y la cantidad de grasa que contienen los alimentos. En este sentido, Mart-
Hennerberg (1993) y Hernndez Rodrguez (1999) han descrito que la prdida fecal de grasa y
Ca estn ntimamente correlacionadas. Los expertos en nutricin infantil hacen las siguientes
recomendaciones en relacin con el aporte de Ca en la dieta: 50 mg de Ca/100 kcal, que es
aproximadamente el contenido en Ca de la leche materna (FAO/OMS, 1976) 60-75 mg/100
kcal (ESPGAN, 1977).
Los lactantes alimentados con frmulas cuyo contenido en P es superior al de la leche
materna (15 mg/100 mL) excretan una gran parte en la orina, como consecuencia de lo cual
aumenta la carga renal de solutos, y por tanto la osmolaridad. Como el aclaramiento del P no
est desarrollado completamente al nacimiento, un exceso de P supondra, adems del riesgo
de hiperfosfatemia, un cuadro secundario de hipocalcemia (Hernndez Rodrguez, 1999). Para
minimizar este riesgo, el Comit de la ESPGAN recomienda que los aportes de P oscilen entre
30-50 mg/100 kcal (20-35 mg/100 mL) y la relacin Ca/P no sea inferior a 1,2 ni superior a 2.
Magnesio. El aporte ptimo no est completamente establecido y el Comit de la
ESPGAN recomienda un mnimo de 6 mg/100 kcal (4 mg/100 mL), que equivale a una ingesta
diaria de 40-70 mg. Segn los clculos actuales, la ingesta de magnesio (Mg) a travs de la
lactancia materna excede en 4-5 veces las necesidades estimadas en el lactante (Mart-
Hennerberg, C. 1993; Hernndez Rodrguez, 1999).
Hierro. La leche humana y la de vaca tienen un contenido entre 0,01-0,05 mg/100 mL.
Tanto una como otra permite n cubrir las necesidades del recin nacido y lactante sano en las
primeras ocho semanas de vida. A partir del tercer mes el nio necesita aproximadamente 1
mg/kg/da, y puesto que el coeficiente de absorcin del Fe es de 7-15%, las frmulas utilizadas
para la alimentacin de los lactantes a partir del tercer mes deben estar enriquecidas con Fe,
recomendndose una concentracin igual o superior a 1 mg/100 kcal, sin que la ingesta total
exceda los 15 mg/da (Hernndez Rodrguez, 1999).

31
2. ALIMENTOS FUNCIONA LES

En la ltima dcada los conceptos bsicos en nutricin estn cambiando, hasta ahora la
idea tradicional de una dieta adecuada estaba referida nicamente al aporte de nutrientes
suficientes para asegurar la supervivencia de un individuo, satisfacer sus necesidades
metablicas, y complacer su sensacin de hambre. En la actualidad el nfasis se acenta en la
potencialidad de los alimentos para la promocin de la salud, mejorar el bienestar y reducir el
riesgo de enfermedades. As, el concepto de nutricin adecuada tiende a ser sustituido por el
de nutricin ptima, en cuyo mbito aparecen los alimentos funcionales, denominacin no muy
acertada, pues a juicio de Palou y Serra (2000) todos los alimentos y sus componentes tienen
una funcin.
Un alimento puede ser considerado funcional si se ha demostrado suficientemente que
afecta de forma beneficiosa (ms all de proporcionar una nutricin adecuada desde el punto
de vista tradicional) a una o varias funciones relevantes del organismo, de manera que
proporciona un mejor estado de salud y bienestar y/o reduce el riesgo de padecer enfermedad
(Roberfroid, 1995).
En la Unin Europea, el SCF desarrolla diversos programas en relacin con los alimentos
funcionales, as como la evaluacin de nuevos alimentos de acuerdo con el Reglamento (CE) n
258/97 del Parlamento Europeo y del Consejo sobre nuevos alimentos y nuevos ingredientes
alimentarios, entre los que se encuentran algunos ingredientes funcionales. El SCF de la
Comisin Europea (Direccin General de Salud y Seguridad del Consumidor), constituido por 19
cientficos y expertos independientes, establece el marco cientfico de referencia sobre el que
basar sus opiniones a la hora de aceptar o no un nuevo alimento como seguro y adecuado para
el consumo humano (Commission of the European Communities, 1997a; 1997b).

2.1. Concepto de alimento funcional

Los alimentos funcionales son nuevos alimentos obtenidos por diversos procedimientos,
con la caracterstica particular de que alguno de sus componentes, sea o no nutriente, afecta a
funciones diana del organismo, de manera especfica y positiva, y promueve un efecto
fisiolgico o psicolgico ms all de su valor nutritivo tradicional. El efecto positivo de un
alimento funcional puede ser tanto su contribucin al mantenimiento del estado de la salud y
bienestar como la reduccin del riesgo de padecer una determinada enfermedad (Diplock y col.,
1999). Un alimento funcional puede ser un alimento natural o modificado (alterando, aadiendo
o eliminando uno o varios de sus componentes) o una combinacin de ambos. Adems, puede
ser funcional para la poblacin en general o para grupos particulares de la poblacin, definidos
por sus caractersticas genticas, sexo, edad o por otros factores.
Todo ello permite a las industrias alimentarias el desarrollo de nuevos productos con un
valor potencial aadido en el mercado, siendo uno de sus aspectos ms notables el desarrollo

32
de alimentos de diseo, es decir de productos con funciones adicionales a las del alimento
original (Cantor, 2000). Sin embargo y como referencia, en el Reglamento (CE) n 258/97 se
recoge el concepto de equivalencia sustancial, que expresa la idea de que los organismos ya
existentes o los productos utilizados como alimentos o como fuente de ellos, pueden servir de
base o referencia para compararlos con los nuevos alimentos modificados. El desarrollo de
alimentos funcionales constituye una oportunidad real de contribuir a la mejora de la calidad de
la dieta y a la seleccin de alimentos que pueden afectar positivamente la salud y el bienestar
del consumidor. En este sentido, la perspectiva europea difiere de la norteamericana, ya que
considera los alimentos funcionales como nutraceticos o farmaalimentos. As pues, el concepto
de alimento funcional incluye que, como componentes habituales de la dieta, deben ejercer sus
efectos en cantidades consumidas normalmente en una dieta equilibrada, y se excluye como
tales a las pldoras, cpsulas y tabletas (Diplock y col., 1999; Milner, 2000).

2.2. Dianas que presentan un mayor inters en el desarrollo de nuevos alimentos

De acuerdo con las conclusiones elaboradas en el documento consenso sobre los

alimentos funcionales (Diplock y col., 1999), las dianas con mayor inters en el desarrollo de
nuevos alimentos son las que afectan a las siguientes funciones:

1- Crecimiento, desarrollo y diferenciacin

Dieta de gestantes: evitar malformaciones
Leche de lactantes: suministrar dieta ptima
Efectos sobre el ciclo celular en tejidos especficos
2- Metabolismo intermediario, sistema cardiovascular y antioxidantes
Reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares
Control de la resistencia a insulina: diabetes tipo 2, obesidad
Estrs oxidativo celular y tisular
3- Metabolismo de xenobiticos
Modulacin por componentes de la dieta
Control de toxicidad y carcinogenicidad por contaminantes alimentarios
4- Sistema gastrointestinal
Mejora de la microflora colnica
Biodisponibilidad de nutrientes
Promocin de la actividad inmunitaria intestinal
Modulacin de la proliferacin celular del epitelio intestinal
5- Humor y comportamiento
Mejora de las capacidades cognitivas
Modulacin del estado psicolgico
Aumento de la calidad de vida y de su percepcin

Un producto alimenticio se puede convertir en un alimento funcional mediante cinco

estrategias bsicas:

1. Eliminacin de un componente, del cual se sabe que causa un efecto perjudicial para el
consumidor, como ocurre con la eliminacin de la protena del gluten del trigo.

33
2. Incremento de la concentracin de un componente natural del alimento, de manera que se
pueda alcanzar una concentracin superior a la habitual, y que ello suponga inducir
resultados positivos sobre la salud. La adicin de Ca de la leche o de vitaminas y minerales
en cereales pueden englobarse en este grupo de alimentos funcionales.
3. Adicin de un componente, que no se halla normalmente presente en la mayora de los
alimentos, pero que se ha demostrado que causa efectos beneficiosos, tal y como sucede
con la adicin de fibra en el yogurt.
4. Sustitucin de un componente que provoca efectos no deseables por otro que tiene efectos
neutros o beneficiosos sobre la salud, como sustituir grasas saturadas por hidratos de
carbono no solubles en leche y helados.
5. Alteracin de la biodisponibilidad metablica, ya sea mejorando la de compuestos que
producen efectos beneficiosos o dificultando la de componentes perjudiciales. El aumento de
transferrina en leche sera un ejemplo del 1er punto, mientras que la disminucin de
fitosteroles lo sera del 2.

Puede deducirse que estas estrategias abarcan dos grandes grupos de health claims
(proclamas alimentarias reivindicativas de un efecto beneficioso para la salud): aquellas que
proclaman el aumento de la funcin original del alimento y por tanto, pueden suponer una
mejora de la salud, y aquellas que proclaman la reduccin del riesgo de padecer enfermedades.

2.3. Proclamas alimentarias reivindicativas de efectos beneficiosos para la salud

Definida en 1991 por el Codex Alimentarius como cualquier representacin que afirma,
sugiere o implica que un alimento tiene ciertas caractersticas relacionadas con su origen,
propiedades nutricionales, naturaleza, produccin, procesamiento, composicin o cualquier otra
cualidad (Diplock y col., 1999).
En Japn, la investigacin sobre alimentos funcionales empez activamente ya a
principios de los 80, y en 1986 se implementaron los primeros programas especficos. En 1991
se introduce el concepto de alimentos para usos especficos en el fomento de la salud (Foods
for Specified Health Use, FOSHU). stos deben estar en la forma de alimentos ordinarios, no en
cpsulas ni pastillas, y se asume que se consumen como parte de la dieta habitual. La mayor
parte de los productos que han sido aprobados contienen oligosacridos (OS) o bacterias como
factores que promueven la salud a nivel intestinal (Diplock y col., 1999). La legislacin
japonesa, situada a la vanguardia mundial de alimentos funcionales, reconoce doce clases
diferentes de ingredientes como favorecedores de la salud: FD, OS, azcares, pptidos y
protena, glcidos, alcoholes, isoprenoides y vitaminas, colinas, bacterias acidolcticas (BAL),
minerales, AG poliinsaturados y otros.
Tanto la Food and Drug Administration (FDA) en EEUU, como el SCF en Europa, se
basan en la informacin cientfica disponible, y en el acuerdo sustancial entre expertos

34
cualificados, de forma que los health claims propuestos responden a las evidencias cientficas.
Partiendo de dichos estudios cientficos se pueden considerar cuatro tipos principales de
reivindicaciones sobre la salud que sirven de base para su aprobacin en la Unin Europea
(Diplock y col., 1999; Ross, 2000):

Tipo I: Proclamas relacionadas con recomendaciones dietticas o con dietas consideradas

sanas. Por ejemplo dietas bajas en grasas saturadas y elevadas en fibra.
Tipo II: Proclamas del contenido en nutrientes. Adoptan la expresin es fuente de Ca,
tiene elevado contenido en fibra y es bajo en grasa.
Tipo III: Comparativas del contenido en nutrientes entre dos o ms alimentos. Hacen
referencia a menores niveles de grasa y COL, mayor abundancia de vitaminas y Fe.
Tipo IV: Proclamas de la funcionalidad de nutrientes. Entre estas podemos citar aquellas
que indican el Ca ayuda al correcto desarrollo de huesos y de dientes ms fuertes o el
cido flico contribuye a asegurar el desarrollo normal del feto.

Sin embargo, estas cuatro categoras no hacen referencia a las consecuencias que
podran derivarse de un consumo excesivo, por encima de los niveles recomendados en una
dieta equilibrada. As, recientemente se han propuesto dos nuevas categoras para cubrir de
forma especfica las particularidades adicionales de los alimentos (Diplock y col., 1999):

Reivindicaciones de aumento de funcin (tipo A). Efecto(s) beneficioso(s) especfico(s) de

la(s) interaccin(es) entre un componente del alimento y una(s) actividad(es) biolgica(s),
fisiolgica(s) o psicolgica(s), ms all de las establecidas por su papel nutritivo tradicional.
Por ejemplo, el efecto de ciertos oligosacridos no digeribles (OND) sobre bacterias de la
microflora intestinal o, de los folatos sobre la homocistena.
Reivindicaciones de reduccin del riesgo de enfermedad (tipo B). Reduccin del riesgo de
padecer una enfermedad mediante el consumo de un o una mezcla de componente(s)
especfico(s) o ingrediente(s) alimenticio(s). Como ejemplo podra citarse la expresin el Ca
reduce del riesgo de osteoporosis.

2.4. Oligosacridos no digeribles (OND) como ingredientes alimenticios funcionales

Son numerosas las sustancias que han sido descritas como alimentos funcionales, lo s
fitosteroles y vitamina E, probiticos (lactobacilos y bifidobacterias), prebiticos (inulina y
oligofructosa) y simbiticos (probiticos ms prebiticos), licopeno, polifenoles e isoflavonas.
Sin embargo cabra destacar la importancia de los OND como firmes candidatos a ser incluidas
en esta categora. A pesar de que los OND se encuentran como componentes naturales en
muchos alimentos comunes como la fruta, legumbres, leche y miel, durante la pasada dcada

35
su popularidad como ingredientes alimenticios ha aumentado rpidamente, particularmente en
Japn y Europa (Sako y col., 1999). En 1991 el gobierno japons legisl sobre los FOSHU entre
los que se incluyeron a los fructooligosacridos (FOS), galactooligosacridos (GOS),
sojaoligosacridos (SOS) y palatinosaoligosacridos (POS). En 1996 la lista de FOSHU inclua un
total de 58 alimentos aprobados, de los cuales treinta y cuatro renen a OS como ingredientes
funcionales, incluyendo a la lactulosa, lactosucrosa, xilooligosacridos (XOS) e
isomaltooligosacridos (IOS) (Critteden, y Playne, 1996). En Europa hay dos clases que se usan
ampliamente, la inulina y FOS, y los -GOS (Salminen y col., 1998; Sako y col., 1999).
Esta popularidad se ha debido principalmente a los posibles beneficios para la salud que
se han asociado con el consumo de estos compuestos. Sus propiedades nutritivas se originan
principalmente en su resistencia a las actividades hidrolticas en la parte superior del tracto
digestivo de los animales monogstricos, seguidos por una extensa fermentacin en el intestino
grueso. Adems, debido a su capacidad de estimular selectivamente el crecimiento de las
bifidobacterias de la microbiota del colon, han sido propuestos como sustancias con carcter
prebitico. Las reas ms prometedoras para el desarrollo de tal afirmacin son:

1. Alivio del estreimiento por el efecto de aumento de deposicin y posiblemente de los

efectos sobre la motilidad intestinal (Kleessen y col., 1997b).
2. Inhibicin de la diarrea, especialmente cuando est asociada con infecciones intestinales.
Esto puede estar directamente relacionado con el posible efecto inhibitorio de las
bifidobacterias sobre las bacterias gram-positivas y gram-negativas (Wang, 1993; Wang y
Gibson,1993).
3. Reduccin del riesgo de osteoporosis si ciertamente mejoran la biodisponibilidad de Ca, y
si este efecto funcional es seguido por un cambio fisiolgico en la densidad y masa sea
(Roberfroid y Slavin, 2000).
4. Reduccin del riesgo de aterosclerosis (enfermedad cardiovascular asociada con
dislipidemia, especialmente hipertrigliceridemia e insulina resistente) que est asociada con
un rgimen de alimentacin de hidratos de carbono hipercalrica (Aarsland y col., 1996).
5. Reduccin del riesgo de obesidad y posiblemente diabetes no insulino dependiente que
estn asociadas con la resistencia a la insulina (Roberfroid y Slavin, 2000).

36
3. BIFIDOBACTERIAS

3.1. Descubrimiento e historia

En 1899, en el Instituto Pasteur, Tissier observ y aisl de las heces de nios una
bacteria con una inusual, y hasta entonces desconocida, forma de Y. A comienzos de siglo, la
taxonoma se basaba enteramente en criterios morfolgicos y Tissier (1900) denomin a esta
bacteria Bacillus bifidus communis. Al mismo tiempo, pero en Italia, Moro (1900a) descubri en
condiciones similares una bacteria que reconoci como diferente de la de Tissier y que identific
como perteneciente al gnero Lactobacillus. A pesar de las diferencias entre estas dos
bacterias, Holland (1920) propuso un nombre comn: Lactobacillus bifidus. Fue necesario
esperar hasta 1965 y el progreso de la gentica molecular para que el equipo de Sebald y col.
(1965) demostraran que el porcentaje de guanina ms citosina (G+C) en el ADN de las
especies del gnero Bifidobacterium difera del de los gneros Lactobacillus, Corynebacterium y
Propionoibacterium. Adems en 1967, De Vries y Stouthamer demostraron la presencia en las
bifidobacterias de un enzima especfica de este gnero como es la fructosa-6 fosfato
fosfoketolasa (F6PPK) y la ausencia de la aldolasa y de la deshidrogenasa glucosa-6 fosfatasa,
dos enzimas presentes en los lactobacilos. Por tanto, la clasificacin de las bifidobacterias en el
gnero Lactobacillus no estaba justificada. En 1974, la 8 edicin del Manual de Bergey de la
determinacin bacteriolgica reconoci a las bifidobacterias como un gnero por derecho propio
consistente en 11 especies (Buchanan y Gibbons, 1974).
Hoy en da dentro del gnero Bifidobacterium se incluyen treinta especies, diez de las
cuales son de origen humano (presentes en la caries dental, heces y vagina), diecisiete del
tracto intestinal animal y del rumen, dos de aguas residuales y una de leche fermentada, tal y
como se muestra en la Tabla 4 (Gomes y Malcata, 1999).

3.2. Morfologa, fisiologa, metabolismo y ecologa

Las bifidobacterias se caracterizan por ser gram-positivas, no esporuladas, inmviles y

catalasa-negativas. Son pleomrficas, incluyendo las formas de bacilos cortos, bacilos curvados,
bacilos con forma de porra y bacilos bifurcados con forma de Y (Sgorbati y col., 1995).
Son microorganismos anaerobios estrictos, sin embargo el grado de tolerancia del O2
depende de la especie y del medio de cultivo (De Vries y Stouthamer, 1969). En presencia de
dixido de carbono (CO2), la sensibilidad al O2 vara considerablemente dependiendo de la cepa
(Scardovi, 1986). Adems, Cheng y Sandine (1989) encontraron un crecimiento satisfactorio en
bifidobacterias incubadas sin condiciones anaerbicas en un medio de cultivo con base de
suero, L-cistena y extracto de levadura.

37
 Tabla 4. Especies del gnero Bifidobacterium en funcin de su origen
Origen
Humano
B. adolescentis B. dentium
B. angulatum B. globosum
B. bifidum B. infantis
B. breve B. longum
B. catenulatum B. pseudocatenulatum
Intestino y rumen animales
B. animalis B. magnum
B. asteroides B. merycicum
B. boum B. pseudolongum
B. coryneforme B. pullorum
B. cuniculi B. ruminantium
B. choerinum B. saeculare
B. gallicum B. suis
B. gallinarum B. thermophilum
B. indicum
Agua residual
B. minumun
B. subtile
Leche fermentada
B. lactis
Adaptada de Gomes y Malcata (1999)

La temperatura ptima de crecimiento para el desarrollo de las especies humanas,

como es natural, oscila entre 37 y 41 C. No hay crecimiento por debajo de 20 C y no resisten
la temperatura por encima de 46 C; B. bifidum muere a 60C (Rasic y Kurman, 1983). El pH
inicial ptimo de crecimiento est entre 6 y 7. No crecen por debajo de 4,5-5 ni por encima de
8-8,5 (Scardovi, 1986).
Las bifidobacterias estn agrupadas filogenticamente en la rama actinomicete de las
bacterias gram-positivas (Sgorbati y col., 1995), que se caracteriza por un elevado contenido en
G+C (entre 54 y 67 mol%). El tipo de peptidoglucano de la pared celular vara en funcin de
que el aa bsico presente en el tetrapptido sea ornitina o lisina. Los fosfolpidos de la pared
celular son igualmente variados tales como el poliglicerolfosfolpido y sus liso-derivados,
alanilfosfatidilglicerol y los lisoderivados del difosfatidilglicerol.
El metabolismo de los azcares es heterofermentativo (Mital y Carg, 1992). Son
organismos sacarolticos que producen cido actico y lctico sin generacin de CO2, excepto en
la degradacin de gluconato (Kurman y Rasic, 1991). Las hexosas son degradadas exclusiva y
especficamente por la ruta de la fructosa 6-fosfato descrita por Scardovi y Trovatelli (1965). La
fermentacin de 2 moles de glucosa da lugar globalmente a 3 moles de acetato y 2 de lactato.
De este modo se produce un ratio molar terico (actico:lctico) de 1,5, y el c. lctico
producido est en la forma L(+). La enzima caracterstica del metabolismo del azcar por el
gnero Bifidobacterium es la F6PPK. Esta enzima, que es especfica de gnero, est ausente en
las bacterias anaerobias que podran confundirse morfolgicamente con las bifidobacterias,

38
como las pertenecientes a los gneros Lactobacillus, Arthrobacter, Propionibacterium,
Corynebacterium y Actinomycetaceae (Scardovi y Trovatelli, 1965). Todas las bifidobacterias de
origen humano son tambin capaces de utilizar, adems de la glucosa, la galactosa, lactosa y
comnmente la fructosa como fuentes de carbono. Las bifidobacterias tambin son capaces de
fermentar en algunos casos hidratos de carbono complejos como lo demuestra un estudio
realizado por Crociani y col. (1994) con 290 cepas de 29 especies de bifidobacterias de origen
humano y animal. Deguchi y col. (1985) se interesaron en la sntesis de seis vitaminas por las
bifidobacterias de origen humano: tiamina (B1), riboflavina (B2), piridoxina (B6) c. flico (B9),
cianocobalamina (B12) y c. nicotnico (PP). Cinco de estas vitaminas (excepto la vitamina B2)
fueron sintetizadas por la mayora de las cepas examinadas y adems, las vitaminas B6, B9, y
B12 se excretaron en gran proporcin. Estos autores tambin describieron que B. bifidum y B.
infantis fueron buenos productores de las vitaminas B1, B9 y PP, mientras que B. breve y B.
longum las produjeron en pequeas cantidades y B. adolescentis no sintetiz ninguna de estas
vitaminas.
La mayora de las bifidobacterias son capaces de usar las sales de amonio (NH4+) como
su nica fuente de nitrgeno (N) (Hassinen y col., 1951). B. bifidum crece solamente en
presencia de Mg, Mn y sobre todo de Fe. El Fe es quizs asimilado por B. bifidum en ambas
formas oxidadas (Fe2+y Fe3+) dependiendo de la acidez del medio (Bezkorovainy y col., 1996).
En la bibliografa cientfica han sido descritas numerosas sustancias que pueden actuar
como factores de crecimiento de las bifidobacterias. En 1953 Gyrgy, describi en la leche
humana una serie de derivados del N-acetilglucosamina que hoy da se sabe que son necesarios
para el crecimiento de las bifidobacterias y se denominan factores bifidognicos (Modler y col.,
1990). Se distinguen tres grupos principales de factores bifidognicos que dependen de la
especie y que se denominan factor BB (BF1, BF2 y glicoprotenas) para B. bifidum, factor BI
para B. infantis y factor BL para B. longum. La lactoferrina y sus tres complejos metlicos (Fe,
Cu, Zn) tienen un efecto estimulante del crecimiento en ocho especies del gnero
Bifidobacterium (cinco de origen humano y tres de origen animal) al comienzo de la fase
logartmica de su crecimiento (Shimamura, 1989). La lactulosa no se metaboliza en el ID del
hombre ni de los animales. In vivo, puede incrementar el desarrollo de B. bifidum. Sin embargo,
este factor no es activo in vitro y no est presente en estado libre en la leche materna. Su
accin es debida al hecho de que resiste mejor que la lactosa la degradacin por lactasas en el
tracto digestivo y por tanto puede ser usada por las bifidobacterias, aunque tambin podra ser
metabolizado por otras bacterias intestinales (Yazawa y Tamura, 1982). Por ltimo, se ha
descrito que determinados OS estimulan el crecimiento de las bifidobacterias. Este tipo de
hidratos de carbono ser discutido ms ampliamente en el punto 7 de esta seccin. Sin
embargo, podemos destacar aqu que la rafinosa, estaquiosa e inulina son usadas
especficamente por B. infantis y no por otras bacterias intestinales como E. coli, L. acidophilus
y S. faecalis (Yazawa y col., 1978). Los FOS tambin son metabolizados por las bifidobacterias,

39
adems de por otro tipo de bacterias, y no son degradados por las enzimas digestivas humanas
ni generalmente por bacterias indeseables dentro del tracto digestivo (Mitsuoka y col., 1987).
Aunque la sensibilidad de las bifidobacterias frente a los antibiticos no ha sido muy
investigada y las condiciones experimentales son variables, puede ser aceptado que la
sensibilidad de las especies vara entre 10 y 500 g de antibitico /mL (La Vergne y col., 1959),
siendo la mayora de las bifidobacterias resistentes a numerosos antibiticos y de forma notable
al c. nalidxico, gentamicina, kanamicina, metronidazol, neomicina, polimixina B y
estreptomicina. Por el contrario, la ampicilina, bacitracina, cloranfenicol, clindamicina,
eritromicina, lincomicina, nitrofurantona, oleandomicina, penicilina G y vancomicina inhiben
fuertemente a la mayora de las especies (Scardovi, 1986).
Las bifidobacterias son microorganismos de gran importancia en el activo y complejo
ecosistema del tracto intestinal de los humanos y otros animales de sangre caliente, y de las
abejas (Sgorbati y col., 1995). Estn distribuidos en varios nichos ecolgicos en el tracto GI y
genitourinario, y su proporcin est determinada principalmente por la edad y la dieta. Como
ejemplo podemos citar que la microflora natural de los bebs est dominada por bifidobacterias
que se establecen al poco de nacer, descendiendo su nmero con la edad hasta situarse tras
los gneros Bacteroides y Eubacterium. Adems, el perfil de especies constituyentes tambin
cambia; B. infantis y B. breve, tpicos en los bebs, son reemplazados por B. adolescentis en los
adultos, mientras que B. longum, persiste toda la vida (Mitsuoka, 1990c). Estos cambios
pueden obviamente estar influidos tanto por el consumo de factores bifidognicos (Modler,
1994) como por la fisiologa del hospedador (Kurmann y Rasic., 1991).
Aunque las bifidobacterias han estado implicadas en infecciones del aparato
genitourinario (Darbas y col., 1989), slo una especie es considerada como patgena para el
hombre: B. dentium, que causa caries dental (Sgorbati y col., 1995).

3.3. Medios y parmetros de cultivo

Se ha afirmado que un elevado nmero de bifidobacterias en el colon es positivo para

la salud humana, puesto que puede prevenir la colonizacin de patgenos, y podra tener
efectos positivos sobre el peristaltismo intestinal, el sistema inmune, la prevencin del cncer y
el metabolismo del COL e hidratos de carbono en el colon (Mitsuoka, 1990c; Ishibashi y
Shimamura, 1993). Por estas razones las bifidobacterias se han aadido como probiticos,
especialmente en productos lcteos (Tamime y col., 1995). Debido a este inters se ha hecho
necesario tener un mtodo rpido, seguro y relativamente barato para determinar las
bifidobacterias tanto en heces como en alimentos. Se podran aplicar varios mtodos, como los
recuentos en placa, mtodos basados en la deteccin de ADN (Ito y col., 1992) o mtodos
enzimticos (Scardovi, 1986). Para el control de calidad en productos lcteos, o para estudios
de la flora fecal con un gran nmero de muestras, los mtodos de recuento en placa son

40
todava preferibles. Por tanto, se hace necesario el disponer de un medio que promueva
selectivamente el crecimiento de la mayora de bifidobacterias mientras suprime la gran parte
de otras bacterias fecales o aisladas en productos lcteos, como lactobacilos y estreptococos
(Hartemink y col., 1996). Debido a los numerosos medios descritos para el cultivo de las
bifidobacterias, se llega a la conclusin que no existe un medio estndar para la detecin de las
mismas. Rasic y Sad (1990) indicaron que los dos factores importantes en la deteccin y
recuento de bifidobacterias son un medio de cultivo adecuado y condiciones de anaerobiosis.
En la siguiente tabla (Tabla 5) se enumeran los medios de cultivo bsicos y no
selectivos empleados para bifidobacterias. Este tipo de medios es til para el recuento rutinario
de bifidobacterias cuando estn presentes en leches no fermentadas y en leches fermentadas
con bifidobacterias. Su finalidad es la de determinar el inculo inicial y averiguar el tiempo que
estos microorganismos permanecen viables durante su almacenamiento.

Tabla 5. Medios de cultivo bsicos y no select ivos para bifidobacterias en productos lcteos
Abreviatura Nombre
Concentracin final de los aditivos
del medio del medio
BL Glucose Blood-Liver -
CLB Columbia base -
LCL Liver Cysteine Lactose -
mBL BL modificado sin sangre L-cistena HCl, 0,05%
mMRS MRS modificado L-cistena HCl, 0,05%
L-cistena HCl, 0,05%
mMRS+sangre MRS modificado
Sangre de oveja (10 mL)
Lactosa 1,0%
mRCM RCM modificado
Sangre humana (50 mL)
MRS De Man Rogosa Sharpe -
RCM Reinforced Clostridia Medium -
RCPB RCM Azul de prusia 0,03%
TPY Tryptone Phytone Yeast -
X--Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-
X--Gal MRS
galactopiranosido)
Adaptado de Rasic y Kurmann, (1983); Samona y Robinson (1991) y Arroyo y col. (1994)

Para un correcto recuento de bifidobacterias se han hecho varios intentos por obtener
un medio selectivo para el aislamiento de esta especie frente a otros microorganismos lcteos
relacionados, especialmente estreptococos y lactobacilos (Sozzi y col., 1990). Estos medios se
caracterizan por la presencia de sustancias que disminuyen el potencial redox (cistena, cistina,
c. ascbico o sulfito de Na), de antibiticos y/o una fuente de carbono sencilla como agentes
selectivos para inhibir el crecimiento de otras BAL. Estos medios son enriquecidos
frecuentemente con sangre de oveja o caballo (Rasic y Sad, 1990). A menudo tambin
incorporan L-cistena (0,1-0,5%) para mejorar la recuperacin de las bifidobacterias (Teraguchi
y col., 1978). La cistena es un aa azufrado que proporciona N amino como factor de
crecimiento mientras reduce el potencial redox, ambos efectos favorecen el crecimiento de las
bififdobacterias (Shah, 2000). En muchos casos, el recuento de bajos nmeros de
bifidobacterias podra estar sujeto a la interferencia con S. thermophilus, produciendo colonias

41
en puntos (Roy, 2001). En la Tabla 6 se muestran los medios selectivos (por el antibitico
empleado, el hidrato de carbono a fermentar y el pH del medio) para el recuento de
bifidobacterias en muestras fecales y en productos lcteos (Hartemink y Rombouts, 1999; Roy,
2001).

Tabla 6. Medios de cultivo selectivos para el recuento de bifidobacterias presentes en muestras fecales
(MF) y en productos lcteos (PL)
Medio Selectividad basada en Uso
AL agar Lactosa, acetilglucosamina MF
c. nalidxico, polimixina B, c. iodoactico, TTC (2,3,5-trifeniltetrazolium), mezcla LP (LiCl 2
AMC PL
g/L+propionato Na 3 g/L)
BBM agar c. Nalidxico, rifanpicina, rafinosa MF
BFM LiCl, azul de metileno, c. propinico (5 mL) PL
BiBL agar Azul de anilina, sangre MF
Bif-medium Suero humano, c. nalidxico, paromomicina, aztreonam, netilmicina PL
Kanamicina, c. nalidxico, c. iodoactico, neomicina,
BIM-25 MF/PL
polimixina B, 2,3,5-trifeniltetrazolium cloruro
BL-OG Oxgall, gentamicina PL
BS agar LiCl, neomicina, paromomicina, propionato MF
CB agar Color especfico del azul china MF
DP Dicloxacillin, c. propinico (5 mL) PL
Ecobion 2 Neomicina, LiCl PL
GL agar Galactosa, LiCl PL
LCL Cistena, Lactosa MF
LP Mezcla LP (LiCl 2 g/L+ propionato Na 3 g/L), lactosa PL
mCAB c. propinico (5 mL) PL
MPN agar Lactosa, c. nalidxico MF
mRCB Cefalotina, sangre MF
MRS-D Dicloxacilina PL
MRS-LP agar c. propinico, LiCl PL
MRS-NNL LiCl, neomicina, c. nalidxico MF
Solucin NPNL (neomicina sulfato 100 mg+paromomicina 200 mg
MRS-NPNL PL
+c. nalidxico 15 mg+LiCl 3 g)
mTPY c. Actico glacial (1 mL/L), mupirocina (100 mg/L) MF
mVF agar LiCl, propionato, neomicina, lauril sulfato Na PL
NPNL agar Solucin NPNL MF/PL
Propionate agar
c. propinico, pH 5,0 MF
(Beerens-agar)
RAF 5.1 Mezcla LP PL
RB LiCl (3 g/L), propionato Na (15 g/L), rafinosa MF/PL
RCM+tincin Tincin azul de metileno de Loeffler PL
RMS+PPNL Propionato Na, neomicina PL
Rogosa-N pH bajo, c. nalidxico MF
TCPY Zumo de tomate MF
TCPY+azida Zumo de tomate, azida MF
TCPY+c. srbico Zumo de tomate, c. srbico MF
TCPY+ab Zumo de tomate, c. srbico, antibiticos MF
TOS agar Transgalactooligosacridos MF/PL
TOS-NPNL TOS, Solucin NPNL PL
TPY-D Dicloxacilina PL
TPY-NPNL Solucin NPNL PL
TTC agar TTC MF
YN-6 Lactosa, c. nalidxico, neomicina, verde bromocresol MF
X--Gal X--Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactopiranosido) MF
Adaptado de Hartemink y Rombouts (1999) y Roy (2001)

42
4. FLORA INTESTINAL HUMANA

El cuerpo humano est formado aproximadamente 1014 clulas, de las cuales el 90%
son bacterias y slo un 10% son de origen mamfero (Sanders y Sanders, 1984). Cada persona
alberga unos 100 billones de bacterias de unas 400 especies distintas (Salminen y col., 1998).
Ms del 95% vive en el tracto digestivo, sobre todo en el colon (Raibaud, 1999).
El tracto GI humano consiste en un gran tubo compuesto por la boca, esfago,
estmago, ID e intestino grueso. El ID se puede dividir en duodeno, yeyuno e leon, y el
intestino grueso en ciego, colon ascendente, colon transverso, colon descendente y recto
(Cummings y Macfarlane, 1991; Macfarlane y Cummings, 1991). En la Figura 1 se muestra la
distribucin de especies microbiolgicas en el tracto GI humano.

108/cm2
Streptococcus
Lactobacillus <104/g
cavidad oral Colon 1011-1012/g
Bifidobacterium H. pylori Bacteroides
Streptococcus Bifidobacterium
Lactobacillus Coprococcus
Duodeno 103/g hgado Peptostreptococcus
estmago Eubacterium
Streptococcus
Ruminococcus
Lactobacillus
E. coli
Fusobacterium
Enterococcus
Streptococcus
Yeyuno
Lactobacillus
Bifidobacterium
Enterococcus
Clostridium
Bacteroides intestino delgado Veillonella
Megasphera
leon
intestino grueso Propionibacterium
Anaerobios estrictos
109/g Enterobacteriaceae

Figura 1. Distribucin de las principales especies bacterianas en el aparato digestivo (adaptado de

Hartemink, 1999)

La flora GI ha sido descrita como uno de los ecosistemas bacterianos conocidos ms

complejos (Drasar y Hill, 1974). Los recuentos totales varan entre las diferentes regiones
dentro del tracto GI y dependen principalmente de la tensin de O2, pH y flujo del contenido
digestivo. En la cavidad oral, el nmero de bacterias aproximado es de 7-8 log/g en el hombre y
otras especies. Las principales especies son BAL del gnero Streptococcus, Lactobacillus y
Bifidobacterium. En la placa dental y en infecciones orales, se han aislado muchas especies
anaerobias, principalmente Prevotella y Porphyromonas (Marsh y Martin, 1992). En el jugo
gstrico del hombre hay solo unas 1.000 bacterias por mL debido a la acidez del medio (pH por
debajo de 3), mientras que en otras especies como las ratas y los cerdos, los recuentos llegan
hasta 7 log/g debido a su mayor pH en el estmago (Hill, 1995). Se sabe que hay

43
microorganismos que son altamente tolerantes al cido y que residen en la capa mucosa que
yace encima del epitelio gstrico como Helicobacter pylori (Rathbone y Heatley, 1992),
lactobacilos y estreptococos (Hill, 1995). A lo largo del ID la concentracin de bacterias va
creciendo desde 104 bacterias/mL en el duodeno proximal, hasta 107 bacterias/mL en leon
terminal. La motilidad del ID aclara peridicamente las bacterias de la luz, y las secreciones
intestinales tales como las enzimas pancreticas y variables fisicoqumicas como el pH y el
potencial redox, pueden contribuir a que se desarrolle un tipo determinado de microflora
(Macfarlane y col., 1995) que coloniza sobre todo las criptas y los recodos ciegos. La parte
anterior del ID est dominada por bacterias aerobias y anaerobias facultativas como
estreptococos, estafilococos y lactobacilos. En cambio en el colon, el tiempo de trnsito se
reduce marcadamente y el pH es ms neutro y apropiado para el crecimiento bacteriano, por lo
que la poblacin de microorganismos en el colon es mucho mayor y se alcanzan
concentraciones de 1011-1012 bacterias por mL de contenido (Salminen y col., 1998). Hay un
predominio de las especies anaerobias estrictas en relacin con las anaerobias facultativas
(desde 10:1 hasta 1.000:1) (Nord y Kager, 1984). La inmensa mayora (ms del 90%) de las
clulas totales del cuerpo estn presentes como bacterias en el colon, y se piensa que el 60%
de la masa fecal pueden ser clulas procariotas. La microflora del intestino grueso humano se
adquiere al nacimiento, y aunque inicialmente dominan las cepas de anaerobios facultativos, la
composicin de la flora en etapas posteriores del crecimiento responde principalmente a la dieta
ingerida (Gibson y McCartney, 1998).

4.1. Adquisicin de la microbiota del intestino por los neonatos

Est admitido de forma general que hasta el momento del nacimiento el feto est
rodeado de un ambiente completamente estril. Tras el nacimiento, el tracto digestivo
rpidamente es colonizado por las bacterias (Bezirtzoglou, 1985), aunque no est claro si es a
partir de la boca o del recto. La hiptesis de que la colonizacin se produce a partir de la flora
vaginal o fecal de la madre, est basada en la observacin de que la invasin del tracto
digestivo del neonato ocurre ms rpidamente tras el nacimiento por va genital que por
cesrea (Walch, 1956). Tambin se ha observado que los microorganismos tanto del contenido
gstrico como de la nasofaringe de los bebs inmediatamente antes del nacimiento son
similares a los encontrados en el cervix vaginal de sus madres (Macgregor y Tunnessenn, 1973;
Brook y col., 1979). Despus del nacimiento, los microbios del ambiente, y los orales y cutneos
de la madre sern transferidos mecnicamente al recin nacido mediante varios procesos
incluyendo el amamantamiento, los besos y los cuidados. As, la proximidad entre el canal del
parto y el ano, al igual que los cuidados de los progenitores con el neonato, son mtodos
efectivos para garantizar la transmisin de los microbios de una generacin a otra (Tannock,
1994). Los recin nacidos estn tambin expuestos a nuevos microbios provenientes de la leche
materna (hasta 109 microbios/L) (Moughan y col., 1992). Los gneros ms frecuentes son

44
estafilococos, estreptococos, corynebacterias, lactobacilos, micrococos, propionibacterias y
bifidobacterias, ya que todos ellos tienen su origen en el pezn y alrededor de la piel, as como
en los conductos galactforos de la mama (West y col.,1979).

4.2. Desarrollo de la flora intestinal y factores influyentes

El desarrollo de la microbiota intestinal en los nios se puede dividir en cuatro fases

separadas (Cooperstock y Zedd, 1983):

1a Fase: alrededor de la 1-2 semana.

2a Fase: periodo restante de alimentacin a pecho exclusivamente.
3a Fase: tiempo entre el comienzo de la alimentacin complementaria y del cese de la
alimentacin a pecho.
4a Fase: periodo de conversin de los patrones de microbiota adulta empezando tras la
finalizacin del destete.

Todos los nios al nacer son colonizados inicialmente por bacterias aerobias y
anaerobias facultativas, sobre todo por grandes cantidades de E. coli, estreptococos,
estafilococos y otras enterobacterias, a menudo alcanzando 108-1010/g heces (Bullen y col.,
1977; Yoshioka y col., 1991). Estas bacterias son responsables de la creacin de un ambiente
reducido, favorable para el establecimiento de gneros anaerobios estrictos como Bacteroides,
Bifidobacterium y Clostridium en los primeros das (Stark y Lee, 1982; Lundequist y col., 1985;
Tannock y col., 1990). En los nios alimentados a pecho se reduce el nmero de E. coli y
estreptococos, as como los de bacteroides y clostridios, en relacin a la microbiota fecal
dominada por bifidobacterias. Una vez que comienza la alimentacin complementaria, el perfil
de bacterias de los nios alimentados a pecho se asemeja a la de los alimentados con frmula,
en los que las bifidobacterias no son el grupo dominante. Durante las fases 3a y 4a, tras la
introduccin de la comida slida y el destete, parece ocurrir un cambio repentino de la flora,
perdindose estas diferencias y la microbiota fecal se va asemejando a la de los adultos entre el
primer y cuarto ao de edad (Stark y Lee, 1982; Cooperstock y Zedd, 1983; Neut y col.,
1985a). En algunos nios las bifidobacterias descienden bruscamente, mientras que en otros,
se mantienen estables. Tambin se ha observado una marcada proliferacin de Bacteroides,
Eubacterium, Peptostreptococcus y Clostridium (Mitsuoka, 1989). Los nmeros de bacteroides y
anaerobios cocos gram-positivos gradualmente se incrementan durante estas dos fases
(Cooperstock y Zedd, 1983), existiendo adems otros grupos bacterianos (eubacteria,
veillonella, estafilococos, propionibacteria, bacilli, fusobacteria y levaduras) que se presentan
normalmente en las heces del adulto (Conway, 1997). En la Figura 2 se muestra la evolucin de
los principales grupos bacterianos durante toda la vida del hombre (Mitsuoka, 1984).

45
 Log10 del nmero de bacterias por
gramo de heces

Nacimiento Destete Edad adulta Vejez

Figura 2. Cambios de la flora intestinal desde el nacimiento hasta la vejez (Mitsuoka, 1984)

El desarrollo de la flora intestinal est influido por numerosos factores que afectan al
tipo de especies (incluido el gnero Bifidobacterium) que colonizarn el intestino infantil. A
juicio de Mountzouris y col. (2002) los ms importantes son los siguientes:

1. La edad de gestacin. El nacimiento prematuro es causa de dificultad de implantacin de

las bifidobacterias por falta de receptores y/o substratos endgenos, mientras que las
enterobacterias y bacteroides colonizan fcilmente el colon (Stevenson y col., 1985).
2. El tipo de parto y condiciones ambientales. Tal y como se ha mencionado anteriormente,
los nios nacidos por parto vaginal, durante el paso a travs del canal del parto, estn
expuestos a la flora vaginal de la madre (Tannock y col., 1990), aunque la flora del
intestino de la madre ha sido reconocida como la fuente ms importante de la colonizacin
bacteriana intestinal del recin nacido por parto vaginal (Adlerberth, 1999).
Sin embargo, el ambiente tambin contribuye en la colonizacin bacteriana, ya que
dentro de las salas de maternidad puede existir una transmisin horizontal de bacterias
entre los neonatos a travs de las manos del personal mdico o de enfermera (Lundequist
y col., 1985), especialmente si los bebs son separados de sus madres durante largos
periodos de tiempo tras el nacimiento (Murono, y col., 1993) o nacen por cesrea
(Fryklund y col., 1992). Las enterobacterias pertenecientes a los gneros Klebsiella,
Enterobacter y Citrobacter son ms frecuentes que E. coli en estos neonatos debido su
mayor supervivencia en el medio hospitalario (Adlerberth, 1999). Grnlund y col. (1999),
encontraron que los nios nacidos por cesrea tienen un mayor rango de colonizacin de
Clostridium perfringes que los nios nacidos vaginalmente al mes de edad (57 y 17%
respectivamente). Entre todos los nios nacidos por parto vaginal, las bacterias ms
frecuentes durante los dos primeros meses de vida son las pertenecientes al gnero
Bifidobacterium (85-97%), aunque el grupo de Bacteroides fragilis es tambin comn (52-
79%). Esto demuestra que no existe un patrn claro de colonizacin, ya que algunos

46
 investigadores han encontrado a las especies pertenecientes al gnero Bifidobacterium
como predominantes en el caso de parto vaginal, y Bacteroides en un porcentaje ms
escaso (Stark y Lee, 1982; Yoshioka y col., 1983), mientras que otros autores encontraron
el hecho contrario (Simhon y col., 1982; Lundequist y col., 1985).
3. Tipo de alimentacin. A principio del siglo pasado, Tissier (1900) describi que la flora del
neonato alcanzada con lactancia materna consista completamente en bifidobacterias,
mientras que los lactobacilos eran flora predominante en los alimentados con lactancia
artificial. Investigaciones posteriores han demostrado que no hay diferencia cualitativa en
la distribucin de especies entre estos dos tipos de alimentacin, si no que dicha diferencia
radica a nivel cuantitativo, es decir en la proporcin de bifidobacterias y otras especies
(Mitsuoka, 1982; Yuhara y col., 1983; Benno y col., 1984). Numerosos estudios sobre las
caractersticas de la microflora intestinal en los nios alimentados con lactancia materna,
en comparacin con los alimentados con lactancia artificial, han demostrado que los
primeros poseen una menor cantidad de clostridios y de enterococos, y una mayor
cantidad de estafilococos que los nios alimentados con lactancia artificial (Simhon y col.,
1982; Yoshioka y col., 1983; Lundequist y col., 1985; Balmer y Wharton, 1989; Tannock,
1994).
En los nios alimentados con lactancia materna existe un predominio de
bifidobacterias respecto a las enterobacterias, clostridios y bacteroides en la flora intestinal
(Siigur y col., 1993; Langhendries y col., 1995), relacionado con el alto contenido en OS de
la leche materna. stos estimulan el crecimiento de las bifidobacterias que fermentan la
lactosa hasta producir c. lctico y c. actico dando lugar a un medio cido (pH 5-5,5)
muy adecuado para su crecimiento y desarrollo (Newburg, 2000). En cambio, los nios
alimentados con lactancia artificial desarrollan una flora intestinal ms compleja, rica en
enterobacterias y bacterias anaerobias gram-negativas (bacteroides), clostridios y
estreptococos debido al desarrollo de un medio ms alcalino (Gibson y Collins, 1999). Con
la lactancia artificial, adems se mantienen elevados los niveles de especies aerobias (E.
coli y estreptococos) que inicialmente colonizan el tracto digestivo y permiten el desarrollo
de bacterias anaerobias (Bacteroides, Clostridium, Eubacteria, Peptostreptococaceae,
Enterobacteriaceae, Streptococcus) (Mitsuoka y Kaneuchi, 1977; Mitsuoka, 1989).
Respecto a la influencia de la alimentacin en el tipo de bifidobacteria, se ha
encontrado que la especie aislada ms frecuentemente y en mayor nmero es B. breve en
ambos tipos de lactancia (natural y artificial), y menos frecuentemente y en menor nmero
B. adolescentis, B. longum y B. bifidum (Yuhara y col., 1983; Benno y col., 1984;
Mevissen-Verhage y col., 1987). Otros autores han descrito que B. infantis es el dominante
en los nios alimentados a pecho, con B. longum y B. bifidum como las siguientes en
frecuencia (Mitsuoka y Kaneuchi, 1977; Mitsuoka, 1982; Rasic y Kurmann, 1983). En
cambio en otros estudios, B. bifidum se mostr como la especie dominante durante la
alimentacin con lactancia materna (Beerens y col., 1980; Yuhara y col., 1983).

47
4. Hbitos obsttricos y teraputicos. Los antibiticos de amplio espectro y otros agentes
antimicrobianos, como ungentos antispticos utilizados en la palpacin vaginal durante el
parto, son capaces de provocar importantes alteraciones de la flora autctona intestinal,
con ruptura del equilibrio del ecosistema y un aumento considerable del nmero de
microorganismos resistentes a estos antibiticos (Pseudomona aeruginosa, levaduras y
Clostridium difficile) (Bernasconi, 1986).

4.3. El colon humano

Las funciones biolgicamente importantes del intestino grueso incluyen la absorcin y

secrecin de ciertos electrolitos y agua, as como el almacenamiento y excrecin de materiales
de deshecho (Drasar y Hill, 1974; Eastwood, 1982). Adems, el intestino grueso es la regin
ms colonizada del tracto digestivo, con ms de 1012 bacterias por cada gramo de intestino, por
lo que esta microbiota residente tiene una funcin importante en la nutricin y posiblemente en
la salud (Gibson y Macfarlane, 1995).

4.3.1. La microflora del colon

Como se ha comentado con anterioridad, en el colon de un adulto humano hay

alrededor de 400 especies de bacterias distintas pertenecientes a 50 gneros, siendo las
bacterias anaerobias superiores en nmero a la aerobias, en un rango de 1.000:1 (Moore y
Holdeman, 1974; Finegold y col., 1974; Nord y Kager, 1984). Esta comunidad bacteriana
alberga a especies pertenecientes a los gneros Bacteroides, Bifidobacterium y Eubacterium
que son numricamente predominantes (Moore y Holdeman, 1974). Otros grupos
cuantitativamente menos importantes son Lactobacillus, Clostridium, Enterobacteriaceae, cocos
gram-positivos, bacterias metangenas y sulfato-reductoras (Finegold y col., 1974).

COLON DESCENDENTE
COLON ASCENDENTE (lado izquierdo)
(lado derecho)
Rico en protenas
Rico en hidratos de carbono Actividad proteoltica
Actividad sacaroltica pH 7,2-7,6
pH 5,5-6,5 Menor humedad
Mayor humedad Menos AGCC
Ms AGCC Tiempo de residencia 12-36 h
Tiempo de residencia 6-16 h Menor crecimiento bacteriano
Mayor crecimiento bacteriano Gases H2, CO2 y CH4
Gases H2 y CO 2 Aminas, fenoles y amonio

Figura 3. Diferencias regionales en la funcin del intestino grueso humano

48
 Las bacterias tienen actividades fluctuantes en respuesta a la disponibilidad de
substrato, potencial redox, pH, tensin de O2 y distribucin en el colon (Cummings y
Macfarlane, 1991). El intestino grueso recibe la digesta del leon terminal aproximadamente 5 h
tras la ingestin (Cummings, 1984). Consecuentemente, los microorganismos residentes en el
colon ascendente (lado derecho) tienen un suplemento abundante de nutrientes de la dieta y
as crecen ms rpido, provocando un descenso del pH (5,5-6,5) como resultado de la intensa
actividad sacaroltica y produccin de cidos grasos de cadena corta (AGCC). Sin embargo, en
el colon descendente (lado izquierdo) la disponibilidad de substrato es menor, por lo que las
bacterias crecen ms lentamente y el pH frecuentemente se aproxima a la neutralidad (7,2-7,6)
(Cummings y col., 1987) tal y como se puede apreciar en la Figura 3.

4.3.2. Efectos fisiolgicos de la microflora del colon

Las principales actividades fisiolgicas derivadas de la fermentacin de los hidratos de

carbono no digeribles pueden resumirse en las siguientes:
Suministro de energa y substratos nutritivos para las bacterias apoyando su crecimiento y
proliferacin (Macfarlane y Cummings, 1991).
Recuperacin parcial de la energa de la dieta proporcionada por los substratos (AGCC, c.
lctico) a la circulacin sistmica (Macfarlane y Cummings, 1991).
Modulacin de la proliferacin y diferenciacin normal y transformada de las clulas de la
mucosa del colon (principalmente a travs del c. butrico). Tal actividad puede jugar un
papel importante, tanto en beneficio como en detrimento, de la promocin y progresin de
las clulas neoplsicas en el proceso carcinognico (van Munster y col., 1994).
Control del pH del colon, que puede llegar a ser ms cido debido a la produccin de cidos
carboxlicos. Tal efecto podra controlarse por la absorcin transepitelial de AGCC, que se
acompaa de la transferencia intraluminal de HCO3-, y por la concentracin de Ca en el
contenido del colon; a baja concentracin se favorece un pH muy cido y cuando la
concentracin es elevada el pH no es tan cido (Macfarlane y Cummings, 1991; Nagengast
y col., 1993).
Absorcin incrementada de iones (Ca, Mg y Fe), as como control de la concentracin de
estos iones en el lumen del colon (Delzenne y col., 1995; Ohta y col., 1995; Lopez y col.,
2000).

4.3.3. Bifidobacterias y sus efectos beneficiosos en la salud humana

Las bifidobacterias producen cidos orgnicos (acetato y lactato) como productos

metablicos finales de la fermentacin de los hidratos de carbono no digeribles que llegan al
colon. Como consecuencia se produce un descenso del pH del medio que puede ejercer adems

49
un efecto antibacteriano (Kawase, 1982; Rasic, 1983). Posteriores trabajos han indicado que las
bifidobacterias son capaces de excretar un producto metablico final que es directamente
inhibidor de un rango de bacterias patgenas gram-positivas y gram-negativas (Gibson y Wang,
1994a y 1994c). Un efecto aadido a la produccin de estos cidos es la protonacin del NH3 (y
aminas) potencialmente txico en forma de NH4+ que no es difundible a sangre, disminuyendo
de esta manera los niveles sanguneos de NH3 (Hansen, 1985). Adems, estas bacterias no
forman otros compuestos txicos como aminas alifticas, c. sulfhdrico (H2S) o nitritos
(Bezkorovainy y Miller-Catchpole, 1989). Las bifidobacterias tambin producen vitaminas, en
gran parte del grupo B, y en especial vitamina B9 (Nishizawa, 1960), as como enzimas
digestivas como la fosfatasa casena y lisozima (Kawase, 1982). Tambin se ha descrito que
ciertos componentes celulares de las bifidobacterias actan como inmunomoduladores,
destacando de entre ellos los que promueven el ataque inmunolgico contra clulas malignas
(Sekine y col., 1985). Las bifidobacterias igualmente han sido utilizadas como tratamiento para
restablecer la flora normal intestinal que se ve alterada durante la terapia antibitica
(Korshunov y col., 1985). Por ltimo aunque todava no est totalmente aceptado, las
bifidobacterias podran intervenir en la disminucin de los niveles sricos de COL (Tahri y col.,
1995, 1997).

4.3.4. Caractersticas de la fermentacin en el colon humano

La mucosa del colon es incapaz de alimentarse por s misma desde la sangre, por lo
tanto su nutricin debe ser recibida desde el lumen, donde diferentes nutrientes, AGCC, aa,
poliaminas, factores de crecimiento, vitaminas y antioxidantes son producidos por una flora no
patgena. Los substratos para la produccin de estos nutrientes consisten principalmente en
fibra, almidn resistente y protenas complejas, pero tambin se pueden incluir sustancias
producidas por el propio hospedador como glucoprotenas (Macfarlane y col., 1989a), clulas
epiteliales exfoliadas, mucus endgeno, bacterias (Wolin y Miller, 1983) y secreciones
pancreticas (Macfarlane y col., 1989a), que son tambin importantes substratos para la
poblacin bacteriana anaerobia del colon humano. Una caracterstica comn de esta comida
para el colon debe ser el que ningn enzima del ID sea capaz de metabolizarla. Se recomienda
que un mnimo del 10% de las caloras ingeridas y alrededor de un 20% del volumen de
alimento sea considerado como comida para el colon (Bengmark, 2000).
Los principales substratos para el crecimiento bacteriano son los hidratos de carbono
dietticos o endgenos que escapan de la digestin del tracto GI superior (Cummings y col.,
1989; Macfarlane y Cummings, 1991). Entre 10-60 g/da de los hidratos de carbono de la dieta
alcanzan el colon (Cummings y Macfarlane, 1991). De ellos se estima que de 8 a 40 g/da lo
constituye el almidn resistente que contribuye a una parte importante del substrato
fermentable disponible, seguido de 8-18 g/da de PS no almidn (nomenclatura aceptada para
referirse a los polisacridos diferentes del amidn), 2-10 g/da de azcares no absorbibles y 2-8

50
g/da de OS (Van Loo y col., 1995). Tambin hay una contribucin de 2-3 g/da de hidratos de
carbono endgenos constituidos fundamentalmente por residuos N-acetil-D-galactosamina
procedentes de los factores sanguneos. Los gneros bacterianos ms conocidos utilizadores de
PS en el colon pertenecen al gnero Bacteroides (Macy y Probst, 1979). Otras bacterias capaces
de utilizar los hidratos de carbono son especies sacarolticas pertenecientes a los gneros
Bifidobacterium, Ruminococcus, Eubacterium, Lactobacillus y Clostridium (Gibson y Roberfroid,
1995). Adems de los hidratos de carbono, las protenas que escapan a la digestin pueden ser
utilizadas para el crecimiento bacteriano (Macfarlane y Cummings, 1991). El gnero
Bacteroides, uno de los grupos ms numerosos de microorganismos intestinales, puede
metabolizar las peptonas, y se cree que algunas cepas utilizan el N elemental para la sntesis de
protenas microbianas (Grtte y col., 1965). Generalmente las bifidobacterias muestran una
dbil actividad proteoltica (Rasic y Kurmann, 1983), sin embargo se ha comprobado que B.
bifidum puede dividir las protenas de la leche en aa.
Los principales productos finales de la fermentacin por la microbiota del colon humano
son unos pequeos cidos orgnicos denominados AGCC como el acetato, butirato y propionato
(Cummings, 1985; Rechkemmer y col., 1988), producidos por la mayora de las bacterias
sacarolticas del colon, que metabolizan los hidratos de carbono por la ruta de Embden-
Meyerhoff (Wolin y Miller, 1983). En la fermentacin tambin se produce un cierto nmero de
gases incluyendo hidrgeno (H2), CO2, H2S y metano (CH4) (Gibson y col., 1988). Algunos
intermediarios de estas oxidaciones anaerobias incluyen etanol y cidos orgnicos (lactato,
succinato y piruvato), que adems podran seguir fermentndose hasta AGCC (Turton y col.,
1983). La ruptura oxidativa de los aa por especies proteolticas da lugar a cidos grasos de
cadena ramificada (AGCR) iso-AGCC, tales como isobutirato y isovalerato (Macfarlane y col.,
1992). Si los ingredientes no digeribles de la dieta que llegan al colon son principalmente
pptidos y protenas, la fermentacin bacteriana, adems de producir AGCC y AGCR
(Macfarlane y col., 1986), puede dar inicio a actividades menos beneficiosas, como la
produccin de sustancias potencialmente txicas como NH3, aminas, fenoles, tioles e indoles
(Cummings y Macfarlane, 1991; Macfarlane y Cummings, 1991; Roberfroid y col., 1994). En la
Figura 4 se ilustran todos los productos generados por la flora bacteriana del colon humano.

Figura 4. Esquema general de la fermentacin por la flora bacteriana del colon

51
 Debido a las fermentaciones de los hidratos de carbono por las bifidobacterias y otras
bacterias del colon, los contenidos en esta parte del intestino se vuelven cidos, convirtiendo el
NH3 en NH4+ . Este paso sirve para extraer el NH3 desde la sangre al colon, y as el NH4+ es
excretado por las heces (Bezkorovainy, 2001). Los gases producidos pueden ser expulsados
mediante la respiracin o flatulencia (Levitt y Ingelfinger, 1968) o, en el caso del H2, adems
ser utilizado por oxidadores finales tales como las bacterias sulfato-reductoras (Gibson y col.,
1988) y metanognicas (Miller y col., 1982). Los AGCC son los principales productos de la
fermentacin microbiana de los PS que forman parte de la FD en el colon humano (Wolin y
Miller, 1983; Cummings, 1985). En la Figura 5 se representa de forma esquemtica la ruta
metablica que sufren los AGCC producidos en la luz intestinal. stos son absorbidos en gran
cantidad (90-95%) en el ciego y colon ascendente (Ruppin y col., 1980) y metabolizados por las
clulas epiteliales, dando lugar a cuerpos cetnicos (acetoacetato, hidroxibutirato), CO2 y agua.
Adems, el butirato es la principal fuente de energa de las clulas epiteliales del colon, y a
bajas concentraciones puede actuar como regulador de las expresin de genes involucrados en
la proliferacin y diferenciacin de los colonocitos de los mamferos, as como de las clulas del
carcinoma de colon (Tanaka y col., 1990). En cualquier caso, junto a otros AGCC, una pequea
cantidad del butirato alcanza la circulacin portal, y entra en el hgado donde es un precursor
de la lipognesis, y junto al acetato son metabolizados en el hgado dando lugar a los aa
glutamato y glutamina, as como a cuerpos cetnicos (Rombeau y Kripke, 1990). El propionato
y L-lactato son metabolizados completamente en el hgado, donde el primero es transformado
en metilmalonilSCoA y luego en succinilSCoA, y el lactato ejerce de precursor en la
gluconeognesis. Sin embargo, parte del acetato (25-50%) escapa del metabolismo y va
circulacin sistmica, alcanza los tejidos perifricos, principalmente el msculo (Schumann y
col., 1991; Rmsy y col., 1993). El acetato y propionato posiblemente en combinacin con L-
lactato, tambin pueden jugar un papel en la regulacin del metabolismo lipdico y del COL
(Wolever y col., 1991). As mismo, es de gran importancia la capacidad de los AGCC para
estimular la proliferacin de la mucosa intestinal, concretamente la del colon (Sakata, 1987).
Finalmente, tambin se ha descrito la capacidad de los AGCC de estimular la absorcin de Ca,
Mg y Fe en el colon (Delzenne y Roberfroid, 1994). Este ltimo efecto se describe con mayor
detalle en el apartado 7.5. de esta seccin.

Luz intestinal Circulacin portal

AGCC COLONOCITO HGADO

Acetato
Acetato Butirato y Acetato Propionato Msculo
Butirato
Propionato Energa Glutamato Gluconeognesis
Cuerpos cetnicos Glutamina
CO2 Cuerpos cetnicos
H2O

Figura 5. Representacin esquemtica de la formacin de AGCC en la fermentacin de las bacterias del colon

52
4.3.5. El colon y la accin de su microbiota en la infancia

Las diferencias fermentativas en los nios se deben principalmente al tipo de

alimentacin (lactancia materna o artificial) durante los primeros meses de vida. En diferentes
estudios (Siigur y col., 1993; Gibson y col., 1995) se ha observado que en los nios alimentados
a pecho el c. actico forma la mayor parte de los AGCC totales en las heces, mientras que en
los alimentados a frmula el propionato y en menor proporcin el butirato, presentan mayores
ratios molares. Se cree que estas diferencias se deben al hecho de que la leche materna es
utilizada mejor por el sistema digestivo del nio, llegando menos compuestos sin absorber al
colon y consecuentemente se producen menos AGCC. Sin embargo, los nios alimentados a
pecho suelen tener un pH en las heces ms cido, entre 5-6, comparado con el pH ms neutro
de las heces de los nios alimentados con frmula, a pesar de que los primeros tengan menor
cantidad de AGCC fecales. Una posible explicacin es la menor capacidad tamponadora de la
leche materna comparada con la frmula infantil que permite que el contenido intestinal de los
nios alimentados con leche se acidifique ms fcilmente (Bullen y col., 1977; Rose, 1984).
Otro aspecto importante a tener en cuenta como consecuencia de la accin fermentativa de las
bacterias del colon es la actividad enzimtica que da lugar a componentes con efectos
potencialmente txicos (Salminen y col., 1998). Grounlund y col. (1999) estudiando en
lactantes la actividad de varias enzimas bacterianas durante los 6 primeros meses de vida,
encontraron que los nios alimentados con frmula tenan una actividad ureasa
significativamente mayor en los dos primeros meses y -glucuronidasa a los seis meses de
edad.
A pesar de que los neonatos y los nios menores de 3 meses presentan una deficiencia
de la actividad -amilasa pancretica en el duodeno, se ha observado que lactantes de menos
de 6 meses parecen ser capaces de tolerar cantidades moderadas de almidn. Esto se debe a
dos enzimas presentes en el borde en cepillo del epitelio duodenal como son la maltasa-
glucoamilasa y la amilasa mamaria, involucradas tambin en la hidrlisis del almidn (Lee,
1983). Adems, Lifschitz y col. (1983) mostraron que en los nios alimentados a pecho, la
lactosa que escapa a la absorcin en el ID fue utilizada completamente en el colon. En un
estudio de fermentacin in vitro de glucosa, lactosa, FOS y SOS por la flora intestinal de
lactantes alimentados a pecho o con frmula, se observ que ambos grupos tenan la misma
capacidad de fermentar los azcares simples y los FOS, pero fueron igualmente pobres en la
fermentacin de los SOS (Parrett y Edwards, 1997). La capacidad de fermentar in vitro los
hidratos de carbono complejos por lactantes alimentados a pecho se ha visto que no se
desarrolla significativamente hasta el final del destete, tal y como evidenciaron Parrett y col.
(1997) mediante un incremento en los niveles de propionato y butirato. La presencia de estos
c. orgnicos indica el desarrollo de una flora ms compleja ya que son producidos
principalmente por bacteroides y clostridios (Cummings y Macfarlane, 1991). Posiblemente

53
antes del destete la microflora intestinal del nio est adaptada a la lactosa y a los OS de la
leche materna, y por tanto las enzimas para fermentar los hidratos de carbono complejos no
estn lo suficientemente activas (Parrett y Edwards, 1997). La ingestin continuada de stos
podra ejercer un cambio en la microflora del colon de los nios, incrementndose la habilidad
para fermentar estos substratos (Parrett y col., 1997).

5. BENEFICIOS DE LA LECHE MATERNA

La industria lctea ha realizado innumerables esfuerzos por alcanzar una adaptacin de

la composicin de las frmulas infantiles a la de la leche humana, debido a que los nios
alimentados con lactancia materna durante el primer ao de vida parecen tener una menor
incidencia de infecciones gastrointestinales y respiratorias, o stas son menos severas que las
padecidas por los nios alimentados con lactancia artificial, independientemente del grado de
desarrollo del pas (Cunningham, 1979; Janson y col., 1984). Ms recientemente, este efecto
protector de la lactancia materna ha sido sugerido tambin frente a las infecciones del aparato
urinario (Pisacane y col., 1992). Adems de los componentes inmunolgicos, principales
responsables de este efecto, hay muchos factores no inmunolgicos en la leche humana que se
consideran agentes antiinfecciosos para el recin nacido (Goldman y col., 1986). Entre estos
hay que destacar una serie de sustancias que por su estructura qumica actan como
homlogos de los compuestos presentes en la pared celular de los microorganismos patgenos,
y que interaccionan con los receptores de las superficies celulares, de esta manera pueden
inhibir la unin del patgeno a sus receptores celulares. Entre estas sustancias homlogas se
encuentran los glicolpidos, glicoproteinas, mucinas, glicosaminoglicanos y los OS (Newburg,
1997).
Moro en 1900 observ que la leche materna deba de contener un factor de crecimiento
para B. bifidus. En 1926 se describi que este factor deba de ser una fraccin no proteica de la
leche humana (Schnfeld, 1926). Posteriormente Gyrgy y col. (1954) usando un
microorganismo mutante llamado B. bifidum subspecie Pennylvanicum, encontraron que
gynolactose, una mezcla de alrededor de 10 OS, era el factor de promocin del crecimiento
de las bifidobacterias. A estos hallazgos hay que sumar los descritos por Kuhn (1958) que
demostr que la incorporacin de OS de leche humana con N a la leche bovina mejoraron el
crecimiento de B. bifidum subsp. Penn., efecto debido a la presencia de N-acetilglucosamina.
Probablemente esto no se deba exclusivamente a la accin de un nico factor de la leche
humana, sino ms bien una compleja interaccin de factores (Heine y col., 1992) entre los que
cabe destacar:

1. Los oligosacridos, incluyendo a N-acetilglucosamina, el elevado contenido en lactosa,

as como la presencia de otros azcares tales como glucosa, galactosa y fucosa (Gyorgy,
1953; Gauhe y col., 1954).

54
2. El bajo contenido en protenas y minerales, y la reducida capacidad tamponadora de la
leche humana pueden permitir elevar el crecimiento de bifidobacterias (Willis y col., 1973;
Bullen y col., 1977).
3. Ciertos compuestos, incluyendo la lactoferrina (Law y Reiter, 1977) y ciertos lpidos
inhiben el crecimiento de algunos microorganismos (Raibaud, 1988). La concentracin de
lactoferrina en la leche materna es diez veces mayor que en la leche de vaca y sobrevive al
paso por el tracto GI de los nios (Spik y col., 1982), pudiendo ejercer su actividad
antimicrobiana al restringir el Fe a las bacterias (Griffiths, 1987). Pero podra tener algn
papel como donador de Fe a las bifidobacterias ya que stas lo necesitan para su
crecimiento (Miller-Catchpole y col., 1997).
4. Ciertas bacterias pueden estimular la produccin de inmunoglobulinas tales como la Ig
A secretoria.
5. Los nucletidos tambin pueden ser factores de crecimiento especficos para las
bifidobacterias (Gil y col., 1986; Balmer y col., 1994).

Todos estos hallazgos han motivado que se lleven a cabo muchos intentos por mejorar
las frmulas infantiles con el fin de inducir una colonizacin lo ms parecida a la encontrada en
los nios alimentados con lactancia materna. Estos intentos han incluido el enriquecimiento con
lactosa para alcanzar los niveles de la leche humana, la adicin de almidn, lactoferrina o
nuceltidos, la reduccin del contenido graso y la bsqueda de un ratio proteico ptimo
caseina:suero (Stark y Lee, 1982; Simhon y col., 1982; Yoshioka y col., 1983; Lundequist y col.,
1985; Balmer y col., 1994; Kleessen y col., 1995). Adems, la influencia del calentamiento
durante el procesado de la leche de vaca se sabe que convierte parcialmente la lactosa en
lactulosa, un ismero del anterior que tras atravesar el ID sin ser degradado podra promover el
crecimiento bacteriano (Heine y col., 1992; Brommage y col., 1993).

5.1. Oligosacridos no digeribles (OND) de la leche humana

Entre los mamferos, la leche humana es la que posee la mayor cantidad de OS

complejos (5-8 g/L), y aparte de la leche de elefanta, ninguna otra leche de mamfero analizada
hasta la fecha tiene cantidades comparables de OS fucosilados complejos (Kunz y col., 1999).
Diversos estudios han cuantificado la concentracin de OS en 20-23 g/L en el calostro y 12-14
g/L en la leche madura (Viverge y col., 1985; Coppa y col., 1993). Desde un punto de vista
cuantitativo representan el tercer componente en la leche humana despus de la lactosa (60
g/L) y los lpidos (39 g/L) (Newburg y Neubauer, 1995). Este dato es importante si se tiene en
cuenta que los monosacridos constituyen slo el 1% (0,5-1,0 g/L) del total de hidratos de
carbono (Coppa y col., 1993), y el contenido en protena es de 10-12 g/L (Egge y col., 1983).
Desde un punto de vista bioqumico, los OND son el resultado de la adicin secuencial
de monosacridos a la molcula de lactosa por glicosiltransferasas especficas de la glndula

55
mamaria (Egge, 1993). En particular, las unidades de monosacrido estn representadas por
fucosa, galactosa, N-acetilglucosamina y cido silico (c. silico) que se unen formando
estructuras lineales o ramificadas. Todos los OS suelen tener un resto de lactosa en el extremo
reducido y con frecuencia contienen una molcula de fucosa y/o c. silico en el extremo no
reducido. La mayora de los OS de la leche estn compuestos por molculas con 3-9 unidades
de monosacrido (Coppa y col., 1991). Estos componentes se combinan de diferente forma
(Tabla 7) para dar lugar a los 130 OS que se han identificado (Sabharwal y col., 1991), que en
base a su composicin qumica se clasifican en:

1- Oligosacridos ncleo (OS-nucleo), formados por glucosamina, galactosa y N-

acetilglucosamina, representando las estructuras originarias para la sntesis de OS ms
complejos.
2- Fucosil-Oligosacridos (Fucosil-OS), derivados de la adicin a los anteriores de una o ms
molculas de fucosa.
3- Sialil-Oligosacridos (Sialil-OS), resultantes de la adicin a los primeros de una o ms
molculas de c. silico.
4- Sialil-fucosil-Oligosacridos (Sialil-fucosil-OS), que contienen tanto fucosa como c. silico.

Tabla 7. Oligosacridos de la leche humana

Oligosacridos ncleo
Lacto-N-hexaosa Lacto-N-neo-tetraosa
Lacto-N-neo-hexaosa Lacto-N-octaosa
Lacto-N-neo-hexaosa Lacto-N-tetraosa
Lacto-N-neo-octaosa
Fucosil-Oligosacridos
2-fucosil-lactosa Lacto-N-difuco-hexaosa II
3-fucosil-lactosa Lacto-N-fuco-pentaosa I
Difucosil-lacto-N-hexaosa Lacto-N-fuco-pentaosa II
Difucosil-lacto-N-hexaosa b Lacto-N-fuco-pentaosa III
Difucosil-lacto-N-hexaosa I Lacto-N-fuco-pentaosa V
Difucosil-lactosa Monofucosil-lacto-N-hexaosa
Lacto-N-difuco-hexaosa I Trifucosil-lacto-N-hexaosa

Sialil-Oligosacridos
3-sialil-lactosa Sialil-lacto-N-tetraosa a
6-sialil-lactosa Sialil-lacto-N-tetraosa b
Disialil-lacto-N-tetraosa Sialil-lacto-N-tetraosa c
Monofucosil-monosialil-lacto-N-neo-hexaosa
Sialil-fucosil-Oligosacridos
3-sialil-3-fucosil-lactosa
Sialil-fucosil-lacto-N-tetraosa I
Sialil-fucosil-lacto-N-tetraosa II
Adaptado de Kunz y Rudloff (1993) y Coppa y col. (1999)

La composicin de OS de la leche materna presenta variaciones durante la lactacin.

Los fucosil-OS, la 2-fucosil-lactosa, difucosil-lacto-N-hexaosa y trifucosil-lacto-N-hexaosa
representan entre el 60-70% de este grupo, presentando un progresivo descenso del 20%

56
durante el primer mes de lactacin, sin variaciones significativas hasta el tercer mes. Entre los
OS-ncleo, la lacto-N-tetraosa y lacto-N-neotetraosa representan el 90%, con una reduccin
gradual durante los 30 primeros das, para luego incrementarse hasta el da 60 y 90
respectivamente, y ser similares al calostro. En los sialil-OS, la sialil-lacto-N-tetraosa c, 6-sialil-
lactosa y disialil-lacto-N-tetraosa, se reducen con el tiempo de forma que al da 90 representan
el 50% del calostro (Coppa y col., 1999). De forma general, la mayor concentracin se produce
en el da 4 (20 g/L), descienden un 10% en el da 10 y otro 10% al da 30, luego permanecen
constantes hasta el final del tercer mes. Esta concentracin decreciente de los OS durante las
primeras semanas de lactancia est asociada con un incremento en la maduracin del sistema
inmunolgico del nio (Miller y col., 1994).
Hay estudios que han probado que las heces de los nios alimentados a pecho tienen
un patrn de OS con un mnimo de similitud del 40% al presente en la leche humana (Coppa y
col., 2001). Estos datos han llevado a sugerir que probablemente un 60% de los OS ingeridos
por el nio sean parcialmente metabolizados por la flora intestinal, y posteriormente son
parcialmente absorbidos tal y como se encuentran, o tras su degradacin a unidades de
monosacridos por las glicohidrolasas especficas de la leche (Coppa y col., 1987).
Los OS de la leche no slo mejoran el crecimiento de la flora bifidognica (Gyorgy y
col., 1954), sino tambin juegan un papel importante en la defensa frente a varios patgenos
como anteriormente se ha comentado. Las superficies celulares contienen un gran nmero de
glucolpidos y glucoprotenas que funcionan en la comunicacin intracelular y como receptores
especficos extracelulares para muchos patgenos en el duodeno (E. coli, C. jejuni, Shigella
spp., Vibrio cholerae y Salmonella spp.) (Beachey, 1981). Debido a que los OS de la leche
parecen ser sintetizados por glucotransferasas similares a aquellas que sintetizan las
glucoprotenas y glucolpidos de los componentes de las superficies celulares (Kobata 1978), es
razonable asumir que algunos de estos OS podran tener estructura homloga a los hidratos de
carbono superficiales. Estos podran actuar como anlogos u homlogos de los receptores
celulares superficiales de los patgenos, y por lo tanto inhibiendo la habilidad del patgeno para
unirse al glucoconjugado homlogo de la superficie celular. Como el estmago de los nios no
es tan cido como el de los adultos y su sistema inmune no est del todo desarrollado, este
mecanismo acta como una proteccin adicional frente a los patgenos entricos.
Se ha observado que los fucosil-OS previenen la adhesin de E. coli enteropatgena y
uropatgena (Cravioto y col., 1991) y de Candida albicans a la superficie de la mucosa intestinal
(Brassart y col., 1991), los nucleo-OS inhibe la unin de S. pneumoniae (Andersson y col.,
1986), y los sialil-OS frente a H. pylori (Evans y col., 1988), E. coli S-fimbriado y virus de la
influenza (Zopf y Roth, 1996).
La funcin protectora de la leche humana tambin se ha descrito sobre las vas
respiratorias altas, frente a las otitis medias en recin nacidos, causadas en el 70% de los casos
por pneumococos o Haemophilus influenzae sp. (Anderson y col., 1986), y en el aparato
urinario (Coppa y col., 1990). Chester y col. (1981) mediante un anlisis de la orina de nios

57
alimentados a pecho y con frmula detectaron la presencia de 2- y 3-fucosil-lactosa y difucosil-
lactosa nicamente en los nios alimentados a pecho. Los fucosil-OS estaban prcticamente
ausentes en la orina de nios alimentados con frmula, mientras que los componentes sialilados
estaban en ambos grupos. Rudloff y col. (1996) tambin encontraron mayores cantidades de
OS de la leche materna (lacto-N-tetraosa, lacto-N-fuco-pentaosa I y II, y difucosil-lacto-N-
hexaosa) en la orina de nios alimentados con lactancia materna que en los alimentados con
frmula. Otros factores como un incremento local de la produccin de Ig A en el tracto urinario
de los nios alimentados a pecho (Goldblum y col., 1989) o la excrecin de lactoferrina materna
(Goldman y col., 1990) pueden tambin inhibir la adhesin bacteriana a las clulas epiteliales a
este nivel.
Los OS de la dieta podran tambin jugar un papel destacable en el desarrollo del
cerebro, concretamente en la sntesis de glucoprotenas cerebrales y glucolpidos (Carlson,
1985). Aproximadamente la mitad de los OS presentes en la leche humana son sialil-OS
(Sabharwal y col., 1991). En ratas el descenso de las concentraciones de c. silico, de
ganglisidos y glicoprotenas del cerebro y cerebelo estuvo asociado con un empeoramiento
irreversible en el comportamiento de aprendizaje en la rata (Morgan y Winick, 1980). Aunque el
hgado infantil puede sintetizar c. silico, no tiene la capacidad para cubrir completamente los
requerimientos durante el periodo postnatal ms temprano (Morgan y Winick, 1980). La
elevada concentracin de c. silico asociado en la leche humana durante la primera semana de
lactacin (1.200 mg/L), coincide con una etapa de rpida sntesis de sialoglicoprotenas y
gangliosidos del cerebro (Morgan y Winick, 1980). Sin embargo, al final del tercer mes de
lactacin, el c. silico ha descendido 3 veces. Algunos trabajos han sugerido que los recin
nacidos poseen una enzima intestinal sialidasa que incrementa su actividad durante la
maduracin del intestino (Sabharwal y col., 1991). Estas investigaciones podran explicar el
hecho de que los nios alimentados con lactancia materna poseen mayor puntuacin en test de
inteligencia que los alimentados con lactancia artificial (Lucas y col., 1992).

58
6. PROBITICOS

6.1. Definicin y evolucin del trmino probitico

El trmino probitico proviene del griego (pro, para, y bios, vida). Su significado ha
ido cambiando con el paso del tiempo. Metchnikoff en 1907 fue el primero en sugerir que las
bacterias ingeridas, en forma de yoghurt y otros alimentos fermentados, podran afectar
beneficiosamente a la flora normal intestinal (Metchnikoff, 1907). Pero no fue hasta 1965
cuando Lilly y Stillwell emplearon el trmino probitico por primera vez para describir
sustancias secretadas por un microorganismo que estimula el crecimiento de otro, y as fue
propuesto como antnimo al trmino antibitico. En 1971 Sperti aplic el trmino a extractos
de tejidos que estimulaban el crecimiento microbiano. Parker (1974) fue el primero en utilizar
el trmino probitico en el sentido que se hace actualmente. l defini los probiticos como
organismos y sustancias que contribuyen al equilibrio microbiano intestinal. Debido a que esta
definicin result ser muy amplia y poda abarcar desde preparaciones diseadas
especficamente para ejercer efectos beneficiosos sobre el crecimiento y salud animal hasta los
yogures y leches fermentadas, incluso pasando por los antibiticos, Fuller en 1989 intent
mejorar la definicin de probitico de Parker con la siguiente diferenciacin: Un suplemento o
alimento microbiano vivo que afecta beneficiosamente al animal hospedador mediante la
mejora de su equilibrio microbiano intestinal. Sin embargo, esta definicin est restringida al
consumo de suplementos alimenticios, a los animales como hospedador, y a la flora del tracto
intestinal como nico rgano diana. As, en 1992 Havenaar y Huis int Ved ampliaron la
definicin con respecto al hospedador y al hbitat de la microflora en los siguientes trminos:
Un cultivo nico o mixto de microorganismos viables, que aplicados a los animales o al hombre
afecta beneficiosamente al hospedador mediante la mejora de las propiedades de la microflora
autctona. Para Salminen (1996) y Schaafsma (1996) el probitico es un cultivo microbiano
vivo o producto lcte o cultivado, que influye beneficiosamente sobre la salud y nutricin del
hospedador. Sin embargo, Schrezenmeir y de Verse (2001) propusieron la siguiente definicin
como la ms cercana al trmino probitico dada por Havenaar y Huis int Ved (1992): Una
preparacin de un producto que contiene microorganismos viables y definidos en nmero
suficiente, que altera la microflora (mediante implantacin o colonizacin) en un
compartimiento del hospedador y ejerce efectos beneficiosos sobre la salud en el hospedador.

6.2. Criterios que deben cumplir los probiticos

Para que las bacterias seleccionadas como probiticos puedan proporcionar beneficios
saludables y clnicos deben de cumplir una serie de requisitos. Klaenhammer y Kullen (1999)
recopilaron y clasificaron los requisitos descritos en la bibliografa cientfica en cuatro grupos
como muestra la siguiente tabla.

59
Tabla 8. Seleccin de criterios para las cepas probiticas

Idoneidad
Identificacin taxonmica precisa
Habitantes normales de las especies objetivo: de origen humano para los probiticos humanos
No txicos, ni patgenos y con estatus GRAS (Generally Recognized As Safe, reconocidos
generalmente como seguros)

Aplicabilidad tecnolgica
Adecuado en la produccin en masa y almacenamiento: buen crecimiento, recuperacin,
concentracin, congelacin, deshidratacin y distribucin
Viabilidad en elevadas poblaciones (preferentemente 106-10 8)
Estabilidad de las caractersticas deseadas durante la preparacin, almacenamiento y entrega del
cultivo
Capacidad de proporcionar cualidades organolpticas deseables cuando se incluyan en los
alimentos o procesos de fermentacin
Genticamente estable
Genticamente adecuado
Competitividad
Capaz de sobrevivir, proliferar, y actividad metablica en el lugar diana in vivo
Resistente a la bilis
Resistente a los cidos
Capaz de competir con la microflora normal, incluyendo las mismas especies o las ms
cercanamente relacionadas, potencialmente resistente a las bacteriocinas, cidos y otros
antimicrobianos producidos por la microflora residente
Preferentemente con potencial de adherencia y colonizacin
Rendimiento y funcionabilidad
Capaz de ejercer uno o ms beneficios para la salud clnicamente documentados
Antagonistas hacia las bacterias patgenas/carcinognicas
Produccin de sustancias antimicrobianas (bacteriocinas, perxido de hidrgeno, cidos orgnicos
u otros componentes inhibitorios)
Inmunoestimulatorios
Antimutagnicos
Anticarcingenos
Produccin de compuestos bioactivos (enzimas, anticuerpos, pptidos)
Adaptado de Klaenhammer y Kullen (1999)

Sin embargo, los criterios situados en los apartados competitividad y rendimiento

permanecen bajo controversia, ya que los mecanismos subyacentes por los cuales los
probiticos ejercen su papel funcional in vivo no estn descritos totalmente. Tres excelentes
ejemplos son:

1- Tolerancia a la bilis y a la actividad hidrolasa de las sales biliares. Los probiticos varan
considerablemente sus niveles de tolerancia a la bilis, y el nivel mnimo aceptable para un
candidato permanece todava sin conocerse (Tannock, 1998).
2- Actividad adyuvante e inmunoestimulacin. Hay mucha informacin sobre el incremento de
los niveles de los anticuerpos IgA e IgM (Tannock, 1998). No obstante, estas propiedades
son muy variables entre las cepas y falta por determinar qu caractersticas de la clula o
de su superficie es la responsable de ejercer estos efectos.

60
3- Antimicrobianos. No se ha descrito ningn probitico de los que han sido propuestos con
efectos inhibitorios in vivo (Bernet-Camard y col., 1997; Hudault y col., 1997). As, queda
por investigar si estos compuestos son producidos en el intestino o tienen propiedad
funcional (Klaenhammer y Kullen, 1999).

6.3. Microorganismos utilizados comnmente como probiticos

A pesar de que no existan criterios ampliamente aceptados sobre determinadas

caractersticas que deben reunir un microorganismo para ser considerado como probitico,
algunos de los ms comnmente usados para promover la salud y la nutricin animal incluyen
cepas de los gneros Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Streptococcus, Pediococcus,
Enterococcus, y mohos de los gneros Saccharomyces, Aspergillus y Torulopsis (Tannock,
1997). En el desarrollo de los alimentos probiticos propuestos para el consumo humano, las
cepas de las BAL, tales como Lactobacillus, Bifidobacterium y Streptococcus, han sido las
usadas ms comnmente, debido al hecho de que son bacterias deseables de la microflora
intestinal (Berg, 1998). Las principales especies de BAL empleadas como probiticos humanos
(Collins y col., 1998; Kopp-Hoolihan, 2001; Holzapfel y col., 2001) se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9. Especies bacterianas empleadas como probiticos

Gnero Lactobacillus
L. acidophilus L. johnsonii
L. amylovorus L. lactis
L. casei L. paracasei
L. crispatus L. plantarum
L. fermentum L. reuteri
L. gallinarum L. rhamnosus
L. gasseri L. salivarius
Gnero Bifidobacterium
B. adolescentis B. infantis
B. animalis B. lactis
B. bifidum B. longum
B. breve
Gnero Streptococcus
S. lactis
S. salivaris
S. thermophilus
Otras BAL
Enterococcus faecium
Leuconostoc mesenteroides

Bacterias no cido-lcticas
Bacillus cereus var. toyoi
Propionibacterium fredenreichii
Saccharomyces boulardii

61
6.4. Valoracin in vitro de cepas bacterianas como potenciales probiticos

Varios grupos de investigacin han recomendado que la valoracin de microorganismos

como potenciales probiticos debe incluir principalmente la estimacin de la resistencia de la
acidez gstrica y toxicidad biliar, capacidad de adhesin al tejido epitelial del intestino, la
habilidad para colonizar el tracto GI, la produccin de sustancias antimicrobianas y su habilidad
para modular las respuestas inmunes (Marteau y Rambaud, 1993; Salminen y col., 1996;
Tannock, 1997; Guarner y Schaafsma, 1998; Brassart y col., 1998; Collins y col., 1998). Estas
caractersticas van a ser desarrolladas a continuacin con ms detalle.

6.4.1. Resistencia a la acidez gstrica

Antes de alcanzar el tracto GI, las bacterias probiticas deben sobrevivir al trnsito a
travs del estmago (Henriksson y col., 1999), donde la secrecin del c. gstrico constituye la
primera defensa contra la mayora de los microorganismos ingeridos. En un estudio in vitro
fueron usadas seis cepas de L. acidophilus y nueve cepas del gnero Bifidobacterium,
mantenindose a pH 1,5-3 durante menos de 3 h. Se pudo observar que la viabilidad dependi
del pH, el tiempo de exposicin al cido, y de las especies y cepas usadas. Los organismos ms
resistentes fueron L. acidophilus 2401, 2409 y 2415, B. longum 1941, y B. pseudolongum
20099, en el rango de pH citado a lo largo del tiempo de ensayo (Lankaputhra y Shah, 1995).

6.4.2. Resistencia a los cidos biliares

Los cidos biliares se sintetizan en el hgado a partir del COL y se secretan de la

vescula biliar al duodeno en forma conjugada pudiendo sufrir modificaciones qumicas en el
colon (deconjugacin) (Hoffman y col., 1983). Los cidos biliares, tanto conjugados como
deconjugados, exhiben actividad antibacteriana inhibiendo in vitro el crecimiento de E. coli,
Klebsiella spp. y Enterococcus spp. (Lewis y Gorbach, 1972), y se ha visto que las bacterias
gram-positivas son ms sensibles que las gram-negativas a este efecto (Floch y col., 1972). En
estudios in vitro para evaluar la supervivencia de las cepas de lactobacilos y bifidobacterias se
mantuvieron a concentraciones biliares de 0-1,5% durante menos de 3 h. La supervivencia
vari entre las diferentes cepas y dependi de la concentracin de bilis y los tiempos de
exposicin. Entre las bifidobacterias, B. longum 1941, B. infantis 1912 y B. pseudolongum
20099 fueron las ms resistentes, mientras que entre los lactobacilos las cepas 2402 y 2415 de
L. acidophilus fueron las ms resistentes (Lankaputhra y Shah, 1995). Tambin se puede
evaluar el crecimiento bacteriano en presencia de sales biliares mediante la aparicin de cidos
biliares deconjugados en el medio de cultivo. Las sales biliares deconjugadas, que son mejores
agentes lisantes que los cidos biliares conjugados, se obtienen por la accin de las hidrolasas
de sales biliares presentes tanto en lactobacilos como bifidobacterias. Gopal y col. (1996)

62
observaron que L. acidophilus 2405 y 2401 fueron los ms resistentes (sales biliares
conjugadas) con oxgall al 0,3% entre los lactobacilos, mientras que B. infantis 1912 y B.
adolescentis 1920 lo fueron entre las bifidobacterias.

6.4.3. Adherencia de los aislados bacterianos del leon a las lneas celulares
humanas

Est generalmente aceptado que para que una cepa bacteriana se establezca
permanentemente en el intestino del hospedador, el microorganismo debe ser capaz de
adherirse a las clulas de la mucosa intestinal (OSullivan y col., 1992).
Este efecto ha sido probado utilizando lneas celulares intestinales humanas que
expresan caractersticas fisiolgicas y morfolgicas de los enterocitos normales humanos
(clulas HT-29 y Caco-2) (Brassart y col., 1998), y que han servido para comprender los
mecanismos que median en la adhesin de enteropatgenos (Coconnier y col., 1993; Bernet y
col., 1994). Estas lneas celulares se han usado igualmente para seleccionar, y
consecuentemente evaluar las BAL en base a sus propiedades de adhesin (Crociani y col.,
1995; Tuomola y Salminen, 1998). Sin embargo, las evidencias disponibles actualmente
sugieren que esto no ocurre in vivo. Por ejemplo, Bouhnik y col. (1992) observaron que aunque
el porcentaje de recuperacin de la cepa de bifidobacterias administrada fue de 29,7 6% de
la dosis ingerida en heces de voluntarios alimentados con bifidobacterias, cuando se detuvo la
administracin de esta cepa, no se recuper ms en las heces. Estos autores concluyeron que
la administracin de bifidobacterias parece que no coloniza el colon humano. Kullen y col.
(1997) en otro estudio indicaron que aunque las bifidobacterias puede sobrevivir al paso a
travs del tracto GI, no lo colonizan en una proporcin significativa, y que la colonizacin podra
ser innecesaria para alcanzar resultados positivos en la terapia con probiticos.

6.5. Efectos de los probiticos

La OMS recomend una reduccin inmediata y drstica del uso de antibiticos en la

produccin animal (animales de renta y pescado) y vegetal, y en medicina humana (FAO,
1994). No obstante, la OMS ha recomendado una segunda tctica o terapia de interferencia
microbiana basada en el uso de microorganismos no patgenos para eliminar a los que s lo son
como un complemento al cese en el uso de los antibiticos. Es aqu donde entran en accin los
probiticos, aunque a stos se les han sugerido muchos ms efectos sobre la salud que los
meramente descritos anteriormente.
En la Tabla 10 se muestran los efectos de los probiticos sobre el sistema digestivo
recogidos en la bibliografa cientfica (Rolfe, 2000; Bezkorovainy, 2001; Dunne y col., 2001;
Floch y Hong-Curtiss, 2001).

63
Tabla 10. Efectos de probiticos descritos sobre el sistema digestivo

Cepa bacteriana Efectos descritos en estudios clnicos

Estimulacin del sistema inmune, adjuvante de vacunas, adherencia al
L. acidophilus LC1
intestino humano, equilibrio de la microflora intestinal
Descenso de las enzimas fecales, prevencin de la diarrea relacionada con
L. acidophilus NCFO 1748
radioterapia, tratamiento del estreimiento
Prevencin de la diarrea asociada a antibiticos, tratamiento y prevencin de
la diarrea por rotavirus, tratamiento de la recada en la diarrea de C. difficile,
L. rhamnosus GG y L. casei GG prevencin de la diarrea aguda causada por Salmonella spp. y Shigella spp.,
alivio de la enfermedad de Crohn, antagonista contra bacterias
carcinognicas, efectivo en el tratamiento de la pouchitis
Prevencin de alteraciones intestinales, equilibrio de bacterias intestinales,
L. casei Shirota
descenso de las enzimas fecales
L. gasseri Reduccin de las enzimas fecales, supervivencia en el tracto gastrointestinal
Tratamiento de la diarrea por rotavirus, equilibrio de la microflora intestinal,
B. bifidum
tratamiento de la diarrea por C. difficile
Prevencin de la diarrea del viajero, prevencin y tratamiento de la diarrea C.
S. boulardii difficile, y de la diarrea asociada a antibiticos, tratamiento de la diarrea
crnica por el virus HIV, descenso de la diarrea por alimentacin parenteral
B. longum + L. acidophilus Reduccin significativa de la disbiosis gastrointestinal
Tratamiento de la intolerancia a la lactosa, produccin de bacteriocinas,
L. acidophilus NFCM
descenso de la actividad enzimtica, elevada actividad lactasa
Colonizacin del tracto gastrointestinal, acortamiento de la diarrea asociada a
L. reuteri
antibiticos
Lactobacillus + Bifidobacterium Desciende la reincidencia de la pouchitis, tratamiento de la intolerancia a la
+ S. thermophilus lactosa
En ratones gnotobiticos y en estudios in vitro antagonista de la gastritis
Lactobacillus
crnica y lcera gstrica y duodenal por H. pylori
Tratamiento de la encefalopata heptica por descenso de la actividad ureasa
L. acidophilus + neomicina
fecal
Eliminacin de los sntomas por el sobrecrecimiento bacteriano en el intestino
L. plantarum + L. GG
delgado
Inmunomodulador contra clulas malignas, restauracin de la flora intestinal
B. infantis
tras una terapia antibitica

Los mecanismos de accin de los probiticos descritos en el tratamiento de los

desrdenes gastrointestinales son los siguientes:

1. Produccin de sustancias inhibitorias frente a gram-positivos y gram-negativos, e incluyen

cidos orgnicos, diacetilo, perxido de hidrgeno (H2 O2) y bacteriocinas. De todas ellas
destaca la nisina, producida por algunas subespecies de L. lactis (Jack y col., 1995), que
afecta al metabolismo o produccin de toxinas de las bacterias causantes de la afeccin GI
(Gibson y Wang, 1994c).
2. Bloqueo de los nichos de adhesin de los patgenos en la superficie de las clulas
epiteliales mediante un mecanismo de inhibicin competitiva de los mismos (Goldin y col.,
1992; Fujiwara y col., 1997).
3. Competicin por los nutrientes, ya que los probiticos pueden utilizar nutrientes que en
caso contrario seran consumidos por los microorganismos patgenos.

64
4. Degradacin del receptor del txico. Es el mecanismo utilizado por S. boulardii contra C.
difficile (Castagliuolo y col., 1999).
5. Estimulacin de la inmunidad especfica o inespecfica (Kaila y col., 1992; Fukushima y col.,
1998). La administracin oral de L. GG durante la diarrea aguda por rotavirus se asocia con
una mejora de la respuesta inmune (Kaila y col., 1992).

Ciertos probiticos como los pertenecientes a los gneros Lactobacillus y

Bifidobacterium han demostrado su efecto en aspectos selectivos de la funcin inmune, que
puede afectar a uno o varios componentes de la respuesta inmune (inmunidad humoral, celular
o no especfica). En la Tabla 11 se muestran los efectos de los probiticos descritos sobre el
sistema inmunitario (Erickson y Hubbard, 2000).

Tabla 11. Efectos de los probiticos sobre el sistema inmunitario en roedores y el hombre

Probitico/va
Especie Efecto
administracin
INMUNIDAD HUMORAL
L. casei Shirota, oral (muerta) Roedor Inhibicin esplnica de IgE in vitro y IgE srica
L. casei, oral (viva) Roedor Incremento de IgA y reduccin de infeccin entrica
L. acidophilus + Descenso de la translocacin e incremento de anti-E. coli IgM y
Roedor
Peptostreptococcus, oral (viva) IgE
B. bifidum, oral (viva) Humano Incremento de IgA y clulas B
PRODUCCIN DE CITOQUINAS
L. casei, oral (seco) Humano Incremento IFN srica
L. GG, oral (viva) Humano Descenso fecal de TNF en pacientes con alergia alimentaria
Lactobacillus,Bifidobacterium,
Roedor Mejora de IL-6 y IL-12 y de IFN y TNF
Streptococcus, oral (viva)
INMUNIDAD NO ESPECFICA
L. casei Shirota, intravenosa Roedor Incremento de fagocitosis
L. acidophilus o B. bifidum, oral
Roedor Mejora de fagocitosis
(viva)
L. acidophilus o casei, oral (viva) Roedor Mejora de fagocitosis
L. casei Shirota, oral (viva) Humano Sin efecto en citolisis in vitro de clulas killer

Otros efectos de los probiticos descritos en la bibliografa cientfica incluyen efectos

frente a las siguientes patologas: enfermedad alcohlica del hgado (Nanji y col., 1994), colitis
ulcerativa (Kruis y col., 1997), alergia a la protena lctea (Pelto y col., 1996), vaginitis
candiadial (Hilton y col., 1995), artritis crnica juvenil (Malin y col., 1996), efectos
antioxidativos (Ahotupa y col., 1996), inhibicin del carcinoma superficial de la vejiga (Aso y
Akazan, 1992) y reduccin de los niveles sricos de COL (Salminen y col., 1993; Sanders,
1993b).
A pesar de dcadas de trabajo y de los efectos demostrados, el apoyo de la comunidad
cientfica al concepto de probitico es escaso (Sanders, 1993a) debido principalmente a una
serie de motivos que pueden resumirse en los siguientes cinco puntos:

65
1- Se han propuesto numerosas cepas y especies bacterianas candidatas a ser
catalogadas como probiticos.
2- La confusin sobre los resultados obtenidos con cepas bacterianas que no estn
adecuadamente identificadas y descritas.
3- La calidad de almacenamiento de los cultivos probiticos es variable, dando lugar a
prdidas de la dosis ingerida y de su actividad en las pruebas clnicas.
4- Las cepas nicas de probiticos a menudo son propuestas por aportar una multitud de
beneficios a travs de muchos individuos en una poblacin en estudio.
5- Los elevados costes de las pruebas clnicas que utilizan de una forma drstica
experimentos de una cepa frente a un placebo, con la intencin de probar la eficacia del
probitico en poblaciones con un nmero limitado de individuos.

6.6. Eficacia y seguridad de los probiticos

Muchos estudios en los que se evala el efecto de los probiticos frente a la diarrea, la
intolerancia a la lactosa y al cncer de colon muestran que es necesaria una dosis efectiva de
109-1010 microorganismos al da (Sanders y col., 1996). Esta cifra corresponde a una ingestin
de un litro de leche acidfila al da formulada al nivel tpico de 2x106 ufc/ml (Sanders, 1998a).
Sin embargo, independientemente de la dosis administrada para que el probitico pueda ejercer
el efecto que se le presupone en el organismo, ste debe de sobrevivir en el alimento que lo
vehicula. La viabilidad de una cepa probitica en un alimento est ntimamente relacionada con
los tratamientos tecnolgicos. As, la supervivencia de la cepa depende del pH del alimento y de
su capacidad tamponadora, de la presencia de microorganismos competitivos, de la
temperatura y de la presencia de inhibidores microbianos en el alimento (cloruro sdico (NaCl)
y H2O2) (Kurmann y Rasic, 1991).
La vida comercial de un producto refrigerado que contenga probiticos es de tres a seis
semanas, siendo ms estable el contenido en productos no refrigerados. Para suplementos
desecados el tiempo de vida comercial es de doce meses, aunque los niveles descienden
significativamente durante este tiempo (Kopp-Hoolihan, 2001). Se han detectado casos de
marcada prdida de la viabilidad en productos lcteos tanto con bifidobacterias como con
lactobacilos, ms marcada durante su almacenamiento en refrigeracin a pH bajo (Klaver y col.,
1993; Lankaputhra y col., 1996). Por el contrario, las bifidobacterias sobreviven bien en
productos de baja acidez como el yogurt congelado (Laroia y Martin, 1991), los helados
(Hekmat y McMahon, 1992) o el queso (Dinakar y Mistry, 1994).
La seleccin de especies tolerantes al O2 podra ser una solucin para minimizar el
efecto adverso del O2 en productos fermentados que contengan Bifidobacterium spp. y
Lactobacillus spp. Los primeros estudios de sensibilidad al O2 permitieron establecer tres
categoras de doce cepas de bifidobacterias segn el alcance de la inhibicin del crecimiento en
presencia de O2, aunque no se pudo establecer una correlacin entre la sensibilidad al O2 y la

66
actividad enzimtica relacionada con el metabolismo del O2 (de Vries y Stouthamer, 1969). Por
el contrario, Shimamura y col. (1992) establecieron una fuerte correlacin inversa entre las
actividades enzimticas (NADH oxidasa y NADH peroxidasa) y el grado de sensibilidad al O2 en
cuatro especies de bifidobacterias. As, encontraron que B. infantis, B. breve y B. longum fueron
mucho ms tolerantes al O2 (mostraron una mayor actividad de las enzimas anteriormente
mencionadas) que B. adolescentis (con muy baja actividad enzimtica), por lo que las tres
primeras especies podran ser ms apropiadas para las aplicacin industrial de probiticos en
los alimentos. Estos resultados permiten adems apoyar la hiptesis enunciada por estos
mismos autores (Shimamura y col., 1990) en la que se establece que la ruta que implica a las
dos enzimas NADH oxidativas sirve como un mecanismo de defensa para reducir la toxicidad al
O2 en Bifidobacterium spp.
En cualquier caso, han sido establecidas una serie de cantidades mnimas en los
productos que contienen microorganismos probiticos para asegurar su efectividad en el
organismo que los ingiere, de tal forma que los productos fermentados deben contener al
menos 106 ufc/mL, ya que normalmente se considera que la dosis teraputica mnima diaria es
108-109 clulas viables, suponiendo una ingestin de 100 g de producto fermentado que
contenga 106-107 ufc/mL (Rasic y Kurmann, 1983).
El sello Live active culture (cultivo activo vivo) establecido por la National Yogurt
Association americana, requiere la presencia de al menos 108 BAL viables/g en el momento de
la elaboracin para yogures refrigerados, y 107/g para yogures congelados. Los fabricantes de
cultivos recomiendan incluir aproximadamente 106 bacterias probiticas/g para yogures y leche
acidfila al final de la vida til del producto (Kopp-Hoolihan, 2001).
En cuanto a la seguridad de las bacterias empleadas como probiticos, existe un
acuerdo general por el que las BAL se consideran microorganismos benignos, y existen registros
bien establecidos sobre su seguridad. A este hecho hay que aadir el que no se ha notificado
ningn brote de contaminacin alimentaria relacionado con estos microorganismos (Sgobarti y
col., 1995). La FDA debido a la larga historia de su empleo en alimentos fermentados ha
designado a muchos de estos probiticos como GRAS (Generally Recognized As Safe,
generalmente reconocido como seguro), e incluso para aquellos probiticos que no gozan del
estado GRAS, la industria los ha utilizado en alimentos fermentados asumiendo que la historia
de su uso en la alimentacin lleva implcito la seguridad de los mismos (Kopp-Hoolihan, 2001).
Dosis elevadas de probiticos del orden de 1012 ufc/g no han mostrado ninguna
toxicidad, slo B. dentium se considera actualmente como patgena para el hombre por su
papel en la caries dental (Sgobarti y col., 1995).

67
7. PREBITICOS

7.1. Definicin y criterios que debe cumplir un prebitico

Un prebitico es un ingrediente alimenticio no digerible que afecta beneficiosamente al

hospedador mediante la estimulacin selectiva del crecimiento y/o actividad de uno o un
nmero limitado de bacterias en el colon, mejorando as la salud del hospedador (Gibson y
Roberfroid, 1995). Para que un ingrediente alimenticio sea clasificado como prebitico debe
cumplir segn Gibson (1999) los siguientes requisitos:

1- No ser hidrolizado ni absorbido en la parte anterior del tracto GI.

2- Ser un substrato selectivo para una o un nmero limitado de bacterias comensales
beneficiosas del colon, estimulando su crecimiento y/o metabolismo.
3- Modificar la composicin de la flora del colon, facilitando el desarrollo de especies
beneficiosas.
4- Inducir efectos en lumen o sistmicos que son beneficiosos para la salud del hospedador.

Los hidratos de carbono no digeribles (OS y PS), algunos pptidos y protenas, y ciertos
lpidos (steres y teres) son considerados como prebiticos. Debido a su estructura qumica,
estos compuestos no son absorbidos en la parte anterior del tracto GI o no son hidrolizados por
enzimas digestivas humanas. Estos compuestos se podran llamar "alimentos del colon", puesto
que entran en el colon y sirven como substratos para las bacterias endgenas del mismo, as
indirectamente proporcionan al hospedador energa, substratos metablicos y micronutrientes
esenciales (Gibson y Roberfroid, 1995).
En trminos prcticos, los prebiticos tienen algunas ventajas sobre los probiticos.
Claramente, la supervivencia del producto no es algo cuestionable, ya que el alimento puede
ser expuesto al calor (esto no es posible con microorganismos vivos) y el tipo de vehculo de la
dieta es muy amplio. Adems, los problemas que se pueden experimentar tras la ingestin de
probiticos no deberan de aparecer con el empleo de prebiticos ya que el objetivo es el
fortalecimiento de la propia flora autctona (Gibson y McCartney, 1998).
A pesar de estas consideraciones, hay determinados casos en los que la ingestin de
probiticos es asequible y deseable. Por ejemplo, en poblaciones de riesgo como los nios y los
ancianos, dnde la flora intestinal puede estar comprometida, podra ser ms adecuado
potenciar la microflora mediante el uso de probiticos (Gibson y McCartney, 1998).

7.2. Oligosacridos (OS) y Oligosacridos no digeribles (OND)

Los hidratos de carbono no son simplemente fuente de energa, sino que debido a la
estructura fsica de la pared celular de la que forman parte tienen efecto sobre la saciedad

68
(Blundell y col., 1994) y la proporcin y extensin de la digestin del almidn, que es el
principal factor de control sanguneo de glucosa e insulina (Jenkins y col., 1981; Englyst y col.,
1996). Los hidratos de carbono se pueden clasificar en base al grado de polimerizacin (GP)
como OS (GP entre 2 y 10 unidades de monosacridos) y PS (GP ms de 10 monosacridos)
(Cummings y col., 1997). Al mismo tiempo, segn sus propiedades fisiolgicas se pueden
clasificar como digeribles o no digeribles (o no disponibles). Los no digeribles que estn
representados por el almidn resistente, PS no almidn (PS de las paredes celulares de las
plantas, hemicelulosa, pectinas, gomas), y OND (Delzenne y Roberfroid, 1994), muestran varios
efectos fisiolgicos y nutricionales. Sin embargo, no todos los compuestos que estn
clasificados como alimentos del colon son prebiticos. De hecho, para la mayora de estas
sustancias, el proceso de fermentacin en el colon no est bien especificado, y pueden adems
estimular en el colon el crecimiento y/o la actividad metablica de diferentes especies
bacterianas, incluyendo especies que son tanto perjudiciales como beneficiosas (Drasar y col.,
1976; Wang y Gibson, 1993).

7.2.1. Propiedades de los OS

Los OS son hidratos de carbono con un GP bajo y consecuentemente bajo peso

molecular (Yun, 1996). Segn la terminologa de la IUB-IUPAC (International Union of Pure and
Applied Chemistry) (1982), el punto de divisin entre OS y PS en base al GP es 10, aunque no
haya ninguna razn fisiolgica o qumica que justifique esta divisin (Cummings y col., 1997).
Recientemente Englyst y Hudson (1996) propusieron el nombre de hidratos de carbono de
cadena corta para un nuevo grupo de hidratos de carbono alimenticios que incluyan a los OS y
los PS ms pequeos. Para propsitos analticos, la solubilidad en etanol 80% (v/v) ha sido
validada como una forma prctica de aislar a este grupo de hidratos de carbono (Englyst y
Hudson, 1996; Cummings y col., 1997). Para una mejor compresin, en la Tabla 12 se muestra
la clasificacin de los principales hidratos de carbono de la dieta (Cummings y Englyst, 1995;
Englyst y Hudson, 1996).

Tabla 12. Clasificacin de los principales hidratos de carbono de la dieta

Clases (GP) Subgrupos (tipo de monosacrido y uniones )
Azcares Monosacridos: fructosa, galactosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa
(1-2) Disacridos: celobiosa, gentibiosa, lactosa, maltosa, melibiosa, sacarosa, trehalosa
Polialcoholes: sorbitol, maltitol, lactitol, xilitol
Oligosacridos Maltooligosacridos (-glucanos)
Otros oligosacridos (-OND): fructooligosacridos, galactooligosacridos, rafinosa,
(3-10)
estaquiosa
Polisacridos Almidn (-glucanos): amilopectina, amilosa
(>10) Polisacridos no almidn: celulosa, hemicelulosa, pectinas, gomas, muclagos, -glucanos

69
 El concepto de OND se debe a de que el tomo de C anomrico (C1 C2) de las
unidades de monosacridos de algunos OS dietticos (Figura 6), tiene una configuracin que
hace a sus enlaces osdicos no digeribles por la actividad hidroltica de las enzimas digestives
humanas. Esta resistencia a la digestin ha sido demostrada en varios ensayos, incluyendo
voluntarios humanos ileostomizados. Las principales categoras de OS actualmente disponibles o
en desarrollo como ingredientes alimenticios incluye a hidratos de carbono en los que la unidad
de monosacrido es fructosa, galactosa, glucosa, y/o xilosa (Delzenne y Roberfroid, 1994;
Cummings y col., 1996; Crittenden y Playne, 1996).

Figura 6. Estructura tpica de un oligosacrido

En general, los alimentos clasificados como OS no son productos puros, sino que son
mezclas de OS con diferentes grados de polimerizacin, el polisacrido o disacrido original y
los azcares monomricos. Aunque las propiedades fisicoqumicas y fisiolgicas de cada
oligosacrido varan dependiendo del tipo de mezcla adquirida, algunas propiedades son
comunes a casi todos los OS.
Junto a las propiedades de los OS enumeradas anteriormente hay que destacar que son
solubles en agua y medianamente dulces, normalmente 0,3-0,6 veces tan dulce como la
sacarosa, aunque esta propiedad decrece con la longitud de la cadena. Adems, debido a la
fermentacin del colon, dan una contribucin energtica al alimento de 1,5 kcal/g, similar al de
la FD soluble. Los OND proporcionan una elevada capacidad de retencin de humedad,
previniendo una excesiva desecacin, y una baja actividad agua, que es conveniente en el
control de la contaminacin microbiana (Nakakuki, 1993).

7.2.2. Tipos de OS

Como anteriormente se ha descrito, los OND se encuentran en diferentes alimentos de

forma natural, sin embargo tambin pueden ser producidos mediante diferentes reacciones
qumicas en el laboratorio. Principalmente existen 3 mtodos para elaborar los OND como a
continuacin se resume:
1. Mediante la extraccin directa en agua caliente de diferentes races, como la chicoria
o alcachofa de Jerusaln para extraer la inulina, o de semillas para la obtencin de los
SOS.

70
2. Hidrlisis enzimtica parcial de OND, como en la obtencin de oligofructosa a partir
del hidrolizado de la inulina (De Bruyn y col., 1992), o de PS para obtener los XOS por la
accin de xilanasa sobre los xilanopolisacridos (Yamaguchi y col., 1994).
3. Sntesis enzimtica de un disacrido o de una mezcla de disacridos usando
osiltransferasas, como la obtencin de FOS de cadena corta (FOS cc) a partir de la
sacarosa (Spiegel y col., 1994), los GOS a partir de la lactosa y la lactosucrosa a partir de
una mezcla de sacarosa y lactosa (Yamaguchi y col., 1994).

El organismo humano carece de los enzimas digestivos necesarios para poder hidrolizar
los OND, puesto que stas, -glucosidasa, maltasa-isomaltasa y sucrasa, son en su mayor parte
especficas de uniones -osdicas. Debido a que las enzimas no pueden romper el enlace
glucosdico , los OND a nivel nutritivo se comportan como fibras alimentarias solubles, ya que
llegan ntegros al intestino grueso donde son fermentados por la flora del colon (Tsuji y col.,
1986; Tokunaga y col., 1989; Molis y col., 1996). En la Figura 7 se representan
esquemticamente los diferentes procesos de produccin de los OS, y en la Tabla 13 se
muestran los OS encontrados en la bibliografa cientfica como candidatos a ejercer un efecto
prebitico.

Tabla 13. Nombre y estructura qumica de los oligosacridos (OS)

Nombre Nombre comercial Estructura qumica y tipo de enlace osdico

Inulina Raftiline -D-Glu (12)-[-D-Fru]n-(12) -D-Fru (n=1060)
Oligofructosa Raftilose -D-Fru (12)-[-D-Fru]n-(12) -D-Fru (n=210)
Fructooligosacridos de Actilight, -D-Glu (12)-[-D-Fru]n-(12) -D-Fru (n=13)
cadena corta Neosugar
Galactooligosacridos Oligomate -D-Gal (16)-[-D-Gal] n-(14) -D-Glu (n=15)
Galactotriosa/TOS Cup-Oligo -D-Gal (16)-[-D-Gal] n (n=2)
Isomaltooligosacridos Isomalto-900 [-D-Glu (16)]n (n=25)
Sojaoligosacridos Soya-Oligo [-D-Gal (16)] n--D-Glu-(12) -D-Fru (n=13)
Xilooligosacridos - [-D-Xyl-(14)] n (n=29)
Gentiooligosacridos Gentose [-D-Glu-(16)] n (n=25)
Lactulosa Duphalac -D-Gal-(14)--D-Fru
Lactosucrosa - -D-Gal-(14)--D-Glu (12)--D-Fru
Celobiosa - -D-Glu (14)-D-Glu
Celodextrinas - [-D-Glu (14)] n-D-Glu (n=3-6)
Ciclodextrinas Dexy Pearl [-D-Glu (14)]n cclico (n=6-12)
Glucanoligosacridos - -
Leucrosa - -D-Glu (15)-D-Fru
Maltitol - -D-Glu (16)-D-Sor
Palatinosaoligosacridos - [-D-Glu (16)-D-Fru]n (n=2-4)
Lactitol - -D-Gal (14)-D-Sor
Maltooligosacridos - [-D-Glu (14)]n (n=27)
Manooligosacridos Alltech [-D-Man (16)]n (n=28)
Glucosilsucrosa Coupling Sugar -D-Glu (14)--D-Glu (12)--D-Fru
Glucooligosacridos - [-D-Glu] n (n=2-6)
Fru=Fructosa, Gal=Galactosa, Glu=Glucosa, Man=Manosa, Sor=Sorbitol, Xyl=Xilosa
Adaptado de Delzenne y Roberfroid (1994) y Crittenden y Playne (1996)

71
 Sin embargo, no todos los compuestos listados en la Tabla 13 han demostrado
cientficamente su capacidad como prebitico, debido en parte a su digestin total o parcial por
las enzimas del ID humano, por la imposibilidad de promover una fermentacin selectiva en el
colon y por la falta de estudios concluyentes. Por tanto el nmero de OND reales se reduce a
los siguientes: FOS, GOS y SOS, que por otra parte han sido los ms extensamente estudiados
y pueden proporcionar la mejor evidencia de los efectos prebiticos en humanos (Critteden y
Playne, 1996), y son los que a continuacin se describen.

Alcachofa de Jerusaln extraccin hidrlisis

Chicoria Inulina (FOS) Oligofructosa (FOS)

extraccin
Remolacha Rafinosa (SOS)

transfructosilacin
Sucrosa FOS cadena corta
palatinosa sintetasa
Sacarosa Palatinosaoligosacridos (POS)

transfructosilacin
Lactosucrosa

isomerizacin alcalina
Lactulosa
Leche de vaca Lactosa
transgalactosilacin
(Trans)Galactooligosacridos(TOS/GOS)
transglucosilacin
Glucosilsucrosa

transglucosilacin
Ciclodextrinas
transglucosilacin
Almidn Almidn Maltooligosacridos (MOS)

soluble transglucosilacin
Isomaltooligosacridos (IOS)
transglucosilacin
Gentiooligosacridos (GES)

Glucosa Glucooligosacridos (GUS)

extraccin extraccin
Soja Suero de soja Sojaoligosacridos (SOS)

hidrlisis
Celulosa Celobiosa

extraccin hidrlisis
Mazorca Xiln Xilooligosacridos (XOS)

Figura 7. Esquema que representa los procesos de produccin de los oligosacridos (OS)

Galactooligosacridos (GOS). El establecimiento de una microflora de bifidobacterias en

el intestino de los nios alimentados a pecho se ha atribuido a la presencia de OND que
contienen galactosa en la leche humana (Smart, 1993). Por tanto, la inclusin de GOS como
ingredientes alimenticios prebiticos ha atrado un inters comercial considerable, y varias

72
empresas estn actualmente implicadas en su produccin. Son producidos comercialmente a
partir de la lactosa usando la actividad galactosiltransferasa de la -galactosidasa, que es la
principal enzima en la hidrlisis de lactosa en elevadas concentraciones de sta (Smart, 1993).
Fructooligosacridos (FOS). Es uno de los principales OND bifidognicos en cuanto a
volumen de produccin. Se elaboran mediante 2 procesos, que resultan en productos finales
ligeramente diferentes. En el primer mtodo, los FOS se producen a partir del disacrido
sacarosa usando la actividad transfructosilacin del enzima -fructofuranosidasa de Aspergillus
niger. Al igual que sucede en la produccin de GOS, se necesita una elevada concentracin de
material inicial para una eficaz transglucosilacin (Park y Almeida, 1991). Los FOS as formados
contienen entre 2 y 4 unidades de fructosa unidas con enlaces (21), con un residuo
terminal -D-glucosa, y entre ellos cabe destacar: 1-kestosa (Glu-Fru2), 1-nistosa (Glu-Fru3) y
1F -fructosilnistosa (Glu-Fru4). Dependiendo del productor a esta mezcla de FOS cc se les ha
denominado como Actilight, Nutraflora Meliogo. El segundo mtodo es la hidrlisis
enzimtica o qumica de la inulina. La mezcla de FOS formada por este proceso se parece a la
mezcla producida por el proceso de transfructosilacin. Sin embargo, no todas las cadenas
fructosa con uniones (21) acaban en una glucosa terminal (Frum , m=1-7). A este producto
se le conoce como oligofructosa.
Sojaoligosacridos (SOS). Son extrados directamente del alimento crudo y no requieren
procesos enzimticos de elaboracin. El suero de la soja, un producto de la produccin de
concentrados y aislados de protenas de soja, contiene OS rafinosa (formado por fructosa,
galactosa y glucosa) y estaquiosa, sta ltima tiene un residuo de galactosa ms. Ambos son
indigeribles y por tanto alcanzan el colon intactos, donde actan como prebiticos, estimulando
el crecimiento de las bifidobacterias en el hombre (Benno y col., 1987).

7.3. Efecto fisiolgico de los OND a nivel sistmico

Los OND ms ampliamente estudiados son los FOS y los GOS. En este apartado se van
a sealar los efectos a nivel GI que han sido descritos nicamente para los FOS, y debido a la
importancia que tienen los GOS en este trabajo, stos se van a tratar en el apartado 7.4 de
esta seccin. Estos efectos se pueden clasificar en los cinco que continuacin se describen:
Produccin de cidos grasos de cadena corta y efectos asociados. La fermentacin en el
colon de OND produce AGCC, lactato, y determinados gases. Todos los hidratos de carbono que
son fermentados en el colon humano deberan dar un valor calrico de 1,5 kcal/g (6,3 KJ/g)
(Cummings y Frohlich, 1993). Para la inulina y oligofructosa los valores publicados de
produccin de AGCC varan entre 1 y 2,1 kcal/g (4,2 a 8,8 KJ/g) (Livesey, 1992; Roberfroid y
col., 1993; Molis y col., 1996).
De estudios in vivo en animales se puede concluir que el enriquecimiento con OND
desciende el pH cecal e incrementa la produccin de AGCC cecales, siendo el acetato el

73
principal seguido por el butirato y propionato (Ito y col., 1993; Rowland y Tanaka, 1993;
Campbell y col., 1997). Este incremento en la produccin de AGCC est relacionado con una
hiperplasia de la mucosa intestinal e incremento del grosor de la pared tanto en el ID como en
el ciego (Hoshi y col., 1994; Campbell y col., 1997).
Efecto sobre el metabolismo de los lpidos. La mayora de los estudios que muestran
efectos de los OND sobre los lpidos sanguneos, tanto en animales como en humanos han sido
realizados con FOS. A continuacin se describen los efectos de los OND sobre el metabolismo
de los lpidos descritos en la bibliografa cientfica.
1. Estudios en animales. La administracin de inulina y oligofructosa en ratas han
demostrado descender los niveles de TG sricos, COL total y fosfolpidos, pero no los niveles de
AG libres (Bhattathiry, 1968; Hata y col. 1983; Tokunaga y col., 1986; Fiordaliso y col., 1995).
En un estudio ms reciente, Kok y col (1998b) demostraron que el incremento postpandrial de
TG inducido por una dieta rica en grasas fue disminuido en ratas (-50%) por la administracin
de oligofructosa. Estos autores explicaron que la hipotrigliceridemia observada se debi
principalmente al descenso en la concentracin en plasma de lipoprotenas de muy baja
densidad (VLDL). Sin embargo, Kok y col. (1996a) describieron que este efecto probablemente
era debido ms bien a un descenso de la sntesis heptica de TG que a un incremento en el
catabolismo de lipoprotenas ricas en TG. Estos datos apoyan la hiptesis de que un descenso
en la lipognesis de novo en el hgado, a travs de una reduccin coordinada de la actividad de
todas las enzimas lipolticas, es un acontecimiento clave en la reduccin de la secrecin de
VLDL-TG en ratas alimentadas con inulina. El hecho de que la lipognesis de novo sea la base
para desarrollar el efecto hipotrigliceridmico de los FOS en el hgado de la rata, podra explicar
el escaso efecto observado en humanos sanos, que consumen muchos menos hidratos de
carbono que los roedores (Roberfroid y Slavin, 2000).
2. Estudios en humanos. Ha sido descrito un descenso de los niveles de las
lipoprotenas de baja densidad (LDL) y COL total en individuos con diabetes no insulino-
dependiete mediante el empleo de oligofructosa (Yamashita y col., 1984; Luo y col., 1996), y
de TG y COL total con inulina (Canzi y col., 1995), mientras que el empleo de inulina en
voluntarios hiperlipidmicos ha mostrado un descenso de los TG (Williams, 1999) y del COL y
LDL (Davidson y col., 1998). Sin embargo, cuando los estudios se llevaron a cabo en individuos
sanos y normolipidmicos no se observ ningn efecto sobre los niveles lipdicos tras la
administracin de inulina, oligofructosa o transgalactooligosacridos (TOS) (Van Dokkum y col.,
1995; Pedersen y col., 1997; Ellegrd y col. 1997).
El papel de los AGCC en estos efectos es difcil de establecer, ya que ni aislados ni en
una mezcla estos cidos tienen efectos antagonistas sobre el metabolismo del COL. Se ha
confirmado que el acetato siendo un precursor metablico del COL, est presente al comienzo
de la hipercolesterolemia observada en pacientes sanos que recibieron lactulosa (Jenkins y col.,
1991), mientras que el propionato, que disminuye los niveles de COL srico cuando se

74
administra en la dieta de ratas, puede descender la sntesis de COL mediante la inhibicin de la
3-hidroxi-metil-glutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa (Rodwell y col., 1976).
Por tanto y aunque en los estudios con ratas si parece existir un claro efecto favorable
de los OND sobre el metabolismo lipdico, en los humanos los datos recogidos de la bibliografa
son todava inconsistentes para hablar de un efecto claro.
Efecto sobre la uremia y eliminacin de nitrgeno/urea. Los FOS cc incrementa n
eficazmente la excrecin fecal de N y reducen la excrecin renal de N en ratas (Younes y col.,
1996). Este efecto ocurre porque estos hidratos de carbono fermentables sirven como fuente
de energa para las bacterias intestinales, que durante el crecimiento tambin requieren de una
fuente de N para la sntesis proteica. Adems, su efecto osmtico en el ID acelera el trnsito de
urea al leon distal y al intestino grueso donde puede proliferar una amplia microflora ureoltica.
De hecho, la cantidad de NH3 requerido para sustentar el crecimiento del mximo de bacterias
podra llegar a ser insuficiente, y la urea en sangre sera entonces requerida como una fuente
fcil para la sntesis proteica bacteriana en el ciego (Younes y col., 1997).
Debido al efecto osmtico, que puede transferir agua al intestino grueso (un efecto que
est inversamente relacionado con la longitud de cadena), y por su elevada tasa de
fermentacin y produccin de gases, altas dosis de FOS podran causar malestar intestinal o
incluso diarrea. Este efecto no es especfico para los OND pero es comn a todas las sustancias
dietticas no digeribles y fermentables. La estimacin de una dosis aceptable es difcil porque
cada individuo tiene su propia sensibilidad sobre la molestia intestinal aceptable y no aceptable.
Las conclusiones que se pueden alcanzar con los datos disponibles en cuanto a la relacin entre
la ingesta de FOS y sntomas gastrointestinales (Stone-Dorshow y Levitt, 1986; Pellier y col.,
1995) son las siguientes:
En forma lquida, una dosis nica de 10 g no causa efecto, mientras que 20 g causan
sntomas transitorios medios. Excepto para determinados individuos, aquellos que estn
probablemente adaptados a una dieta alta en fruta-vegetales-cereales, la dosis nica que
probablemente cause una gran molestia o incluso diarrea en la mayora de las personas
es del orden de 30 g (Roberfroid y Slavin, 2000).
Si los FOS son tomados como una parte de un alimento slido, la dosis sensible es
relativamente superior a la forma lquida. Si la dosis se divide durante todo el da en
pequeos servicios individuales, los sntomas se reducen y, en la mayora de los casos
desaparecern incluso para dosis tan altas como 20-30 g (Roberfroid y Slavin, 2000).

75
7.4. Galactooligosacridos (GOS)

7.4.1. Produccin y propiedades de los GOS

Los GOS se producen por la accin de las -galactosidasas con actividad de

transgalactosilacin. Las uniones glicosdicas entre dos unidades de galactosa principalmente
son uniones del tipo (1-4) (como 4-galactosil-lactosa, 4-GOS) cuando se usan las -
galactosidasas derivadas de Bacillus circulans (Mozaffar y col., 1984) o de Cryptococcus
laurentii (Ozawa y col., 1989), y del tipo (1-6) (como 6-galactosil-lactosa, 6-GOS) cuando se
usan las enzimas derivadas de A. oryzae o Streptococcus thermophilus (Matsumoto, 1990).
Normalmente ms del 55% de la lactosa que se emplea como substrato se convierte en GOS
(Ishikawa y col., 1995). Aunque los principales productos de la reaccin son desde tri- hasta
hexasacridos con dos a cinco unidades de galactosa, tambin se producen en la reaccin
disacridos transgalactosilados (DT) formados por una molcula de galactosa y otra de glucosa
con un enlace -glicosdico diferente al de la lactosa. En cualquier caso y para resumir el
proceso, los principales productos son trisacridos, particularmente 4-GOS 6-GOS, y OS
mayores con cuatro o ms unidades de monosacrido.
Las propiedades fisicoqumicas que mejor se conocen son las de un producto del
mercado japons (Oligomate 55) que contiene al menos un 55% de 4-GOS incluyendo tambin
DT. El relativo dulzor de este producto es alrededor del 35% del de la sacarosa. Los GOS son
estables a altas temepraturas, ya que permanecen sin alteracin tras un tratamiento de 160 C
durante 10 min a pH neutro. Sin embargo, a 120 C durante 10 min a pH 3 100 C durante
10 min a pH 2 alrededor de la mitad o ms de la sacarosa es degradada. Tambin son bastante
estables durante un almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente incluso en
condiciones de acidez. La estabilidad por lo tanto de los GOS es mayor que la de los FOS
(Voragen, 1998).

7.4.2. Efectos de los GOS sobre la salud humana

Los GOS han sido estudiados ampliamente por su papel fisiolgico sobre la flora
intestinal, derivado principalmente de sus caractersticas fisicoqumicas. Los principales efectos
descritos por los GOS sobre la salud humana se detallan a continuacin.
Indigestibilidad en el tracto gastrointestinal superior y valor energtico. Ha sido
demostrado en varios experimentos in vitro la indigestabilidad y la estabilidad de los GOS a la
hidrlisis por la -amilasa de la saliva humana y pancreas de cerdo, el contenido del ID de rata
y el jugo gstrico humano artificial (Ohtsuka y col., 1990). Como otros OND, tienen
configuracin , mientras que las enzimas digestivas gastrointestinales humanas son
principalmente especficas para uniones -glicosdicas. Adems, la actividad lactasa (-

76
galactosidasa) localizada en el ribete en cepillo de la mucosa del ID, que tiene el potencial para
digerir GOS, es normalmente dbil o a menudo deficiente (Ito y Kimura, 1993).
La indigestibilidad in vivo de los GOS ha sido demostrada mediante el test de
respiracin de H2 en estudios humanos (Tanaka y col., 1983; Ishikawa y col., 1995). El tiempo
de trnsito buco-cecal de 4-GOS se ha estimado en 1,9 h (Ishikawa y col., 1995), indicando
que los GOS resisten la digestin y la absorcin del ID y alcanzan ntegros el ciego y el colon,
donde son fermentados por las bacterias del colon.
El valor calrico de los OND tales como GOS, FOS y lactulosa ha sido estimado en 1,0-2,0
kcal/g (Roberfroid y col., 1993; Cummings y col., 1997). Para los GOS el valor calrico est
calculado en 1,73 kcal/g de acuerdo con el mtodo estandarizado en Japn (Sako y col, 1999).
Utilizacin in vitro de los GOS por las bacterias intestinales. Este efecto ha sido
ampliamente estudiado (Tanaka y col., 1983; Ohtsuka y col., 1989; Ishikawa y col., 1995) ya
que el compuesto 4-GOS es selectivamente utilizado por todas las cepas de Bifidobacterium
evaluadas en comparacin con la lactulosa y rafinosa, cuya especificidad es menor. Otros
estudios demuestran que algunas cepas de Lactobacillus, Bacteroides y Clostridium fermentan
los GOS, y que los DT podran incluso ser mejores substratos para estas bacterias (Tanaka y
col., 1983; Ishikawa y col., 1995).
Muchas cepas de especies de Bifidobacterium producen enzimas glucolticas (-
galactosidasas) que hidrolizan una amplia variedad de unidades de monosacridos y diferentes
uniones de glucsidos, mientras que las actividades enzimticas de las otras bacterias son
menos variadas y ms dbiles (Tochikura y col., 1986). No se conoce por el momento si estas
mltiples enzimas glucolticas estn especficamente asociadas con Bifidobacterium o si otras
bacterias del colon tambin las poseen. Sin embargo, es posible que aquellas bacterias que
habitan el intestino grueso hayan adquirido diferentes actividades glucolticas para utilizar
eficientemente hidratos de carbono no digeribles que son abundantes en el colon.
Actividad bifidognica. El hecho de que los nios alimentados a pecho tengan una flora
intestinal con un nmero significativamente superior de bifidobacterias que los nios
alimentados con frmula, ha dirigido a muchos investigadores a estudiar y aislar los factores
bifidognicos que exclusivamente promueven el crecimiento de bifidobacterias en el intestino.
Se han propuesto muchos candidatos derivados de la leche humana y otras fuentes. Los 6-GOS
son un componente de los OS de la leche humana (Yamashita y Kobata, 1974), su
administracin a adultos sanos a dosis de 10 g/da es suficiente para detectar un efecto
bifidognico (Tanaka y col., 1983; Ito y col., 1990; Bouhnik y col., 1997). Sin embargo, cuando
el nmero inicial de bifidobacterias autctonas es bajo, la ingestin diaria de 2,5 g/da de 6-
GOS es suficiente para producir un incremento en las bifidobacterias fecales (Ito y col., 1993).
El incremento en bifidobacterias a veces est acompaado de un descenso de Bacteroidaceae
(Tanaka y col., 1983), dando lugar a un cambio en el gnero dominante de la flora fecal de
Bacteroidaceae a Bifidobacterium. En el caso de otros OND, la dosis necesaria para producir

77
este efecto es de 3 g/da para lactulosa (Terada y col., 1992) y de 1 g/da para los FOS
(Tokunaga y col., 1990).
Metabolismo en el colon. Los productos finales de la fermentacin de los hidratos de
carbono por las bacterias del colon son AGCC, tales como c. actico, propinico y butrico, y
los gases H2 y CO2. Se piensa que los AGCC eficientemente absorbidos y utilizados por las
clulas epiteliales del colon humano estimulan la absorcin de sales y agua, el crecimiento de
las clulas epiteliales y la motilidad intestinal (Cummings, 1981).
Aunque Ito y col. (1993) e Ishikawa y col. (1995) detectaron cambios en la microflora
fecal de voluntarios sanos tras la ingestin de GOS, los cambios en la produccin de AGCC en
esos sujetos no fue evidente, ya que ms del 95% de los AGCC producidos en el colon se
absorben en esta regin del intestino grueso como fuente de energa (Darcy-Vrillon y col.,
1996), y algunas bacterias tienen la habilidad de utilizarlos.
En contraste, datos obtenidos de estudios con animales (Chonan y col., 1995; Kikuchi y
col. 1996; Kikuchi-Hayakawa y col., 1997) claramente demostraron un descenso en el pH y un
incremento en los AGCC y otros cidos orgnicos en los contenidos cecales. El agrandamiento
del ciego e incremento en el contenido cecal es comn en estos animales tras el consumo de
GOS. Adems, los cidos orgnicos que se incrementaron drsticamente en modelos con ratas
fueron el c. lctico y succnico (Chonan y col., 1996a; Chonan y Watanuki, 1996). Hay algunas
evidencias de que estos cidos tambin se incrementan en los contenidos cecales de ratas a las
que se les adicion flora humana y conocidas como ratas con flora humana asociada (Kikuchi y
col., 1996) y en los contenidos fecales de voluntarios humanos (Ishikawa y col., 1995) tras el
consumo de GOS. Parece lgico que estos cidos orgnicos pueden ser las sustancias clave que
disminuyen el pH del contenido del colon (Fukushima, 1998). El agrandamiento del ciego y el
incremento en c. succnico en el contenido cecal tambin fueron observados en ratas
alimentadas con galactosilsucrosa y xilosilfructosa (Hoshi y col., 1994).
Mejora de la defecacin. En distintos estudios se ha demostrado que la administracin
de GOS tiene efectos beneficiosos sobre individuos afectados de estreimiento (Narimiya y col.,
1996; Deguchi, y col., 1997). En el estudio de Deguchi y col. (1997), 75 mujeres mejoraron la
frecuencia de la defecacin cuando ingirieron diariamente durante una semana 5 g de GOS (no
se observ efecto con 2,5 g de GOS). En otro estudio con 50 sujetos, la ingestin de 10 g de
GOS de nuevo mejor significativamente la proporcin de defecacin (Deguchi y col., 1997). El
motivo que justifica este hecho puede estar basado en la produccin de AGCC, contribuyendo al
incremento de la presin osmtica y a la estimulacin del peristaltismo (Ishikawa y col., 1995).
Eliminacin del amoniaco. Los mecanismos que estn bajo este efecto probablemente
se deban al incremento de las bifidobacterias y al descenso de ciertas bacterias autctonas
tales como Bacteroides que tienen potencial para producir NH3. Deguchi y col. (1997)
demostraron que algunas bifidobacterias tienen la habilidad de asimilar NH3 como fuente de N.
Por tanto, la reduccin del NH3 en sangre es atribuida al consumo de NH3 intestinal por las
bifidobacterias incrementadas en nmero, adems de la supresin de las bacterias productoras

78
de NH3. En un estudio con personas sanas, la ingestin de 3 g/da de 4-GOS redujo
significativamente la concentracin fecal de NH3 (Tamai y col., 1992). Ciertos aa derivados de
compuestos putrefactivos producidos por las bacterias intestinales tales como fenol, p-cresol e
indol, pueden tambin descender, lo que indica que hay un cambio drstico en el metabolismo
bacteriano bajo la ingestin de 4-GOS. Un resultado similar se observ en ratas con flora
humana asociada (Kikuchi y col., 1996).
Prevencin del cncer de colon. Se ha sugerido que varias enzimas bacterianas, tales
como -glucuronidasa, -glucosidasa y nitroreductasa, podran jugar un papel importante en la
carcinognesis del colon convirtiendo pre-carcingenos en carcingenos (Rowland, 1988). En
un estudio (Rowland y Tanaka, 1993) con ratas con flora humana asociada, la administracin
de 5% GOS de GOS ms B. breve durante 4 semanas, produjo un incremento en la
concentracin cecal de anaerobios totales, lactobacilos y bifidobacterias as como un descenso
en el nmero de enterobacterias. Tambin se redujo significativamente el pH cecal tras la
ingestin de GOS, as como la actividad de -glucuronidasa y nitroreductasa. Adems, los
autores describieron en este mismo estudio que la ingestin de GOS se asocia con un descenso
en la conversin del carcingeno diettico 2-amino-3-metil-3H-imidazol [4, 5-f] quinonina a su
derivado 7-hidroxi con potencial genotxico. En otro estudio, se describi que las personas que
consumieron los DT tambin redujeron el pH fecal as como las concentraciones de NH3, p-
cresol e indol junto con un incremento de bifidobacterias y lactobacilos, y un descenso de
Bacteroides (Ito y col., 1993).
Efectos sobre el colesterol y metabolismo lipdico. Son realmente escasos los estudios
realizados en personas del efecto de los GOS sobre el metabolismo lipdico, por lo que an no
se pueden extraer conclusiones definitivas a este nivel. As, mientras que en un estudio con 4-
GOS se observaron efectos positivos de sobre el metabolismo del COL en humanos (Hayashi,
1989), en otro estudio ms reciente donde se administraron 15 g/da de inulina, oligofructosa o
TOS a 12 voluntarios, no se observ ningn efecto (van Dokkum y col. 1995).
Aplicaciones como ingredientes alimenticios. Hay que destacar la estabilidad de los GOS
en condiciones de acidez y elevada temperatura, lo que facilita que stos sean aplicados sin que
se descompongan posteriormente en una amplia variedad de alimentos.
Actualmente los GOS se emplean como edulcorantes y adicionados a alimentos como
leches fermentadas, panes, mermeladas, confitera, bebidas, etc. Durante la fermentacin con
levadura y en el horneado del pan los GOS no son destruidos, proporcionando un sabor y una
textura excelentes a los productos de panadera. Los productos lcteos fermentados a los que
se les han adicionado probiticos y GOS son otro buen ejemplo de la utilizacin de estos
compuestos en un mercado creciente en Japn y Europa. Los alimentos infantiles y alimentos
especficos para personas mayores y gente hospitalizada son prometedores campos de
aplicacin de los GOS, ya que estas personas son ms susceptibles de sufrir cambios en su flora
intestinal (Sako y col., 1999).

79
7.5. Efecto de los OND en la absorcin mineral

Como ya se describi anteriormente, las necesidades minerales durante la lactancia son

especialmente importantes ya que se requiere un adecuado aporte para un correcto desarrollo
fsico y mental. En este sentido es de vital importancia el Ca, Mg y P para la mineralizacin sea
(Moya y col., 1990), as como un correcto aporte de Fe puesto que la deficiencia en este
mineral no es infrecuente en la infancia (Craig, 1994), y el desarrollo de una anemia ferropnica
a esta edad puede dar lugar a problemas psicomotrices (Walter y col., 1989).
La composicin de la dieta es un importante determinante en la densidad mineral del
hueso durante el periodo de crecimiento, as como en la prdida mineral sea, particularmente
entre las mujeres postmenopusicas (Michaelsen y col., 1994). El mineral del hueso se deposita
durante la niez con un incremento ms rpido durante la pubertad, no obstante esta
deposicin contina a menor velocidad una vez que el crecimiento en altura se ha detenido
(British Nutrition Foundation, 1989). El desarrollo mximo de masa sea durante el crecimiento
y la reduccin de la prdida de hueso posterior son las dos principales estrategias para prevenir
la osteoporosis y el riesgo de fracturas que suceden en la 3 edad (Weaver, 2000). Una ingesta
suficiente de Ca y vitamina D podran reducir el riesgo de fracturas (Michaelsen y col., 1994),
sin embargo, el consumo de Ca diettico est por debajo de los niveles recomendados en
muchos estados de la UE (European Commission, 1998).
Junto al contenido en Ca de la dieta, la absorcin del Ca diettico de los alimentos es
tambin un factor crtico para determinar la disponibilidad de este mineral en el desarrollo y
mantenimiento seo. En este sentido, en los ltimos aos hay un inters por identificar
componentes alimentarios y/o ingredientes alimentarios funcionales que puedan influir
positivamente sobre la absorcin de Ca, con el fin de mejorar su biodisponibilidad en los
alimentos (Kennefick y Cashman, 2000). As, la leche y los productos lcteos son una
importante fuente de minerales esenciales, aunque la disponibilidad del Ca en los productos
lcteos est afectada por la naturaleza del complejo de Ca (Wong y LaCroix, 1982) y tambin
por otros factores como su solubilidad e ionizacin (Allen, 1982). Sin embargo se ha
demostrado que otros componentes de la leche adems de la lactosa (Andrieux y Sacquet,
1983; Abrams y col., 2002), actan como estimulantes de la absorcin de Ca tales como la
lactulosa (Brommage y col., 1993) y los fosfopptidos derivados de la hidrlisis enzimtica de la
casena (Naito y Suzuki, 1974).
Hay una evidencia emergente que muestra que ciertos OND pueden mejorar la
absorcin de Ca y quizs otros minerales en adolescentes y adultos (Cashman, 2002). La FD,
pectina o celulosa, se caracteriza por pasar a travs del ID sin ser digerida al igual que los OND,
y de ah que stos hayan sido propuestos tambin como componentes de la FD. Sin embargo,
la fibra muestra varias diferencias en sus propiedades fsicas como dispersabilidad, viscosidad y
capacidad de adsorcin con respecto a OND como inulina y oligofructosa (Schneeman, 1999).
Estas diferencias presumiblemente explican la variacin en los efectos fisiolgicos y porqu los

80
OND, la fibra y los polialcholes afectan al metabolismo mineral de forma tan diferente. A
continuacin se resumen los estudios realizados con hidratos de carbono no digeribles tanto en
animales como humanos sobre su efecto en la absorcin mineral.

7.5.1. Estudios en animales

El balance mineral es el mtodo ms comnmente usado para evaluar el efecto que

tiene el aporte de una determinada cantidad de OND a la dieta sobre la absorcin mineral en
las ratas. La mayora de los experimentos duran de 3 a 4 semanas y se realizan con ratas en
crecimiento. Las dosis usadas de OND varan entre 2,5 y 10% en la dieta. A continuacin se
describen los efectos encontrados en la bibliografa cientfica por mineral estudiado.
Calcio. La estimulacin de la absorcin de Ca por hidratos de carbono no digeribles en
la dieta ha sido ampliamente descrito en ratas jvenes y en crecimiento mediante la
administracin de FOS (Ohta y col., 1995a, 1998d, 1999; Delzenne y col., 1995), de TOS
(Chonan y Watanuki, 1995), de lactulosa (Brommage y col., 1993), de almidn resistente
(Schulz y col., 1993; Younes y col., 1996; Lopez y col., 1998), de 4-GOS (Chonan y col.,
2001), de 6-GOS (Chonan y Watanuki, 1996) y de hidrolizado de goma guar (Hara y col., 1996,
1999). Tambin se ha descrito en ratas ovariectomizadas alimentadas con GOS (Chonan y col.,
1995), deficientes en Mg con FOS cc (Ohta y col., 1994a), deficientes en Fe con FOS cc (Ohta y
col., 1995b), gastrectomizadas con FOS cc (Ohta y col., 1998b, 1998c), canuladas por el ciego
(Chonan y Takahashi, 1999) y anmicas tras gastrectoma con FOS cc (Ohta y col., 1998a). En
cuanto a la intensidad de la estimulacin, Delzenne y col. (1995) observaron que la
oligofructosa estimul la absorcin de Ca de forma ligeramente ms eficaz que la inulina,
mientras que en otro estudio los FOS cc estimularon la absorcin de Ca significativamente ms
que los GOS, pero igual que la rafinosa en ratas destetadas (Ohta y col., 1993).
Magnesio. La alimentacin con FOS en ratas jvenes mejora significativamente la
retencin de Mg cuando se aaden a una dieta normal (Delzenne y col., 1995; Ohta y col.,
1993, 1995a, 1998d; Ohta, 1999), a una dieta deficiente en Mg (Ohta y col., 1994a) o
proporcionados a animales anmicos y deficientes en Fe (Ohta y col., 1995b). Adems, los FOS
cc (Baba y col., 1996) y el 4-GOS (Chonan y Takahashi, 1999) incrementan la absorcin y
retencin de Mg en ratas canuladas por el ciego. Los FOS cc estimulan la absorcin de Mg
significativamente ms que los GOS pero igual que la rafinosa en ratas destetadas (Ohta y col.,
1993), mientras que en ratas cecectomizadas la administracin de FOS cc incrementa la
absorcin de Mg (Ohta y col., 1994b). Tambin ha sido observado un incremento en la
absorcin de Mg en ratas alimentadas con una dieta con 4-GOS (Ishikawa y col., 1995; Chonan
y col., 1996a, 2001). Otros hidratos de carbono no digeribles tambin han estimulado la
absorcin de Mg en ratas, tales como la lactulosa (Heijnen y col., 1993), la lactosa (Andrieux y
Sacquet, 1983) o el almidn resistente (Schulz y col., 1993; Younes y col., 1996; Lopez y col.,
1998).

81
 Fsforo. Los estudios que muestran un efecto estimulante de los OND sobre la
absorcin de P son ms escasos. Adems Ohta (1999) necesit una concentracin de FOS cc
del 15% para obtener un incremento significativo en la absorcin de P, ya que estudios previos
no observaron ningn efecto con dosis del 5% en ratas jvenes deficientes en Mg (Ohta y col.,
1994a), ni con 7,5% de FOS cc en ratas gastrectomizadas (Ohta y col., 1998b). En un estudio
con ratas adultas ovariectomizadas, se observ que la absorcin y retencin de P no se vieron
afectadas por la oligofructosa con un 0,5 ni un 1% de Ca en dieta, nicamente se redujo la
excrecin urinaria de P cuando la concentracin de oligofructosa fue igual o superior al 5%
(Scholz-Ahrens y Schrezenmeir, 2002).
Hierro. En ratas normales se ha descrito que el almidn resistente al 10% estimul la
absorcin de Fe (Lopez y col., 1998), tambin con un 10% de oligofructosa aunque en menor
medida que la absorcin del Ca y Mg, pero de forma ms efectiva que la del Zn (Delzenne y
col., 1995). Tambin se ha descrito en ratas la prevencin de anemia tras una gastrectoma y
dieta libre de Fe mediante la administracin de FOS cc, as como un incremento significativo en
la absorcin aparente (AA) de Fe, en el hematocrito (Ht), en la concentracin de Hb y en la
eficiencia de regeneracin de Hb (Ohta y col., 1995b, 1998a; Sakai y col., 2000). Ohta y col.
(1999) describieron igualmente que la administracin de FOS cc a ratas gastrectomizadas
previno la anemia por incremento de la absorcin tanto del Fe no-hemo (citrato Fe) como de Fe
hemo.

Mecanismos por los que se incrementa la absorcin mineral

Calcio. El intestino grueso puede representar el mayor lugar de absorcin de Ca cuando

tiene lugar la fermentacin cida (Younes y col., 1996), en este sentido se ha demostrado que
los OND facilitan la absorcin de Ca tanto a nivel colorectal (Ohta y col., 1995a) como cecal
(Demign y col., 1989; Rmsy y col., 1993; Ohta y col., 1994b). Asi, hay estudios que indican
que el efecto estimulante de los FOS cc (Ohta y col., 1994b) y GOS (Chonan y Takahashi, 1999)
sobre la absorcin del Ca sucede principalmente en el ciego, puesto que su absorcin no
aument en ratas cecectomizadas. Tambin se observa un incremento de la absorcin de Ca
cuando las ratas reciben GOS por infusin en el estmago y en el ciego, con un efecto similar al
encontrado cuando se les administra oralmente, indicando que los efectos estimulantes de los
GOS se ejercen en el intestino grueso, incluido el ciego (Chonan y Takahashi, 1999). Sin
embargo, en el n
i testino grueso el Ca est presente en una forma muy poco absorbible
(Ammann y col., 1986), y para ser absorbido debe de encontrarse soluble e ionizado (Allen,
1982). Una manera de incrementar la absorcin de Ca es mediante la ingestin de diferentes
hidratos de carbono no digeribles, tales como la inulina (Levrat y col., 1991; Rmsy y col.,
1993), FOS cc (Ohta y col., 1993), lactulosa (Demign y col., 1989; Heijnen y col., 1993),
lactosa (Brommage y col., 1993; Abrams y col., 2002), almidn resistente (Younes y col.,
1996), TOS (Chonan y Watanuki, 1995), 6-GOS (Chonan y Watanuki, 1996) y GOS (Chonan y

82
col., 1995). La fermentacin de estos azcares en el intestino grueso da lugar a la produccin
de AG voltiles en el ciego con la consiguiente disminucin del pH del lumen (Campbell y col.,
1997). Los productos de la fermentacin de la inulina y oligofructosa son c. lctico y AGCC,
principalmente propionato y acetato, y en menor cantidad butirato (Levrat y col., 1991), con un
efecto demostrado en el aumento de la concentracin de Ca soluble e ionizado, acelerando de
esta forma la difusin pasiva (Andrieux y Sacquet, 1986; Levrat y col., 1991; Younes y col.,
1993; Rmesy y col., 1993; Schulz y col., 1993; Brommage y col., 1993; Heijnen y col., 1993;
Ohta y col., 1996, 1993; Chonan y col., 1995; Lopez y col., 1998). Tambin se ha observado
una estimulacin selectiva del crecimiento bacteriano en el lumen intestinal, sobretodo
bifidobacterias y lactobacilos por parte de XOS y oligofructosa (Campbell y col., 1997), TGOS
(Rowland y Tanaka, 1993), y FOS cc (Howard y col., 1995; Campbell y col., 1997; Sakai y col.,
2001). Los AG voltiles, acetato y butirato tienen efecto directo en el colon distal (Scharrer y
Lutz, 1990), ya que aceleran la absorcin de Ca (Lutz y Scharrer, 1991; Levrat y col., 1991), y
un efecto estimulatorio sobre la mucosa cecal junto con un incremento del flujo sanguneo en el
ciego (Levrat y col., 1991; Younes y col., 1993; Campbell y col., 1997). Sin embargo, el hecho
de que lactosa sea capaz de estimular la absorcin de Ca en ratas libres de grmenes (Andrieux
y Sacquet, 1982, 1983) y que el maltitol tambin estimule la absorcin de Ca en segmentos de
leon evertidos (Goda y col., 1993), indica que el bajo pH en el intestino no debe ser el nico
factor relacionado con la absorcin de Ca.
Ha sido descrito un aumento del peso del ciego, tanto del contenido como de la pared,
en ratas alimentadas almidn resistente (Rmsy y col., 1993) y con diferentes OND (Demign
y col., 1989; Levrat y col., 1991; Hoshi y col., 1994; Ohta y col., 1994; Younes y col., 1996;
Kikuchi y col., 1996; Campbell y col., 1997) y del colon con FOS cc (Tokunaga y col., 1986).
Este aumento lleva consigo un incremento del rea de superficie disponible para la absorcin de
nutrientes. Tambin se ha sugerido que la presencia de stos azcares resistentes
osmticamente activos en el ID debe incrementar la cantidad de fluido dentro del lumen para
mantener la isotonicidad (Brommage y col., 1993). Como ya indic Bronner (1987), este fluido
adicional debe aumentar la absorcin pasiva del Ca mediante el incremento de la permeabilidad
de la unin intercelular entre los enterocitos. De tal manera que la inyeccin de TOS o lactosa
en el ciego produce un aumento significativo del peso de la fase lquida en el lumen intestinal,
por lo que la mayor absorcin de Ca tambin puede deberse a este ltimo efecto (Chonan y
Watanuki. 1995).
El efecto trfico de los AGCC sobre la proliferacin de las clulas epiteliales del colon ha
sido observado tanto en ratas (Koruda y col., 1988; Kripke y col., 1989; Rmsy y col., 1992;
Frankel y col., 1994) como en humanos (Scheppach y col., 1992). La hiptesis de que los AGCC
producidos de la fermentacin de los OND estn involucrados en la proliferacin de las clulas
epiteliales del colon, se ha visto fortalecido con los hallazgos de proliferacin de las clulas
epiteliales del colon tras la administracin luminal de AGCC (Sakata y von Englehardt, 1983;
Sakata, 1987; Campbell y col., 1997) acompaado de un aumento en el tamao de las criptas

83
(Campbell y col., 1997; Ichikawa y Sakata, 1998). El butirato parece ser el ms efectivo,
actuando como fuente de energa y estimulando as la proliferacin celular, con un incremento
en la profundidad de las criptas y en la densidad celular (Sakata y von Englehardt, 1983;
Campbell y col., 1997). Sin embargo, las bifidobacterias producen slo una pequea cantidad
de butirato comparado con otras especies (Djouzi y Andrieux, 1997), por tanto estos datos no
apoyan la relacin causal entre la estimulacin de absorcin mineral por las bifidobacterias va
butirato. Como ya hemos comentado anteriormente, el gran aumento de la solubilidad de Ca en
el ciego permite a este rgano jugar un papel importante en la absorcin total de Ca. De hecho,
el ciego de la rata tiene la mayor densidad de lugares de transporte de Ca sensibles a los
metabolitos de la vitamina D (Nellans y Goldsmith, 1981), pudiendo incrementarse con la
hipertrofia cecal (Lopez y col., 1998).
Tambin se ha sugerido que es posible que los AGCC influyan directamente en la
absorcin de Ca modificando el intercambio de varios electrolitos (Ca-H) (Lopez y col., 1999).
Wasserman y col. describieron la produccin de un complejo altamente absorbible de Ca-lactato
(Wasserman y Lengemann, 1960; Armbrecht y Wasserman, 1976). Trinidad y col. (1993) han
sugerido que el Ca podra pasar a travs de la membrana celular ms fcilmente en forma de
complejo menos cargado (acetato de Ca) que el Ca ionizado. De hecho, para neutralizar la
elevada concentracin de cido orgnico y mantener un pH cecal en un valor de acidez
moderado (cercano a 6), deberan de alcanzar el ciego una cantidad suficiente de minerales. En
este sentido, Rmsy y col. (1993) mostraron que la acumulacin de sales insolubles de Ca,
principalmente de fosfato, jugaban un importante papel como sistema tamponador del pH cecal
en ratas alimentadas con inulina. Este complejo de Ca insoluble (carente de efecto osmtico)
puede ser efectivo en contrarrestar la acidificacin cecal cuando hay una fermentacin muy
activa. As, Younes y col. (1996) en ratas alimentadas con almidn digerible observaron que
sta capacidad tamponadora de los contenidos cecales fue muy alta, porque los electrolitos
provenientes del leon se concentraron en un volumen pequeo. En cambio en ratas
alimentadas con almidn resistente, la mayor efectividad de la absorcin de Ca en el tracto
digestivo superior, junto con una dilucin del Ca en un gran volumen cecal, dio lugar a una
menor concentracin de este complejo de Ca y P, y por lo tanto una menor neutralizacin del
pH. Aunque est aceptado que un pH muy cido (pH 5) inhibe a los microorganismos que
metabolizan el cido lctico (Cummings, 1981), Younes y col. (1996) tambin observaron una
produccin notable de cido lctico a pH 5,7.
Un ltimo mecanismo propuesto es la accin de la calbindin-D9k (CaBP), una protena
de la mucosa intestinal que tiene una gran afinidad por el Ca en el intestino de ratas (Duflos y
col., 1996). Ohta y col. (1998c) observaron en ratas que los FOS cc incrementaron los niveles
de CaBP en el intestino grueso. Los autores propusieron que el incremento de la concentracin
luminal de Ca como consecuencia de la fermentacin de los FOS cc, poda incrementar el flujo
difusivo de Ca en las clulas de la mucosa intestinal y as mantener la homeostsis local del Ca

84
en el intestino grueso. Esto sugiere que la existencia de una ruta transcelular, va CaBP, en el
intestino grueso adems de la paracelular (Ohta y col., 1998c).
Magnesio. Al igual que ocurra con el Ca, el Mg tambin es capaz de absorberse desde
el colon y el ciego (Karbach, 1989a, 1989b; Scharrer y Lutz, 1990; Hardwick y col., 1991). Se
ha descrito que los AGCC aceleran la absorcin de Mg tanto desde el ciego (Lutz y col., 1991)
como desde el colon (Scharrer y col. 1990; Lutz y col., 1991). Ohta y col. (1994b) observaron
que la administracin de FOS cc disminuy el pH luminal del colon en ratas cecectomizadas y
concluyeron que el efecto estimulante de los FOS cc sobre la absorcin de Mg sucede
principalmente en el colon o en el colon compensado por la falta del ciego. En estudios
posteriores estos autores describieron que la mitad del incremento en la absorcin del Ca y Mg
inducido por los FOS cc tiene lugar en el colon y recto (Ohta y col., 1995a) y la otra mitad en el
ciego (Ohta y col., 1997). En otro estudio, el empleo de 4-GOS increment la absorcin de Mg
no slo cuando se infundi en el estmago sino tambin en los animales que recibieron infusin
en el ciego con la misma intensidad que por la administracin oral de los GOS, los autores
concluyeron que los efectos estimulantes de los GOS fueron ejercidos principalmente en el
ciego, con una menor contribucin relativa del colon y del recto (Chonan y Takahashi, 1999).
Ha sido descrito, al igual que para el Ca, que el Mg al ser muy poco soluble en las
condiciones del intestino grueso in vivo, debe encontrarse de forma soluble para ser absorbido
a este nivel (Chonan y Watanuki, 1995, 1996). As pues, el incremento de la produccin de
AGCC y el consiguiente descenso del pH estn asociados con un incremento en el la solubilidad
del Mg en la fase lquida en el leon y ciego, por disolucin del complejo Ca-Mg-P insoluble
cuando las ratas son alimentadas con lactulosa (Heijnen y col., 1993), almidn resistente
(Schulz y col., 1993), arabinoxilanos (Lopez y col., 1999), FOS cc (Ohta y col., 1994a) o con 4-
GOS (Chonan y col., 1996a). Adems, Ohta y col. (1993) demostraron que haba una
correlacin significativa entre la AA de Mg y la concentracin de lactato en el ciego, y Scharrer y
Lutz. (1990) sugirieron que el butirato afectaba a la absorcin de Mg en el colon. Tambin se
ha propuesto que el efecto del almidn resistente en la absorcin cecal de Mg podra estar
relacionado con la hipertrofia cecal, y probablemente hay un efecto especfico de los AGCC en
la absorcin pasiva de Mg (Scharrer y Lutz, 1992; Younes y col., 1996), actuando en el mismo
un sistema de intercambiadores de protones (incluido Mg-H) necesario para la absorcin de los
AGCC (Lutz y col., 1991).
En el intestino grueso podra ocurrir lo mismo que en el delgado, donde se ha descrito
cierta competitividad entre la absorcin de Ca y Mg (Brink y col., 1992) pero con mecanismos
independientes (Karbach y Remmel, 1990; Hayasi y Hoshi 1992), ya que ha sido demostrado
que el incremento del consumo de Ca P puede perjudicar la AA de Mg (Ohta y col., 1994a)
debido a la formacin de un complejo insoluble de Ca-Mg-P en el lumen intestinal (Brink y col.,
1992), sin embargo la administracin de FOS cc es capaz de incrementar la absorcin de Mg.
Fsforo. Se ha demostrado que el Ca de la dieta tiene un marcado efecto inhibitorio
sobre la absorcin intestinal de fosfato, y adems en ratas hay una relacin inversa entre la

85
absorcin de fosfato y el contenido en Ca de la dieta (Draper y col., 1972; Anderson y Draper,
1972). En un estudio con ratas alimentadas con una cantidad elevada de P (1,3%) la absorcin
intestinal y excrecin urinaria de fosfato fueron significativamente ms elevados cuando el
contenido en Ca de la dieta fue bajo (0,2%) que cuando fue normal (0,6%), y esta diferencia
se asoci con la formacin de fosfato clcico insoluble en el tracto GI (Schaafsma y Visser,
1980).
Sin embargo, Ohta y col. (1993) observaron que la alimentacin con FOS cc a ratas
estimul significativamente la AA de P, encontrando una correlacin positiva entre la absorcin
mineral y la concentracin de L-lactato en el colon. En otro estudio, Ohta y col. (1997)
observaron que la absorcin de P en ratas con infusin de Ca y Mg en el ciego fue mayor que
cuando se realiz en el estmago, mientras que la retencin de P disminuy con la ingestin de
FOS cc, siendo menor en la ratas con infusin en el ciego. Una explicacin a esto hecho es la
posible formacin de un complejo insoluble Ca-P-Mg en el lumen (Brink y col., 1992), que se
estimula con una alimentacin elevada en P, descendiendo la absorcin de estos minerales. Por
tanto y como nicamente ha sido propuesto un mecanismo de absorcin de P en el ID (Birge y
Aviol, 1981), la inhibicin de la absorcin de P podra reflejar la formacin de un complejo
insoluble de la sal de P con el Ca y Mg en el ID. En un estudio ms reciente, Ohta y col.
(1998b) observaron que la absorcin de P se increment en ratas gastrectomizadas, usando
como fuente de P el fosfato potsico (KH2PO4) que es soluble en agua, sin embargo la adicin
de FOS cc tampoco estimul la absorcin de P por encima del grupo control como ocurri con el
Ca.
Hierro. Se ha observado que en el intestino grueso se absorbe el Fe suficiente para que
las ratas se recuperen de una anemia (Ebihara y Okano, 1995). El ciego juega un importante
papel en el mecanismo por el que los FOS cc previenen la anemia postgastrectoma (Ohta y
col., 1998a, 1999), aunque al parecer la absorcin de Fe no slo tiene lugar en ciego sino
tambin en el colon y recto (Sakai y col., 2000). Al igual que ocurra con los otros minerales, la
solubilizacin del Fe es esencial antes de que pueda ser absorbido en el lumen intestinal
(Monsen y Cook, 1976). Ohta y col. (1995b) en ratas anmicas observaron un aumento en la
absorcin del Fe, indicando como responsables de tal efecto a los cidos orgnicos como el
lactato y los AGCC producidos por las bacterias del lumen a partir de la fermentacin de los FOS
cc, ya que el lactato forma un pequeo complejo molecular absorbible con Fe frrico (Derman y
col., 1980).
Ohta y col. (1995a) relacionaron la absorcin de Fe (pirofosfato frrico) en ratas
anmicas alimentadas con FOS cc con la disminucin del pH del contenido del ciego y un
incremento de la concentracin de Fe en la fase soluble del mismo. Posteriormente Ohta y col.
(1998a), utilizaron un compuesto soluble (citrato de Fe) en ratas gastrectomizadas y
argumentaron que sin el efecto del cido gstrico, para que el Fe fuera absorbido ste debi ser
cambiado en otra forma qumica insoluble en el intestino (sal de fosfato), como un paso
intermedio que permita su unin a protenas (mucina) con las que formar complejos solubles

86
fcilmente absorbibles. Conrad y col. (1993) propusieron que la ruta de transporte de Fe en el
intestino consiste en varias protenas fijadoras de Fe incluyendo mucina, integrina, mobilferrina
y ferritina. Una vez que se ha formado el complejo Fe-mucina, mantiene el Fe en forma soluble
tras la alcalinizacin del lumen y por tanto facilita la absorcin del Fe. Otra explicacin es que el
Ca y Fe puedan competitivamente unirse a una o ms sustancias que son importantes en la
ruta de absorcin transcelular (Hallberg y col., 1991), puesto que en las ratas algunas protenas
duodenales como la mobilferrina y calreticulina tienen afinidad por Ca y Fe (Conrad y col.,
1993). Estas protenas tambin se encuentran en el intestino grueso (Petith y col., 1979). Junto
a estos mecanismos de absorcin, Ohta y col. (1998a) observaron que los FOS cc
incrementaron la absorcin del Ca en ratas gastrectomizadas, de manera que si los FOS cc
estimulan la absorcin de Ca por una ruta independiente a la de la absorcin del Fe, como la
ruta paracelular, los FOS cc podran reducir el efecto inhibitorio del Ca sobre la absorcin de Fe.
Tambin se ha demostrado un efecto estimulante de los FOS cc en la absorcin de Fe,
en ratas anmicas postgastrectoma alimentadas con una fuente de Fe hemo, mediante el
descenso del pH en los contenidos cecales y el incremento en la concentracin de Fe en la
fraccin soluble de los mismos. Sin embargo, este efecto estimulante fue ms dbil que en el
caso del Fe no hemo y no se observ ningn efecto en ratas normales (Ohta y col., 1999). En
otro estudio con ratas normales alimentadas con almidn resistente, el aumento significativo en
la absorcin de Fe se relacion con un incremento en el rea de intercambio (aumento del
ciego y mayor tiempo de trnsito) y la elevacin del flujo sanguneo del ciego (Lopez y col.,
1998).
Efecto sobre la mineralizacin sea. Uno de los objetivos principales que se busca en la
administracin de OND a la dieta es que la estimulacin de la absorcin mineral se traduzca en
una deposicin de estos minerales en el hueso, especialmente en las etapas de crecimiento. Los
FOS y GOS han sido los ms estudiados en este sentido y a continuacin se describen los datos
ms relevantes.
En ratas jvenes (Chonan y col., 1995) y adultas (Scholz-Ahrens y col., 2001a; Scholz-
Ahrens y Schrezenmeir, 2002) ovariectomizadas, usadas como modelo de mujeres
postmenopusicas, los GOS y la oligofructosa previnieron de forma efectiva la prdida de
contenido mineral seo, y el contenido en Ca del fmur y tibia fue un 10% mayor en las ratas
alimentadas con los GOS (Chonan y col., 1995). Sin embargo, mientras que la ingestin de 5%
de oligofructosa previno de la prdida sea en el fmur en presencia de Ca diettico elevado
(1%), se necesit un 10% de oligofructosa para incrementar significativamente la
mineralizacin sea con 0,5% de Ca (Scholz-Ahrens y col., 2001a; Scholz-Ahrens y
Schrezenmeir, 2002). En ratas gastrectomizadas los FOS cc tambin aumentaron la absorcin
de Ca, y previnieron el descenso de contenido clcico en el fmur y la densidad sea mineral
como consecuencia de la osteopenia que sobreviene a una gastrectoma (Ohta y col.,
1998a,1998b). Igualmente en ratas normales los 6-GOS incrementaron el contenido de Ca en
fmur y tibia cuando el contenido de Ca en la dieta fue normal (0,5%), mientras que cuando

87
ste fue bajo (0,05%) no se observ ningn efecto sobre la mineralizacin sea (Chonan y
Watanuki, 1996).
As pues, el contenido en la dieta de Ca puede ser importante a la hora de que los OND
puedan tener o no efecto sobre su deposicin en el hueso. Rmsy y col. (1993) observaron
que la concentracin de Ca soluble en el ciego fue superior si se aada inulina a una dieta con
concentracin elevada de Ca (0,8%), y se correlacion con la cantidad de Ca absorbido desde
el ciego.
En ratas ovariectomizadas se ha observado un efecto dosis-dependiente con la
administracin de inulina en el incremento de la absorcin de Ca, y consecuentemente en el
incremento de la densidad mineral sea (Scholz-Ahrens y Schrezenmeir, 2002). Posteriormente,
estos autores describieron que la persistencia del efecto de mineralizacin del hueso mediado
por oligofructosa dependi de la parte del esqueleto medida. En el fmur, la prevencin de la
desmineralizacin mediante el empleo de oligofructosa fue ms pronunciado tras ocho semanas
y se perdi significacin tras diecisis semanas de haber sido ovariectomizadas (Scholz-Ahrens
y col., 2001b).

7.5.2. Estudios en humanos

En voluntarios ileostomizados la ingestin de inulina y oligofructosa no modific el

trnsito de Ca, Mg, Zn y Fe desde el leon hacia el colon, sugiriendo que la absorcin mineral
tiene lugar en el colon (Ellegrd y col., 1996). Van Dokkum y col. (1995) mediante una tcnica
de istopos estables, no observaron ningn efecto de los OND sobre la absorcin mineral en
hombres jvenes tras la toma de 15 g de inulina, oligofructosa o GOS al da durante 3 semanas,
debido segn los autores al corto periodo de tiempo (24 h) en la recogida de las muestras. En
un estudio posterior, las muestras fueron recogidas a las 36 h de la administracin del istopo,
se observ un incremento significativo (p<0,05) en la absorcin de Ca con el empleo de
oligofructosa (van den Heuvel y col., 1999b). Coudray y col. (1997) tambin observaron un
incremento significativo (p<0,01) en la absorcin de Ca en voluntarios que tomaron inulina
durante 4 semanas, sin embargo no se mostraron efectos en la absorcin de Mg, Fe y Zn. van
den Heuvel y col. (1999a) investigaron la absorcin de Ca en un estudio con mujeres
postmenopusicas, observando una diferencia significativa (p<0,01) en la absorcin entre el
grupo control y el alimentado con 10 g de lactulosa. Un estudio reciente (Abrams y Griffin,
2001) con una dieta relativamente alta en Ca (1.500 mg/da), y con consumo de inulina y
oligofructosa durante 3 semanas, revel un incremento del 18% en la fraccin real de la
absorcin de Ca y un incremento absoluto del Ca absorbido de 90 mg/da.
Mecanismo por el que los OND aumentan la absorcin mineral. Como ya hemos visto
con las ratas, el mecanismo por el cual se estimula la absorcin mineral est probablemente
relacionado con el incremento de la solubilidad de estos minerales en el ciego y el colon como
consecuencia del aumento de la fermentacin microbiana y descenso del pH del lumen. En el

88
hombre debera de ocurrir algo parecido ya que como anteriormente se ha descrito el efecto
estimulante de los OND sobre la absorcin mineral es debido principalmente a su carcter
prebitico, al ser fermentado selectivamente por los microorganismos del colon con
consecuencias beneficiosas para la salud del hospedador (Gibson y Roberfroid, 1995;
Roberfroid y col., 1998;). Sin embargo, debido a que la fisiologa del aparato digestivo de la
rata es diferente de la humana, el segmento del ciego, que est prcticamente ausente en los
humanos, juega un papel importante en la absorcin mineral de los roedores (Rayssiguier y
Rmsy, 1988). En los humanos se sabe que los minerales como el Ca, P y Mg adems de en el
ID, tambin se absorben de forma efectiva desde el colon (Sellin y col., 1984; Colette y col.,
1986). Adems Flourie y col., (1985) y Cummings y col., (1987) observaron una fermentacin
ms activa en el colon de los humanos con un mayor valor de AGCC y un menor pH luminal,
requisito para la estimulacin de la absorcin de Ca en el colon humano (Trinidad y col., 1993).
Varios son los estudios que demuestran que los OND (oligofructosa, TGOS, inulina y
GOS) alcanzan el colon intactos (Alles y col., 1997; Bouhnik y col., 1997) y all son fermentados
de forma especfica por las bifidobacterias del colon, aumentando su nmero en la muestras
fecales, sin modificar el pH fecal y el recuento de otros gneros bacterianos como las
enterobacterias (Bouhnik y col., 1997; Kleessen y col., 1997; Djouzi y Andrieux, 1997), o por el
contrario disminuyendo el nmero de bacteroides y clostidios (Ito y col., 1993; Gibson y col.,
1995). Sin embargo, otros autores (Scholz-Ahrens y col., 2001) consideran todava escasas las
evidencias de esta especificidad, y proponen que el principal efecto de los prebiticos
responsable de la mayor absorcin mineral en humanos est relacionado con su efecto como
comida del colon. Es decir, que sta sirve como substrato para la flora intestinal de una forma
inespecfica pero que podra estimular la tasa de fermentacin, produccin de AGCC y
acidificacin luminal. Sin embargo, y como se ha mencionado anteriormente no se ha
encontrado un claro efecto de los OND sobre el pH fecal y concentracin o proporcin de AGCC.
Esta falta de relacin clara podra explicar parcialmente la menor estimulacin de la absorcin
mineral por estas sustancias en los humanos con relacin a los animales. Otra explicacin que
dan estos mismos autores es la corta duracin de los estudios en humanos, haciendo imposible
extrapolar a corto plazo los efectos de los OND en la absorcin mineral sobre el desarrollo del
esqueleto o salud del hueso, por lo que se requieren estudios a ms largo plazo.
Otro aspecto que tampoco est claro en el hombre es que el efecto dosis-dependiente
de los prebiticos sobre la absorcin de algunos minerales pueda estar relacionado con la
capacidad estimulante sobre las bifidobacterias del substrato. As, Roberfroid y col (1998)
concluyeron que aunque no haba relacin dosis-efecto en el rango de 4 a 20 g/da de inulina y
oligofructosa, esta cantidad era suficiente para estimular el crecimiento de estas bacterias.
Hasta ahora no est claro si existe un efecto dosis-dependiente de los prebiticos sobre la
absorcin mineral asociada con un efecto dosis-dependiente en el crecimiento de
bifidobacterias. No obstante, una variable que se puede correlacionar con estos incrementos es
el nmero inicial de bifidobacterias en heces, independientemente de la dosis de los FOS, ya

89
que se ha observado que cuando el nmero inicial de bifidobacterias es ms bajo se produce el
mayor incremento de estas bacterias cualquiera que sea la dosis diaria de FOS empleada
(Roberfroid y Delzenne, 1998).

7.6. Mtodos para evaluar el potencial de los prebiticos

Los OND son considerados como los substratos prebiticos ms importantes ya que
cumplen los criterios actuales para que un ingrediente sea clasificado como prebitico (Gibson y
Roberfroid, 1995), incluyendo la capacidad de modular beneficiosamente la flora intestinal. Sin
embargo, se hace imperativo que se puedan utilizar mtodos seguros para determinar su
eficacia. A continuacin se muestran las tcnicas que actualmente se emplean con este fin.
Estudios en cultivos puros. Estos estudios se llevan a cabo con bifidobacterias y
lactobacilos (Yazawa y col., 1978) en cultivo puro con OS y PS, comparando el crecimiento con
otras cepas bacterianas. Tambin se han llevado a cabo cultivos mixtos en los que cepas
intestinales seleccionadas han sido usadas para determinar la actividad prebitica en cocultivo
(Djouzi y col., 1995). Estas tcnicas introducen algn elemento de competicin entre los
organismos, pero de nuevo no se asemeja de forma adecuada a las complejas interacciones de
la microflora intestinal humana que comprende aproximadamente unas 500 especies.
Fermentaciones in vitro con cultivos mixtos. Los fermentadores in vitro ms simples son
cultivos estticos cerrados en los que el substrato es limitado y por tanto es slo apropiado en
experimentos que lleven poco tiempo (Wang y Gibson, 1993). Un mtodo ms fisiolgico es un
cultivo continuo, en el que variando la proporcin de la dilucin y otros parmetros se pueden
determinar las condiciones ptimas para el crecimiento (Gibson y Wang, 1994b). Los cultivos
semicontinuos consisten en ir aadiendo el medio, y el cultivo gastado se elimina a intervalos
especficos (Rumney y Rowland, 1992). Los fermentadores de fase mltiple se han empleado
como modelos intestinales efectivos. Este sistema consiste en tres vasos alineados en sucesin,
el primero rico en nutrientes, de trnsito rpido y condiciones cidas, el tercero con menos
substrato, de trnsito lento debido a un mayor volumen operativo y condiciones de pH neutro
(Gibson y Wang, 1994b), mientras que el segundo presenta unas condiciones intermedias entre
los dos anteriores. Como resultado, el primero imita el colon proximal, el segundo el colon
transverso y el tercero simula el colon distal. Los fermentadores continuos de cinco fases
tambin se han usado para simular el tracto intestinal desde el yeyuno hasta el colon
descendente (Molly y col., 1993). Aunque los fermentadores de cultivos continuos son
herramientas razonables de fermentacin, no pueden imitar completamente el ambiente del
colon, y su principal inconveniente es la falta de potencial de absorcin.
Mtodos in vivo. Los animales, a menudo ratas o ratones, se han utilizado para
determinar la naturaleza prebitica de un substrato (Campbell y col., 1997; Kullen y col., 1998).
Ratas gnotobiticas (libres de grmenes) o aquellas inoculadas con uno o un nmero limitado
de organismos pueden ser usadas para investigar las interacciones entre el hospedador y los

90
microorganismos, aunque el ecosistema resultante difiera de la situacin normal en el intestino
humano (Valette y col., 1993; Djouzi y col., 1995). Las ratas, conocidas como ratas con flora
humana asociada, pueden dar una mayor representacin de la situacin del intestino humano,
aunque la fisiologa intestinal no sea la misma (Rowland y Tanaka, 1993). Tambin se han
llevado a cabo estudios con personas, aunque los distintos estudios mostraron diferencias en la
dosis administrada, la duracin del estudio y las caractersticas de los voluntarios (Ito y col.,
1990; Gibson y col., 1995; Kleessen y col., 1997b; Bouhnik y col., 1997).
Caracterizacin bacteriana. La microflora bacteriana ha sido detectada usando mtodos
fenotpicos y bioqumicos de identificacin clsicos. Sin embargo, adems de llevar tiempo y ser
laboriosos, son de baja resolucin ya que estn limitados por el medio de cultivo usado y no
son completamente selectivos para los organismos deseados. La llegada de tcnicas
moleculares ha permitido cambiar esta situacin mediante el empleo de herramientas con
mayor poder discriminatorio y fiabilidad. El inters actual se est centrando en extraer el ADN
de colonias puras obtenidas mediante tcnicas clsicas de cultivo, amplificandolo mediante la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), para secuenciar finalmente el ARNr 16S y
compararlo entonces con bases de datos (Wilson y Blitchington, 1996). Las sondas de
oligonucletidos especficas de gnero y especie han sido desarrolladas recientemente. La
hibridacin con fluorescencia in situ es quizs el mtodo mejor conocido, mediante el cual
sondas marcadas con fluorescencia especficas de gnero hibridan el ARNr de un gnero
particular (bifidobacteria en clulas fijadas sobre superficie microscpica) y las clulas con
fluorescencia son cuantificadas (Langendijk y col., 1995). El inters actual se est dirigiendo
hacia el diseo de sondas genotpicas, que hibridan especficamente una nica secuencia(s) del
ARNr 16S del microorganismo que queremos identificar. As, una sonda de oligoncletido,
especfica para una cepa probitica, puede ser marcada con una protena fluorescente, y por
tanto ser usada para marcar el probitico, facilitando as la diferenciacin de la bifidobacteria y
lactobacilo del hospedador. Las sondas de oligonucletidos marcadas fluorescentemente
haciendo blanco en la secuencia especfica de ARNr 16S para un gnero bacteriano, han sido
utilizadas por Welling y col. (1997) para caracterizar la composicin de una muestra de
bacterias fecales (Rycroft y col., 1999).

7.7. Empleo de oligosacridos (OS) frente a la fibra diettica (FD)

La FD es un componente de la dieta normal, ampliamente aceptado como una parte

importante de la nutricin sana. Se ha propuesto una definicin de la FD basada en un criterio
fisiolgico/nutricional (Br, 1993; British Nutrition Foundation, 1990) como: aquella parte de
los oligosacridos, polisacridos y sus derivados (hidroflicos), que no puede ser descompuesta
en componentes absorbibles por las enzimas digestivas humanas en el estmago e ID,
incluyendo la lignina. Segn esta definicin de la fibra, sta puede dividirse en PS no almidn,
oligosacridos no digeribles, almidn resistente y lignina.

91
 El hecho de que los OS no sean digeridos por los jugos digestivos del hombre podra
calificarlos como FD de bajo peso molecular, no formadora de viscosidad y solubles en agua.
Los beneficios para la salud de la ingestin de OS son tambin semejantes a los desarrollados
por la FD. Sin embargo, los OS no poseen los efectos fsicos de la FD, tales como el incrementar
la viscosidad, retencin de agua y efectos de volumen. La contribucin a la salud de los OS
proviene de su caracterstica de ser fermentada (factor de crecimiento de bifidobacterias). Las
ventajas que los OS tienen sobre la FD es un requerimiento diario menor (3 g/da), no causan
diarrea a las dosis recomendadas, son ligeramente dulces, no tienen ni mal sabor ni textura,
son completamente solubles en agua, no dan viscosidad, no retienen minerales, son fsicamente
estables y son ms fcilmente incorporados en comidas y bebidas procesadas (Tomomatsu,
1994).

7.8. Dosis y efectos secundarios

La dosis diaria efectiva de OS (en forma pura) es de 3 g de FOS, 2-2,5 g de GOS, 2 g

de SOS y 0,7 g de XOS. La mxima dosis que no produce diarrea de SOS es de 0,64 g/kg para
hombres y 0,96 g/kg para mujeres (Hata y col., 1989), y la dosis mnima de FOS requerida para
inducir diarrea es de 44 g para hombres y 49 g para mujeres (Spiegel y col., 1994).
Los GOS generalmente han sido reconocidos como seguros GRAS, debido al hecho de
que son componentes de la leche humana y del yogurt tradicional, y son producidos a partir de
la lactosa ingerida por bacterias intestinales residentes que producen -galactosidasa. En
pruebas de toxicidad aguda y crnica en ratas, la ingestin oral de GOS a razn de 20 g/kg de
peso corporal administrada en una sla dosis, y de 1,5 g/kg de peso corporal durante 6 meses,
no ha mostrado toxicidad. Tampoco se encontr mutagenicidad en la prueba de mutacin
microbiana de Ames, ni genotoxicidad en el ensayo de la reparacin por recombinacin de Rec.
El nico efecto adverso conocido de los GOS es a lo sumo una diarrea transitoria debido a la
llamada diarrea osmtica, que ocurre cuando se consume un exceso de GOS. La cantidad de
GOS que no produce diarrea osmtica se estima que es aproximadamente 0,3-0,4 g/kg de peso
corporal o alrededor de 20 g por persona (Sako y col., 1999).

92
8. SIMBITICOS

Los simbiticos se definen como la mezcla en un nico producto de probiticos y

prebiticos que afectan beneficiosamente al hospedador, mediante la mejora de la
supervivencia y la implantacin de los microorganismos vivos en el tracto GI aadidos en la
dieta. Dicha implantacin promueve la estimulacin selectiva del crecimiento y/o activacin del
metabolismo de uno o un nmero limitado de bacterias promotores de la salud, mejorando as
el bienestar del hospedador (Gibson, y Roberfroid, 1995).
Esta combinacin podra mejorar la supervivencia del microorganismo probitico ya que
su substrato especfico se encuentra fcilmente disponible para su fermentacin. Por ello se
podra esperar que el substrato prebitico confiriera proteccin al microorganismo durante su
trnsito por el tracto GI superior frente a la acidez gstrica (la eficacia en la proteccin depende
de los constituyentes en azcar del prebitico y tipo de partes del enlace) y contra el ataque
proteoltico de las proteasas gstricas y pancreticas, probablemente a travs de los
mecanismos de revestimiento de la superficie del probitico e impedimento estrico. No
obstante, estos mecanismos deben ser todava investigados (Mountzouris y col., 2002).
Ejemplos de simbiticos empleados son la combinacin de bifidobacterias con FOS,
lactobacilos con lactitol y de bifidobacterias con GOS (Collins y Gibson, 1999). Los estudios que
evalan la estimulacin del crecimiento de las bifidobacterias intestinales tras la ingestin de
simbiticos son todava escasos. Recientemente, Bielecka y col. (2002) demostraron que la
administracin de B. longum o B. adolescentis junto con oligofructosa al 5% a ratas durante 14
das aument el nmero de bifidobacterias en heces en 1,4 log ufc/g respecto al grupo control.
Sin embargo, no mostr diferencias respecto al empleo nico de oligofructosa en la dieta (1,6
log ufc/g).
En cuanto a los efectos descritos en la bibliografa sobre la salud humana tras la
administracin de simbiticos, hay que destacar la actividad antiinfecciosa y la colonizacin
intestinal por bifidobacteria tras la administracin de B. breve con OS 6-transgalactosilados.
Esta combinacin se mostr efectiva frente a la infeccin oportunista de un patgeno con
resistencia antibitica como fue Salmonella enterica serovar. Typhimurium (Asahara y col.,
2001).
Tambin se ha descrito la mejora de la funcin intestinal en una nia con sndrome de
intestino corto. Este conjunto de sntomas se observa en pacientes que han sufrido una
reseccin masiva del intestino dando lugar a un intestino dilatado y un sobrecrecimiento
bacteriano en el mismo (Vanderhoof y col., 1998). Kanamori y col. (2001) administraron una
terapia simbitica consistente en B. breve, L. casei y GOS durante un mes. Tras este tiempo
detectaron que las heces contenan un gran nmero de los probiticos administrados, as como
otras especies de bifidobacterias y lactobacilos. As mismo, se observ una reduccin de los
niveles en heces de E. coli y Candida durante el tratamiento.

93
9. PROBITICOS Y PREBITICOS EN LA ALIMENTACIN INFANTIL

El hecho de que las bifidobacterias lleguen a ser predominantes en los bebs

alimentados con lactancia materna, como anteriormente se ha descrito, ha provocado que la
industria est evaluando los mtodos que hacen que la flora GI de los bebs alimentados con
frmula sea comparable a la de los alimentados a pecho. Sin embargo, no est claro si esta
diferencia tiene alguna consecuencia a largo plazo con un significado clnico y exactamente
durante cuanto tiempo persiste esta diferencia (Vandenplas, 2002).
En la industria alimentaria, la composicin y estructura de los OS de la leche humana
no pueden ser reproducidas, y por lo tanto no estn disponibles comercialmente. Por ello se
emplea otro tipo de OS de origen animal y vegetal (como FOS y GOS) en la alimentacin
infantil, tratando de obtener los efectos potencialmente beneficiosos de los OS de la leche
humana (Rivero-Urgell y Santamaria-Orleans, 2001).
Algunas compaas tratan de imitar el patrn de colonizacin GI de los bebs
alimentados con lactancia materna mediante la adicin de lactobacilos y/o bifidobacterias a las
frmulas infantiles, mientras que otras tratan de imitar a la leche materna y aaden OS a la
frmula para obtener el mismo efecto que la leche materna tiene en la colonizacin GI durante
los primeros meses de vida (Vandenplas, 2002). Existen varios productos en el mercado que
contienen FOS y GOS en su composicin y se venden dentro del campo peditrico, como
frmulas infantiles de continuacin en el mercado japons y europeo o los alimentos infantiles
basados en los cereales (Rivero-Urgell y Santamaria-Orleans, 2001).
La adicin de bifidobacterias a la frmula infantil da lugar a una flora GI dominada por
bifidobacterias comparable a la de los bebs alimentados con leche materna (Pahwa y Mathur,
1987; Langhendries y col., 1995). Tambin cambian algunos aspectos tpicos de los bebs
alimentados con lactancia materna como el aspecto y pH de las heces (Pahwa y Mathur, 1987).
Las BAL se han empleado en el uso profilctico y teraputico contra la diarrea en bebs
prematuros (Millar y col., 1993), recin nacidos (Sepp y col., 1993) y nios (Saavadra y col.,
1994; Majamaa y col., 1995). Estas observaciones nos conducen a la conclusin de que la
teora probitica es vlida y que la flora GI puede ser manipulada aadiendo bifidobacterias a
las frmulas infantiles. Sin embargo, este concepto puede ser visto como poco fisiolgico ya
que las bifidobacterias no estn presentes en la leche humana. Otro aspecto desfavorable de
este concepto es que las bacterias necesitan ser administradas de forma viable, y por tanto
necesitan una serie de recomendaciones durante la preparacin de la frmula. Otra razn que
se nos imponen a la hora de realizar una cuidadosa seleccin de las cepas utilizadas es la de
evitar posibles daos colaterales como actividades metablicas perjudiciales, infecciones
sistmicas, efectos desfavorables sobre la inmunomodulacin y transferencia gnica (de genes
resistentes a antibiticos que estn codificados por plsmidos) (Ballabriga, 1998). A su favor se
debe decir que la adicin de probiticos a las frmulas ha mostrado un descenso en la

94
incidencia y severidad de los episodios de diarreas infecciosas, tales como las producidas por
rotavirus en los nios hospitalizados (Saavedra, 2000).
En el concepto prebitico, los OS (FOS y/o GOS) son aadidos a las frmulas, lo que
indica en principio un procedimiento ms fisiolgico y no se necesitan recomendaciones
especiales en la preparacin de las frmulas. Pero, por supuesto, los aspectos dinmicos del
contenido de OS de la leche de la madre no pueden ser imitados en la lactancia artificial. Se ha
demostrado que la adicin de OS (GOS+FOS) a la frmula infantil da lugar a un efecto similar
en la colonizacin GI, convirtindose las bifidobacterias en la flora predominante (Boehm y col.,
2002; Moro y col., 2002). El nmero absoluto de bifidobacterias y la proporcin de las mismas
en el porcentaje de microorganismos totales se incrementa con frmulas complementadas con
prebiticos (Boehm y col., 2002). Consecuentemente se ha observado que el nmero de
lactobacilos tambin se incrementa significativamente (Moro y col., 2002).
Tal y como se ha descrito en el apartado 7.3. de la presente seccin, hay suficientes
indicios para asegurar que los OS tienen la capacidad de descender los niveles de COL y el peso
corporal. Sin embargo, hasta ahora los efectos sobre el COL plasmtico no han sido evaluados
en nios mediante la adicin de los OS a frmulas infantiles. Por el contrario, y aunque los
datos de ganancia de peso son todava limitados, la ganancia de peso en nios alimentados con
frmula infantil con y sin OS parece similar. Debido a que los OS son compuestos que no se
encuentran de forma natural en los alimentos infantiles (excepto los OS de la leche materna),
resulta primordial evaluar que los aspectos de seguridad de los OS en las frmulas infantiles,
aunque estos ya hayan sido reconocidos de forma general como sustancias seguras
(Vandenplas, 2002).

95
MATERIAL Y MTODOS

1. DISEO EXPERIMENTAL

El desarrollo del trabajo experimental se llev a cabo en tres estudios, tal y como
muestra la Figura 8.
En el primer estudio del trabajo (zona en color azul de la Figura 8) se procedi a
evaluar el crecimiento in vitro de las especies de Bifidobacterium (Punto 2.2 de la presente
seccin), que con mayor frecuencia se aslan de las heces infantiles segn la bibliografa
cientfica, sobre diferentes hidratos de carbono constituidos por OND (Punto 2.3 de la presente
seccin) con el fin de seleccionar el substrato ms adecuado para ser incorporado a la dieta
evaluada en el tercer estudio.
En el segundo estudio (zona en color granate de la Figura 8) se seleccion una frmula
infantil comercial probitica con las mismas bifidobacterias seleccionadas en el estudio previo.
Se comprob la viabilidad de las bifidobacterias de la frmula infantil durante los periodos de
tiempo mnimo (seis das) y mximo (catorce das) en los que, segn las recomendaciones del
fabricante y dependiendo de la edad del lactante, se consumira la frmula. Tras comprobar la
estabilidad de los fermentos lcticos en dichos periodos, se realiz un estudio con dos grupos
de nios a los que se les administr una frmula infantil normal o la frmula infantil probitica
desde el 4 mes hasta el ao de edad. Fueron realizados recuentos microbiolgicos de la flora
anerobia fecal en los meses 1, 3, 5, 7, 9 y 12 con el fin de evaluar el efecto de la frmula
probitica sobre la flora fecal infantil.
En el tercer estudio (zona en color verde de la Figura 8), y a partir de los OS
seleccionado en el 1er estudio y las frmulas infantiles normal y probitica del segundo, se
elaboraron un total siete dietas. Los OS fueron aadidos a la concentracin de 1,2, 5 y 10% en
ambas frmulas infantiles dando lugar a tres dietas prebiticas y tres dietas simbiticas, ms la
dieta formada por la frmula probitica. La frmula infantil normal sin adicin de OS ni
bifidobacterias se emple como control, y por ltimo otra dieta de mantenimiento para ratas,
denominada AO4 se emple como referencia para comprobar el normal desarrollo de los
animales durante el periodo de ensayo. Todas las dietas fueron analizadas para determinar su
composicin nutricional y posteriormente se realiz un estudio in vivo con animales de
laboratorio con el fin de evaluar el efecto de los probiticos, prebiticos y simbiticos aadidos
en las frmulas infantiles sobre la absorcin intestinal mineral. Para ello fueron realizados los
siguientes estudios: balance mineral de Ca, Mg, P y Fe, estructura histolgica del ciego y colon,
contenido mineral en la fase slida y lquida de los contenidos del ciego y colon, contenido
mineral en el fmur y tibia; y contenido en bifidobacterias de las heces de las ratas tras 30 das
alimentadas exclusivamente con las nueve dietas empleadas (Figuras 14 y 15).

96
 BIFIDOBACTERIAS

OLIGOSACRIDOS
Bifidobacterium bifidum FOS cc
ESTUDIO IN VITRO
Bifidobacterium breve Inulina
Bifidobacterium infantis Oligofructosa
Bifidobacterium longum 4-GOS
Crecimiento bacteriano
Descenso pH

Bifidobacterias seleccionadas Oligosacridos seleccionados

1 er ESTUDIO

Frmula Frmula DIETA AO4 (DIETA 1)

infantil infantil
Frmula infantil (DIETA 2)
probitica
Frmula Probitica (DIETA 3)
Frmulas Prebiticas (DIETAS 4-6)
Frmulas Simbiticas (DIETAS 7-9)

ESTUDIO IN VITRO ESTUDIO IN VIVO

Evaluacin in vivo en ratas del ANLISIS
efecto de los probiticos, NUTRICIONAL
Viabilidad bifidobacterias Flora anaerobia fecal infantil
prebiticos y simbiticos sobre
la absorcin mineral (Ca, Mg, P Humedad
Recuento en placa (6 y 14 Total, bacteroides, Cenizas
y Fe)
das) bifidobacterias y clostridios Protena bruta
pH y humedad pH fecal Hidratos de carbono
Grasa bruta
Fibra diettica total
Minerales (Ca, Mg, P y Fe)
2 ESTUDIO 3 er ESTUDIO

Figura 8. Representacin grfica del diseo experimental del presente estudio de investigacin

97
2. MATERIALES

2.1. Alimentos problema

2.1.1. Frmulas infantiles

Para la realizacin del presente estudio se tomaron como base dos tipos de frmulas
infantiles comerciales, denominadas Leche 2 de continuacin y Leche 2 de continuacin
probitica, cuyo consumo est indicado a partir del 4 mes de edad y hasta los tres aos.
Ambas frmulas poseen el mismo procesado (Figura 9) y los mismos ingredientes (ver Tabla
14), diferencindose slo en que la leche de continuacin probitica posee los fermentos
lcticos Bifidobacterium bifidum y Bifidobacterium longum en su formulacin. Las bifidobacterias
son aadidas al producto final en una atmsfera protectora, rica en N2, para evitar la presencia
de O2 que provocara tanto una oxidacin del producto como una menor supervivencia de los
microorganismos. Las muestras empleadas en este estudio pertenecieron al mismo lote de
produccin fabricado por Hero Espaa S.A.
El Consejo de las Comunidades Europeas estableci en 1991 el cambio de nombre de
este tipo de alimentos infantiles, pasando la denominacin tradicional de frmula infantil de
continuacin a llamarse leche de continuacin. Sin embargo, y para evitar cualquier confusin y
simplificar la terminologa, hemos preferido continuar empleando el nombre de frmula infantil
en el del trabajo sin la especificacin de de continuacin, puesto que la frmula de inicio no
se ha empleado.

Tabla 14. Ingredientes de Leche 2 de continuacin y Leche 2 de continuacin probitica

Leche 2 Leche 2 continuacin
Ingredientes
continuacin probitica

Leche desnatada + +
Suero lcteo desmineralizado + +
Dextrinomaltosa + +
Aceites vegetales + +
Lactosa + +
Lecitina + +
Minerales (aadidos individualmente)* + +
Vitaminas (aadidas en forma de mix) + +
Fermentos lcticos (B. bifidum y B. longum) - +
Taurina + +
Inositol + +
Colina + +
Carnitina + +
*
El contenido mineral (expresado en mg/100 g) consta de: Fosfato bisdico 160 mg; Cloruro clcico 320 mg;
Citrato clcico 320 mg; Citrato potsico 840 mg; Sulfato de cinc 7,7 mg; Sulfato d e cobre 0,96 mg; Sulfato ferroso
42,88 mg; Yoduro potsico 0,04 mg; Hidrxido magnsico 33 mg; Cloruro de colina 80,4 mg.

98
 Concentrado Lactosa o
Leche Agua Dextrinomaltosa
Minerales de protenas Grasa
desnatada sricas
concentrada

Disolucin Depsito
en agua

Depsito
mezcla de ingredientes

Pasteurizacin (7072 C)

Homogeneizacin

Enfriamiento

Depsito Vitaminas

Concentracin

Pasteurizacin

Homogeneizacin

Secado

Dextrinomaltosa Bifidobacterias Filtrado

Llenado en Big-Bag de leche

Mezclado
Mezclado
Envasado

Envasado

Leche 2 continuacin Leche 2 continuacin

probitica

Figura 9. Diagrama de flujo de la elaboracin de Leche 2 de continuacin y Leche 2 de continuacin probitica

99
2.1.2. Dieta de mantenimiento para animales de laboratorio

Con el fin establecer un alimento de referencia con respecto a las frmulas infantiles
que se les administr a las ratas de laboratorio empleadas durante el estudio in vivo de los
efectos de los probiticos, prebiticos y simbiticos ensayados, un grupo de ratas fue
alimentado con una dieta de mantenimiento para ratas de laboratorio denominada A04.

2.2. Bifidobacterias

Las bifidobacterias empleadas en la evaluacin in vitro de la utilizacin de los diferentes

OND, as como de las entidades suministradoras aparecen recogidas en la siguiente Tabla:

Tabla 15. Bifidobacterias utilizadas para la evaluacin de diferentes oligosacridos

Fuente de suministro Especie de Bifidobacteria

Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT)
CECT 4549 Bifidobacterium bifidum
CECT 4839T Bifidobacterium breve
CECT 4551T Bifidobacterium infantis
Morinaga Nutritional Foods (Deutschland GmbH)
BB536 Bifidobacterium longum

2.3. Oligosacridos no digeribles (OND)

En la Tabla 16 y Figura 10 se muestran los diferentes OND (composicin y estructura

qumica) utilizados como substratos para el crecimiento in vitro de las bifidobacterias.

Tabla 16. Substratos utilizados para el crecimiento de las bifidobacterias

Substrato Producto Composicin

Monosacrido Glucosa D(+)glucosa

FOS* Actilight 950P

GF2 (30,38%), GF3 (50,18%), GF4 (15,69%), glucosa, fructosa
y sacarosa
Raftiline HP inulina (>99,5%), glucosa, fructosa y sacarosa
Raftilose P95 oligofructosa (>93,2%), glucosa, fructosa y sacarosa

GOS* Oligomate 55P 4-galactosil-lactosa (>55%), lactosa y monosacridos (<45%)

*
FOS, fructooligosacridos; GOS, galactooligosacridos

GF 2, kestosa; GF3, nistosa; GF 4, fructosil-nistosa

Para simplificar la nomenclatura de los OS utilizados, puesto que el producto Actilight

950P est compuesto por la mezcla de tres FOS (kestosa, nistosa y fructosil-nistosa), a partir
de ahora nos referiremos a l como FOS de cadena corta (FOS cc). En el caso de los GOS,
como el producto mayoritario es la 4-galatosil-lactosa nos referiremos a l como 4-GOS.

100
 -1

FOS cc (GFn) Inulina Oligofructosa 4-galactosil-lactosa

n=2 Kestosa n=10-60 n=2-10 (4-GOS)
n=3 Nistosa
n=4 Fructosil-nistosa

Figura 10. Estructura qumica de los componentes mayoritarios de los OND utilizados para el
crecimiento selectivo de las bifidobacterias

101
3. METODOLOGA EXPERIMENTAL Y ANALTICA

1er ESTUDIO

3.1. Evaluacin in vitro del crecimiento de bifidobacterias y del cambio de pH del

medio de cultivo, en presencia de diferentes oligosacridos (OS)

Reactivos utilizados

* Caldo TPY (g/L):

10,0 Triptona (Oxoid, Hampshire, Inglaterra)
5,0 Peptona de soja (Merck, Darmstadt, Alemania)
5,0 Glucosa (C6 H12O6) (Merck, Darmstadt, Alemania)
2,5 Extracto de levadura (Oxoid, Hampshire, Inglaterra)
1,0 Tween 80 (Merck, Darmstadt, Alemania)
0,5 L-cistena hidrocloruro (C3 H8ClNO2S) (Merck, Darmstadt, Alemania)
2,0 di-Potasio hidrgenofosfato (K2 HPO4) (Merck, Darmstadt, Alemania)
0,5 Cloruro de magnesio hexahidratado (Cl2Mg.6H2O) (Merck, Darmstadt,
Alemania)
0,5 Sulfato de cinc heptahidratado (ZnSO4.7H2O) (Merck, Darmstadt, Alemania)
0,15 Cloruro clcico (CaCl2) (Merck, Darmstadt, Alemania)

* FOS de cadena corta (Actilight 950P) (Beghin-Meiji Industries, Francia)

* GOS (Oligomate 55P) (Yakult Pharmaceutical Industry Co., LTD., Japn)
* Inulina (Raftiline HP) (Orafti, Blgica)
* Oligofructosa (Raftilose P95) (Orafti, Blgica)
* cido sulfrico 1% (v/v) (H2SO4) (Merck, Darmstadt, Alemania)
* Cloruro de bario 1% (v/v) (BaCl2) (Merck, Darmstadt, Alemania)

Material y equipo utilizados

* Agitador de tubos modelo REAX 2000 (Heidolph, Schwabach, Alemania)

* Autoclave Sterilav-S 75 (Reypa, Barcelona, Espaa)
* Bolsa generadora de gas (CO2 + H2) Anaerogen AN 35 (Oxoid, Hampshire, Inglaterra)
* Bomba de vaco (Barna-Vaco, Barcelona, Espaa)
* Cubetas de poliestireno para espectrofotmetro (Kartell, Noviglio, Italy)
* Espectrofotmetro de absorcin molecular modelo U-2000 (Hitachi, Tokio, Japn)
* Estufa Incubac 2000 (P-Selecta, Barcelona, Espaa)

102
 * Indicador anaerbico BR 55 (Oxoid, Hampshire, Inglaterra)
* Jarra de anaerobiosis HP 11 (Oxoid, Hampshire, Inglaterra)
* Tubos de ensayo de cristal de 20 mL de capacidad (Pobel, Madrid, Espaa)
* pH-metro micro pH 2000 (Crison, Barcelona, Espaa)

Preparacin de las soluciones

Caldo TPY: se mezclaron todos los ingredientes y posteriormente se esteriliz en

autoclave durante 15 min a 121 C. Cuando el caldo TPY se empleo como medio de
cultivo para las bifidobacterias durante siete das, tanto los OS como la glucosa se
aadieron a la concentracin de 12 g/L.

Procedimiento

Las bifidobacterias empleadas en el presente estudio (Tabla 15) fueron adquiridas

liofilizadas y fueron almacenadas en refrigeracin (5 C) hasta el momento de su utilizacin.
Para su revivificacin cada cultivo se rehidrat en caldo TPY (Tryptone Phytone Yeast)
(Scardovi, 1986) mediante dos transferencias sucesivas de 24 h (Gomez Zavaglia y col., 1998) a
37 oC bajo condiciones de anaerobiosis. Posteriormente el cultivo rehidratado se inocul al 5%
de nuevo en caldo TPY y se incub en las mismas condiciones descritas anteriormente. El
cultivo entonces se monitoriz visualmente cada 4 h tras 16 h de incubacin (Dubey y Mistry,
1996), evaluando el grado de turbidez (densidad ptica, DO) del cultivo a una longitud de onda
de 600 nm (Gomez Zavaglia y col., 1998; Perrin y col., 2001; Crittenden y col., 2001) en un
espectrofotmetro de absorcin molecular hasta obtener un valor de 2 en la escala MacFarland
(Figura 11). Esta medida equivale a una absorbancia de 0,615 y se corresponde con un
crecimiento de 6x108 ufc/mL. Para la realizacin de la escala MacFarland, se calibraron 7
patrones de turbidez. stos consistieron en una serie de tubos que contenan BaCl2 al 1% y
cantidades crecientes de H2SO4 al 1%, dando origen a un precipitado de BaSO4 origen de la
turbidez, tal y como se muestra en la Tabla 17.

Tabla 17. Preparacin e interpretacin de la escala de MacFarland

Escala BaCl2 H2SO4 ufc/mL
DO
MacFarland 1% 1% x108
0,5 0,05 * 9,95 * 1,5 0,116
1 0,1 9,9 3 0,351
2 0,2 9,8 6 0,615
3 0,3 9,7 9 0,996
4 0,4 9,6 12 1,205
5 0,5 9,5 15 1,256
6 0,6 9,4 18 1,667
*
Volumen en mL

103
 Para las cepas bacterianas se estableci una equivalencia entre la turbidez de cada tubo
y la concentracin de bacterias (en ufc/mL) que genera una turbidez similar.
Una vez alcanzada dicha concentracin (6x108 ufc/mL), se aadi un inculo al 1%
(v/v) de cada una de las bifidobacterias a 4 tubos con tapn de rosca que contenan caldo TPY,
cada uno con un substrato diferente (Tabla 19) a una concentracin de 1,2% (p/v). Los tubos
se incubaron en anaerobiosis a 37 C durante siete das. Se tom una muestra aspticamente
en tiempo 0 y cada 24 h, y tras agitar la muestra en un vortex se transfiri a una cubeta con el
fin de medir la turbidez (DO del cultivo) de la misma manera que anteriormente fue descrita,
expresando el crecimiento bacteriano como log decimal de las ufc. Como blanco se emple un
tubo con caldo TPY sin inculo para cada uno de los cuatro substratos.
As mismo, se tom otra muestra para registrar la variacin del pH del medio de cultivo,
medido igualmente cada 24 h con un pH-metro micro pH 2000 (Crison, Barcelona, Espaa).
Como substrato control frente a los cuatro OS se emple la glucosa que contena el caldo TPY,
utilizndose nicamente como referencia y como comparacin con el resto de hidratos de
carbono, ya que su valor no nos interesa desde el punto de vista funcional, puesto que al
contrario que los OS, la glucosa es absorbida en el intestino delgado y no llega como fuente de
energa para las bacterias del colon.

1,8

1,6

1,4

1,2
Densidad ptica

0,8

0,6

0,4

0,2

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
ufc/mL

Figura 11. Representacin de la recta de calibrado para la escala MacFarland

El contenido en microorganismos en los medios de cultivo se determin a partir de la

siguiente ecuacin, obtenida de la recta patrn:

Concentracin ufc/mL y = 0,0901x + 0,049 R2 = 0,9785

104
2 ESTUDIO

3.2. Evaluacin del grado de viabilidad de las bifidobacterias en las frmulas

infantiles

Reactivos utilizados

* cido nalidxico (C12 H12N2O3) (Sigma, St. Louis, U.S.A.)

* Agar TPY (Scharlau, Barcelona, Espaa)
* Agua de peptona tamponada (Oxoid, Hampshire, Inglaterra)
* Cloruro de litio (LiCl) (Merck, Darmstdat, Alemania)
* Fosfato disdico anhidro (Na 2 HPO4) (Probus, Barcelona, Espaa)
* Fosfato monosdico dihidrogeno anhidro (NaH2PO4) (Probus, Barcelona, Espaa)
* Sulfato de neomicina (C23H46N6 O13.3H2SO4) (734 g de neomicina por mg) (Sigma, St.
Louis, U.S.A.)
* Tween 80 (Merck, Darmstadt, Alemania)

Preparacin de soluciones

Tampn fosfato 0,1 M, pH 7,0: se disolvieron 1,75 g de Na 2HPO4 y 10,52 g de NaH2PO4

en 1 L de diluyente. Se ajust el pH a 7,0.
Solucin antibitica (NNL): se disolvieron 3 g/L de cloruro de litio, 0,1 g/L de sulfato de
neomicina y 0,015 g/L cido nalidxico en agua destilada y aadieron en forma de
solucin esterilizada por filtracin al medio de cultivo tras su esterilizacin en
autoclave.
Medio de cultivo TPY: Se suspendieron 51 g de polvo agar TPY en 1 L de agua destilada
que contena 1 mL de Tween 80. Posteriormente se esteriliz en autoclave durante 15
min a 121 C y tras atemperar, se aadi estrilmente la solucin antibitica.

Material y equipo utilizados

* Agitador de tubos modelo REAX 2000 (Heidolph, Schwabach, Alemania)

* Autoclave Sterilav-S 75 (Reypa, Barcelona, Espaa)
* Balanza de precisin modelo ER-180A (Salter, Tokio, Japn)
* Bolsa generadora de gas (CO2 + H2) Anaerogen AN 35 (Oxoid, Hampshire, Inglaterra)
* Bomba de vaco Tipo 019 de Barna-Vaco S.A. (Barcelona, Espaa)
* Cabina de flujo laminar vertical (Telstar, Tarrasa, Espaa)
* Contador de colonias digital (Bioser, Barcelona, Espaa)

105
 * Embudo con placa filtrante y esmerilado, vidrio borosilicato Pyrex de 35 mm de
dimetro (Afora, Barcelona, Espaa)
* Estufa de desecacin (aire forzado) modelo 201 (P-Selecta, Barcelona, Espaa)
* Estufa Incubac 2000 (P-Selecta, Barcelona, Espaa)
* Filtros de membrana estriles de nitrato de celulosa de 47 mm de dimetro y 0,22 m
de poro (Whatman, Maidstone, Kent, Inglaterra)
* Frascos Pyrex de 100 mL de capacidad (Afora, Barcelona, Espaa)
* Indicador anaerbico BR 55 (Oxoid, Hampshire, Inglaterra)
* Jarra de anaerobiosis HP 11 (Oxoid, Hampshire, Inglaterra)
* Matraz Kitasato de vidrio borosilicato Pyrex de 250 mL de capacidad Pyrex (Afora,
Barcelona, Espaa)
* Placas de petri (Sterilin, Inglaterra)
* Portafiltros SolVac de polipropileno de 47 mm de dimetro (Pall, Missouri, U.S.A.)

Procedimiento

Se evalu la viabilidad de las bifidobacterias aadidas a la frmula infantil probitica

utilizando como control la frmula infantil Leche de continuacin, que se diferencia nicamente
de la anterior en la ausencia de bifidobacterias en su composicin. Con el fin de simular las
condiciones de empleo de la frmula infantil, el estudio se ha diseado de acuerdo a la pauta
de administracin referida por el fabricante. Para ello teniendo en cuenta que para cada edad
est indicada un nmero de tomas diarias, que cada medida son aproximadamente 4 g y que el
envase tiene 900 g, se pueden disear cuatro estudios de duracin diferente tal y como
muestra la Tabla 18. De todos ellos fueron realizados los de seis y catorce das de duracin, ya
que abarcan los periodos de administracin mnima y mxima. De la cantidad total de g de
frmula infantil que deba ser consumida por el nio diariamente, se tomaron 10 g para el
anlisis que fueron diluidos en 90 mL de tampn fosfato 0,1 M (Macfarlane y Englyst, 1986;
Ingham, 1999) y mantenidos a 22 C durante 30 min hasta la dispersin de la muestra.
Posteriormente se tom un volumen para realizar las diluciones decimales necesarias (10-1-10-6)
con agua de peptona 0,1% (p/v), y se sembr 1 mL en masa sobre agar TPY + NNL (Moreno y
col., 2000) por duplicado. Tambin fue tomada otra muestra de la solucin madre (10 g de
frmula ms 90 mL de agua de peptona) para medir el pH de la frmula infantil durante los
das de estudio. Las placas fueron incubadas a 37 C en anaerobiosis durante 72 h. As mismo,
se determin la humedad de las muestras, tal y como se indica en el punto 3.5.1. de la
presente seccin, nada ms ser retiradas stas del envase. Los anlisis realizados tanto en la
frmula control como en la frmula probitica fueron realizados en tres botes para cada tipo de
frmula pertenecientes al mismo lote de produccin.

106
 Tabla 18. Diseo del estudio de la viabilidad de las bifidobacterias aadidas a las frmulas infantiles
en funcin de la pauta de administracin indicada por el fabricante
Edad del nio Pauta de administracin Duracin
4 mes 4 g x 7 medidas x 5 tomas diarias = 140 g/da 6 das
5-6 mes 4 g x 8 medidas x 4 tomas diarias = 128 g/da 7 das
7-9 mes 4 g x 8 medidas x 3 tomas diarias = 96 g/da 9 das
10-9 mes y 1-3 aos 4 g x 8 medidas x 2 tomas diarias = 64 g/da 14 das

Finalmente, se obtuvo el porcentaje de viabilidad de las bacterias estudiadas aplicando

el siguiente clculo (Shin y col., 2000a):

ufc t1
Viabilidad (%) = x 100
ufc t0

donde to es el da comienzo del estudio, y t1 es el da de finalizacin del estudio.

3.3. Composicin de la flora fecal de bebs alimentados con frmula infantil

probitica

Reactivos utilizados

* Agar Bacteroides Bile Esculin (BBE) (g/L):

40,0 Trypticase soy agar (BBL, Kansas city, U.S.A.)
20,0 Bilis de bovino (Ox gall powder) (Sigma, St. Louis, U.S.A.)
1,0 Esculina (C15H16O9.1,5H2O) (Merck, Darmstadt, Alemania)
0,5 Citrato de amonio y hierro (III) (NH4Fe(C6 H5O7)) (Merck, Darmstadt,
Alemania)
2,0 mL/L Solucin de Hemin (5 mg/mL) (Merck, Darmstadt, Alemania)
2,5 mL/L Solucin de Gentamicina (40 mg/mL) (Sigma, St. Louis, U.S.A.)
* Agar Columbia sangre (CBA) (g/L):
39,0 Agar Columbia (base) (Merck, Darmstadt, Alemania)
Sangre desfibrinada de oveja (Oxoid, Hampshire, Inglaterra).
* Agar Triptosa-Sulfito-Cicloserina (TSC) (g/L):
42,0 Agar Triptosa-Sulfito-Cicloserina (base) (Merck, Darmstadt, Alemania)
3,0 mg/L Sulfato de polimixina (C55 H96 H16O13 2H2SO4) (Sigma, St. Louis, U.S.A.)
12,0 mg/L Sulfato de kanamicina (C18 H36N4O11 H2SO4) (Sigma, St. Louis, U.S.A.)
* Agua de peptona tamponada + 0,5% glucosa (p/v) (APTG) (g/L):
20,0 Agua de peptona tamponada (Merck, Darmstadt, Alemania)
5,0 D(+)-Glucosa (C6H12O6) (Merck, Darmstadt, Alemania)
* Medio Rafinosa Bifidobacterium (RB) (g/L):

107
 18,0 Agar bacteriolgico No.1 (Merck, Darmstadt, Alemania)
7,5 D(+) Rafinosa (Merck, Darmstadt, Alemania)
5,0 Caseinato de sodio (Sigma, St. Louis, U.S.A.)
5,0 Extracto de levadura (Oxoid, Hampshire, Inglaterra)
3,0 Cloruro de litio (LiCl) (Merck, Darmstdat, Alemania)
15,0 Tioglicolato de sodio (C2H3 NaO2S) (Merck, Darmstdat, Alemania)
0,5 L-Cistena (C3H7 NO2S) (Merck, Darmstdat, Alemania)
15,0 mL/L Prpura bromocresol 1% (p/v) (Merck, Darmstdat, Alemania)
40,0 mL/L Solucin salina (g/L):
0,2 Magnesio sulfato (MgSO4) (Merck, Darmstdat, Alemania)
0,2 Cloruro de calcio (CaCl2) (Merck, Darmstdat, Alemania)
1,0 Fosfato de potasio monobsico (K2 HPO4) (Merck, Darmstdat, Alemania)
1,0 Fosfato de potasio dibsico (KH2 PO4) (Merck, Darmstdat, Alemania)
10,0 Bicarbonato sdico (NaHCO3) (Merck, Darmstdat, Alemania)
2,0 Cloruro sdico (NaCl) (Merck, Darmstdat, Alemania)
* Solucin de peptona fisiolgica reducida (RPS) (g/L):
8,5 Cloruro sdico (NaCl) (Merck, Darmstadt, Alemania)
1,0 Peptona bacteriolgica neutralizada (Merck, Darmstadt, Alemania)
0,5 L-cistena hidrocloruro (C3 H8ClNO2S) (Merck, Darmstadt, Alemania)
* Tincin de Gram:
Solucin Cristal violeta 1% (p/v) (Merck, Darmstadt, Alemania)
Solucin Safranina 0,5% (p/v) (Merck, Darmstadt, Alemania)
Lugol (Merck, Darmstadt, Alemania)
Alcohol 95%
* Galera api 50 CH (Biomerieux, Francia)
Parafina lquida fluida (Merck, Darmstadt, Alemania)
Medio api 50 CHL (ampollas de 10 mL) (g/L):
10,0 Polipeptona
5,0 Extracto de levadura
0,2 Sulfato magnesio 7 H2O
0,05 Sulfato manganeso 4 H2 O
1,0 mL Tween 80
3,6 L-arginina cloruro monohidrato
2,0 Citrato diamonio
5,0 Acetato sdico 3 H2O
2,0 Fosfato dipotsico
0,17 Prpura bromocresol

108
 Preparacin de medios y soluciones

BBE: se mezclaron todos los ingredientes y se ajust a pH 7,00,1 posteriormente se

esteriliz a 121 oC durante 15 min. La solucin de hemin (5 mg/mL) se prepar con
0,5 g Hemin (bovino) y 10 mL NaOH 1 N en 90 mL de agua destilada, y se aadi
junto al resto de ingredientes antes de ajustar el pH.
CBA: se esteriliz a 121 oC durante 15 min y despus se dej enfriar hasta 50 oC, para
aadir un 5% de sangre desfibrinada previamente atemperada a 50 oC.
APTG: fueron esterilizados a 121 oC durante 15 min.
RB: se ajust a pH 6,70,1 y despus se esteriliz a 121 oC durante 15 min.
RPS: se ajust a pH 6,70,1 y despus se esteriliz a 121 oC durante 15 min.
TSC: despus de esterilizar a 121 C durante 15 min, se dej enfriar a 50 oC y se
aadieron estrilmente los antibiticos.

Material y equipo utilizados

* Agitador de tubos modelo REAX 2000 (Heidolph, Schwabach, Alemania)

* Autoclave Sterilav-S 75 (Reypa, Barcelona, Espaa)
* Balanza de precisin modelo ER-180A (Salter, Tokio, Japn)
* Botella de gas (CO2 + H2 + N2)
* Cabina de anaerobiosis (Departamento de Microbiologa alimentaria, Universidad de
Wageningen, Holanda)
* Cabina de flujo laminar vertical (Telstar, Tarrasa, Espaa)
* Contador de colonias digital (Bioser, Barcelona, Espaa)
* Estufa Incubac 2000 (P-Selecta, Barcelona, Espaa)
* Filtros de membrana estriles de nitrato de celulosa de 30 mm de dimetro y 0,22 m
de poro (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania)
* Jarra de anaerobiosis HP 11 (Oxoid, Hampshire, Inglaterra)
* Microscopio de contraste de fase (Olympus America Inc, Melville, U.S.A.)
* pHmetro micro pH 2000 (Crison, Barcelona, Espaa)
* Placas de petri (Sterilin, Inglaterra)
* Recipientes de plstico estriles de 100 mL de capacidad (Deltalab, Moirans, Francia)

Procedimiento

El presente estudio consisti en determinar si la composicin de la microflora fecal

infantil se vea afectada por el consumo de una frmula infantil probitica (con Bifidobacterium
spp.) durante el primer ao de vida. Para ello fueron tomadas muestras fecales a la edad de 1,

109
3, 5, 7, 9 y 12 meses a cinco bebs. Dos de ellos actuaron como control, ya que estuvieron
alimentados con la Leche 2 de continuacin, empleada como base para elaborar la frmula
infantil probitica que se administr a los otros tres bebs. Las muestras fueron recogidas por
los padres en recipientes estriles e inmediatamente congeladas a 20 oC hasta su anlisis. Los
bebs fueron los hijos/as de miembros del rea de Nutricin y Bromatologa de la Universidad
de Murcia. Los padres fueron informados del estudio y firmaron la hoja de consentimiento
informado conforme a la ley de proteccin de datos (Ley Orgnica 15/1999, de 13 de
diciembre, de Proteccin de Datos de Carcter Personal) tal y como se muestra a continuacin:

HOJA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO

TITULO DEL ENSAYO CLNICO

COMPOSICIN DE LA FLORA FECAL DE BEBS A LIMENTADOS CON FRMULA INFANTIL PROBITICA

Yo (nombre y apellidos) .............................................

He ledo la hoja de informacin que se me ha entregado.
He sido informado sobre el estudio y he podido hacer preguntas sobre el mismo.
He recibido suficiente informacin sobre el estudio.
He hablado con (nombre del investigador) ...........................................................
Comprendo que podr ser informado si lo deseo de los anlisis y medidas que se practiquen a mi hijo/a.
Comprendo que podr ser informado si lo deseo de los resultados de este estudio.
Comprendo que la participacin es voluntaria y que puedo retirar a mi hijo/a del estudio:
Cuando quiera
Sin tener que dar explicaciones

Acepto que los datos registrados con ocasin de este estudio pueden ser objeto de un tratamiento
informtico. Solamente autorizo su consulta a las personas que colaboran en el estudio sujetas al secreto
profesional o a los representantes de las autoridades sanitarias.
Expreso libremente mi conformidad a que mi hijo/a participe en el estudio.

Fecha
Nombre de los padres y del participante (maysculas)

Firma de los padres del participante

En la Tabla 19 se resume el perfil de alimentacin de los bebs empleados en el

presente estudio.

Tabla 19. Alimentacin de los bebs participantes en el estudio de la flora fecal infantil durante el primer
ao de vida
Tipo de frmula 1 mes 3 meses 5 meses 7 meses 9 meses 12 meses
Control (beb 1) LM FI1 FI2+CI FI2+CI+B FI2+CI+B FI2+CI+B
Control (beb 2) LM+FI1 FI1+CI FI2+CI FI2+CI+B FI2+CI+B FI2+CI+B
Probitica (beb 3) LM+FI1 FI1 FIP+CI FIP+CI+B FIP+CI+B FIP+CI+B
Probitica (beb 4) LM+FI1 LM+FI1 FIP FIP+CI+B FIP+CI+B FIP+CI+B
Probitica (beb 5) LM FI1 FIP+CI FIP+CI+B FIP+CI+B FIP+CI+B
LM (Leche Materna), FI1/FI2 (Frmula Infantil 1 2), FIP (Frmula Infantil Probitica 2), CI (Cereales Infantiles), B
(Beikosts: fruta + vegetales + carne + pescado)

110
 El pH fecal se determin tras hacer una suspensin fecal al 10% en NaCl 0,15 M y el pH
se midi con un pHmetro tras homogeneizar la suspensin en un vortex (La nghendries y col.,
1995). Para el anlisis de la composicin de la flora fecal se tomaron aproximadamente 3 g de
muestra fecal, que fue diluida en 25 mL de agua de peptona tamponada con 0,5% de glucosa
(APTG), dejndose las muestras durante 2 h antes de realizar los anlisis con el fin de
recuperar el mayor nmero de microorganismos posible. Tras este tiempo se hicieron las
diluciones seriadas necesarias con solucin de peptona fisiolgica reducida (RPS), tomando 1
mL de muestra y homogeneizndola con 9 mL de RPS. Una alcuota de 0,3 mL fue sembrada en
las placas de petri con el fin de cultivar los microorganismos (ver condiciones en la Tabla 20).
Todos los anlisis se realizaron bajo estrictas condiciones de anaerobiosis usando una
atmsfera compuesta por 80% N2, 10% CO2, 10% H2, y fueron incubadas en jarras
anaerbicas.

Tabla 20. Condiciones de cultivo de los microorganismos investigados de la flora fecal infantil
Medio de Temp. y tiempo
Bacteria Diluciones Referencias
cultivo * incubacin
-4 -7
Anaerobios totales CBA 10 a 10 37 oC/48 h Langhendries y col., 1995
Bacteroides BBE 10 -4 a 10 -6 37 oC/48 h Summanen y col., 1993
Bifidobacterias RB 10 -4 a 10 -6 37 oC/72 h Hartemink y Rombouts, 1999
Clostridios TSC 10 -2 a 10 -4 37 oC/48 h Neut y col., 1985b
*
Columbia blood agar (CBA), Bacteroides bile esculine agar (BBE), Raffinose Bifidobacterium medium (RB), Tryptose
sulfite cycloserine (TSC)

Tras el tiempo de incubacin descrito para cada bacteria, stas fueron contadas y el
resultado se expres como log decimal de las ufc por g de muestra. En el caso de las
bifidobacterias, se tomaron algunas colonias para ser aisladas en medio de cultivo rafinosa
bifidobacterium (RB) agar durante 48 h en condiciones de anaerobiosis. Tras este tiempo las
colonias fueron testadas para:

1. Tincin de Gram. Se realiz siguiendo el protocolo estndar de tincin de Gram con

los reactivos anteriormente descritos.
2. Morfologa de la colonia al microscopio. Visualizacin de la colonia previamente
teida con el objetivo x40 y x100 (objetivo de inmersin).
3. Patrn de fermentacin de hidratos de carbono. Fue determinado con la galera
enzimtica api 50 CH.

Cada test api 50 CH consta de cincuenta pocillos que contienen una zona anaerobia (la
porcin en forma de tubo) para el estudio de fermentacin, y una zona aerobia (la porcin en
forma de cpula) para el estudio de oxidacin o asimilacin. El primer pocillo no contiene
ningn substrato y se usa como control negativo. El resto de pocillos contienen una cantidad

111
 determinada de substrato deshidrata do, pertenecientes a la familia de hidratos de carbono y
sus derivados (hetersidos, polialcoholes, cidos urnicos).

Estos substratos pueden ser metabolizados mediante diferentes rutas bioqumicas:

Asimilacin: se indica por el crecimiento del microorganismo en la cpula cuando el

substrato es la nica fuente de carbono presente.
Oxidacin: se muestra por un cambio de color en la cpula, y es debido a la
produccin aerobia de cido detectado por el indicador de pH incluido en el medio
elegido.
Fermentacin: se muestra por un cambio de color en el tubo, y es debido a la
produccin anaerobia de cido detectado por el indicador de pH incluido en el
medio elegido.

Para evaluar la ltima de estas rutas (fermentacin) se us la galera api 50 CH. La

composicin de cada test se muestra en la Tabla 21.

Tabla 21. Substratos incluidos en cada uno de los 50 pocillos de la galera enzimtica para bacterias cido-lcticas
api 50 CH

Tira 0-9 Tira 10-19 Tira 20-29 Tira 30-39 Tira 40-49
Pocillo/substrato Pocillo/substrato Pocillo/substrato Pocillo/substrato Pocillo/substrato
0. CONTROL* 10. GALactose 20. 1-Methyl-D-Mannoside 30. MELibiose 40. D-TURanose
1. GLYcerol 11. GLUcose 21. 1-Methyl-D-Glucoside 31. Sucrose 41. D-LYXose
2. ERYthrol 12. FRUctose 22. N-Acetyl-Glucosamine 32. TREhalose 42. D-TAGatose
3. D-ARAbinose 13. MaNosE 23. AMYgdaline 33. INUlin 43. D-FUCose
4. L-ARAbinose 14. SorBosE 24. ARButin 34. MeLeZitose 44. L-FUCose
5. RIBose 15. RHAmnose 25. ESCulin 35. RAFfinose 45. D-ARabitol
6. D-XYLose 16. DULcitol 26. SALicin 36. Starch 46. L-ARabitol
7. L-XYLose 17. INOsitol 27. CELlobiose 37. GLYcoGen 47. GlucoNaTe
8. ADOnitol 18. MANitol 28. MALtose 38. XyLiTol 48. 2-Keto-Gluconate
9. -Methyl-D-Xyloside 19. SORbitol 29. LACtose 39. GENtiobiose 49. 5-Keto-Gluconate

*
En la prctica, slo se usan las abreviaturas en maysculas de los respectivos hidratos de carbono.

Para la realizacin del api test se tom una colonia, tras haber sido aislada durante 48 h
o
de incubacin a 37 C en anaerobiosis, y se inocul en el medio api 50 CHL, pipetendose
entonces en los diferentes pocillos (en la parte del tubo). Posteriormente, se rellenaron las
cpulas con parafina fluida para mantener las condiciones anaerobias para la fermentacin, y
as se incubaron las tiras a 37 oC durante 48 h. Todo lo descrito anteriormente se realiz bajo
condiciones anaerobicas dentro de una campana de anaerobiosis.

112
 Para la interpretacin de los resultados los pocillos que aparecieron sin cambio de color
(prpura) se consideraron como negativos y aquellos dnde se detect un cambio de color
(amarillo, negro en el pocillo n 25) (de acuerdo con el color del control) se consider
positivo (ver Figura 12).

Figura 12. Galera enzimtica (metabolismo de

hidratos de carbono) api 50 CH para bacterias
cido-lcticas

113
3er ESTUDIO

3.4. Anlisis nutricional de las dietas empleadas en el presente estudio

Para el presente estudio se utilizaron un total de nueve dietas, siendo la primera de

ellas una dieta de mantenimiento (A04) para ratas de laboratorio, proporcionada por el
animalario de la Universidad de Murcia. Las ocho dietas restantes fueron elaboradas a partir de
las frmulas infantiles Leche 2 de continuacin y Leche 2 de continuacin probitica, cada una
compuesta por la homogeneizacin de cuatro envases pertenecientes al mismo lote de
produccin. El primer estudio nos permiti la seleccin de dos especies de bifidobacterias: B.
bifidum y B. longum (en base a su crecimiento y capacidad de reducir el pH del medio) y un
substrato: 4-GOS (por su capacidad para estimular el crecimiento de las bifidobacterias). La
Tabla 22 representa la combinacin de estos probiticos (bifidobacterias) y prebiticos (4-GOS,
a concentraciones de 1,2, 5 y 10%) para elaborar las dietas empleadas en el estudio.

Tabla 22. Dietas empleadas en el estudio in vivo con ratas del efecto de los probiticos, prebiticos y
simbiticos en frmulas infantiles sobre la absorcin mineral
Grupo Dietas Composicin dietas
1 A04 Dieta de mantenimiento A04
2 Control Leche 2 de continuacin
3 Probitica Leche 2 de continuacin + bifidobacterias
4 Prebitica 1,2% Leche 2 de continuacin + 4-GOS (1,2%)
5 Prebitica 5% Leche 2 de continuacin + 4-GOS (5%)
6 Prebitica 10% Leche 2 de continuacin + 4-GOS (10%)
7 Simbitica 1,2% Leche 2 de continuacin + bifidobacterias + 4-GOS (1,2%)
8 Simbitica 5% Leche 2 de continuacin + bifidobacterias + 4-GOS (5%)
9 Simbitica 10% Leche 2 de continuacin + bifidobacterias + 4-GOS (10%)

3.4.1. Determinacin de la humedad

Para la determinacin de la humedad en las frmulas infantiles se utiliz el mtodo

934.01 de la A.O.A.C. (1999).

Material y equipo utilizados

Balanza de precisin modelo ER-180A (Salter, Tokio, Japn)

Estufa de desecacin (aire forzado) modelo 201 (P-Selecta, Barcelona, Espaa)
Placas de petri de vidrio (Pobel, Madrid, Espaa)

114
 Procedimiento

Las muestras fueron desecadas durante 20 h a 110 C, en una estufa de aire forzado,
hasta obtener peso constante. La prdida de peso se calcul en porcentaje del peso de la
muestra. Para el clculo de la humedad se utiliz la siguiente ecuacin:

M1 - M2
Humedad (%) = x 100
M1 - M0

donde M0 es el peso (g) de la placa y de su tapadera, M1 es el peso (g) de la placa y de su

tapadera y de la muestra fresca y M2 es el peso (g) de la placa y de su tapadera y de la

muestra desecada.

3.4.2. Determinacin de la protena bruta

Para la determinacin de la protena bruta se ha seguido el procedimiento de

micro- Kjeldahl, mtodo 991.20 de la A.O.A.C. (1999).

Reactivos utilizados

cido brico (H3 BO3) (Panreac, Barcelona, Espaa)

cido clorhdrico (HCl) 0,1 N (Merck, Darmstadt, Alemania)
cido sulfrico puro (H2SO4) (Merck, Darmstadt, Alemania)
Alcohol etlico (CH3-CH2OH) 96% (v/v) (Panreac, Barcelona, Espaa)
Azul de metileno (C16H18ClN3S .2-3H2O) (Panreac, Barcelona, Espaa)
Hidrxido sdico (NaOH) 38% (v/v) (Panreac, Barcelona, Espaa)
Rojo de metilo (C15H15N3 O2) (Panreac, Barcelona, Espaa)
Selenio (Panreac, Barcelona, Espaa)
Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O) (Panreac, Barcelona, Espaa)
Sulfato potsico (K2SO4) (Panreac, Barcelona, Espaa)
Verde de bromocresol (C21 H14Br4O5S) (Panreac, Barcelona, Espaa)

Preparacin de soluciones

Mezcla cataltica: esta mezcla fue preparada con los siguientes reactivos: selenio,
sulfato de cobre pentahidratado y sulfato potsico (Se/CuSO4.5H2 O/K2SO4) en una
proporcin 1/1,25/14,42 (p/p/p), respectivamente.

115
 Solucin de indicador mixto (4%): esta solucin fue preparada disolviendo 2 g de rojo
de metilo y 1 g de azul de metileno en 1 L de alcohol etlico 96%.

Material y equipo utilizados

Balanza de precisin modelo ER-180A (Salter, Tokio, Japn)

Bureta de cristal (Pobel, Madrid, Espaa)
Matraces erlenmeyer de 250 mL de capacidad (Pobel, Madrid, Espaa)
Placa de agitacin magntica modelo M-500 (Darlab Egara S.L., Tarrasa, Espaa)
Probeta graduada de plstico de 25 mL (Pobel, Madrid, Espaa)
Tubos de digestin Kjeldahl (Pobel, Madrid, Espaa)
Equipo de determinacin de protenas Kjeltec System y unidad de digestin (Tecator,
Hgans, Suecia)

Procedimiento

En un tubo de digestin se pes 1 g de muestra a la cual se le adicionaron 7 g de

mezcla cataltica y 15 mL de cido sulfrico (H2SO4), llevando el tubo al bloque calefactor,
donde permaneci aproximadamente 45 min a 400 C. Una vez realizada la digestin, el tubo
fue llevado a la unidad de destilacin, neutralizando la muestra con hidrxido sdico (NaOH) al
40%. Los iones amonio formados en esta fase son arrastrados con la destilacin y recogidos en
una solucin de cido brico (H3BO3) al 4% con solucin indicadora de rojo de metilo y verde
de bromocresol. Este indicador permite identificar la variacin del pH del medio debido a la
concentracin de iones amonio, en funcin del color rojo (medio cido) o verde (medio bsico).
Finalmente se realiz la valoracin con cido clorhdrico (HCl) 0,1 N para determinar la cantidad
de amoniaco absorbido por el H3 BO3. Para el clculo de la protena bruta se utiliz la siguiente
ecuacin:

(V2 - V1) x N
Protenabruta (%) = x 1,4 x 6,25
M

donde V1 es el volumen (mL) de la solucin de HCl requerido para la prueba del blanco, V2 es el

volumen (mL) de solucin de HCl requerido para la muestra problema, N la normalidad de la

solucin de cido clorhdrico y M el peso (g) de la muestra.

116
3.4.3. Determinacin de la grasa bruta

El contenido en grasa bruta en las frmulas infantiles se determin mediante la tcnica

desarrollada por la Direccin General de Control y Anlisis de la Calidad, Secretara General
para el Consumo del Ministerio de Sanidad y Consumo (1985). (Norma ISO-1443).

Reactivos utilizados

* cido clorhdrico (HCl) 37% (v/v) (Merck Darmstadt, Alemania)

* ter dietlico (C4H10O) p.a. exento de perxidos (Merck, Darmstadt, Alemania)

Material y equipo utilizados

* Balanza de precisin modelo ER-180A (Salter, Tokio, Japn)

* Embudos de cristal (Pobel, Madrid, Espaa)
* Estufa de desecacin (aire forzado) modelo 201 (P-Selecta, Barcelona, Espaa)
* Matraces de fondo plano de 500 mL de capacidad (Pobel, Madrid, Espaa)
* Papel de filtro de 20 cm de dimetro (Albet, Barcelona, Espaa)
* Bloque calefactor (P-Selecta, Barcelona, Espaa)
* Probeta graduada de cristal de 250 mL (Pobel, Madrid, Espaa)
* Tiras de papel indicador de pH (Indesa, Barcelona, Espaa)
* Extractor de grasas modelo 2055 Soxtec Avanti (Foss Tecator AB, Hgans, Suecia)
* Vasos metlicos (Foss Tecator AB, Hgans, Suecia)

Procedimiento

A 4 g de muestra se les aadieron 150 mL de HCl, sometiendo la muestra a ebullicin

suave durante 1 h y media. Se dej enfriar y se filtr sobre doble papel de filtro, evitando
cualquier paso de materia grasa al filtrado. El residuo resultante se lav con agua caliente hasta
la desaparicin de la reaccin cida, comprobndose mediante la utilizacin de papel indicador
de pH. El papel de filtro conteniendo el residuo se dej desecar durante toda la noche a 37 C.
Una vez seco el conjunto, se introdujo en el extractor, donde se efectu la extraccin con ter
dietlico calentado a 80 C durante 5 h, tras lo cual la grasa de la muestra qued depositada en
el fondo del vaso. Tras recuperar el disolvente empleado en la extraccin, el vaso conteniendo
el residuo de grasa fue desecado en la estufa durante 1 h a 105 C. Tras dejarlo enfriar en un
desecador, se pes cuando alcanz la temperatura ambiente. El porcentaje de grasa bruta se
calcul segn la siguiente ecuacin:

117
 (M1 - M2 )
Grasa bruta (%) = x 100
M

donde M1 es el peso del vaso con el extracto etreo, M2 es el peso del vaso vaco y M el peso

de la muestra.

3.4.4. Determinacin de las cenizas

Se realiz segn el procedimiento 945.46 de la A.O.A.C. (1999).

Material y equipo utilizados

* Balanza de precisin modelo ER-180A (Salter, Tokio, Japn)

* Crisoles de porcelana C-4 (KPM, Berln, Alemania)
* Estufa de desecacin (aire forzado) modelo 201 (P-Selecta, Barcelona, Espaa)
* Horno mufla modelo L3/S (Naberthem, Bremen, Alemania)
* Placa calefactora (P-Selecta, Barcelona, Espaa)

Procedimiento

En un crisol de porcelana se pes 1 g de muestra, el cual fue colocado en el horno

mufla durante 15 h a 525 C hasta la obtencin de cenizas completamente blancas, sin restos
de materia orgnica. El porcentaje de cenizas es calculado mediante la expresin:

M2 - M0
Cenizas (%) = x 100
M1 - M0

donde M0 es el peso del crisol vaco, M1 es el peso del crisol con la muestra y M2 el peso del

crisol con las cenizas.

3.4.5. Determinacin de la fibra diettica total (FDT)

La Fibra Diettica Total (FDT) fue determinada segn el procedimiento enzimtico-

gravimtrico 985.29 de la A.O.A.C. (1999), descrito por Prosky y col. (1988).

118
Reactivos utilizados

* -Amilasa termoestable A-3306 (Sigma, St. Louis, U.S.A.)

* cido fosfrico (H3 PO4) (Panreac, Barcelona, Espaa)
* Aminoglucosidasa de Aspergillus niger A-9913. (Sigma, St. Louis, U.S.A.)
* Celite 545 (Merck, Darmstadt, Alemania)
* Etanol 78% y 95% (v/v) (C2 H6O) (Scharlau, Barcelona, Espaa)
* Fosfato disdico anhidro (Na 2 HPO4) (Probus, Barcelona, Espaa)
* Fosfato monosdico dihidrogeno anhidro (NaH2PO4) (Probus, Barcelona, Espaa)
* Hidrxido sdico (NaOH) 40% (Panreac, Barcelona, Espaa)
* Proteasa P-3910 (Sigma, St. Louis, U.S.A.)

Preparacin de soluciones

Solucin de NaOH 0,171 M: se diluyeron 171 mL de NaOH 1 N con agua destilada

hasta un volumen total de 1 L.
Tampn fosfato 0,05 M, pH 6,0: se disolvieron 0,875 g de fosfato disdico anhidro
(Na 2 HPO4) y 5,26 g de fosfato monosdico dihidrogeno anhidro (NaH2PO4) en 700
mL de agua, diluyendo hasta 1 L con agua destilada. Se ajust el pH a 6,0.
Solucin de proteasa: diluir 40 mg de proteasa en 0,8 mL de tampn fosfato 0,05 M.
Solucin de cido fsfrico (H3PO4) 0,205 M: se diluy con agua destilada 205 mL
de una solucin de H3PO4 1,0 M hasta un volumen de 1 L.

Material y equipo utilizados

* Balanza de precisin modelo ER-180A (Salter, Tokio, Japn)

* Bao termosttico Unitronic 320 OR con agitacin (P-Selecta, Barcelona, Espaa)
* Bomba de vaco Tipo 019 (Barna-Vaco, Barcelona, Espaa)
* Crisoles de placa porosa borosilicato 3.3 de 30 mL (Tecator, Hgans, Suecia)
* Equipo de determinacin de protenas Kjeltec System y unidad de digestin (Tecator,
Hgans, Suecia)
* Equipo para la determinacin de fibra modelo Fibertec System E (Tecator, Hgans,
Suecia)
* Estufa de desecacin (aire forzado) modelo 201 (P-Selecta, Barcelona, Espaa)
* Horno mufla modelo L3/S (Naberthem, Bremen, Alemania)
* pH-metro micro pH 2000 (Crison, Barcelona, Espaa)

119
 Procedimiento

Se pes 1 g de muestra por duplicado y se le adicionaron 50 mL de tampn fosfato

0,05 M de pH 6, agitando hasta obtener una dispersin homognea. Posteriormente se llev la
muestra a un bao a 95 C y se le adicion 0,2 mL de -amilasa termoestable, para gelatinizar
el almidn, mantenindola durante 30 min. Una vez completado el tiempo de digestin, las
muestras se enfriaron hasta alcanzar la temperatura ambiente, ajustando el pH de la muestra a
7,5 con la solucin de NaOH 0,171 M. Se transfirieron las muestras a un bao a 60 C y se les
adicion 0,1 mL de la solucin de proteasa para eliminar la protena de la muestra,
mantenindolas durante 30 min en agitacin continua. Tras la proteolisis se enfriaron
nuevamente las muestras y se llevaron a pH 4,5 con la solucin de H3PO4 0,205 M, alcanzando
as el pH ptimo para la digestin de la muestra con 0,3 mL de la enzima amiloglucosidasa a 60
C durante 30 min. Sobre el volumen de digestin, se adicionaron 200 mL de etanol 95% a 60
C para precipitar la fraccin soluble de la FDT, dejando las muestras a temperatura ambiente
durante un tiempo mnimo de 12 h. Posteriormente se filtraron utilizando crisoles de cristal con
un tamao de poro de 40-60 m, sobre los cuales previamente se pesaron 0,5 g de Celite,
formando una fina capa con el fin de reducir el tamao del poro de filtracin. Durante la
filtracin se lavaron los vasos de digestin y los residuos con etanol 78%. Una vez obtenidos
los residuos por duplicado para una muestra, se determin sobre uno de ellos el contenido de
cenizas (mtodo 945.46 de la A.O.A.C., 1999) y sobre el otro el contenido de protena bruta
(mtodo 991.20 de la A.O.A.C., 1999), calculando el porcentaje de FDT con la siguiente
ecuacin:

R1 + R 2
(PB + C) B
2
FDT (%) = x 100
M1 + M2
2

donde R1 y R2 son el peso (mg) de los residuos del duplicado de la muestra, PB es el contenido

(mg) de protena bruta en uno de los residuos, C es el contenido (mg) de cenizas en el otro
residuo, B el valor del blanco de los reactivos (mg), y M1 y M2 los pesos de los duplicados de la

muestra (mg).

3.4.6. Determinacin de los hidratos de carbono

La determinacin de hidratos de carbono se realiz por diferencia (FAO/OMS, 1982), a

partir de los resultados obtenidos en las determinaciones de grasa (G), cenizas (C), protena
bruta (PB), humedad (H) y fibra diettica total (FDT) de forma que:

120
 Hidratos de carbono (%) = 100 (G + C + PB + H + FDT)

3.4.7. Valor energtico

El valor energtico de las muestras se obtuvo mediante la suma del valor energtico de la
protena, de los hidratos de carbono y de la grasa de cada una de las muestras. Para ello se
utilizaron los siguientes factores de conversin de acuerdo los nmeros de Atwater
(FAO/OMS/UNU, 1985):

Protenas: 4 Kcal/g
Hidratos de carbono: 4 Kcal/g
Grasas: 9 Kcal/g

3.4.8. Determinacin de la composicin mineral (Ca, Mg y Fe)

La determinacin de minerales (Ca, Mg y Fe) se realiz por espectrofotometra de absorcin

atmica (EAA), siguiendo el mtodo 985.35 de la A.O.A.C. (1999).

Reactivos utilizados

* cido clorhdrico calidad Suprapur (HCl) (Merck, Darmstadt, Alemania)

* cido ntrico calidad Suprapur (HNO3) (Merck, Darmstadt, Alemania)
* Agua bidestilada desionizada
* Cloruro de lantano con una pureza de 99,99% (LaCl3) (Fluka, Buchs, Suiza)
* Soluciones stock-patrn de 1.000 mg/L (Fluka, Buchs, Suiza):
Calcio (n cat. 21049)
Magnesio (n cat. 63046)
Hierro (n cat. 44093)

Material y equipo utilizados

* Balanza de precisin modelo ER-180A (Salter, Tokio, Japn)

* Crisoles de porcelana C-4 (KPM, Berln, Alemania)
* Espectrofotmetro modelo 3100 (Perkin-Elmer, Norwalk, U.S.A.)
* Estufa de desecacin (aire forzado) modelo 201 (P-Selecta, Barcelona, Espaa)
* Horno mufla modelo L3/S (Naberthem, Bremen, Alemania)
* Matraces aforados de 50 y 100 mL de capacidad (Pobel, Madrid, Espaa)
* Placa calefactora (P-Selecta, Barcelona, Espaa)

121
 Limpieza del material de laboratorio

Todo el material de vidrio y porcelana utilizado en la determinacin de minerales fue

lavado durante una noche en cido ntrico (HNO3) 10% para arrastrar cualquier tipo de
impureza adherida a las paredes del material, y posteriormente enjuagado tres veces con agua
bidestilada desionizada.

Procedimiento

Los minerales se determinaron a partir de las cenizas obtenidas tras la incineracin de

las muestras (heces, orina, contenido cecal (fase slida y lquida) y huesos) a 525 C durante
15 h. Estas cenizas fueron recogidas con 2 mL de HNO3 puro y 5 mL de HCl, agitando
suavemente sobre una placa calefactora hasta su total evaporacin. Posteriormente se aadi
un volumen igual del mismo cido, procedindose a la evaporacin de la mitad del mismo con
el fin de disolver las cenizas en su totalidad. La solucin obtenida fue llevada a un matraz
aforado de 50 mL, al cual se le adicionaron los volmenes de lavado del crisol, enrasando
finalmente con agua bidestilada desionizada. Dependiendo del tipo de muestra y del mineral
que se fuera a determinar, se realiz la correspondiente dilucin (ver Tabla 24). Para evitar las
interferencias con otros elementos (fosfatos), en la determinacin de Ca y Mg se adicion
cloruro de lantano (LaCl3) al 0,1% (p/v) tanto a las muestras como a los patrones para estos
dos elementos. Todas las determinaciones fueron llevadas a cabo siguiendo las
recomendaciones del fabricante del espectrofotmetro de absorcin atmica (Ros, 1995;
Martnez y col., 1998), especificndose las condiciones instrumentales en la Tabla 23.

Tabla 23. Condiciones instrumentales establecidas para la determinacin de los minerales (Ca, Mg
y Fe) investigados
Longit ud de onda Apertura de rendija Sensibilidad del
Elemento mineral
(nm) (nm) chequeo (mg/L)
Ca 422,7 0,7 4,0
Mg 285,2 0,7 0,3
Fe 248,3 0,2 5,0

La calibracin se realiz utilizando distintas diluciones de patrones de los elementos

minerales analizados a partir de las soluciones de patrones comerciales anteriormente
sealadas. El clculo de las concentraciones de cada uno de los minerales analizados,
expresadas en mg/100 g de muestra, se realiz de diferente manera dependiendo del tipo de
muestra empleada, tal y como se aprecia a continuacin (Tabla 24).

122
Tabla 24. Clculo de las concentraciones de los minerales (Ca, Mg y Fe) analizados en las diferentes
muestras
Dietas
Ca y Mg Elemento (mg/100 g) = [ppm] x 250 y 500/ M*
Fe Elemento (mg/100 g) = [ppm] x 5/ M
Heces
Ca Elemento (mg/100 g) = [ppm] x 500, 1000 y 2000/ M
Mg Elemento (mg/100 g) = [ppm] x 250 y 500/ M
Fe Elemento (mg/100 g) = [ppm] x 50/ M
Huesos
Ca Elemento (mg/100 g) = [ppm] x 1000, 2000 y 2500/ M
Mg Elemento (mg/100 g) = [ppm] x 500 y 1000/ M
Fe Elemento (mg/100 g) = [ppm] x 5/ M

Contenido ciego y colon (F.S.)
Ca, Mg y Fe Elemento (mg/100 g) = [ppm] x 50/ 1000 x M

Contenido ciego y colon (F.L.)
Ca, Mg y Fe Elemento (mg/mL) = [ppm] x 25/ 1000
Orina
Ca Elemento (mg/100 mL) = [ppm] x 10 y 20
Mg Elemento (mg/100 mL) = [ppm] x 20 y 200
Fe Elemento (mg/100 mL) = [ppm] x 1/10
*
ppm es la concentracin del mineral en partes por milln dada por el espectrofotmetro y M es el peso de la muestra
utilizada en la determinacin expresada en g

F.S. es la fase slida y F.L. es la fase lquida del contenido del ciego y del colon

La Tabla 25 muestra las concentraciones de los patrones utilizados para elaborar la

recta de calibrado para cada uno de los elementos minerales estudiados y las ecuaciones de la
recta pertenecientes a sus curvas de calibrado.

Tabla 25. Concentraciones de los patrones utilizados, ecuaciones de las rectas de calibrado y
coeficientes de linealidad (R2) para las rectas patrn cada uno de los minerales determinados

Mineral Concentracin (ppm) Ecuacin de la recta R2

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 1 2 3 4 5
Ca * * * * * y = 2,67.10 -3 + 5,24.10 -2 x 0,999
. -3
Mg * * * * * y = 1,42 10 + 0,65x 1,000
. -3 . -2
Fe * * * * * y = 2,86 10 + 4,76 10 x 0,998
*
Concentracin (ppm) utilizada para elaborar la ecuacin de la recta de cada elemento. En todos los casos se
utilizaron 5 puntos.

Definicin de las variables dependiente e independiente de la ecuacin de la recta. y = concentracin del

elemento; x = absorbancia.

123
3.4.9. Determinacin de fsforo (P) total

La determinacin de P se realiz mediante la tcnica colorimtrica de amonio vanadato

986.24 de la A.O.A.C. (1999), descrita por Chapman y Pratt (1961).

Reactivos utilizados

* cido clorhdrico concentrado (HCl) (Merck, Darmstadt, Alemania)

* cido ntrico puro (HNO3) (Merck, Darmstadt, Alemania)
* cido sulfrico concentrado (H2SO4) (Merck, Darmstadt, Alemania)
* Fosfato potsico monobsico (KH2PO4) (previamente desecado unas 2 h a 105 C)
(Probus, Barcelona, Espaa)
* Metavanadato amnico (NH4VO3) (Probus, Barcelona, Espaa)
* Molibdato amnico tetrahidratado ((NH4)6Mo7O24.4H2O) (Probus, Barcelona, Espaa)

Preparacin de soluciones

Solucin de molibdato amnico: 20 g de molibdato amnico tetrahidratado se

diluyeron en 200 mL de agua destilada caliente (50 C).
Solucin de metavanadato amnico: 1 g de metavanadato amnico se diluy en 300
mL de agua destilada caliente, y tras enfriar se aadieron 140 mL de HNO3.
Solucin de metamolibdeno-vanadato: la solucin de molibdato amnico se verti
lentamente y agitando sobre la solucin de metavanadato amnico, enrasado a 1 L
con agua destilada.
Solucin patrn de P para la recta de calibrado (Solucin A): se pesaron 4,3885 g de
potasio fosfato monobsico y se disolvieron en 100 mL de agua destilada. Se
aadieron 2 mL de H2SO4 y se diluyeron a 1 L. Esta solucin contiene 1 mg/mL de P.
Solucin patrn de P para la recta de calibrado (Solucin B): se diluyeron 10 mL de
la solucin A hasta 250 mL con agua destilada, obteniendo de este modo la solucin
B con una concentracin de 0,04 mg/mL.

A partir de las soluciones A y B se prepararon las siguientes diluciones:

a) A partir de la solucin B se tomaron 5, 15 y 50 mL
b) A partir de la solucin A se tomaron 4, 6 y 8 mL

Las diferentes concentraciones de ambas soluciones fueron enrasadas a 50 mL en

matraces aforados. De esta manera se obtuvieron las soluciones utilizadas para la recta patrn
con unas concentraciones de P de 0,2, 0,6, 2, 4, 6 y 8 mg/50 mL.

124
 Material y equipo utilizados

Balanza de precisin modelo ER-180A (Salter, Tokio, Japn)

Crisoles de porcelana C-4 (KPM, Berln, Alemania)
Cubetas de poliestireno para espectrofotmetro (Kartell, Noviglio, Italy)
Espectrofotmetro de absorcin molecular modelo U-2000 (Hitachi, Tokio, Japn)
Estufa de desecacin (aire forzado) modelo 201 (P-Selecta, Barcelona, Espaa)
Horno mufla modelo L3/S (Naberthem, Bremen, Alemania)
Matraces aforados de 50 mL de capacidad (Pobel, Madrid, Espaa)
Placa calefactora (P-Selecta, Barcelona, Espaa)

Procedimiento

Se pes 1 g de muestra que fue incinerada a 525 C durante 15 h hasta la obtencin de

cenizas. Posteriormente dichas cenizas fueron calentadas con 2 mL de HNO3 y 5 mL de HCl, en
una placa calefactora durante 10 min, recogiendo la solucin obtenida en un matraz aforado a
50 mL, adicionndole los volmenes de lavado del crisol con agua destilada hasta completar un
volumen total de 50 mL.
Para medir el contenido de P tanto en las soluciones patrn como en las muestras
problema, se tomaron 5 mL de la solucin final a los que se les adicionaron 10 mL del reactivo
metamolibdeno-vanadato, enrasado finalmente a 50 mL con agua destilada. Las muestras
fueron ledas a los 30 min en un espectrofotmetro de absorcin molecular a 400 nm. A partir
de los valores obtenidos de los patrones se realiz la siguiente recta patrn (Figura 13).

1,6

1,4

1,2

1
Absorbancia

0,8

0,6

0,4

0,2

0
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18
Concentracin (mg/mL)

Figura 13. Representacin de la recta de calibrado para el fsforo (P)

125
 El contenido de fsforo de las soluciones problemas se determin a partir de la
siguiente ecuacin, obtenida de la recta patrn:

Concentracin mg/mL = Abs 0,032 / 8,8051 R2 = 0,9999

En el caso de las muestras de orina, se realiz un blanco del reactivo y de la muestra

para evitar que el color amarillo de la orina interfiriera en la reaccin colorimtrica entre los
reactivos y el P de la muestra.
El contenido final de P en las muestras, expresado en mg/100 g, se determin de
diferente manera dependiendo del tipo de muestra empleada, tal y como se muestra en la
siguiente ta bla:

Tabla 26. Clculo de las concentraciones de fsforo (P) analizado en las diferentes muestras
Muestras
*
Dietas Fsforo (mg/100 g) = [C x 50 y 500/ M] x 100
Heces Fsforo (mg/100 g) = [C x 50/ M] x 100
Huesos Fsforo (mg/100 g) = [C x 2500/ M] x 100

Contenido ciego y colon (F.S.) Fsforo (mg/100 g) = [ppm x 50 / M x 1000] x 100

Contenido ciego y colon (F.L.) Fsforo (mg/100 mL) = [ppm x 250 / 1000] x 100
Orina Fsforo (mg/100 mL) = [C x 500 y 2500/ V] x 100
*
C es la concentracin de fsforo expresada en mg/100 g, M es el peso de la muestra expresado en g, ppm
es la concentracin del mineral en partes por milln dada por el espectrofotmetro y V es el volumen de la
muestra empleada en mL

F.S. es la fase slida y F.L. es la fase lquida del contenido del ciego y del colon

3.5. Estudio in vivo con ratas del efecto de los probiticos, prebiticos y simbiticos
en frmulas infantiles sobre la absorcin mineral

3.5.1. Animales

Las ratas de experimentacin fueron suministradas por el animalario de la Universidad

de Murcia (establecimiento autorizado para la produccin y distribucin de animales de
laboratorio segn Real Decreto 223/1988, sobre proteccin de los animales para
experimentacin y otros fines cientficos, publicada en el B.O.E. nm. 67 de 18 de marzo de
1988). Se utilizaron un total de cincuenta y cuatro ratas macho del tipo Sprague-Dawley recin
destetadas (21 das de edad), con un peso corporal medio de 40-50 g. Los animales fueron
instalados en jaulas colectivas (6 animales por cada jaula y grupo) para trasladarlas durante el
periodo de balance mineral a jaulas metablicas individuales de plstico (Techniplastgazzada,
Bugugiatte, Italia), que permiten la recogida separada de heces y orina, as como el control de
la ingestin de alimento y bebida. Fueron seleccionadas por peso para cada experimento,

126
recibiendo un tipo distinto de dieta. Los experimentos se realizaron en una cmara
termorregulada a una temperatura 23 2 C, con un fotoperodo constante de 12 h de luz
(desde las 8:00 a.m. hasta las 8:00 p.m.) y 12 h de oscuridad, y una humedad relativa de 50-
70%.

3.5.2. Dietas

En la siguiente tabla se muestra el valor nutricional de las nueve dietas empleadas para
la alimentacin de las ratas.

Tabla 27. Composicin nutricional de las dietas empleadas en el presente

estudio de investigacin

Nutrientes Dietas
1 2-9
Energa (kcal/100 g) 317,680,01 465,804,38
Humedad (%) 9,050,194 3,450,13
Cenizas (%) 5,040,05 3,750,04
Protena (%) 14,000,05 13,850,13
Grasa (%) 2,36 0,06 22,200,21
Hidratos de carbono (%) 60,110,00 52,640,59
Fibra (%) 18,491,81 -
Calcio (mg/100 g) 765,5015,74 571,728,67
Magnesio (mg/100 g) 150,090,66 50,100,86
Fsforo (mg/100 g) 503,984,44 343,689,68
Hierro (mg/100 g) 30,412,58 8,550,24
Relacin calcio/fsforo 1,52 1,66
2, 3...NO
Galactooligosacridos NO 4, 7...1,2%
5, 8...5%
6, 9...10%
Bifidobacterias NO 2, 4, 5, 6...NO
3, 7, 8, 9...SI

Las dietas empleadas cubren las necesidades de los minerales estudiados en el

presente estudio para las ratas, que se establecen en 500 mg/100 g para el Ca, 3,5 mg/100 g
para el Fe, 40 mg/100 g para el Mg y 400 mg/100 g para el P (NRC, 1978).

3.5.3. Pauta de recogida de datos y toma de muestras

3.5.3.1. Ingestin de alimento, toma de peso en vivo, recogida de heces y orina

Reactivos utilizados

* cido clorhdrico (HCl) (Merck, Darmstdat, Alemania)

* cido ntrico (HNO3) (Merck, Darmstdat, Alemania)

127
 Material utilizado

* Balanza granatario (Sartorius, Gttingen, Alemania)

* Botellas de plstico de 250 mL de capacidad (Vidra Foc, Espaa)
* Filtros con membrana de acetato de celulosa de 25 mm de dimetro y 0,45 m de poro
(Iwaki glass, Japn)
* Jaulas metablicas de plstico (Techniplastgazzada, Bugugiatte, Italia)
* Jeringuillas de 10 mL (Becton Dickinson, New Jersey, U.S.A.)
* Papel de filtro Whatman del n 41, exento de cenizas (Maidstone, Kent, Inglaterra)
* Tubos de ensayo de cristal de 20 mL de capacidad (Pobel, Madrid, Espaa)

Procedimiento

El diseo experimental y la metodologa de trabajo seguido en el estudio in vivo con

ratas de laboratorio para determinar el efecto de los probiticos, prebiticos y simbiticos en
frmulas infantiles sobre la absorcin mineral, se presenta en las Figuras 14 y 15. El estudio
tuvo una duracin de treinta das en total, de los cuales los cinco primeros se dedicaron a la
adaptacin de las ratas a la dieta. Los animales se pesaron al comienzo y al final de la
experiencia, as como durante los tres periodos de tres das (das 8-10, 18-20 y 28-30) en que
consisti el balance mineral, utilizando una balanza Sartorius. Antes del comienzo de la
experiencia las jaulas, los recipientes de polietileno utilizados para la recogida de heces y orina,
los comederos, bebederos, y los distintos botes para la recogida de muestras, se lavaron en
HNO3 10% y posteriormente se enjuagaron tres veces con agua bidestilada desionizada.
Durante la experiencia, el alimento y agua bidestilada desionizada se proporcionaron ad libitum,
midiendo la cantidad de alimento ingerido y de agua bebida en los tres periodos para cada uno
de los animales. Durante los tres periodos tambin se procedi a la recogida de heces y orina
con el fin de realizar el recuento de bifidobacterias (heces) y la determinacin del contenido
mineral (ambos). A los recipientes para la recogida de la orina se les aadi HCl 0,5 M a razn
de 10 mL de cido/L de orina (Lopez y col., 2000). La orina fue filtrada en primer lugar con
papel Whatman n 41 exento de cenizas para eliminar todo resto de comida, heces o cualquier
otro material grosero, y posteriormente con filtros de 0,45 m de poro (Iwaki glass). La orina
recogida de esta manera y las heces fueron almacenadas a 4 C, para la determinacin de
minerales, a -20 C en el caso de las heces destinadas al recuento microbiolgico. Al final del
periodo de balance, las ratas fueron anestesiadas y murieron por desangrado. Tras la apertura
de la cavidad torcica se recolect de cada rata toda la sangre posible de la arteria aorta.
Tambin fueron recogidas las siguientes piezas anatmicas: ciego y colon (incluyendo sus
contenidos); fmur y tibia derecha.

128
3.5.3.2. Anestesia y diseccin

Reactivos utilizados

* ter etlico ((CH3CH2)2O) (Probus, Barcelona, Espaa)

* Solucin salina fisiolgica (9 g de NaCl/L)

Material utilizado

* Algodn hidrfilo.
* Balanza de precisin modelo ER-180A (Salter, Tokio, Japn)
* Balanza granatario (Sartorius, Gttingen, Alemania)
* Bolsas de plstico de cierre hermtico 80 x 120 mm (Vidra Foc, Espaa)
* Campana de anestesia
* Guantes de latex (Ibertex, Barcelona, Espaa)
* Hoja de bstur n 21 (Becton Dickinson, New Jersey, U.S.A.)
* Jeringuillas de 5 mL (Becton Dickinson, New Jersey, U.S.A.)
* Mangos de bstur n 3
* Pinzas de diseccin
* Tabla de diseccin
* Tijeras de diseccin
* Tubos de centrfuga de plstico

Procedimiento

Los animales fueron anestesiados con ter etlico, pesados e inmovilizados mediante la
fijacin de las extremidades y la cola en una tabla de diseccin. Se les practic una diseccin a
la altura de la lnea media abdominal. Se separ la piel y posteriormente se abri la cavidad
abdominal permitindonos, al desplazar lateralmente las vsceras, un perfecto acceso a la aorta
abdominal, de donde se extrajo la sangre (4-5 mL) y se procedi a la diseccin de los rganos
seleccionados. Cada pieza anatmica seleccionada para el estudio fue diseccionada, evitando en
la medida de lo posible el pedculo vascular y cualquier otro tejido no perteneciente a la pieza
anatmica en s.

129
 Ratas S-D macho destetadas
(21 das, peso=40-50 g, n= 54)

DIETAS
DIETAS
Dieta A04 Dieta Control

Dieta Prebitica Dieta Probitica Dieta Simbitica

(1,2-5-10% 4-GOS) (1,2-5-10% 4-GOS)

CONDICIONES DE TRABAJO

Cmara termorregulada 23 C

Fotoperiodo 12-12 h

Humedad relativa 50-70%

Periodo de adaptacin (5 das)

Periodo Periodo Periodo

8-10 das 18-20 das 28-30 das

Ingestin diaria Ingestin diaria Ingestin diaria

Excrecin fecal Excrecin fecal Excrecin fecal
Excrecin urinaria Excrecin urinaria Excrecin urinaria
Contenido minerales en Contenido minerales en Contenido minerales en
heces y orina heces y orina heces y orina
Recuento bifidobacterias Recuento bifidobacterias Recuento bifidobacterias

Contenido mineral en huesos y

contenido ciego y colon
pH en contenido ciego y colon
Peso y morfologa de pared ciego y SACRIFICIO
colon
Parmetros hematolgicos y
bioqumicos

Figura 14. Diseo experimental del estudio in vivo con ratas del efecto de los probiticos, prebiticos y
simbiticos en frmulas infantiles sobre la absorcin mineral

130
 Recogida de Anestesia Recogida de
orina heces

Filtrado Extraccin de Extraccin Recuento de Liofilizado

sangre de rganos bacterias totales y
bifidobacterias

Centrifugacin
Acidificacin 4.000 rpm/10 Homogeneizado
min
Parmetros
hematolgicos

Determinacin de Determinacin de
Ca, Mg, P y Fe Parmetros Ca, Mg, P y Fe
bioqumicos

Ciego y colon Fmur y tibia

Desengrasado
Pared del ciego
Contenidos del
y colon
ciego y colon

Contenido en cenizas
Fijacin en formol Determinacin de Ca,
Mg, P y Fe
Minerales
Fase slida
Fase lquida Estudio
histolgico

Figura 15. Metodologa seguida en el estudio in vivo con ratas

3.5.4. Preparacin de las muestras

Reactivos utilizados

* ter de petrleo 40-60 (Probus, Barcelona, Espaa)

* Formaldehdo (CH2O) 36% (v/v) (Merck, Darmstadt, Alemania)
* n-Hexano (C6 H14) (Panreac, Barcelona, Espaa)
* Solucin salina fisiolgica (9 g de NaCl/L)

131
 Material y equipo utilizados

* Balanza de precisin modelo ER-180A (Salter, Tokio, Japn)

* Balanza granatario (Sartorius, Gttingen, Alemania)
* Bolsas de plstico de 80 x 120 mm (Vidra Foc, Espaa)
* Centrifuga modelo 5416 (Eppendorf, Hamburg, Alemania)
* Estufa de desecacin (aire forzado) modelo 201 (P-Selecta, Barcelona, Espaa)
* Liofilizador modelo TD-3-MP (FTS Systems, New York, U.S.A.)
* Martillo de caucho
* pHmetro micro pH 2000 (Crison, Barcelona, Espaa)

Procedimiento

Para la preparacin de las muestras se procedi con distintas metodologas

dependiendo de la naturaleza y tipo de muestra. De forma general, todas las piezas anatmicas
se lavaron cuidadosamente con SSF tras la extraccin de las mismas. Despus de extraer el
ciego y del colon y previo a su limpieza, se procedi a la determinacin del pH en el contenido
de ambas vsceras mediante la insercin en la luz intestinal del electrodo de cristal del pHmetro.
Posteriormente, el ciego y el colon se pesaron antes y despus de vaciar sus contenidos, para
proceder a su congelacin (-20 C) inmediatamente despus de pesarlos hasta su anlisis. La
pared del ciego y del colon tras su limpieza con SSF y su pesada, se introdujeron en formol al
10% para su conservacin hasta la realizacin del anlisis histolgico. El peso del contenido del
ciego y del colon se evalu como la diferencia entre el peso de los rganos con y sin el
contenido.
Las piezas seas fueron sometidas a un tratamiento, que consisti en el secado de los
huesos en una estufa a 95 C durante 24 h, seguido del desengrasado, mantenindolos con n-
hexano durante 12 h y otras 12 h en ter para completar la eliminacin de la grasa, tras lo que
se volvieron a secar en la estufa durante 5-6 h a 95 C para medir el peso seco (Ros, 1995).
Las muestras de sangre fueron inmediatamente centrifugadas (12.000 x g durante 2
min) y el sobrenadante recogido se almacen en refrigeracin hasta el anlisis de los lpidos
sanguneos.
Para la preparacin de las muestras fecales, las heces se limpiaron de materia extraa
adherida, se pesaron, fueron liofilizadas y molidas, tomndose una muestra de 0,5 g para el
proceso de mineralizacin. El peso seco de las heces se estim desecando una porcin a 80 C
en una estufa hasta obtener peso constante.
Las muestras de orina por el contrario no requirieron una preparacin especial, salvo la
adicin de cido y el proceso de filtracin descrito anteriormente (Punto 3.6.3.1.).

132
3.5.5. Determinacin de parmetros hematolgicos

Reactivos utilizados

* Anticoagulante de heparina (Analema, Vigo, Espaa)

Material y equipo utilizados

* Contador celular Microcell counter modelo Sysmex F-800 (Toa Medical Electronics Co.
LTD, Kobe, Japn)
* Tubos de vidrio de 5 mL (Vidra Foc, Espaa)

Procedimiento

El anlisis hematolgico fue realizado inmediatamente despus de la obtencin de la

muestra sangunea para evitar cualquier tipo de alteracin debida al paso del tiempo. De cada
animal se obtuvieron de 4-5 mL de sangre en total, distribuyndose en tubos de 0,5 a 1 mL
para los distintos anlisis. Tras las extraccin de la sangre se determin el recuento de glbulos
rojos (RGR), el valor hematocrito (HTC) y la hemoglobina (Hb), utilizando el contador celular
Microcellcounter Sysmex F-800.

3.5.6. Determinacin de parmetros bioqumicos

Material y equipo utilizados

* Autoanalizador de bioqumica tipo Cobas Mire Plus (Abx diagnostics, Monpellier,

Francia)
* Centrifuga modelo 5416 (Eppendorf, Hamburg, Alemania)
* Pipetas Pasteur de vidrio (Vidra Foc, Espaa)
* Tubos de plstico de cloruro de polivinilo (Vidra Foc, Espaa)

Procedimiento

La valoracin de estos parmetros se realiz durante las primeras 24 h de extraccin

sobre las muestras sangre centrifugadas a 4.000 x g durante 10 min.

Hierro srico y capacidad total de fijacin de hierro (TIBC): El procedimiento a seguir en

esta tcnica se basa en la aplicacin de dos equipos colorimtricos de bioMrieux, con

133
 los que se consigue en primer lugar la saturacin de la transferrina realizando
posteriormente y de forma continua la determinacin del Fe srico y la TIBC. Para la
determinacin de TIBC utilizamos el kit comercial TIBC Additif de bioMrieux
(Charbonnires-les-Bains Cedex, Francia). Este parmetro se valora despus de la
saturacin de la transferrina srica con una solucin de Fe y la adsorcin del exceso
de Fe sobre hidroxicarbonato de Mg. Tras esta primera fase y despus de centrifugar
(3.000 rpm durante 15 min) se obtiene un sobrenadante al que le aplicaremos el
equipo Ferrimat-kit de bioMrieux para la determinacin de Fe sin desproteneizacin.
Esta tcnica se fundamenta en que en medio cido y en presencia de guanidina se
libera Fe frrico unido a las protenas, principalmente del complejo Fe-transferrina.
Por medio de la hidroxilamida se reduce el Fe frrico a ferroso que forma un complejo
coloreado con la FerroZine (Hach Chemical Co., Ames, Iowa, USA). La reaccin
coloreada se mide en el espectrofotmetro de absorcin molecular a una longitud de
onda de 562 nm.
Para obtener nuestro valor numrico aplicamos las siguientes ecuaciones para el Fe
srico y la TIBC:

A m TIBC - Abm TIBC

TIBC ( g/100 mL) = xn
Ap

donde Am es la absorbancia de la muestra problema, Abm la absorbancia del blanco de la

muestra, Ap la absorbancia del patrn y n es un factor de conversin igual a 200.

Am - Abm
Hierro srico ( g/100 mL) = xn
Ap

donde Am es la absorbancia de la muestra problema, Abm la absorbancia del blanco de la

muestra, Ap la absorbancia del patrn y n es un factor de conversin igual a 600.

Albmina: Su determinacin se llev a cabo mediante el test colorimtrico

Bromocresol, mediante el cual la albmina se combina con el verde de bromocresol
a pH 4,2 producindose un cambio de color del indicador, de amarillo verdoso a verde
azulado. La variacin de color se midi a una longitud de onda de 630 nm.
Urea: La medicin de la urea fue realizada con el test cintico Ureasa-GLDH. El
fundamento del mtodo consiste en la catalizacin de la hidrlisis de la urea presente
en la muestra por la ureasa dando lugar a amonio y CO2. El amonio formado se valora
mediante una reaccin enzimtica mediada por la glutamato deshidrogenasa (GLDH).

134
 La disminucin de la absorbancia, medida en un espectrofotmetro de absorcin
molecular a 340 nm, frente al tiempo es proporcional a la concentracin de urea.

Los lpidos sanguneos se determinaron a una longitud de onda de 600 nm en un

espectrofotmetro de absorcin molecular. Los mtodos que se emplearon fueron los
recomendados por la Sociedad Espaola de Qumica Clnica:

Colesterol total: Mtodo enzimtico colesterol esterasa-oxidasa-peroxidasa. Se emple

el kit comercial ABX Diagnostics Cholesterol 250 (Flegg, 1973). El COL se determina
segn el siguiente esquema de reaccin:

colesterol esterasa
Colesterol esterificado colesterol + cidos grasos
colesterol oxidasa
Colesterol colesteno-4, ona-3 + H2O
peroxidasa
2 H2O + fenol + amino-4 antipirina quinoneimina + 4 H2O

HDL-Colesterol: Se utiliz el kit comercial colesterol-hdl de Spinreact (William y col.

1979). Es un mtodo enzimtico-colorimtrico directo, que utiliza enzimas modificadas
que en presencia de un detergente polianinico reducen la actividad del COL
especialmente en quilomicrones y VLDL.

LDL-Colesterol: Se calcul por la frmula de Friedewald y col. (1972):

Colesterol total - HDLcolesterol - Triglicri dos

LDLcolesterol =
5

Triglicridos: Se emple el kit comercial ABX Diagnostics Triglycerides 25 (Fossati y

Prencipe, 1982). Es un mtodo enzimtico mediante el cual los TG son hidrolizados
por una lipoproteina-quinasa a glicerol y AG. El glicerol es fosforilado por la
glicerolquinasa en presencia de ATP formndose Glicerol-3-P, el cual es oxidado por
una oxidasa liberndose H2O2, que por accin de una peroxidasa da lugar a un
compuesto coloreado estable.

3.5.7. Recuento de bacterias totales y bifidobacterias fecales de las ratas

Reactivos utilizados

* cido nalidxico (C12 H12N2O3) (Sigma, St. Louis, U.S.A.)

* Agar Clostridium reforzado (Oxoid, Hampshire, Inglaterra)

135
* Agar Plate Count (Merck, Darmstadt, Alemania)
* Agar TPY (Scharlau, Barcelona, Espaa)
* Agua de peptona tamponada (Oxoid, Hampshire, Inglaterra)
* Cloruro de litio (LiCl) (Merck, Darmstdat, Alemania)
* Fosfato disdico anhidro (Na2 HPO4) (Probus, Barcelona, Espaa)
* Fosfato monosdico dihidrogeno anhidro (NaH2PO4) (Probus, Barcelona, Espaa)
* Sulfato de neomicina (734 g de neomicina por mg) (Sigma, St. Louis, U.S.A.)
* Tween 80 (Merck, Darmstadt, Alemania)

Preparacin de soluciones

Las soluciones fueron preparadas de la misma forma que como se muestra en el punto
3.4. de esta seccin.

Material y equipo utilizados

* Agitador de tubos modelo REAX 2000 (Heidolph, Schwabach, Alemania)

* Autoclave Sterilav-S 75 (Reypa, Barcelona, Espaa)
* Balanza de precisin modelo ER-180A (Salter, Tokio, Japn)
* Bolsa generadora de gas (CO2 + H2) Anaerogen AN 35 (Oxoid, Hampshire, Inglaterra)
* Bomba de vaco Tipo 019 de Barna-Vaco S.A. (Barcelona, Espaa)
* Cabina de flujo laminar vertical (Telstar, Tarrasa, Espaa)
* Contador de colonias digital (Bioser, Barcelona, Espaa)
* Embudo con placa filtrante y esmerilado, vidrio borosilicato Pyrex de 35 mm de
dimetro (Afora, Barcelona, Espaa)
* Estufa Incubac 2000 (P-Selecta, Barcelona, Espaa)
* Filtros de membrana estriles de nitrato de celulosa de 47 mm de dimetro y 0,22 m
de poro (Whatman, Maidstone, Kent, Inglaterra)
* Frascos Pyrex de 100 mL de capacidad (Afora, Barcelona, Espaa)
* Incubador de CO2 CB 150 WTB (Binder, Tuttlingen, Alemania)
* Indicador anaerbico BR 55 (Oxoid, Hampshire, Inglaterra)
* Matraz Kitasato de vidrio borosilicato Pyrex de 250 mL de capacidad (Afora, Barcelona,
Espaa)
* Placas de petri (Sterilin, Inglaterra)

136
 Procedimiento

Todas las determinaciones bacterianas se realizaron inmediatamente tras la recogida de

las muestras fecales. Se pes aproximadamente 1 g de heces frescas y fueron diluidas en 9 mL
de tampn fosfato (Macfarlane y Englyst, 1986; Ingham, 1999) y mantenidas a 22 C durante
30 min hasta la dispersin de la muestra. Tras realizar las diluciones decimales (10-1-10-6)
necesarias con agua de peptona 0,1% (p/v), se sembr en masa 1 mL del homogeneizado fecal
sobre los medios de cultivo por duplicado como muestra la Tabla 28. Tras sembrar las placas
stas se incubaron a 37 C en aerobiosis o anaerobiosis segn correspondiera, durante 24-48 h
para los mesfilos y 72 h para las bifidobacterias. Los resultados se expresaron como log ufc/g
de heces.

Tabla 28. Medios de cultivo empleados en el recuento de las bifidobacterias y de flora total aerobia y
anaerobia fecal en ratas
Microorganismos Medio de cultivo Referencias
Mesfilos aerobios totales Plate Count Agar (PCA) Alles y col., 1999
Mesfilos anaerobios totales Reinforced Clostridial Agar (RCA) Venketeshwer Rao y col., 1994
Bifidobacterias TPY Agar + NNL Moreno y col., 2000

3.5.8. Determinacin del contenido mineral

Tras la desecacin y obtencin del peso seco de las heces, piezas seas (fmur y tibia)
y fase slida de los contenidos del ciego y del colon, stas fueron incineradas en la mufla a 550
C durante 12 h. Para facilitar la incineracin, se aadieron 2 mL de HNO3 a cada una de las
muestras, se calentaron en una placa hasta la total evaporacin del cido, volviendo a incinerar
a 550 C durante unas 5 h adicionales, siguiendo un proceso similar al realizado por Sherman y
col. (1985). Una vez realizada la incineracin de las muestras se procedi a la determinacin del
contenido de Ca, Fe y Mg por EAA y de P por espectrofotometra de absorcin molecular tal y
como se describe en los apartados 2.5.8. y 2.5.9. de esta seccin, respectivamente.
Las muestras lquidas, correspondientes a la orina y la fase lquida de los contenidos del
ciego y colon, empleadas en la determinacin mineral mediante EAA no sufrieron ningn
tratamiento especial salvo el ya indicado en el punto 3.6.4. Para la determinacin de P, se
emple la cantidad de 1 mL de muestra a la que se le adicion 10 mL del reactivo molibdeno-
vanadato y se enras a 50 mL con agua destilada.

137
3.5.9. Determinacin del contenido mineral en la fase lquida y slida de los
contenidos del ciego y del colon

Reactivos utilizados

* cido clorhdrico (HCl) 0,1 N (Merck, Darmstadt, Alemania)

* cido perclrico (HClO4) 70% (v/v) (Merck, Darmstadt, Alemania)
* cido tricloroactico (C2 HCl3O2) (Merck, Darmstadt, Alemania)
* Cloruro de lantano con una pureza de 99,99% (LaCl3) (Fluka, Buchs, Suiza)

Material y equipo utilizados

* Balanza de precisin modelo ER-180A (Salter ,Tokio, Japn)

* Centrifuga modelo 5416 (Eppendorf, Hamburg, Alemania)
* Estufa de desecacin (aire forzado) modelo 201 (P-Selecta, Barcelona, Espaa)
* Horno mufla modelo L3/S (Naberthem, Bremen, Alemania)
* Liofilizador modelo TD-3-MP (FTS Systems, New York, U.S.A.)
* Placa calefactora (P-Selecta, Barcelona, Espaa)

Procedimiento

Tras descongelar las muestras de los contenidos del ciego y colon se tom una parte de
los mismos y se diluy en cinco partes de agua bidestilada, y a continuacin se centrifugaron a
40.000 x g durante 15 min. El sobrenadante y el precipitado fueron separados y pesados. El
precipitado fue desecado, pesado e incinerado a 500 C durante 12 h en horno mufla,
disolvindose las cenizas en 1 mL de HCl 6 M y 4 mL de agua bidestilada para su atomizacin.
En el caso de Ca y Mg se analizaron en presencia de LaCl3 al 0,1% (Schulz y col., 1993; Baba y
col., 1996).
La distribucin de los minerales entre la fase slida y lquida del contenido cecal se
calcul de la siguiente manera. El precipitado que se obtiene tras la centrifugacin de los
contenidos del ciego y colon es la fase slida, pero sta se encuentra parcialmente contaminada
con sobrenadante (fase lquida). As, el peso real de la fase slida se obtuvo tras la desecacin
del precipitado en una estufa tal y como se indica en el punto 3.5.1. de esta seccin. El peso
real de la fase lquida se obtuvo como la suma del peso de la fase lquida que contaminaba el
precipitado (peso total del precipitado menos el peso real de la fase slida) ms el peso del
sobrenadante. La concentracin de minerales en la fase slida se calcul como la obtenida en el
precipitado total menos la de la fase lquida que contaminaba el precipitado. Mientras que
multiplicando la concentracin mineral en el sobrenadante por el peso real de la fase lquida dio
la cantidad de minerales de la fase lquida (Schulz y col., 1993).

138
3.5.10. Anlisis histolgico del epitelio de la pared del ciego y del colon

Reactivos utilizados

* Clara de huevo
* Eosina G (Merck, Darmstadt, Alemania)
* Etanol absoluto (C2 H6O) (Merck, Darmstadt, Alemania)
* Formaldehdo (CH2O) 36% (v/v) (Merck, Darmstadt, Alemania)
* Glicerina 30% (v/v) (Probus, Barcelona, Espaa)
* Hematoxilina (Merck, Darmstadt, Alemania)
* Parafina 56-58 C Histo grade (J.T. Baker, Holanda)
* Pegamento Histomount (Shandon, Pittsburgh, U.S.A.)
* Timol (Probus, Barcelona, Espaa)
* Xileno (Shandon, Pittsburgh, U.S.A.)
* Xilol (Shandon, Pittsburgh, U.S.A.)

Preparacin de reactivos

Albmina de Mayer: se puso la clara de huevo en agitacin a las revoluciones

necesarias para que se homogeneizara sin que llegase a punto de nieve. Luego se le
aadi la misma cantidad de glicerina 30% y se homogeneiz. A esta solucin se le
aadi un poco de Timol, se agit y filtr.

Material y equipo utilizados

* Bao histolgico (Leica, Bensheim, Alemania)

* Cabina de extraccin de gases
* Cmara modelo DXC-151 AP (Sony, U.S.A.)
* Cassettes de plstico (Simport, Canada)
* Cubreobjetos 24 x 24 mm (Menzel-Glaser, Alemania)
* Cuchillas deshechables modelo 818 del microtomo (Leica, Bensheim, Alemania)
* Dispensador de parafina modelo EG 1160 (Leica, Bensheim, Alemania)
* Estufa Incubac 2000 (P-Selecta, Barcelona, Espaa)
* Lpiz de grafito
* Microscopio ptico Axioskop (Zeiss, Alemania)
* Microtomo modelo RM 2155 (Leica, Bensheim, Alemania)
* Pinzas de diente de ratn de 10 cm (Vidra Foc, Espaa)
* Portaobjetos 76 x 26 mm (Menzel-Glaser, Alemania)

139
 * Procesador de tejidos modelo TP 1050 (Leica, Bensheim, Alemania)
* Programa de ordenador Microm Image Processing (MIP 4 Advanced) (Digital image
systems, Barcelona, Espaa)
* Tabla de madera

Procedimiento

Elaboracin de las preparaciones histolgicas

Tras la extraccin de las muestras de la pared del ciego y del colon, stas fueron
limpiadas, secadas y pesadas. A continuacin fueron fijadas en una solucin de formol al 10%,
con el fin de conservar las muestras en un estado lo ms parecido al estado vivo, hasta su
anlisis. Para ello se sigui el proceso que a continuacin se detalla:
Tallado de la muestra y formacin de cassettes para la impregnacin en parafina. Se
confeccionaron piezas de dimensiones finas (5 a 7 mm) de las siguientes partes: una
muestra del ciego que corresponda al pice del ciego y dos muestras del colon
correspondientes a las zonas proximal (1 cm distal a la unin cecoclica) y distal (1 cm
proximal al recto) (Howard y col., 1995a). Posteriormente se colocaron en el interior
de los cassettes con las pinzas, almacenndose en formol hasta su procesado.
Proceso para la impregnacin de las piezas en parafina. De esta manera se consigue
que los tejidos adquieran una consistencia tal que permita la posterior obtencin de
cortes delgadsimos mediante el microtomo. Este proceso se realiz en un procesador
de tejidos cerrado (Leica modelo TP 1050) durante 18 h, mediante los siguientes
pasos: deshidratacin (por medio de una cadena de alcoholes de concentracin
creciente: 50% < 70% < 96% < absoluto), aclaramiento (mediante xilol) e
impregnacin con parafina a 59 C.
Inclusin de las muestras en parafina y formacin de bloques. El objeto de la
formacin de bloques de parafina que incluyan las muestras a estudiar, es
proporcionar a los tejidos un medio homogneo no slo dentro de la pieza sino
tambin a su alrededor. Los bloques fueron confeccionados en un dispensador de
parafina (Leica modelo EG 1160) y guardados en el congelador hasta que se cortaron
en el microtomo.
Preparacin de portaobjetos. Los portas se limpiaron con alcohol absoluto para
eliminar la posible presencia de grasa y polvo en el mismo. Una vez limpios y secos se
les aadi una gota de solucin fijadora (albmina de Mayer) que se extendi por toda
la superficie. Posteriormente los portas se secaron colocndolos sobre el borde de un
bao de agua caliente.

140
 Obtencin de cortes mediante el microtomo. Antes de realizar los cortes se procedi al
desbastado de los bloques de parafina con el fin de que visualmente aparezcan las
piezas completamente en la superficie de corte. Los cortes, de 4 m de espesor, se
efectuaron con un microtomo (Leica modelo RM 2155) sobre las piezas de los tejidos
incluidos en bloques de parafina previamente enfriados por su superficie de corte.
Luego las lminas inmersas en un bao histolgico fueron pescadas con los
portaobjetos y guardadas en la estufa a 37 C durante al menos 1 h.
Preparacin de los cortes antes de la coloracin. La coloracin de los cortes
histolgicos conlleva un proceso en el que se incluye el desparafinado y la hidratacin
de los mismos. Despus se procede a la coloracin con hemotoxilina-eosina (Rmsy y
col., 1993; Ichikawa y Sakata, 1998; Lu y col., 2000) de los portaobjetos con los
cortes fijados, as como a una posterior deshidratacin, y una fijacin definitiva de los
cubreobjetos, sobre los cortes ya teidos, con pegamento antes de su observacin al
microscopio. Este proceso se detalla a continuacin:

Xilol (15 min)

Alcohol absoluto (5 min)
Desparafinado Alcohol absoluto (5 min)
Alcohol 96% (5 min)
Alcohol 70% (5 min)
Hidratacin Agua (5 min)
Hematoxilina (10 min)
Coloracin Agua (5 min)
Eosina (4 min)
Enjuague con agua
Alcohol 96% (30 seg)
Alcohol absoluto (5 min)
Deshidratacin
Alcohol absoluto (8 min)
Xilol (5 min)
Xilol (3 min)

Evaluacin morfolgica de las preparaciones histolgicas

Una vez teidos los cortes histolgicos, stos fueron observados mediante un
microscopio ptico (Axioskop Zeiss) a los siguientes aumentos: x 10, x 20, x 40 y x 60. En la
realizacin del estudio morfolgico fue utilizado el programa informtico MIP 4 Advanced,
evalundose morfolgicamente un nmero de siete criptas por seccin de tejido (colon
proximal, colon distal y ciego) y grupo, que inclua a su vez a tres animales, por lo que de cada

141
grupo y cada seccin se analizaron veintiuna criptas. Las mediciones se realizaron con el fin de
determinar la altura ( profundidad) de la cripta (distancia lineal desde la base hasta el pice de
la cripta) y la densidad celular (nmero clulas por cripta). La densidad celular se realiz
contando el nmero de clulas en el lado derecho de la seccin axial de una cripta (Howard y
col., 1995a; Ichikawa y Sakata, 1998). En la Figura 16 se muestra una imagen de las criptas
epiteliales del colon proximal, y las medidas realizadas sobre la misma (A: profundidad de la
cripta; B: ncleo de una clula epitelial).

Figura 16. Imagen de las criptas epiteliales del colon proximal de ratas. A, muestra la
profundidad de la cripta medida en m, y B, muestra el ncleo de una de las clulas
epiteliales.

142
3.5.11. Clculos realizados para la evaluacin del balance mineral

En la evaluacin del balance mineral se procedi a la determinacin del porcentaje de

absorcin aparente y retencin mineral respecto a la ingestin de estos elementos por los
animales segn el tipo de dieta.
El porcentaje de absorcin aparente (AA) es el porcentaje de absorcin mineral ingerido
respecto al excretado. El porcentaje de la retencin (R) se considera como el porcentaje
mineral retenido por la rata durante la experiencia respecto al mineral ingerido.
Estos parmetros fueron calculados segn las siguientes frmulas:

(I - EH)
AA (%) = x 100
I

(I - EH - EO)
R (%) = x 100
I

donde I es la cantidad de mineral ingerido por la rata durante el balance; EH es la cantidad de

mineral excretado en las heces durante el periodo de balance, EO es la cantidad de mineral
excretado por la orina durante el periodo de la experiencia.

3.5.12. Validacin de la determinacin mineral

La validacin de los resultados obtenidos en la determinacin mineral mediante

espectrofotometra de absorcin atmica (Ca, Mg y Fe) y espectrofotometra molecular (P), se
llev a cabo teniendo en cuenta la linealidad del mtodo analtico mediante obtencin de la
curva de calibrado y el coeficiente de correlacin para cada mineral. Tambin se determin la
exactitud del mtodo mediante el ensayo de recuperacin, de tal forma que a cada tipo de
muestra se aadieron concentraciones conocidas de patrn y mediante el clculo del porcentaje
de recuperacin se determin la exactitud de la tcnica. Por ltimo la precisin del mtodo se
realiz midiendo una muestra elegida al azar 18 veces en el mismo da y otra 10 veces en das
diferentes en tres semanas para cada mineral.

143
4. ANLISIS ESTADSTICO

En los tres estudios en los que se ha dividido la presente tesis fue realizado un anlisis
de varianza (ANOVA) para comprobar los efectos de las fuentes de variacin medidas en cada
uno de ellos (evaluacin del crecimiento de bifidobacterias, evaluacin de la viabilidad de las
bifidobacterias, adicin de probiticos y prebiticos a frmulas infantiles), partiendo de la
hiptesis nula de la no existencia de diferencias entre las medias de las variables examinadas.
En aquellos casos en los que fueron detectadas diferencias debidas a las anteriores fuentes de
variacin se realiz un anlisis de comparaciones mltiples por parejas utilizando las pruebas de
Tukey y Dunnett. La prueba de Tukey fue empleada para comparar el efecto de la fuente de
variacin entre los grupos problema, mientras que la de Dunnett (prueba de contraste bilateral)
se emple para comparar cada grupo problema con el control.

En el tercer estudio fueron realizados los anlisis adicionales que a continuacin se

detallan. La relacin entre el balance mineral (absorcin aparente y retencin mineral) y el
depsito de minerales en fmur y tibia con los parmetros medidos en el lumen intestinal (pH y
proliferacin de la mucosa: altura de criptas y densidad celular) fue determinado mediante un
anlisis de correlacin controlando el efecto de las diferentes dietas, utilizando el coeficiente de
correlacin de Pearson, que mide la relacin lineal entre dos variables cuantitativas. Para
predecir la absorcin mineral a partir del pH y la proliferacin de la mucosa (altura de criptas y
densidad celular) fue realizado un anlisis de regresin lineal simple o mltiple mediante la
tcnica de pasos sucesivos, que permite seleccionar diferentes modelos predictivos para
explicar el comportamiento de una variable dependiente (absorcin mineral) a partir de un gran
nmero de variables independientes. Finalmente, para explicar el depsito mineral en huesos a
partir de las variables estudiadas fue realizado un anlisis factorial mediante el mtodo de
extraccin de factores anlisis de componentes principales. Con el anlisis factorial se
persigui la reduccin de datos para identificar un pequeo nmero de factores o variables que
expliquen la mayora de la varianza observada. De esta manera se pueden generar hiptesis
relacionadas con los mecanismos de depsito mineral en huesos mediante la colinealidad de las
variables o su relacin de proximidad (o disimilaridad) segn su disposicin en el espacio
mtrico representado por todas las variables.

En todos los casos un valor de p<0,05 fue considerado como significativo. Los
resultados de la presente tesis muestran el valor medio y el error estndar obtenido por
triplicado en los dos primeros estudios, mientras que en el tercero se corresponde con los datos
obtenidos de seis ratas por dieta. El anlisis estadstico se realiz mediante el programa
informtico SPSS para Windows versin 10.0.6 (SPSS Inc., Chicago, IL).

144
RESULTADOS Y DISCUSIN

1er ESTUDIO

1. Evaluacin del crecimiento in vitro de bifidobacterias y del cambio de pH del caldo

de cultivo, en presencia de diferentes oligosacridos no digeribles (OND)

El crecimiento de una poblacin o cultivo bacterianos se puede expresar en funcin del

aumento de la masa del cultivo o del aumento del nmero de clulas. Dentro de los mtodos
empleados para medir la masa bacteriana de una forma indirecta, estn los denominados
mtodos turbidimtricos (pticos) cuyo fundamento consiste en medir la cantidad de luz
dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano y que es, dentro de ciertos lmites,
proporcional a la masa del cultivo. Uno de los mtodos ms utilizados es la medicin de la luz
transmitida a travs de la escala de MacFarland (Meyer y col., 1985).
Numerosos estudios han evaluado la fermentacin in vitro de diferentes OS por las BAL
y en particular por las bifidobacterias, as como su crecimiento mediante el uso de la DO a
diferentes longitudes de onda (Gmez Zavaglia y col., 1998; Shin y col., 2000a; Crittenden y
col., 2001; Perrin y col., 2001).
En la Tabla 29 se muestra el anlisis de varianza para el crecimiento de bifidobacterias
(DO y log ufc/mL) y el pH del caldo de cultivo en funcin del substrato utilizado, del tiempo de
incubacin y de la interaccin de ambos. El uso de cinco substratos diferentes influy
significativamente (p<0,001) en el pH del caldo y crecimiento de las bifidobacterias en los
cuatro microorganismos estudiados. El paso de los das desde el inicio de la incubacin (del da
1 al 7) tambin influy significativamente (p<0,001) en el crecimiento de todos los
microorganismos cultivados expresados como DO y log ufc/mL y en el pH del caldo de cultivo.
Por ltimo, la tabla tambin muestra que la interaccin de ambos factores fue una fuente de
variacin para la modificacin del pH y del crecimiento en todas las bifidobacterias ya que para
un substrato determinado y en un da concreto, la medida del crecimiento y del pH mostraron
diferencias estadsticamente significativas (p<0,001) entre ellas para cada microorganismo.

Tabla 29. Anlisis de varianza del pH del medio de cultivo y del crecimiento de 4 especies de
bifidobacterias (expresado en DO y log ufc/mL) utilizando como fuente de variacin el substrato, el
tiempo de incubacin y la interaccin entre ambos
Fuente de
B. bifidum B. breve B. infantis B. longum
variacin
pH DO log ufc pH DO log ufc pH DO log ufc pH DO log ufc
Substrato (S) *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
Tiempo (T) *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
SxT *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
Diferencias significativas para: ***p<0,001

145
 En la Figura 17 se observa el crecimiento bacteriano, expresado como DO y log
ufc/mL, a lo largo los siete das de incubacin de las bifidobacterias con cinco substratos
diferentes. Para ello se estableci una relacin entre la DO del caldo de cultivo y la
concentracin bacteriana expresada en ufc/mL a travs de la escala de MacFarland. De forma
general el patrn de crecimiento bacteriano sigui una tendencia similar en todos los casos,
salvo B. bifidum, con un crecimiento exponencial a las 24 h de incubacin y posteriormente un
crecimiento ms sostenido hasta el 7 da. En el caso de B. bifidum, se observ un
crecimiento rpido y exponencial cuando el substrato empleado fue la glucosa, con los FOS cc
fue ms sostenido y en los tres ltimos das sufri un retroceso. Con el resto de substratos no
se produjo un claro crecimiento hasta el 2 da, mantenindose ms bajo con oligofructosa e
inulina, e incrementndose progresivamente con 4-GOS hasta obtenerse un mayor crecimiento
con este substrato al final del estudio (7 da). B. breve mostr un crecimiento exponencial en
las primeras 24 h con todos los substratos excepto con la inulina, mantenindose el crecimiento
hasta el ltimo da. Sin embargo, con la inulina el crecimiento observado fue bastante menor y
a partir del 3er da se produjo un leve descenso en el mismo. Para B. infantis, el crecimiento
exponencial con los FOS cc y la glucosa no se produjo hasta el 2 da. Con todos los substratos
se obtuvo un crecimiento similar, excepto con 4-GOS e inulina que fue algo menor. En el caso
de B. longum, se reprodujo el patrn de crecimiento ya comentado excepto con la inulina,
donde la fase exponencial de crecimiento fue bastante pequea y el crecimiento con este
substrato a lo largo de los siete das fue ms bajo que con el resto de hidratos de carbono.
En la Figura 18 se observa la variacin de los valores de pH del caldo de cultivo a lo
largo los siete das de incubacin de las bifidobacterias con cinco substratos diferentes. El pH en
el momento de aadir el inculo bacteriano era de 7,00 y en todos los casos se observ que
tras las primeras 24 h de incubacin ste haba descendido al menos en 0,5 puntos, excepto
para los FOS cc cuando sirvieron de substrato a B. bifidum (6,94), B. infantis (7,00) y B. longum
(6,96), la inulina con B. bifidum (6,78) y la glucosa con B. longum (6,81). En el caso de B.
bifidum, la adiccin de inulina al caldo al cultivo prcticamente no modific el pH, y con la
oligofructosa slo lo hizo en 0,5 puntos. Con el resto de substratos el descenso del pH del caldo
de cultivo fue ms o menos acusado, destacando el caso de la glucosa. Para B. breve, se
produjo un descenso bastante pronunciado de los valores de pH excepto con la inulina que slo
descendi hasta 6,5, mientras que el resto se mantuvo entre 4 y 5. Con el cultivo de B.
infantis a las 24 h de incubacin con todos los substratos se obtuvieron unos valores de pH
entorno a 4,5 excepto con los FOS cc que se mantuvieron prcticamente en 7 y con la glucosa
que descendieron a 6,32. Sin embargo a partir del 2 da todos los valores se mantuvieron
hasta el final entre 4,50 y 3,50. En el caso de B. longum, nicamente la glucosa y el 4-GOS
produjeron un descenso de pH significativo a las 24 h. Sin embargo, fue la inulina la que
mantuvo unos valores de pH menos bajos (5,0).

146
 Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium breve
2,5 3
2,5
2

DO (600 nm)
DO (600 nm)

2
1,5
1,5
1
1
0,5 0,5

0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7

Tiempo de incubacin (das) Tiempo de incubacin (das)

Bifidobacterium infantis Bifidobacterium longum

2,5 2,5

2 2
DO (600 nm)

DO (600 nm)
1,5 1,5

1 1

0,5 0,5

0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7

Tiempo de incubacin (das) Tiempo de incubacin (das)

Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium breve

9,5 9,5
Crecimiento bacteriano

Crecimiento bacteriano

9 9
(log ufc/mL)

(log ufc/mL)

8,5 8,5

8 8

7,5 7,5
7 7
0 1 2 3 4 5 6 7
0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo de incubacin (das)
Tiempo de incubacin (das)

Bifidobacterium infantis Bifidobacterium longum

9,5 9,5
Crecimiento bacteriano

Crecimiento bacteriano

9 9
(log ufc/mL)

(log ufc/mL)

8,5 8,5

8 8

7,5 7,5

7 7
0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7

Tiempo de incubacin (das) Tiempo de incubacin (das)

Figura 17. Grficos de medias obtenidas para la interaccin del tiempo de incubacin con el
substrato, donde se muestra el crecimiento de las bifidobacterias (Bifidobacterium bifidum, B. breve,
B. infantis, B. longum) mediante la medicin de cambios en la DO y log ufc/mL. Los substratos
empleados fueron glucosa () y diferentes oligosacridos [FOS cc (), inulina ( ), oligofructosa ( ) y
4-GOS (+)]

147
 Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium breve
7 7
6,5 6,5
6 6

pH
pH

5,5 5,5
5 5
4,5 4,5
4 4
0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7

Tiempodeincubacin(das) Tiempo de incubacin (das)

Bifidobacterium infantis Bifidobacterium longum

7 7
6,5 6,5
6 6
5,5 pH 5,5
pH

5 5
4,5 4,5
4
4
3,5
3,5
0 1 2 3 4 5 6 7
0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo de incubacin (das)
Tiempo de incubacin (das)

Figura 18. Grficos de medias obtenidas para la interaccin del tiempo de incubacin con el substrato,
donde se muestran los cambios de pH en el caldo TPY [glucosa ( ), FOS cc (), inulina ( ), oligofructosa ( )
y 4-GOS (+)] incubado con bifidobacterias (Bifidobacterium bifidum, B. breve , B. infantis, B. longum)

El empleo de la escala MacFarland tiene el inconveniente de ser un mtodo poco

preciso, por lo que ha sido desplazado por mtodos espectrofotomtricos en los que se mide la
DO del cultivo, es decir la absorbancia (Meyer y col., 1985). As pues, en la Tabla 30 se
muestran los valores finales de crecimiento (DO) de bifidobacterias y de pH de caldo de cultivo
tras siete das de incubacin con cinco substratos diferentes. Se puede establecer que en el 7
da de incubacin y para todas las bifidobacterias, fueron los substratos 4-GOS y FOS cc los
que estimularon el crecimiento bacteriano en mayor medida (2,07 en B. bifidum y 2,59 en B.
breve para 4-GOS y 2,22 en B. infantis y 2,03 en B. longum para FOS cc). En cambio, la inulina
fue el substrato que menos estimul el crecimiento bacteriano en todos los casos tras siete das
de incubacin. En cuanto a los valores de pH del caldo de cultivo al 7 da de incubacin,
fueron de nuevo los substratos 4-GOS y FOS cc los que produjeron un mayor descenso del pH
del caldo de cultivo, y la inulina la que menos acidific el pH al final del estudio. Se puede
establecer por tanto una relacin directa entre el crecimiento bacteriano y el descenso de pH, el
cual se hace ms evidente para B. breve y B. longum. En las otras dos especies de
bifidobacterias no ocurri esta relacin, puesto que para B. bifidum se obtuvo un mayor
crecimiento con el 4-GOS y un descenso de pH ms pronunciado cuando fue cultivado con la

148
glucosa y los FOS cc, y B. infantis present un mayor crecimiento con los FOS cc y sin embargo
fue con la oligofructosa y el 4-GOS con los que mostr un menor pH.

Tabla 30. Valores finales de crecimiento de bifidobacterias expresado como densidad

ptica (DO) y de pH del caldo de cultivo obtenidos al 7 da de incubacin
Bifidobacterium spp. Substratos DO pH
B. bifidum glucosa 1,880,001b 4,400,020e
FOS cc 0,680,002d 4,890,015d
inulina 0,340,001e 7,020,026a
oligofructosa 0,770,002c 6,420,025b
4-GOS 2,070,001a 5,040,015c
B. breve glucosa 2,140,001d 4,940,020b
FOS cc 2,380,001c 4,450,010c
inulina 0,570,003e 6,560,020a
oligofructosa 2,390,001b 4,420,036c
4-GOS 2,590,001a 4,060,015d
B. infantis glucosa 2,090,002c 4,090,020b
FOS cc 2,220,002a 3,890,083bc
inulina 1,590,012e 4,330,015a
oligofructosa 2,170,004b 3,750,046c
4-GOS 1,790,017d 3,870,017c
B. longum glucosa 1,700,007d 4,200,020b
FOS cc 2,030,031a 4,090,026d
inulina 0,740,002e 4,940,030a
oligofructosa 1,780,002c 4,150,015c
4-GOS 1,910,010b 4,000,006e
Cada valor es la mediaerror tpico, n=3
a-e
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma columna muestran
diferencias significativas para p<0,001

As pues, de forma general se puede concluir que la inulina fue el substrato con el que
todas las bifidobacterias crecieron en menor medida y cuya fermentacin dio lugar a un
descenso del pH del caldo de cultivo menos acusado. Este hecho coincide con el descrito por
Shin y col. (2000a) que evaluaron el crecimiento de dos cepas de B. bifidum en leche desnatada
fermentada en presencia de FOS cc, GOS e inulina, y observaron que la inulina fue el menos
o
efectivo en la estimulacin del crecimiento bacteriano tras 48 h de incubacin a 37 C. Los
autores sealaron que fue necesaria una concentracin de un 5% de inulina para observar
diferencias significativas (p<0,05) con los controles, y que la produccin de c. actico y c.
lctico medida en el cultivo fue menor (p<0,05) en las cepas que crecieron en presencia de
inulina.
Recientemente Crittenden y col. (2001) evaluaron in vitro el crecimiento de B. lactis B94
con diferentes OS y monosacridos. Observaron que B. lactis B94 fue capaz de crecer mejor
con FOS, GOS y XOS que con sus unidades de monosacrido, la fructosa, la galactosa y la
xilosa, mostrando unos valores de crecimiento medidos como DO a 600 nm en orden
decreciente como sigue: glucosa (1,9) > GOS (1,6) > FOS cc (1,2) > oligofructosa (1,0) >
inulina (0,7). Nuestros datos mostraron una tendencia muy similar a la descrita por Crittenden y
col., siendo 4-GOS y FOS cc los substratos con los que se obtuvieron los mayores crecimientos

149
bacterianos a lo largo de los siete das de incubacin con cualquiera de las bifidobacterias
empleadas. Una posible explicacin a las diferencias encontradas en la fermentacin de los
hidratos de carbono es su GP. As pues, mientras que la inulina es la que posee un GP mayor
(entre 10 y 60), FOS cc y 4-GOS poseen menor GP (de 2 a 3 y de 3 a 5, respectivamente). Se
ha descrito mediante fermentacin in vitro de la inulina y los productos derivados de su
hidrlisis por bacterias fecales humanas, que las molculas con un GP < 10 son fermentadas
dos veces ms rpido que las que tienen un GP > 10 (Roberfroid y col. 1998). Este fenmeno
ha sido observado con diversos OS tambin para las bifidobacterias por varios autores (Gibson
y Wang, 1994a; Hopkins y col., 1998; Bielecka y col. 2002). Adems, se ha sugerido que estos
microorganismos tienen mecanismos de transporte de substratos especficos, que son ms
eficientes para el transporte de OND que para el de azcares simples. En cualquier caso, en
nuestro estudio se observ que la fermentacin de la glucosa dio lugar a un mayor crecimiento
bacteriano que la inulina en todas las bifidobacterias. En este sentido, en un estudio
fermentacin in vitro realizado por Degnan y Macfarlane (1991) utilizando como substratos los
azcares arabinosa, manosa, xilosa, glucosa y galactosa, los mayores rangos de crecimiento se
alcanzaron con los dos ltimos. B. longum, B. bifidum y B. infantis obtuvieron el mayor
crecimiento con glucosa, mientras que B. breve lo obtuvo con galactosa.
En cuanto a la acidificacin del caldo de cultivo, el 4-GOS fue el substrato con el que se
alcanz un valor de pH ms cido a lo largo de los siete das de incubacin con B. breve y B.
longum, siendo adems B. infantis el que alcanz menores valores de pH con cualquiera de los
substratos empleados.
En un medio sinttico, las bifidobacterias se caracterizan por producir 3 moles de c.
actico y 2 moles de c. lctico por cada 2 moles de glucosa (Scardovi y Trovatelli, 1965). Por
tanto y a priori, ya que en nuestro estudio no se midieron los cidos orgnicos producidos por
la fermentacin de los OS, con 4-GOS las bifidobacterias generaron una mayor cantidad de
stos cidos, que son los metabolitos generados en la fermentacin anaerobia de dichos
substratos. Los valores de pH obtenidos en este estudio podran considerarse bajos a los
registrados en otros estudios, sin embargo varios autores han obtenido valores similares. As,
Dubey y Mistry (1996) evaluaron el crecimiento de 4 especies de bifidobacterias (B. bifidum, B.
breve, B. infantis y B. longum) en tres frmulas infantiles durante 24 h. B. bifidum y B. breve
fueron los que alcanzaron un menor pH (4,1 y 4,0, respectivamente) con una frmula con base
de leche. En nuestro estudio los menores valores de pH con 4-GOS a las 24 h fueron obtenidos
con B. breve y B. longum (4,08 y 4,16, respectivamente) para terminar a los 7 das siendo de
4,06 y 4,00 respectivamente. Sin embargo, Ustunol y Gandhi (2001) evaluaron el crecimiento
de dos cepas de B. bifidum en leche desnatada desecada con un 5% de miel (4-5% de OS en
su composicin), sacarosa, fructosa o glucosa durante 48 h. Los valores de pH a las 48 h fueron
de 3,61 para la miel y de 3,67 para la glucosa. Este menor pH con la miel se tradujo en una
mayor concentracin de c. actico y lctico con este substrato. En nuestro caso B. bifidum a
las 48 h obtuvo el pH ms reducido con la glucosa (4,46) mientras que con el resto de

150
substratos no descendi de 5. En otro estudio con mayor tiempo de incubacin, Marx y col.
(2000) describieron que el crecimiento de B. breve y B. longum alcanz su mximo nivel tras
20-25 h de incubacin en presencia de -(2,6)-FOS, mantenindose constante hasta el 5o da.
Durante el crecimiento los valores de pH del medio descendieron, principalmente debido a la
produccin de cidos orgnicos. El pH inicial fue de 6,5 y descendi hasta 5 con B. breve, y 5,3
con B. longum en 24 h, y se mantuvo prcticamente constante hasta el final. Tal y como se ha
descrito anteriormente, en nuestro estudio la fase de mayor crecimiento bacteriano y mayor
acidificacin del medio se produjo en las primeras 24 h, para mantenerse constante el resto del
tiempo.
Los valores de pH ms bajos encontrados en el caldo de cultivo con B. breve y B.
infantis cuando crecieron con 4-GOS respecto a FOScc e inulina tambin fue descrito por
Kajiwara y col. (2002) tras incubar 48 h estos microorganismos en presencia de GOS, FOScc e
inulina al 5%, y fue debido a una mayor produccin de c. lctico en ambos casos.
Rycroft y col. (2001) evaluaron in vitro la fermentacin de distintos OS por
bifidobacterias durante 24 h, y observaron que los OS que contenan galactosa (lactulosa, GOS y
SOS) fueron ms efectivos que los que contenan fructosa (oligofructosa e inulina) en el
incremento del nmero de bifidobacterias. Adems, concluyeron que IOS y GOS fueron los
prebiticos ms efectivos ya que incrementaron el nmero de bifidobacterias ejerciendo poco
efecto sobre el resto de grupos bacterianos (clostridios, bacteroides, lactobacilos, estreptococos
y E. coli), incrementaron significativamente la produccin de lactato y produjeron los volmenes
de gas ms bajos. Este efecto tambin fue observado por Djouzi y Andrieux (1997) en un
estudio con ratas con flora humana asociada, donde los GOS incrementaron el nmero de
bifidobacterias en mayor medida que los FOS.
De los resultados desprendidos en el presente estudio podemos afirmar que de los
substratos evaluados el 4-GOS fue el que estimul en mayor medida el crecimiento in vitro de
las bifidobacterias que con mayor frecuencia se encuentran en las heces infantiles. En cuanto a
las bifidobacterias que mejor crecieron con el 4-GOS fueron B. breve y B. bifidum, y las
bifidobacterias que al fermentar dicho OS descendieron en mayor medida el pH del caldo de
cultivo fueron B. breve y B. longum.
Con los resultados obtenidos en este primer estudio, el siguiente paso fue elaborar
distintas variantes de una frmula infantil comercial mediante la adicin de los probiticos y los
prebiticos previamente seleccionados. Puesto que la elaboracin de la frmula probitica
supona mantener unas condiciones de elaboracin muy estrictas de asepsia y anaerobiosis en el
momento de aadir el microorganismo probitico, se opt por seleccionar entre las frmulas
probiticas disponibles en el mercado, la que proporcionase una combinacin de las especies de
bifidobacteria seleccionadas en nuestro estudio. As pues, se seleccion una frmula probitica
que contena B. bifidum y B. longum, dos de las especies que con mayor frecuencia se aslan en
nios alimentados con lactancia materna (Mitsuoka, 1982; Rasic y Kurmann, 1983), y una

151
frmula infantil comercial para emplearla como base de sta frmula probitica. Para la
elaboracin de las frmulas prebiticas se emple la misma frmula infantil comercial a la que se
le adicion es este caso distintas concentraciones de 4-GOS. Por ltimo tambin se elaboraron
frmulas simbiticas que contenan tanto los probiticos como los prebiticos seleccionados. La
frmula infantil empleada como base para elaborar las dietas prebiticas, probiticas y
simbiticas fue utilizada como control en los estudios posteriores.

152
2 ESTUDIO

A partir de los resultados obtenidos en el primer estudio, fue seleccionada una frmula
infantil probitica que contena B. bifidum y B. longum en su composicin por ser dos de las
especies que mejor crecieron in vitro con el OND (4-GOS) propuesto como prebitico en el
estudio previo. El objetivo del segundo estudio fue evaluar la viabilidad de las bifidobacterias
presentes en la frmula infantil probitica durante el periodo de tiempo que sta estara siendo
consumida segn las especificaciones del fabricante, y que dependiendo de la edad del nio
abarca un tiempo entre seis y catorce das.

2. Evaluaci n del grado de viabilidad de las bifidobacterias en las frmulas infantiles

Algunos estudios (Klaver y col., 1993; Dave y Shah, 1997) han mostrado que las
bifidobacterias crecen poco en la leche y no sobreviven bien en el producto final. El
mantenimiento de la viabilidad de las bifidobacterias en la leche y productos lcteos fermentados
ha sido un reto para los fabricantes de productos lcteos ya que estos microorganismos
requieren para crecer un potencial de oxidacin-reduccin bajo (Shimamura y col., 1992) y son
sensibles a valores de pH bajos, condiciones que no se dan de forma natural en la leche
fermentada. Tambin requieren factores de crecimiento especficos (Klaver y col., 1993; Modler,
1994). Sin embargo, varios investigadores han descrito la viabilidad de las bifidobacterias en
diferentes productos lcteos, como la leche fermentada (Medina y Jordano, 1994), el queso (Roy
y col., 1997), los postres lcteos fermentados congelados (Laroia y Martin, 1991), los helados
(Hekmat y McMahon, 1992) y el yougurt (Shah y col., 1995).
Para que las bifidobacterias produzcan efectos teraputicos, se ha recomendado que
stas sean viables y que se ingieran en cantidades superiores a 106 clulas/g (Kurmann y Rasic,
1991). En Japn, la Asociacin de leches fermentadas y bebidas acidolcticas ha establecido un
estndar que requiere que ms de 107 clulas/g estn presentes en los productos lcteos que
reclaman contener bifidobacterias (Ishibashi y Shimamura, 1993). La Regulacin alimentaria
suiza as como el International Standard de FIL/IDL requieren que tales productos contengan
ms de 106 clulas/g de bifidobacterias (Shin y col., 2000b).
Los principales factores a los que se les ha atribuido el provocar una prdida de la
viabilidad de las bacterias probiticas son el descenso del pH del medio y la acumulacin de
cidos orgnicos, como resultado del crecimiento y la fermentacin por los microorganismos de
los substratos disponibles en el producto lcteo (Shah y Jelen, 1990). Adems, debido a las
caractersticas de las bifidobacterias, su nmero en los alimentos puede sufrir un descenso
debido a la presencia de O2 disuelto, a sus derivados como el H2O2, superxido y radicales
hidroxilo (Carlsson y col., 1978), y a la permeabilidad al O2 del envase. La disponibilidad de
factores de crecimiento tambin afecta a la viabilidad de las cepas probiticas en los productos
lcteos (Shah, 2000).

153
 En la Tabla 31 se muestra el anlisis de varianza del recuento de bifidobacterias, pH y
humedad de las muestras en los estudios de seis y catorce das respectivamente, y que
representan el periodo mnimo y mximo de consumo de la frmula infantil por el nio. En todos
los casos, excepto en la humedad de la muestra en el estudio de seis das, existieron diferencias
estadsticamente significativas (p<0,01) a lo largo del tiempo en las variables estudiadas, sin que
esto haya supuesto una prdida de la dosis mnima efectiva de bifidobacterias en el producto, tal
y como se muestra en las dos siguientes figuras.

Tabla 31. Anlisis de varianza del recuento de bifidobacterias en las frmulas infantiles
durante el periodo de consumo por el lactante (6 y 14 das)
Viabilidad 6 das Viabilidad 14 das
log ufc ** ***
pH *** ***
Humedad NS **
Diferencias significativas para: **p<0,01; ***p<0,001; NS=no significacin

En las Figuras 19 y 20 se muestra la evolucin del recuento de las bifidobacterias en

las frmulas infantiles probiticas tanto en el periodo de seis como en el de catorce das. Como
control se emple la frmula infantil utilizada como base para la elaboracin de la frmula
probitica, y que por tanto no posee ningn tipo de bifidobacteria en su formulacin. Los
resultados obtenidos con la frmula empleada como control no se muestran ya que durante los
catorce das en los que se realiz la microbiologa para detectar la posible presencia de
bifidobacterias, no se observ crecimiento bacteriano alguno en las muestras analizadas.

8 Bifidobacterias Humedad 4
*
7,5 3
Humedad (%)
log ufc/g

7 2

6,5 1

6 0
1 2 3 4 5 6
Tiempo (das)

Figura 19. Viabilidad de las bifidobacterias de la frmula infantil durante el periodo

de consumicin del bote (6 das) y humedad de la frmula durante dicho periodo
* La presencia de asteriscos indica diferencias significativas (p<0,05) de los recuentos de
bifidobacterias del da 2 al 6 con respecto al primer da, realizada mediante un test de
separacin de medias bilateral

154
 En el primer estudio (Figura 19) se tomaron muestras de la frmula infantil probitica
durante seis das consecutivos. Como se puede observar, los recuentos iniciales presentaron un
valor de 7,59 log ufc/g de muestra que se mantuvieron sin mostrar diferencias significativas
(p<0,05) durante los 5 primeros das. Al 6 da los recuentos descendieron significativamente
(p<0,05) hasta 7,10 log ufc/g de muestra, mantenindose en todo caso por encima del valor
recomendado de 106 clulas/g para que el producto tenga efecto en el organismo.

8 Bifidobacterias Humedad 4
* * * * * * * * * *
7,5 3

Humedad (%)
log ufc/g

7 2

6,5 1

6 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Tiempo (das)

Figura 20. Viabilidad de las bifidobacterias de la frmula infantil durante el periodo de

consumicin del bote (14 das) y humedad de la frmula durante dicho periodo.
* La presencia de asteriscos indica diferencias significativas (p<0,05) de los recuentos de bifidobacterias del
da 2 al 14 con respecto al primer da, realizada mediante un test de separacin de medias bilateral

En el segundo estudio (Figura 20), los niveles iniciales observados de bifidobacterias

fueron algo mayores (7,88 log ufc/g de muestra), y se mantuvieron hasta el 4 da sin mostrar
diferencias significativas (p<0,05). El resto de los das y hasta el da catorce de incubacin los
recuentos fueron significativamente (p<0,05) inferiores al recuento del primer da, reducindose
hasta 7,19 log ufc/g de muestra. Al igual que en el estudio previo el recuento obtenido el ltimo
da tambin se mantuvo por encima del valor recomendado, siendo algo superior en este caso
probablemente porque los valores iniciales tambin lo fueron.
En ambos estudios se realiz paralelamente una medicin del grado de humedad de la
muestra para comprobar que un posible y acentuado descenso en el nmero de bifidobacterias
pudiera ser debido a un aumento del contenido de agua de la muestra. En ninguno de los dos
estudios se observ un aumento acusado del nivel de humedad, oscilando entre 2,70 y 3,33%
en el estudio de catorce das.
Otro parmetro que poda afectar a la viabilidad de las bifidobacterias es el pH, por lo
que ste tambin fue medido en la muestra que se utiliz para realizar la siembra microbiolgica
en ambos estudios. El pH tanto en el estudio de seis como de catorce das oscil entre 7,06 el
da 1 y 6,74 el da 14, valores que estn muy por encima de los sealados en otros estudios

155
como causa importante del deterioro de la viabilidad de las bifidobacterias aadidas sobretodo a
leches fermentadas.
Por ltimo y para obtener un valor numrico del grado de viabilidad de las
bifidobacterias de las frmulas infantiles tanto a los seis como a los catorce das, se ha
relacionado el recuento final (6 y 14 da) con el inicial (1er da), obtenindose un valor de un
32,19% de viabilidad para el estudio de seis das, y una viabilidad del 25,55% para el de catorce
das.
La mayora de los estudios de viabilidad de bifidobacterias en productos lcteos
encontrados en la bibliografa cientfica se refieren a yogures o leches fermentadas conservados
en refrigeracin durante varias semanas. En algunos de estos estudios (Yaguchi, 1984; Reuter
1990; Hughes y Hoover, 1995) se ha observado una prdida de la viabilidad bacteriana, ms
pronunciada en leche fermentada que en la leche no fermentada, manteniendo recuentos de
bifidobacterias por encima de 106 ufc/mL tras quince das de almacenamiento la primera, y la
segunda despus de 28 das. En otros trabajos ha sido descrito una prdida de viabilidad de
hasta un 82% de B. infantis en leche desnatada con un pH de 4,3 (Lankaputhra y col., 1996). En
nuestro estudio la viabilidad de las bifidobacterias se mantuvo por encima del nivel recomendado
durante catorce das, posiblemente debido a que el pH de la leche no descendi por debajo de
6,74. Resultados similares de viabilidad fueron obtenidos por Shin y col. (2000b) en dos leches
no fermentadas que contenan bifidobacterias y mantenidas a 4 oC, los autores sealaron que el
pH en ambos casos se mantuvo en valores de 6,6 superiores.
Nosotros empleamos B. bifidum y B. longum como microorganismos probiticos en base
a los resultados obtenidos en el primer estudio, y mediante este estudio hemos constatado su
viabilidad en la frmula infantil durante catorce das. A pesar de que no existan muchos estudios
en los que se compare la capacidad de las diferentes especies de bifidobacteria de mantenerse
viables en los productos a los que se aaden, ha sido descrito que B. bifidum fue ligeramente
ms estable que B. breve tanto en leches fermentadas como no fermentadas vendidas en Japn
(Reuter, 1990). Tambin ha sido descrito que una forma de aumentar la viabilidad de B. bifidum
en leche desnatada fermentada es la adicin de un 5% de FOS cc de GOS a la misma,
consiguiendo unos valores de 67,3 y 52,2% respectivamente, frente al 11,6% de la leche control
(Shin y col. 2000a).
Aunque los porcentajes de viabilidad en nuestro estudio no sean muy elevados, como
hemos visto los recuentos se mantienen siempre por encima de las recomendaciones. Esto
podra ser debido por otra parte a las ventajas que presenta la frmula infantil en polvo sobre
otros productos lcteos, como es su conservacin a temperatura ambiente, el envasado en
atmsfera protectora hasta el momento de su apertura, la escasa humedad del producto, la
estabilidad en el pH y el empleo de un material no permeable al O2 para el envasado, puesto
que se ha observado una prdida importante de la viabilidad de las bifidobacterias aadidas a
yogures envasados en recipientes de plstico en comparacin con los contenidos en botellas de
cristal (Dave y Shah, 1997).

156
3. Composicin de la flora fecal de bebs alimentados con frmula infantil probitica

Una vez comprobada la viabilidad de las bifidobacterias de la frmula infantil probitica

y que sus recuentos se han mantenido por encima del nivel mnimo recomendado de 106
clulas/g durante los catorce das de consumo del producto, se plante un segundo objetivo,
que consisti en la evaluacin de la composicin de la flora fecal infantil durante el primer ao
de vida en funcin de su alimentacin y ms concretamente de la ingestin de una frmula
probitica (FP). Para ello, se administr la FP a un grupo de nios, y a otro grupo de nios una
frmula control (FC), que consisti en la frmula infantil utilizada como base para elaborar la
anterior. En la Tabla 23 de la seccin Material y Mtodos se muestra la pauta de alimentacin
seguida en los cinco nios utilizados en el presente estudio.
La composicin de la microflora residente en el tracto GI de los nios ha sido
determinada ampliamente mediante tcnicas de cultivo estndar y caracterizaciones fenotpicas
(basadas en la morfologa de la colonia y determinados marcadores bioqumicos tales como
actividades enzimticas y productos finales del metabolismo). Sin embargo, estos mtodos de
cultivo tradicionales slo pueden mostrar una parte de la gran diversidad microbiana presente
en el colon infantil, ya que slo son aplicables a bacterias cultivables y con bastante frecuencia
los medios elegidos no son selectivos para la especie o gnero bacteriano requerido (Silvi y col.,
1996; Hartemink y Rombouts, 1999).
As en los ltimos aos se estn empleando con gran xito tcnicas de biologa
molecular para el estudio de la microflora del tracto GI. En los procariotas el anlisis
comparativo del ARN ribosomal, en particular de los genes 16S y 23S ARNr, se han empleado
en la identificacin de las bacterias desde nivel de gnero hasta especie o cepa (Langendijk y
col., 1995). En particular, la reaccin en cadena de la polimerasa usando los cebadores 16S
ARNr se ha aplicado con xito en la deteccin y cuantificacin de los anaerobios predominantes
en la heces tanto de nios como adultos (Wang y col., 1996), as como en el seguimiento de
Bifidobacterium como probitico en las heces de nios alimentados con una frmula infantil
instantnea que contiene dicha cepa (Kok y col., 1996b).
El presente estudio se realiz con las tcnicas de microbiologa convencionales puesto
que el nmero de microorganismos a investigar fue reducido, as como por el hecho de que los
medios de cultivos empleados para su recuento en placa estn suficientemente aceptados en la
bibliografa cientfica como adecuados para las bacterias investigadas: anaerobios totales,
bacteroides, bifidobacterias y clostridios.
En la Tabla 32 se muestra el anlisis de varianza de los recuentos microbiolgicos y pH
fecales de los cinco bebs alimentados con FC FP durante el 1er ao de vida. En todos los
casos las diferencias fueron estadsticamente significativas (p<0,001), debido a que la
alimentacin durante el 1er ao de vida del beb influy significativamente en el recuento
microbiolgico fecal y ste a su vez en los valores finales de pH fecal debidos a la produccin
de c. orgnicos.

157
 Tabla 32. Anlisis de varianza de los recuentos de la microbiota fecal infantil y del pH a lo
largo del 1er ao de vida entre los grupos alimentados con frmula control y frmula
probitica
Microorganismo Beb 1 Beb 2 Beb 3 Beb 4 Beb 5
Anaerobios totales *** *** *** *** ***
Bacteroides *** *** *** *** ***
Bifidobacterias *** *** *** *** ***
Clostridios *** *** *** *** ***
pH *** *** *** *** ***
Diferencias significativas para: ***p<0,001

En la Tabla 33 se muestran los recuentos (log ufc/g heces) de los anaerobios totales,
bacteroides, bifidobacterias y clostridios encontrados en cinco bebs durante el primer ao de
vida, dos de ellos alimentados con una FC y los otros tres con la misma FP. Tal y como se
recomienda (ESPGAN, 1981), la FP no se les administr a los bebs problema hasta los cuatro
meses de edad. Los dos primeros recuentos se caracterizaron por presentar una menor
cantidad de bacteroides (excepto el beb 5 en el 1er mes) y clostridios (excepto en el 3er mes)
en los bebs alimentados con FP que los alimentados con FC, a pesar de estar todos ellos a
base de leche materna y/o frmula infantil de inicio. El recuento de bifidobacterias en este
periodo se caracteriz por ser muy similar entre todos los bebs y por disminuir a los tres
meses de edad (excepto en el beb 2). En el beb 1, alimentado con FC, los recuentos de
bifidobacterias y clostridios se mantuvieron sin cambios a lo largo del tiempo, mientras que el
de bacteriodes disminuy significativamente (p<0,05). Los recuentos de bacteroides y
clostridios en el beb 2 alimentado con FC no presentaron una tendencia clara en el tiempo, sin
embargo el contenido de bifidobacterias disminuy significativamente (p<0,05) con la edad (de
7,12 log ufc/g al mes de edad hasta 6,62 log ufc/g al ao de edad). Entre los bebs
alimentados con FP el recuento de bacteroides con el tiempo se mantuvo sin cambios
significativos (p<0,05) en el beb 3 (de 6,71 log ufc/g al mes de edad hasta 6,84 log ufc/g al
ao de edad), aument de forma significativa (p<0,05) hasta el 9 mes en el beb 4 (7,35 log
ufc/g) hasta el 7 mes en el beb 5 (7,90 log ufc/g), para disminuir posteriormente de forma
significativa (p<0,05). En cuanto a los clostridios, se produjo un aumento significativo (p<0,05)
a partir del 7 mes en el beb 1 (6,10 log ufc/g), en el 12 mes en el beb 4 (7,68 log ufc/g), y
sin mostrar una clara tendencia y terminar disminuyendo significativamente (p<0,05) en el 12
mes en el beb 5 (4,81 log ufc/g). Las bifidobacterias mostraron una clara tendencia a
disminuir con la edad en los bebs alimentados con FC. Entre los alimentados con FP, los bebs
3 y 4 aumentaron el recuento a partir del 7 mes (6,94 y 8,14 log ufc/g, respectivamente)
aunque en el caso del beb 4 ste disminuy al final (6,12 log ufc/g) de forma significativa
(p<0,05). El beb 5 mostr una recuperacin significativa (p<0,05) del nmero de
bifidobacterias en el 5 mes (8,84 log ufc/g) pero a partir del 7 mes el recuento disminuy
(8,12 log ufc/g) de forma significativa (p<0,05) con la edad.
Para resumir los resultados presentados en la Tabla 33, hay que destacar la falta de
homogeneidad en los recuentos de bacteroides y clostridios entre los distintos bebs hayan o

158
no recibido la FP. En cuanto al recuento de bifidobacterias, mientras que los bebs alimentados
con la FC ste disminuy progresivamente con la edad, en los alimentados con la FP se observ
una recuperacin tras la administracin de dicha frmula, aunque al final del estudio los
recuentos disminuyeran.
Los recuentos obtenidos de los diferentes microorganismos en el 1er y 3er mes de vida
coinciden con otros recuentos encontrados en la bibliografa cientfica para esta edad tanto con
alimentacin con frmula infantil (Lundequist y col., 1985; Kleessen y col., 1995) como con
leche materna (Lundequist y col., 1985; Kleessen y col., 1995; Orrhage y Nord, 1999). Para los
recuentos a partir del 5 mes apenas existen estudios sobre la composicin de la microflora
infantil a estas edades. Se han descrito recuentos de clostridios que oscilan de 4 a 5,5 y 5,8 log
ufc/g heces para nios alimentados con leche materna a los seis y doce meses (Orrhage y
Nord, 1999). Estos recuentos coinciden con los hallados por nosotros, as como tambin para
los obtenidos en el caso de los bacteroides y las bifidobacterias al ao de edad en el que se
describen recuentos de 7 y 7,3 log ufc/g heces, respectivamente.

Tabla 33. Recuento microbiolgico en muest ras fecales infantiles a lo largo del 1er ao de vida
Tipo de frmula Edad del beb
Microorganismo 1 mes 3 meses 5 meses 7 meses 9 meses 12 meses
Control (beb 1)
Anaerobios totales 7,760,04 ab 8,460,01 a 6,600,41 d 7,950,03 ab 6,750,10 cd 7,480,00 bc
Bacteroides 7,240,04 ab 7,360,05 a 7,160,05 bc 7,170,03 bc 7,050,02 c 6,450,02 d
Bifidobacterias 7,250,04 a 5,830,17 bc 5,430,20 c a
6,740,03 5,660,031 bc
6,110,01 b
Clostridios 6,440,22 ab 6,450,04 ab 6,790,01 a 6,040,02 b
3,840,07 c
6,800,27 a
Control (beb 2)
Anaerobios totales 9,120,03 a 8,770,01 b 8,770,04 b 7,580,14 c 7,480,01 c 7,010,04 d
Bacteroides 6,910,43 ab 7,710,12 a 5,780,01 c 7,060,13 ab 7,280,07 ab 6,570,03 bc
Bifidobacterias 7,120,08 b 7,650,03 a 7,060,02 b 7,210,04 b 7,260,05 b 6,620,08 c
Clostridios 6,720,01 a 3,480,01 d 6,630,18 a 6,210,02 b 5,190,03 c 5,860,05 b
Probitica (beb 3)
Anaerobios totales 8,470,09 a 6,940,12 bc 7,190,12 bc 7,310,12 b 6,700,14 c 7,320,01 b
Bacteroides 6,710,08 a 6,570,10 a 6,710,04 a 6,520,16 a 5,780,01 b 6,840,08 a
Bifidobacterias 8,200,01 a 6,050,01 d 5,650,17 e 6,940,11 c 7,540,01 b 7,320,12 b
Clostridios 5,940,23 a 5,400,05 bc 5,370,03 c 6,100,01 a 5,930,01 a 5,870,07 ab
Probitica (beb 4)
Anaerobios totales 7,640,45 ab 6,710,08 b 8,490,06 a 8,250,01 a 7,910,16 6,750,17 b
Bacteroides 5,570,11 b 5,520,24 b 4,470,01 c 6,710,06 a 7,350,26 a 5,780,01 b
Bifidobacterias 8,820,13 a 7,650,32 b 7,580,11 b 8,140,06 ab 8,140,18 ab 6,120,20 c
Clostridios 4,600,08 d 5,370,13 cd 6,050,06 bc 6,140,17 bc 6,410,18 b 7,680,07 a
Probitica (beb 5)
Anaerobios totales 7,910,27 bc 7,640,14 bc 8,860,08 a 8,220,08 ab 8,200,09 ab 7,360,10 c
Bacteroides 7,510,23 ab 5,120,03 c 7,900,03 a 7,900,03 a 7,400,01 b 7,280,06 b
Bifidobacterias 7,850,27 bc 6,760,02 d 8,840,03 a 8,120,06 b 7,850,13 bc 7,380,05 c
Clostridios 5,030,16 abc 5,470,02 a 5,240,04 ab 4,710,04 c 5,350,15 a 4,810,11 bc
Cada valor es la media del log ufc/g heces en peso hmedoerror tpico, n=3
a-e
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma fila para cada beb muestran diferencias
significativas (p<0,001) para el recuento de cada microorganismo en las diferentes edades

159
 En la Tabla 34 se muestran los valores de pH medidos en las diferentes muestras
fecales de los cinco bebs del presente estudio. La tendencia general es hacia un aumento del
pH de las heces conforme los bebs avanzan en edad. De hecho en cuatro de los cinco bebs
(bebs 1, 2, 4 y 5) el valor de pH ms elevado se encuentr en la muestra correspondiente al
ao de edad. Los valores ms bajos de pH se mostraron en todos los bebs, excepto el beb 4,
dentro de los tres primeros meses.
El hecho de que las heces de los nios alimentados a pecho tengan un menor pH que
los alimentados con frmula infantil ha sido observado en varios estudios (Balmer y col., 1989;
Kleessen y col., 1995; Langhendries y col., 1995). Se ha sugerido que el elevado contenido en
lactosa, y bajo contenido en protenas y fosfatos de la leche materna podran actuar como
factores bifidognicos (Yoshioka y col., 1983). Adems su baja capacidad tamponadora
favorece el crecimiento de las bifidobacterias, ya que la fermentacin de la lactosa mantiene la
acidez intestinal mediante la produccin de c. actico y c. lctico (Yoshioka y col., 1983). En
nuestro estudio, los bebs 1 y 5 fueron los que mostraron un pH significativamente (p<0,001)
ms reducido en la primera muestra debido a que fueron los nicos bebs que tomaron leche
materna como nico alimento durante el primer mes. Langhendries y col. (1995) tambin
encontraron que al mes de edad, el grupo de bebs alimentados nicamente con leche materna
present un pH significativamente (p<0,05) ms bajo (5,07) que el grupo alimentado con
frmula infantil a base de suero lcteo (5,52), pero no mostr diferencias con el pH de las
heces del grupo cuya frmula contena B. bifidum (5,30), siendo las bifidobacterias la flora
anaerobia predominante en los nios alimentados a pecho y con la frmula probitica. Kleessen
y col. (1995) encontraron unos valores de pH ms similares a los nuestros en un grupo de nios
alimentados con leche materna o con frmula infantil a base de suero lcteo al mes (6,22 y
6,99, respectivamente) y tres meses (5,82 y 7,22, respectivamente) de edad.

Tabla 34. Valor de pH de las muestras fecales infantiles a lo largo del 1er ao de vida
Edad del beb
Tipo de frmula
1 mes 3 meses 5 meses 7 meses 9 meses 12 meses
Control (beb 1) 5,480,07 e 7,070,05 b 6,390,03 d 6,780,01 c 7,000,01 b 7,400,009a
Control (beb 2) 6,430,07 d 6,230,01 e 6,930,02 c 7,280,02 b 7,490,03 a 7,580,01 a
Probitica (beb 3) 6,960,03 d 7,150,01 c 6,340,03 e 7,870,01 a 7,720,01 b 7,210,02 c
Probitica (beb 4) 6,710,006b 5,980,003d 6,720,007b 6,390,006c 5,720,003e 7,640,006a
Probitica (beb 5) 5,580,05 e 7,180,005b 6,920,02 c 6,280,009d 7,180,01 b 8,020,009a
Cada valor es la mediaerror tpico, n=3
a-e
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma fila muestran diferencias significativas
(p<0,001) para cada valor de pH en las diferentes edades

La Tabla 35 muestra el anlisis de varianza para observar las diferencias existentes

entre los diferentes recuentos microbiolgicos del grupo de bebs alimentados con FC (beb 1 y
2) y del grupo alimentado con FP (bebs 3, 4 y 5) a diferentes edades durante el 1er ao de
vida. Los recuentos bacterianos mostraron una gran variabilidad hasta el 3er mes debido
posiblemente al hecho de que la adquisicin por el nio de un tipo de flora u otra est

160
fuertemente influenciado por la propia flora vaginal e intestinal de la madre, por el tipo de parto
(vaginal o por cesrea) y el tipo de lactancia (materna o artificial) (Lundequist y col., 1985).
Respecto a la influencia del parto, son de gran importancia las condiciones ambientales de la
sala de maternidad y la higiene de las manos del personal mdico y de enfermera durante el
parto (Lundequist y col., 1985; Grnlund y col., 1999). A partir del 5 mes no se detectaron
diferencias significativas (p<0,05) en los recuentos de anaerobios totales, bacteroides y
bifidobacterias, aunque si lo fueron para los clostridios (p<0,001). Este hecho coincide con el
inicio de la toma de la FP y de la alimentacin complementaria, caracterizada sta ltima por
asemejar el perfil microbiolgico entre los nios alimentados a pecho y los alimentados con
frmula (Stark y Lee, 1982), y por tanto ser la responsable de que los recuentos de anaerobios
totales, bacteroides y clostridios (salvo el 9 mes) se mantengan sin diferencias entre ambos
grupos hasta el ao de edad. En el 7 y 9 mes ya se apreciaron diferencias en el recuento de
las bifidobacterias entre el grupo alimentado con FP y el control. La diferencia se observa
claramente en la Figura 21 donde los recuentos de bifidobacterias en estos dos meses fueron
significativamente (p<0,05) superiores en el grupo alimentado con FP. Tambin se puede
observar un significativo (p<0,01) mayor nmero de bifidobacterias en el 1er mes de edad en
este mismo grupo debido posiblemente al efecto de la leche materna, puesto que a esa edad
todava no tomaban la FP. Por ltimo como se puede observar en la Tabla 35, a los doce
meses la similitud de los recuentos microbiolgicos fecales entre ambos grupos afecta a todas
las bacterias estudiadas, debido posiblemente a que la gran diversidad de alimentacin que el
nio toma a esa edad y a que el aporte de la FP a la dieta infantil se ve reducido
considerablemente, promoviendo el desarrollo de una microflora intestinal con una mayor
variedad de especies bacterianas (Stark y Lee, 1982).

Tabla 35. Anlisis de varianza de los recuentos de la microbiota fecal infantil a diferentes edades entre
los grupos alimentados con frmula control y frmula probitica
Edad del beb
Microorganismo
1 mes 3 meses 5 meses 7 meses 9 meses 12 meses
Anaerobios totales NS *** NS NS NS NS
Bacteroides NS *** NS NS NS NS
Bifidobacterias ** NS NS * *** NS
Clostridios *** NS *** NS *** NS
Diferencias significativas para: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; NS=no significacin

161
 9 control probitica

* *
Recuento bifidobacterias 8
(log ufc/g heces)
7

4
1 3 5 7 9 12
Edad (meses)

Figura 21. Recuento de bifidobacterias en los grupos alimentados con frmula control
y frmula probitica durante el 1er ao de vida
* La presencia de asteriscos indica diferencias significativas (p<0,05) de los recuentos de
bifidobacterias del mes 3 al 12 entre ambos grupos, realizada mediante un test de separacin de
medias bilateral

En la Figura 22 se representa el pH de las muestras fecales de los grupos alimentados

con FC FP. Anteriormente se ha descrito que en varios estudios se observ un menor pH fecal
en nios alimentados con leche materna y con frmula probitica respecto a los nios
alimentados con frmula infantil (Langhendries y col., 1995). Tal y como se muestra en la
Figura 22, en nuestro estudio no existieron diferencias significativas (p<0,05) en el pH de las
muestras fecales en ninguna edad, sin embargo, a los siete y nueve meses los valores de pH
fueron menores en el grupo alimentado con FP respecto al alimentado con FC, edades en las
que el recuento de bifidobacterias fue significativamente (p<0,05) superior en el grupo
alimentado con FP.

8 control probitica

7,5

6,5
pH

5,5

4,5

4
1 3 5 7 9 12
Edad (meses)

Figura 22. pH de las heces infantiles en los grupos alimentados con frmula control
y frmula probitica durante el 1er ao de vida

162
 Tras realizar los recuentos microbiolgicos de las bifidobacterias, se procedi al
aislamiento de una colonia por muestra en cada uno de los periodos de muestreo con el fin de
incubarla posteriormente en la galera api 50 CHL y obtener un perfil bioqumico que permita su
caracterizacin. Previamente, estas colonias fueron estudiadas al microscopio, aprecindose que
todas ellas fueron gram-positivas y con una morfologa pleomrfica.
El patrn de fermentacin de las bifidobacterias aisladas de las muestras fecales
infantiles se muestra en la Tabla 36. Se observa que en todas las muestras se repite un patrn
de fermentacin muy similar por lo que no se puede asegurar que las bacterias probiticas
afecten de forma definitiva a las bifidobacterias fecales. Adems, en casi todos los casos las
colonias no fermentaron el substrato rafinosa, que fue la fuente de carbono empleada en el
medio de cultivo Raffinose-Bifidobacterium (RB) utilizado en el recuento y aislamiento de las
bifidobacterias fecales. Moreno y col. (2000) tampoco encontraron que la galera api 50CHL
resultara del todo reproducible al 100% en la identificacin de las bifidobacterias en productos
lcteos, y concluyeron que para estas bacterias no se encontr ninguna batera de pruebas
bioqumicas que diferencien claramente este gnero, a pesar de que otros autores consideran
este sistema adecuado (Shin y col., 200b).
Como conclusin en esta fase, podemos afirmar que las bacterias B. bifidum y B.
longum presentes en la frmula infantil estudiada mostraron unos recuentos por encima de 106
ufc/g durante los catorce das de consumo del producto. Sin embargo, cuando sta fue
administrada a un grupo de bebs desde el 4 hasta el 12 mes de edad, nicamente se obtuvo
un recuento de bifidobacterias fecales significativamente (p<0,05) superior al del grupo
alimentado con frmula control a la edad de siete y nueve meses, sin mostrar diferencias ni en
el 5 mes, debido probablemente a que era demasiado pronto para observar algn efecto, ni en
el 12 mes por la escasa aportacin cuantitativa de la frmula probitica a la dieta del nio a
esa edad. Adems, el patrn de fermentacin de azcares (api 50 CHL) mostrado por las
bifidobacterias fecales no indic ningn cambio en la composicin de esta especie bacteriana
tras la administracin de la frmula probitica.

163
 164
Tabla 36. Patrn de fermentacin de las bifidobacterias aisladas de las muestras fecales infantiles mediante la galera api 50CH. Los resultados se muestran por

49. 5 -keto-glucona to
48. 2 -keto-gluconato
47. Gluconato
46. L-Arabitol
45. D -Arabitol
44. L-Fucosa
43. D -Fucosa
42. D -Tagatosa
41. D -Lixosa
40. D -Turanosa
39. 2 -Gentiobiosa
38. Xilitol
37. Glucgeno
36. Almidn
35. D -Rafinosa
34. Melezitosa
33. Inulina
32. Trealosa
31. Sacarosa
30. Melobiosa
api 50 CHL

29. Lactosa
28. Maltosa
27. Celobiosa
26. Salicina
25. Esculina
24. Arbutina
23. Amigdalina
22. N -Acetil-glucosamina
21. 1 -Metil-D-glucsido
20. 1 -Metil-D-mansido
19. Sorbitol

beb (1, 2, 3, 4 y 5) y periodo de muestreo (1, 3, 5, 7, 9 y 12).

18. Manitol
17. Inositol
16. Dulcitol
15. R amnosa
14. L-Sorbosa
13. D -Manosa
12. D -Fructosa
11. D -Glucosa
10. Galactosa
9. 2 -Metil-xilsido
8. Adonitol
7.L-Xilosa
6. D -Xilosa
5. Ribosa
4. L-Arabinosa
3. D -Arabinosa
2. Eritritol
1. Glicerol

1.12

2.12

3.12

4.12

5.12
1.1
1.3
1.5
1.7
1.9

2.1
2.3
2.5
2.7
2.9

3.1
3.3
3.5
3.7
3.9

4.1
4.3
4.5
4.7
4.9

5.1
5.3
5.5
5.7
5.9
Muestra
3er ESTUDIO

4. Estudio in vivo con ratas del efecto de los probiticos, prebiticos y simbiticos en
frmulas infantiles sobre la absorcin mineral

Los resultados obtenidos en el estudio in vitro del primer estudio del presente trabajo
nos llevaron a la eleccin de 4-GOS como prebitico para ser aadido tanto a una frmula
infantil normal como a una frmula probitica (B. bifidum y B. longum) a la concentracin de
1,2, 5 y 10%. De tal forma que fueron elaboradas un total de siete dietas problema
denominadas dieta probitica, prebiticas (1,2, 5 y 10%) y simbiticas (1,2, 5 y 10%)
empleando la frmula infantil como control y una dieta de mantenimiento (dieta AO4) como
referencia del normal desarrollo de los animales. El objetivo principal de este tercer estudio fue
evaluar el efecto de los probiticos y prebiticos, tanto de forma individual como conjunta
(simbiticos) aadidos a las frmulas infantiles, sobre la absorcin mineral mediante la
administracin de las dietas anteriores en ratas recin destetadas durante 30 das.
Los estudios en bebs son muy limitados por razones ticas y de metodologa, por lo
que en su sustitucin se emplean las tcnicas in vitro en las que se simulan las condiciones
fisiolgicas del organismo destino del estudio. Una alternativa son los estudios in vivo
empleando cras de rata como un modelo infantil animal para la evaluacin de la disponibilidad
mineral en frmulas infantiles (Lnnerdal y col., 1993, 1994). En este trabajo fueron empleados
animales separados de sus madres a las tres semanas de edad ya que todava son lactantes y
constituyen un mejor modelo que la rata adulta. Para Sarri y col. (2001) es razonable y lgico
que se usen las cras con una dieta a base de leche y presumiblemente tengan una fisiologa
gastrointestinal con mayor similitud a la del nio.

4.1. Efecto sobre las medidas fisiolgicas y tasa de crecimiento de las ratas

Durante el estudio fueron medidos distintos parmetros fisiolgicos en los animales,

tales como el peso corporal, la ganancia de peso, la toma de alimento y agua, y la excrecin de
heces y orina, con el fin de evaluar posibles diferencias en la fisiologa de las ratas como
consecuencia del consumo de una u otra dieta.
La Tabla 37 muestra el anlisis de varianza realizado a los parmetros medidos en los
animales para evaluar el crecimiento de los mismos como son el peso corporal final, la ganancia
de peso y la ingestin total de alimento, as como la eficiencia alimentaria obtenida tras el
consumo de las distintas dietas utilizadas. Tal y como se muestra todos estos parmetros se
vieron significativamente (p<0,001) afectados por el consumo de una u otra dieta.

165
 Tabla 37. Anlisis de varianza de los parmetros peso final, ganancia de peso,
ingestin de alimento y eficiencia alimentaria debido a las dietas objeto de estudio, y
estudio del efecto del peso inicial de los animales en la variacin de estos parmetros
MANCOVA
Variable ANOVA
covariable: peso inicial
Peso final *** ***
Ganancia de peso *** NS
Ingestin total de alimento *** **
Eficiencia alimentaria *** NS
Diferencias significativas para: **p<0,01; ***p<0,001; NS=no significacin

Para la discusin de los resultados y el anlisis estadstico de los datos obtenidos se ha

prescindido del primer grupo (alimentado con la dieta AO4), ya que la alimentacin de este
grupo consisti en un tipo de dieta distinto al empleado con el resto de grupos. Dicho grupo
(alimentado con una dieta especfica para ratas de laboratorio) se utiliz como referencia para
monitorizar el crecimiento de los animales alimentados con las frmulas infantiles problema. De
todas formas, los resultados obtenidos con este grupo tambin se muestran en las diferentes
tablas con el fin de apreciar de un modo ms ntido las diferencias existentes con el resto de
grupos.
En la Tabla 38 se muestran los parmetros relacionados con el crecimiento y la
eficiencia alimentaria de las ratas alimentadas con las nueve dietas experimentales. Tal y como
se puede observar el peso de los animales al inicio del estudio difiri significativamente
(p<0,05) entre los diferentes grupos. Los grupos con animales de mayor peso fueron los
grupos con las dietas AO4 y control (89,37 y 72,67 g, respectivamente), oscilando el peso para
los restantes grupos entre 36,32 y 55,93 g (grupos alimentados con las dietas simbiticas al 1,2
y 10%, respectivamente). Como era previsible, al final del estudio los animales de los grupos
con las dietas AO4 y control fueron los que presentaron un mayor peso corporal (321,77 y
217,40 g, respectivamente), y el grupo alimentado con la dieta simbitica al 1,2% el que
present un menor peso final (81, 30 g). Los pesos finales de los animales alimentados con las
dietas probitica, prebitica al 1,2% y simbitica al 5 y 10% no mostraron diferencias
estadsticamente significativas (p<0,05). Al igual que con el peso corporal inicial y final, los
parmetros de ganancia de peso e ingestin total de alimento fueron significativamente
(p<0,05) superiores en el grupo alimentado con la dieta AO4 (232,40 y 695,12 g,
respectivamente) respecto a los grupos alimentados con las dietas problema y control. El nico
grupo que no mostr diferencias significativas (p<0,05) en ninguno de los dos parmetros con
el grupo control (144,73 y 298,53 g, respectivamente) fue el alimentado con la dieta prebitica
al 5% (130,08 y 262,98 g, respectivamente), y de nuevo los grupos que mostraron los valores
significativamente (p<0,05) ms bajos fueron los alimentados con las dietas simbitica la 1,2%
(81,30 y 175,21 g, respectivamente) y 5% (90,77 y 206,28 g, respectivamente).
Con los valores obtenidos de la ganancia de peso corporal durante los treinta das del
estudio y la ingestin total de alimento durante dicho periodo, se calcul la eficiencia
alimentaria (relacin del primero entre el segundo) con el fin de establecer si la diferencia de

166
peso observada entre los diferentes grupos supona un menor aprovechamiento nutricional del
alimento por parte de los grupos que partan con un menor peso inicial. Tal y como se observa,
todos los grupos alimentados con frmula infantil presentaron una mayor eficiencia alimentaria
( 0,44) respecto al primer grupo, alimentado con la dieta AO4 (0,33). La eficiencia alimentaria
nos permite evidenciar un posible retraso en el crecimiento o una carencia nutricional
apreciable fsicamente en los animales alimentados con una frmula infantil para lactantes
humanos. Los resultados por tanto muestran que ninguna de las ratas alimentadas con las
diferentes variantes de dicha dieta present el menor signo de carencia nutricional durante el
estudio, y que el aporte proteico de la misma era de mayor calidad que la dieta administrada a
las ratas del primer grupo. Ninguno de los siete grupos alimentados con alguna de las dietas
experimentales mostr diferencias estadsticamente significativas (p<0,05) con el grupo control
alimentado con la frmula infantil utilizada como base.

Tabla 38. Crecimiento y eficiencia alimentaria

Peso inicial Peso final Ganancia de Ingestin total Eficiencia
Dieta
(g) (g) peso (g) de alimento (g) alimentaria
AO4 89,370,54a 321,777,27 a 232,407,09 a 695,1212,04a 0,330,01 c
Control 72,672,50b 217,408,44 b 144,736,35 b 298,5312,70b 0,480,01 ab
Probitica 42,680,83d 154,882,53 de 112,202,15 ce 223,366,46 d 0,500,02 a
Prebitica 1,2% 42,771,22d 164,173,38 ce 121,402,67 cd 239,295,48 cd 0,510,01 a
Prebitica 5% 52,020,63c 182,102,72 c 130,082,49 bc 262,982,99 bc 0,490,01 a
Prebitica 10% 55,730,52c 176,054,12 cd 120,324,11 cd 255,625,20 cd 0,470,01 ab
Simbitica 1,2% 36,322,57e 117,625,23 f 81,304,75g 175,216,25 f 0,460,01 ab
Simbitica 5% 51,930,36c 142,703,57 e 90,773,54fg 206,287,67 ef 0,440,01 b
Simbitica 10% 55,930,99c 165,084,76 ce 109,154,50 def 234,158,29 cde 0,460,01 ab
Cada valor es la mediaerror tpico, n=6
a-g
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma columna muestran diferencias
significativas para p<0,05

Metodolgicamente resulta complejo la seleccin de animales de experimentacin a

edades tempranas con pesos iniciales idnticos, debido a que entre otros factores es necesario
cubrir al mismo tiempo a un nmero de hembras elevado para que la cantidad total de cras
resultante en cada camada sea suficiente, aadiendo adems a este hecho el tiempo necesario
(21 das) hasta su destete. Parece lgico pensar que al partir de animales con diferentes pesos
iniciales, los resultados obtenidos para el resto de variables que miden el crecimiento y la
eficiencia alimentaria, estuvieran determinados por aquellos, y ser de esta manera un factor
determinante a la hora de comparar otros parmetros fisiolgicos de este estudio. Con el fin de
validar los resultados obtenidos, y que comparativamente se puedan obtener conclusiones
fiables cuando se enfrenten los resultados obtenidos de los diferentes grupos de ratas, se
realiz un estudio de la covarianza multivariante (MANCOVA). Tal y como se muestra en la
Tabla 37, el anlisis realizado sobre las variables peso corporal final, ganancia de peso,
ingestin total de alimento y eficiencia alimentaria revel que no existieron diferencias para la
ganancia de peso y la eficiencia alimentaria cuando se utiliz como covariable el peso inicial en

167
las ratas empleadas en el estudio, controlando de esta manera el influjo que esta variable tuvo
sobre el resto.
La eficiencia alimentaria encontrada en nuestro estudio es similar a la mostrada en
otros estudios (eficiencia alimentaria de 44) realizados con ratas de cuatro y cinco semanas de
edad alimentadas con dietas enriquecidas con 5 y 10% GOS durante diez y siete das (Chonan y
Watanuki, 1995; Chonan y Takahashi, 1999).
La Tabla 39 muestra las diferentes medidas fisiolgicas tomadas en los animales
durante los tres periodos de tres das en los que las ratas fueron sometidas a un balance
mineral y estuvieron controladas en jaulas metablicas. En la tabla anterior se puede observar
como entre los grupos problema, los que mostraron un mayor peso corporal inicial fueron los
alimentados con las dietas prebitica y simbitica al 5 y 10% (entre 51,93 y 55,93 g). Sin
embargo como se observa en la Tabla 39, en el 1er periodo (8-10 das) el grupo alimentado con
la dieta simbitica al 5% present un peso significativamente (p<0,05) inferior (74,93 g)
respecto a los otros tres (grupos alimentados con las dietas prebiticas al 5 y 10% y simbitica
al 10%), y en el 2 (18-20 das) y 3er periodo (28-30 das) los grupos con un mayor peso
corporal fueron los alimentados con las dietas prebiticas al 5 y 10% (121,65 y 118,47 g;
177,09 y 170,78 g, respectivamente). Por el contrario, desde el inicio y hasta el ltimo da de
estudio el grupo alimentado con una dieta simbitica al 1,2% present en todo momento el
menor peso corporal (de 36,32 g a 113,57 g).
En cuanto a la ingestin de alimento, en el 1er periodo ningn grupo excepto el
alimentado con la dieta simbitica al 1,2% (4,67 g/da) mostr diferencias significativas
(p<0,05) respecto al grupo control (6,05 g/da). En el 2 periodo todos mostraron una ingestin
de alimento significativamente (p<0,05) inferior al grupo control (10,42 g/da). En el 3er periodo
nicamente los grupos alimentados con las dietas prebiticas al 5 y 10% (12,59 y 12,73 g/da,
respectivamente) no mostraron diferencias con el grupo control (13,07 g/da), siendo adems
los que ingirieron una mayor cantidad de alimento a lo largo de todo el estudio entre los grupos
problema. Estas diferencias en el consumo de las dietas se podran deber a la diferencia de
peso entre los animales ya que los que presentaron un mayor peso fueron los que ingirieron
ms alimento.
El consumo de 4-GOS est condicionado por el consumo de alimento. En este sentido
se observa que en los grupos prebiticos y simbiticos a las concentraciones de 1,2 y 5%, la
ingestin de 4-GOS fue menor en los grupos alimentados con las dietas simbiticas que en los
alimentados con las prebiticas, debido al menor consumo de alimento de las ratas alimentadas
con las dietas simbiticas. Por el contrario los grupos alimentados con las dietas prebitica y
simbitica al 10% presentaron la misma cantidad de 4-GOS ingerida durante los tres periodos.
En el 1er periodo los nicos grupos que mostraron niveles significativamente (p<0,05)
superiores de ingestin de agua respecto al grupo control (9,83 mL/da) fueron los alimentados
con las dietas prebitica y simbitica al 10% (11,53 y 12,03 mL/da, respectivamente), que son
los que tienen una mayor concentracin de 4-GOS. En el 2 periodo stos mismos grupos

168
fueron los nicos que no mostraron diferencias con el grupo control (13,33 mL/da), siendo la
ingestin de agua de los mismos superior al resto de los grupos. En el 3er periodo, todos los
grupos mostraron valores similares al grupo control (15,89 mL/da) excepto los alimentados con
las dietas simbiticas al 1,2 y 5% con valores significativamente (p<0,05) inferiores (11,00 y
12,44 mL/da, respectivamente). En cuanto al volumen de orina excretado, en el 1er periodo se
observ que en los animales alimentados con la dieta probitica y las dietas simbiticas al 1,2 y
5% (1,96, 1,29 y 1,46, respectivamente) excretaron un volumen de orina significativamente
inferior respecto al grupo control (3,23 mL/da). En el 2 periodo, los grupos con las dietas
prebitica y simbitica con la mxima concentracin de 4-GOS (3,44 y 3,66 mL/da,
respectivamente) fueron los nicos que no mostraron diferencias con el grupo control (3,32
mL/da), con un volumen de orina estadsticamente (p<0,05) superior al resto de los grupos. En
el 3er periodo, todos los grupos problema mostraron valores significativamente (p<0,05)
inferiores al grupo control (5,31 mL/da) y los grupos alimentados con las dietas prebitica y
simbitica al 10% (4,06 y 4,18 mL/da, respectivamente) fueron los que excretaron un mayor
volumen de orina. Por tanto, se puede concluir que la adicin de un 10% de 4-GOS a las dietas
provoc en las ratas una mayor ingestin de agua y como consecuencia una mayor excrecin
urinaria respecto a los grupos con menor concentracin (1,2 y 5%).
En cuanto al volumen de heces excretadas (expresado en peso fresco), se aprecia que
el volumen de heces de las ratas alimentadas con la dieta AO4 fue muy superior en los tres
periodos (doce, ocho y seis veces mayor, respectivamente) respecto al de las ratas alimentadas
con la frmula infantil. En el 1er periodo, nicamente el grupo alimentado con la dieta simbitica
al 1,2% (0,22 g/da) present un volumen significativamente (p<0,05) inferior respecto al
grupo control (0,69 g/da). En el 2 periodo, todos los grupos mostraron un volumen de heces
significativamente (p<0,05) inferior al grupo control (1,32 g/da), hecho que puede atribuirse al
periodo de adaptacin intestinal a los probiticos y prebiticos, ya que en el 3er periodo,
nicamente los grupos alimentados con las dietas prebitica al 10% y simbitica al 1,2% (0,99
y 1,10 g/da, respectivamente) mostraron una cantidad de heces excretadas significativamente
(p<0,05) inferior al grupo control (1,96 g/da).
Por ltimo, en esta misma tabla (Tabla 39) se muestra el porcentaje de humedad de las
heces excretadas. En el 1er periodo, nicamente el grupo alimentado con la dieta prebitica al
1,2% (47,64%) no present diferencias significativas (p<0,05) con el grupo control (47,42%),
el resto de grupos mostraron valores significativamente (p<0,05) inferiores, y de ellos los
grupos alimentados con las dietas simbiticas fueron los que tuvieron unas heces menos
acuosas (de 20,42 a 25,96% de humedad). En el 2 periodo, el grupo alimentado con la dieta
probitica (47,78%) mostr una humedad superior al resto de grupos (incluido el control), y los
grupos con una menor humedad fueron los alimentados con las dietas prebitica al 1,2 y 10%,
y simbitica al 1,2% (35,10, 30,45 y 33,64%, respectivamente). En el 3er periodo, slo el grupo
alimentado con la dieta prebitica al 10% mostr una humedad (38,16%) significativamente
(p<0,05) inferior respecto al grupo control (50,33%). Por tanto, el contenido acuoso de las

169
heces disminuy cuando se aliment a las ratas con una frmula infantil, y adems esta
disminucin fue significativa (p<0,05) en los tres periodos cuando se aadieron 4-GOS al 10%
(dieta prebitica al 10%).
Un efecto conocido de la fibra diettica insoluble y de ciertos OND es el aumento del
volumen fecal (Cummings y col. 1992; Gibson y col., 1995; Roberfroid y col., 1993). Sin
embargo, nosotros no observamos este efecto cuando se suministr 4-GOS a la dieta.
Diferentes estudios con ratas tampoco han encontrado diferencias significativas (p<0,05) en el
peso seco de las heces con el grupo control cuando los animales fueron alimentados con un 5%
de 4-GOS durante siete das (Chonan y col., 2001), con un 5% de FOS cc, nistosa, inulina o
goma guar durante seis semanas (Tashiro y col., 1997; Ohta y col., 1994b). En nuestro estudio
la frmula infantil, sin fibra en su composicin, empleada como base de la dieta a la que se le
aadi 4-GOS, posiblemente podra ser la causa de la diferencia de peso en las heces
encontrada entre los grupos alimentados con la frmula y los alimentados con la dieta AO4, que
present un 18,5% de fibra en su composicin (Tabla 27 de la seccin de Material y Mtodos).

4.2. Parmetros hematolgicos y bioqumicos en las ratas

Tras el sacrifico de los animales el da treinta de estudio, se realiz un anlisis

sanguneo con los parmetros hematolgicos y bioqumicos con el fin de completar la
evaluacin de estado fisiolgico y nutricional de las ratas alimentadas con dietas diferentes a la
indicada para su normal desarrollo durante las primeras semanas de vida (dieta AO4), y que ya
se inici con la medicin de las variables de crecimiento y eficiencia alimentaria descritas
anteriormente.
En la Tabla 40 se muestran los valores obtenidos al final del estudio para los
siguientes parmetros: hemoglobina (Hb), recuento de glbulos rojos (RGR), hematocrito (Ht),
Fe srico, TIBC (capacidad total de fijacin del hierro), albmina y urea sricas, as como los
parmetros lipdicos triglicridos (TG) sanguneos, colesterol total (COL total) y sus fracciones,
lipoprotenas de muy baja densidad (VLDL) y lipoprotenas de alta densidad (HDL). Como se
puede observar, los niveles de Hb, RGR y Ht en los grupos alimentados con frmula infantil no
presentaron diferencias significativas (p<0,05) con el grupo de referencia (A04), indicando as
que el consumo de las dietas empleadas en el presente estudio no provoc anemia ni afect al
normal desarrollo de los animales. Los parmetros bioqumicos de Fe srico, TIBC, albmina y
urea tampoco mostraron grandes diferencias entre los grupos problema con el grupo control,
excepto en el alimentado con la dieta prebitica al 10% que present un nivel de Fe srico
(438,75 g/dL) significativamente (p<0,05) superior al grupo control (240,50 g/dL), y el
alimentado con la dieta simbitica al 1,2% con un valor de albmina (2,37 g/dL)
significativamente (p<0,05) inferior al grupo control (3,00 g/dL).

170
Tabla 39. Medidas fisiolgicas de las ratas
Ingestin Ingestin GOS Ingestin agua Volumen orina Heces pf Humedad
Periodo Dietas Peso (g)
alimento (g/da) (g/da) (mL/da) (mL/da) (g/da) heces (%)
8-10 das AO4 146,052,45 20,290,74 0,000,00 22,280,80 4,500,35 8,810,33 53,541,09
Control 102,322,62 6,050,46 0,000,00 9,830,50 3,230,20 0,690,14 47,420,89
Probitica 70,051,11*/c 5,850,13 b 0,000,00 f 10,060,37ab 1,960,10 */b 0,470,12 a 40,350,19*/b
Prebitica 1,2% 72,981,33*/c 5,870,27 b 0,070,00 */d 11,060,71a 3,850,26 a 0,700,09 a 47,641,04a
Prebitica 5% 83,650,89*/a 6,870,15 a
0,340,01 */b 11,860,44a 3,180,18 a 0,500,09 a 40,040,92*/b
Prebitica 10% 83,981,10*/a 5,910,23 b
0,590,02 */a 11,530,49*/a 3,800,23 a 0,440,08 a 33,580,81*/c
Simbitica 1,2% 55,841,81*/d 4,670,19 */c
0,060,00 */e 8,220,27 b 1,290,09 */c 0,220,04 */a 20,420,17*/e
Simbitica 5% 74,931,11*/c 5,260,32 bc
0,260,01 */c 8,890,43 b 1,460,12 */bc 0,360,09 a 24,030,25*/d
Simbitica 10% 80,901,18*/ab 5,870,16 b
0,590,01 */a 12,030,63*/a 3,460,36 a 0,340,09 a 25,960,69*/d
18-20 das AO4 233,193,17 25,660,35 0,000,00 26,501,24 7,130,29 11,400,31 59,230,17
Control 148,113,66 10,420,40 0,000,00 13,330,55 3,320,17 1,320,11 43,481,68
Probitica 105,031,01 */de 7,720,36 */bc 0,000,00 f 11,000,31*/b 2,380,12 */b 0,850,12 */a 47,781,10*/a
Prebitica 1,2% 109,371,31 */cd 8,500,19 */ab 0,100,00 */d 10,830,53*/bc 2,160,12 */b 0,510,06 */a 35,102,06bc
Prebitica 5% 121,651,28 */a 8,810,31 */ab
0,440,01 */b 11,330,37*/b 2,320,08 */b 0,740,08 */a 41,741,02b
Prebitica 10% 118,471,65 */ab 8,920,33 */a
0,890,03 */a 11,720,71b 3,440,23 a 0,450,09 */a 30,450,91*/c
Simbitica 1,2% 79,062,26*/f 6,220,18 */d
0,070,00 */e 8,940,37 */c 1,060,12 */c 0,550,10 */a 33,642,69*/bc
Simbitica 5% 100,271,23 */e 7,010,21 */cd
0,350,01 */c 9,720,36 */bc 1,280,13 */c 0,710,14 */a 37,061,57*/b
Simbitica 10% 114,911,87 */bc 8,760,33 */ab
0,870,03 */a 14,410,54a 3,660,29 a 0,670,08 */a 39,381,89b
28-30 das AO4 317,293,94 27,920,77 0,000,00 31,781,73 8,450,42 11,970,63 54,540,12
Control 209,874,50 13,070,48 0,000,00 15,890,95 5,310,47 1,960,13 50,331,50
Probitica 150,501,34 */c 10,430,65*/c 0,000,00 f 14,670,50a 2,890,20 */bc 1,590,23 a 52,382,15ac
Prebitica 1,2% 159,042,03 */bc 11,000,43*/abc 0,130,01 */d 13,830,93abc 3,600,23 */ab 1,310,21 a 57,701,24a
Prebitica 5% 177,091,77 */a 12,590,25 ab
0,630,01 */b 15,890,35a 3,410,19 */ab 1,390,13 a 44,291,79cd
Prebitica 10% 170,782,24 */a 12,730,30 a
1,270,03 */a 15,500,50a 4,060,27 */a 0,990,16 */a 38,162,03*/d
Simbitica 1,2% 113,572,82 */e 8,110,29 */d
0,090,00 */e 11,000,63*/c 2,090,12 */c 1,100,11 */a 46,622,35bcd
Simbitica 5% 139,662,16 */d 10,230,46 */c
0,510,02 */c 12,440,34*/bc 2,830,34 */bc 1,710,26 a 48,522,75abcd
Simbitica 10% 160,762,60 */b 10,730,52 */bc
1,070,05 */a 13,970,51ab 4,180,29 */a 1,900,23 a 53,061,81ab
Cada valor es la media error tpico, n=6
*
La presencia de asteriscos dentro de la misma columna para cada uno de los 3 periodos indica diferencias significativas (p<0,05) de los grupos con dietas probitica, prebitica y simbitica
respecto al grupo control, realizada mediante un test de separacin de medias bilateral
a-f
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma columna para cada uno de los 3 periodos, indican diferencias significativas (p<0,05) entre los grupos con dietas
probitica, prebitica y simbitica; pf, peso fresco

171
 En cuanto al contenido de COL total en sangre, aunque todos los grupos problema,
excepto el alimentado con dieta probitica, presentaron valores ligeramente inferiores al grupo
control (78,70 mg/dL), nicamente alimentado con la dieta prebitica al 1,2% muestr un valor
significativamente (p<0,05) inferior (65,23 mg/dL) al del grupo control. Al analizar los valores
encontrados para la fraccin VLDL, se observa que todos los grupos problema tuvieron un valor
inferior al grupo control (29,88 mg/dL) pero sin mostrar diferencias estadsticamente
significativas (p<0,05). Con la fraccin HDL del COL tampoco se observaron diferencias
significativas en ninguno de los grupos problema con el grupo control (48,84 mg/dL),
mostrando los valores ms elevados los grupos alimentados con la dieta probitica y simbitica
al 10% (54,52 y 52,85 mg/dL, respectivamente). Es en el nivel de TG en sangre donde
encontramos un claro y significativo (p<0,05) efecto de reduccin de sus niveles en todos los
grupos problema (de 49,83 mg/dL con la dieta simbitica al 10% a 75,63 mg/dL con la dieta
probitica) con respecto al grupo control (97,25 mg/dL).
Por tanto se puede concluir que en nuestro caso la adiccin de bifidobacterias y/o 4-
GOS tuvo un efecto significativo (p<0,05) en la reduccin de los niveles de TG tras la
administracin de una dieta pro-, pre- y simbitica durante treinta das. Nuestros resultados
coinciden con los descritos por otros autores (Hata y col., 1983; Tokunaga y col., 1986) que
emplearon como OND la oligofructosa a la concentracin de 5, 10 y 20%, y observaron un
descenso significativo en los TG; sin embargo los niveles de COL no siempre fueron reducidos.
Ms recientemente, Kok y col. (1998b) han demostrado que el incremento postpandrial de TG
en ratas inducido por una dieta rica en grasas se redujo tras la administracin de oligofructosa.

172
Tabla 40. Valores hematolgicos y bioqumicos de las ratas alimentadas con diferentes dietas durante 30 das
Prebitica Prebitica Prebitica Simbitica Simbitica Simbitica
Dietas/Parmetros AO4 Control Probitica
1,2% 5% 10% 1,2% 5% 10%
Hemoglobina (g/dL) 13,951,24a 14,821,31a 14,640,66a 13,450,76a 13,980,61a 14,121,25a 14,630,81a 14,630,54a 14,120,96a
RGR (x 106/mm3) 6,860,79a 6,642,11a 6,440,13a 7,191,13a 7,852,64a 6,510,54a 6,500,35a 6,440,31a 6,740,41a
Hematocrito (%) 44,404,27a 43,003,52a 44,001,86a 48,534,18a 47,802,21a 43,033,66a 44,252,76a 44,922,94a 45,701,52a
Fe srico (g/dL) 238,5052,92 240,5018,17 277,2524,96b 270,5619,84b 257,7512,99b 438,7523,47*/a 332,5039,00ab 353,7525,46ab 265,2546,05b
TIBC (g/dL) 345,2532,32 324,5014,79 272,007,53b 351,3323,48ab 407,7529,47a 360,5028,72ab 368,7517,11ab 421,7521,45a 340,0052,44ab
Albmina (g/dL) 3,270,13 3,000,00 3,020,11a 2,950,11ab 3,120,10a 2,870,03ab 2,370,16*/b 2,920,10ab 2,700,17ab
Urea (g/dL) 24,300,61 21,762,02 19,351,05a 21,641,89a 16,550,42a 22,851,15a 24,473,16a 23,121,77a 17,972,74a
Colesterol total (mg/dL) 69,423,59 78,704,20 82,101,88a 65,231,12*/b 75,461,36ab 72,831,63ab 75,335,22ab 74,480,99ab 74,861,85ab
VLDL (mg/dL) 29,212,28 29,884,51 27,571,73a 22,052,08a 24,622,48a 21,901,38a 29,562,26a 24,812,20a 22,021,05a
HDL (mg/dL) 40,212,20 48,840,62 54,521,88a 43,151,66a 50,783,08a 50,932,28a 45,773,87a 49,671,63a 52,851,61a
Triglicridos (mg/dL) 68,805,34 97,257,40 75,632,94*/a 55,333,32*/b 60,463,74*/ab 53,732,10*/a 53,754,81*/a 53,002,68*/a 49,834,00*/a
Cada valor es la mediaerror tpico, n=6
*
La presencia de asteriscos dentro de la misma fila indica diferencias significativas (p<0,05) de los grupos con dietas probitica, prebitica y simbitica respecto al grupo control, realizada mediante un test de
separacin de medias bilateral
a-b
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma fila indican diferencias significativas (p<0,05) entre los grupos con dietas probitica, prebitica y simbitica

RGR: recuento de glgulos rojos, TIBC: capacidad total de fijacin del hierro, VLDL: lipoprotenas de muy baja densidad, HDL: lipoprotenas de alta densidad

173
4.3. Recuento microbiolgico total y de bifidobacterias fecales en heces de ratas

En la Tabla 41 se muestran los recuentos, expresados en log ufc/g de heces, de los

microorganismos aerobios y anaerobios totales y de las bifidobacterias encontrados en las
heces de las ratas estudiadas en los tres periodos de tres das de balance. En el recuento de
aerobios mesfilos totales slo fueron detectadas diferencias puntuales de los grupos objeto de
estudio respecto al control, siendo destacable que al finalizar el estudio (3er periodo) ninguno de
ellos present recuentos mayores al grupo control. En el recuento de anaerobios mesfilos
totales, se observ en el 1er periodo un recuento significativamente (p<0,05) inferior en el
grupo alimentado con la dieta prebitica al 1,2% (6,40 log ufc/g heces) respecto al grupo
control, en el 2 periodo en los grupos alimentados con las dietas prebitica y simbitica al
10% (6,82 y 6,97 log ufc/g heces, respectivamente) y en el 3er periodo en los grupos
alimentados con la dieta prebitica al 10% y las dietas simbiticas (de 7,17 log ufc/g heces con
la dieta simbitica al 5% a 7,85 log ufc/g heces con la dieta prebitica al 10%). En cuanto al
recuento de bifidobacterias, en el 1er periodo, slo el grupo alimentado con dieta simbitica al
10% mostr un recuento significativamente (p<0,05) superior (7,37 log ufc/g heces) al grupo
control (6,84 log ufc/g heces). Cabra sealar que los nicos grupos que mostraron mayores
valores (superiores a 7 log ufc/g heces) fueron los grupos a los que se les adicion
bifidobacterias en las dietas probitica y simbiticas. En el 2 periodo, todos los recuentos
descendieron en general, mostrando valores significativamente (p<0,05) superiores los grupos
alimentados con dietas simbiticas (6,26, 7,08 y 6,61 log ufc/g heces, respectivamente) frente
al grupo alimentado con la dieta control (5,62 log ufc/g heces). Estos datos sugieren que
mientras el recuento de anaerobios totales permanece sin alteraciones en estos grupos, el 4-
GOS est siendo utilizado preferentemente por las bifidobacterias, mejorando su crecimiento a
expensas de otras especies bacterianas del intestino grueso. Sin embargo, en el 3er periodo
todos los grupos incluido el grupo control (6,35 log ufc/g heces) presentaron un ligero aumento
en sus recuentos de bifidobacterias sin haber diferencias significativas (p<0,05) entre los
mismos, excepto el grupo alimentado con la dieta prebitica al 1,2% con un mayor recuento
(7,07 log ufc/g heces).
Recientemente, Bielecka y col. (2002) encontraron en un estudio con ratas adultas que
la administracin de oligofructosa al 5% durante catorce das aument significativamente
(p<0,001) el nmero de bifidobacterias en heces en un 1,6 log ufc/g respecto al grupo control,
mientras que la administracin junto a B. longum lo hizo en 1,4 log ufc/g. Sin embargo, el
recuento de bacterias aerobias mesfilas (de 7,79 a 8,81 log ufc/g) y anaerobias facultativas no
difiri entre los grupos problema y control. Nuestros resultados no mostraron ningn efecto en
el 1er periodo posiblemente debido a que las ratas solamente llevaban tomando las dietas
problema como nico alimento tres das (los cinco primeros se utilizaron como periodo de
adaptacin a las nuevas dietas y stas se administraban en concentraciones crecientes
mezcladas con la dieta AO4). En el 2 periodo, los grupos alimentados con la dieta simbitica

174
mostraron un incremento desde 0,64 log ufc/g con la dieta simbitica al 1,2% hasta 1,46 log
ufc/g con la dieta simbitica al 5% con respecto al grupo control (5,28 log ufc/g). Y en el ltimo
periodo, el nico que mostr un recuento significativamente (p<0,05) superior al grupo control
(6,35 log ufc/g) fue el alimentado con la dieta prebitica al 1,2% (7,07 log ufc/g). Por tanto la
dieta probitica por s sola no fue suficiente para producir un aumento significativo (p<0,05) en
el nmero de bifidobacterias fecales en ratas. La incorporacin conjunta de un prebitico, 4-
GOS en nuestro caso, y un probitico mejor significativamente los recuentos de estos ltimos
en el 2 periodo. Por el contrario en el 3er periodo, en el que no se observ dicho efecto, puede
estar motivado por la reduccin del nmero de bifidobacterias intestinales que ocurre con la
edad (Drasar y Hill, 1974; Mitsuoka, 1984).

Tabla 41. Recuento microbiolgico de aerobios, anaerobios y bifidobacterias en heces de ratas

Bacterias
Mesfilos aerobios Mesfilos anerobios
Periodo Dietas Bifidobacterias
totales totales
8-10 das AO4 6,720,50 8,140,16 6,580,05
Control 6,860,24 7,680,11 6,840,21
Probitica 7,970,07 */a 7,860,11 a 7,060,00 b
Prebitica 1,2% 6,260,12 */d 6,400,11 */c 6,410,06 c
abc
Prebitica 5% 7,280,16 7,470,08 ab 6,540,19 abc
bd
Prebitica 10% 6,830,08 7,230,07 b 6,830,06 b
b
Simbitica 1,2% 7,010,03 7,740,24 ab 7,030,13 ab
bcd
Simbitica 5% 6,990,16 7,780,19 ab 7,250,03 a
cd
Simbitica 10% 6,660,04 7,370,07 ab 7,370,00 */a
18-20 das AO4 7,280,16 7,750,11 5,280,09
Control 6,770,31 7,510,21 5,620,19
Probitica 7,210,29 a 7,170,07 ab 5,130,07 c
Prebitica 1,2% 6,700,13 a 7,140,07 ab 5,520,15 bc
a
Prebitica 5% 6,800,15 7,110,09 ab 5,960,06 b
a
Prebitica 10% 6,690,18 6,820,07 */b 5,730,08 b
a
Simbitica 1,2% 6,760,12 7,460,07 a 6,260,11 */ab
*/a
Simbitica 5% 7,580,24 7,760,16 a 7,080,20 */a
a
Simbitica 10% 6,590,13 6,970,18 */ab 6,610,26 */ab
28-30 das AO4 6,760,03 8,030,17 6,290,14
Control 7,510,16 8,280,05 6,350,02
Probitica 7,570,12 ab 8,050,06 a 6,890,08 a
Prebitica 1,2% 7,010,08 c 8,120,04 a 7,070,03 */a
Prebitica 5% 7,810,04 a 8,160,02 a 6,760,09 a
ac
Prebitica 10% 7,080,18 7,850,14 */ab 6,830,24 a
Simbitica 1,2% 7,160,25 ac 7,730,19 */ab 6,540,19 a
*/bc
Simbitica 5% 6,690,20 7,170,14 */b 6,800,19 a
*/bc
Simbitica 10% 6,350,28 7,530,11 */b 6,720,21 a
Cada valor es la media del log ufc/g heces en peso hmedoerror tpico, n=6
*
La presencia de asteriscos dentro de la misma columna para cada uno de los 3 periodos indica diferencias significativas
(p<0,05) de los grupos con dietas probitica, prebitica y simbitica respecto al grupo control, realizada mediante un test
de separacin de medias bilateral
a-d
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma columna para cada uno de los 3 periodos,
indican diferencias significativas (p<0,05) entre los grupos con dietas probitica, prebitica y simbitica

175
4.4. Balances minerales

En las siguientes tablas (de la 42 a la 46) se muestran los balances minerales de Ca,
Mg, P y Fe medidos a travs del clculo de la absorcin aparente (AA) y retencin de estos
minerales. As mismo, tambin se muestran los contenidos minerales excretados por heces y
orina expresados en mg de mineral/g de heces (en peso seco) y mg de mineral/mL de orina,
respectivamente. Junto a estos valores igualmente se muestran los contenidos minerales
excretados por da. De esta manera se puede apreciar si el mayor porcentaje de absorcin
aparente y/o de retencin de un mineral es debido a su menor presencia en las heces y/u orina,
o si por el contrario se debe a un menor volumen de excrecin fecal o urinaria.

4.4.1. Balance del calcio

La Tabla 42 muestra el balance mineral del Ca en tres periodos de tres das cada uno
durante el tiempo en el que se les administr los diferentes tipos de dietas a las ratas. La AA de
Ca, que nicamente tiene en cuenta las prdidas por heces, mostr en el 1er periodo que todos
los grupos problema tuvieron valores significativamente (p<0,05) superiores al grupo control
(91,70%), excepto el grupo alimentado con la dieta prebitica al 1,2% (92,77%) debido a su
mayor error tpico. Sin embargo, no existieron diferencias significativas (p<0,05) entre los
diferentes grupos problema, oscilando sus valores desde 92,77 para la dieta prebitica al 1,2%
hasta 98,04% para la dieta prebitica al 10%. En el 2 periodo, todos los grupos mostraron una
AA de Ca superior (p<0,05) respecto al grupo control (73,66%), excepto los alimentados con
las dietas probitica y simbitica al 1,2% (79,99 y 76,06%, respectivamente). Los grupos
alimentados con las dietas prebiticas al 1,2% y 10%, y simbitica al 10% mostraron una AA
ms elevada (93,76, 95,80 y 94,55%, respectivamente) respecto al resto de grupos problema.
En el 3er periodo, de nuevo todos los grupos problema presentaron una AA superior a la del
grupo control (58,77%), sin embargo, en el grupo alimentado con la dieta simbitica al 1,2%
(64,80%) esta diferencia no fue estadsticamente significativa (p<0,05). El resto de grupos
mostr unos valores entre 77,25 y 86,26% para las dietas prebitica y simbitica al 5 y 10%,
respectivamente.
En los tres periodos se observ que todos los grupos problema excretaron por heces
una cantidad diaria de Ca significativamente (p<0,05) inferior a la excretada por el grupo
control, lo cual se reflej en una mayor AA de Ca en casi todos los grupos, con la excepcin de
los alimentados con las dietas prebitica al 1,2% (en el 1er periodo), probitica (en el 2
periodo) y simbitica al 1,2% (en el 2 y 3er periodo). Estas diferencias pueden ser debidas a
una menor ingestin de Ca respecto al grupo control tal y como se observa en la Tabla 39.
La retencin mineral tiene en cuenta las prdidas minerales que se producen por orina,
y por tanto permite obtener un valor ms real que la AA. Para el Ca en el 1er periodo, las
mayores prdidas por orina supusieron un descenso de un 8,5 y 8,7% respecto al valor de la

176
AA en los grupos alimentados con las dietas prebiticas al 5 y 10% respectivamente, debido a
que excretaron una cantidad de Ca por orina significativamente (p<0,05) superior al grupo
control. Por este motivo el grupo alimentado con la dieta prebitica al 5% mostr una menor
retencin de Ca (86,92%) que el grupo control (91,68%), siendo los grupos alimentados con
las dietas probitica y simbiticas al 1,2 y 10% los que mostraron los porcentajes ms elevados
(de 96,28 a 97,01% para las dietas simbiticas al 10% y 1,2%, respectivamente). En el 2
periodo sin embargo, al ser menores las prdidas de Ca por orina, todos los grupos presentaron
una retencin de Ca superior a la del grupo control (73,02%), siendo los grupos alimentados
con las dietas prebiticas y simbiticas al 5 y 10% los que mostraron valores significativamente
(p<0,05) superiores (de 82,64 a 93,53% para las dietas prebitica al 5% y simbitica al 10%,
respectivamente). En el 3er periodo, se mantuvieron las diferencias descritas en el periodo
anterior con todos los grupos, con una retencin de Ca superior al grupo control pero con
porcentajes de retencin algo ms bajos; adems la retencin de los grupos alimentados con
las dietas prebiticas y simbiticas al 5 y 10% (de 76,56% para la dieta prebitica al 5% a
85,14% para la dieta prebitica al 10%) fue de nuevo significativamente superior (p<0,05) a la
del grupo control (58,19%).
Finalmente cabra resear los elevados porcentajes AA y retencin de Ca encontrados
en todos los grupos alimentados con frmula infantil respecto al alimentado con la dieta AO4.
Tambin hay que destacar que en todos los grupos stos porcentajes descendieron con el
tiempo, posiblemente debido al descenso de los requerimientos del organismo que se produce
con la edad. La excrecin urinaria de Ca supuso muy poca aportacin en el conjunto final del
balance mineral de este elemento, nicamente destacable en los grupos alimentados con la
dieta prebitica al 5 y 10% en el 1er periodo. Los nicos grupos que mostraron una AA y
retencin de Ca significativamente (p<0,05) superior al grupo control en los tres periodos
fueron los alimentados con las dietas simbiticas al 5 y 10%, mientras que en los grupos
alimentados con las dietas prebiticas se observ esta diferencia en los dos ltimos periodos.
En los grupos alimentados con las dietas simbiticas se observ una cierta relacin dosis-efecto,
, en el 2 y 3er periodo en la concentracin de 5 y 10% respecto a la de 1,2%, es decir que una
mayor concentracin de 4-GOS produjo una mayor AA y retencin de Ca. El consumo de las
dietas simbiticas nicamente mejor la retencin de Ca respecto a los grupos alimentados con
las dietas probitica y prebiticas de forma muy puntual. As en el 1er y 2 periodo el grupo
alimentado con dieta simbitica al 5% tuvo una retencin de Ca significativamente (p<0,05)
superior al alimentado con la dieta prebitica al 5%, y en el 3er periodo el grupo alimentado con
la dieta simbitica al 10% present una AA y retencin de Ca significativamente (p<0,05)
superior al alimentado con la dieta probitica.

177
Tabla 42. Balance mineral del calcio
Absorcin Retencin Excrecin fecal Excrecin fecal Excrecin urinaria Excrecin urinaria
Periodo Dietas
aparente (%) (%) (mg/g) (mg/da) (mg/mL) (mg/da)
8-10 das AO4 43,770,88 45,341,94 10,950,49 86,781,83 0,0350,001 0,170,083
Control 91,700,97 91,680,97 5,720,50 4,250,49 0,0030,000 0,0080,002
Probitica 96,970,33*/a 96,690,24*/a 2,330,22 */bd 0,920,05 */a 0,0430,014 c 0,0910,034 c
Prebitica 1,2% 92,771,89a 92,411,86abc 5,060,18 a 2,400,66 */a 0,0320,001 c 0,120,021c
Prebitica 5% 95,470,39*/a 86,920,54*/c 3,350,28 */c 1,640,12 */a 0,970,079*/a 3,090,17 */a
Prebitica 10% 98,040,47*/a 89,320,56bc 1,520,13 */b 0,720,18 */a 0,790,029*/a 3,190,32 */a
Simbitica 1,2% 97,040,79*/a 97,010,78*/a 4,370,10 */a 0,890,27 */a 0,0060,001 c 0,0080,002 c
Simbitica 5% 96,400,69*/a 96,280,76*/a 2,700,10 */cd 1,040,13 */a 0,0260,012 c 0,0320,019 c
Simbitica 10% 97,950,69*/a 93,022,01ab 2,050,08 */bd 0,630,21 */a 0,480,052*/b 1,510,39 */b
18-20 das AO4 39,572,27 38,322,45 10,500,27 120,338,36 0,340,066 2,510,53
Control 73,661,57 73,021,39 11,650,71 15,440,29 0,150,084 0,480,29
Probitica 79,991,07cd 79,381,15c 8,360,48 bcd 7,950,60 */a 0,100,017bc 0,240,046bc
Prebitica 1,2% 93,761,04*/a 92,091,07*/ab 5,850,51 */bce 2,980,46 */b 0,400,045a 0,790,096abc
Prebitica 5% 84,031,97*/bc 82,641,81*/c 9,641,20 bc 7,320,69 */a 0,280,046abc 0,650,11 abc
Prebitica 10% 95,801,29*/a 92,851,49*/ab 3,740,75 */e 2,050,75 */b 0,380,097ab 1,420,38 */a
Simbitica 1,2% 76,061,13d 76,021,14c 14,581,60a 8,420,22 */a 0,0130,001 c 0,0170,005 c
Simbitica 5% 91,240,73*/ab 91,220,73*/ab 5,320,50 */bce 3,460,30 */b 0,0100,003 c 0,0120,004 c
Simbitica 10% 94,553,14*/a 93,533,36*/a 3,411,06 */de 2,221,17 */b 0,0120,005 abc 0,430,092abc
28-30 das AO4 29,484,74 29,064,75 12,900,78 149,007,70 0,120,007 0,890,029
Control 58,772,94 58,192,94 12,531,22 26,742,82 0,0650,016 0,370,025
Probitica 69,794,03*/bc 68,944,00bc 10,760,77a 18,101,91*/a 0,210,014a 0,590,076a
Prebitica 1,2% 82,690,95*/a 81,701,16*/a 8,460,61 a 10,770,83*/bcd 0,170,034a 0,630,14 a
Prebitica 5% 77,253,93*/a 76,563,91*/ab 10,861,69ab 15,372,52*/ac 0,140,028a 0,470,091a
Prebitica 10% 85,750,84*/a 85,140,86*/a 8,930,82 ab 10,320,79*/ad 0,220,075a 0,440,043a
Simbitica 1,2% 64,803,01c 62,343,53c 15,712,53ab 17,581,91*/ab 0,150,041a 0,350,068a
Simbitica 5% 80,690,82*/ab 79,650,84*/ab 7,180,88 ab 10,110,88*/bcd 0,220,056a 0,540,036a
Simbitica 10% 86,262,06*/a 85,132,09*/a 4,090,46 */b 7,080,79 */d 0,170,063a 0,590,17 a
Cada valor es la mediaerror tpico, n=6
*
La presencia de asteriscos dentro de la misma columna para cada uno de los 3 periodos indica diferencias significativas (p<0,05) de los grupos con dietas probitica,
prebitica y simbitica respecto al grupo control, realizada mediante un test de separacin de medias bilateral
a-e
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma columna para cada uno de los 3 periodos, indican diferencias significativas (p<0,05) entre los
grupos con dietas probitica, prebitica y simbitica

178
 Los elevados porcentajes de absorcin de Ca que hemos obtenido en nuestro estudio,
tambin (entre un 80 y 90%) han sido encontrados por otros autores mediante el empleo de
diferentes OND como los FOS cc, TGOS y 4-GOS al 5 y 10% (Chonan y Watanuki, 1995;
Chonan y Takahashi, 1999; Ohta y col., 1998d; Chonan y col., 2001). Adems, Chonan y
Watanuki (1996) observaron que cuando el contenido de Ca en la dieta era bajo (215 mg de
Ca/100 g), la administracin de un 5% de 6-GOS a ratas durante 30 das, origin una AA de Ca
significativamente (p<0,05) mayor (superior al 95%) en los tres periodos de balance mineral
respecto al grupo con un contenido normal de Ca (2.150 mg de Ca/100 g) en la dieta. Las
dietas empleadas en este estudio aportaron 571,72 mg de Ca/100 g, lo que puede considerarse
un contenido moderadamente bajo comparado con el anterior estudio.
Otros autores (Sarri y col., 2001) tambin han encontrado elevados porcentajes de
absorcin de Ca, entorno al 97%, en ratas lactantes que consumieron frmula infantil durante
siete das. Para estos autores los elevados valores de absorcin estn asociados al alto
contenido en lactulosa de las frmulas infantiles y a la aparicin, en el destete de las ratas, de
un sistema de transporte de Ca mediado por transportadores (Bronner, 1987) adems de la
difusin pasiva, principal mecanismo de absorcin de Ca hasta la 2 semana de vida la rata. En
nuestro estudio, el porcentaje de AA encontrado en la frmula infantil control en el 1er periodo
fue ligeramente inferior (91,7%) al descrito por Sarri y col., aunque ste aument
significativamente (p<0,05) con la incorporacin de los probiticos y prebiticos a la frmula
infantil. Adems, hay que tener en cuenta que la mayora de estos estudios se han realizado
con animales jvenes, los cuales tienen incrementadas las necesidades de Ca para la formacin
sea (NRC, 1991) durante la etapa de crecimiento.
Durante la elaboracin de frmulas infantiles se emplean los tratamientos trmicos de
secado y esterilizacin, que pueden inducir la isomerizacin de la lactosa, dando lugar a
lactulosa. A pesar de que la cantidad de lactulosa formada durante el tratamiento trmico
pueda ser baja debido a la baja actividad agua del producto y las condiciones trmicas
moderadas (Sarri y col., 2001), sta llega prcticamente ntegra al colon ya que resiste la
hidrlisis enzimtica del intestino delgado. Este ismero de la lactosa mejora la absorcin de Ca
ms intensamente que la lactosa (Brommage y col., 1993). En nuestro estudio, por tratarse de
dietas elaboradas a base de leche sometida a tratamientos trmicos de desecado y
pasteurizacin, la lactulosa formada (90-150 mg/L en frmulas en polvo (Sarri-Ruiz, 1998)
puede explicar en parte la elevada absorcin mineral los grupos control y problema respecto al
grupo alimentado con la dieta AO4.
Otra de las razones que posiblemente explican los elevados valores de absorcin de Ca
obtenidos, pueden ser la fuente de Ca (cloruro y citrato clcico) utilizada en el mix de minerales
que se le aade a las frmulas infantiles, ya que el citrato clcico presenta la ventaja de su
elevada solubilidad sobre otras fuentes de Ca ampliamente utilizadas como el carbonato clcico
(Harvey y col., 1988).

179
 En la absorcin de Ca tambin influye la fuente proteica de la frmula infantil utilizada.
Lnnerdal y col. (1994) estudiaron la biodisponibilidad mineral en ratas lactantes alimentadas
con leche de vaca, leche humana y diversas frmulas infantiles con diferente fuente proteica
(caseina, protena de suero, hidrolizados proteicos o soja). Observaron que la absorcin de Ca
de las frmulas infantiles, incluyendo la enriquecida con protena de suero como es nuestro
caso, era mayor a un 70%. La nica absorcin ms baja detectada correspondi a la frmula
con protena de soja.
Aunque la frmula infantil desde un punto de vista nutricional trata de asemejarse
cuantitativa y cualitativamente a la leche humana, est ampliamente aceptado que la leche
humana es la mejor fuente de Ca para el hombre, especialmente durante la lactancia. Son
varias las razones que pueden explicar las diferencias observadas en la biodisponibilidad de Ca
entre la leche humana y las frmulas infantiles. En la leche humana el Ca est principalmente
unido a protenas del suero o como parte de complejos de bajo peso molecular, mientras que la
leche de vaca, est unida principalmente a la casena (Fransson y Lnnerdal, 1983). Adems
puede influir la diferente distribucin del Ca entre la casena y las protenas del suero, ya que
mientras que en la leche humana la casena principal es una -casena, en la de vaca es una -
casena (Kunz y Lnnerdal, 1992). En el caso de las protenas del suero, la lactoferrina es la
principal protena en la leche humana y la -lactoglobulina en la de vaca (Lnnerdal, 1997).
Tambin se debera mencionar que la casena de la leche forma grandes micelas que contiene
fosfato clcico coloidal, mientras que la leche humana las micelas son pequeas (Kunz y
Lnnerdal, 1992), pudiendo afectar este hecho a la precipitacin y digestibilidad en el tracto GI
(Lnnerdal, 1997). Se ha destacado que los fosfopptidos formados durante la digestin
enzimtica de la casena, ms probable en la de leche materna que en la de vaca, tienen un
efecto positivo en la absorcin del Ca (Mellander, 1950) debido a su habilidad para unir Ca e
inhibir su precipitacin, y as mantenerlo en forma soluble en el lumen intestinal y por tanto
disponible para la absorcin.
Como conclusin a los resultados obtenidos en el balance mineral del Ca podemos
afirmar que todos los grupos problema presentaron en alguno de los periodos una AA y
retencin de Ca significativamente (p<0,05) superior a la del control. La adicin de prebiticos
fue ms efectiva que la de los probiticos, ya que mientras que stos slo fueron claramente
superiores al grupo control en el 1er periodo, los grupos alimentados con dieta prebitica lo
fueron en el 2 y 3er periodo. El aumento de concentracin de 4-GOS en la dieta no mostr una
clara relacin dosis-efecto sobre la absorcin de Ca. La adicin conjunta de ambos en forma de
dieta simbitica tampoco mostr una clara mejora en la absorcin de Ca respecto a su
administracin individualizada. Sin embargo, los grupos alimentados con las dietas simbiticas
al 5 y 10% fueron los ms eficaces al mostrar una AA y retencin de Ca significativamente
(p<0,05) superior a la grupo control en los tres periodos.

180
4.4.2. Balance del magnesio

La Tabla 43 muestra el balance mineral del Mg en tres periodos de tres das cada uno
durante el tiempo en el que se les administr los diferentes tipos de dietas a las ratas. En el 1er
periodo el nico grupo que mostr un porcentaje de AA significativamente (p<0,05) superior a
la del grupo control (82,85%) fue el alimentado con la dieta simbitica al 10% (94,74%),
mientras que el resto de grupos problema no mostraron diferencias con el grupo control. Entre
los grupos problema, los alimentados con las dietas prebiticas al 5 y 10% y simbiticas fueron
los que mostraron los mayores valores (de 86,68% con la dieta prebitica al 5% a 94,74% con
la dieta simbitica al 10%) al excretar una cantidad diaria de Mg en heces significativamente
(p<0,05) inferior a la del grupo control (0,73 mg/da). En el 2 periodo, los grupos alimentados
con las dietas prebiticas al 1,2 y 10% y simbiticas al 5 y 10% presentaron valores
significativamente (p<0,05) superiores (de 90,35% con la dieta prebitica al 1,2% a 95,06%
con la dieta simbitica al 10%) al del grupo control (81,92%) y al alimentado con la dieta
probitica. Como se observa en la variable excrecin fecal, estos grupos fueron los que
excretaron una cantidad diaria de Mg en heces significativamente (p<0,05) inferior a la del
grupo control (0,85 mg/da). En el 3er periodo, excepto los grupos alimentados con las dietas
probitica y prebitica al 5% (76,95 y 81,18%, respectivamente), el resto mostr una AA de Mg
significativamente (p<0,05) superior (de 85,59% con la dieta prebitica al 1,2% a 90,90% con
la dieta simbitica al 10%) a la del grupo control (76,63%). Nuevamente, estos fueron los
grupos que excretaron una cantidad diaria de Mg en heces significativamente (p<0,05) inferior
a la del grupo control (1,32 mg/da).
Las prdidas de Mg por orina fueron ms acusadas que las de Ca, sobre todo en
determinados grupos y periodos, lo que redujo significativamente el porcentaje de retencin de
este mineral. As, el grupo alimentado con dieta simbitica al 10% descendi un 3,3 y 3,7% sus
porcentajes de retencin de Mg en los dos primeros periodos, mientras que en el 3er periodo
fueron los grupos alimentados con dieta simbitica al 1,2 y 5% los que ms Mg excretaron por
orina al descender el porcentaje en un 16,8 y 23,15%, respectivamente. En el 1er periodo,
nicamente el grupo alimentado con dieta prebitica al 1,2% mostr un porcentaje (66,97%)
significativamente (p<0,05) inferior al del grupo control (81,78%), puesto que fue el nico
grupo que excret una cantidad diaria de Mg por orina significativamente (p<0,05) mayor que
la del grupo control (0,046 mg/da). Entre los grupos problema los alimentados con las dietas
prebiticas al 5 y 10% y simbiticas fueron los que mostraron los mayores valores (de 86,49%
con la dieta prebitica al 5% a 91,45% con la dieta simbitica al 10%). En el 2 periodo, los
grupos alimentados con las dietas prebitica al 10% y simbiticas al 5 y 10% fueron los que
presentaron unos porcentajes significativamente (p<0,05) superiores (90,48, 92,61 y 89,67%,
respectivamente) a los del grupo alimentado con la dieta control (78,41%), aunque no las
mostraron con los grupos alimentados con el resto de dietas prebiticas y simbiticas. Estas
diferencias fueron debidas a la menor excrecin de Mg estadsticamente significativa (p<0,05)

181
respecto al grupo control (0,16 mg/da), calculada por heces y da. En el 3er periodo, los grupos
alimentados con todas las dietas prebiticas y la simbitica al 10% fueron los que presentaron
valores significativamente (p<0,05) superiores al grupo control (de 80,99% con la dieta
prebitica al 5% a 90,69% con la dieta simbitica al 10%). Sin embargo, los grupos
alimentados con las dietas simbiticas al 1,2 y 5% mostraron los valores ms reducidos debido
a la mayor prdida de Mg por orina, siendo en el segundo grupo significativamente (p<0,05)
inferior al grupo control (p<0,05).
Como conclusin al balance del Mg se ha de resear de nuevo los elevados porcentajes
de AA y retencin encontrados en todos los grupos alimentados con frmula infantil respecto al
alimentado con la dieta AO4. Tambin hay que destacar que en todos los grupos stos
porcentajes fueron descendiendo con la edad de los animales, aunque al contrario que ocurri
con el Ca, el nmero de grupos con una AA y retencin significativamente (p<0,05) superior al
grupo control fue siendo mayor conforme avanz el estudio. Los grupos alimentados con las
dietas prebitica al 10% y simbiticas al 5 y 10% fueron los que mostraron unos valores de AA
y retencin de Mg significativamente (p<0,05) superiores al grupo control en los dos ltimos
periodos, y de ellos el grupo alimentado con la dieta simbitica al 10% fue el nico en mostrar
una AA de Mg significativamente (p<0,05) superior al grupo control en todos los periodos. La
relacin dosis-efecto respecto a la variacin de la concentracin de 4-GOS nicamente fue
observada para la dieta prebitica en el 1er periodo y para la simbitica en el tercero.
Diversos estudios con ratas muestran que cuando se aaden a la dieta diferentes OND
la absorcin de Mg se incrementa significativamente. La administracin de dietas con 5% de 4-
GOS a ratas, obtuvo como resultado una AA de Mg del 87,4% frente al 56,9% del grupo control
(Chonan y col., 2001). En otro estudio con ratas laparotomizadas y una dieta con 5% de GOS,
la AA de Mg fue de 90,6% frente al 60,2% del control (Chonan y Takahashi, 1999). Por otra
parte, estudios ms largos en el tiempo con OND diferentes muestran resultados similares a los
nuestros. La administracin de un 5% FOS cc a la dieta de ratas durante tres periodos de
balance (3-7 das, 14-18 das y 27-31 das) produjo una AA de Mg significativamente (p<0,01)
mayor (83,1, 78,3 y 73,3%, respectivamente) que el grupo control (61, 55,3 y 49,8%,
respectivamente) (Ohta y col., 1993). Delzenne y col. (1995) encontraron en ratas alimentadas
con una dieta (0,1 g/100 g de Mg) con inulina u oligofructosa al 10%, una retencin de Mg del
75%. Ratas de cinco semanas que se alimentaron con una dieta con 10% FOS cc mostraron
una retencin de Mg del 90,7% en el 1er periodo (10-14 das) y del 85,9% en el 2 periodo (24-
28 das) (Ohta y col., 1998d). En base a estas referencias podemos afirmar que el incremento
en la absorcin y retencin de Mg en este estudio y debido a la dieta con 4-GOS, est en
consonancia con los datos hallados en la bibliografa.
No obstante, en la absorcin de Mg influyen otros factores como la concentracin de
otros minerales presentes en la dieta (Ohta y col., 1994a). Estos autores observaron que en
una dieta con contenido normal de Ca (520 mg/ 100 g) y normal de P (800 mg/100 g) la AA de
Mg eran mayor (83,6%) que con contenido normal de Ca y alto de P (1.200 mg/ 100 g)

182
(59,3%). En nuestro estudio los contenidos de Ca y P fueron de 572 y 344 mg/100 g,
respectivamente, contenidos que pueden ser considerados normales.
Estudios de balance con nios nacidos a trmino (Skyberg y col., 1968) muestran una
absorcin de Mg de 55-75%, similares a los encontrados en nuestro estudio. Se sabe que la
absorcin de Mg en ratas jvenes, al igual que en el hombre (Shils, 1988), no se produce
mediante transporte activo, por lo que la difusin pasiva va ruta pericelular parece ser el nico
mecanismo de absorcin durante las primeras semanas (Meneely y col., 1982). Una explicacin
a esta similitud, adems del posible efecto ejercido por los probiticos y prebiticos aadidos a
las frmulas infantiles sobre la absorcin de Mg, es el hecho de la mayora del Mg encontrado
tanto en la leche humana como en las frmulas infantiles, est en la fraccin soluble del mismo
(92% en la fraccin del suero de la leche humana y 83% en frmula con suero lcteo)
(Lnnerdal y col., 1993). Adems, estos mismos autores en ratas lactantes observaron que ni la
cantidad de Mg o Ca en la dieta, ni las diferentes fuentes de Mg usadas en las frmulas
infantiles (MgHPO4, MgCl2, MgO) afectaron a la absorcin de Mg. Tambin sealaron que
probablemente la abundancia de ligandos presentes en la frmula infantil ayudan a solubilizar el
Mg, como se demostr en un estudio in vitro simulando las condiciones del tracto GI, donde el
citrato tena la mayor capacidad para formar complejos absorbibles con el Mg (Blaquiere y
Berthon, 1987).
Como conclusin al balance mineral del Mg podemos afirmar que de forma general los
grupos problema tuvieron una AA y retencin superior al grupo control, con valores
significativamente superiores a este ltimo en los periodos 2 y 3. Es de destacar que el grupo
alimentado con la dieta probitica mostr los valores ms bajos en los tres periodos entre los
grupos problema y nunca fue significativamente superior al control. nicamente se observ una
clara relacin dosis-efecto en los grupos alimentados con la dieta prebitica en el 1er periodo y
con la dieta simbitica en el 3er periodo. El mayor efecto de las dietas simbiticas respecto a las
prebiticas, se observ nicamente en la AA y retencin de Mg del grupo alimentado con la
dieta simbitica al 1,2%, y en la AA de Mg en el grupo alimentado con la dieta simbitica al
5%. Sin embargo, las dietas prebitica al 10% y simbiticas al 5 y 10% se mostraron como las
ms eficaces al obtener una significativa mayor AA y retencin de Mg en los dos ltimos
periodos.

183
Tabla 43. Balance mineral del magnesio
Absorcin Retencin Excrecin fecal Excrecin fecal Excrecin urinaria Excrecin urinaria
Periodo Dietas
aparente (%) (%) (mg/g) (mg/da) (mg/mL) (mg/da)
8-10 das AO4 52,062,53 50,302,83 1,700,10 14,991,19 0,130,035 0,550,10
Control 82,853,94 81,783,89 0,960,16 0,730,16 0,0140,007 0,0460,022
Probitica 80,863,42b 77,503,45bc 1,300,10 ab 0,520,07 b 0,0460,006 a 0,0920,014 abc
Prebitica 1,2% 71,471,44c 66,972,67*/c 1,410,04 a 0,780,10 a 0,0470,007 a 0,180,015*/a
Prebitica 5% 86,680,60ab 86,490,76ab 0,870,08 bc
0,420,02 b 0,0020,000 a 0,0060,005 bc
Prebitica 10% 90,541,59a 90,081,58a 0,610,02 c
0,280,05 */bc 0,0030,000 a 0,0140,001 b
Simbitica 1,2% 89,691,87ab 87,681,85ab 1,540,12 */a
0,290,06 */bc 0,0370,005 a 0,0510,002 ac
Simbitica 5% 87,401,29ab 86,601,40ab 0,860,15 c
0,320,03 */bc 0,0150,007 a 0,0220,011 bc
Simbitica 10% 94,741,77*/a 91,453,91a 0,440,01 */c
0,140,04 */c 0,0370,033 a 0,090,07 abc
18-20 das AO4 57,420,79 54,630,99 1,450,07 16,560,54 0,140,02 1,0710,14
Control 81,921,46 78,410,57 0,710,01 0,850,14 0,0460,005 0,160,036
Probitica 78,332,54d 77,162,56b 0,960,15 a 0,780,10 a 0,0180,008 c 0,0440,02*/b
Prebitica 1,2% 90,351,74*/ac 84,291,94ab 0,780,05 abc 0,400,07 */bc 0,130,011*/a 0,250,008*/a
Prebitica 5% 84,931,53bcd 84,731,52ab 0,790,03 ab
0,610,04 ab 0,0040,000 */c 0,0080,000 */b
Prebitica 10% 91,131,13*/ab 90,481,31*/a 0,680,02 abc
0,340,05 */bc 0,0070,003 */c 0,0230,01*/b
Simbitica 1,2% 87,530,65ab 86,530,78a 0,700,06 abc
0,410,02 */bc 0,0210,008 bc 0,0320,017 */b
Simbitica 5% 93,490,44*/ab 92,610,27*/a 0,340,04 bc
0,220,01 */c 0,0240,008 bc 0,030,013*/b
Simbitica 10% 95,060,98*/a 89,672,45*/a 0,320,03 c
0,180,03 */c 0,0530,008 b 0,190,045ab
28-30 das AO4 52,643,33 50,083,00 1,690,12 19,580,99 0,1360,021 1,070,19
Control 76,631,78 72,001,53 0,660,09 1,320,14 0,0460,012 0,260,008
Probitica 76,952,03d 71,803,17b 0,760,07 ab 1,180,10 a 0,100,04 b 0,250,10 b
Prebitica 1,2% 85,591,49*/ac 81,331,25*/a 0,600,03 ab 0,770,10 */bc 0,0750,044 b 0,210,12 b
Prebitica 5% 81,181,15bcd 80,991,15*/a 0,790,05 a
1,080,05 ab 0,0030,000 b 0,0110,000 b
Prebitica 10% 89,850,89*/a 89,680,92*/a 0,570,09 ac
0,600,06 */c 0,0020,000 b 0,0090,001 b
Simbitica 1,2% 85,651,48*/ab 63,540,57bc 0,540,02 bc
0,640,09 */c 0,420,034*/a 0,970,06 */a
Simbitica 5% 89,901,67*/a 60,033,66*/c 0,310,04 */c
0,450,08 */c 0,500,11 */a 1,340,24 */ab
Simbitica 10% 90,902,03*/a 90,692,05*/a 0,230,04 */c
0,400,07 */c 0,0020,000 b 0,0090,001 b
Cada valor es la mediaerror tpico, n=6
*
La presencia de asteriscos dentro de la misma columna para cada uno de los 3 periodos indica diferencias significativas (p<0,05) de los grupos con dietas probitica, prebitica y
simbitica respecto al grupo control, realizada mediante un test de separacin de medias bilateral
a-d
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma columna para cada uno de los 3 periodos indica diferencias significativas (p<0,05) entre los grupos
con dietas probitica, prebitica y simbitica

184
4.4.3. Balance de fsforo

La Tabla 44 muestra el balance mineral del P en tres periodos de tres das cada uno
durante el tiempo en el que se les administr los diferentes tipos de dietas a las ratas. En el 1er
periodo la AA de P de ninguno de los grupos problema mostr diferencias significativas
(p<0,05) respecto a la del grupo control (93,13%). Tampoco fueron observadas diferencias
entre los grupos problema, oscilando sus valores de 90,68 a 96,23%. En el 2 periodo,
nicamente el grupo alimentado con la dieta prebitica al 10% mostr una AA
significativamente (p<0,05) superior (94,24%) a la del grupo alimentado con la dieta control
(82,38%), debido a su menor excrecin diaria de P en heces respecto al grupo control (5,86
mg/da). En el 3er periodo, los grupos alimentados con las dietas probitica y prebiticas al 1,2
y 10% (85,82, 87,73 y 91,63%, respectivamente) fueron los que tuvieron una AA
significativamente (p<0,05) mayor a la del grupo control (79,04%), por presentar los dos
ltimos una excrecin de P en heces inferior a la del grupo control (8,45 mg/da).
Debido a que las prdidas por orina de P fueron ms importantes que en el resto de
minerales, los porcentajes de retencin de P descendieron de forma considerable. Esta
reduccin fue ms notoria en los grupos alimentados con las dietas simbiticas al 1,2 y 5% en
todos los periodos. As en el 1er periodo, la reduccin fue de un 19,2 y 9,5%, respectivamente,
en el 2 periodo de un 8 y 12,2%, respectivamente, y en el 3er periodo de un 16 y 17%,
respectivamente. En cuanto a los valores de retencin en el 1er periodo, los nicos grupos que
mostraron diferencias significativas (p<0,05) con el grupo control (92,92%) fueron los grupos
alimentados con las dietas simbiticas al 1,2 y 5% (77,07 y 81,17%, respectivamente) debido a
las significativas (p<0,05) prdidas de P por orina. En el 2 periodo, al igual que con la AA el
nico grupo con una retencin significativamente (p<0,05) superior a la del grupo control
(81,28%) fue el alimentado con la dieta prebitica al 10% (92,70%), aunque no mostr
diferencias significativas (p<0,05) con los grupos alimentados con las otras dietas prebiticas y
con la simbitica al 10% (88,67, 85,52 y 86,66%, respectivamente). Por el contrario, los grupos
con los porcentajes ms bajos fueron los alimentados con las dietas probitica y simbitica al
5% (75,16 y 74,53%, respectivamente) al ser los dos grupos con mayores prdidas de P por
orina y da. En el 3er periodo, fueron nicamente los grupos alimentados con las dietas
prebiticas al 1,2 y 10% los que mostraron valores significativamente (p<0,05) superiores
(86,23 y 90,20%, respectivamente) al del grupo control (72,53%). Los grupos que presentaron
los valores de retencin ms bajos fueron los alimentados con las dietas probitica y simbiticas
(desde 63,91% con la dieta simbitica al 1,2% hasta 70,39% con la simbitica al 10%) debido
a su mayor excrecin de P por orina.
Como conclusin al balance del P se puede sealar de nuevo los elevados porcentajes
AA y retencin encontrados en todos los grupos alimentados con frmula infantil respecto al
alimentado con la dieta AO4. Tambin hay que destacar que en todos los grupos estos
porcentajes fueron descendiendo conforme los animales iban siendo mayores. Al igual que

185
ocurri con el Mg, el nmero de grupos con una AA y retencin significativamente (p<0,05)
superior al grupo control fue siendo mayor conforme avanzaba el estudio. Tambin se observ
un efecto claro en la excrecin urinaria de P en los grupos alimentados con las dietas
simbiticas al 1,2 y 5%, que redujo significativamente (p<0,05) los porcentajes de retencin en
el 1er periodo, y simbitica 1,2% en el 3er periodo.
Los estudios sobre el efecto de los OND en la absorcin de P son muy escasos. Ohta y
col. (1993) observaron que la administracin de un 5% FOS cc a la dieta de ratas produjo un
aumento significativo (p<0,05) de la AA de P, mientras que los GOS y la rafinosa no mostraron
diferencias con el control. En ratas de cuatro semanas de edad alimentadas con una dieta que
contena un 5% de FOS cc se obtuvo una AA de P del 90 y 95% cuando se realiz una infusin
de Ca y Mg en el estmago y ciego, respectivamente (Ohta y col., 1997). Ohta y col. (1994a)
describieron que la administracin a ratas de dietas con elevado contenido de Ca (1.040
mg/100 g) produjo una reduccin en la absorcin de P (del orden del 20%). En nuestro estudio
el efecto de la concentracin de Ca de la dieta no fue determinante para modificar la absorcin
de P, ya que el nivel de Ca en la dieta empleada puede considerarse moderado (572 mg/ 100
g). Los valores de AA de P obtenidos en este estudio (1er periodo) coinciden con los descritos
por Ohta y col. (1994a) (93%) cuando el contenido de Ca en la dieta es similar (520 mg/100 g).
Para finalizar el balance del P, se puede concluir que nicamente los grupos
alimentados con las dietas probitica, prebiticas al 1,2 y 10% mostraron una absorcin de P
significativamente (p<0,05) mayor a la del grupo alimentado con la dieta control en alguno de
los tres periodos de balance mineral. El grupo alimentado con frmula probitica no present
un mayor efecto respecto a los grupos alimentados con frmula prebitica. Al igual que con los
otros minerales, en ningn periodo se pudo establecer una relacin dosis-efecto en cuanto al
incremento de la concentracin de 4-GOS en la dieta y la absorcin de P. El nico grupo que
mostr una AA y retencin significativamente (p<0,05) superior al grupo control en los ltimos
dos periodos fue el alimentado con la dieta prebitica al 10%. Las dietas simbiticas no
presentaron ninguna mejora en la absorcin de P respecto a las dietas prebiticas.

186
Tabla 44. Balance mineral del fsforo
Absorcin Retencin Excrecin fecal Excrecin fecal Excrecin urinaria Excrecin urinaria
Periodo Dietas
aparente (%) (%) (mg/g) (mg/da) (mg/mL) (mg/da)
8-10 das AO4 33,873,38 33,113,47 7,860,45 69,515,44 0,170,030 0,780,18
Control 93,130,55 92,920,54 2,970,07 2,210,18 0,020,007 0,0650,01
Probitica 95,400,28a 88,700,86ab 2,850,17 bcd 1,140,06 */a 0,830,064*/c 1,650,19 */bc
Prebitica 1,2% 92,041,84a 91,881,84ab 3,110,09 c 1,440,35 a 0,0710,003 e 0,0280,01d
Prebitica 5% 93,000,56a 91,060,84ab 3,010,16 bcd 1,470,10 a 0,120,017de 0,410,084bc
Prebitica 10% 95,950,64a 94,210,53a 1,710,04 */d 0,790,14 */a 0,0850,002 de 0,340,03 bc
Simbitica 1,2% 96,230,90a 77,072,88*/c 4,030,03 */ab 0,800,22 */a 2,760,108*/a 3,900,58 */a
Simbitica 5% 90,681,89a 81,174,04*/bc 4,910,18 */a 1,900,28 a 1,560,157*/b 1,960,51 */b
Simbitica 10% 93,232,34a 88,872,98abc 4,000,21 */ac 1,270,44 a 0,410,071*/d 1,190,11 */bcd
18-20 das AO4 31,541,91 25,016,00 8,490,72 97,3110,77 0,150,001 1,120,12
Control 82,384,39 81,284,37 4,280,61 5,861,49 0,110,008 0,370,001
Probitica 88,220,45b 81,860,45c 4,610,31 b 3,810,16 a 0,860,026*/b 2,050,068*/b
Prebitica 1,2% 90,851,78ab 88,671,65ab 4,610,34 b 2,380,43 */bc 0,300,054c 0,580,089d
Prebitica 5% 87,471,53b 85,521,64bc 4,360,34 bc 3,360,32 ab 0,220,031c 0,520,082d
Prebitica 10% 94,241,04*/a 92,701,02*/a 2,860,27 c 1,460,31 */c 0,110,011cd 0,380,031d
Simbitica 1,2% 84,971,30b 79,861,50c 6,920,75 */a 3,920,15 ab 1,250,34 */b 1,330,15 */c
Simbitica 5% 86,750,49b 71,691,13d 5,720,41 ab 3,710,14 ab 3,180,13 */a 4,210,12 */a
Simbitica 10% 88,332,23ab 86,662,42abc 5,390,51 ab 3,040,48 ab 0,120,019cd 0,430,04 d
28-30 das AO4 40,561,21 33,646,08 7,870,69 90,806,73 0,170,005 1,330,06
Control 79,041,59 72,531,75 4,250,37 8,450,46 0,490,05 2,640,43
Probitica 85,821,32*/ab 67,901,52c 4,150,38 ab 6,500,63 a 2,920,14 */a 8,270,54 */a
Prebitica 1,2% 87,731,06*/ab 86,231,12*/a 3,230,21 b 4,150,41 */bc 0,150,018b 0,510,06 d
Prebitica 5% 82,610,81b 78,081,49b 4,870,29 ab 6,700,26 a 0,530,13 b 1,760,42 cd
Prebitica 10% 91,630,86*/a 90,201,02*/a 3,090,51 b 3,240,34 */c 0,140,032b 0,550,15 d
Simbitica 1,2% 79,973,09ab 63,914,38*/c 5,820,96 a 6,821,18 ab 2,210,76 */a 5,291,86 ab
Simbitica 5% 81,151,40ab 64,153,57c 4,920,45 ab 7,020,85 a 2,210,19 */a 6,191,31 */a
Simbitica 10% 75,763,26ab 70,393,20bc 4,390,49 ab 7,580,75 a 0,450,03 b 1,690,26 bcd
Cada valor es la mediaerror tpico, n=6
*
La presencia de asteriscos dentro de la misma columna para cada uno de los 3 periodos indica diferencias significativas (p<0,05) de los grupos con dietas probitica, prebitica
y simbitica respecto al grupo control, realizada mediante un test de separacin de medias bilateral
a-e
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma columna para cada uno de los 3 periodos indica diferencias significativas (p<0,05) entre los grupos
con dietas probitica, prebitica y simbitica

187
4.4.4. Balance de hierro

La Tabla 45 muestra el balance mineral del Fe en tres periodos de tres das cada uno
durante el tiempo en el que se les administr los diferentes tipos de dietas a las ratas. En el 1er
periodo, la AA del Fe de todos los grupos problema fue superior a la del grupo control
(50,78%), siendo la diferencia estadsticamente significativa (p<0,05) en los grupos
alimentados con las dietas probitica, prebiticas y simbiticas al 1,2 y 10% (de 63,82 a
66,91%), sin embargo los grupos cuyas dietas contenan un 5% de 4-GOS fueron los que
mostraron una menor AA. Todos los grupos problema excretaron en heces cantidades
significativamente (p<0,05) inferiores de Fe respecto al grupo control. En el 2 periodo, todos
los grupos problema mostraron una AA de Fe superior a la del grupo control (31,12%) excepto
el alimentado con la dieta simbitica al 10% (27,21%). nicamente los grupos alimentados con
las dietas prebiticas al 5 y 10% mostraron una AA significativamente (p<0,05) superior (67,76
y 63,48%, respectivamente) al grupo control (31,12%). En este periodo, todos los grupos
excretaron la misma cantidad de Fe por g de heces (entre 0,51 y 0,76 mg/g heces para los
grupos alimentados con las dietas simbitica y prebitica al 1,2%, respectivamente) que el
grupo control (0,53 mg/g heces), pero estas diferencias se hicieron significativamente (p<0,05)
inferiores en todos los grupos cuando se tuvo en cuenta la excrecin total de Fe al da. En el 3er
periodo, todos los grupos problema presentaron una AA de Fe superior a la del grupo control
(15,71%), y fueron los grupos alimentados con las dietas prebitica al 10% y simbitica al 1,2 y
10% (36,71, 30,32 y 35,14%, respectivamente) los que mostraron una AA significativamente
(p<0,05) superior a la del grupo control (15,71%). En este ltimo periodo, todos los grupos
excretaron la misma cantidad de Fe por g de heces (entre 0,38 y 0,54 mg/g heces para los
grupos alimentados con las dietas simbitica y prebitica al 5%, respectivamente) que el grupo
control (0,53 mg/g heces), excepto el grupo alimentado con la dieta simbitica al 1,2% (0,21
mg/g heces), pero de nuevo estas diferencias se hicieron significativamente (p<0,05) inferiores
en todos los grupos cuando se tuvo en cuenta la excrecin fecal total de Fe al da, excepto en
el grupo alimentado con la dieta probitica que no mostr diferencias (0,83 mg/da).
Debido a que las prdidas de Fe por orina fueron muy pequeas y estas no mostraron
diferencias significativas (p<0,05) con las encontradas en el grupo control en ningn periodo,
los porcentajes de retencin de Fe no llegaron a tener ms de un 1,2% de diferencia (en el
grupo alimentado con la dieta simbitica al 10% en el 1er periodo) con el valor de AA en
cualquier periodo. As, las diferencias encontradas entre los grupos en cuanto al porcentaje de
retencin de Fe fueron las mismas que las de la AA de Fe, excepto en el 3er periodo dnde
nicamente los grupos alimentados con las dietas que contienen un 10% de 4-GOS fueron las
que mostraron una retencin significativamente (p<0,05) superior entorno al doble (36,47 y
34,89% con las dietas prebitica y simbitica al 10%, respectivamente) de la retencin del
grupo alimentado con la dieta control (15,30%).

188
 Como conclusin al balance del Fe se puede sealar de nuevo los mayores porcentajes
AA y retencin encontrados en todos los grupos alimentados con frmula infantil respecto al
alimentado con la dieta AO4 pero sin ser tan elevados como en el Ca. Las diferencias
encontradas entre el grupo control y los grupos problema fueron las mismas para la AA y la
retencin de Fe, puesto que las cantidades de Fe excretado por orina apenas tuvieron efecto en
el clculo de los balances. Los nicos grupos que mostraron una AA y retencin
significativamente (p<0,05) superior a las del grupo control en los tres periodos fueron los
alimentados con las dietas prebitica y simbitica al 10%. Las diferencias en los valores de AA
en todos los periodos y grupos respecto al grupo control se debieron a una menor excrecin de
Fe en las heces (en los grupos ya comentados anteriormente) causada por la excrecin de un
menor volumen fecal. Hay que destacar que en todos los grupos estos porcentajes fueron
descendiendo con el tiempo puesto que se observ un menor nmero de grupos problema con
valores significativamente (p<0,05) superiores al grupo control. Por otra parte, no fue
observada una relacin clara dosis-efecto ni en la AA ni en la retencin de este mineral.
Existen pocos datos en la bibliografa cientfica que evalen el efecto de los GOS en la
absorcin de Fe. No obstante, otros autores han empleado OND diferentes a los GOS en la
evaluacin del balance del Fe. As, Delzenne y col. (1995) encontraron en ratas jvenes
alimentadas con una dieta con 7,8 mg/100 g de Fe y con inulina u oligofructosa al 10% durante
26 das, una retencin de Fe del 34%. Ohta y col. (1995b) en ratas anmicas recin destetadas,
alimentadas con FOS cc al 5% y una dieta baja (1,5 mg/100 g) o normal en Fe (3,0 mg/100 g),
observaron una AA de Fe significativamente (p<0,05) menor en la dieta baja en Fe (46,3%)
que en la de contenido normal en Fe (54,4%) sin estar afectados los balances del Ca y del Mg.
Ms recientemente, Lopez y col. (1998) en un estudio con ratas alimentadas con almidn
resistente, observaron que el balance del Fe aument significativamente con una AA del 54%
con almidn resistente respecto al control (45%).
Como puede observarse al comparar los resultados obtenidos en este estudio con los
descritos anteriormente, la AA y retencin de Fe debida a el 4-GOS es menor que para otros
OND (inulina, oligofructosa, FOS cc), debido entre otros motivos a las diferentes condiciones de
evaluacin del balance mineral, ya que en estos estudios las ratas parten de condiciones
anmicas, por lo que el efecto de los OND es ms intenso que cuando las condiciones
fisiolgicas son normales, como ocurre en nuestro estudio. Tambin se han de tener en cuenta
los posibles productos de la reaccin de Maillard (lisinoalanina y lactulosa) que se pueden
originar durante el procesado tecnolgico de las frmulas infantiles (Sarri y col., 2000). Estos
productos tienen el potencial de interactuar con varios minerales y elementos traza incluyendo
al Fe (Sarri y Vaquero, 2001) formando complejos insolubles que disminuyen su
biodisponibilidad. Adems, como consecuencia del dao proteico debido a los procesos trmicos
se podran perder propiedades asociadas con los mecanismos de absorcin mineral (Prez-
Llamas y col., 1996).

189
 Para concluir la discusin de los resultados obtenidos en el balance del Fe, excepto el
grupo alimentado con la dieta simbitica al 5%, todos los grupos problema presentaron una AA
y retencin de Fe significativamente (p<0,05) superior a la del grupo alimentado con dieta
control en alguno de los periodos. El efecto de las dietas prebiticas fue mayor que el de la
dieta probitica, sin embargo, la adicin de diferentes concentraciones de 4-GOS a la dieta no
mostr una clara tendencia dosis-efecto. La incorporacin de los probiticos a la dieta
prebitica dando lugar a las dietas simbiticas tampoco mejor la absorcin de Fe respecto a
las primeras. Los grupos alimentados con las dietas prebitica y simbitica al 5 y 10% fueron
los ms eficaces al mostrar una AA y retencin de Fe significativamente (p<0,05) superior a la
grupo control durante los tres periodos de balance.

190
Tabla 45. Balance mineral del hierro
Absorcin Retencin Excrecin fecal Excrecin fecal Excrecin urinaria Excrecin urinaria
Periodo Dietas
aparente (%) (%) (mg/g) (mg/da) (g/mL) (g/da)
8-10 das AO4 20,774,74 20,194,76 0,600,05 4,830,11 1,330,16 5,700,32
Control 50,782,94 50,562,95 0,630,06 0,440,03 0,660,14 2,160,45
Probitica 63,980,54*/ac 63,850,55*/ab 0,580,01 a 0,260,02 */a 0,600,22 a 1,280,51 a
Prebitica 1,2% 65,152,43*/ab 64,922,49*/ab 0,510,08 */ab 0,180,02 */bc 0,560,088 a 2,300,61 a
Prebitica 5% 56,691,44bc 56,421,46bc 0,570,01 a 0,270,01 */a 0,860,19 a 2,700,44 a
Prebitica 10% 66,910,26*/a 66,660,28*/a 0,470,02 */ab 0,170,01 */c 0,620,03 a 2,480,27 a
Simbitica 1,2% 63,823,17*/ac 63,603,17*/ab 0,640,01 a 0,160,03 */c 0,160,22 a 2,170,067 a
Simbitica 5% 55,982,00c 55,082,41c 0,400,03 */b 0,160,01 */c 6,204,83 a 8,987,63 a
Simbitica 10% 66,020,75*/a 64,830,96*/ab 0,580,02 a 0,240,05 */ab 24050 a 68961 a
18-20 das AO4 23,681,62 21,123,50 0,530,02 6,020,31 109595,8 8104834
Control 31,123,70 30,853,67 0,590,04 0,680,06 0,860,14 a 2,730,52
Probitica 32,182,80cb 32,002,79cb 0,550,02 a 0,460,03 */ab 0,760,053 a 1,810,11 a
Prebitica 1,2% 45,091,54*/bc 44,782,17*/bc 0,760,06 a 0,400,01 */a 1,430,16 a 2,810,25 a
Prebitica 5% 67,765,19*/a 67,525,19*/a 0,480,17 a 0,350,12 */ab 1,400,29 a 3,160,53 a
Prebitica 10% 63,480,80*/a 63,241,51*/a 0,620,02 a 0,290,07 */b 0,710,12 a 2,710,72 a
Simbitica 1,2% 40,442,44bcd 40,112,53bcd 0,510,01 a 0,320,03 */ab 3,832,43 a 3,281,11 a
Simbitica 5% 27,214,05d 26,434,47d 0,610,05 a 0,390,02 */ab 6,013,75 a 7,785,77 a
Simbitica 10% 53,282,91*/ab 52,912,83*/ab 0,680,09 a 0,450,02 */a 602110a 2160429 a
28-30 das AO4 14,443,80 13,873,82 0,630,02 7,320,41 788131 6025664
Control 15,710,81 15,301,28 0,530,02 1,040,06 0,580,069 3,371,00
Probitica 17,092,98b 16,153,36b 0,510,06 ab 0,830,03 a 3,472,57 a 9,346,26 a
Prebitica 1,2% 22,272,63a 22,152,58ab 0,530,05 ab 0,770,08 */ab 0,320,22 a 1,180,73 a
Prebitica 5% 24,235,19ab 23,415,70ab 0,540,03 a 0,780,08 */ab 0,211,28 a 6,573,69 a
Prebitica 10% 36,712,97*/a 36,473,00*/a 0,550,07 a 0,600,06 */ac 0,610,06 a 2,410,50 a
Simbitica 1,2% 30,323,90*/ab 29,443,98ab 0,210,01 */b 0,480,05 */c 0,750,18 a 1,730,20 a
Simbitica 5% 25,142,00ab 24,362,24ab 0,380,06 ab 0,530,01 */bc 2,600,79 a 7,783,53 a
Simbitica 10% 35,142,99*/a 34,892,98*/ab 0,450,08 ab 0,750,01 */ac 6,640,07 a 2,520,55 a
Cada valor es la mediaerror tpico, n=6
*
La presencia de asteriscos dentro de la misma columna para cada uno de los 3 periodos indica diferencias significativas (p<0,05) de los grupos con dietas probitica, prebitica y
simbitica respecto al grupo control, realizada mediante un test de separacin de medias bilateral
a-d
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma columna para cada uno de los 3 periodos indica diferencias significativas (p<0,05) entre los grupos con dietas
probitica, prebitica y simbitica

191
4.5. Efecto sobre el ciego y el colon de las ratas

4.5.1. Peso y valor de pH del ciego y del colon y sus contenidos

En la Tabla 46 se muestran las siguientes variables medidas en el ciego: el peso total

del ciego y de la pared del mismo tras extraer su contenido, el pH y peso del contenido, as
como los pesos de la fase slida y lquida del mismo tras su centrifugacin. Como muestra la
tabla, la incorporacin a la dieta de probiticos y/o prebiticos no modific significativamente
(p<0,05) el peso total del ciego ni el de su contenido. La pared del ciego se vio afectada en el
grupo alimentado con la dieta prebitica al 10%, en el que se observ un aumento de peso
(1,58 g), lo que representa un incremento de 1/3 del peso de la pared del grupo control. A
pesar de no observar diferencias significativas en relacin al grupo control, los grupos
alimentados con las dietas prebitica al 10% y simbiticas al 5 y 10% fueron los que
presentaron un peso total, de la pared y del contenido del ciego superior entre los grupos
problema. En cuanto al pH del contenido del ciego, fueron los grupos alimentados con las dietas
simbiticas los que mostraron un pH significativamente (p<0,05) ms bajo (5,14, 5,12 y 5,13,
respectivamente) que el grupo control (5,60). De las dos fases en las que se divide el contenido
del ciego tras su centrifugacin, el peso de la fase slida no tuvo diferencias significativas
(p<0,05) en los grupos problema respecto al grupo control (0,29 g). Sin embargo, los grupos
alimentados con las dietas prebitica al 10% y simbiticas mostraron un peso significativamente
(p<0,05) mayor de la fase lquida (de 3,28 g con la dieta simbitica al 1,2% a 3,70 g con la
dieta prebitica al 10%) en comparacin con el del grupo alimentado con la dieta control (2,91
g).

Tabla 46. Peso y pH del ciego y su contenido en ratas

Peso total Peso pared Peso contenido Peso fase Peso fase
Dietas pH
(g) (g) (g) lquida (g) slida (g)
AO4 5,940,92 1,200,17 4,740,80 5,950,09 4,120,02 0,620,02
Control 4,240,53 1,020,08 3,210,49 5,600,09 2,910,04 0,290,03
Probitica 4,220,18ab 1,040,05b 3,180,16ab 5,670,07a 2,880,02c 0,300,02a
Prebitica 1,2% 3,510,38b 1,000,11b 2,500,30b 5,500,09ab 2,280,03*/d 0,220,03a
Prebitica 5% 3,380,39b 0,990,05b 2,400,36b 5,400,14ab 2,220,01*/d 0,170,01a
Prebitica 10% 5,520,37a 1,580,27*/a 3,940,35ab 5,420,09ab 3,700,06*/a 0,230,06a
Simbitica 1,2% 4,510,33ab 0,950,10b 3,560,36ab 5,140,06*/b 3,280,06*/b 0,250,06a
Simbitica 5% 5,390,35a 1,360,02ab 4,030,34a 5,120,08*/b 3,690,06*/a 0,340,06a
Simbitica 10% 5,400,78a 1,370,09ab 4,030,74ab 5,130,07*/b 3,670,01*/a 0,360,01a
Cada valor es la mediaerror tpico, n=6
*
La presencia de asteriscos dentro de la misma columna indica diferencias significativas (p<0,05) de los grupos con dietas probitica,
prebitica y simbitica respecto al grupo control, realizada mediante un test de separacin de medias bilateral
a-d
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma columna indican diferencias significativas (p<0,05) entre
los grupos con dietas probitica, prebitica y simbitica

En la Tabla 47 se muestra el peso total del colon y de la pared del mismo tras extraer
su contenido, el pH y el peso del contenido del colon, as como los pesos de la fase slida y
lquida en la que se divide el contenido del colon despus de su centrifugacin. Al igual que

192
sucedi con el ciego, la incorporacin a la dieta de probiticos y/o prebiticos no modific
significativamente (p<0,05) el peso total del colon ni el de su contenido respecto al grupo
control. Sin embargo, el peso de la pared del colon en los grupos alimentados con dieta
simbitica al 1,2 y 5% mostraron los valores ms bajos (0,49 y 0,61 g, respectivamente). El
grupo alimentado con la dieta prebitica al 10% fue el que mostr un mayor peso total y de la
pared del colon (1,51 y 0,85 g, respectivamente), y el alimentado con la dieta probitica un
mayor peso total y del contenido del colon (1,57 y 0,84 g, respectivamente) entre los grupos
problema. En cuanto al pH del contenido del colon, al igual que ocurri con el ciego, los grupos
alimentados con las dietas simbiticas fueron los que mostraron un pH ms bajo (5,25, 5,21 y
5,26, respectivamente) junto al alimentado con la dieta prebitica al 5% (5,36), difiriendo todos
ellos significativamente (p<0,05) con el grupo control (5,77). Excepto la fase slida del grupo
alimentado con dieta simbitica al 10% (0,33 g), ningn grupo problema mostr diferencias
significativas (p<0,05) en el peso de las fases slida y lquida del contenido del colon con el
grupo control (0,17 y 0,41 g, respectivamente).

Tabla 47. Peso y pH del colon y su contenido en ratas

Peso total Peso pared Peso contenido Peso fase Peso fase
Dietas pH
(g) (g) (g) lquida (g) slida (g)
AO4 3,830,45 1,550,07 2,280,45 5,980,06 1,740,10 0,540,10
Control 1,400,15 0,850,06 0,580,10 5,770,15 0,410,01 0,170,01
Probitica 1,570,11a 0,720,03ab 0,840,10a 5,510,12a 0,630,03a 0,210,03 a
Prebitica 1,2% 1,420,11ab 0,790,08ab 0,630,07a 5,530,15a 0,490,02ab 0,130,03a
Prebitica 5% 1,420,10ab 0,660,03abc 0,760,08a 5,360,07*/a 0,540,03ab 0,220,02a
Prebitica 10% 1,510,16a 0,850,07a 0,690,14a 5,420,08a 0,520,07ab 0,160,07a
Simbitica 1,2% 0,930,10b 0,490,05*/c 0,430,07a 5,250,04*/a 0,290,03b 0,130,03a
Simbitica 5% 1,250,11ab 0,610,04*/bc 0,640,08a 5,210,07*/a 0,420,06ab 0,220,06a
Simbitica 10% 1,440,18ab 0,700,03ac 0,740,17a 5,260,08*/a 0,410,13ab 0,330,13*/a
Cada valor es la mediaerror tpico, n=6
*
La presencia de asteriscos dentro de la misma columna indica diferencias significativas (p<0,05) de los grupos con dietas probitica,
prebitica y simbitica respecto al grupo control, realizada mediante un test de separacin de medias bilateral
a-c
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma columna indica diferencias significativas (p<0,05) entre
los grupos con dietas probitica, prebitica y simbitica

Del anlisis de las dos tablas anteriores podemos concluir que nicamente el grupo
alimentado con dieta prebitica la 10% tuvo un aumento significativo (p<0,05) en el peso de la
pared del ciego y que las dietas simbiticas redujeron significativamente (p<0,05) el pH de los
contenidos del ciego y colon respecto al grupo control. En cuanto a la fase slida del contenido
del ciego y colon, no hubo ningn efecto, y sobre la fase lquida del ciego, fueron los grupos
alimentados con las dietas simbiticas y prebitica al 10% las que incrementaron
significativamente (p<0,05) el peso de esta fase, que es donde se encuentran los minerales
dispuestos para ser absorbidos por las clulas epiteliales del intestino grueso.
Todos los estudios coinciden en sealar una disminucin significativa (p<0,05) en el pH
del contenido del ciego como consecuencia de la administracin de OND a la dieta. En este
sentido, Ohta y col. (1993) observaron que la administracin de un 5% de GOS, rafinosa o FOS
cc a la dieta de ratas disminuy significativamente (p<0,05) los valores del pH del contenido del

193
ciego (5,62, 5,54 y 5,24, respectivamente) frente al grupo control (6,88). Junto al tipo de OND
interviene tambin la concentracin de OND administrada y la concentracin de Ca en la dieta.
As Chonan y Watanuki (1995) encontraron que el pH del contenido del ciego en las ratas fue
de 5,6 cuando se les administr un 5% de TOS y de 5,3 con un 10% de TOS. Respecto al
contenido en Ca, estos mismos autores (Chonan y Watanuki, 1996) describieron que el
consumo de un 5% de 6-GOS en una dieta con bajo contenido de Ca (215 mg Ca/100 g) dio
lugar a un menor pH del contenido del ciego (5,80) en comparacin al pH alcanzado (6,04) por
el grupo alimentado con una dieta con contenido normal en Ca (2.150 mg Ca/100g). Rmsy y
col. (1993) en ratas alimentadas con una dieta con 300 mg/100 g y otra con 800 mg/100 g de
Ca enriquecidas con inulina al 15%, tambin encontraron que el pH del grupo alimentado con la
dieta con menor cantidad de Ca fue significativamente (p<0,05) inferior (5,30) al otro grupo
(5,9).
Lopez y col. (1998) no observaron diferencias significativas en el peso de la pared del
ciego utilizando como fuente de hidratos de carbono el almidn resistente y no resistente. No
obstante, empleando otro tipo de hidrato de carbono resistente se han observado otros
resultados como los descritos por Chonan y col. (2001) que observaron que la alimentacin de
ratas con una dieta con un 5% de 4-GOS produjo un aumento del peso total del ciego y de su
pared. Sin embargo, en un estudio previo Chonan y Watanuki (1995) encontraron un mayor
peso significativo de la pared del ciego slo en el grupo alimentado con un 10% de TOS, como
ocurre en nuestro trabajo empleando 4-GOS como OND.
Al igual que en nuestro estudio y empleando otros OND, Campbell y col. (1997)
tampoco encontraron diferencias significativas con el peso total y de la pared del colon respecto
al grupo control en las ratas alimentadas con dietas con un 6% de celulosa, FOS cc,
oligofructosa o XOS.
El empleo de probiticos para evaluar sus efectos sobre el ciego y el colon y sobre sus
contenidos est poco estudiado. An as, Djouzi y col. (1997) describieron que la administracin
de una dieta con probiticos provoc una disminucin significativa (p<0,05) en el pH del
contenido cecal en ratas libres de grmenes alimentadas con una dieta con un 30% de leche
fermentada con L. casei. Sin embargo y al igual que en nuestro estudio no encontraron cambios
significativos en el peso del ciego tras cuatro semanas de estudio.
En cuanto al pH del contenido del colon no suele ser medido puesto que a esta zona se
le da una menor importancia desde el punto de vista fermentativo, sin embargo Ohta y col.
(1994b) en un estudio con ratas laparotomizadas y alimentadas con una dieta con un 5% de
FOS cc, describieron que el pH del contenido del ciego y colon fue de 5,36 y 5,7
respectivamente. Al igual que en nuestro estudio, el pH del colon fue mayor que el encontrado
en el ciego, debido posiblemente a que a diferencia del hombre, la rata es una especie donde la
fermentacin se produce principalmente en el ciego (Campbell y col., 1997).
Nosotros encontramos un aumento significativo en el peso de la fase lquida del
contenido del ciego en los grupos alimentados con las dietas prebitica al 10% y las dietas

194
simbiticas. Este hallazgo tambin ha sido descrito por otros autores mediante el empleo de
almidn resistente (Schultz y col., 1993), arabinoxilanos y goma guar (Lu y col., 2000) y TGOS
(Chonan y Watanuki, 1995). Se ha descrito que este hecho podra tener un efecto directo en la
absorcin mineral y ms concretamente en la de Ca, debido a que este fluido debe aumentar la
absorcin pasiva del calcio mediante el incremento de la permeabilidad de la unin intercelular
entre los enterocitos (Bronner, 1987).
Como conclusin del efecto de los probiticos y prebiticos sobre los paramtros
medidos en el ciego y colon de las ratas, los grupos alimentados con las dietas simbiticas
fueron los que presentaron un pH del contenido del ciego significativamente (p<0,05) inferior al
del grupo control y un peso de la fase lquida, junto a la dieta prebitica al 10% en este ltimo
parmetro, significativamente (p<0,05) mayor a la del grupo control. En el colon los grupos
alimentados con las dietas simbiticas junto al alimentado con la dieta prebitica al 5%, fueron
nuevamente los que mostraron un pH del contenido del colon significativamente (p<0,05)
inferior al del grupo control.

4.5.2. Distribuci n mineral en la fase lquida y slida del contenido del ciego y del
colon

En la Tabla 48 se muestra la distribucin mineral (Ca, Mg, P y Fe) en las fases lquida y
slida del contenido del ciego y del colon expresados en mg de mineral/contenido. En todos los
minerales se observ una mayor presencia de los mismos en la fase slida respecto a la fase
lquida. La concentracin mineral de la fase lquida, donde se encuentran los minerales en su
forma soluble, tanto en el contenido del ciego como del colon de forma general no mostr
diferencias significativas (p<0,05) con la del grupo alimentado con la dieta control. nicamente
en la fase lquida del contenido del ciego la concentracin de Fe de los grupos alimentados con
las dietas prebitica y simbitica al 10% fue significativamente (p<0,05) superior (0,102 y 0,07
mg Fe, respectivamente) a la del grupo control (0,024 mg Fe).
Prcticamente todos los grupos problema presentaron un porcentaje mineral en la fase
lquida del ciego sin diferencias significativas (p<0,05) en comparacin con el del grupo control.
Sin embargo y como era de esperar, el porcentaje de Fe en la fase lquida del contenido del
colon en los grupos alimentados con las dietas prebiticas al 5 y 10% (13,66 y 15,31%,
respectivamente) fue significativamente (p<0,05) superior al grupo control (5,15%). Adems, el
grupo alimentado con la dieta prebitica al 5% present un porcentaje de Mg en la fase lquida
del ciego (95,50%) significativamente (p<0,05) mayor al del grupo control (59,22%). Los
mayores porcentajes se observaron en los minerales Ca y Mg, sugiriendo que en el contenido
del ciego se solubiliz una importante cantidad de estos minerales. En cuanto al colon, el
porcentaje de mineral solubilizado fue menor para el Ca y Mg, pero algo mayor para el Fe y P,
sugiriendo que estos dos minerales se puedan absorber en mayor medida a partir del contenido
del colon. En cualquier caso y como ocurra en el ciego fueron muy escasos los grupos

195
problema que presentaron un porcentaje mineral significativamente (p<0,05) superior al
encontrado en el grupo alimentado con la dieta control. Solamente el grupo alimentado con la
dieta prebitica al 10% present un porcentaje de Ca en la fase lquida del contenido del colon
significativamente (p<0,05) superior (61,66%) al del grupo control (10,86%). Por ltimo
destacar tanto en el ciego como en el colon el escaso porcentaje de P en la fase lquida en
comparacin al resto de minerales, posiblemente debido a que se encuentre formando algn
tipo de complejo (Brink y col., 1992) que impida su correcta medicin, puesto que la absorcin
intestinal de este mineral como se ha descrito anteriormente es bastante importante.
Ohta y col. (1995b), observaron que la concentracin de Fe en la fase lquida del
contenido del ciego fue significativamente mayor en el grupo de ratas alimentado con un 5% de
FOS cc que en el grupo control, y como en nuestro estudio, tampoco se observaron diferencias
en el contenido de Ca y Mg en la fase lquida del ciego. El Fe fue el nico mineral que mostr
un porcentaje en la fase lquida del ciego significativamente (p<0,05) superior al del control en
los grupos alimentados con dieta prebitica 5 y 10%, sin que existieran diferencias con el Ca,
Mg y P respecto al grupo control salvo en el grupo alimentado con la dieta prebitica y
simbitica al 5% para el Mg. Tambin se ha observado que la concentracin de mineral en la
dieta influye sobre la concentracin de ese mineral en la fase lquida del contenido del ciego.
As pues, Younes y col. (1996) encontraron que en ratas alimentadas con almidn resistente el
porcentaje de Ca soluble presente en el contenido del ciego fue de un 49% cuando la dieta
contena una concentracin baja de Ca (250 mg/100 g), frente a un 16% cuando el contenido
de Ca en la dieta fue mayor (750 mg/100 g). En nuestro estudio, aunque la cantidad de Ca en
la dieta fue intermedia (572 mg/100 g) a la empleada por Younes y col., obtuvimos unos
porcentajes ms similares a los del grupo alimentado con una menor cantidad de Ca.

196
T abla 48. Distribucin de los minerales (mg/contenido) en las fases lquida y slida del contenido del ciego y del colon
Prebitica Prebitica Simbitica Simbitica Simbitica
Control Probitica Prebitica
AO4 1,2% 10% 1,2% 5% 10%
5%
CIEGO
Calcio
En la fase slida 14,801,32 9,952,13 11,750,95a 7,122,75ab 5,790,27b 5,500,37b 4,590,93b 9,090,39ab 6,720,75ab
En la fase lquida 2,200,02 2,680,610 1,200,06a 2,120,03a 3,570,45a 2,550,59a 2,640,99a 3,500,97a 3,380,31a
% en fase lquida 13,080,89 21,231,06 9,330,82b 27,668,26ab 37,923,19a 30,944,44ab 37,386,95ab 26,685,21ab 33,672,60ab
Magnesio
En la fase slida 1,070,10 0,270,03 0,190,01a 0,160,06ab 0,020,00b 0,200,01*/a 0,360,03*/a 0,160,02ab 0,180,03ab
En la fase lquida 1,360,19 0,430,12 0,340,02a 0,470,14a 0,470,06a 0,330,11a 0,520,14a 0,680,15a 0,600,06a
% en fase lquida 55,692,57 59,224,78 64,441,06bc 75,245,59abc 95,500,34*/a 60,125,32bc 56,906,63c 79,144,80*/ab 76,661,61abc
Fsforo
En la fase slida 9,620,55 2,000,48 2,630,35a 2,680,96a 1,880,15a 1,740,17a 1,540,30a 2,940,24a 2,600,40a
En la fase lquida 0,0500,001 0,0410,005 0,0440,001a 0,0610,022a 0,0330,004a 0,0480,005a 0,0330,009a 0,0410,004a 0,0420,004a
% en fase lquida 0,520,04 2,210,41 1,730,25ab 2,190,20ab 1,710,09ab 2,720,40a 2,020,31ab 1,400,23b 1,630,25ab
Hierro
En la fase slida 1,080,08 0,420,05 0,330,04c 0,290,05c 0,240,02c 0,580,07ab 0,210,02*/c 0,430,01abc 0,640,08*/a
En la fase lquida 0,0220,006 0,0240,007 0,0230,005c 0,0260,008c 0,0380,005bc 0,1020,002*/a 0,0270,002c 0,0140,008c 0,0700,013*/ab
% en fase lquida 2,110,76 5,150,96 6,581,31bc 7,821,17abc 13,661,25*/ab 15,311,40*/a 11,651,78ab 3,191,78c 10,422,61abc
COLON
Calcio
En la fase slida 7,440,51 5,961,26 9,630,08*/a 3,030,65*/bc 9,340,93*/a 0,980,09*/c 3,140,31bc 3,750,46c 5,310,82b
En la fase lquida 1,330,12 1,160,06 1,170,03 1,280,08a 2,900,41a 2,130,94a 2,091,10a 1,370,71a 1,460,13a
% en fase lquida 15,342,08 17,794,43 10,860,19b 30,864,30ab 23,560,93b 61,6612,21*/a 35,6011,67ab 23,489,76b 21,851,16b
Magnesio
En la fase slida 1,710,29 0,250,04 0,340,01a 0,150,01b 0,270,03a 0,100,00*/bc 0,080,04*/c 0,130,05*/b 0,260,09a
En la fase lquida 1,030,02 0,480,08 0,200,03 0,460,06a 0,450,09a 0,500,33a 0,410,02a 0,590,37a 0,440,12a
% en fase lquida 38,403,78 65,820,83 37,223,63b 75,232,12ab 61,084,54ab 69,4613,68ab 84,636,72a 68,1114,45ab 60,586,40ab
Fsforo
En la fase slida 4,840,90 2,260,68 3,170,75a 1,320,27bc 2,480,25ab 0,510,27*/c 1,100,01bc 1,070,03bc 1,930,01abc
En la fase lquida 0,030,00 0,100,02 0,030,00a 0,100,03a 0,080,01a 0,060,03a 0,090,02a 0,030,00a 0,110,01a
% en fase lquida 0,640,15 4,811,42 1,140,21b 6,581,26ab 2,990,19ab 9,182,59a 7,662,17ab 3,070,74ab 5,560,17ab
Hierro
En la fase slida 0,760,17 0,380,12 0,340,08ab 0,280,06ab 0,480,05a 0,140,08b 0,110,01b 0,140,02b 0,320,05ab
En la fase lquida 0,0330,024 0,0310,017 0,0160,012a 0,0460,007a 0,0210,000a 0,0390,015a 0,0250,001a 0,0410,031a 0,0440,012a
% en fase lquida 3,411,87 6,601,61 5,384,46a 15,524,76a 4,340,45a 25,258,17a 19,051,12a 18,6211,78a 13,114,91a
Cada valor es la mediaerror tpico, n=6
*
La presencia de asteriscos dentro de la misma fila indica diferencias significativas (p<0,05) de los grupos con dietas probitica, prebitica y simbitica respecto al grupo control, realizada mediante
un test de separacin de medias bilateral
a-c
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma fila indican diferencias significativas (p<0,05) entre los grupos con dietas probitica, prebitica y simbitica

(contenido mineral en la fase lquida) / [(contenido mineral en la fase lquida) + (contenido mineral en la fase slida)] x 100

197
4.5.3. Morfologa de la mucosa del ciego y del colon

En la Tabla 49 se muestra la altura de las criptas y la densidad celular por cripta del
epitelio de la pared del ciego y colon (en ambas porciones: proximal y distal). En el ciego no se
apreciaron diferencias en la altura de las criptas y en la densidad celular cuando se comparan
los grupos alimentados con diferentes dietas. Respecto al colon, en la porcin proximal todos
los grupos problema mostraron una altura en sus criptas significativamente (p<0,05) mayor (de
342,22 m con la dieta probitica a 448 m con la dieta simbitica al 1,2%) a las del grupo
control (300,23 m). En cuanto a la densidad celular por cripta, los grupos alimentados con las
dietas probitica, prebiticas al 1,2 y 10%, y simbitica al 5% (de 30,0 clulas con la dieta
prebitica al 1,2% a 32,89 clulas con la dieta probitica) fueron los que mostraron un mayor
nmero de clulas por cripta, siendo su nmero significativamente mayor al encontrado en el
grupo control (26,50 clulas). En el colon distal todos los grupos problema mostraron unas
criptas significativamente (p<0,05) ms altas (de 347,39 con la dieta simbitica al 1,2% a
395,12 m con la dieta simbitica al 10%) que el grupo control (316,84 m). En cuanto a la
densidad celular por cripta, fueron los grupos alimentados con las dietas prebiticas al 1,2 y 5%
y simbiticas al 5 y 10% los que mostraron un nmero significativamente (p<0,05) ms alto de
clulas (de 28,43 clulas con la dieta prebitica al 5% a 32,33 clulas con la dieta simbitica al
10%) que el grupo alimentado con la dieta control (25,57 clulas).
Estos datos ponen de manifiesto que la adiccin de bifidobacterias y/o 4-GOS a las
dietas no tuvo ningn efecto morfolgico sobre el epitelio del ciego, al menos en la porcin
correspondiente al pice del mismo, pero s sobre la altura de las criptas y densidad celular,
tanto del colon proximal como distal. Respecto a este ltimo parmetro, y a diferencia de la
altura de las criptas en las que el incremento se observ en todos los grupos, el efecto de la
dieta se detect en el colon proximal en los grupos alimentados con las dietas probitica,
prebiticas al 1,2 y 10% y simbitica al 5%, y en el colon distal con las dietas prebiticas al 1,2
y 5% y simbiticas al 5 y 10%.
Los grupos alimentados con las dietas prebitica al 5% y simbiticas al 1,2 y 10%
mostraron en el colon proximal una altura de las criptas significativamente (p<0,05) superior a
la del grupo control pero con una densidad celular sin diferencias significativas. Este mismo
efecto tambin ocurri en la porcin del colon distal en los grupos alimentados con las dietas
probitica, prebitica al 10% y simbitica al 1,2%. Este hecho implica un aumento de tamao
de las clulas de las criptas epiteliales en los grupos descritos, que ha sido explicado en lneas
celulares de colon de rata debido a que los AGCC producidos en el lumen intestinal son
absorbidos por los colonocitos disminuyendo el pH intracelular. Con el fin de recuperara el pH,
en las clulas son activados los mecanismos de intercambio de Na + /H+ y H+ /AGCC provocando
un aumento del volumen celular (Diener y col., 1993).

198
 En el hombre se ha descrito que la fermentacin de los hidratos de carbono que
escapan a la hidrlisis enzimtica del intestino delgado sucede principalmente en el colon
ascendente debido a la mayor disponibilidad de substrato, lo que se traduce en un mayor
crecimiento bacteriano y pH ms cido (Cummings y Macfarlane, 1991). En nuestro estudio el
hecho de que la mucosa del colon haya experimentado cambios en la porcin proximal y distal
indica que las dietas han aportado una cantidad suficientemente alta de 4-GOS para que sea
fermentado en ambas porciones.
Los datos encontrados en la bibliografa son diferentes en cuanto a los efectos de los
OND sobre la morfologa del epitelio del intestino grueso en funcin del OND estudiado. Howard
y col. (1995a) en ratas jvenes que tomaron un 3% de FOS cc, XOS o goma arbiga,
observaron que nicamente el grupo alimentado con goma arbiga mostr una altura de las
criptas del ciego y del colon significativamente (p<0,05) mayor a las del grupo control, y
ninguno de los tratamientos estimul la densidad celular del ciego y del colon. Tashiro y col.
(1997) en ratas alimentadas con un 5% de FOS cc, nistosa, inulina, goma guar o celulosa, slo
encontraron diferencias significativas en la densidad celular de las criptas del ciego (25
clulas/cripta en el control y 30 clulas/cripta en grupos con inulina y goma guar), pero no en la
del colon proximal ni distal. Sin embargo, nuestros resultados coinciden con los descritos por
Howard y col. (1995b) que alimentaron con FOS al 0,3% a cerdos neonatos y encontraron que
se increment la altura de las criptas y la zona de proliferacin en el colon proximal y distal,
pero no en el ciego.
Tambin se ha descrito que la concentracin de Ca en la dieta puede tener efecto en la
proliferacin celular de la mucosa del intestino grueso. En este sentido, Rmsy y col. (1993)
observaron que tras la administracin de inulina al 15%, la altura de las criptas del ciego y la
densidad celular fueron significativamente (p<0,05) mayores en el grupo con una dieta con 800
mg Ca/100 g (320 m y 63 clulas/cripta, respectivamente) que el alimentado con una dieta
que contena 300 mg Ca/100 g.

199
Tabla 49. Morfologa de la mucosa del colon y del ciego de las ratas
CIEGO COLON COLON
(proximal) (distal)

Altura de las Densidad Altura de las Densidad Altura de las Densidad

Dietas
criptas (m) celular criptas (m) celular criptas (m) celular
AO4 316,386,77 26,751,03 400,683,18 32,801,02 338,5810,17 34,280,68
Control 404,301,48 25,200,86 300,2314,38 26,500,29 316,845,62 25,570,81
Probitica 408,185,01 b 28,140,74a 342,2211,33d/* 32,890,65a/* 376,237,04 /* 25,330,41d
Prebitica 1,2% 448,525,01 a 27,800,92a 386,766,61 c/* 30,000,84ab/* 393,338,03 a/* 29,140,46b/*
Prebitica 5% 366,926,91 c 27,500,29a 406,645,58 bc/* 29,430,37b 375,2511,43a/* 28,430,37bc/*
Prebitica 10% 358,7415,08bc 27,140,55 417,164,84 ab/* 30,171,75abc/* 397,9011,41a/* 25,600,68cd
Simbitica 1,2% 397,210,83 b 25,251,84ab 448,727,74 a/* 25,670,56c 347,397,94 a/* 27,290,56bcd
Simbitica 5% 382,8711,68bc 23,140,70b 388,908,44 bc/* 31,370,36ab/* 395,127,78 a/* 31,331,12ab/*
Simbitica 10% 380,285,75 bc 25,670,33ab 383,087,21 cd/* 30,100,38b 372,948,20 a/* 32,330,33a/*
Cada valor es la mediaerror tpico, n=6
*
La presencia de asteriscos dentro de la misma columna indica diferencias significativas (p<0,05) de los grupos con dietas probitica, prebitica y
simbitica respecto al grupo control, realizada mediante un test de separacin de medias bilateral
a-d
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma columna indican diferencias significativas (p<0,05) entre los grupos
con dietas probitica, prebitica y simbitica

200
4.6. Efecto sobre la mineralizacin del fmur y tibia de las ratas

La estructura del mineral seo est constituida principalmente por hidroxiapatita

(Ca10(PO4)6OH2) (Rasmussen y Bordier, 1974), sin embargo el hueso no slo est compuesto
por Ca y P, sino que el Mg tambin es necesario para su formacin (Rude, 1996). Por este
motivo se analizaron los huesos corporales largos ms importantes del organismo de los
mamferos durante su crecimiento, para evaluar si un incremento en la absorcin mineral se
traduce en un mayor depsito de estos minerales en el hueso. El Fe por el contrario no tiene
como rgano diana al sistema esqueltico, si no que se encuentra mayoritariamente formando
parte de la Hb, Mb y diversas enzimas. Sin embargo, hasta el 30% del Fe corporal est
almacenado como ferritina y hemosiderina, el 30% est en el hgado, el 30% se presenta en la
mdula sea, y el resto se encuentra en el bazo y los msculos (NCR, 1991; Czajka, 1996).
Adems, la evaluacin del Fe contenido en la hemosiderina est considerado normalmente
como la referencia estndar por ser el indicador ms sensible y especfico para la valoracin de
las reservas de Fe (Holyoake y col., 1993). Por tanto, tambin se midi el contenido de Fe que
el fmur y la tibia presentaban almacenado en su mdula sea.
En la Tabla 50 se muestra el peso seco, contenido en cenizas y en minerales (Ca, Mg,
P y Fe), expresado en mg de mineral/g de hueso en peso seco, del fmur de las ratas
empleadas en el estudio de balance mineral. Todos los grupos problema presentaron un fmur
significativamente (p<0,05) menos pesado (de 282,25 mg con la dieta simbitica al 1,2% a
304,13 mg con la dieta prebitica al 5%) que el del grupo control (349,60 mg), siendo el grupo
alimentado con la dieta simbitica al 1,2% el que mostr el hueso ms ligero. En cuanto al
contenido en cenizas, los grupos alimentados con las dietas prebiticas no mostraron
diferencias con el grupo control (57,24%), siendo por el contrario menor el peso de los grupos
alimentados con las dietas simbiticas y la probitica. Sin embargo, y a pesar de estos valores
de cenizas el contenido en Ca del fmur de todos los grupos problema fue significativamente
(p<0,05) superior (de 181,07 mg con la dieta probitica a 206,78 mg con la dieta simbitica al
5%) respecto al grupo control (156,03 mg), mostrando los grupos alimentados con las dietas
prebitica al 1,2% y simbiticas al 1,2 y 5% los mayores porcentajes (197,67, 196,74 y 206,78
mg, respectivamente) entre los grupos problema. El contenido en Mg del fmur de los grupos
problema no fue superior al del grupo control (1,82 mg) en ningn caso y adems en los
grupos alimentados con las dietas prebiticas fue significativamente (p<0,05) inferior (1,63,
1,62 y 1,6 mg, respectivamente). Sin embargo, el contenido en P se mostr significativamente
(p<0,05) superior en los grupos alimentados con las dietas prebiticas y las dietas simbiticas
al 1,2 y 10% (de 106,05 con la dieta prebitica al 5% a 108,74 mg con la dieta prebitica al
1,2%) respecto al del grupo control (103,56 mg). El contenido en Fe nicamente fue
significativamente (p<0,05) superior al grupo control (5,71 mg) en el grupo alimentado con la
dieta simbitica al 5% (7,70 mg).

201
 Podemos concluir que ninguno de los grupos problema mostr un fmur ms pesado
que el del grupo control, debido probablemente a que su desarrollo estuvo ms relacionado con
el peso del animal. Sin embargo, la deposicin de Ca fue significativamente (p<0,05) mayor en
todos los grupos problema y la de P en los alimentados con las dietas prebiticas y las dietas
simbiticas al 1,2 y 10%, mientras que con el Mg y Fe no se observ ningn efecto positivo.
Respecto a la relacin dosis-efecto, en ningn mineral se observ un efecto de mayor depsito
en el fmur debido a un aumento de la concentracin de prebiticos en la dieta. Tampoco se
observ un efecto sinrgico cuando las bifidobacterias y el 4-GOS se administraron de forma
conjunta (dietas simbiticas).

Tabla 50. Mineralizacin del fmur (mg mineral/ g de hueso en peso seco) en ratas
Peso seco Cenizas Contenido Contenido Contenido Contenido
Dietas
(mg) (%) Ca Mg P Fe
AO4 453,205,59 56,770,44 229,593,59 3,370,12 105,850,57 7,230,89
Control 349,6010,76 57,240,10 156,030,42 1,820,05 103,560,00 5,710,80
Probitica 275,314,40*/b 54,630,70*/ab 181,580,83*/b 1,720,08a 105,310,38bc 5,060,35b
Prebitica 1,2% 282,254,49*/b 57,010,78a 197,673,46*/a 1,630,00*/a 108,740,00*/a 5,790,13b
Prebitica 5% 304,132,75*/a 55,810,41ab 182,331,18*/b 1,620,08*/a 106,050,85*/abc 5,720,44b
Prebitica 10% 289,008,74*/ab 55,560,45ab 168,833,02*/c 1,600,02*/a 108,170,69*/ab 5,770,38b
Simbitica 1,2% 197,527,09*/c 53,890,64*/b 196,743,71*/a 1,730,02a 107,270,41*/ab 6,250,06ab
Simbitica 5% 267,432,74*/b 54,510,76*/ab 206,780,41*/a 1,710,02a 104,200,88c 7,700,52*/a
Simbitica 10% 287,104,54*/ab 53,370,08*/b 181,072,75*/b 1,630,01*/a 108,490,42*/a 6,300,21ab
Cada valor es la mediaerror tpico, n=6
*
La presencia de asteriscos dentro de la misma columna indica diferencias significativas (p<0,05) de los grupos con dietas probitica,
prebitica y simbitica respecto al grupo control, realizada mediante un test de separacin de medias bilateral
a-c
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma columna indican diferencias significat ivas (p<0,05) entre los
grupos con dietas probitica, prebitica y simbitica

En la Tabla 51 se muestra el peso, contenido en cenizas y en minerales (Ca, Mg, P y

Fe), expresado en mg de mineral/g de hueso en peso seco, de la tibia de las ratas empleadas
en el estudio de balance mineral. Todos los grupos problema presentaron una tibia
significativamente (p<0,05) menos pesada (de 171,53 mg con la dieta simbitica al 1,2% a
241,03 mg con la dieta prebitica al 1,2%) que la del grupo control (285,72 mg) al igual que
ocurriera con el fmur, siendo el grupo alimentado con la dieta simbitica al 1,2% el que
mostr el hueso ms ligero. Como sucedi con el fmur, ningn grupo mostr un porcentaje de
contenido en cenizas significativamente (p<0,05) mayor que el del grupo control (58,68%). El
contenido en Ca de todos los grupos problema fue significativamente (p<0,05) superior al del
grupo control (144,70 mg) oscilando los valores en los grupos problema desde 171,93 a 188,21
mg, no existiendo efecto debido a la concentracin de 4-GOS ni a la accin combinada de
bifidobacterias y 4-GOS. El contenido en Mg de la tibia en todos los grupos problema no mostr
diferencias significativas (p<0,05) con el grupo control (2,44 mg). Sin embargo, el contenido en
P fue significativamente (p<0,05) superior en los grupos alimentados con las dietas prebiticas
y simbiticas respecto al grupo control (98,60 mg), no existiendo estas diferencias en el grupo
probitico y en el control. El contenido en Fe fue superior significativamente (p<0,05) al del

202
grupo control (7,06 mg) en el grupo alimentado con las dietas prebitica al 5% y simbiticas al
1,2 y 10% (9,67, 9,50 y 9,81 mg, respectivamente).
Podemos concluir que al igual que con el fmur, ninguno de los grupos problema
mostr una tibia ms grande que la del grupo control, debido probablemente a que ste grupo
tuvo un peso corporal significativamente (p<0,05) mayor que los grupos problema. Aunque
tampoco se observ ningn efecto positivo sobre el contenido de Mg en la tibia, la
incorporacin de 4-GOS tuvo un efecto claro de mayor deposicin de Ca y P en la tibia de los
grupos enriquecidos con este ingrediente, no existiendo relacin entre la concentracin de 4-
GOS empleada en las dietas y el depsito de estos minerales en el hueso.

Tabla 51. Mineralizacin de la tibia (mg mineral/ g de hueso en peso seco) en ratas
Peso seco Cenizas Contenido Contenido Contenido Contenido
Dietas
(mg) (%) Ca Mg P Fe
AO4 382,1710,87 57,430,10 223,605,47 2,990,22 108,331,95 7,680,22
Control 285,725,81 58,680,10 144,704,74 2,440,15 98,603,55 7,060,99
Probitica 210,087,42*/a 57,020,22a 171,932,12*/b 2,580,08a 104,600,83a 6,660,35c
Prebitica 1,2% 241,035,92*/a 57,120,04a 187,582,09*/a 2,760,07a 107,690,47*/a 7,640,71bc
Prebitica 5% 238,785,45*/a 57,840,17a 180,643,90*/ab 2,620,13a 105,920,92*/a 9,670,19*/ab
Prebitica 10% 231,156,15*/a 56,440,58a 188,211,73*/a 2,440,08a 106,960,86*/a 8,600,45abc
Simbitica 1,2% 171,533,23*/b 54,871,05*/a 180,340,81*/ab 2,710,04a 106,180,83*/a 9,500,10*/ab
Simbitica 5% 221,831,42*/a 54,651,18*/a 185,232,42*/a 2,650,18a 107,331,00*/a 9,220,49ab
Simbitica 10% 234,433,13*/a 55,491,89a 179,920,28*/ab 2,750,24a 105,760,69*/a 9,810,39*/a
Cada valor es la mediaerror tpico, n=6
*
La presencia de asteriscos dentro de la misma columna indica diferencias significativas (p<0,05) de los grupos con dietas probitica,
prebitica y simbitica respecto al grupo control, realizada mediante un test de separacin de medias bilateral
a-c
Letras distintas como superndice de los valores medios dentro de la misma columna indican diferencias significativas (p<0,05) entre
los grupos con dietas probitica, prebitica y simbitica

Chonan y col. (1995) observaron que en ratas alimentadas con una dieta con 4-GOS al
5% el contenido de Ca en el fmur aument significativamente (p<0,05), pero que ni el peso
seco ni en cenizas del fmur se modificaron respecto al grupo control, y por el contrario en la
tibia aument significativamente el contenido en cenizas pero no se modificaron ni el peso seco
ni el contenido en Ca de la tibia. En nuestro estudio tampoco se ha encontrado un aumento
significativo (p<0,05) en el peso seco ni en cenizas del fmur y la tibia, pero en ambos huesos
el contenido en Ca fue significativamente (p<0,05) superior en todos los grupos problema.
Junto al contenido de OND de la dieta, estos efectos son dependientes del contenido en Ca de
las dietas administradas a los animales de experimentacin. As, mientras un contenido de Ca
de 2.150 mg Ca/100 g en la dieta incrementa significativamente el peso en cenizas del fmur y
el contenido en Ca del fmur y la tibia, un contenido de Ca sensiblemente ms bajo (215 mg
Ca/100 g) no afecta a los parmetros de mineralizacin sea (Chonan y Watanuki, 1996). Las
dietas empleadas en el presente trabajo contienen una cantidad intermedia de Ca (572 mg de
Ca/100 g) de las empleadas por Chonan y Watanuki, aunque en la misma cantidad para los
grupos problema y control, por lo que la diferencia apreciada en el depsito de Ca en huesos no
fue debida a este factor sino al hecho diferenciador entre las dietas: la adicin de
bifidobacterias y 4-GOS.

203
4.7. Relacin entre las variables morfolgicas y pH del contenido del intestino
grueso, la biodisponibilidad mineral y la mineralizacin sea

4.7.1. Efecto del peso inicial de las ratas en los pesos de los rganos diana (ciego,
colon, fmur y tibia)

Al igual que fue realizado el estudio del efecto de diferentes pesos iniciales en la
variabilidad de los parmetros de eficiencia alimentaria debida a los diferentes tipos de dietas
empleados, se ha realizado este segundo estudio para comprobar el efecto que tuvo la dieta
sobre las siguientes variables: peso de la pared del ciego, peso de la pared del colon, peso seco
del fmur y peso seco de la tibia, pero controlando el influjo que el peso inicial (covariable) tuvo
sobre estas seis variables. De esta manera podemos eliminar del estudio el efecto que pudieran
tener diferentes pesos iniciales en la valoracin del efecto de las dietas sobre los pesos de los
rganos diana objeto de este estudio (ciego, colon, fmur y tibia).
En la Tabla 52 puede observarse como la dieta fue un factor de variacin en los pesos
de las variables estudiadas y que en tres de ellas (peso de la pared del ciego, peso de la pared
del colon y peso seco de la tibia) el peso inicial de las ratas no fue determinante en la existencia
de diferencias significativas debidas al tipo de alimentacin. Slo en el caso del peso del fmur
no podemos afirmar que la obtencin de diferentes pesos de este hueso entre los distintos
grupos no sea debido a la diferencia de pesos de las ratas con las que se inici el estudio.

Tabla 52. Estudio del efecto del peso inicial de los animales en la variacin de los
pesos de los rganos diana
Variable Dieta Covariable: Peso inicial
Peso de la pared del ciego *** NS
Peso de la pared del colon *** NS
Peso seco del fmur *** **
Peso seco de la tibia *** NS
Diferencias significativas para: **p<0,01; ***p<0,001; NS=no significacin

4.7.2. Estudio de correlacin entre los diferentes parmetros morfolgicos y pH del

intestino grueso, la biodisponibilidad mineral y la mineralizacin sea

En la Tabla 53 se muestran los ndices de correlacin entre los valores de pH de los

contenidos del ciego y colon, y los parmetros histolgicos de sus mucosas. As, el pH del
contenido del ciego no se correlacion con la altura de las criptas ni con la densidad celular de
las criptas de la mucosa del ciego, mientras que el pH del contenido del colon lo hace
negativamente con la altura de las criptas y densidad celular del colon proximal (r=-0,773 y -
0,489, respectivamente) y con la densidad celular de las criptas del colon distal (r=-0,644). Por
tanto, es en la mucosa del colon donde se observa un efecto de estimulacin de la proliferacin
celular debido a un menor pH del contenido del colon generado por la fermentacin a este nivel

204
del 4-GOS administrado en la dieta. A diferencia de lo descrito anteriormente, otros autores
han encontrado en el ciego una correlacin negativa entre el pH y la altura de las criptas
(Tashiro y col., 1997), estando el pH menos correlacionado con la proliferacin celular en las
partes ms distales del intestino grueso (Edwards y col., 1992), debido a que las fuentes de
OND empleadas por estos autores fueron fermentadas fundamentalmente en ciego. No
obstante, en nuestro estudio la fermentacin de los OND incorporados en la dieta, bien por la
flora cecal o colnica o por la aportada en la propia dieta (dietas simbiticas), tuvo lugar tanto
en el ciego como en el colon, como as lo indican los bajos valores de pH descritos en los
contenidos del ciego y colon (Tablas 46 y 47) y la alta correlacin encontrada entre las variables
pH del contenido del ciego y colon (r=0,87).

Tabla 53. Indices de correlacin entre el pH del contenido del ciego y colon con los parmetros histolgicos
en la mucosa del ciego y colon
Altura criptas Densidad celular
pH colon
ciego ciego

I. correlacin 0,870
pH ciego NS NS
Significacin 0,000
Altura criptas Densidad celular Altura criptas Densidad celular
colon proximal colon proximal colon distal colon distal
I. correlacin -0,773 -0,489 -0,644
pH colon NS
Significacin 0,000 0,015 0,001

NS=no significacin para p<0,05, I. correlacin: ndice de correlacin

En la Tabla 54 se muestran los ndices de correlacin entre la AA mineral y los

parmetros medidos en el ciego y colon. La AA del Ca estuvo correlacionada negativamente con
el pH del contenido del colon (r=-0,502) y positivamente con la altura de las criptas y la
densidad celular en el colon proximal (r=0,418 y 0,556, respectivamente) y colon distal
(r=0,870 y 0,581, respectivamente). La AA del Mg se correlacion negativamente con el pH del
contenido del ciego (r=-0,785) y colon (r =-0,728), pero positivamente con la altura de las
criptas del colon proximal y distal (r=0,639 y r=0,590, respectivamente) y con la densidad
celular del colon distal (r=0,658). La AA de P se correlacion positivamente con la densidad
celular del ciego (r=0,601), la altura de las criptas del colon distal (r=0,581) y la densidad
celular del colon proximal (r=0,423). La AA del Fe se correlacion negativamente con el pH del
contenido del ciego y la altura de las criptas del ciego (r=-0,671 y 0,554, respectivamente). La
absorcin de este mineral tambin se correlacion negativamente con el pH del contenido del
colon y positivamente con la altura de las criptas del colon proximal (r=-0,666 y r=0,730,
respectivamente).

205
 Tabla 54. Coeficientes de correlacin entre la absorcin aparente mineral y los parmetros
medidos en el intestino grueso
Calcio Magnesio Fsforo Hierro
I. correlacin -0,785 -0,671
pH ciego NS NS 0,000
Significacin 0,000
I. correlacin -0,502 -0,728 NS -0,666
pH colon 0,000
Significacin 0,012 0,000
Altura criptas I. correlacin NS -0,554
NS NS
ciego Significacin 0,005
Altura criptas I. correlacin 0,418 0,639 NS 0,730
colon proximal Significacin 0,042 0,001 0,000
Altura criptas I. correlacin 0,870 0,590 0,581 NS
colon distal Significacin 0,000 0,002 0,003
Densidad celular I. correlacin 0,601 NS
NS NS
ciego Significacin 0,002
Densidad celular I. correlacin 0,556 0,423 NS
NS 0,040
colon proximal Significacin 0,005
Densidad celular I. correlacin 0,581 0,658 -0,503 NS
colon distal Significacin 0,003 0,000 0,012
NS=no significacin para p<0,05, I. correlacin: ndice de correlacin

En la Tabla 55 se muestran los ndices de correlacin entre la retencin mineral y los

parmetros medidos en el ciego y colon. La retencin del Ca se correlacion negativamente con
el pH del contenido del colon (r=-0,463) y positivamente con la altura de las criptas y la
densidad celular del colon distal (r=0,868 y 0,562, respectivamente) y con la densidad celular
del colon proximal (r=0,576). Sin embargo la retencin del Mg y P nicamente se
correlacionaron de forma positiva con la densidad celular del ciego (r=0,564 y 0,605,
respectivamente). La retencin del Fe se correlacion negativamente con el pH del contenido
del ciego y con la altura de las criptas del ciego (r=-0,658 y -0,537), y tambin tuvo una
correlacin negativa con el pH del contenido del colon (r=-0,643), pero positiva con la altura de
las criptas del colon proximal (r=0,714).

Tabla 55. Coeficientes de correlacin entre la retencin mineral y los parmetros medidos
en el intestino grueso
Calcio Magnesio Fsforo Hierro
I. correlacin NS -0,658
pH ciego NS NS
Significacin 0,000
I. correlacin -0,463 NS -0,643
pH colon NS 0,001
Significacin 0,023
Altura criptas I. correlacin NS -0,537
NS NS 0,007
ciego Significacin
Altura criptas I. correlacin NS 0,714
NS NS
colon proximal Significacin 0,000
Altura criptas I. correlacin 0,868 NS NS
NS
colon distal Significacin 0,000
Densidad celular I. correlacin 0,564 0,605 NS
NS
ciego Significacin 0,020 0,002
Densidad celular I. correlacin 0,576 NS NS
NS
colon proximal Significacin 0,003
Densidad celular I. correlacin 0,562 NS NS
NS
colon distal Significacin 0,003
NS=no significacin para p<0,05, I. correlacin: ndice de correlacin

206
 La Tabla 56 muestra los coeficientes de correlacin entre el contenido mineral del
fmur y los parmetros estudiados en el intestino grueso, la absorcin y retencin mineral. Los
contenidos de Ca y Fe mostraron ndices de correlacin negativos con los valores de pH de los
contenidos de ciego y colon, destacando de entre ellos el presentado entre el depsito de Fe y
los bajos valores de pH del contenido del ciego (r=-0,806). Del resto de coeficientes para
ambos minerales destacaremos los mostrados con la densidad celular en el colon distal, siendo
de 0,70 para el Fe y de 0,58 para el Ca. Finalmente researemos que el contenido de Mg y P en
el fmur mostr en algunos casos bajos coeficientes de correlacin con las variables estudiadas
en el intestino grueso, y en otros, stos no fueron significativos, siendo el P el nico de los
cuatro minerales que present una correlacin significativa con la retencin mineral (r=0,521).

Tabla 56. Estudio de correlacin establecido entre el contenido mineral del fmur y los
balances minerales y parmetros medidos en el intestino grueso
Calcio Magnesio Fsforo Hierro
I. correlacin -0,556 NS -0,806
pH ciego NS
Significacin 0,005 0,000
I. correlacin -0,694 NS -0,627
pH colon NS
Significacin 0,000 0,001
Altura criptas I. correlacin NS
NS NS NS
ciego Significacin
Altura criptas I. correlacin 0,547 0,602
NS NS
colon proximal Significacin 0,006 0,002
Altura criptas I. correlacin 0,514 0,456
NS NS
colon distal Significacin 0,010 0,025
Densidad celular I. correlacin 0,437
NS NS NS
ciego Significacin 0,033
Densidad celular I. correlacin NS
NS NS NS
colon proximal Significacin
Densidad celular I. correlacin 0,581 NS 0,700
NS
colon distal Significacin 0,003 0,000
Absorcin I. correlacin NS
NS NS NS
Aparente Significacin
I. correlacin 0,521
Retencin NS NS NS
Significacin 0,009
NS=no significacin para p<0,05, I. correlacin: ndice de correlacin

La Tabla 57 muestra los coeficientes de correlacin entre el contenido mineral de la

tibia y los parmetros estudiados en el intestino grueso, la absorcin y retencin mineral. A
diferencia de lo descrito en el fmur, se observa que todos los minerales tuvieron una
correlacin negativa con el pH del contenido del ciego y colon (de r=-0,472 del Ca con el pH del
contenido del ciego a r=-0,874 del Fe con el pH del contenido del ciego) siendo destacable, al
igual que ocurri en el fmur, la correlacin entre el depsito de Fe y los bajos valores de pH en
los contenidos de ciego y colon. El Ca mostr una correlacin positiva con los parmetros
morfolgicos del colon proximal y distal, siendo sta ms elevada con altura de las criptas
(r=0,806 y 0,876, respectivamente) y con la AA (r=0,795) y retencin de Ca (r=0,768), y ms
moderada con la densidad celular (r=0,406 y 0,435, respectivamente). Para el contenido en Mg

207
de la tibia, la correlacin fue positiva con la altura de las criptas del colon proximal (r=0,430) y
con la densidad celular del colon distal (r=0,733). El P se correlacion de forma positiva con la
altura de las criptas y con la densidad celular del colon proximal (r=0,787 y 0,425,
respectivamente) y distal (r=0,868 y 0,460, respectivamente). Finalmente, en el contenido en
Fe existi una correlacin positiva con la altura de las criptas del colon proximal (r=0,735) y con
la densidad celular del colon distal (r=0,643). Tambin se correlacion positivamente con la AA
(r=0,728) y retencin de Fe (r=0,714).
De todos los parmetros correlacionados con el depsito mineral en fmur y tibia son la
AA y retencin mineral los que influyen de una manera directa en la fijacin mineral por el
hueso, ya que cuanto mayor sea la cantidad de mineral absorbida en intestino y retenida por el
organismo, mayor puede ser su depsito en el hueso. En este sentido se debe destacar los
coeficientes de correlacin encontrados en la tibia para el Ca y Fe, que indican que altos valores
en su AA y retencin tienen un reflejo positivo en el depsito de Ca y Fe en la tibia, es decir que
las dietas a la que se adicion 4-GOS aumentaron la cantidad de mineral (Ca y Fe) en huesos
debido a sus altos valores de AA y retencin, frente a las dietas control y con prebiticos cuyos
valores de balance y depsito mineral fueron inferiores (Tabla 42, 45 y 51).

Tabla 57. Estudio de correlacin establecido entre el contenido mineral de la tibia y los
balances minerales y parmetros medidos en el intestino grueso
Calcio Magnesio Fsforo Hierro
I. correlacin -0,472 -0,537 -0,476 -0,874
pH ciego
Significacin 0,020 0,007 0,019 0,000
I. correlacin -0,734 -0,574 -0,745 -0,839
pH colon
Significacin 0,000 0,003 0,000 0,001
Altura criptas I. correlacin
NS NS NS NS
ciego Significacin
Altura criptas I. correlacin 0,806 0,430 0,787 0,735
colon proximal Significacin 0,000 0,036 0,000 0,000
Altura criptas I. correlacin 0,876 0,868
NS NS
colon distal Significacin 0,000 0,000
Densidad celular I. correlacin
NS NS NS NS
ciego Significacin
Densidad celular I. correlacin 0,406 0,425
NS NS
colon proximal Significacin 0,049 0,038
Densidad celular I. correlacin 0,435 0,733 0,460 0,643
colon distal Significacin 0,033 0,000 0,024 0,001
Absorcin I. correlacin 0,795 0,728
NS NS
Aparente Significacin 0,000 0,000
I. correlacin 0,768 0,714
Retencin NS NS
Significacin 0,000 0,000

NS=no significacin para p<0,05, I. correlacin: ndice de correlacin

208
4.7.3. Estudio de regresin entre la absorcin mineral, los parmetros morfolgicos
y el pH del contenido del intestino grueso

El estudio de correlacin realizado para la absorcin mineral y mostrado en la tabla 54

ha revelado la relacin significativa entre este parmetro y la modificacin del pH y morfologa
del intestino como consecuencia de las diferentes dietas administradas. Basndonos en estas
evidencias de relacin ha sido realizado el siguiente estudio de regresin lineal mediante la
tcnica de pasos sucesivos, con el fin de obtener ecuaciones de regresin lineal para la
absorcin de Ca, Mg y Fe con las que predecir sus porcentajes de absorcin en intestino grueso
a partir de las variables estudiadas (pH, altura de las criptas y densidad celular de las mismas
en ciego y colon). Para el P no fue posible obtener un modelo de regresin lineal con el que
predecir el comportamiento de su absorcin intestinal.
En la Figura 23 podemos observar la relacin lineal existente entre la absorcin de Ca
y la altura de las criptas de colon distal (% Absorcin Ca = -43,86 + 0,32 x altura cripta colon
distal, R2=0,76). Dicha relacin es lineal creciente, por lo que en aquellos grupos en los que se
describi criptas de mayor altura en la porcin distal del colon se obtuvieron mayores
porcentajes de absorcin de Ca (grupos alimentados con las tres dietas prebiticas y las
simbiticas al 5 y 10%).

A
AA
AA
84
A A
AA

78 AA
% absorcin de Ca

72
A

66
A
AA

60
A

% Absorcin Ca = -43,86 + 0,32 * altura cripta

54 2
R = 0,76 colon distal

325 350 375 400

altura cripta colon distal ( m)

Figura 23. Representacin grfica de la relacin lineal entre la

absorcin de Ca y la altura de las criptas del colon distal

209
 En el estudio de regresin realizado para predecir la absorcin de Mg mediante la
tcnica de pasos sucesivos se obtuvieron cuatro modelos, que a diferencia del Ca no fueron
modelos de regresin lineal simple sino mltiple. La Figura 24 muestra un primer modelo cuya
configuracin espacial representa la correspondencia entre el aumento de las criptas en la
porcin proximal del colon y la densidad celular en las criptas del colon distal con los mayores
porcentajes de absorcin de Mg (% abs. Mg = 28,10 + 0,06 x altura cripta colon proximal +
1,14 x densidad cl. colon distal, R2=0,67).

A A
A A A
A

A
A

% abs. Mg = 28,10 + 0,06 * altura cripta colon proximal + 1,14 * densidad cl. colon distal
R2 = 0,67

Figura 24. Representacin grfica tridimensional de la relacin entre la absorcin de Mg, la

densidad celular del colon distal y la altura de las criptas del colon proximal

En el segundo modelo predictivo (Figura 25) la absorcin de este mineral se determina

a partir de la densidad celular del colon distal y pH del contenido del ciego (% abs. Mg =
166,54 + 0,38 x densidad cl. colon distal 17,23 x pH ciego, R2=0,63). El tercer modelo
(Figura 26) tiene en cuenta el pH del contenido del ciego y del colon (% abs. Mg = 203,94

210
5,94 x pH colon 16,23 x pH ciego, R2 =0,63). Por ltimo, el cuarto modelo representa la
conjuncin de las variables independientes de los modelos anteriores (pH del contenido del
ciego, altura de las criptas de colon proximal y densidad celular del colon distal) en el que el
porcentaje de absorcin de Mg vendr determinado por la suma de los efectos producidos por
las tres variables citadas (% abs. Mg = 88,67 + 0,74 x densidad cl. colon distal + 0,045 x
altura cripta colon proximal 7,91 x pH ciego, R2=0,70).

A
A
AA
AA

AA
A A

% abs. Mg = 166,54 + 0,38 densidad cel. colon distal - 17,23 pH ciego

R2 = 0,63

Figura 25. Representacin grfica tridimensional de la relacin entre la absorcin de

Mg, la densidad celular del colon distal y el pH del contenido del ciego

211
 A
A
A
A
A
A
AA A
A
A A AA
A A
A
A
A
A

% absorcin Mg = 203,94 - 5,94 pH colon - 16,23 pH ciego

R2 = 0,63

Figura 26. Representacin grfica tridimensional de la relacin entre la absorcin

de Mg, el pH del contenido del ciego y del colon

De los estudios de regresin realizados para la absorcin de Ca y Mg se desprende que

para el primero la absorcin se realiza fundamentalmente en el colon, posiblemente debido al
hecho de que los grupos con mayor altura de criptas y similar nmero de clulas en las mismas
presenten clulas de mayor tamao, y por lo tanto con mayor superficie de captacin del
catin. En este sentido Delzenne y col. (1995) han propuesto el incremento de la superficie de
absorcin en el intestino grueso como un mecanismo que explique una mayor retencin de Ca y
Mg. De igual manera se ha descrito en colonocitos aislados de rata (Diener y col., 1993) y
humanos (Rowe y col., 1993) que la exposicin de los mismos a los AGCC produce un descenso
del pH intracelular. Para la recuperacin del pH las clulas disponen de una serie de
mecanismos entre los que podran estar implicados el intercambio de Na + /H+ y el cotransporte
H+ /AGCC. Este intercambio de iones causa un incremento del volumen celular y del contenido
de Na + intracelular.

212
 La absorcin de Mg por el contrario no solo ocurre en el colon sino tambin en el ciego,
como ha sido descrito por los modelos de regresin lineal. Bajos valores de pH en el contenido
del ciego fomentan la aparicin de formas solubles de este mineral facilitando su paso a travs
de la pared del ciego (Scharrer y Lutz, 1992; Baba y col., 1996). Sin embargo, el pH del
contenido del colon tuvo un efecto pequeo o solapado a las variables morfolgicas de este
segmento del intestino, ya que su incorporacin a la ecuacin de regresin (cuarto modelo) no
increment el coeficiente de correlacin de la misma (0,70) a pesar de ser su efecto
estadsticamente significativo (p<0,001). Respecto al efecto de las criptas de colon, es de
destacar que la absorcin de Mg se increment a medida que fue mayor la densidad celular en
el colon distal y la altura de las criptas del colon proximal.
Las ecuaciones de regresin para Ca y Mg indican que las variables que explican la
absorcin de uno u otro mineral son diferentes, fenmeno que puede ser debido a la
competencia descrita entre el Ca y Mg por los lugares de absorcin en el intestino grueso (Ohta
y col., 1994a). Diferentes estudios han demostrado que el ciego y colon tienen capacidad para
absorber Ca y Mg, sin embargo el segmento del intestino donde tiene lugar dicha absorcin
vara en funcin del mineral y de la fuente de fibra fermentable que promueva la absorcin
(Demign y col., 1989; Levrat y col., 1991; Younes y col., 1993; Ohta y col., 1995a). Chonan y
Takahashi (1999) han descrito que el efecto de los GOS en la absorcin de Ca ocurre
principalmente en ciego debido a un efecto trfico sobre la mucosa del mismo, mientras que
para el Mg el incremento de absorcin debida a una alimentacin rica en GOS se debe a una
contribucin de diferentes partes del intestino (ciego, colon y recto). Sin embargo, Delzenne y
col. (1995) utilizando FOS como fuente de hidratos de carbono no digeribles, encontraron que
la absorcin de Mg ocurre principalmente en el colon, y por el contrario la de Ca fue en ciego
debido a un efecto estimulante de la mucosa cecal. En nuestro estudio como ha sido descrito
no se ha encontrado ninguna relacin positiva entre al absorcin de Ca y las variables
morfolgicas de ciego. Por el contrario en el colon proximal y distal fueron descritas diferencias
en la altura de las criptas y densidad celular entre los diferentes grupos, siendo por lo tanto una
explicacin posible del incremento de la absorcin de Ca y Mg debidas al aumento de la
superficie de absorcin. A su vez el descenso del pH del contenido del ciego motivado por la
fermentacin microbiana de los GOS puede generar formas solubles de Mg en las que sea ms
fcil su absorcin.

Finalmente, la Figura 27 representa tridimensionalmente la tendencia mostrada por la

variable porcentaje de absorcin de Fe, que al igual que ha sido descrito para la absorcin de
Mg, el incremento en su absorcin estuvo determinada por los bajos valores de pH en el
contenido del ciego y los mayores de la altura de las criptas en el colon proximal. El efecto de
los hidratos de carbono fermentables sobre la biodisponibilidad mineral del Fe est poco
documentada. Kim y Atallah (1993) han propuesto un mecanismo de absorcin a travs de
complejos solubles con grupos carboxlicos derivados de la fermentacin cuando se utiliza la

213
pectina como fuente de hidratos de carbono fermentable. Estos complejos solubles Fe-grupos
carboxlicos ven facilitado su paso a travs de la membrana celular.

AA
A

A A

A
A

% abs. Fe = 47,43 + 0,09 altura cripta colon proximal -10,42 pH colon

R2 = 0,56

Figura 27. Representacin grfica tridimensional de la relacin entre la absorcin de

Fe, el pH del contenido del colon y la altura de las criptas del colon proximal

4.7.4. Anlisis factorial

De los estudios de correlacin descritos anteriormente y mostrados en las Tablas 54-57

hemos obtenido conclusiones parciales acerca de cmo estn relacionadas dos a dos cada par
de variables enfrentadas. Con el anlisis factorial intentamos identificar aquellas variables
subyacentes o factores que explican la configuracin de las correlaciones dentro del conjunto
de variables estudiadas, es decir una reduccin de los datos de un gran nmero de variables

214
para identificar un pequeo nmero de factores (en nuestro estudio dos, Componente 1 y 2)
que expliquen la mayora de la varianza observada (expresada como varianza total explicada).
Como mtodo de extraccin factorial fue empleado el anlisis de componentes principales
(ACP) con el que podremos obtener combinaciones lineales entre las variables y generar
hiptesis relacionadas con los mecanismos causales. Este estudio fue realizado de forma
separada para los cuatro minerales (Figuras 28-31) con el fin de identificar las relaciones de los
contenidos minerales del fmur y la tibia con las variables morfolgicas del intestino grueso, el
pH del contenido del ciego y del colon. Del estudio se eliminaron aquellas variables que a priori
no iban a influir en el anlisis factorial debido a que no mostraron variacin entre los grupos.
De esta forma la altura de las criptas y la densidad celular en ciego fueron eliminadas del
estudio.
La Figura 28 representa el ACP realizado para el Ca, cuya varianza total explicada fue
de 79,75%, lo que significa que este modelo representa casi el 80% de la variabilidad de los
datos obtenidos para los parmetros analizados. El Componente 1 (eje horizontal) representa la
relacin inversa entre los valores del pH del contenido del ciego y del colon y el resto de
variables analizadas. Como muestran las tablas de correlacin parcial (Tablas 54, 56 y 57), esta
relacin inversa es mayor para el pH del contenido del colon y el contenido en Ca en tibia (r=-
0,73), pH del contenido del colon y contenido en Ca en fmur (r=-0,69), y el pH del contenido
del colon y la absorcin intestinal de Ca (r=-0,5). En el Componente 2 (eje vertical) se ha
evaluado la asociacin entre las variables por su proximidad en el plano. En primer lugar y
como se representa en las cuatro figuras de componentes principales, el pH del contenido del
ciego y colon aparecen prximos en el plano indicando que bajos valores en un segmento del
intestino se corresponden igualmente con bajos valores en el otro (r=0,87 en Tabla 53), o lo
que es lo mismo que los GOS son fermentados igualmente en ciego y colon ocasionando un
descenso paralelo del pH del contenido en ambos segmentos del intestino grueso. El
Componente 2 representa tambin la relacin lineal entre la absorcin y retencin de Ca con la
altura de las criptas del colon distal (Figura 28) y entre la absorcin intestinal de Ca y el
depsito de Ca en la tibia. Finalmente este tipo de anlisis permite descubrir la relacin entre
variables cuando no existe una relacin lineal directa entre ellas, como por ejemplo entre el
depsito mineral en fmur y tibia y los parmetros morfolgicos del intestino grueso. De esta
manera podemos establecer que aquellos grupos en los que se encontraron mayores niveles de
Ca en fmur se correspondieron con los que mostraron una mayor densidad celular en el colon
distal y altura de las criptas en el colon proximal. Por ltimo tambin se puede establecer una
relacin entre el contenido de Ca en la tibia y la mayor altura de las criptas en el colon distal
(r=0,88, Tabla 57).

215
 1

densidad celular
pH ciego colon proximal

altura cripta
0,5 pH colon colon distal
retencin Ca
absorcin Ca
Componente 2

Ca tibia
0
densidad celular
colon distal

Ca fmur

-0,5 altura cripta

colon proximal

-1

-1 -0,5 0 0,5 1

Componente 1
Figura 28. Anlisis de componentes principales (ACP) para el calcio

El ACP realizado para representar la relacin del contenido de Mg del fmur y la tibia con
los parmetros del intestino grueso (Figura 29) mostr una varianza total explicada del
71,17%. Al igual que fue descrito para el modelo obtenido en el Ca, el Componente 1 (eje
horizontal) represent la relacin inversa entre el pH del contenido del ciego y del colon y la
absorcin de Mg. Por otra parte, del estudio de esta figura se desprenden los tres puntos
siguientes: a) la existencia de una gran distancia relativa entre las variables absorcin y
retencin de Mg, debida a una gran eliminacin de Mg por orina, fundamentalmente en los
grupos alimentados con las dietas simbitica al 1,2 y 5% (Tabla 43); b) la relacin del
contenido de Mg en la tibia con la altura de las criptas del colon proximal (como fue descrito
para el Ca) y la densidad celular en el colon distal; y c) la ausencia de relacin del contenido de
Mg en el fmur con todas las variables estudiadas, tal como muestra la Tabla 56 de
correlaciones parciales. Finalmente, podemos observar grficamente por la dispersin de las
variables en el plano los cuatro modelos de regresin lineal establecido para este mineral.

216
 1
densidad celular
colon proximal
altura cripta
colon distal
pH ciego
retencin Mg
0,5
pH colon
Componente 2

absorcin Mg
0
altura cripta colon proximal

densidad celular colon distal

Mg tibia

-0,5
Mg fmur

-1
-1 -0,5 0 0,5 1

Componente 1
Figura 29. Anlisis de componentes principales (ACP) para el magnesio

La Figura 30 representa el ACP realizado para observar grficamente la relacin entre

el balance de P y su fijacin en la tibia y fmur con las variables medidas en el ciego y colon,
mostrando una varianza total explicada del 74,01%. A diferencia de los dos estudios anteriores
la distribucin de las variables en el plano present mayor dispersin, por lo que la
interpretacin del grfico por medio de distancias o disimilaridades no resulta tan sencilla. No
obstante, se puede apreciar nuevamente la relacin de proximidad entre ambos parmetros de
pH, y entre la absorcin y retencin de P (indicando que la excrecin renal de P fue poco
importante). Como muestran las tablas de correlacin (Tablas 56 y 57), el contenido de P en
fmur y tibia present una relacin positiva con valores elevados de altura de las criptas de
colon proximal y distal, e inversamente proporcional a los bajos valores de pH, de forma ms
clara en el contenido del P en tibia. Estas relaciones pueden aprecindose en el grfico por su
disposicin en el plano.

217
 1
absorcin P

pH ciego retencin P
altura cripta
colon distal
densidad celular
0,5 pH colon colon proximal
Componente 2

P fmur
P tibia

0
altura cripta
colon proximal

densidad celular
colon distal
-0,5

-1
-1 -0,5 0 0,5 1

Componente 1

Figura 30. Anlisis de componentes principales (ACP) para el fsforo

El ltimo ACP (Figura 31) fue el realizado para estudiar el grado de asociacin entre
las variables contenido en Fe en fmur y tibia, la absorcin y retencin de Fe, el pH del
contenido de ciego y colon y los parmetros morfolgicos de ambas secciones del intestino
grueso. La varianza total explicada fue de 75,30%, y en el caso del Fe son vlidas igualmente
las interpretaciones dadas a los Componentes 1 y 2 que han sido explicadas en las Figuras 28 y
29 para el Ca y Mg, aprecindose nuevamente la asociacin por proximidad de ambos pH y la
relacin inversa entre la disminucin de estas dos variables con el aumento de la absorcin y
retencin de Fe. El modelo de regresin mltiple planteado para interpretar la absorcin de Fe
a partir de los valores de pH del contenido del colon y la altura de las criptas del colon proximal
puede apreciarse grficamente en la presente figura. Finalmente, los contenidos de Fe en el
fmur y tibia mostraron una elevada relacin de proximidad con los valores obtenidos para la
absorcin y retencin de Fe, por lo que podemos suponer que un incremento en la captacin
intestinal de Fe debe corresponderse con un mayor depsito de Fe en los huesos largos.
Igualmente, aunque no sea de forma directa, el contenido de Fe en la fmur y tibia se asocia
positivamente con los altos valores de densidad celular en el colon distal y de altura de las
criptas del colon proximal, y de forma inversa con bajos valores del pH del contenido del ciego
y colon.

218
 1
densidad celular
colon proximal
altura cripta colon
distal

0,5
Componente 2

pH ciego densidad celular

colon distal

0 Fe fmur absorcin Fe
pH colon
retencin Fe
altura cripta colon proximal

Fe tibia

-0,5

-1
-1 -0,5 0 0,5 1

Componente 1

Figura 31. Anlisis de componentes principales (ACP) para el hierro

Los mecanismos implicados en la absorcin mineral en intestino grueso mediados por la

presencia de OND en la dieta pueden resumirse en dos, uno debido a la formacin de
complejos solubles como consecuencia del descenso del pH luminal, y un segundo mecanismo
relacionado con el aumento de la superficie de captacin del mineral, reflejo del efecto trfico
que los OND tienen sobre la mucosa de ciego y colon. En el presente estudio la relacin entre el
descenso del pH en el lumen intestinal y el incremento de la absorcin mineral se ha mostrado
claramente para el Mg y Fe, para los cuales los grupos alimentados con las dietas prebiticas al
1,2 y 10% (4 y 6) y simbiticas (7, 8 y 9) mostraron mayores valores de absorcin. Para estos
dos minerales se obtuvieron altos ndices de correlacin entre la absorcin aparente y el pH del
contenido del ciego y colon, y en las ecuaciones de regresin el pH se mostr como una
variable predictiva de su absorcin a travs de la mucosa intestinal. De igual manera, para el Ca
se obtuvo un ndice de correlacin significativo entre el pH del contenido del colon y la
absorcin mineral, sin embargo el ndice de correlacin ms alto se obtuvo con la altura de las
criptas de colon distal, que fue la nica de las variables estudidas con la que se obtuvo una
relacin lineal creciente, y en la que los grupos prebiticos (4, 5 y 6) y simbiticos al 5 y 10%
(8 y 9) mostraron mayores valores de absorcin y altura de las criptas. A su vez la absorcin de
Mg y Fe estuvo relacionada linealmente con otros parmetros de la mucosa de colon, como la
altura de las criptas en la porcin proximal (Mg y Fe) y la densidad celular en colon distal (Mg).

219
El hecho de que ciertos minerales interaccionen entre s establecindose una competencia entre
ellos por los lugares de absorcin puede no haberse reflejado en los resultados obtenidos en
este estudio.
Es conocido que el Fe presenta una competencia con el Ca y Mn por determinados
lugares de absorcin en la mucosa intestinal (Lnnerdal, 1989; Hallber y Rossander-Hulthen,
1993), y que un incremento en el Ca y P en la dieta inhibe la absorcin de Mg (Ohta y col.,
1994a). Sin embargo para los tres minerales (Ca, Mg y Fe), se ha descrito que la incorporacin
a la dieta de 4-GOS ha mejorado la absorcin aparente en los grupos prebiticos y simbiticos
respecto al grupo control, hecho explicable si se tiene en cuenta que para los minerales entre
los que ha sido descrita tal competencia (entre Ca y Fe y entre Ca y Mg) los lugares de
absorcin han sido diferentes, para el Ca fue la porcin distal del colon y para Mg y Fe la
porcin proximal.
Para el P no fueron halladas relaciones claras entre la absorcin aparente y los dos
factores implicados en su absorcin derivados de la fermentacin intestinal de 4-GOS (pH y
aumento de la superficie de absorcin), como han mostrado los estudios de correlacin y
regresin. No obstante ha sido descrito un aumento de la absorcin de este mineral en
determinados grupos (probiticos, y prebiticos 1,2 y 10%) respecto al grupo control, lo que
nos hace pensar en la existencia de otros factores no evaluados en el presente estudio y que
favorecen la absorcin de P. En este sentido Brommage y col. (1993) han descrito un aumento
en la absorcin de Ca, Mg y Zn relacionado con la presencia de lactulosa en la dieta. Sera
presumible pensar que durante el tratamiento trmico a que se somete el preparado de leche
infantil durante su procesado industrial se haya formado cierta cantidad de dicho componente
(Sarri y col., 2001), con actividad prebitica demostrada (Sahota y col., 1982; Kawaguchi y
col., 1993) que pudiera estimular la absorcin de P.
Finalmente, las cuatro figuras del anlisis de componentes principales reflejan
grficamente los dos mecanismos por los que el 4-GOS mejora la absorcin mineral. El
Componente 1 representa el efecto del descenso del pH en la formacin de complejos solubles
de Ca, Mg y Fe y fcilmente asimilables por la mucosa. El Componente 2 resume los distintos
efectos que la modificacin de la mucosa de colon (aumento en la altura de criptas y de la
densidad celular) tienen sobre la absorcin mineral y su depsito en huesos (ms evidente en la
tibia) y que son debidos en ltima instancia a la fermentacin del 4-GOS.

220
CONCLUSIONES

Conclusiones del primer objetivo:

1.1. La fermentacin in vitro de cuatro clases de oligosacridos no digeribles por las

especies de bifidobacterias Bifidobacterium bifidum, B. breve, B. infantis y B. longum,
muestra que el galactooligosacrido 4-galactosil lactosa es el ms adecuado para el
crecimiento de dichas bacterias.
1.2. Las especies de bifidobacterias infantiles que muestran un mayor crecimiento tras siete
das de incubacin en presencia de 4-galactosil lactosa son B. breve y B. bifidum.

Conclusin del segundo objetivo:

2. Las bifidobacterias (B. bifidum y B. longum) aadidas en la frmula infantil probitica

estudiada muestran una viabilidad por encima del nivel mnimo recomendado (106
ufc/g) durante el periodo de consumo de la misma, estimado en 14 das.

Conclusin del tercer objetivo:

3. La administracin de una frmula probitica (B. bifidum y B. longum) desde el cuarto mes
y hasta el primer ao de vida eleva los niveles de bifidobacterias fecales de forma
significativa a la edad de siete y nueve meses respecto a los alimentados con una
frmula infantil control.

Conclusiones del cuarto objetivo:

4.1. Todas las dietas problema estimulan en mayor o menor medida la absorcin mineral,
siendo las dietas compuestas por las frmulas infantiles prebitica al 10% y simbitica
al 5 y 10% las que incrementan de forma ms clara la absorcin de Ca, Mg y Fe
respecto al grupo control. La absorcin de P es mayor en el grupo alimentado con la
frmula infantil prebitica al 10%.
4.2. La adicin a las dietas de cantidades crecientes de 4-GOS (1,2, 5 y 10%) no produce
un incremento proporcional de la absorcin mineral.

Conclusin del quinto objetivo:

5. La adicin a ratas de probiticos (B. bifidum y B. longum) y prebiticos (4-galactosil

lactosa) en frmulas infantiles modifica el epitelio en la porcin proximal y distal del
colon. Dicha modificacin consiste en un incremento de la altura de la criptas y del

221
 nmero de clulas que forman la misma (densidad celular). El uso de
galactooligosacridos a distintas concentraciones no se relaciona con una modificacin
en el epitelio del colon. No se observa ninguna modificacin en el epitelio del ciego
debido a la adicin de probiticos y prebiticos a las frmulas infantiles.

Conclusiones del sexto objetivo:

6.1. El descenso del pH en el contenido del ciego y colon debido a la fermentacin de 4-

galactosil lactosa presente en la dieta, se relaciona de forma clara con una mayor
absorcin de Ca, Mg y Fe.
6.2. El incremento en la absorcin mineral muestra un elevado ndice de correlacin con los
parmetros histolgicos medidos en la mucosa del intestino grueso. La absorcin de Ca
tiene lugar fundamentalmente en el colon distal, la absorcin de Fe en el colon
proximal, y la absorcin de Mg en el colon proximal y colon distal.
6.3. El empleo de probiticos y prebiticos en frmulas infantiles, incrementa el contenido
de Ca, P y Fe en el fmur y en la tibia respecto al grupo alimentado con dieta control.

Conclusin del sptimo objetivo:

7. El depsito de Ca, P y Fe en el fmur y en la tibia se relaciona con el aumento de la altura

de las criptas y del nmero de clulas epiteliales del colon, y con la disminucin del pH
en el contenido del ciego y colon. En el caso del incremento del depsito de Mg, ste
slo afecta a la tibia y se relaciona con la altura de las criptas y el incremento en el
nmero de clulas epiteliales del colon.

222
RESUMEN

Uno de los objetivos ms importantes de la alimentacin a finales del siglo XX y

comienzos del XXI es la incorporacin a nuestra dieta de alimentos e ingredientes que tengan
efecto beneficioso a largo plazo y que nos permita mantener un estado saludable de manera
prolongada. De hecho cuanto antes se incorporen en la alimentacin, mayor efecto beneficioso
tendr a largo plazo. Al amparo de esta idea se ha desarrollado el concepto de alimento y/o
ingrediente funcional. Destacan, por su efecto netamente positivo para la salud, los probiticos
y prebiticos, y como ejemplo de ambos las bacterias del gnero Bifidobacterium, y los
oligosacridos no digeribles, respectivamente. Con el objetivo de conseguir efectos beneficiosos
en la dieta a corto, medio y largo plazo, estos ingredientes han sido incorporados a las frmulas
infantiles. Aunque son evidentes los beneficios de estos ingredientes, deben ser valorados ms
profundamente de cara al aseguramiento de su calidad nutricional.
El presente trabajo ha sido dividido en tres estudios diferentes con el fin de hacer ms
clara su comprensin. En el primer estudio se evalu la fermentacin in vitro de diversos
oligosacridos por cuatro especies de bifidobacterias, mostrando que 4-galactosil lactosa (4-
GOS) estimul en mayor medida el crecimiento de las bacterias estudiadas, especialmente de B.
breve y B. bifidum. En un segundo estudio, se evalu la viabilidad de las bifidobacterias
presentes en una frmula comercial probitica (B. bifidum y B. longum) durante un mximo de
14 das, mostrando que aunque el paso del tiempo redujo significativamente (p<0,05) los
recuentos bacterianos, stos se mantuvieron siempre por encima del nivel recomendado (106
clulas/g de producto). Posteriormente se estudi el efecto de la administracin de sta frmula
probitica sobre la flora fecal infantil durante el primer ao de vida. Los resultados mostraron
que los recuentos de bifidobacterias en las heces de los nios alimentados con frmula
probitica fueron siempre superiores a los mostrados por los nios alimentados con una frmula
estndar. Sin embargo, estos recuentos no fueron significativamente (p<0,05) superiores a los
del grupo control hasta tres meses despus de estar tomando la frmula probitica
(correspondiente a las muestras analizadas a los 7 y 9 meses de edad).
Para la realizacin del tercer estudio se elaboraron un total siete dietas experimentales
(1 dieta probitica, 3 prebiticas y 3 simbiticas) y tras analizar su composicin nutricional
fueron administradas a un total de 54 ratas recin destetadas durante 30 das. El objetivo de
este tercer estudio fue el de evaluar el efecto de los probiticos (B. bifidum y B. longum) y
prebiticos (4-GOS) aportados en la dieta sobre la absorcin de los minerales mediante un
balance mineral realizado en tres periodos. En general, los grupos alimentados con las dietas
simbiticas al 5 y 10% fueron los que mostraron una mayor absorcin de Ca, Mg, y Fe, aunque
la adicin de 4-GOS al 1,2% tambin mostr una absorcin mineral superior al grupo
alimentado con la dieta control. Sin embargo, en el balance del P el grupo alimentado con la
dieta prebitica al 10% fue el que present unos mayores porcentajes de absorcin. Con el fin
de explicar los mecanismos de absorcin mineral promovidos por la accin del 4-GOS aadido a

223
la dietas, fueron determinados los parmetros de pH, peso y presencia mineral en los
contenidos del ciego y del colon, los parmetros histolgicos de altura de las criptas y densidad
celular del intestino grueso, y el contenido mineral en el fmur y la tibia de los animales
estudiados. Los estudios de correlacin y regresin establecido entre todos los parmetros
implicados en la absorcin mineral desvel una relacin directa entre la disminucin del pH del
contenido intestinal y la absorcin de Ca, Mg y Fe. Sin embargo, la relacin entre la absorcin
de estos minerales y la proliferacin celular de la mucosa intestinal difiri entre los mismos. As
para el Ca se obtuvo un elevado ndice de correlacin con la altura de las criptas del colon
distal, para el Mg existi una relacin lineal entre la absorcin de este mineral y la altura de las
criptas en el colon proximal y con la densidad celular en el colon distal. La absorcin intestinal
de Fe mostr al igual que el Mg una relacin lineal con la altura de las criptas en el colon
proximal. En el caso del P no se observ ninguna relacin clara entre su absorcin y el resto de
parmetros estudiados, a pesar de mostrar una absorcin en determinados grupos problema
significativamente superior a la observada en el grupo control. El anlisis factorial revel que el
aumento en la absorcin de Ca, Mg y Fe estuvo relacionado con el descenso del pH y el
incremento en la proliferacin del epitelio del colon. Igualmente, este estudio permiti
relacionar el depsito en huesos (tibia y fmur) con la absorcin y retencin mineral, el pH en
el contenido del ciego y colon y la proliferacin del epitelio del colon.

224
SUMMARY

One of the most important aims of feeding between the end of XX century and the
beginning of XXI century, is the incorporation to the diet of food and ingredients which affect us
beneficially to a long rage and allow us to maintain a healthy state in an extended way. In fact,
the sooner these ingredients are incorporated to the feeding, the higher the beneficial effect
will be and at a long rage. According to this idea, the concept of functional food and/or
ingredient has been developed. Probiotics and prebiotics stand out for their positive effect in
health. Examples of both are bacteria of the genera Bifidobacterium and the non-digestible
oligosaccharides, respectively. With the objective to obtain beneficial effects in the diet to a
short, medium and long rage, these ingredients have been incorporated to infant formulas.
Although the profitable effects of these ingredients are evident, they must be assessed more
deeply to ensure their nutritional quality.
The present work has been divided into three studies to facilitate its understanding. In
the first study the in vitro fermentation of some oligosaccharides by four species of
bifidobacteria. It showed that 4-gallactosyllactose (4-GOS) estimulated more intensively the
bacterial growth specially of B. breve and B. bifidum. In the second study, it was evaluated the
viability of bifidobacteria presents in a commercial probiotic infant formula (B. bifidum and B.
longum) during 14 days as maximum. The counts were decreasing significantly (p<0,05) with
days. However, they were kept above the recommended level (106 cells/g of product). Later, it
was studied the effect of the administration of the probiotic formula on infant fecal flora during
the first year of life. The results showed that bifidobacteria fecal counts of probiotic formula fed
infants were always higher than those found in control formula fed infants. However, these
counts were not significantly (p<0,05) larger than those of the control group until three months
after consuming the probiotic formula (corresponding to the samples analyzed at 7 and 9
months of age).
To carry out the third study, a total of seven experimental diets were elaborated (1
probiotic, 3 prebiotics and 3 synbiotics diets), and after analysing their nutritional composition
they were administered to 54 weanling rats during 30 days. The aim of this tirad study was to
evaluate the effect of probiotics (B. bifidum and B. longum) and prebiotics (4-GOS) added to
the diet on mineral absorption by mineral balance of three periods. In general, groups fed
synbiotic 5 and 10% diets displayed the higher Ca, Mg, and Fe but the addition of 4-GOS at
1,2% also showed a larger mineral absorption than that of group fed control diet. However, P
balance in group fed prebiotic 10% diet displayed the highest absorption percentages. In order
to explaining the mechanisms of mineral absorption induced by 4-GOS added to the diets, the
parameters of pH, weight and mineral content in the contents of cecum and colon, histologist
parameters of crypts depth and cell density of the large intestine mucosa, and mineral content
in femur and tibia of the rats were determined. The regression and correlation studies
established among the parameters involved in the mineral absorption revealed a direct

225
relationship between the decrease of pH of the intestinal content and Ca, Mg and Fe
absorption. Nonetheless, the relationship between the absorption of these minerals and cell
proliferation of the large intestine mucosa was different among the minerals. Thus, for Ca a
high factor of correlation was obtained with crypts depth in the distal colon, for Mg the lineal
relationship was found between the absorption of Mg and crypts depth in the proximal colon
and with cell density in the distal colon. The absorption of Fe, as previously with Mg, showed a
lineal relationship with crypts depth in the proximal colon. With regard to P no clear relationship
between its absorption and the other parameters was observed, in spite of showing an
absorption in some groups significantly higher than in group fed control diet. The factorial
analysis exhibited that the increase of Ca, Mg and Fe absorption was related with the pH
decrease and the increase of cell proliferation in the epithelium of the colon. Likewise, this
study allowed to relate the mineral content in bones (femur and tibia) with the mineral
absorption and retention, pH of the content of the cecum and colon and the proliferation of the
epithelium of colon.

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251
 Faculty of Veterinary

UNIVERSITY OF MURCIA

DOCTORAL THESIS

ADDITION OF PROBIOTICS AND PREBIOTICS TO

INFANT FORMULAS AND THEIR EFFECT ON MINERAL
BIOAVAILABILITY

Daro Prez Conesa

Department of Food Science and Nutrition
Murcia 2003

252
INTRODUCTION

There are very good reasons to study nutrition and growth during infancy, since this is
the period of life when the speed of growth and nutritional requirements are the highest.
Children increase their weight in three-fold and their length about 50% during the first year. In
fact, this process becomes more evident during the first month of life, when growth is specially
fast, since infants acquire 200 g of weight and increase their length in 1 cm per week. In a
parallel way, organs grow and maturate at high proportion. Animal studies have shown that
differences in the diet during early age may have metabolic consequences at later age (Sultan
and Barker, 1994), specially on subject growth up, and afterwards it could produce diseases
(Lucas et al., 1990).
Breast-feeding has a very special role in infants feeding and from a quality point of view
it is considered higher than bottled-feeding (Standing Committee on Nutrition of the British
Paediatric Association, 1994). Natural feeding is since a nutritional point of view the most
important during the first months of infancy. However, and although two third parts of the
healthy infants from all over the world are initially breast-fed, this amount is considerably
reduced during lactation. Consequently, a big population of healthy infants is fed with artificial
lactation by using commercial infant formulas. This situation makes important the challenge of
providing the nutrients and bioactive factors that stimulate the development of a microbiota
which promotes gastrointestinal health. This challenge becomes higher when critical cares are
considered, such as pre-term infants and infants with parenteral feeding. Clearly, infant
nutrition supplies a very practical and important reason for understanding the ecology
development of the infant intestine (Gaskins and Lien, 1999).
Although nowadays breast-feeding is considered as the natural and preferable method
for infant feeding, it was not always considered in this way. In 1500 aristocrat women from
England though that nursing a baby was inconvenient and made the mothers old prematurely.
Therefore, it was established that breast-feeding should be done by substitute mothers. High
class women from any part of the world often had from 12 to 20 children, even 30 was not
unusual, and wet-nursing was the only safe and responsible option (Udall and Kilbourne, 1988).
Modern technology introduced a change in infant feeding: cow milk based formula. The
development of this formula was promoted by the discovery of milk pasteurization and the
digestibility improvement of cow milk after heat treatment. The first cow milk based formula
was traded in 1867 by the German chemist Von Liebig. The commercial success of this formula
generated a substitute product of human milk between the end of XIX century and the
beginning of XX century. Generally this formula could be divided into three types: dried cow
milk combined with a sugared cereal, any kind of malted carbohydrate, and cereals with fresh
cow milk (Anderson et al., 1982). Due to that, infant nutritional requirements were estimated
during the next decades, the nutritional value of the improved humanised formula and the
composition of the formula started to mimic the human milk composition.

253
 The production and distribution of the infant formula has been transformed in a
complex purpose during the XX century. This fact involves the knowledge of the nutritional
requirements, digestion physiology and nutrients absorption, and the technology for the
production of formulas, the economy to produce healthy and nutritive infant formula at a
reasonable price. Nowadays it is known that diet, among other environmental and genetic
factors, has an important role in health and disease status of the subject. There is also an
increasing evidence that human colon microbiota could affect positively on nutrition and health
of the host. Therefore, the capacity to modulate the diet has been proposed as an important
factor to improve the health of the human intestine, especially during infancy which is the most
sensitive period of life (Mountzouris et al., 2002).
Many authors have shown the existence of differences in the intestine microflora
composition and in the incidence of infections between breast-fed and bottled-fed infants.
Although the development of infant formulas has shown an important increase since the
beginning of its trading, there are some components of the human milk that can not be
duplicated in the infant formula and could be the reason for these differences. However, there
are several functional ingredients such as oligosaccharides, prebiotics and probiotics that could
be added to the infant formula and modify beneficially the composition and activities of the
microflora of infants (Gibson and Roberfroid, 1995).

254
OBJECTIVES

The aims of the present thesis were:

1.- To evaluate the in vitro growth of some species of bifidobacteria with different non-
digestible oligosaccharides as substrates, and select the most suitable for its use as a prebiotic
in infant formulas.

2.- To study the viability of the bifidobacteria incorporated in a probiotic infant formula during
its period of consumption.

3.- To evaluate the effect of the consumption of a probiotic infant formula on the infant faecal
flora during the first year of life.

4.- To know the effect of the administration of seven diets formed by infant formulas
supplemented with bifidobacteria and/or galactooligosaccharides on in vivo bioavailability of
calcium, magnesium, phosphorous and iron, in weaning Sprague-Dawley rats using a mineral
balance.

5.- To determine the influence of probiotics and prebiotics added to infant formulas on the
intestinal epithelium of the cecum and colon of rats.

6.- To determine the influence of probiotics and prebiotics added to infant formulas on the
absorption of calcium, magnesium, phosphorous and iron in the cecum and colon of rats.

7.- To determine the influence of probiotics and prebiotics added to infant formulas on the
deposition of calcium, magnesium, phosphorous and iron in the femur and tibia of rats.

255
MATERIAL AND METHODS

Experimental schedule

The work of the current Thesis was divided in three studies, as it is shown in Figure 1.
In the first study was evaluated the in vitro fermentation of different oligosaccharides
by the species of Bifidobacterium which more often have been isolated in infant faeces. The aim
of this study was to select the most suitable substrate to be added to the diet assess in the
third study.
In the second study, a commercial infant formula containing the species of
bifidobacteria selected in the previous study was used. First, it was evaluated the viability of the
bifidobacteria of this infant formula. Following the manufacturers recommendations, the
viability was evaluated during the minimum period of consumption (six days) when children
have between 9 months and three years of age and the maximum period of consumption
(fourteen days) when children have four months of age. After checking the stability of the
bifidobacteria during these periods, it was carried out a study with two groups of infants fed
with follow-up infant formula or probiotic follow-up infant formula since the fourth to the twelve
month of age. Anaerobe faecal bacteria were enumerated at 1, 3, 5, 7, 9 and 12 months of life
to evaluate the effect of the probiotic infant formula on infant faecal flora.
In the third study the effect of probiotics and prebiotics on intestinal mineral absorption
and retention was examined in growing male rats using a three periods of three-day mineral
balance technique. The OS selected in the first study, was added at different concentrations
(1,2, 5 and 10%) to the follow-up infant formula and probiotic follow-up infant formula
originating three prebiotics diets and three synbiotic diets. Moreover, the follow-up infant
formula was used as control diet and the probiotic follow-up infant formula as probiotic diet.
The AO4 maintenance diet for rats was used as a reference diet, and together with the others
the nutritional composition of the diets was determined. The mineral balance study also
involved a histologist study of the cecal and colonic mucosa, mineral content determination in
the solid and liquid phase of the cecal and colonic contents, mineral content determination in
femur and tibia, and the faecal bifidobacteria content in rats (Figures 3 and 4) after thirty days
of study.

256
 OLIGOSACCHARIDES
BIFIDOBACTERIA
Bifidobacterium bifidum SCFOS
IN VITRO STUDY
Bifidobacterium breve Inulin
Bifidobacterium infantis Oligofructose
Bifidobacterium longum 4-GOS
Bacterial growth
pH changes

Bifidobacteria selected Oligosaccharides selected

1s t STUDY

Follow-up Probiotic follow -up DIET AO4 (DIET 1)

infant formula infant formula
Follow-up infant formula (DIET 2)
Probiotic follow-up infant formula (DIET 3)
Prebiotic follow-up infant formulas (DIETS 4 -6)
Synbiotic follow-up infant formulas (DIETS 7-9)

IN VITRO STUDY IN VIVO STUDY

In vivo experiment with rats NUTRITIONAL
to study the effect of follow- ANALYSIS
Viability of bifidobacteria Infant faecal anaerobe flora
up infant formulas containing
probiotics, prebiotics and Moisture
Plate count (6 and 14 days) Total, bacteroides, synbiotics on mineral Ash
pH and moisture bifidobacteria and clostridia absorption (Ca, Mg, P and Crude protein
pH faeces Fe) Carbohydrates
Total fat
Total dietary fiber
Minerals (Ca, Mg, P and Fe)
2nd STUDY 3rd STUDY

Figure 1. Schematic graph of the experimental design of the study

257
1st STUDY

In vitro evaluation of bifidobacteria growth and pH variation of the culture broth

with different non- digestible oligosaccharides (NDO)

Bifidobacteria used are shown in Table 1. Bacteria cultures were liofilized and they were
maintained refrigerated at 5 C until their utilization. For bacterial reactivation each culture was
rehydrated in TPY (Tryptone Phytone Yeast broth) (Scardovi, 1986) containing (in grams per
liter): tryptone, 10,0; soy peptone, 5,0; glucose, 5,0; yeast extract, 2,5; Tween 80, 1,0;
cysteine hydrochloride, 0,5; K2 HPO4, 2,0; Cl2Mg.6H2O, 0,5; ZnSO4.7H2O, 0,25; CaCl2, 0,15; pH
7,0, by two consecutive subcultures of 24 hours (Gomez Zavaglia et al., 1998) at 37 oC under
anaerobic conditions. Rehydrated culture was inoculated at 5% into TPY broth and was
incubated at the same conditions as described before. The culture was then monitored visually
every 4 hours after 16 hours of incubation (Dubey and Mistry, 1996) evaluating the turbidity
(optical density, OD) of the culture at 600 nm (Gomez Zavaglia et al., 1998; Perrin et al., 2001;
Crittenden et al., 2001) in a molecular absorption spectrophotometry (Hitachi U-2000, Japan) to
obtain a value of 2 in the MacFarland scale. This measure is equivalent to a absorbance value of
0,615 which it is corresponded to a growth of 6x108 cfu/mL. For bacterial cultures was
established an equivalence between the turbidity of the seven tubes used as standards (BaCl2
1% with increasing volumes of H2SO4 1%) and the bacterial concentration (in cfu/mL) that
generates a similar turbidity.

Table 1. Bifidobacterium used in the first study

Supplier Bifidobacterium spp.

Spanish type culture collection (STCC)
STCC 4549 Bifidobacterium bifidum
STCC 4839T Bifidobacterium breve
STCC 4551T Bifidobacterium infantis

Morinaga nutritional foods Deutschland GmbH

BB536 Bifidobacterium longum

Once reached the mentioned concentration (6x108 cfu/mL), an aliquot at 1% (vol/vol)

of each bifidobacteria was added to screw-capped, sterilized tubes containing TPY broth each
one with a different substrate (Table 2) to a concentration of 1,2% (wt/vol). The tubes were
incubated at 37 C anaerobically using AnaeroGen 3,5 L bags (Oxoid, UK) during seven days.
Samples were collected aseptically at 0 hours and every 24 hours postinoculation and after
shaking in a vortex (Heidolph, Germany) the sample was transferred to a disposable cuvette,
and turbidity (culture OD) was measured at 600 nm as previously was described. The bacterial
growth was expressed as decimal logarithm of the colony forming units (cfu). Uninoculated
sterilized with TPY broth was used as the blank for each substrate.

258
 Another sample was also collected each 24 hours for pH culture measurement with a
micro pH 2000 pH-meter (Crison, Barcelona, Spain). Glucose was used as control substrate of
the four oligosaccharides and as a reference of the bacterial growth.
To simplify the terminology of the substrates, from now we will name Actilight 950P as
short-chain FOS (SCFOS) and in the case of Oligomate 55P as 4-GOS.

Table 2. Substrates used in the first study

Substrate Product Composition

Monosaccharide Glucose D(+)glucose

FOS* Actilight 950P

GF2 (30,38%), GF3 (50,18%), GF4 (15,69%), glucose, fructose
and sucrose
Raftiline HP inulin (>99,5%), glucose, fructose and sucrose
Raftilose P95 oligofructose (>93,2%), glucose, fructose and sucrose

GOS* Oligomate 55P 4-galactosyllactose (>55%), lactose and monosaccharides (<45%)

*
FOS, fructooligosaccharides; GOS, galactooligosaccharides

GF 2, kestose; GF3, nystose; GF 4, fructosylnystose

2nd STUDY

Infant formulas

A powder follow-up infant formula and its probiotic form were provided by the same
manufacturer (Hero Espaa S.A.). The consumption of both infant formulas by infants is
recommended from the fourth month to the third year of age. The infant formulas have the
same ingredients in their composition except the presence of lactic ferments (Bifidobacterium
bifidum and Bifidobacterium longum) in the probiotic infant formula (see Table 3). The Figure 2
shows the flow diagram of the infant formulas manufacturing process and the step in which the
lactic ferments were added.

Table 3. Composition of the infant formulas

Follow-up infant Probiotic follow-up
Ingredients formula infant formula
Skim milk + +
Demineralizated whey-protein + +
Dextrinomaltose + +
Vegetal oils + +
Lactose + +
Lecitin + +
Minerals (added individually)* + +
Vitamins (added as a mix) + +
Lactic ferment (B. bifidum and B. longum) - +
Taurine + +
Inositol + +
Coline + +
Carnitine + +
*
Mineral content (as mg/100 g): Bisodium phosphate 160 mg; Calcium chloride 320 mg; Calcium citrate 320 mg;
Potassium citrate 840 mg; Cinc sulphate 7,7 mg; Copper sulphate 0,96 mg; Iron sulphate 42,88 mg; Potassium
iodure 0,04 mg; Magnesium hydroxide 33 mg; Coline chloride 80,4 mg.

259
 Water Whey-protein Lactose or
Skim milk Minerals dextrinomaltose
concentrated Fat
concentrated

Solution in Storage
water

Storing
Blending of the ingredients

Pasteurization (7072 C)

Homogenization

Cooling

Storage Vitamins

Concentration

Pasteurization

Homogeneization

Drying

Dextrinomaltose Bifidobacteria Filtering

Filling in Big-Bag

Blending
Blending
Tinning

Tinning

Probiotic follow-up infant Follow-up

formula infant formula

Figure 2. Flow diagram of the infant formulas manufacturing process

260
Viability of bifidobacteria in commercial powder infant formula

The viability of the bifidobacteria present in the probiotic follow-up infant formula was
determined using as a control the same infant formula without bifidobacteria. To mimic the
using conditions of the infant formula by the mother at home, the study was designed
according to the rule of consumption described by the manufacturer. It was took into account
the number of doses depending the age of the infant, the amount of each dose (4 grams) and
each can have approximately 900 g of powdered product. On the basis of these four studies
could be designed (Table 4). From all of them, it was carried out the studies with the minimum
(six days) and maximum (fourteen days) duration.
From the total amount of formula that should be consumed by the infant, ten grams
were suspended in 90 mL of 0,1 M phosphate buffer (pH 7,0) (Macfarlane and Englyst, 1986;
Ingham, 1999) and maintained at 22 C during 30 min until dispersion of the sample. Then, a
volume was collected to make the necessary decimal dilutions (10 -1-10-6) with peptone water
0,1% (wt/vol), and 1 mL was poured per duplicate on TPY agar with selective supplement
containing (in grams per liter): lithium chloride, 3,0; neomycin sulphate, 0,1; nalidixic acid,
0,015 (Moreno et al., 2000). This solution was filter sterilized (0,45 m, Millipore Corporation,
Bedford) and added to the autoclaved TPY agar. Another sample from the first dilution was
collected to measure the pH of the infant formula during the days of study. The plates were
incubated at 37 C under anaerobic conditions for 72 hours. Moreover, the moisture of the
sample was measured, as it is described in the next section, after remove it from the can. The
analysis with both follow-up and probiotic follow-up infant formulas were carried out using
three cans for each infant formula belonging to the same batch of production.

Table 4. Design of the viability of bifidobacteria study for probiotic formula regarding to the guide of
consumption recommended by the manufacturer
Age of the baby Guide of consumption Duration
4th month 4 g x 7 doses x 5 daily intakes = 140 g/day 6 days
th th
5 6 month 4 g x 8 doses x 4 daily intakes = 128 g/day 7 days
th th
7 -9 month 4 g x 8 doses x 3 daily intakes = 96 g/day 9 days
th th
9 -10 month and 1-3 years 4 g x 8 doses x 2 daily intakes = 64 g/day 14 days

Finally, it was obtained the percentage of the viability of the bifidobacteria using the
following calculation (Shin et al., 2000a):

cfu t1
Viability (%) = x 100
cfu t0

where to is the first day of the study, and t1 is the last day of the study.

261
Composition of faecal microflora in infants fed control or probiotic formula during
the first year of life

This study was carried out to evaluate if the composition of the infant faecal microflora
was affected by the consumption of the probiotic follow-up infant formula (containing
Bifidobacterium spp.) during the first year of life. Faecal samples were collected at the age of 1,
3, 5, 7, 9 and 12 months from five babies. Two of them were fed with a follow-up infant
formula used as control, and the other three were fed with the probiotic follow-up infant
formula. Babies were sons/daughters of the members of the Department of Food Science and
Nutrition of the University of Murcia. Parents were informed of the study and signed the
authorisation of conformist according the Spanish law (15/1999). Samples were collected by the
parents in sterile containers and were immediately frozen at 20 oC until analysis. Table 5
shows the feed schedule of infants used in this study.

Table 5. Feed schedule of infants participating in the composition of faecal microflora study
Type of formula 1 month 3 months 5 months 7 months 9 months 12 months
Control (baby 1) HM IF1 IF2+IC IF2+IC+B IF2+IC+B IF2+IC+B
Control (baby 2) HM+IF1 IF1+IC IF2+IC IF2+IC+B IF2+IC+B IF2+IC+B
Probiotic (baby 3) HM+IF1 IF1 PIF+IC PIF+IC+B PIF+IC+B PIF+IC+B
Probiotic (baby 4) HM+IF1 HM+IF1 PIF PIF+IC+B PIF+IC+B PIF+IC+B
Probiotic (baby 5) HM IF1 PIF+IC PIF+IC+B PIF+IC+B PIF+IC+B
HM (Human milk), IF1/IF2 (Infant Formula 1 or 2), PIF (Probiotic Infant Formula), IC (Infant Cereals), B (Beikosts: fruit
+ vegetables + meat + fish)

Faecal pH was determined after 10% faecal suspension in saline solution (0,15 M NaCl
solution) with a micro pH 2000 pH-meter (Crison, Barcelona, Spain) after homogenize the
suspension in a vortex (Heidolph, Germany) (Langhendries et al., 1995). For the faecal flora
composition, 3 g of faecal sample were diluted in 25 mL of peptone water with 0,5% glucose.
All the specimens were analysed within 2 hours after being passed to recover the major number
of bacteria. Serial 100-fold dilutions were performed in sterile reduced physiological salt solution
(RPSS) (physiological solution with 0,5 g/L cysteine HCl, pH 6,7) taking 1 mL of sample and 9
mL of RPW. An aliquot of 0,3 mL was spread on petri dishes (see conditions in Table 6). All the
analysis were carried out under strict anaerobic conditions using an atmosphere composed by
80% N2, 10% CO2, 10% H2, and the plates were incubated in anaerobic jars.

Table 6. Culture conditions of bacteria in the composition of infant faecal microflora

Culture Temp. and time
Bacteria Dilutions References
media* of incubation
-4 -7
Total anaerobes CBA 10 to 10 37 oC/48 h Langhendries et al., 1995
Bacteroides BBE 10 -4 to 10-6 37 oC/48 h Summanen et al, 1993
Hartemink and Rombouts,
Bifidobacterium RB 10 -4 to 10-6 37 oC/72 h
1999
Clostridium TSC 10 -2 to 10-4 37 oC/48 h Neut et al., 1985b
*
Columbia blood agar (CBA), Bacteroides bile esculine agar (BBE), Raffinose Bifidobacterium medium (RB), Tryptose
sulfite cycloserine (TSC)

262
 Colonies were identified after two or three days of incubation at 37 oC under anaerobic
conditions and results were expressed as decimal logarithm of the cfu per gram of faecal
sample. In the case of bifidobacteria, some colonies were isolated in RB agar (Hartemink and
Rombouts, 1999) containing (in grams per liter): agar bacteriological No. 1, 18,0; D(+)
raffinose, 7,5; sodium caseinate, 5,0; yeast extract, 5,0; lithium chloride, 3,0; sodium
propionate, 15,0; L-cysteine, 0,5; sodium thioglycollate, 0,5; bromocresolpurple 1% solution,
15,0; salt solution (MgSO4, 0,2; CaCl2, 0,2; K2HPO4, 1,0; KH2PO4, 1,0; NaHCO3, 10,0; NaCl;
2,0), 40,0; pH 6,7 during 48 hours anaerobically and then they were tested for Gram stain,
colony morphology microscopically using OLYMPUS Phase-contrast microscope with optical
magnification of x40 and x100, and carbohydrate fermentation pattern using the enzymatic test
API 50CH and API 50 CHL broth (Biomerieux, France). After 48 hours of incubation under
anaerobic conditions one colony of each plate was inoculated in api 50 CHL medium, then it
was pipetted from the medium into the 50 api-microtubes. Then, the api-cupules were filled
with paraffine for maintaining anaerobic conditions for the fermentation and thus we incubated

the strip at 37 C for 48 hours. All the previous analysis were performed under anaerobic
conditions in an anaerobic chamber.

3r d STUDY

Nutritional composition of the experimental diets

In the third study were used a total of nine diets, the first one was a maintenance diet
(AO4) for rats provided by the animalarium of the University of Murcia. The remaining eight
diets were elaborated from the follow-up and probiotic follow-up infant formulas, being each
diet composed by the homogenisation of four cans belonging to the same batch of production.

Table 7. Diets used in the in vivo experiment to study the effect of follow-up infant formulas
containing probiotics, prebiotics and synbiotics on mineral absorption
Group Diets Composition
1 A04 Maintenance diet A04
2 Control Follow-up infant formula
3 Probiotic Follow-up infant formula + bifidobacteria
4 Prebiotic 1,2% Follow-up infant formula + 4-GOS (1,2%)
5 Prebiotic 5% Follow-up infant formula + 4-GOS (5%)
6 Prebiotic 10% Follow-up infant formula + 4-GOS (10%)
7 Synbiotic 1,2% Follow-up infant formula + bifidobacteria + 4-GOS (1,2%)
8 Synbiotic 5% Follow-up infant formula + bifidobacteria + 4-GOS (5%)
9 Synbiotic 10% Follow-up infant formula + bifidobacteria + 4-GOS (10%)

The first study gave rise to the selection of two species of bifidobacteria: B. bifidum and
B. longum (according to their growth and capacity to decrease pH of the media) and a
substrate: 4-GOS (according to its capacity to stimulate the growth of bifidobacteria). Table 7

263
shows the combination of these probiotics (bifidobacteria) and prebiotics (4-GOS, at 1,2, 5 and
10%) to elaborate the diets used in the study.
Moisture was determined by weight loss from triplicate samples dried in an oven at 100
C for 20 hours. The crude protein content was calculated by converting the nitrogen content
determined by Kjeldahl digestion (method 991.20 of the AOAC, 1999) and multiplying it using a
factor of 6,25. Fat was determined by the method described by the AOAC (1999), using the
Soxhlet system. Ash content was carried out according to method 945.46 of the AOAC (1999)
by dry-ashing in a furnace oven at 525 C for 24 hours. Total dietary fiber was determined
following the enzymatic-gravimetric method described by Prosky et al. (1988) and adapted by
the AOAC as the official method 985.29 (AOAC, 1999). Carbohydrates were calculated by
subtracting the other components from the total as recommended by FAO/WHO (1982). Energy
was estimated by applying the numbers of Atwater. For fat content, the factor was 9 kcal/g and
for the carbohydrate and protein contents the factor was 4 kcal/g.
Ca, Mg and Fe analyses were carried out by atomic absorption spectrophotometry
(EAA) according to method 945.46 by the AOAC (1999). Samples were dried overnight in a
forced-draught oven at 90 C. Mineral composition was analyzed after destroying the organic
matter of the samples by dry ashing in a Nabertherm furnace oven, model L3/P (Liliental,
Bremen, Germany) for 24 hours with a final temperature of 525 C. The ash was subsequently
dissolved with a mixture of 2 mL of 65% HNO3 and 5 mL of 37% HCl on an electrical hot plate.
Subsequently, the ash was collected from the crucibles by washing with distilled deionized
water and filtered through a Whatman GF/C glass microfiber filter into 50 mL volumetric flasks.
Minerals were measured in the final filtrate solution using a Perkin-Elmer atomic absorption
spectrophotometer model 3100 (Norwalk, CT, USA). A 10 cm one-slot burner head, impact
bead, flow spoiler, corrosion resistant nebulizer and standard air-acetylene flame were used. A
monoelemental hollow cathode lamp was used for each element. The instrumental conditions
recommended by the manufacturer (wavelength, slit and lamp intensity) were applied (Ros,
1995; Martnez et al., 1998). The acids (Suprapur quality) and the mineral standard solution
(Tritisol) used were obtained from Merck (Darmstadt, Germany). P was determined after dry
ashing, in the same conditions applied for the other minerals, using the ammonium vanadate
colorimetric method according to method 986.24 (AOAC, 1999), described by Chapman and
Pratt (1961), reading the absorbance in a Hitachi H-2000 double beam molecular
spectrophotometer.
To minimize the risk of adventitious contamination, all glassware and crucibles were
acid-washed overnight in a 6 M solution of analytical grade HCl. Distilled, deionized water was
used to rinse all glassware twice. In the determination of Ca and Mg and to avoid interference
with other elements, such as phosphates, lanthanum chloride 0,1% (wt/vol) was added to the
samples and standards.

264
In vivo study with rats of the effect of follow-up infant formulas containing
probiotics, prebiotics and synbiotics on mineral absorption

Animals

Rats were provided by the animalarium of the University of Murcia (institution

authorized for production and distribution of laboratory animals according to Real Decreto
223/1988, about animal protection for experimentation and other scientific purposes, published
in B.O.E. nm. 67 from 18th March 1988). Rat assays were approved by the Ethical Committee
of the University of Murcia. Fifty-four three-week-old weanling male Sprague-Dawley rats (initial
body weight 40-50 grams) were housed in collective wire stainless steel cages. During the
mineral balance periods the animals were moved to metabolic cages (Techniplastgazzada,
Bugugiatte, Italy) in an environmentally controlled room, maintained at 23 2 C, with a 12
hours light-dark cycle and 50-70% humidity. Rats were selected by initial weight receiving a
different diet according to the group.

Diets

The following table shows the nutritional composition of the nine diets used in the
feeding of the rats. All diets cover the rat requirements of the minerals studied in this work and
they are established in 500 mg/100 g for calcium, 40 mg/100 g for magnesium, 400 mg/100 g
for phosphorous and 3,5 mg/100 g for iron (NRC, 1978).

Table 8. Nutritional composition of the diets used in the third study

Nutrients Diets
1 2-9
Energy (kcal/100 g) 317,680,01 465,804,38
Moisture (%) 9,050,194 3,450,13
Ash (%) 5,040,05 3,750,04
Protein (%) 14,000,05 13,850,13
Fat (%) 2,36 0,06 22,200,21
Carbohydrates (%) 60,110,00 52,640,59
Dietary fiber (%) 18,491,81 -
Calcium (mg/100 g) 765,5015,74 571,728,67
Iron (mg/100 g) 30,412,58 8,550,24
Magnesium (mg/100 g) 150,090,66 50,100,86
Phosphorous (mg/100 g) 503,984,44 343,689,68
Ratio calcium/phosphorous 1,52 1,66
2, 3...NO
Galactooligosaccharides NO 4, 7...1,2%
5, 8...5%
6, 9...10%
Bifidobacterium NO 2, 4, 5, 6...NO
3, 7, 8, 9...YES

265
Collection and processing of samples

The experimental design and methodology followed in the in vivo study to determinate
the effect of probiotics and prebiotics on intestinal mineral absorption and retention using a
mineral balance technique is shown in Figures 3 and 4. Before starting the experiment, cages,
eatables, drinkables, containers for urine and faeces, and containers for other samples were
washed in 10% HNO3 solution and then rinsed three times in deionized distilled water. After a
5-day adaptation period, during which rats were fed the control diet, the animals were
separated into nine groups of six rats having similar mean body weight. The animals were also
weighted at the end of the study and during the three periods of three days (days 8-10, 18-20
and 28-30) of mineral balance using a scales (Sartorius, Gttingen, Germany). Diets and
deionized water were given ad libitum for 30 days, recording also the intake of food and water
during the periods of mineral balance. Moreover, faeces and urine (acidified by HCl, 0,5 M, 10
mL/L) (Lopez et al., 2000) were collected during these periods for microbial analysis (total
faecal bacteria and faecal bifidobacteria) and for mineral balance determination (in both).
Faeces were cleaned from any food residue, weighted, liofilized, milled, and afterwards a
sample of 0,5 grams was taken for mineralization. Dry weight of faeces was estimated after
drying a sample in an oven until obtaining a constant weight. Urine was filtered (Whatman filter
paper 41, ashless, Maidstone, UK) to remove any food and faeces residues and then was
filtered again (0,45 m, Iwaki glass, Japan). Both, faeces and urine were stored at 4 C. After a
30-day feeding period, the animals were anesthetized by exposure to diethyl ether and
posterior to laparotomy, 4-5 mL of blood was collected by aorta puncture. The cecum and colon
were removed, pH of the cecal and colonic contents was measured with a glass microelectrode
inserted from the ileum and rectum respectively. The cecal and colonic tissues were flushed
clean with deionized water, blotted on filter paper and weighted. Subsequently, the cecal and
colonic wall were stored in formol solution until histologist study. The cecal and colonic contents
were collected, weighted and then stored at 20 C until needed for mineral analysis. The
femur and tibia from the right leg were removed to determinate their ash weight and mineral
content. Previously the bones were dried in an oven at 95 C for 24 hours and defatted by two
successive passes of 12 hours in n-hexane and ether, drying them again in an oven at 95 C for
5-6 hours to measure their dry weight (Ros, 1995).

266
 Weanling male SD rats
(21 days, weight=40-50 g, n= 54)

DIETS
DIETAS
A04 Diet Control Diet

Prebiotic Diets Probiotic Diet Synbiotic Diets

(1,2-5-10% 4-GOS) (1,2-5-10% 4-GOS)

WORKING CONDITIONS

Termoregulated chamber 23 C

12 h light-dark cycle

Humidity 50-70%

Adaptation period (5 days)

Period Period Period

8-10 days 18-20 days 28-30 days

Daily food intake Daily food intake Daily food intake

Faecal excretion Faecal excretion Faecal excretion
Urine excretion Urine excretion Urine excretion
Content of minerals in Content of minerals in Content of minerals in
faeces and urine faeces and urine faeces and urine
Count of bifidobacteria Count of bifidobacteria Count of bifidobacteria

Content of minerals in bones and

content of the cecum and colon
pH of content of the cecum and
colon SACRIFICE
Weight and morphology of the wall
of the cecum and colon
Haematological and biochemical
parameters

Figure 3. Experimental design of the in vivo experiment to study the effect of follow-up infant formulas
containing probiotics, prebiotics and synbiotics on mineral absorption

267
 Collection Anaesthesia Collection
of urine of faeces

Filtration Blood Organs Count of total Liofilization

extraction extraction bacteria and
bifidobacteria

Centrifugation
Acidification 4.000 rpm/10 Homogenization
min
Haematological
parameters

Determination of Determination of
Ca, Mg, P and Fe Biochemical Ca, Mg, P and Fe
parameters

Cecum and colon Femur and tibia

Defatted
Wall of the cecum
Contents of the
and colon
cecum and colon

Ash content
Fixation in formol Determination of Ca,
Mg, P and Fe
Minerals
Solid phase
Liquid phase Histologist
study

Figure 4. Methodology followed in the in vivo study with rats

Determination of the haematological and biochemical parameters

The haematological parameters were analyzed immediately after collecting the blood to
avoid any alteration of the sample. The blood of the animals was analyzed for total red cells,
hematocrit and the concentration of hemoglobin were measured using a Microcellcounter
Sysmex F-800. A portion the blood sample was centrifuged at 4.000 x g for 10 min for
determining the biochemical parameters. Serum iron and total iron binding capacity (TIBC)
were analyzed by means of commercial test kits (Ferrimat-kit and TIBC Additif-kit, BioMrieux,
France) using a molecular absorption spectrophotometry (Hitachi U-2000, Japan) at 562 nm.
The numeric values were calculated from the following formula:

268
 A m TIBC - Abm TIBC
TIBC ( g/100 mL) = xn
Ap

where Am is the absorbance of the problem sample, Abm the absorbance of the blank, Ap the
absorbance of the standard and n is the conversion factor with a value of 200.

Am - Abm
Serum iron ( g/100 mL) = xn
Ap

where Am is the absorbance of the problem sample, Abm the absorbance of the blank, Ap the
absorbance of the standard and n is the conversion factor with a value of 600.
Albumin was determined using the colorimetric test Bromcresol green and urea was
calculated with the kinetic test GLDH method. The colorimetric reaction in both test were
measured in a in a molecular absorption spectrophotometry at 630 and 340 nm, respectively.
Blood lipids were determined by using commercial test kits and analyzed in a molecular
absorption spectrophotometry (Hitachi U-2000, Japan) at 600 nm. Total cholesterol, HDL-
cholesterol and triacylglycerols were determined with the ABX Diagnostics Cholesterol 250,
colesterol-hdl Spinreact and ABX Diagnostics Triglycerides 25 kits, respectively. LDL-cholesterol
was calculated by the following formula:

Total cholesterol - HDLcholesterol - Triacylgly cerols

LDLcholesterol =
5

Enumeration of total bacteria and bifidobacteria in faeces of rats

All bacteria determinations were done immediately after sampling. About 1 g of fresh
faeces collected directly from each rats were immediately diluted in 9 mL of phosphate buffer
(Macfarlane and Englyst, 1986; Ingham, 1999) and kept at 22 C for 30 min until dispersion of
the faecal sample. Then serial decimal dilutions (10 -1 to 10-6) with peptone water 0,1% (wt/vol)
were made, and 1 mL of the faecal homogenised was poured on the different culture media per
duplicate as Table 9 shown. The plates were incubated at 37 C under aerobic and anaerobic
conditions during 24-48 hours for total aerobes and anaerobes, and anaerobically at 37 C
during 72 hours for bifidobacteria. The results were expressed as log cfu/g faeces.

269
Table 9. Culture media used in the enumeration of total bacteria and bifidobacteria in faeces of rats
Bacteria Culture media References
Total aerobes Plate Count Agar (PCA) Alles and col., 1999
Total anaerobes Reinforced Clostridial Agar (RCA) Venketeshwer Rao and col., 1994
Bifidobacteria TPY Agar with antibiotic solution Moreno and col., 2000

Determination of the mineral content

After drying and obtaining dry weight of faeces, bones (femur and tibia) and solid
phase of the cecal and colonic contents, they were dry ashed in an furnace oven at 550 C
during 12 hours. For a better ashing of the samples, 2 mL of 65% HNO3 were added, then ash
was boiled on an electrical hot plate and they were dry ashed at 550 C for additional 5 hours
following the method described by Sherman et al. (1985). Minerals (Ca, Mg, Fe and P) were
determined as previously was described. Liquid samples (urine and liquid phase of cecal and
colonic contents) did not suffer any additional treatment from that previously described and
were directly measured for mineral determination.

Determination of the mineral content in the solid and liquid phases of the contents
of cecum and colon

Cecal and colonic contents were thawed and a part of them was added to five volumes
of deionized water. The contents were then shaken and centrifuged (15 min, 40.000 x g) with
the use of a high speed centrifuge (5416 model, Eppendorf, Hamburg, Germany). Supernatant
fraction and pellet were separated and weights were determined. The pellet was dry ashed in
an furnace oven at 550 C during 12 hours dissolving ashes in a mixture of 1 mL of 6 mol/L HCl
and 4 mL of distilled deionized water on an electrical hot plate. Ca and Mg in cecal and colonic
contents were analyzed in the presence of 0,1% (wt/vol) lanthanum chloride by EAA (Schulz et
al., 1993; Baba et al., 1996).
The distribution of minerals between the solid and liquid phase of both cecal and
colonic content was calculated. The pellet obtained after centrifugation of the contents
comprises the solid phase contaminated with liquid phase. Weight of the solid phase was
obtained after drying the pellet. Weight of the liquid phase was calculated as the sum of
weights of the liquid phase in the pellet (total pellet weight minus solid phase) and supernatant.
The concentration of minerals in the supernatant was taken for that in the liquid phase. The
amount of minerals in the solid phase was calculated as that in the total pellet minus that in the
liquid phase of the pellet. Multiplying mineral concentration in the supernatant by the weight of
the liquid phase gave the amount of minerals in the liquid phase (Schulz et al., 1993).

270
Histologist study of the epithelium of the wall of cecum and colon

Elaboration of the histological preparations. After removing, washing, drying and

weighting of cecal and colonic walls, they were fixed in a 10% (vol/vol) formol solution until
processing. Tissues were removed from the formol solution and sections of 5-7 mm were cut
from apex of cecum, proximal (1 cm distal to ceco-colonic junction) and distal (1 m proximal to
the rectum) colon (Howard et al., 1995a) and embedded in paraffin blocks. A 4 m thick cross
section was prepared from each specimen and mounted on microscope glass slides, then they
were stained with hematoxylin and eosin (Rmsy et al., 1993; Ichikawa and Sakata, 1998; Lu
et al., 2000).
Measurement of epithelial proliferation in the histological preparations. The prepared
slides were coded and they were observed using an Axioskop Zeiss light microscope with optical
magnification of x 10, x 20, x 40 and x 60. One biopsy was taken from each intestinal segment
and seven well-oriented and longitudinally sectioned crypts were examined on each biopsy
specimen (an average of 21 readable crypts were attained for each segment and for each
group fed a different diet) using the MIP 4 Advanced computer programme. The morphological
measurements of the stained slides included the linear distance from the base to the mouth of
the crypt (crypt depth) and the number of epithelial cells of the right side of axial crypt sections
or number of cells per crypt column (cell density) (Howard et al., 1995a; Ichikawa and Sakata,
1998) as it is shown in Figure 5.

Figure 5. Image of the epithelial crypts in the proximal colon of the rat. A
shows the crypt depth measured in m, and B shows the nucleus of one of
the epithelial cell.

271
Calculations for the evaluation of mineral balance

The apparent absorption ratio and retention ratio of minerals were determined by the
following equations:

Apparent absorption ratio (%)=(mineral intakefaecal mineral excretion) x 100/mineral

intake
Retention ratio (%)=(mineral intakefaecal mineral excretion-urinary mineral excretion)
x 100/mineral intake

Validation of mineral determination

The method validation for mineral determination was performed by using a curve of
calibration and a correlation factor for each mineral. To evaluate the accuracy of the analytical
method the recovery rates was calculated by adding known concentrations of the standards to
each type of sample, and the percentage recovery was determined. To establish the within-run
precision, one sample chosen at random was measured 18 times in the same day, and for the
between-run precision the samples were measured 10 times in different days within 3 weeks for
each mineral.

Statistical analysis

In the three studies which the present thesis has been divided, the sources of variation
measured in each study (evaluation of bifidobacteria growth, evaluation of the viability of
bifidobacteria, addition of probiotics and prebiotics to infant formulas) have been checked with
a variance analysis (ANOVA), using the null hypothesis of no differences among means of
variables measured. In the cases that statistical differences due to the previous sources of
variation were found, a multiple by couples comparison test was carried out using Tukey and
Dunnett analysis. Tuckey test was employed to compare the effect of the diets among problem
groups, while Dunnett test (bilateral contrast proof) was used to compare each problem group
with the control group.

In the third study were done the additional analyses which are described as follow. The
relationship between mineral balance (mineral apparent absorption and mineral retention) and
mineral content in femur and tibia with the parameters measured in the intestinal lumen (pH
contents and mucosa proliferation: crypt depth and cell density) was determined by a
correlation analysis. Thus, the effect of the different diets is controlled, using the Pearsons
correlation coefficient. To predict mineral absorption from the pH and mucosa proliferation was
carried out a simple or multiple lineal regression analysis by successive steps technique. Finally,

272
to explain the mineral deposition in bones beginning with the studied variables it was used the
a factorial analysis Principal Components Analysis (PCA). The factorial analysis was used to
reduce the data for identifying a small number of factors or variables which explains the
majority of the observed variance. In this way hypothesis related to the mechanisms of mineral
deposition in bones can be generated, by the linearity of the variables or the relationship of
proximity (or dissimilarity) according to their disposition in the metric space represented by all
the variables.

In all cases a value of p<0,05 was considered as significant. The results of this thesis
are showed as the mean and standard error obtained from the experiments which were
independently replicated three times in a completely randomized design in the two first studies.
In the third study, results are showed from six rats per diet. Statistical analysis was conducted
using SPSS 10.0 version for Windows.

273
RESULTS AND DISCUSSION

1st STUDY

In vitro evaluation of bifidobacteria growth and pH variation of the culture broth

with different non- digestible oligosaccharides (NDO)

The growth of a bacterial culture could be expressed as the increase in the mass of the
culture or in the number of cells. Among the methods used to measure the bacterial mass in an
indirect way, the turbidimetric (optical) methods are widely followed. The principle of these
methods is to measure the amount of light dispersed or transmitted through a bacterial culture
and it is, within certain limits, proportional to the mass of the culture. One of the most useful
methods is the measurement of the transmitted light using the Macfarland scale (Meyer et al.,
1985).
Many in vitro studies have evaluated the fermentation of different oligosaccharides by
lactic-acid bacteria, bifidobacteria particularly, and also the bacterial growth using optical
density (OD) at different wavelengths (Gmez Zavaglia et al., 1998; Shin et al., 2000a;
Crittenden et al., 2001; Perrin et al., 2001).
Table 10 shows the two-way ANOVA of bacterial growth (OD and log cfu/mL) and pH
of the broth according to the substrate used, incubation time and the interaction of both. The
utilization of five different substrates affected significantly (p<0,001) on pH of the broth and
bacterial growth of the four microorganisms studied. Progress of time (from day 1 to 7) also
affected significantly (p<0,001) on bacterial growth expressed as OD and log cfu/mL and pH of
the broth. The interaction of both factors was a source of variation for pH oscillation and
bifidobacteria growth since the measurements of bacterial growth and pH for a determined
substrate and day, showed significant differences (p<0,001) for each microorganism.

Table 10. Two-way ANOVA of culture broth pH and growth of 4 species of bifidobacteria (OD and
log cfu/mL) using the substrate, time of incubation and the interaction of both as source of variation
Source of
B. bifidum B. breve B. infantis B. longum
variation
pH OD log cfu pH OD log cfu pH OD log cfu pH OD log cfu
Substrate (S) *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
Time (T) *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
SxT *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***
Statistical significance: ***p<0,001

Figure 6 shows the bacterial growth, expressed as OD and log cfu/mL, along the seven
days of incubation of the bifidobacteria with five different substrates. A relationship between
the OD of the culture broth and the bacterial concentration expressed as cfu/mL using the
MacFarland scale was established. In general, the trend of bacterial growth followed a similar
pattern, except B. bifidum, with a exponential growth at 24 hours of incubation and then a

274
more supported growth until the seventh day of incubation. In the case of B. bifidum, was
observed a fast and exponential growth with glucose as substrate, while with SCFOS the growth
was more supported and it decreased in the last three days. With the rest of substrates a clear
growth did not appear till the second day, being lower with oligofructose and inulin. However,
with 4-GOS the bacterial growth was increasing progressively up to obtain the highest growth
at the end of the incubation (seventh day). B. breve showed an exponential growth with all
the substrates in the first 24 hours except with inulin, and it was maintained until the last day.
However, the bacterial growth observed with inulin was smaller, and from the third day it
decreased slightly. For B. infantis, the exponential growth with SCFOS and glucose was
observed, and appears in the second day. With all the substrates it was obtained a similar
growth, except for 4-GOS and inulin which was smaller. In the case of B. longum, it was
reproduced the trend of growth described previously except for inulin, which the exponential
phase of growth was very small and the growth with this substrate along the seven days was
smaller than with the other carbohydrates.
In Figure 7 it is observed the variations of pH of the culture broth throughout seven
days of incubation of four species of bifidobacteria with five substrates. In the moment of
adding the inoculum the pH of the broth was 7,00, and except for SCFOS as substrate with B.
bifidum (6,94), B. infantis (7,00) and B. longum (6,96), inulin with B. bifidum (6,78) and
glucose with B. longum (6,81), it was observed a decrease of 0,5 points in the first 24 hours. In
the case of B. bifidum, the addition of inulin to the culture broth practically did not modify the
pH, and with oligofructose the pH of the broth only dropped in 0,5 points. With the rest of
substrates the decrease of the pH was more noteworthy, standing out the case of glucose. For
B. breve, except with inulin which pH only decreased to 6,5, it was produced an important
drop in pH with values ranging between 4 and 5. The culture of B. infantis at 24 hours of
incubation with all the substrates it was obtained pH values around 4,5 except for SCFOS which
was maintained practically in 7 and with glucose pH broth decreased to 6,32. However, from
the second day all pH values were kept till the end of the study between 4,50 and 3,50. In the
case of B. longum, only glucose and 4-GOS produced a significant descent of pH at 24 hours.
Nevertheless, with inulin the pH showed the smaller values (5,0).

275
 Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium breve
2,5 3
2,5
2
OD (600 nm)

OD (600 nm)
2
1,5
1,5
1
1
0,5 0,5

0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7

Tiempo de incubacin (das) Incubation time (days)

Incubation time (days) Tiempo de incubacin (das)

Bifidobacterium infantis Bifidobacterium longum

2,5 2,5

2 2
OD (600 nm)

OD (600 nm)
1,5 1,5

1 1

0,5 0,5

0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7

Incubation time (days) Incubation time (days)

Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium breve

9,5 9,5
Bacterial growth

Bacterial growth

9 9
(log cfu/mL)

(log cfu/mL)

8,5 8,5

8 8

7,5 7,5

7 7
0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo de incubacin
Incubation (das)
time (days) Incubation
Tiempo time (days)
de incubacin (das)

Bifidobacterium infantis Bifidobacterium longum

9,5 9,5

9
Bacterial growth

Bacterial growth

9
(log cfu/mL)

(log cfu/mL)

8,5 8,5

8 8

7,5 7,5

7 7
0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7
Incubation
Tiempo time (days)
de incubacin (das) Incubation
Tiempo time (days)
de incubacin (das)

Figure 6. Graphics of the means obtained for the interaction of substrate and time of incubation,
showing bifidobacteria growth (Bifidobacterium bifidum, B. breve , B. infantis, B. longum) as changes
in OD and log cfu/mL. Glucose () and different oligosaccharides [SCFOS (), inulin ( ), oligofructose
( ) and 4-GOS (+)] were used as substrates

276
 Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium breve
7 7
6,5 6,5
6 6

pH
pH
5,5 5,5
5 5
4,5 4,5
4 4
0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7

Incubation time (days) Incubation time (days)

Bifidobacterium infantis Bifidobacterium longum

7 7
6,5 6,5
6 6
5,5 5,5

pH
pH

5 5
4,5 4,5
4 4
3,5 3,5
0 1 2 3 4 5 6 7
0 1 2 3 4 5 6 7
Incubation time (days)
Incubation time (days)

Figure 7. Graphics of the means obtained for the interaction of substrate and time of incubation, showing
pH changes in TPY broth [glucose ( ), SCFOS (), inulin ( ), oligofructose ( ) and 4-GOS (+)] using
different bifidobacteria (Bifidobacterium bifidum, B. breve, B. infantis, B. longum)

The use of the MacFarland scale has the disadvantage to be a method not very exact,
for this reason it has been displaced by spectrophotometric methods which measure the OD of
the culture, that is the absorbance (Meyer et al., 1985). Therefore, in Table 11 is shown the
final growth values (OD) of bifidobacteria and the pH of the culture broth after seven days of
incubation with five different carbohydrates. It could be established that in the seventh day of
incubation and for all bifidobacteria, the substrates 4-GOS and SCFOS were which stimulated
more strongly the bacterial growth (2,07 in B. bifidum and 2,59 in B. breve for 4-GOS and 2,22
in B. infantis and 2,03 in B. longum for SCFOS). In the other hand, inulin was the substrate
which less effect on the bacterial growth in all the cases after seven days of incubation.
Regarding to pH values of the culture broth in the seventh day of incubation, again the
substrates 4-GOS and SCFOS were which produced a higher decrease in the pH of the culture
broth, and inulin was which less dropped the pH at the end of the study. A relationship between
bacterial growth and pH decrease could be found, which is more noticeable for B. breve and B.
longum. In the other two species of bifidobacteria can not be established this relationship, due
that B. bifidum obtained a greater growth with 4-GOS and a more pronounced decrease of pH
when it was incubated with glucose and SCFOS, and B. infantis showed a higher growth with
SCFOS but however, with oligofructose and 4-GOS showed a smaller pH in the culture broth.

277
 Table 11. Values of optical density (OD) and culture broth pH at seventh day of
bifidobacteria incubation
Bifidobacterium spp. Substrate OD pH
B. bifidum glucose 1,880,001b 4,400,020e
SCFOS 0,680,002d 4,890,015d
inulin 0,340,001e 7,020,026a
oligofructose 0,770,002c 6,420,025b
4-GOS 2,070,001a 5,040,015c
B. breve glucose 2,140,001d 4,940,020b
SCFOS 2,380,001c 4,450,010c
inulin 0,570,003e 6,560,020a
oligofructose 2,390,001b 4,420,036c
4-GOS 2,590,001a 4,060,015d
B. infantis glucose 2,090,002c 4,090,020b
SCFOS 2,220,002a 3,890,083bc
inulin 1,590,012e 4,330,015a
oligofructose 2,170,004b 3,750,046c
4-GOS 1,790,017d 3,870,017c
B. longum glucose 1,700,007d 4,200,020b
SCFOS 2,030,031a 4,090,026d
inulin 0,740,002e 4,940,030a
oligofructose 1,780,002c 4,150,015c
4-GOS 1,910,010b 4,000,006e
Values are meanSE, n=3
a-e
Means with unlike superscript letter are significantly different by Tukeys test (p<0,001)

Therefore, we conclude that in general inulin was the substrate with minor
effectiveness in bifidobacteria growth and its fermentation produced a pH decrease of the
culture broth less noticeable. This fact agrees with that described by Shin et al. (2000a) who
evaluated the growth of two commercial strains of B. bifidum in fermented skim milk in the
presence of SCFOS, GOS and inulin. They observed that inulin was the less effective in bacterial
growth after 48 hours of incubation at 37 oC. The authors described that it was necessary a 5%
of inulin to observe significant differences (p<0,05) with the control. Moreover, acetic and lactic
acid production measured in the culture was smaller (p<0,05) in the strains which grew with
inulin.
Recently, Crittenden et al. (2001) evaluated in vitro the growth of B. lactis B94 with
different oligosaccharides and monosaccharides. They reported that B. lactis B94 growth better
in the presence of FOS, GOS and xylooligosaccharides (XOS) than with their monosaccharide
moieties fructose, galactose and xylose, showing a growth values measured as OD at 600 nm in
decreasing order: glucose (1,9) > GOS (1,6) > SCFOS (1,2) > oligofructose (1,0) > inulin (0,7).
Our data showed a similar trend to that described by Crittenden et al., with 4-GOS and SCFOS
as the substrates exhibiting the higher bacterial growth along the seven days of incubation with
any of the bifidobacteria tested. A possible explanation for the differences found in the
carbohydrate fermentation is the degree of polymerization (DP). Therefore, while inulin has the
higher DP (between 10 and 60), SCFOS and 4-GOS have smaller DP (2-3 and 3-5,
respectively). It has been described by in vitro fermentation of inulin and derived products of its
hydrolysis by faecal human bacteria, that the molecules with a DP < 10 are fermented twice
faster than those with a DP > 10 (Roberfroid et al. 1998). This phenomena has been observed

278
also in bifidobacteria by some authors (Gibson and Wang, 1994a; Hopkins et al., 1998; Bielecka
et al. 2002). Moreover, it have been suggested that these microorganisms have mechanisms of
transport for specific substrates, which are more efficient in OND transport than for simple
sugars. However, in our study the fermentation of glucose leaded to a higher bacterial growth
than inulin with the four species of bifidobacteria. In a study of in vitro fermentation using a
range of monosaccharides (arabinose, xylose, mannose, galactose and glucose), the higher
growth rates were reached with the two last sugars. B. longum, B. bifidum and B. infantis
preferred glucose as substrate, while B. breve showed a greater growth with galactose (Degnan
and Macfarlane, 1991).
With regard to the acidification of the culture broth, B. breve and B. longum showed
the most acidic pH in the presence of 4-GOS after seven days of incubation. B. infantis, was
the specie with the lowest values of pH in presence any of the substrates used.
In a synthetic media, bifidobacteria produce 3 mol of acetic acid and 2 mol of lactic acid
from 2 mol of glucose (Scardovi and Trovatelli, 1965). Although we did not measure the acids
produced in the broth after the fermentation of the carbohydrates, it could be mentioned that
bifidobacteria produced the greatest amount of these acids in the presence of 4-GOS which are
the characteristic metabolites produced during the anaerobic fermentation of carbohydrates.
The values of pH obtained in the present study could be considered low comparing to other
studies, however some authors have found similar values. Then, Dubey and Mistry (1996)
evaluated the growth of four bifidobacteria (B. bifidum, B. breve, B. infantis and B. longum) in
three infant formula during 24 hours. B. bifidum and B. breve showed the lowest pH (4,1 and
4,0, respectively) with an infant formulas based on hydrolyzed casein. In our study the lowest
pH values in presence of 4-GOS at 24 hours of incubation were found with B. breve and B.
longum (4,08 and 4,16, respectively) to conclude with values of 4,06 and 4,00 respectively, at
seventh day. However, Ustunol and Gandhi (2001) evaluated the growth of two strains of B.
bifidum in reconstituted nonfat dry milk containing 5% honey (oligosaccharides make up 4 to
5% of its composition), sucrose, fructose or glucose during 48 hours. pH values were 3,61 with
honey and 3,67 with glucose at 48 hours of incubation. This low pH found with honey was as a
consequence of a higher concentration of acetic and lactic acid when this substrate was used.
In our study, B. bifidum obtained the lowest pH (4,46) in presence of glucose at 48 hours, while
with the remaining substrates pH did not decrease below 5. In other study with longer
incubation, Marx et al. (2000) described that the growth of B. breve and B. longum reached its
higher level after 20-25 hours of incubation in the presence of -(2,6)-FOS, and it remained
constant till the fifth day of incubation. During growing pH values of the media decreased,
mainly due to the organic acids production. Initial pH was 6,5 and it decreased to 5,0 with B.
breve, and 5,3 with B. longum at 24 hours and it was maintained practically stable until the end
of the study. As it was described previously, in our study the phase of higher bacterial growth

279
and broth acidification it was produced in the first 24 hours, and both remained constant during
the rest of the study.
The lower pH values found with B. breve and B. infantis when they were grown in the
culture broth containing 4-GOS with respect to SCFOS and inulin also it was described by
Kajiwara et al. (2002) after incubating these two bifidobacteria in the presence of 5% GOS,
SCFOS and inulin during 48 hours. For both bifidobacteria this fact was due to the greatest
lactic acid production.
Rycroft et al. (2001) evaluated the in vitro fermentation of different oligosaccharides by
bifidobacteria during 24 hours, and they reported that the oligosaccharides containing galactose
(lactulose, GOS and soybean-oligosaccharides (SOS)) were more effective than those containing
fructose (oligofructose and inulina) in enhancing bifidobacteria growth. Moreover, the authors
concluded that isomalto-oligosaccharides (IMO) and GOS appeared to be effective prebiotics as
they increased numbers of bifidobacteria with little effect on the other bacterial groups
(clostridia, bacteroides, lactobacilli, streptococci and E. coli), increasing significantly lactic acid
production and produced the lowest gas volumes. This fact was also observed by Djouzi and
Andrieux (1997) in a study using rats inoculated with a human faecal flora, where GOS increased
bifidobacteria populations to a greater extent than FOS.
From the results of the present study we may affirm that of the substrates used, 4-GOS
was that which stimulated more intensively the in vitro the growth of the bifidobacteria often
found in infant faeces. B. breve and B. bifidum were the two species with higher growth rates in
the presence of 4-GOS, while B. breve and B. longum showed the lower pH values in the culture
broth when they were grown with the substrate selected as prebiotic (4-GOS).
With the results obtained in this first study, the next step was to use a commercial infant
formula for elaborating different diets with the probiotics and prebiotics previously selected.
Because of the elaboration of a probiotic infant formula will suppose to have a very strict
anaerobic and asepsia conditions in the moment of adding of the probiotic bacteria, we decided
to select the commercial probiotic infant formula containing the strains selected in the first
study. Therefore, it was selected a probiotic infant formula containing B. bifidum and B. longum,
two of the species more often isolated in breast-fed infants (Mitsuoka, 1982; Rasic and
Kurmann, 1983), and an infant formula without bifidobacteria to use it as the base of the
probiotic formula. For elaborating the prebiotic infant formulas, it was used the same commercial
infant formula to that different concentrations of 4-GOS were added. Furthermore, adding the
prebiotic selected to the probiotic infant formula was elaborated the synbiotic infant formula.

280
2nd STUDY

Based on the results obtained in the first study, it was selected a commercial probiotic
infant formula containing B. bifidum and B. longum because they were two of the species with
the best in vitro growth rates in the presence of the NDO (4-GOS) proposed as prebiotic in the
previous study. The aim of the second study was evaluate the viability of the bifidobacteria
present in the probiotic infant formula during the time of consumption, according to the
manufacturer conditions. Depending on infant age this period of time range between six and
fourteen days.

1. Viability of bifidobacteria in commercial powder infant formula

Some studies (Klaver et al., 1993; Dave and Shah, 1997) have shown that bifidobacteria
grow poorly in milk and do not survive well in the final product. Maintaining viability of
bifidobacteria in milk and in fermented dairy foods has been a challenge to the dairy
manufacturers because the bacteria requires low oxidation reduction potential for growth
(Shimamura et al., 1992) and it is sensitive to low pH, conditions not occurring naturally in
fermented milk. The organism also requires specific growth factors (Klaver et al., 1993; Modler,
1994). However, various researches have reported on the viability of bifidobacteria in dairy
products, such as fermented milk (Medina and Jordano, 1994), cheese (Roy et al., 1997), frozen
fermented desserts (Laroia and Martin, 1991), ice-cream (Hekmat and McMahon, 1992) and
yogurt (Shah et al., 1995).
To provide health benefits, the recommended rules for probiotic bacteria are to be
viable in the product and be ingested in numbers 106 cfu/g (Kurmann and Rasic, 1991). In
Japan, the Fermented Milks and Lactic Acid Beverages Association has already established a
standard that requires 107 viable bifidobacteria/mL to be present in dairy products that claim
to contain bifidobacteria (Ishibashi and Shimamura, 1993). The Swiss Food Regulation as well
as the International Standard of FIL/IDF requires that such products contain 106 cfu/g of
bifidobacteria (Shin et al., 2000b).
The main factors claimed to promote loss of viability of probiotic bacteria in dairy
products include the decrease pH of the medium and the accumulation of organic acids as a
result of bacterial growth and fermentation of the substrates available in the dairy product (Shah
and Jelen, 1990). Moreover, because of bifidobacteria is an anaerobic specie, a rapid decline in
their numbers in food might due to the dissolved oxygen, to its derivatives hydrogen peroxide,
superoxide and hydroxyl radicals (Carlsson et al., 1978), and oxygen permeation through the
package. The availability of growth factors also affects the viability of probiotic strains in dairy
products (Shah, 2000).

281
 In Table 12 is shown the one-way ANOVA of the count of bifidobacteria, pH and
moisture of probiotic infant formula in the studies of six and fourteen days, which display the
minimum and maximum periods of consumption of the formula by infants. In all the cases,
except moisture in the study of six days, there were significant differences (p<0,01) along the
time in variables studied, not producing a loss in the minimum effective dose of bifidobacteria in
the product, as it is shown in the two following Figures (8 and 9).

Table 12. One-way ANOVA of the count of bifidobacteria in the infant formulas during
the period of consumption by infants (6 and 14 days)
Viability in 6 days Viability in 14 days
log cfu ** ***
pH *** ***
Moisture NS **
Statistical significance: **p<0,01; ***p<0,001; NS=not significant

Figures 8 and 9 show the evolution of the number of bifidobacteria in the probiotic
infant formula (PIF) in both six and fourteen days studies The infant formula used as base for
elaborating the probiotic infant formula and therefore, it does not have bifidobacteria in its
composition was used as control infant formula (CIF). The results obtained with CIF are not
shown because no bacteria was detected during the fourteen days of the study.

8 Bifidobacteria Moisture 4

*
7,5 3
Moisture (%)
Log cfu/g

7 2

6,5 1

6 0
1 2 3 4 5 6
Time (days)

Figure 8. Viability of bifidobacteria in infant formula and moisture during time of

consumption (6 days).
* Asterisks in the bars show significant differences (p<0,05) by bilateral separate means test in
viability of bifidobacteria (log cfu/g) at days 2 to 6 with respect to 1st day

In the first study (Figure 8) samples from PIF were taken during six consecutive days.
Initial counts showed a value of 7,59 log cfu/g of sample with no significant differences (p<0,05)
respect to the counts recorded in the first five days of study. At the sixth day, the counts
decreased significantly (p<0,05) to 7,10 log cfu/g of sample, but remaining above the minimum
recommended dose (106 cfu/g) to receive the health benefits of these organisms.

282
 8 Bifidobacteria Moisture 4
* * * * * * * * * *
7,5 3

Moisture (%)
Log cfu/g

7 2

6,5 1

6 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time (days)

Figure 9. Viability of bifidobacteria in infant formula and moisture during time of consumption (14
days).
* Asterisks in the bars show significant differences (p<0,05) by bilateral separate means test in viability of
bifidobacteria (log cfu/g) at days 2 to 14 with respect to 1st day

In the second study (Figure 9), initial counts of bifidobacteria were higher (7,88 log
cfu/g of sample) than the previous study, and the counts remained with no significant
differences (p<0,05) until the fourth day of study. The following days the counts were
significantly (p<0,05) lower than those found in the four first days, decreasing down to 7,19 log
cfu/g of sample in the last day of the study. As in the previous study, the count remained above
the minimum recommended dose in the last day, being higher in this second study probably
because initial counts also were higher than in the previous study (six days).
In both studies, the moisture of the samples was determined to check that if a decrease
in the number of bifidobacteria was not due to an increase in the water content of the infant
formula during the time which the can was opened. None of both studies showed an important
increase in moisture content, ranged always between 2,70 and 3,33% for the longest
investigation.
Another factor reported to affect the viability of bifidobacteria is the pH of the product
containing the probiotic bacteria. Therefore, this parameter was measured in the samples used
in the microbiological analyses in both studies. The pH of the product ranged between 7,06 in
the first day to 6,74 in the fourteen day of study. These values are above those mentioned in
other studies for affecting the viability of bifidobacteria in dairy products, specially in fermented
milk.
To complete the experiment, we calculated the percentage of viability of bifidobacteria in
both studies by relating the final count (6th and 14th day) with the initial count (1st day) of each
study. The results showed 32,19% of viability in the study of six days, and 25,55% in the study
of fourteen days.

283
 Many studies found in the scientific bibliography about viability of bifidobacteria in dairy
products are reported to yogurts or fermented milk stored in refrigeration during various weeks.
In some of these studies (Yaguchi, 1984; Reuter 1990; Hughes and Hoover, 1995) have been
observed a more intensive loss of bacterial viability in fermented milk than in unfermented milk,
remaining counts of bifidobacteria >106 cfu/mL after 15 days of storage and after 28 days in the
latter. In other works have been described a decrease in viability up to 82% of B. infantis in skim
milk with at pH 4,3 (Lankaputhra et al., 1996). In our study, viability of bifidobacteria remained
above the recommended dose during fourteen days due milk pH never was under 6,74. Similar
results were reported by Shin et al. (2000b) in two unfermented milk containing bifidobacteria
and stored at 4 oC, with pH values of 6,6 or higher in both milks.
We used B. bifidum and B. longum as probiotic organisms based on the results obtained
in the first experiment. In the present study the viability of bifidobacteria in a powder infant
formula during fourteen days has been demonstrated. Although there are few studies comparing
the capacity of different species of Bifidobacterum to remain viable in the products which are
added, B. bifidum was slightly more stable than B. breve both in fermented and unfermented
milk sold in Japan (Reuter, 1990). It have been also described to enhance viability of B. bifidum
in skim fermented milk the supplementation with 5% SCFOS or GOS, showing 67,3 and 52,2%
of viability, respectively, while the value was 11,6% in control milk (Shin et al. 2000a).
Although the percentage of viability of bifidobacteria found in our study was not enough
high, it remained always above the recommended dose. This fact might be due to the
advantages of the powdered infant formula respect to other dairy products, as well as its
storage at room temperature, package in protect atmosphere, low moisture, pH stability and
the use of material not permeable to oxygen for packing. An example of important loss of
viability of bifidobacteria has been described when adding to yogurts packed in plastic
containers comparing to those packed in glass bottles (Dave and Shah, 1997).

2. Composition of the faecal microflora in control or probiotic infant formula fed

infants during the first year of life

Once tested the viability of the bifidobacteria contained in the probiotic infant formula
with counts above the recommended level (106 cfu/g) during the fourteen days of
consumption of the product, the next step was to evaluate the composition of faecal infant flora
during the first year of life according to the diet composed by a probiotic infant formula (PIF). A
group of infants were fed with PIF, while as control another group of infants was fed with the
formula used as base for elaborating the PIF but with no bifidobacteria (control infant formula
or CIF). Table 5 showed in Material and methods section (page 256), displays the infants feed
schedule followed with the five babies studied.

284
 The composition of the resident microflora in the infant gastrointestinal tract (GT) have
been widely determined using standard culture techniques and phenotypic characterizations
(based in colony morphology and determined biochemical markers such as enzymatic activities
and final products of the metabolism). Nevertheless, these traditional culture methods only can
show a part of the great microbial diversity present in the infant colon since they are only
applicable to cultivable bacteria and frequently the media choose are not selective for the
bacterial specie or genus required (Silvi et al., 1996; Hartemink and Rombouts, 1999).
In the last years, molecular biology techniques are been used successfully to study the
GT microflora. In prokaryotes the comparative analysis of ribosomic RNA (rRNA), especially of
the genes 16S and 23S rRNA, have been used in the identification of bacteria from the level of
genus to specie or strain (Langendijk et al., 1995). In particular, the polymerase chain reaction
(PCR) using the primers 16S rRNA have been applied successfully in the detection and
quantification of predominant anaerobes in the faeces of infants and adults (Wang et al., 1996),
as well as the pursuit of Bifidobacterium as probiotic in faeces of instant infant formula fed
infants containing this strain (Kok et al., 1996b).
The present study was carried out with traditional culture techniques since the number
of organisms to investigate was reduced, as well as the culture media used for plate counts are
sufficiently accepted by the scientific bibliography as suitable for the bacteria investigated: total
anaerobes, bacteroides, bifidobacteria and clostridia.
In Table 13 is shown the one-way ANOVA of the microbiological counts and faecal pH
of the two infants fed with CIF and the three fed with PIF during the first year of life. In all
cases, the differences were statistically significant (p<0,001) due that feeding during the first
year of life of infants affected significantly faecal counts, and this, consequently in the final
values of faecal pH due to the organic acids production.

Table 13. One-way ANOVA for the number of microorganisms and pH of faeces in control or
probiotic formula fed infants during the first year of life
Baby 1 Baby 2 Baby 3 Baby 4 Baby 5
Total anaerobes *** *** *** *** ***
Bacteroides *** *** *** *** ***
Bifidobacterium *** *** *** *** ***
Clostridium *** *** *** *** ***
pH *** *** *** *** ***
Statistical significance: ***p<0,001

Table 14 shows the counts, expressed as log cfu/g faeces, of total anaerobes,
bacteroides, bifidobacteria and clostridia of the five infants during the first year of life. As it is
recommended (ESPGAN, 1981), PIF was not administered until the age of four months. The
two first counts showed lower bacteroides (except baby 5 in the first month) and clostridia
(except in the third month) in PIF than in CIF fed infants, although all infants were fed with
human milk or initial infant formula. The count of bifidobacteria in this period was very similar
among all infants. In baby 1 the counts of bifidobacteria and clostridia remained without

285
changes along time, while count of bacteroides decreased significantly (p<0,05). The numbers
of bacteroides and clostridia in baby 2, fed with CIF, did not show any clear trend throughout
time. However, the count of bifidobacteria decreased significantly (p<0,05) with the age (from
7,12 log cfu/g at first month of age to 6,62 log cfu/g at first year of age). Among PIF fed
infants, the count of bacteroides did not show significant (p<0,05) changes in baby 3 (from
6,71 log cfu/g at first month of age to 6,84 log cfu/g first year of age), increasing significantly
(p<0,05) until the ninth month in baby 4 (7,35 log cfu/g) or seventh month in baby 5 (7,90 log
cfu/g), and afterwards decreasing significantly (p<0,05). Regarding to clostridia, a significant
(p<0,05) increase was produced in the seventh month in baby 1 (6,10 log cfu/g), in the twelfth
month in baby 4 (7,68 log cfu/g), and decreased significantly (p<0,05) at the end in baby 5
(4,81 log cfu/g). Bifidobacteria showed a clear trend to decrease with the age in CIF fed babies.
Among PIF fed infants, babies 3 and 4 increased the counts in the seventh month (6,94 and
8,14 log cfu/g, respectively), although in baby 4 bifidobacteria count decreased significantly
(p<0,05) at the end of the study (6,12 log cfu/g). Baby 5 showed a significant (p<0,05)
recovery of the number of bifidobacterias at fifth month (8,84 log cfu/g) but decreased (8,12
log cfu) significantly (p<0,05) at seventh month.

Table 14. Number of microorganisms in infant feces during the first year of life
Type of formula Age of babies (in months)
Microorganism 1 3 5 7 9 12
Control (baby 1)
Total anaerobes 7,760,043ab 8,460,003a 6,600,41 d 7,950,029ab 6,750,10 cd 7,480,00 bc
ab
Bacteroides 7,240,043 7,360,052 7,160,046bc
a
7,170,035bc 7,050,02 c 6,450,017d
a
Bifidobacterium 7,250,043 5,830,17 bc 5,430,20 c 6,740,029a 5,660,031bc 6,110,009b
Clostridium 6,440,22 ab 6,450,037ab 6,790,009a 6,040,023b 3,840,068c 6,800,27 a
Control (baby 2)
Total anaerobes 9,120,026a 8,770,0145 b 8,770,043b 7,580,137c 7,480,00 c 7,010,038d
Bacteroides 6,910,433ab 7,710,12 a 5,780,00 c 7,060,128ab 7,280,069ab 6,570,029bc
Bifidobacterium 7,120,084b 7,650,029a 7,060,022b 7,210,04 b 7,260,047b 6,620,081c
Clostridium 6,720,014a 3,480,00 d 6,630,182a 6,210,023b 5,190,032c 5,860,049b
Probiotic (baby 3)
Total anaerobes 8,470,087a 6,940,121bc 7,190,12 bc 7,310,12 b 6,700,136c 7,320,008b
Bacteroides 6,710,08 a 6,570,097a 6,710,037a 6,520,159a 5,780,00 b 6,840,082a
Bifidobacterium 8,200,00 a 6,050,003d 5,650,173e 6,940,114c 7,540,00 b 7,320,117b
Clostridium 5,940,227a 5,400,046bc 5,370,032c 6,100,003a 5,930,012a 5,870,072ab
Probiotic (baby 4)
Total anaerobes 7,640,45 ab 6,710,08 b 8,490,055a 8,250,014a 7,910,16 6,750,166b
Bacteroides 5,570,108b 5,520,24 b
4,470,00 c 6,710,058a 7,350,265a 5,780,00 b
Bifidobacterium 8,820,133a 7,650,323 b
7,580,108b 8,140,057ab 8,140,185ab 6,120,2c
Clostridium 4,600,075d 5,370,127 cd
6,050,061bc 6,140,17 bc 6,410,18 b 7,680,067a
Probiotic (baby 5)
Total anaerobes 7,910,274bc 7,640,142bc 8,860,075a 8,220,081ab 8,200,091ab 7,360,096c
Bacteroides 7,510,23 ab 5,120,026c 7,900,029a 7,900,029a 7,400,00 b 7,280,058b
Bifidobacterium 7,850,267bc 6,760,017d 8,840,026a 8,120,064b 7,850,13 bc 7,380,05 c
Clostridium 5,030,156abc 5,470,023a 5,240,043ab 4,710,037c 5,350,15 a 4,810,11 bc
Values are mean log cfu /g of wet fecesSE, n=3
a-e
Means with unlike superscript letter in the same row for each baby are significantly different by Tukeys test (p<0,001)

In summary, Table 33 data showed no homogeneity in bacteroides and clostridia counts

in all babies. With regard to bifidobacteria numbers, it decreased in fed CIF infants with age,

286
but a recovery was observed after PIF administration although their counts decreased at the
end of the study.
The counts obtained from the different organisms at first and third month of life agree
with those found in other studies with infant formula fed infants (Lundequist et al., 1985;
Kleessen et al., 1995) or human milk fed infants (Lundequist et al., 1985; Kleessen et al., 1995;
Orrhage and Nord, 1999). There are very few studies of the infant flora composition further
than five months of age. Clostridia counts have been reported to range from 4 to 5,5 and 5,8
log cfu/g of faeces in human milk fed infants at six and twelve months of age, respectively
(Orrhage and Nord, (1999). These counts are in agreement with our results, as well as those
obtained with bacteroides and bifidobacteria at the first year of life (7 and 7,3 log cfu/g,
respectively).
Table 15 shows pH values measured in the faecal samples of the five babies of the
study. The general trend was an increase of faecal pH through the age of infants. In fact, four
of the five infants (babies 1, 2, 4 and 5) showed the highest value of pH in the sample
corresponding to the first year of life. The lowest pH values were showed during the first three
months of age in all babies except in baby 4.
Some studies have reported that breast-fed infants faeces have a lower pH than bottle-
fed infant faeces (Balmer et al., 1989; Kleessen et al., 1995; Langhendries et al., 1995). The
high lactose content and the low protein and phosphates contents in human milk have been
suggested as bifidogenic factors (Yoshioka et al., 1983). Moreover, the low buffer capacity of
human milk favours bifidobacteria growth since lactose fermentation keep intestinal acidity by
acetic and lactic acids (Yoshioka et al., 1983). In our study, babies 1 and 5 showed a
significantly (p<0,001) more reduced pH in the first sample due both were fed only with human
milk during the first month. Langhendries et al. (1995) also found at first month of life that
human milk fed infants showed a significantly (p<0,05) lower pH (5,07) than whey-adapted
infant formula fed infants (5,52), but no differences were found with faeces pH of formula
containing B. bifidum fed infants (5,30), being bifidobacteria the predominant anaerobe flora in
both breast-fed and probiotic formula fed infants. Kleessen et al. (1995) described pH values
more similar to ours in a group of infants fed with human milk or whey based infant formula at
first month (6,22 and 6,99, respectively) and third month (5,82 and 7,22, respectively) of age.

Table 15. pH values of infant faeces during the first year of life
Age of babies (in months)
Type of formula
1 3 5 7 9 12
Control (baby 1) 5,480,07 e 7,070,05 b 6,390,03 d 6,780,01 c 7,000,01 b 7,400,009a
Control (baby 2) 6,430,07 d 6,230,01 e 6,930,02 c 7,280,02 b 7,490,03 a 7,580,01 a
Probiotic (baby 3) 6,960,03 d 7,150,01 c 6,340,03 e 7,870,01 a 7,720,01 b 7,210,02 c
Probiotic (baby 4) 6,710,006b 5,980,003d 6,720,007 6,390,006c 5,720,003e
b
7,640,006a
Probiotic (baby 5) 5,580,05 e 7,180,005b 6,920,02 c 6,280,009d 7,180,01 b 8,020,009a
Values are meanSE, n=3
a-e
Means with unlike superscript letter in the same row are significantly different by Tukeys test (p<0,001)

287
 In Table 16 is shown the one-way ANOVA of the microbiological counts found in CIF
(babies 1 and 2) and PIF (babies 3, 4 and 5) fed babies during the first year of life. Bacterial
counts displayed a great variability until third month due possibly that infant colonization is
influenced by some factors such as intestinal and vaginal mothers flora, type of delivery
(vaginal or caesarian) and type of lactation (breast or bottle-feeding) (Lundequist et al., 1985).
With regard to the type of delivery, specially important are the environmental conditions in
maternity rooms and hygiene of medical and nursery staffs hands during delivery (Lundequist
et al., 1985; Grnlund et al., 1999). From the fifth month only significant differences (p<0,001)
in clostridia counts were detected. This fact coincides with the beginning of PIF and
complementary feeding that makes similar the microbiological profile between breast-fed or
bottle-fed infants (Stark and Lee, 1982). Therefore, total anaerobes, bacteriodes and clostridia
counts remain with no differences (except at ninth month) between both groups until the first
year of age. At seventh and ninth month of age differences between PIF fed or CIF fed infant
groups in bifidobacteria counts are exhibited. This difference is showed in Figure 10 where
bifidobacteria count at seventh and ninth month was significantly (p<0,05) higher in PIF fed
group. Also a significant (p<0,01) higher number of bifidobacteria at first month of age in PIF
fed group was observed due to the effect of mother milk at this age. Finally, Table 16 shows
the similarity in all bacteriological counts in PIF fed or CIF fed infant groups at first year of life,
possibly due to the great diversity of food that infant had at this age, and because the amount
of PIF fed was reduced comparing to the other foods, might develop a intestinal flora with a
wider bacterial species (Stark and Lee, 1982).

Table 16. One-way ANOVA for the number of microorganisms of faeces between control or probiotic
formula fed infants during the first year of life
Age of babies (in months)
Bacteria
1 3 5 7 9 12
Total anaerobes NS *** NS NS NS NS
Bacteroides NS *** NS NS NS NS
Bifidobacterium ** NS NS * *** NS
Clostridium *** NS *** NS *** NS
Statistical significance: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; NS=not significant

288
 9 control probiotic

Number of bifidobacteria
* *
8

(log cfu/g faeces)

7

4
1 3 5 7 9 12
Age (months)

Figure 10. Number of bifidobacteria in feces of infant fed control or probiotic formula during the first
year of life
* Asterisks in the bars show significant differences (p<0,05) by bilateral separate means test in viability of
bifidobacteria (log cfu/g) at months 3 to 12 between both groups

Figure 11 shows pH values of faecal samples of PIF fed and CIF fed groups. Previously
have been described that various studies reported a lower pH in breast-fed infants and probiotic
infant formula-fed infants than infant formula-fed infants (Langhendries et al., 1995). As it is
shown in Figure 11, pH faecal samples in our study did not display significant differences
(p<0,05) at any age. However, at seventh and ninth month of age pH values were lower in PIF
fed group than those in CIF group, moreover bifidobacteria count in the same group at these
ages was significantly (p<0,05) higher than CIF fed group.

8 control probiotic

7,5

6,5
pH

5,5

4,5

4
1 3 5 7 9 12
Age (months)
Figure 11. pH in faeces of infant fed control or probiotic formula during the first year of
life

289
 The colonies grown in Raffinose Bifidobacterium (RB) medium were gram positive
stained and showed with pleomorphic morphology under optical microscope. These colonies
were afterwards isolated and incubated for carbohydrate fermentation pattern using the
enzymatic test API 50CHL which is shown in Table 17. In all samples the carbohydrate
fermentation pattern was very similar, therefore we cannot affirm that probiotic bacteria affects
faecal bifidobacteria. Moreover, almost all colonies were not able to ferment raffinose, which it
was the carbon source used in RB medium. Moreno et al. (2000) neither found the enzymatic
test API 50CHL as reproducible at 100% for the identification of bifidobacteria in dairy products,
although other researchers consider suitable this enzymatic test (Shin et al., 2000b).
It might be concluded that B. bifidum and B. longum used as probiotics in infant
formula showed counts above 106 cfu/g during the fourteen days of consumption of the
product. However, when the PIF was administered to infants from the fourth to the twelfth
month of age, only bifidobacteria count was significantly (p<0,05) higher than CIF fed group at
seventh and ninth month. At fifth month there were not differences probably because it was
very soon to see any effect, and at twelfth month because the ratio of the PIF to the total
feeding at this age was very lack. Moreover, the carbohydrate fermentation pattern (api 50
CHL) showed by faecal bifidobacteria did not show any change in its composition after PIF
feeding.

290
 291

49. 5-keto-gluconate
48. 2-keto-gluconate
47. Gluconate
46. L-Arabitol
45. D-Arabitol
44. L-Fucose
43. D-Fucose
42. D-Tagatose
41. D-Lyxose
40. D-Turanose
39. 2-Gentiobiose
38. Xylitol
37. Glycogen
36. Starch
35. D-Raffinose
34. Melezitose
33. Inulin
32. Trehalose
31. Sucrose
30. Melibiose
api 50 CHL

29. Lactose
28. Maltose
27. Cellobiose
26. Salicin
25. Esculine
24. Arbutine
23. Amygdaline
22. N Acetyl glucosamine
21. 1-Methyl-D -glucoside
20. 1-Methyl-D -mannoside
19. Sorbitol
18. Mannitol
17. Inositol
16. Dulcitol
15. Rhamnose
14. L-Sorbose
13. D-Mannose
12. D-Fructose
11. D-Glucose
10. Galactose
9. 2-Methyl-xyloside
8. Adonitol
7.L-Xylose
6. D-Xylose
5. Ribose
4. L-Arabinose
3. D-Arabinose
2. Erythritol
1. Glycerol

1.12

2.12

3.12

4.12

5.12
1.1
1.3
1.5
1.7
1.9

2.1
2.3
2.5
2.7
2.9

3.1
3.3
3.5
3.7
3.9

4.1
4.3
4.5
4.7
4.9

5.1
5.3
5.5
5.7
5.9
Sample
Table 17. Pattern of fermentation of bifidobacteria isolated in the infant faecal samples using the api 50CH kit. Results are show n by baby (1, 2, 3, 4 and 5)
and period of sampling (1, 3, 5, 7, 9 and 12).

292
3r d STUDY

In vivo study of the effect of follow-up infant formulas containing probiotics,

prebiotics and synbiotics on mineral absorption in rats

Studies in babies are very limited because of ethical and methodological reasons, for
these motives in vitro tests, which mimic physiological conditions of the organism purpose of
the study are very useful. One alternative are in vivo studies using pup rats as a animal infant
model for the evaluation of mineral availability in infant formula (Lnnerdal et al., 1993, 1994).
In the present work, animals were separated from their dams at three weeks old because they
are already feeding on milk and are a better model than adult rats. Sarri et al. (2001) reported
that it is reasonable to use pup rats with a milk diet and presumably have a gastrointestinal
physiology more similar to that of human infants.

1. Effect on physiological measurements and growth ratio of rats

Table 18 shows the one-way ANOVA of the parameters measured in rats to evaluate
the growth of the animals, such as final body weight, weight gain, food intake and food
efficiency which were all of them affected by the consumption of the different diets.

Table 18. Effect of initial body weight on the variation of final body weight, weight
gain, food intake and food efficiency due to the diets subjected of the study, and
study of the effect of initial body weight on the variation of these parameters
MANCOVA
ANOVA
co-variable: initial body weight
Final body weight *** ***
Weight gain *** NS
Food intake *** **
Food efficiency *** NS
Statistical significance: **p<0,01; ***p<0,001; NS=not significance

Although results obtained from the first group (fed with AO4 diet) are showed, for
discussing the results and statistical analysis of the data we did not use them. This group was
used as a reference to monitor the growth of the rest of groups fed with infant formulas.
In Table 19 are shown the parameters related with the growth and feed efficiency of
the rats fed nine experimental diets. Initial body weight was significantly different (p<0,05)
among the nine groups. The groups with higher initial weight were those fed AO4 and control
diets (89,37 and 72,67 g, respectively), ranging for the rest groups between 36,32 and 55,93 g
(groups fed synbiotic 1,2 and 10% diets, respectively). At the end of the study groups fed AO4
and control diets displayed also the higher final body weights (321,77 and 217,40 g,
respectively), while group fed synbiotic 1,2% diet showed the lower final weight (81, 30 g).
Weight gain and food intake parameters were significantly (p<0,05) higher in group fed AO4

293
diet (232,40 and 695,12 g, respectively) comparing with groups fed control and problem diets
(probiotic, prebiotics and synbiotics diets). The only group with no differences respect to control
group (144,73 and 298,53 g, respectively) was that fed prebiotic 5% diet (130,08 and 262,98
g, respectively), and again the groups with the significant (p<0,05) lower values were those fed
synbiotic 1,2% (81,30 and 175,21 g, respectively) and 5% diets (90,77 and 206,28 g,
respectively).
Using weight gain and total food intake values during 30 days of study, we calculated
food efficiency to evidence a possible less profit of the food in the groups with lower initial body
weight. However, all groups fed infant formula showed a higher feed efficiency (0,44) than
first group (0,33). This fact indicates that no group fed infant formula suffered a delay in
growing or nutritional need during the study, moreover this manifest that protein quality of
diets containing infant formula was higher than in AO4 diet.

Table 19. Body weight and food intake of rats administered the diets for 30 days
Initial body Final body Weight gain Food intake Food
Diets
weight (g) weight (g) (g) (g) efficiency
AO4 89,370,54a 321,777,27 a 232,407,09 a 695,1212,04a 0,330,01 c
Control 72,672,50b 217,408,44 b 144,736,35 b 298,5312,70b 0,480,01 ab
Probiotic 42,680,83d 154,882,53 de 112,202,15 ce 223,366,46 d 0,500,02 a
Prebiotic 1,2% 42,771,22d 164,173,38 ce 121,402,67 cd 239,295,48 cd 0,510,01 a
Prebiotic 5% 52,020,63c 182,102,72 c 130,082,49 bc 262,982,99 bc 0,490,01 a
Prebiotic 10% 55,730,52c 176,054,12 cd 120,324,11 cd 255,625,20 cd 0,470,01 ab
Synbiotic 1,2% 36,322,57e 117,625,23 f 81,304,75g 175,216,25 f 0,460,01 ab
Synbiotic 5% 51,930,36c 142,703,57 e 90,773,54fg 206,287,67 ef 0,440,01 b
Synbiotic 10% 55,930,99c 165,084,76 ce 109,154,50 def 234,158,29 cde 0,460,01 ab
Values are meanSE, n=6
a-g
Means with unlike superscript letter in the same column are significantly different by Tukeys test (p<0,05)

To validate the results obtained and to achieve trustworthy conclusions when

comparing the results of the different groups, a multivariate co-variance was developed using
initial body weight as co-variable because the study started with groups showing different
weights. This study is shown in Table 18, and were not differences for weight gain and food
efficiency when initial body weight was used as co-variable. Therefore, the influence of this
parameter on the others is controlled.
Food efficiency values found in our study are similar to those showed in other studies
(food efficiency of 44) carried out in rats four-five weeks old fed diets supplemented with 5 and
10% GOS during ten and seven days (Chonan and Watanuki, 1995; Chonan and Takahashi,
1999).
Table 20 shows the physiological measurements of animals during the three periods of
mineral balance. In the previous table could be observed that the two problem groups with
higher initial weight were those fed prebiotic and synbiotic 5 and 10% (from 51,93 to 55,93 g).
However, Table 20 displays that in the first period (8-10 days), group fed synbiotic 5% showed
a significant (p<0,05) lower weight (74,93 g) if compared with the other three groups (fed
prebiotics 5 and 10% and synbiotic 10%). In the second (18-20 days) and third periods (28-30

294
days) the groups with the higher body weight were those fed prebiotic 5 and 10% diets (121,65
and 118,47 g; 177,09 and 170,78 g, respectively). On the other hand, until the end of the study
the group fed synbiotic 1,2% diet showed the lowest body weight (from 36,32 g to 113,57 g).
Regarding to food intake, in the first period, except the group fed synbiotic 1,2% diet
(4,67 g/day), no group displayed significant differences (p<0,05) with control group (6,05
g/day). In the second period, all group exhibited a significantly (p<0,05) lower food intake
respect to control group (10,42 g/day). In the third period, only groups fed prebiotic 5 and 10%
diets (12,59 and 12,73 g/day, respectively) did not show differences to control group (13,07
g/day).
The consumption of 4-GOS is affected by the food intake. Thus, groups fed prebiotic
and synbiotic diets at 1,2 and 5% concentrations, 4-GOS intake was lower in groups fed
synbiotic diets than in those fed prebiotic diets, since to the lower food intake in the rats fed
synbiotic diets. However, groups fed prebiotic and synbiotic 10% diets showed the same 4-GOS
intake during the three periods.
In general groups fed prebiotic and synbiotic 10% diets showed the higher water intake
and urine excretion among the problem groups in the three periods of the study.
The faecal volume (expressed as fresh weight) in rats fed AO4 diet was higher in the
three periods (twelve, eight and six times higher, respectively) in regard to those fed infant
formula diets. Moreover, during the three periods of mineral balance no group fed problem
diets showed a significant (p<0,05) higher faecal volume than group fed control diet.
Finally, Table 20 shows the moisture of the faecal samples. The water content in faeces
of groups fed problem diets in all periods presented no significant differences or was
significantly (p<0,05) lower than in faeces of group fed control diet, except in the second
period where faecal humidity of group fed probiotic diet was significantly (p<0,05) higher
(47,78%) than in control group (43,48%).
A known effect of insoluble fiber diet and certain NDO is to increase faecal volume
(Cummings et al. 1992; Gibson et al., 1995; Roberfroid et al., 1993). However, we did not
observed this effect when 4-GOS were added to the diet. Different studies neither found
significant differences (p<0,05) in dry weight of faeces of rats fed diet containing 5% 4-GOS
respect to control group during seven days (Chonan et al., 2001), containing 5% SCFOS,
nystose, inulin and guar gum during six weeks (Tashiro et al., 1997; Ohta et al., 1994b). In our
work infant formula, without fiber in its composition, used as base for adding 4-GOS possibly
might be the reason in the differences of faecal weight found between groups fed problem or
AO4 diet. The latter diet showed in its composition a 18,5% of fiber content (Table 8 in Material
and methods section).

295
 2. Haematological and biochemical parameters in rats

To complete the evaluation of the physiological status of the animals some

haematological and biochemical parameters were determined. In Table 21 are shown the
values obtained for hemoglobin (Hb), total red cells (TRC), hematocrit (Ht), serum Fe, TIBC
(total iron binding capacity), serum albumin and urea, and blood lipid parameters such as total
cholesterol (total COL), very low density lipoproteins (VLDL), high density lipoproteins (HDL)
and triacylglycerols (TG).

Table 20. Physiological parameters in rats

4-GOS Water Urine Feces wet Feces
Body weight Food intake
intake intake excretion weight moisture
Period Diets (g) (g/d)
(g/d) (mL/d) (mL/d) (g/d) (%)
10 days AO4 146,052,45 20,290,74 0,000,00 22,280,80 4,500,35 8,810,33 53,541,09
Control 102,322,62 6,050,46 0,000,00 9,830,50 3,230,20 0,690,14 47,420,89
Probiotic 70,051,11*/c 5,850,13b 0,000,00f 10,060,37ab 1,960,10*/b 0,470,12a 40,350,19*/b
Prebiotic 1,2% 72,981,33*/c 5,870,27b 0,070,00*/d 11,060,71a 3,850,26a 0,700,09a 47,641,04a
Prebiotic 5% 83,650,89*/a 6,870,15a 0,340,01*/b 11,860,44a 3,180,18a 0,500,09a 40,040,92*/b
Prebiotic 10% 83,981,10*/a 5,910,23b 0,590,02*/a 11,530,49*/a 3,800,23a 0,440,08a 33,580,81*/c
Synbiotic 1,2% 55,841,81*/d 4,670,19*/c 0,060,00*/e 8,220,27b 1,290,09*/c 0,220,04*/a 20,420,17*/e
Synbiotic 5% 74,931,11*/c 5,260,32bc 0,260,01*/c 8,890,43b 1,460,12*/bc 0,360,09a 24,030,25*/d
Synbiotic 10% 80,901,18*/ab 5,870,16b 0,590,01*/a 12,030,63*/a 3,460,36a 0,340,09a 25,960,69*/d
20 days AO4 233,193,17 25,660,35 0,000,00 26,501,24 7,130,29 11,400,31 59,230,17
Control 148,113,66 10,420,40 0,000,00 13,330,55 3,320,17 1,320,11 43,481,68
Probiotic 105,031,01*/de 7,720,36*/bc 0,000,00f 11,000,31*/b 2,380,12*/b 0,850,12*/a 47,781,10*/a
Prebiotic 1,2% 109,371,31*/cd 8,500,19*/ab 0,100,00*/d 10,830,53*/bc 2,160,12*/b 0,510,06*/a 35,102,06bc
Prebiotic 5% 121,651,28*/a 8,810,31*/ab 0,440,01*/b 11,330,37*/b 2,320,08*/b 0,740,08*/a 41,741,02b
Prebiotic 10% 118,471,65*/ab 8,920,33*/a 0,890,03*/a 11,720,71b 3,440,23a 0,450,09*/a 30,450,91*/c
Synbiotic 1,2% 79,062,26*/f 6,220,18*/d 0,070,00*/e 8,940,37*/c 1,060,12*/c 0,550,10*/a 33,642,69*/bc
Synbiotic 5% 100,271,23*/e 7,010,21*/cd 0,350,01*/c 9,720,36*/bc 1,280,13*/c 0,710,14*/a 37,061,57*/b
Synbiotic 10% 114,911,87*/bc 8,760,33*/ab 0,870,03*/a 14,410,54a 3,660,29a 0,670,08*/a 39,381,89b
30 days AO4 317,293,94 27,920,77 0,000,00 31,781,73 8,450,42 11,970,63 54,540,12
Control 209,874,50 13,070,48 0,000,00 15,890,95 5,310,47 1,960,13 50,331,50
Probiotic 150,501,34*/c 10,430,65*/c 0,000,00f 14,670,50a 2,890,20*/bc 1,590,23a 52,382,15ac
Prebiotic 1,2% 159,042,03*/bc 11,000,43*/abc 0,130,01*/d 13,830,93abc 3,600,23*/ab 1,310,21a 57,701,24a
Prebiotic 5% 177,091,77*/a 12,590,25ab 0,630,01*/b 15,890,35a 3,410,19*/ab 1,390,13a 44,291,79cd
Prebiotic 10% 170,782,24*/a 12,730,30a 1,270,03*/a 15,500,50a 4,060,27*/a 0,990,16*/a 38,162,03*/d
Synbiotic 1,2% 113,572,82*/e 8,110,29*/d 0,090,00*/e 11,000,63*/c 2,090,12*/c 1,100,11*/a 46,622,35bcd
Synbiotic 5% 139,662,16*/d 10,230,46*/c 0,510,02*/c 12,440,34*/bc 2,830,34*/bc 1,710,26a 48,522,75abcd
Synbiotic 10% 160,762,60*/b 10,730,52*/bc 1,070,05*/a 13,970,51ab 4,180,29*/a 1,900,23a 53,061,81ab
Values are meanSE, n=6
Asterisks within the same column shows significant differences (p<0,05) by bilateral separate means test in groups fed probiotic, prebiotic and synbiotic diets with respect
to control group for each period
Means with unlike superscript letter in the same column are significantly differe nt by Tukeys test (p<0,05) among groups fed probiotic, prebiotic and synbiotic diets for
each period

It can be observed that Hb, TRC and Ht in groups fed infant formula did not shown
significant differences (p<0,05) with respect to group fed reference diet (A04). Biochemical
parameters except in group fed prebiotic 10% diet for serum iron (438,75 g/dL) and fed
synbiotic 1,2% diet for albumin (2,37 g/dL), no significant differences showed among groups
fed problem and control diets.

296
 With regard to total COL, all groups fed infant formula but those fed with probiotic diet,
showed slightly lower values than control group, and in group fed prebiotic 1,2% diet (65,23
mg/dL) this difference was statistically significant (p<0,05). VLDL and HDL values were lower
and higher, respectively in groups fed infant formula but without significant differences respect
to group fed control diet. TG values showed a clear and significant (p<0,05) reduction in all
problem groups (from 49,83 mg/dL with synbiotic 10% diet to 75,63 mg/dL with probiotic diet)
with respect to control group (97,25 mg/dL).
Thus, in our work the addition of bifidobacteria and/or 4-GOS during 30 days reduced
significantly (p<0,05) TG blood levels. These results agree with those reported by other authors
(Hata et al., 1983; Tokunaga et al., 1986) who used oligofructose at 5, 10 and 20%, and
observed a significant decrease in TG values, although, and as well as in our study, COL levels
were not always reduced. More recently, Kok et al. (1998b) showed that the postpandrial
increase in TG induced by high fat diet decreased after oligofructose administration in rats.

3. Enumeration of total bacteria and bifidobacteria in faeces of rats

Table 22 displays the counts, expressed as log cfu/g faeces, of total aerobe and
anaerobe bacteria and bifidobacteria found in rats during the three periods of mineral balance.
No group fed infant formula showed higher counts of total aerobe in the third period than
group fed control diet. In total anaerobe count, a significant (p<0,05) lower number was
observed in group fed prebiotic 1,2% (6,40 log cfu/g faeces), prebiotic and synbiotic 10% diets
(6,82 and 6,97 log cfu/g faeces, respectively) and prebiotic 10% and synbiotic diets (from 7,17
log cfu/g faeces in synbiotic 5% diet to 7,85 log cfu/g faeces in prebiotic 10% diet) than group
fed control diet in the first, second and third periods, respectively. Regarding to bifidobacteria
count, in the first period only group fed synbiotic 10% diet showed a significant (p<0,05)
higher count (7,37 log cfu/g faeces) than control group (6,84 log cfu/g faeces). Moreover, the
only groups with higher numbers (above 7 log cfu/g faeces) were those fed diets containing
bifidobacteria (probiotic and synbiotics diets).
In the second period, generally all counts decreased, showing significantly (p<0,05)
higher values in groups fed synbiotic diets (6,26, 7,08 and 6,61 log cfu/g faeces, respectively)
than in control group (5,62 log cfu/g faeces). These data suggest that while total anaerobe
count remain stable in these three groups, 4-GOS was preferably used by bifidobacteria,
increasing its number respect to other species in the large intestine. However, in the third
period all groups increased slightly their counts but no differences with control group (6,35 log
cfu/g faeces) were found except in group fed prebiotic 1,2% diet (7,07 log cfu/g faeces).

297
Table 21. Values for the haematological and biochemical parameters of the rats fed with different diets for 30 days
Prebiotic Prebiotic Synbiotic Synbiotic Synbiotic
Diets/Parameters AO4 Cont rol Probiotic Prebiotic 10%
1,2% 5% 10% 1,2% 5%
Hemoglobin (g/dL) 13,951,24a 14,821,31a 14,640,66a 13,450,76a 13,980,61a 14,121,25a 14,630,81a 14,630,54a 14,120,96a
TRC (x 106/mm3) 6,860,79 a 6,642,11 a 6,440,13 a 7,191,13 a 7,852,64 a 6,510,54 a 6,500,35 a 6,440,31 a 6,740,41 a
Hematocrit (%) 44,404,27a 43,003,52a 44,001,86a 48,534,18a 47,802,21a 43,033,66 a
44,252,76a 44,922,94 a
45,701,52a
Serum iron (g/dL) 238,5052,92 240,5018,17 277,2524,96b 270,5619,84b 257,7512,99b 438,7523,47*/a 332,5039,00ab 353,7525,46ab 265,2546,05b
TIBC (g/dL) 345,2532,32 324,5014,79 272,007,53 b 351,3323,48ab 407,7529,47a 360,5028,72ab 368,7517,11ab 421,7521,45a 340,0052,44ab
Albumin (g/dL) 3,270,13 3,000,00 3,020,11 a 2,950,11 ab 3,120,10 a 2,870,03 ab 2,370,16 */b 2,920,10 ab 2,700,17 ab
Urea (g/dL) 24,300,61 21,762,02 19,351,05a 21,641,89a 16,550,42a 22,851,15 a
24,473,16a 23,121,77 a
17,972,74a
Total COL (mg/dL) 69,423,59 78,704,20 82,101,88a 65,231,12*/b 75,461,36ab 72,831,63 ab
75,335,22ab 74,480,99 ab
74,861,85ab
VLDL (mg/dL) 29,212,28 29,884,51 27,571,73a 22,052,08a 24,622,48a 21,901,38 a
29,562,26a 24,812,20 a
22,021,05a
HDL (mg/dL) 40,212,20 48,840,62 54,521,88a 43,151,66a 50,783,08a 50,932,28 a
45,773,87a 49,671,63 a
52,851,61a
TG (mg/dL) 68,805,34 97,257,40 75,632,94*/a 55,333,32*/b 60,463,74*/ab 53,732,10 */a
53,754,81*/a 53,002,68 */a
49,834,00*/a
Values are meanSE, n=6
*
Asterisks within the same row shows significant differences (p<0,05) by bilateral separate means test in groups fed probiotic, prebiotic and synbiotic diets with respect to control group
a-b
Means with unlike superscript letter in the same row are significantly different by Tukeys test (p<0,05) among groups fed probiotic, prebiotic and synbiotic diets

TRC: total red cells, TIBC: total iron binding capacity, Total COL: total cholesterol, VLDL-C:very low density lipoproteins, HDL: high density lipoproteins, TG: triacylglycerols

298
 Recently, Bielecka et al. (2002) reported that oligofructose 5% administration for
fourteen days increased significantly (p<0,001) faecal bifidobacteria numbers in 1,6 log ufc/g
respect to control group. If it was administered together with B. longum, this increase was in
1,4 log ufc/g. However, aerobic mesophilic count (from 7,79 to 8,81 log ufc/g) and facultatively
anaerobic count did not deferred between problem and control groups. Our results do not show
any effect in the first period, probably due to the fact that rats were fed with experimental diets
for three days. In the second period, groups fed synbiotic diets showed an increase from 0,64
log ufc/g at 1,2% to 1,46 log ufc/g at 5% respect to control group (5,28 log ufc/g). In the last
period, only the group fed prebiotic 1,2% diet showed significant (p<0,05) higher counts (7,07
log ufc/g) than control group (6,35 log ufc/g). Therefore, it was necessary to add 4-GOS to
probiotic infant formula to observe significant higher bifidobacteria numbers than that of control
group in the second period. On the opposite, no effect was observed in the third period maybe
because bifidobacteria decrease with age (Drasar and Hill, 1974; Mitsuoka, 1984).

Table 22. Number of total aerobes and anaerobes and bifidobacteria in faeces of rats
Bacteria
Period Diets Total aerobes Total anaerobes Bifidobacteria
8-10 days AO4 6,720,50 8,140,16 6,580,05
Control 6,860,24 7,680,11 6,840,21
Probiotic 7,970,07 */a 7,860,11 a 7,060,00 b
Prebiotic 1,2% 6,260,12 */d 6,400,11 */c 6,410,06 c
Prebiotic 5% 7,280,16 abc 7,470,08 ab 6,540,19 abc
Prebiotic 10% 6,830,08 bd 7,230,07 b 6,830,06 b
Synbiotic 1,2% 7,010,03 b 7,740,24 ab 7,030,13 ab
Synbiotic 5% 6,990,16 bcd 7,780,19 ab 7,250,03 a
Synbiotic 10% 6,660,04 cd 7,370,07 ab 7,370,00 */a
18-20 days AO4 7,280,16 7,750,11 5,280,09
Control 6,770,31 7,510,21 5,620,19
Probiotic 7,210,29 a 7,170,07 ab 5,130,07 c
Prebiotic 1,2% 6,700,13 a 7,140,07 ab 5,520,15 bc
Prebiotic 5% 6,800,15 a 7,110,09 ab 5,960,06 b
Prebiotic 10% 6,690,18 a 6,820,07 */b 5,730,08 b
Synbiotic 1,2% 6,760,12 a 7,460,07 a 6,260,11 */ab
Synbiotic 5% 7,580,24 */a 7,760,16 a 7,080,20 */a
Synbiotic 10% 6,590,13 a 6,970,18 */ab 6,610,26 */ab
28-30 days AO4 6,760,03 8,030,17 6,290,14
Control 7,510,16 8,280,05 6,350,02
Probiotic 7,570,12 ab 8,050,06 a 6,890,08 a
Prebiotic 1,2% 7,010,08 c 8,120,04 a 7,070,03 */a
Prebiotic 5% 7,810,04 a 8,160,02 a 6,760,09 a
Prebiotic 10% 7,080,18 ac 7,850,14 */ab 6,830,24 a
Synbiotic 1,2% 7,160,25 ac 7,730,19 */ab 6,540,19 a
Synbiotic 5% 6,690,20 */bc 7,170,14 */b 6,800,19 a
Synbiotic 10% 6,350,28 */bc 7,530,11 */b 6,720,21 a
Values are mean log cfu/g of wet fecesSE, n=6
*
within the same column in each period shows significant differences (p<0,05) by bilateral separate means test in
groups fed probiotic, prebiotic and synbiotic diets with respect to control group
a-d
Means with unlike superscript letter in the same column in each period are significantly different by Tukeys test
(p<0,05) among groups fed probiotic, prebiotic and synbiotic diets

299
4. Mineral balances

4.1. Balance of calcium

Table 23 shows the mineral balance of Ca in the three periods (of three days each) of
study. In the first period (8-10 days), AA of Ca in all problem groups was significantly (p<0,05)
higher than control group (91,70%), except group fed prebiotic 1,2% diet (92,77%) with high
standard error. In the second period (18-20 days), all groups showed a significantly (p<0,05)
higher AA of Ca than control group (73,66%), with the exception of groups fed probiotic and
synbiotic 1,2% diets (79,99 and 76,06%, respectively). Groups fed prebiotic 1,2% and 10%,
and synbiotic 10% diets displayed a higher AA of Ca (93,76, 95,80 and 94,55%, respectively)
than the rest of problem groups. Again, in the third period (28-30 days), all groups fed problem
diets showed a higher AA of Ca than control group (58,77%), however, in group fed synbiotic
1,2% diet (64,80%) this difference was not statistically different (p<0,05).
Regarding to retention of Ca, in the first period the higher urinary Ca excretion in
groups fed prebiotic 5 and 10% diets decreased in 8,5 and 8,7% the values of AA of Ca
respectively, respect to group fed control diet. For this reason the group fed prebiotic 5% diet
showed a lower retention of Ca (86,92%) than control group (91,68%), while groups fed
probiotic and synbiotic 1,2 and 10% diets displayed the higher values (from 96,28 to 97,01% in
synbiotic 10% and 1,2% diets, respectively). However, in the second period all groups showed
a lower urinary Ca excretion and therefore the retention of Ca was higher than in control group
(73,02%). Among problem groups, those fed prebiotic and synbiotic 5 and 10% diets exhibited
significantly (p<0,05) higher values (from 82,64 to 93,53% in prebiotic 5% and synbiotic 10%
diets, respectively). In the third period, retention of Ca in all groups was slightly lower than in
the previous period. Again, retention of Ca in groups fed prebiotic and synbiotic 5 and 10%
diets (from 76,56% in prebiotic 5% diet to 85,14% in prebiotic 10% diet) was significantly
(p<0,05) higher than in group fed control diet (58,19%).
It is interesting to point out the high AA and retention of Ca found in all groups fed
infant formula respect to that fed AO4 diet. In all groups the values decreased with time,
probably due to the decrease in nutritional requirements. Urinary Ca excretion was lack in the
global balance, only noticeable in groups fed prebiotic 5 and 10% diets in the first period.
Groups fed synbiotic 5 and 10% diets showed a AA and retention of Ca significantly (p<0,05)
higher than control group in the three periods of study, and groups fed prebiotic diets in the
two last periods. In groups fed synbiotic diets at 5 and 10% respect to 1,2% concentration
showed a dose-effect relationship in AA and retention of Ca in the second and third periods.
However, this effect did not display significant differences (p<0,05) with absorption of Ca
observed in the other problem groups. Groups fed synbiotic diets showed a significant (p<0,05)
higher retention of Ca respect to those fed probiotic and prebiotic diets only in some cases.

300
Thus, in the first and second periods group fed synbiotic 5% diet respect to those fed prebiotic
5% diet, and in the third period the group fed synbiotic 10% respect to that fed probiotic diet.

301
Table 23. Calcium balance
Apparent Retention Fecal excretion Fecal excretion Urinary excretion Urinary excretion
Period Diets absorption (%) (%) (mg/g) (mg/d) (mg/mL) (mg/d)
8-10 days AO4 43,770,88 45,341,94 10,950,49 86,781,83 0,0350,001 0,170,083
Control 91,700,97 91,680,97 5,720,50 4,250,49 0,0030,000 0,0080,002
Probiotic 96,970,33*/a 96,690,24*/a 2,330,22 */bd 0,920,05 */a 0,0430,014 c 0,0910,034 c
Prebiotic 1,2% 92,771,89a 92,411,86abc 5,060,18 a 2,400,66 */a 0,0320,001 c 0,120,021c
Prebiotic 5% 95,470,39*/a 86,920,54*/c 3,350,28 */c 1,640,12 */a 0,970,079*/a 3,090,17 */a
Prebiotic 10% 98,040,47*/a 89,320,56bc 1,520,13 */b 0,720,18 */a 0,790,029*/a 3,190,32 */a
Synbiotic 1,2% 97,040,79*/a 97,010,78*/a 4,370,10 */a 0,890,27 */a 0,0060,001 c 0,0080,002 c
Synbiotic 5% 96,400,69*/a 96,280,76*/a 2,700,10 */cd 1,040,13 */a 0,0260,012 c 0,0320,019 c
Synbiotic 10% 97,950,69*/a 93,022,01ab 2,050,08 */bd 0,630,21 */a 0,480,052*/b 1,510,39 */b
18-20 days AO4 39,572,27 38,322,45 10,500,27 120,338,36 0,340,066 2,510,53
Control 73,661,57 73,021,39 11,650,71 15,440,29 0,150,084 0,480,29
Probiotic 79,991,07cd 79,381,15c 8,360,48 bcd 7,950,60 */a 0,100,017bc 0,240,046bc
Prebiotic 1,2% 93,761,04*/a 92,091,07*/ab 5,850,51 */bce 2,980,46 */b 0,400,045a 0,790,096abc
Prebiotic 5% 84,031,97*/bc 82,641,81*/c 9,641,20 bc 7,320,69 */a 0,280,046abc 0,650,11 abc
Prebiotic 10% 95,801,29*/a 92,851,49*/ab 3,740,75 */e 2,050,75 */b 0,380,097ab 1,420,38 */a
Synbiotic 1,2% 76,061,13d 76,021,14c 14,581,60a 8,420,22 */a 0,0130,001 c 0,0170,005 c
Synbiotic 5% 91,240,73*/ab 91,220,73*/ab 5,320,50 */bce 3,460,30 */b 0,0100,003 c 0,0120,004 c
Synbiotic 10% 94,553,14*/a 93,533,36*/a 3,411,06 */de 2,221,17 */b 0,0120,005 abc 0,430,092abc
28-30 days AO4 29,484,74 29,064,75 12,900,78 149,007,70 0,120,007 0,890,029
Control 58,772,94 58,192,94 12,531,22 26,742,82 0,0650,016 0,370,025
Probiotic 69,794,03*/bc 68,944,00bc 10,760,77a 18,101,91*/a 0,210,014a 0,590,076a
Prebiotic 1,2% 82,690,95*/a 81,701,16*/a 8,460,61 a 10,770,83*/bcd 0,170,034a 0,630,14 a
Prebiotic 5% 77,253,93*/a 76,563,91 */ab 10,861,69ab 15,372,52*/ac 0,140,028a 0,470,091a
Prebiotic 10% 85,750,84*/a 85,140,86*/a 8,930,82 ab 10,320,79*/ad 0,220,075a 0,440,043a
Synbiotic 1,2% 64,803,01c 62,343,53c 15,712,53ab 17,581,91*/ab 0,150,041a 0,350,068a
Synbiotic 5% 80,690,82*/ab 79,650,84*/ab 7,180,88 ab 10,110,88*/bcd 0,220,056a 0,540,036a
Synbiotic 10% 86,262,06*/a 85,132,09*/a 4,090,46 */b 7,080,79 */d 0,170,063a 0,590,17 a
Values are meanSE, n=6
*
Asterisks within the same column shows significant differences (p<0,05) by bilateral separate means test in groups fed probiotic, prebiotic and synbiotic diets with respect to
control group for each period
a-e
Means with unlike superscript letter in the same column are significantly different by Tukeys test (p<0,05) among groups fed probiotic, prebiotic and synbiotic diets for each
period

302
 The high percentages of Ca absorption obtained with the problem groups in our study
(more than 65%), have been also reported by other authors using various NDO such as SCFOS,
TGOS and 4-GOS at 5 and 10% (Chonan and Watanuki, 1995; Chonan and Takahashi, 1999;
Ohta et al., 1998d; Chonan et al., 2001). Moreover, Chonan and Watanuki (1996) described
that in low Ca containing diets (215 mg Ca/100 g), which was closer to that used in our work
(571,72 mg Ca/100 g), the administration of 5% 6-GOS to rats during 30 days produced an AA
of Ca significantly (p<0,05) higher (>95%) than when normal Ca containing diet (2.150 mg
Ca/100 g) was used in the three periods of mineral balance.
Other authors (Sarri et al., 2001) also found high percentages of Ca absorption,
around 97% in fed infant formula suckling rats during seven days. The authors associated these
values to the high lactulose content in infant formulas, and the development in weaning rats
that apart of the passive diffusion, main mechanism of Ca absorption during the first two weeks
of a rats life, it is also increased the saturable carrier-mediated Ca transport (Bronner, 1987).
In our work, Ca AA percentages in group fed control infant formula in the first period was
slightly lower (91,7%) to that described by Sarri et al., although AA of Ca increased
significantly (p<0,05) when probiotics and prebiotics were added. Moreover, it is important to
remember that the majority of the studies use young rats, which have increased their Ca
requirements because of bone formation (NRC, 1991) during the growth period.
During infant formula industrial elaboration thermal processes such as drying and
sterilization are used, that might induce lactose isomerization producing lactulose. Although the
amount of lactulose produced during heating is lack due to the low water activity of the product
and the relatively mild thermal conditions (Sarri et al., 2001), lactulose reaches the colon
practically intact because it resists enzymatic hydrolysis in the small intestine. This isomeric of
lactose enhances Ca absorption more intensively than lactose (Brommage et al., 1993). The
infant formula used in our study was dried and pasteurized during industrial processing, and the
probable lactulose formed (90-150 mg/L in powder infant formulas (Sarri-Ruiz, 1998) might
explain the high AA of Ca observed in groups fed infant formula with respect that fed AO4 diet.
Another reason for explaining the high percentages of Ca AA obtained, may be the
source of Ca (calcium chloride and citrate) used in the mineral blend added to the infant
formula, since calcium citrate has the advantage of high solubility over other Ca sources
commonly used in Ca supplements such as calcium carbonate (Harvey et al., 1988).
In Ca absorption also influence the protein source used in the infant formula. Lnnerdal
et al. (1994) studied mineral bioavailability in suckling rats fed cow milk, human milk and infant
formulas with different protein sources (casein, whey protein, protein hydrolysates or soy
protein). The authors observed that Ca absorption from infant formulas, except that containing
soy as protein source, was higher than 70%.
Although from a nutritional point of view infant formula mimics human milk
composition, it is accepted that human milk is the best Ca source for infants. Some reasons
explain Ca bioavailability differences between human milk and infant formulas. In human milk

303
Ca is mainly bound to whey proteins or as a part of low molecular weight complexes, while in
cow milk it is bound to casein (Fransson and Lnnerdal, 1983). Moreover, it might influence the
different distribution of Ca between casein and whey proteins, since the main casein in human
milk is -casein, in cow milk it is -casein (Kunz and Lnnerdal, 1992). While among whey
proteins lactoferrin is the major protein in human milk, -lactoglobuline is in cow milk
(Lnnerdal, 1997). It should be also mentioned that phosphopeptides formed during enzymatic
digestion of casein, more probably in human milk than in cow milk, has a positive effect on Ca
absorption (Mellander, 1950) because of its ability to bind Ca and inhibit its precipitation and
thus maintain it soluble in intestinal lumen.
As conclusion of Ca balance, all groups showed in any of the periods all problem groups
an AA and retention significantly (p<0,05) higher than control group. Prebiotics addition was
more efficient than probiotics addition since while group fed probiotic diet was clearly higher
than control group in the first period, groups fed prebiotic diets were during the two last
periods. The increase in 4-GOS concentration added to diets did not show a clear dose-effect
relationship on Ca absorption. The conjunct addition of both in synbiotic diets neither displayed
a clear enhancement on Ca absorption. However, groups fed synbiotic 5 and 10% diets were
the more efficient because showed a AA and retention of Ca significantly (p<0,05) higher than
group fed control diet during the three periods.

4.2. Balance of magnesium

Table 24 shows the mineral balance of Mg in the three periods (of three days each) of
study. In the first period, the only group with an AA of Mg significantly (p<0,05) higher than
control group (82,85%) was that fed synbiotic 10% diet (94,74%). Among problem groups,
those fed prebiotic 5 and 10% and synbiotics diets showed the higher percentages (from
86,68% in prebiotic 5% diet to 94,74% in synbiotic 10% diet) because excreted a daily Mg
amount in faeces significantly (p<0,05) lower than control group (0,73 mg/day). In the second
period, groups fed prebiotic 1,2 and 10% diets and synbiotic 5 and 10% diets showed values
significantly (p<0,05) higher (from 90,35% in prebiotic 1,2% diet to 95,06% in synbiotic 10%
diet) than groups fed control (81,92%) and probiotic diets. In the third period, except groups
fed probiotic and prebiotic 5% diets (76,95 and 81,18%, respectively), the remaining groups
displayed an AA of Mg significantly (p<0,05) higher (from 85,59% in prebiotic 1,2% diet to
90,90% in synbiotic 10% diet) than control group (76,63%).
Urinary Mg excretion was more intensive than in Ca balance, reducing significantly the
Mg retention. Thus, group fed synbiotic 10% diet decreased a 3,3 and 3,7% respect to AA of
Mg percentages in the two first periods, while in the third period groups fed synbiotic 1,2 and
5% diets excreted more Mg in urine since the percentages decreased 16,8 and 23,15%,
respectively. In the first period, only group fed prebiotic 1,2% diet showed a percentage

304
(66,97%) significantly (p<0,05) lower than control group (81,78%) because it excreted a daily
Mg amount in urine significantly (p<0,05) higher than control group (0,046 mg/day). Among
problem groups, those fed prebiotic 5 and 10% and synbiotic diets showed the higher values
(from 86,49% in prebiotic 5% diet to 91,45% in synbiotic 10% diet). In the second period,
groups fed prebiotic 10% and synbiotic 5 and 10% diets displayed percentages significantly
(p<0,05) higher (90,48, 92,61 and 89,67%, respectively) than control group (78,41%), but no
with the remaining prebiotic and synbiotic diets. In the third period, groups fed prebiotic diets
and synbiotic 10% diet showed the significantly (p<0,05) higher values than control group
(from 80,99% in prebiotic 5% diet to 90,69% in synbiotic 10% diet). However, groups fed
synbiotic 1,2 and 5% diets displayed the lowest values due to the higher Mg excretion in urine.
AA and retention of Mg were again higher in groups fed infant formula than in group
fed AO4 diet. In all groups the percentages were decreasing with the age of the rats, although
on the contrary to Ca, the number of groups with an AA and retention of Mg significantly
(p<0,05) higher to control group was increasing in the time. Groups fed prebiotic 10% and
synbiotic 5 and 10% diets showed an AA and retention of Mg significantly (p<0,05) higher than
group fed control diet in the two last periods, and group fed synbiotic 10% diet in all periods.
The dose-effect relationship in 4-GOS concentration was only observed in prebiotic diets in the
first period and synbiotic diets in the third period.
Various studies in rats exhibit that the addition of NDO increases significantly Mg
absorption. For example, the administration of 4-GOS 5% diets to rats resulted in 87,4% of Mg
AA while 56,9% in control group (Chonan et al., 2001). Using laparotomized rats, the addition
of 5% GOS to diet showed a 90,6% in AA of Mg opposite to 60,2% in control group (Chonan
and Takahashi, 1999). In other study, the administration of a diet supplemented with 5%
SCFOS during three periods of mineral balance (3-7 days, 14-18 days and 27-31 days)
produced a AA of Mg significantly (p<0,01) higher (83,1, 78,3 and 73,3%, respectively) than
control group (61, 55,3 and 49,8%, respectively) (Ohta et al., 1993). Delzenne et al. (1995)
found in rats fed diet (0,1 g/100 g Mg) containing 10% inulin or oligofructose, a 75% of Mg
retention. Five weeks old rats fed 10% SCFOS diet showed a 90,7% of Mg retention in the first
period (10-14 days) and 85,9% in the second period (24-28 days) (Ohta et al., 1998d).
According to these references we might affirm that AA and retention of Mg increase in the
present study due to 4-GOS containing diet agrees with data found in the bibliography.
Nevertheless, in Mg absorption influence other factors such as the concentration of
other minerals present in the diet (Ohta et al., 1994a). These authors observed that with the
use of normal Ca (520 mg/ 100 g) and normal P contents diet (800 mg/100 g), the AA of Mg
was higher (83,6%) than in normal Ca and high P contents diet (1.200 mg/ 100 g) (59,3%). In
our study, Ca and P contents were consider as normal (572 and 344 mg/100 g respectively).
Balance studies in healthy term infants (Skyberg et al., 1968) showed a 55-75% of Mg
absorption, similar to those in our study. It is know that Mg absorption in young rats, as in man
(Shils, 1988), it is not produced by active transport, thus passive diffusion via pericellular

305
pathway appears to be the only absorptive mechanism during the first weeks (Meneely et al.,
1982). One explanation for this similarity, might be that the major Mg found in human milk and
infant formula, which is located in the soluble fraction (92% in the whey fraction of human milk
and 83% in the whey based formula) (Lnnerdal et al., 1993). Furthermore, these authors in
suckling rats reported that neither Mg nor Ca amount in the diet, or different Mg sources used
in infant formulas (MgHPO4, MgCl2, MgO) affected Mg absorption. They also pointed that
probably the high content of ligands in infant formula could help to make soluble Mg as it was
demonstrated in an in vitro study mimicking the conditions of the gastrointestinal tract, where
citrate showed the highest capacity to form absorbable complexes with Mg (Blaquiere and
Berthon, 1987).
For Mg balance it can be concluded that the percentages of AA and retention of Mg in
problem groups were significantly higher than in control group in the second and third periods.
Group fed probiotic formula showed the lowest values and it never was significantly higher than
control group. A clear dose-effect relationship was observed in groups fed prebiotic diet in the
first period and in fed synbiotic diet in the third period. The larger effect of synbiotic diets with
respect to prebiotic diets was only observed in AA and retention of Mg of the group fed
synbiotic 1,2% diet and in AA of Mg of the group fed synbiotic 5% diet. However, prebiotic
10% and synbiotic 5 and 10% diets were the most efficient for showing a higher AA and
retention of Mg in the two last periods.

4.3. Balance of phosphorous

Table 25 shows the mineral balance of P in the three periods (of three days each) of
study. In the first period, no problem group showed significant differences (p<0,05) neither
respect to control group (93,13%) nor among problem groups with values ranging from 90,68
to 96,23%. In the second period, only group fed prebiotic 10% diet displayed an AA
significantly (p<0,05) higher (94,24%) than control group (82,38%), because excreted daily
less P in faeces than control group (5,86 mg/day). In the third period, groups fed probiotic and
prebiotic 1,2 and 10% diets (85,82, 87,73 and 91,63%, respectively) showed a AA significantly
(p<0,05) larger than control group (79,04%), excreting in faeces the two last groups lower
amount of P than group fed control diet (8,45 mg/day).
Due that P excretion in urine was more important than the previous minerals, retention
percentages decreased noticeable. This reduction was more accused in groups fed synbiotic 1,2
and 5% diet in all periods. Thus, in the first period this reduction was of 19,2 and 9,5%,
respectively, in the second period of 8 and 12,2%, respectively, and in the third period of 16
and 17%, respectively. Regarding retention percentages in the first period, only groups fed
synbiotic 1,2 and 5% diets (77,07 and 81,17%, respectively) showed significant differences due
to the significant (p<0,05) P urine losses.

306
Table 24. Magnesium balance
Apparent Retention Fecal excretion Fecal excretion Urinary excretion Urinary excretion
Period Diets absorption (%) (%) (mg/g) (mg/d) (mg/mL) (mg/d)
8-10 days AO4 52,062,53 50,302,83 1,700,10 14,991,19 0,130,035 0,550,10
Control 82,853,94 81,783,89 0,960,16 0,730,16 0,0140,007 0,0460,022
Probiotic 80,863,42b 77,503,45bc 1,300,10 ab 0,520,07 b 0,0460,006 a 0,0920,014 abc
Prebiotic 1,2% 71,471,44c 66,972,67*/c 1,410,04 a 0,780,10 a 0,0470,007 a 0,180,015*/a
Prebiotic 5% 86,680,60ab 86,490,76ab 0,870,08 bc 0,420,02 b 0,0020,000 a 0,0060,005 bc
Prebiotic 10% 90,541,59a 0,610,02 c 0,280,05 */bc 0,0030,000 a 0,0140,001 b
90,081,58a
Synbiotic 1,2% 87,681,85ab 1,540,12 */a 0,290,06 */bc 0,0370,005 a 0,0510,002 ac
89,691,87ab
Synbiotic 5% 87,401,29ab 86,601,40ab 0,860,15 c 0,320,03 */bc 0,0150,007 a 0,0220,011 bc
Synbiotic 10% 94,741,77*/a 91,453,91a 0,440,01 */c 0,140,04 */c 0,0370,033 a 0,090,07 abc
18-20 days AO4 57,420,79 54,630,99 1,450,07 16,560,54 0,140,02 1,0710,14
Control 81,921,46 78,410,57 0,710,01 0,850,14 0,0460,005 0,160,036
Probiotic 78,332,54d 77,162,56b 0,960,15 a 0,780,10 a 0,0180,008 c 0,0440,02*/b
Prebiotic 1,2% 90,351,74*/ac 84,291,94ab 0,780,05 abc 0,400,07 */bc 0,130,011*/a 0,250,008*/a
Prebiotic 5% 84,931,53bcd 84,731,52ab 0,790,03 ab 0,610,04 ab 0,0040,000 */c 0,0080,000 */b
Prebiotic 10% 91,131,13*/ab 90,481,31*/a 0,680,02 abc 0,340,05 */bc 0,0070,003 */c 0,0230,01*/b
Synbiotic 1,2% 87,530,65ab 86,530,78a 0,700,06 abc 0,410,02 */bc 0,0210,008 bc 0,0320,017 */b
Synbiotic 5% 93,490,44*/ab 92,610,27*/a 0,340,04 bc 0,220,01 */c 0,0240,008 bc 0,030,013*/b
Synbiotic 10% 95,060,98*/a 89,672,45*/a 0,320,03 c 0,180,03 */c 0,0530,008 b 0,190,045ab
28-30 days AO4 52,643,33 50,083,00 1,690,12 19,580,99 0,1360,021 1,070,19
Control 76,631,78 72,001,53 0,660,09 1,320,14 0,0460,012 0,260,008
Probiotic 76,952,03d 71,803,17b 0,760,07 ab 1,180,10 a 0,100,04 b 0,250,10 b
Prebiotic 1,2% 85,591,49*/ac 81,331,25*/a 0,600,03 ab 0,770,10 */bc 0,0750,044 b 0,210,12 b
Prebiotic 5% 81,181,15bcd 80,991,15*/a 0,790,05 a 1,080,05 ab 0,0030,000 b 0,0110,000 b
Prebiotic 10% 89,850,89*/a 89,680,92*/a 0,570,09 ac 0,600,06 */c 0,0020,000 b 0,0090,001 b
Synbiotic 1,2% 85,651,48*/ab 63,540,57bc 0,540,02 bc 0,640,09 */c 0,420,034*/a 0,970,06 */a
Synbiotic 5% 89,901,67*/a 60,033,66*/c 0,310,04 */c 0,450,08 */c 0,500,11 */a 1,340,24 */ab
Synbiotic 10% 90,902,03*/a 90,692,05*/a 0,230,04 */c 0,400,07 */c 0,0020,000 b 0,0090,001 b
Values are meanSE, n=6
*
Asterisks within the same column shows significant differences (p<0,05) by bilateral separate means test in groups fed probiotic, prebiotic and synbiotic diets with respect to
control group for each period
a-d
Means with unlike superscript letter in the same column are significantly different by Tukeys test (p<0,05) among groups fed probiotic, prebiotic and synbiotic diets for each
period

307
 In the second period, as in AA the only group with a retention of P significantly
(p<0,05) higher than control group (81,28%) was showed by group fed prebiotic 10% diet
(92,70%), although it did not display significant differences (p<0,05) with groups fed prebiotic
diets and synbiotic 10% diet (88,67, 85,52 and 86,66%, respectively). On the contrary, groups
with the lowest percentages were those fed probiotic and synbiotic 5% diets (75,16 and
74,53%, respectively) to be the two groups with higher P excreted in urine per day. In the third
period, only groups fed prebiotic 1,2 and 10% diets showed the significantly (p<0,05) higher
values (86,23 and 90,20%, respectively) than control group (72,53%). The groups with the
lowest retention percentages were those fed probiotic and synbiotics diets (from 63,91% in
synbiotic 1,2% diet to 70,39% in synbiotic 10% diet) due to their higher P excretion in urine.
Concluding P balance, it can be again mentioned the high AA and retention percentages
found in all groups fed infant formula respect to that fed AO4 diet. It is important also to stand
out that in all groups the percentages were decreasing in time. As in Mg, the number of groups
with a AA and retention of P significantly (p<0,05) higher than control group was increasing
along the study. It was also observed a clear effect in urinary excretion of P in groups fed
synbiotic 1,2 and 5% diets, reducing significantly (p<0,05) the percentages of retention in the
first period and groups fed synbiotic 1,2% diet in the third period.
The studies about the effect of NDO on P absorption are quite scarce. Ohta et al.
(1993) observed that dietary 5% SCFOS administration to rats, produced a significant (p<0,05)
increase of P AA, while GOS and raffinose did not show differences with control group. In four
weeks old rats fed a diet containing 5% of SCFOS it was obtained a AA of P of 90 and 95%
when Ca and Mg were infused into the stomach and cecum, respectively (Ohta et al., 1997).
Ohta et al. (1994a) described that the administration to rats of diets with high Ca content
(1.040 mg/100 g) decreased the AA of P (about 20%). In our study, the effect of dietetic ca
concentration was not determinant to modify the absorption of P, since the level of Ca in the
diets used can be considered as moderate (572 mg/100 g). The values of AA of P obtained in
the study (1st period) agree with those reported by Ohta et al. (1994a) (93%) when the Ca
content of the diet was similar to that we used (520 mg/100 g).
To finish P balance, it can be concluded that only groups fed probiotic and prebiotics
1,2 and 10% diets showed a P absorption significantly (p<0,05) higher than control group in
any of the three periods of mineral balance. Group fed probiotic diet did not display a higher
effect respect to those fed prebiotic diets. As with the previous minerals, at any period could be
established a dose-effect relationship between 4-GOS concentration and P absorption. The only
group showing a AA and retention significantly (p<0,05) higher than group fed control diet in
the two last periods was that fed prebiotic 10% diet. Groups fed synbiotics diets did not show
any enhancement in P absorption respect to those fed prebiotic diets.

308
Table 25. Phosphorus balance
Apparent Retention Fecal excretion Fecal excretion Urinary excretion Urinary excretion
Period Diets absorption (%) (%) (mg/g) (mg/d) (mg/mL) (mg/d)
8-10 days AO4 33,873,38 33,113,47 7,860,45 69,515,44 0,170,030 0,780,18
Control 93,130,55 92,920,54 2,970,07 2,210,18 0,020,007 0,0650,01
Probiotic 95,400,28a 88,700,86ab 2,850,17 bcd 1,140,06 */a 0,830,064*/c 1,650,19 */bc
Prebiotic 1,2% 92,041,84a 91,881,84ab 3,110,09 c 1,440,35 a 0,0710,003 e 0,0280,01d
Prebiotic 5% 93,000,56a 91,060,84ab 3,010,16 bcd 1,470,10 a 0,120,017de 0,410,084bc
Prebiotic 10% 95,950,64a 94,210,53a 1,710,04 */d 0,790,14 */a 0,0850,002 de 0,340,03 bc
Synbiotic 1,2% 96,230,90a 4,030,03 */ab 0,800,22 */a 2,760,108*/a 3,900,58 */a
77,072,88*/c
a
Synbiotic 5% 90,681,89 81,174,04*/bc 4,910,18 */a
1,900,28 a
1,560,157 */b
1,960,51 */b
Synbiotic 10% 93,232,34a 88,872,98abc 4,000,21 */ac 1,270,44 a 0,410,071*/d 1,190,11 */bcd
18-20 days AO4 31,541,91 25,016,00 8,490,72 97,3110,77 0,150,001 1,120,12
Control 82,384,39 81,284,37 4,280,61 5,861,49 0,110,008 0,370,001
Probiotic 88,220,45b 81,860,45c 4,610,31 b 3,810,16a 0,860,026*/b 2,050,068*/b
Prebiotic 1,2% 90,851,78ab 88,671,65ab 4,610,34 b 2,380,43 */bc 0,300,054c 0,580,089d
Prebiotic 5% 87,471,53b 85,521,64bc 4,360,34 bc 3,360,32 ab 0,220,031c 0,520,082d
Prebiotic 10% 94,241,04*/a 92,701,02*/a 2,860,27 c 1,460,31 */c 0,110,011cd 0,380,031 d
Synbiotic 1,2% 84,971,30b 79,861,50c 6,920,75 */a 3,920,15 ab 1,250,34 */b 1,330,15 */c
Synbiotic 5% 86,750,49b 71,691,13d 5,720,41 ab 3,710,14 ab 3,180,13 */a 4,210,12 */a
Synbiotic 10% 88,332,23ab 86,662,42abc 5,390,51 ab 3,040,48 ab 0,120,019cd 0,430,04 d
28-30 days AO4 40,561,21 33,646,08 7,870,69 90,806,73 0,170,005 1,330,06
Control 79,041,59 72,531,75 4,250,37 8,450,46 0,490,05 2,640,43
Probiotic 85,821,32*/ab 67,901,52c 4,150,38 ab 6,500,63 a 2,920,14 */a 8,270,54 */a
Prebiotic 1,2% 87,731,06*/ab 86,231,12*/a 3,230,21 b 4,150,41 */bc 0,150,018b 0,510,06 d
Prebiotic 5% 82,610,81b 78,081,49b 4,870,29 ab 6,700,26 a 0,530,13 b 1,760,42 cd
Prebiotic 10% 91,630,86*/a 90,201,02*/a 3,090,51 b 3,240,34 */c 0,140,032b 0,550,15 d
Synbiotic 1,2% 79,973,09ab 63,914,38*/c 5,820,96 a 6,821,18 ab 2,210,76 */a 5,291,86 ab
Synbiotic 5% 81,151,40ab 64,153,57c 4,920,45 ab 7,020,85 a 2,210,19 */a 6,191,31 */a
Synbiotic 10% 75,763,26ab 70,393,20bc 4,390,49 ab 7,580,75 a 0,450,03 b 1,690,26 bcd
Values are meanSE, n=6
*
Asterisks within the same column shows significant differences (p<0,05) by bilateral separate means test in groups fed probiotic, prebiotic and synbiotic diets with respect to
control group for each period
a-e
Means with unlike superscript letter in the same column are significantly different by Tukeys test (p<0,05) among groups fed probiotic, prebiotic and synbiotic diets for each
period

309
4.4. Balance of iron

Table 26 shows the mineral balance of Fe in the three periods (of three days each) of
study. In the first period, Fe AA in all problem groups was higher than control group (50,78%),
with significant differences (p<0,05) in groups fed probiotic, prebiotics diets and synbiotic 1,2
and 10% diets (from 63,82 to 66,91%). However, groups fed diets containing 4-GOS 5%
showed a lower AA of Fe. All problem groups excreted in faeces amounts of Fe significantly
(p<0,05) lower than control group. In the second period, all problem groups showed an AA of
Fe higher than control group (31,12%) except that fed synbiotic 10% diet (27,21%). Only
groups fed prebiotic 5 and 10% diets displayed an AA significantly (p<0,05) higher (67,76 and
63,48%, respectively) respect to control group (31,12%). In this period, all groups excreted the
same amount of Fe in faeces (from 0,51 to 0,76 mg/g faeces in groups fed synbiotic and
prebiotic 1,2% diets, respectively) than control group (0,53 mg/g faeces), but these differences
were significantly (p<0,05) lower in all groups in Fe excreted per day. In the third period, all
problem groups showed a Fe AA larger than control group (15,71%), and groups fed prebiotic
10% and synbiotic 1,2 and 10% diets (36,71, 30,32 and 35,14%, respectively) displayed an AA
significantly (p<0,05) higher to that of group fed control diet (15,71%). In this last period, all
groups excreted a significantly (p<0,05) lower Fe excretion per day than control group, except
in group fed probiotic diet (0,83 mg/day).
Due to the fact that Fe urinary losses were low and they did not show significant
differences with control group at any period, retention Fe percentages did not present higher
differences of 1,2% (group fed synbiotic 10% diet in the first period) than Fe AA values. Thus,
the differences found in Fe retention are the same than those observed in Fe AA, with the
exception of the third period where only groups fed diets containing 10% of 4-GOS showed a
retention significantly (p<0,05) double (36,47 and 34,89% in diets prebiotic and synbiotic 10%,
respectively) to that in control group (15,30%).
It can be concluded that again there were found higher Fe AA and retention
percentages in all groups fed infant formula respect to group fed AO4 diet. Differences found
between control and problem groups were the same for AA and retention of Fe because urinary
Fe excretion did not have almost effect on balance calculations. The only groups showing a Fe
AA and retention significantly (p<0,05) higher than control groups, were those fed prebiotic and
synbiotic 10% diets. Fe absorption percentages were decreasing in time because a lower
number of groups with values significantly (p<0,05) higher than control group were observed.
Moreover, no clear dose-effect relationship of 4-GOS concentration with Fe AA and retention
was found.
There are few studies the literature, which evaluate the effect of GOS on Fe absorption.
Nevertheless, other authors have used different NDO to GOS to assess Fe balance. Thus,
Delzenne et al. (1995) found in young rats fed diet containing 7,8 mg/100 g of Fe and inulin or
oligofructose at 10% during 26 days, a Fe retention of 34%. Ohta et al. (1995b) in weanling

310
anemic rats fed a diet containing SCFOS 5% and low Ca content (1,5 mg/100 g) or normal Fe
content (3,0 mg/100 g), observed a Fe AA significantly (p<0,05) lower in group fed low Fe
content (46,3%) than in that fed normal Fe content (54,4%) not being affected by Mg and Ca
balances. More recently, Lopez et al. (1998) in a study in rats fed resistant starch, observed
that Fe balance increased significantly with an AA of 54% respect to the control (45%).
It can be observed when comparing the results of this study to those described
previously, that Fe AA and retention due to 4-GOS supplementation are lower than for other
NDO (inulin, oligofructose and SCFOS), due among other reasons, to the different conditions of
mineral balance evaluation, since in the previously described studies rats were anemic, and
NDO effect is more intensive than in normal physiological conditions such as in our study. It
have also take into account the possible Maillard-reaction products (lysinoalanyne and
lactulose) originated during technological process of infant formulas (Sarri et al., 2000). This
compounds have the potential to interact with several minerals and trace elements including Fe
(Sarri and Vaquero, 2001) forming insoluble complexes which decrease their bioavailability.
Moreover, proteins damaged as a consequence of the thermal processes may lose some
properties associated to the mechanisms of mineral absorption (Prez-Llamas et al., 1996).
It can be concluded for Fe balance that except in group fed synbiotic 5% diet, all
problem groups showed a Fe AA and retention significantly (p<0,05) higher than group fed
control diet in any of the three periods. The effect of prebiotic diets was higher than probiotic
diet, however the addition of different dietary 4-GOS concentrations did not show a clear dose-
effect trend. The supplementation of probitics to prebiotic diets forming synbiotic diets neither
enhanced Fe absorption respect to prebiotic diets. Groups fed prebiotic and synbiotic 5 and
10% diets were more efficient by showing an AA and retention of Fe significantly (p<0,05)
higher than control diet during the three periods of mineral balance.

311
Table 26. Iron balance
Apparent Retention Fecal excretion Fecal excretion Urinary excretion Urinary excretion
Period Diets absorption (%) (%) (mg/g) (mg/d) (g/mL) (g/d)
8-10 days AO4 20,774,74 20,194,76 0,600,05 4,830,11 1,330,16 5,700,32
Control 50,782,94 50,562,95 0,630,06 0,440,03 0,660,14 2,160,45
Probiotic 63,980,54*/ac 63,850,55*/ab 0,580,01 a 0,260,02 */a 0,600,22 a 1,280,51 a
Prebiotic 1,2% 65,152,43*/ab 64,922,49*/ab 0,510,08 */ab 0,180,02 */bc 0,560,088 a 2,300,61 a
Prebiotic 5% 56,691,44bc 56,421,46bc 0,570,01 a 0,270,01 */a 0,860,19 a 2,700,44 a
Prebiotic 10% 66,910,26*/a 66,660,28*/a 0,470,02 */ab 0,170,01 */c 0,620,03 a 2,480,27 a
Synbiotic 1,2% 63,823,17*/ac 63,603,17*/ab 0,640,01 a 0,160,03 */c 0,160,22 a 2,170,067 a
Synbiotic 5% 55,982,00c 55,082,41c 0,400,03 */b 0,160,01 */c 6,204,83 a 8,987,63 a
Synbiotic 10% 66,020,75*/a 64,830,96*/ab 0,580,02 a 0,240,05 */ab 24050 a 68961 a
18-20 days AO4 23,681,62 21,123,50 0,530,02 6,020,31 109595,8 8104834
Control 31,123,70 30,853,67 0,590,04 0,680,06 0,860,14 a 2,730,52
Probiotic 32,182,80cb 32,002,79cb 0,550,02 a 0,460,03 */ab 0,760,053 a 1,810,11 a
Prebiotic 1,2% 45,091,54*/bc 44,782,17*/bc 0,760,06 a 0,400,01 */a 1,430,16 a 2,810,25 a
Prebiotic 5% 67,765,19*/a 67,525,19*/a 0,480,17 a 0,350,12 */ab 1,400,29 a 3,160,53 a
Prebiotic 10% 63,480,80*/a 63,241,51*/a 0,620,02 a 0,290,07 */b 0,710,12 a 2,710,72 a
Synbiotic 1,2% 40,442,44bcd 40,112,53bcd 0,510,01 a 0,320,03 */ab 3,832,43 a 3,281,11 a
Synbiotic 5% 27,214,05d 26,434,47d 0,610,05 a 0,390,02 */ab 6,013,75 a 7,785,77 a
Synbiotic 10% 53,282,91*/ab 52,912,83*/ab 0,680,09 a 0,450,02 */a 602110a 2160429 a
28-30 days AO4 14,443,80 13,873,82 0,630,02 7,320,41 788131 6025664
Control 15,710,81 15,301,28 0,530,02 1,040,06 0,580,069 3,371,00
Probiotic 17,092,98b 16,153,36b 0,510,06 ab 0,830,03 a 3,472,57 a 9,346,26 a
Prebiotic 1,2% 22,272,63a 22,152,58ab 0,530,05 ab 0,770,08 */ab 0,320,22 a 1,180,73 a
Prebiotic 5% 24,235,19ab 23,415,70ab 0,540,03 a 0,780,08 */ab 0,211,28 a 6,573,69 a
Prebiotic 10% 36,712,97*/a 36,473,00*/a 0,550,07 a 0,600,06 */ac 0,610,06 a 2,410,50 a
Synbiotic 1,2% 30,323,90*/ab 29,443,98ab 0,210,01 */b 0,480,05 */c 0,750,18 a 1,730,20 a
Synbiotic 5% 25,142,00ab 24,362,24ab 0,380,06 ab 0,530,01 */bc 2,600,79 a 7,783,53 a
Synbiotic 10% 35,142,99*/a 34,892,98*/ab 0,450,08 ab 0,750,01 */ac 6,640,07 a 2,520,55 a
Values are meanSE, n=6
*
Asterisks within the same column shows significant differences (p<0,05) by bilateral separate means test in groups fed probiotic, prebiotic and synbiotic diets with respect to control
group for each period
a-d
Means with unlike superscript letter in the same column are significantly different by Tukeys test (p<0,05) among groups fed probiotic, prebiotic and synbiotic diets for each
period

312
5. Effect on cecum and colon of rats

5.1. Cecal and colonic parameters (weight and pH)

Table 27 shows the following parameters measured in cecum: total weight, wall
weight, pH and weight of the content, and liquid and solid phase weights after centrifuging.
The supplementation with probiotics and/or prebiotics did not modify significantly neither total
nor content cecal weights. However, wall cecal weight increased in group fed prebiotic 10%
diet (1,58 g), representing an increase of 1/3 of that in control group. Groups fed prebiotic 10%
and synbiotic 5 and 10% diets showed a higher total, wall and content weights of the cecum
although no differences were observed with control group. Groups fed synbiotic diets displayed
a significant (p<0,05) lower pH of cecal content (5,14, 5,12 and 5,13, respectively) than control
group (5,60). Solid phase weight did not show statistical differences between problem groups
and control group (0,29 g). However, groups fed prebiotic 10% diet and synbiotic diets
displayed a significantly (p<0,05) higher weight of the liquid phase (from 3,28 g in synbiotic
1,2% diet to 3,70 g in prebiotic 10% diet) comparing to group fed control diet (2,91 g).

Table 27. Cecal parameters in rats fed experimental diets for 30 days
Total weight Wall weight Cecal content Cecal content Liquid phase Solid phase
Diets
(g) (g) weight (g) pH weight (g) weight (g)
AO4 5,940,92 1,200,17 4,740,80 5,950,09 4,120,02 0,620,02
Control 4,240,53 1,020,08 3,210,49 5,600,09 2,910,04 0,290,03
Probiotic 4,220,18ab 1,040,05b 3,180,16ab 5,670,07a 2,880,02c 0,300,02a
Prebiotic 1,2% 3,510,38b 1,000,11b 2,500,30b 5,500,09ab 2,280,03*/d 0,220,03a
Prebiotic 5% 3,380,39b 0,990,05b 2,400,36b 5,400,14ab 2,220,01*/d 0,170,01a
Prebiotic 10% 5,520,37a 1,580,27*/a 3,940,35ab 5,420,09ab 3,700,06*/a 0,230,06a
Synbiotic 1,2% 4,510,33ab 0,950,10b 3,560,36ab 5,140,06*/b
3,280,06*/b 0,250,06a
Synbiotic 5% 5,390,35a 1,360,02ab 4,030,34a 5,120,08*/b 3,690,06*/a 0,340,06a
Synbiotic 10% 5,400,78a
1,370,09 ab
4,030,74ab 5,130,07*/b
3,670,01*/a 0,360,01a
Values are meanSE, n=6
*
within the same column shows significant differences (p<0,05) by bilateral separate means test in groups fed probiotic, prebiotic and
synbiotic diets with respect to control group
a-d
Means with unlike superscript letter in the same column are significantly different by Tukeys test (p<0,05) among groups fed
probiotic, prebiotic and synbiotic diets

Table 28 shows the following parameters measured in colon: total weight, wall weight,
pH and weight of the content, and phase liquid and solid weights after centrifuging. As in the
cecum, neither total nor content colon weights in problem groups displayed significant
differences respect to control group. However, wall colonic weight in groups fed synbiotic 1,2
and 5% showed the lowest values (0,49 and 0,61 g, respectively). Group fed prebiotic 10% diet
displayed a larger total and wall colonic weights (1,51 and 0,85 g, respectively), and group fed
probiotic diet showed a higher total and content colonic weights (1,57 and 0,84 g, respectively)
among problem groups. With regard to pH content of the colon, also groups fed synbiotic diets
showed the significant (p<0,05) lowest pH values (5,25, 5,21 and 5,26, respectively) and that
fed prebiotic 5% diet (5,36) than control group (5,77). Except solid phase in group fed synbiotic

313
10% diet (0,33 g), no problem group showed significant differences (p<0,05) according to solid
and liquid phases of colonic content respect to control group (0,17 and 0,41 g, respectively).

Table 28. Colonic parameters in rats fed experimental diets for 30 days
Total weight Wall weight Colonic content Colonic Liquid phase Solid phase
Diets
(g) (g) weight (g) content pH weight (g) weight (g)
AO4 3,830,45 1,550,07 2,280,45 5,980,06 1,740,10 0,540,10
Control 1,400,15 0,850,06 0,580,10 5,770,15 0,410,01 0,170,01
Probiotic 1,570,11a 0,720,03ab 0,840,10a 5,510,12a 0,630,03a 0,210,03 a
Prebiotic 1,2% 1,420,11ab 0,790,08ab 0,630,07a 5,530,15a 0,490,02ab 0,130,03a
Prebiotic 5% 1,420,10ab 0,660,03abc 0,760,08a 5,360,07*/a 0,540,03ab 0,220,02a
Prebiotic 10% 1,510,16a
0,850,07 a
0,690,14a 5,420,08 a
0,520,07ab 0,160,07a
Synbiotic 1,2% 0,930,10b 0,490,05*/c 0,430,07a 5,250,04*/a 0,290,03b 0,130,03a
Synbiotic 5% 1,250,11ab 0,610,04*/bc 0,640,08a 5,210,07*/a 0,420,06ab 0,220,06a
Synbiotic 10% 1,440,18ab 0,700,03ac 0,740,17a 5,260,08*/a 0,410,13ab 0,330,13*/a
Values are meanSE, n=6
*
within the same column shows significant differences (p<0,05) by bilateral separate means test in groups fed probiotic, prebiotic and
synbiotic diets with respect to control group
a-c
Means with unlike superscript letter in the same column are significantly different by Tukeys test (p<0,05) among groups fed
probiotic, prebiotic and synbiotic diets

It can be concluded that only the group fed prebiotic 10% diet increased significantly
(p<0,05) the wall cecal weight and those fed synbiotic diets reduced significantly (p<0,05) pH
content of cecum and colon respect with control group. In regard to liquid phase of cecal
content, groups fed synbiotic diets and prebiotic 10% diet increased significantly (p<0,05) the
weight of this phase, where presumably minerals are found to be absorbed by the epithelial
cells in the large intestine.
All studies agree that there is a significant decrease (p<0,05) in pH of cecal content
after NDO dietetic administration. Thus, Ohta et al. (1993) observed that diets containing 5% of
GOS, raffinose or SCFOS decreased significantly (p<0,05) pH of cecal content (5,62, 5,54 and
5,24, respectively) than control group (6,88) in rats. Moreover, NDO and Ca concentrations in
diet influence on the pH of large intestine content. Chonan and Watanuki (1995) found a pH of
cecal content in rats of 5,6 when 5% of TOS were administered, and a value of 5,3 with 10% of
TOS. The same researchers (Chonan and Watanuki, 1996) described that the consumption by
rats of a diet containing 5% of 6-GOS with low Ca content (215 mg Ca/100 g) led to a lower
pH of the cecal content (5,80) comparing to the pH reached (6,04) by the group fed the diet
with normal Ca content (2.150 mg Ca/100g). Rmsy et al. (1993) in rats fed diet containing
300 mg/100 g or 800 mg/100 g of Ca supplemented with 15% of inulin, also found a significant
(p<0,05) lower pH in the group fed the lower Ca content (5,30) than the other group (5,9).
Lopez et al. (1998) did not observed significant differences in wall cecal weight using
resistant and no-resistant starch as carbohydrates source. Nevertheless, other results have
been observed using other resistant carbohydrates, such as described by Chonan et al. (2001)
who observed in rats fed 4-GOS 5% an increase in total and wall cecal weights. However, in a
previous study Chonan and Watanuki (1995) found a significant greater wall cecal weight only
in group fed TOS 10%, as in our study using 4-GOS as NDO.

314
 As in our work and using other NDO, Campbell et al. (1997) neither found significant
differences in total and wall colonic weights respect to control group in rats fed a diet
containing cellulose, SCFOS, oligofructose or XOS at 6%.
The effect of probiotics on cecum and colon parameters regarding mineral absorption is
little studied. Djouzi et al. (1997) described that probiotics administration decreased
significantly (p<0,05) pH of cecal content in free germ rats fed a diet with 30% of fermented
milk containing L. casei. However, and as in our study, they did not find significant changes in
total cecal weight after four weeks of study.
pH content of the colon is not commonly measured since the lack interest of this place
from a fermentative point of view. However, Ohta et al. (1994b) in a study with laparotomized
rats and fed a diet containing 5% of SCFOS, described a pH of cecal and colonic contents of
5,36 and 5,7 respectively. As in our study, pH found in colonic content was higher than in cecal
content, because contrary to man, rat is a specie where the fermentation occurs mainly in the
cecum (Campbell et al., 1997).
We found a significant increase in the liquid phase of cecal content in groups fed
prebiotic 10% diet and synbiotic diets. This finding has been also described by other authors by
means of using resistant starch (Schultz et al., 1993), arabinoxylans and guar gum (Lu et al.,
2000) and TGOS (Chonan and Watanuki, 1995). It has been reported that this fact could have a
direct effect on mineral absorption and more concretely on Ca absorption, since this fluid might
enlarge passive absorption of Ca by increasing the permeability of the intercellular junction
between enterocites (Bronner, 1987).
Concluding, groups fed synbiotic diets showed a pH cecal content significantly (p<0,05)
lower than control group and a liquid phase weight of cecal content in these same groups and
that fed prebiotic 10% diet significantly (p<0,05) higher than control group. In the colon, again
groups fed synbiotic diets and prebiotic 5% diet displayed a pH colonic content significantly
(p<0,05) lower than group fed control diet.

5.2. Mineral distribution in the liquid and solid phase of cecal and colonic contents

In Table 29 is shown the mineral distribution (Ca, Mg, P and Fe) in liquid and solid
phases of cecal and colonic contents expressed as mg of mineral/content. All minerals exhibited
a higher content in solid phase. Mineral content in liquid phase, place where minerals are in
soluble form, both in cecal and colonic contents in general did not show significant differences
with control group. Only in liquid phase of cecal content Fe concentration of groups fed
prebiotic and synbiotic 10% diets were significantly (p<0,05) larger (0,102 and 0,07 mg Fe,
respectively) than control group (0,024 mg Fe).
Practically all problem groups showed a mineral percentage in the cecal liquid phase
with no differences respecting control group. However, Fe percentage in colonic liquid phase of
groups fed prebiotic 5 and 10% diets (13,66 and 15,31%, respectively) displayed significantly

315
(p<0,05) higher values than control group (5,15%). Moreover, group fed prebiotic 5% diet
showed a Mg percentage in cecal liquid phase (95,50%) significantly (p<0,05) larger than
control group (59,22%). The higher percentages were observed in Ca and Mg, suggesting that
in cecal content was solubilized and important amount of these minerals. Regarding to colon,
the percentages of Ca and Mg solubilized was slightly lower than previously, but also slightly
higher for Fe and P, suggesting that these two minerals are absorbed in a great extent in the
colon. Only group fed prebiotic 10% diet showed a Ca percentage in colonic liquid phase
significantly (p<0,05) higher (61,66%) than control group (10,86%). Finally, point that both in
cecum and colon the scarce P percentage found in the liquid phase comparing to the other
minerals, because probably it is forming any complex (Brink et al., 1992) which avoid its correct
measurement since intestinal absorption of P was high as it was shown previously in the P
balance.
Ohta et al. (1995b), observed that Fe concentration in the liquid phase of cecal content
was significantly higher in group fed SCFOS 5% than in control group, and like in our work no
differences were found in Ca and Mg contents in cecal liquid phase. Fe was the only mineral
showing a significant (p<0,05) higher percentage in groups fed prebiotic 5 and 10% diets with
respect to control group. No differences in Ca, Mg and P percentages were found respecting
control group except in those fed prebiotic and synbiotic 5% diet for Mg. It have been also
observed that mineral concentration in the diet affects its concentration in the liquid phase of
cecal content. Thus, Younes et al. (1996) found in rats fed resistant starch soluble Ca
percentage in cecal content was of 49% with a low Ca content diet (250 mg/100 g), opposite to
a 16% with a diet containing higher Ca content (750 mg/100 g). In our study, although the
amount of Ca used was intermediate (572 mg/100 g) to that used by Younes et al., the
percentages we obtained were more similar to those reported in the group fed the lower Ca
content.

5.3. Epithelial cell proliferation in cecal and colonic mucosa of rats

Table 30 shows the crypt depth and cellular density per crypt of the cecal and colonic
wall (proximal and distal). In cecum were not appreciated differences in crypt depth and cell
density. In colon, all problem groups showed a crypt depth significantly (p<0,05) higher (from
342,22 m in probiotic diet to 448 m in synbiotic 1,2% diet) than control group (300,23 m)
in the proximal portion. Regarding cell density, groups fed probiotic, prebiotic 1,2 and 10%, and
synbiotic 5% diets (from 30,0 cells in prebiotic 1,2% diet to 32,89 cells in probiotic diet)
displayed a significant (p<0,05) larger number of cells per crypt than control group (26,50
cells). In distal colon, all problem groups showed a significant (p<0,05) deeper crypts (from
347,39 in synbiotic 1,2% diet to 395,12 m in synbiotic 10% diet) than control group (316,84
m).

316
 Groups fed prebiotic 1,2 and 5% diets and synbiotic 5 and 10% diets showed a cell
density significantly (p<0,05) higher (from 28,43 cells in prebiotic 5% diet to 32,33 cells in
synbiotic 10% diet) than group fed control diet (25,57 cells).

317
T able 29. Distribution of calcium, magnesium, phosphorus and iron between the liquid and solid phase in the cecal and colonic contents of rats fed experimental
diets for 30 days
Prebiotic Prebiotic Prebiotic Synbiotic Synbiotic Synbiotic
AO4 Control Probiotic
1,2% 5% 10% 1,2% 5% 10%
CECUM
Calcium
In solid phase 14,801,32 9,952,13 11,750,95a 7,122,75ab 5,790,27b 5,500,37b 4,590,93b 9,090,39ab 6,720,75ab
In liquid phase 2,200,02 2,680,610 1,200,06a 2,120,03a 3,570,45a 2,550,59a 2,640,99a 3,500,97a 3,380,31a
% in liquid phase 13,080,89 21,231,06 9,330,82b 27,668,26ab 37,923,19a 30,944,44ab 37,386,95ab 26,685,21ab 33,672,60ab
Magnesium
In solid phase 1,070,10 0,270,03 0,190,01a 0,160,06ab 0,020,00b 0,200,01*/a 0,360,03*/a 0,160,02ab 0,180,03ab
In liquid phase 1,360,19 0,430,12 0,340,02a 0,470,14a 0,470,06a 0,330,11a 0,520,14a 0,680,15a 0,600,06a
% in liquid phase 55,692,57 59,224,78 64,441,06bc 75,245,59abc 95,500,34*/a 60,125,32bc 56,906,63c 79,144,80*/ab 76,661,61abc
Phosphorus
In solid phase 9,620,55 2,000,48 2,630,35a 2,680,96a 1,880,15a 1,740,17a 1,540,30a 2,940,24a 2,600,40a
In liquid phase 0,0500,001 0,0410,005 0,0440,001a 0,0610,022a 0,0330,004a 0,0480,005a 0,0330,009a 0,0410,004a 0,0420,004a
% in liquid phase 0,520,04 2,210,41 1,730,25ab 2,190,20ab 1,710,09ab 2,720,40a 2,020,31ab 1,400,23b 1,630,25ab
Iron
In solid phase 1,080,08 0,420,05 0,330,04c 0,290,05c 0,240,02c 0,580,07ab 0,210,02*/c 0,430,01abc 0,640,08*/a
In liquid phase 0,0220,006 0,0240,007 0,0230,005c 0,0260,008c 0,0380,005bc 0,1020,002*/a 0,0270,002c 0,0140,008c 0,0700,013*/ab
% in liquid phase 2,110,76 5,150,96 6,581,31bc 7,821,17abc 13,661,25*/ab 15,311,40*/a 11,651,78ab 3,191,78c 10,422,61abc
COLON
Calcium
In solid phase 7,440,51 5,961,26 9,630,08*/a 3,030,65*/bc 9,340,93*/a 0,980,09*/c 3,140,31bc 3,750,46c 5,310,82b
In liquid phase 1,330,12 1,160,06 1,170,03 1,280,08a 2,900,41a 2,130,94a 2,091,10a 1,370,71a 1,460,13a
% in liquid phase 15,342,08 17,794,43 10,860,19b 30,864,30ab 23,560,93b 61,6612,21*/a 35,6011,67ab 23,489,76b 21,851,16b
Magnesium
In solid phase 1,710,29 0,250,04 0,340,01a 0,150,01b 0,270,03a 0,100,00*/bc 0,080,04*/c 0,130,05*/b 0,260,09a
In liquid phase 1,030,02 0,480,08 0,200,03 0,460,06a 0,450,09a 0,500,33a 0,410,02a 0,590,37a 0,440,12a
% in liquid phase 38,403,78 65,820,83 37,223,63b 75,232,12ab 61,084,54ab 69,4613,68ab 84,636,72a 68,1114,45ab 60,586,40ab
Phosphorus
In solid phase 4,840,90 2,260,68 3,170,75a 1,320,27bc 2,480,25ab 0,510,27*/c 1,100,01bc 1,070,03bc 1,930,01abc
In liquid phase 0,030,00 0,100,02 0,030,00a 0,100,03a 0,080,01a 0,060,03a 0,090,02a 0,030,00a 0,110,01a
% in liquid phase 0,640,15 4,811,42 1,140,21b 6,581,26ab 2,990,19ab 9,182,59a 7,662,17ab 3,070,74ab 5,560,17ab
Iron
In solid phase 0,760,17 0,380,12 0,340,08ab 0,280,06ab 0,480,05a 0,140,08b 0,110,01b 0,140,02b 0,320,05ab
In liquid phase 0,0330,024 0,0310,017 0,0160,012a 0,0460,007a 0,0210,000a 0,0390,015a 0,0250,001a 0,0410,031a 0,0440,012a
% in liquid phase 3,411,87 6,601,61 5,384,46a 15,524,76a 4,340,45a 25,258,17a 19,051,12a 18,6211,78a 13,114,91a
Values are meanSE, n=6
*
Asterisks within the same row shows significant differences (p<0,05) by bilateral separate means test in groups fed probiotic, prebiotic and synbiotic diets with respect to control
group
a-c
Means with unlike superscript letter in the same row are significantly different by Tukeys test (p<0,05) among groups fed probiotic, prebiotic and synbiotic diets

(mineral content in liquid phase) / [( mineral content in liquid phase) + (mineral content in solid phase)] x 100, mineral content is expressed as mg

318
 The results showed that the addition of bifidobacteria and/or 4-GOS to diets did not
have any effect on morphology of cecal epithelium at least in the apex portion. However, crypt
depth was significantly affected in all groups in the colon, and cell density was significantly
affected in groups fed probiotic, prebiotic 1,2 and 10% and synbiotic 5% diets in proximal
colon, and in groups fed prebiotic 1,2 and 5% and synbiotic 5 and 10% diets in distal colon.
Groups fed prebiotic 5% and synbiotic 1,2 and 10% diets displayed a crypt depth
significantly (p<0,05) higher than control group in proximal colon but no differences were
observed in cellular density. This effect was also showed in distal colon in groups fed probiotic,
prebiotic 10% ans synbiotic 1,2%. This fact involves an increase in cell volume of epithelial
crypts cells of described groups, that has been explained in cell lines of rat colon due to the
SCFA produced on intestinal lumen are absorbed by colonocytes inducing an acidification of the
cells. For recovering intracellular pH, cells have multiple processes including Na + /H+ exchange
and H+ /AGCC cotransport inducing a cell swelling (Diener et al., 1993).
In man, the fermentation of carbohydrates which escape to the enzymatic hydrolysis in
the small intestine occurs mainly in ascending colon due to the higher availability of substrates,
higher bacterial growth and more acidic pH (Cummings and Macfarlane, 1991). In our study the
fact that colon mucosa has experimented changes both in proximal and distal portions,
indicates that diets have provided an amount sufficiently large of 4-GOS to be fermented in
both portions.
The data found in the scientific bibliography on epithelium morphology in large intestine
are different according to NDO used. Howard et al. (1995a) in a study with young rats fed 3%
of SCFOS, XOS or gum arabic, observed that only the group fed gum arabic showed a crypt
depth in cecum and colon significant (p<0,05) higher than control group, and no NDO
stimulated cell density. Tashiro et al. (1997) in rats fed 5% of SCFOS, nystose, inulin, guar gum
or cellulose, only found significant differences in cell density of cecal crypts (25 in group fed
control diet and 30 in those fed inulin and guar gum containing diets), but not in proximal and
distal colon. However, our results agree with those described by Howard et al. (1995b) who fed
neonatal pigs with FOS at 0,3% and found an increase in crypt depth and cell proliferation in
proximal and distal colon, but not in cecum.
It has been also described that Ca concentration might affect mucosa cell proliferation
in the large intestine. Thus, Rmsy et al. (1993) observed that after 15% inulin administration,
cecal crypt depth and cell density were significantly (p<0,05) higher (320 m and 63,
respectively) in group fed diet containing 800 mg Ca/100 g than that fed 300 mg Ca/100 g.

319
Table 30. Morphological measurements of cecal and colonic mucosa of rats fed experimental diets for 30 days
CECUM PROXIMAL DISTAL
COLON COLON
Crypts height Cell density Crypts height Cell density Crypts height Cell density
Diets (m) (m) (m)
AO4 316,386,77 26,751,03 400,683,18 32,801,02 338,5810,17 34,280,68
Control 404,301,48 25,200,86 300,2314,38 26,500,29 316,845,62 25,570,81
Probiotic 408,185,01b 28,140,74a 342,2211,33d/* 32,890,65a/* 376,237,04/* 25,330,41d
Prebiotic 1,2% 448,525,01a 27,800,92a 386,766,61c/* 30,000,84ab/* 393,338,03a/* 29,140,46b/*
Prebiotic 5% 366,926,91c 27,500,29a 406,645,58bc/* 29,430,37b 375,2511,43a/* 28,430,37bc/*
Prebiotic 10% 358,7415,08bc 27,140,55 417,164,84ab/* 30,171,75abc/* 397,9011,41a/* 25,600,68cd
Synbiotic 1,2% 397,210,83b 25,251,84ab 448,727,74a/* 25,670,56c 347,397,94a/* 27,290,56bcd
Synbiotic 5% 382,8711,68bc 23,140,70b 388,908,44bc/* 31,370,36ab/* 395,127,78a/* 31,331,12ab/*
Synbiotic 10% 380,285,75bc 25,670,33ab 383,087,21cd/* 30,100,38b 372,948,20a/* 32,330,33a/*
Values are meanSE, n=6
*
Asterisks within the same column shows significant differences (p<0,05) by bilateral separate means test in groups fed probiotic, prebiotic and
synbiotic diets with respect to control group
a-d
Means with unlike superscript letter in the same column are significantly different by Tukeys test (p<0,05) among groups fed probiotic,
prebiotic and synbiotic diets

6. Effect on mineral content of the femur and tibia in rats

Mineral bone structure is mainly constituted by hidroxiapatite (Ca10(PO4)6OH2)

(Rasmussen and Bordier, 1974), however bones are also composed by Mg (Rude, 1996). On
the contrary, Fe is mainly forming part of hemoglobin (Hb), mioglobin (Mb) and some enzymes,
however up to 30% is placed in bone marrow (NCR, 1991; Czajka, 1996). Evaluation of Hb Fe is
usually regarded as the reference standard for assessment of Fe stores (Holyoake et al., 1993).
Therefore, in Table 31 is shown dry weight, ash content and mineral content (Ca, Mg, P and
Fe), expressed in mg of mineral/g of dry weight bone, of the femur in rats after mineral
balance. All problem groups showed a significant (p<0,05) less weighty femur (from 282,25 mg
in synbiotic 1,2% diet to 304,13 mg in prebiotic 5% diet) than control group (349,60 mg), and
group fed synbiotic 1,2% diet displayed the lightest femur. Regarding ash content, groups fed
prebiotic diets did not show differences with control group (57,24%). Ca content in femur of all
problem groups was significantly (p<0,05) higher (from 181,07 mg in probiotic diet to 206,78
mg in synbiotic 5% diet) respect to control group (156,03 mg). Groups fed prebiotic 1,2% and
synbiotic 1,2 and 5% diets presented the highest percentages (197,67, 196,74 and 206,78 mg,
respectively). Mg content in femur of problem groups were not higher than control group (1,82
mg), and groups fed prebiotic diets was significantly (p<0,05) lower (1,63, 1,62 and 1,6 mg,
respectively). However, P content in femur was significantly (p<0,05) higher in groups fed
prebiotic diets and synbiotic 1,2 and 10% diets (from 106,05 in prebiotic 5% diet to 108,74 mg
in prebiotic 1,2% diet) than control group (103,56 mg). Fe content in femur was only
significantly (p<0,05) higher in group fed synbiotic 5% diet (7,70 mg) than in group fed control
diet (5,71 mg).
We conclude that no problem group showed a femur more weighty than control group,
possibly due to its development was more related to body weight. However, Ca deposition was
significantly (p<0,05) larger in all problem groups and P deposition in groups fed prebiotic and

320
synbiotic 1,2 and 10% diets than control group, with no effect on Mg and Fe content. No dose-
effect relationship or sinergic effect of bifidobacteria and 4-GOS (synbiotic diets) was observed.

Table 31. Bone development of the femur (mg of mineral/g of bone dry weight) in rats
Dry weight Ash weight Calcium Magnesium Phosphorus
Diets Iron content
(mg) (%) content content content
AO4 453,205,59 56,770,44 229,593,59 7,230,89 3,370,12 105,850,57
Control 349,6010,76 57,240,10 156,030,42 5,710,80 1,820,05 103,560,00
Probiotic 275,314,40*/b 54,630,70*/ab 181,580,83*/b 5,060,35b 1,720,08a 105,310,38bc
Prebiotic 1,2% 282,254,49*/b 57,010,78a 197,673,46*/a 5,790,13b 1,630,00*/a 108,740,00*/a
Prebiotic 5% 304,132,75*/a 55,810,41ab 182,331,18*/b 5,720,44b 1,620,08*/a 106,050,85*/abc
Prebiotic 10% 289,008,74*/ab 55,560,45ab 168,833,02*/c 5,770,38b 1,600,02*/a 108,170,69*/ab
Synbiotic 1,2% 197,527,09*/c 53,890,64*/b 196,743,71*/a 6,250,06ab 1,730,02a 107,270,41*/ab
Synbiotic 5% 267,432,74*/b 54,510,76*/ab 206,780,41*/a 7,700,52*/a 1,710,02a 104,200,88c
Synbiotic 10% 287,104,54*/ab 53,370,08*/b 181,072,75*/b 6,300,21ab 1,630,01*/a 108,490,42*/a
Values are meanSE, n=6
*
within the same column shows significant differences (p<0,05) by bilateral separate means test in groups fed probiotic, prebiotic and
synbiotic diets with respect to control group
a-c
Means with unlike superscript letter in the same column are significantly different by Tukeys test (p<0,05) among groups fed
probiotic, prebiotic and synbiotic diets

Table 32 shows dry weight, ash content and mineral content (Ca, Mg, P and Fe),
expressed in mg of mineral/g of dry weight bone, of the tibia in rats after mineral balance. All
problem groups showed a significantly (p<0,05) less weighty tibia (from 171,53 mg in synbiotic
1,2% diet to 241,03 mg in prebiotic 1,2% diet) than control group (285,72 mg) as in femur,
with the lightest tibia in group fed synbiotic 1,2% diet. No problem group displayed a
significantly (p<0,05) greater ash content than control group (58,68%). Ca content of tibia in
all problem groups was significantly (p<0,05) higher than control group (144,70 mg) ranging
from 171,93 to 188,21 mg, with no statistical differences. No problem group showed a Mg
content of tibia with significant differences (p<0,05) respect to control group (2,44 mg).
However, P content was significantly (p<0,05) higher in groups fed prebiotic and synbiotic diets
than control group (98,60 mg), but differences were observed between groups fed probiotic
and control diets. Fe content in tibia was significantly (p<0,05) larger in groups fed prebiotic
5% and synbiotic 1,2 and 10% diets (9,67, 9,50 and 9,81 mg, respectively) than group fed
control diet (7,06 mg).
We conclude that tibia neither showed a significant (p<0,05) more weight in problem
groups than control group. Although no effect was observed on Mg content of tibia, 4-GOS
supplementation increased Ca and P contents.

321
Table 32. Bone development of the tibia (mg of mineral/g of bone dry weight) in rats
Dry weight Ash weight Calcium Magnesium Phosphorus
Diets Iron content
(mg) (%) content content content
AO4 382,1710,87 57,430,10 223,605,47 7,680,22 2,990,22 108,331,95
Control 285,725,81 58,680,10 144,704,74 7,060,99 2,440,15 98,603,55
Probiotic 210,087,42*/a 57,020,22a 171,932,12*/b 6,660,35c 2,580,08a 104,600,83a
Prebiotic 1,2% 241,035,92*/a 57,120,04a 187,582,09*/a 7,640,71bc 2,760,07a 107,690,47*/a
Prebiotic 5% 238,785,45*/a 57,840,17a 180,643,90*/ab 9,670,19*/ab 2,620,13a 105,920,92*/a
Prebiotic 10% 231,156,15*/a 56,440,58a 188,211,73*/a
8,600,45abc
2,440,08a 106,960,86*/a
Synbiotic 1,2% 171,533,23*/b 54,871,05*/a 180,340,81*/ab 9,500,10*/ab 2,710,04a 106,180,83*/a
Synbiotic 5% 221,831,42*/a 54,651,18*/a 185,232,42*/a
9,220,49 ab
2,650,18a 107,331,00*/a
Synbiotic 10% 234,433,13*/a 55,491,89a 179,920,28*/ab 9,810,39*/a 2,750,24a 105,760,69*/a
Values are meanSE, n=6
*
within the same column shows significant differences (p<0,05) by bilateral separate means test in groups fed probiotic, prebiotic and
synbiotic diets with respect to control group
a-c
Means with unlike superscript letter in the same column are significantly different by Tukeys test (p<0,05) among groups fed
probiotic, prebiotic and synbiotic diets

Chonan et al. (1995) observed that in rats fed diet containing 4-GOS 5% Ca content of
femur increased significantly (p<0,05), but no effect was reported in dry and ash weights
respect to control group. On the contrary, ash weight of tibia increased significantly but dry
weight and Ca content were not affected. In our study no significant (p<0,05) increase was
observed in dry and ash weights of femur and tibia, but in both bones Ca content was
significantly (p<0,05) higher in all problem groups than control group. Moreover, Ca content of
the diet has effect on bone mineralization. Thus, a diet containing 2.150 mg Ca/100 g increased
significantly ash weight of femur and Ca content of femur and tibia, however a diet containing
215 mg Ca/100 g did not affect parameters of bone mineralization (Chonan and Watanuki,
1996). Diets used in the present work contained an intermediate Ca content (572 mg de Ca/100
g) to that used by Chonan and Watanuki although we used the same amount of Ca in all diets,
therefore the differences showed in Ca deposition was due to the bifidobacteria or 4-GOS
supplementation.

7. Relationship among morphology variables and pH of the large intestine content,

mineral bioavailabilty and bone mineralization

7.1. Effect of initial body weight on the weight of target organs (cecum, colon,
femur and tibia)

A second study to check the effect of diets on wall cecum weight, wall colon weight,
femur dry weight and tibia dry weight was carried out, but controlling the influence of initial
body weight (co-variable). Thus, we can remove the effect of the different initial weights found
in the groups on the assessment of the effect of diets on the target organ weights (cecum,
colon, femur and tibia). In Table 33 can be observed as the diet was a factor of variation of the
target organs weights and in three of them (cecum weight, wall colon weight and tibia dry
weight) the initial body weight was not determinant on the significant differences due to the

322
type of feeding. Only in femur dry weight we cannot state that groups with different femur
weights will not be due to the different initial body weight at the beginning of the study.

Table 33. Study of the effect of initial body weight on the weight variation of target organs
Variable Diet Co-variable: Initial body weight
Wall cecum weight *** NS
Wall colon weight *** NS
Femur dry weight *** **
Tibia dry weight *** NS
Statistical significance: **p<0,01; ***p<0,001; NS=not significance

7.2. Correlation study among morphology parameters, pH of the large intestine

content, mineral bioavailability and bone mineralization

Table 34 shows the coefficients of correlation between pH values of the cecal and
colonic contents and the hystological parameters of their mucosa. Thus, pH of cecal content
was not correlated with crypt depth or cell density of the cecum, while , pH of colonic content
was negatively correlated with crypt depth and cell density of proximal colon (r=-0,773 and -
0,489, respectively) and with cell density of distal colon (r=-0,644). Therefore, it is in the
colonic mucosa where cell proliferation is observed due to the lowest value of pH among all the
colonic contents, generated by the fermentation of dietary 4-GOS. However, other authors
have found in the cecum a negative correlation between pH and crypt depth (Tashiro et al.,
1997), being the pH less correlated with cell proliferation in the more distal portions of the large
intestine (Edwards et al., 1992), since the other sources of NDO used by these authors were
mainly fermented in the cecum. Nevertheless, in our work the fermentation of the dietary NDO
by cecal or colonic microflora or that provided in the diet (synbiotic diets), occurred so much in
the cecum as much as in the colon, as show the low pH values of their contents (Tables 27 and
28) and the high correlation found between the variables pH of the cecal and colonic contents
(r=0,87).

Table 34. Coefficients of correlation between pH of cecal and colonic contents with the other hystological
parameters in the cecal and colonic mucosa
Crypt depth of Cell density of
pH colon
cecum cecum
CC 0,870
pH cecum NS NS
Significance 0,000
Crypt depth of Cell density of Crypt depth Cell density of
proximal colon proximal colon of distal colon distal colon
CC -0,773 -0,489 -0,644
pH colon NS
Significance 0,000 0,015 0,001

NS=not significant for p<0,05, CC: correlation coefficient

In Table 35 are shown the coefficients of correlation between mineral AA and the
parameters measured in the cecum and colon. AA of Ca was negatively correlated with the pH

323
of colonic content (r=-0,502) and positively with the crypt depth and cell density of proximal
colon (r=0,418 and 0,556, respectively) and distal colon (r=0,870 and 0,581, respectively). AA
of Mg was negatively correlated with the pH of the cecal and colonic contents (r=-0,785 and
r=-0,728, respectively), but positively with crypt depth of the proximal and distal colon
(r=0,639 and r=0,590, respectively) and with cell density of distal colon (r=0,658). AA of P was
positively correlated with cell density of cecum (r=0,601), crypt depth of distal colon (r=0,581)
and cell density of proximal colon (r=0,423). AA of Fe was negatively correlated with the pH of
the cecal content and crypt depth of cecum (r=-0,671 and -0,554, respectively). The absorption
of this mineral was also negatively correlated with the pH of colonic content and positively with
the crypt depth of the proximal colon (r=-0,666 and r=0,730, respectively).

Table 35. Coefficients of correlation between mineral apparent absorption and the parameters
measured in the large intestine
Calcium Magnesium Phosphorous Iron
CC -0,785 -0,671
pH cecum NS NS 0,000
Significance 0,000
CC -0,502 -0,728 NS -0,666
pH colon
Significance 0,012 0,000 0,000
Crypt depth of CC NS -0,554
NS NS
cecum Significance 0,005
Crypt depth of CC 0,418 0,639 NS 0,730
proximal colon Significance 0,042 0,001 0,000
Crypt depth of CC 0,870 0,590 0,581 NS
distal colon Significance 0,000 0,002 0,003
Cell density of CC 0,601 NS
NS NS 0,002
cecum Significance
Cell density of CC 0,556 0,423 NS
NS 0,040
proximal colon Significance 0,005
Cell density of CC 0,581 0,658 -0,503 NS
distal colon Significance 0,003 0,000 0,012
NS=not significant for p<0,05, CC: correlation coefficient

7.3. Regression study among mineral absorption, morphological parameters and the
pH of the large intestinal content

The lineal regression study carried out by successive steps technique, allowed to obtain
lineal regression equations for Ca, Mg and Fe absorption to predict their absorption percentages
in the large intestine from the variables studied (pH, crypt depth and cell density of the cecum
and colon). For P it was not possible to obtain a lineal regression model to forecast the
behaviour of the intestinal absorption.
For Ca was found a lineal relationship between Ca absorption and crypt depth in distal
colon: % Ca absorption = -43,86 + 0,32 x crypt depth of distal colon, R2=0,76). This
relationship increase lineally, thus the groups with a higher crypt depth in the distal colon,
showed the larger Ca absorption percentages (groups fed prebiotics diets and synbiotic 5 and
10% diets).
For Mg were found the following four multiple lineal regression models:

324
 (1) % Mg absorption = 28,10 + 0,06 x crypt depth of proximal colon + 1,14 x cell
density of distal colon, R2 =0,67).
(2) % Mg absorption = 166,54 + 0,38 x cell density of distal colon 17,23 x pH of
cecal content, R2 =0,63).
(3) % Mg absorption = 203,94 5,94 x pH of colonic content 16,23 x pH cecal
content, R2=0,63).
(4) % Mg absorption = 88,67 + 0,74 cell density of distal colon + 0,045 x crypt depth
of proximal colon 7,91 x pH of cecal content, R2 =0,70).

The previous regression models show that Ca absorption mainly takes place in the
colon, due to groups with a higher crypt depth and similar cell density show bigger cells, and
therefore a larger surface for mineral absorption. Thus, Delzenne et al. (1995) proposed the
increase on the surface for absorption in the large intestine as a mechanism for explaining a
higher retention of Ca and Mg. Equally, it has been described in isolated rat (Diener et al.,
1993) and human (Rowe et al., 1993) colonocytes that their exposition to SCFA produced a
decrease of intracellular pH. For recovering the intracellular pH, cells have some mechanisms
involving Na + /H+ exchange and H+ /AGCC co-transport. This ion exchange cause cell swelling
and increase intracellular Na + content.
On the other hand, Mg absorption not only takes place in the colon but also in the
cecum, as showed by the lineal regression. Low pH values of the cecal content lead the
formation of soluble forms of this mineral, stimulating so its passage through the cecal mucosa
(Scharrer and Lutz, 1992; Baba et al., 1996). However, pH of the colonic content had a small
effect or it was overlapped by morphological variables in this portion of the intestine, since its
incorporation to the regression equation do not increased the coefficient of correlation (0,70), in
spite of showing a significant (p<0,001) effect. Regarding to the effect of the cecal crypts, it is
important to emphasize that Mg absorption was increased with a higher cell density in the distal
colon and crypt depth in the proximal colon. This fact may be due to the competition described
between Ca and Mg for the absorption sites in the large intestine (Ohta et al., 1994a). Some
studies have shown that cecum and colon have the capacity to absorb Ca and Mg, however the
portion of intestine where this function takes place changes according to the mineral and the
source of fermentable fiber which stimulates the mineral absorption (Demign et al., 1989;
Levrat et al., 1991; Younes et al., 1993; Ohta et al., 1995a). Chonan and Takahashi (1999)
have reported that the effect of GOS on Ca absorption mainly takes place in the cecum due to
its trophic effect on cecal mucosa, while Mg absorption is due to the contribution of the
different parts of the intestine (cecum, colon and rectum). However, Delzenne et al. (1995)
using FOS as source of non-digestible carbohydrates, found that Mg absorption mainly takes
place in the colon, and Ca absorption in the cecum. In our study no positive relationship
between Ca absorption and the morphological variables in the cecum was found. On the
contrary, in proximal and distal colon differences in the crypt depth and cell density among

325
groups were described, and might explain the Ca and Mg absorption due to the increase of the
absorption surface. Moreover, the pH decrease of the cecal content due to the microbial
fermentation of GOS can generate soluble forms of Mg more easily absorbable.

Finally, for Fe as well as for Mg, it was found a multiple lineal relationship between Fe
absorption, crypt depth in proximal colon and pH of colonic content: % Fe absorption = -47,43
+ 0,09 x crypt depth of proximal colon 10,42 x pH colonic content, R2=0,56). The effect of
fermentable carbohydrates on Fe bioavailability is little documented. Kim and Atallah (1993)
have proposed an absorption mechanism through Fe soluble complexes with free carboxyl
groups derived from the fermentation when pectin is used as the source of fermentable
carbohydrates. These carboxyl groups were available for ionic interaction with Fe soluble
complexes, facilitating in this way their passage through cell membrane.

7.4. Factorial analysis

As a factorial extraction method we used the principal components anal (PCA) to obtain
lineal combinations among the variables and formulate hypothesis related with the causal
mechanisms. This study was separately done with the four minerals (Figures 12-15), to identify
the relationships between the mineral content in femur and tibia and the morphological
variables of large intestine and the pH of the cecal and colonic content. Crypt depth and cell
density of the cecum were removed from the study because did not show variations among the
groups.
Figure 12 shows the PCA of Ca with a total explained variance of 79,75%. Component
1 (vertical axis) displays the inverse relationship among pH values of cecal and colonic contents
and the remaining variables. As it is shown in Table 35 this relationship is higher (r=-0,50)
between pH of the colonic content and the Ca absorption. In the Component 2 (horizontal axis)
has been evaluated the association between the variables by proximity in the graph. In the four
figures pH of the cecal and colonic contents are close in the graph, showing that low values in
one portion of the large intestine also appears in the other portion (r=0,87 in Table 34).
Component 2 also shows the lineal relationship between Ca AA and retention with crypt depth
of the distal colon (Figure 12) and between intestinal absorption of Ca and Ca content in tibia.

326
 1

cell density proximal colon

pH cecum

crypts depth
0,5 pH colon distal colon
Ca retention
Ca absorption
Component 2

Ca tibia
0
cell density distal colon

Ca femur

-0,5
crypts depth proximal colon

-1

-1 -0,5 0 0,5 1

Component 1

Figure 12. Graphic representation of principal components analysis of Ca

The PCA carried out to show graphically the relationship among Mg content in the
femur and tibia and the parameters measured in the large intestine (Figure 13) displayed a
total explained variance of 71,17%. As in the previous mineral, Component 1 showed a inverse
relationship between pH of the cecal and colonic contents and Mg absorption. Moreover, from
the Figure 13 three points can be reported: a) the existence of a great relative distance
between Mg absorption and retention variables, due to a large urinary excretion of Mg, mainly
in groups fed synbiotic 1,2 and 5% diets (Table 24); b) the relationship of the Mg content in
tibia with crypt depth of the proximal colon and cell density in distal colon (as it was described
with Ca); and c) the absence of relationship of Mg content in femur with all the studied
variables. Finally, we can observe the four lineal regression models established for this mineral
by means of the dispersion of the variables in the graph.

327
 1
cell density
proximal colon
crypts depth
distal colon
pH cecum
Mg retention
0,5
pH colon
Component 2

Mg absorption
0
crypts depth proximal colon

cell density distal colon

Mg tibia

-0,5
Mg femur

-1
-1 -0,5 0 0,5 1

Component 1
Figure 13. Graphic representation of principal components analysis of Mg

Figure 14 shows the PCA to observe graphically the relationship among P balance, its
content in femur and tibia and the parameters measured in cecum and colon, showing a total
explained variance of 74,01%. On the opposite to the two previous studies, the distribution of
the variables in the graph showed a higher dispersion. Nevertheless, it can be appreciated
again a relationship of proximity between both pH parameters, and between P absorption and
retention (which displays a negligible P urinary excretion). P content in femur and tibia showed
a positive relationship with high values in crypt depth of proximal and distal colon, but inversely
proportional to the low pH values, more clearly with P content in tibia. These relationships can
be appreciated in the graph due to their disposition in the plane.

328
 1
P absorption

pH cecum P retention
crypts depth
distal colon
cell density
0,5 pH colon proximal colon
Component 2

P femur
P tibia

0
crypts depth
proximal colon

cell density
distal colon
-0,5

-1
-1 -0,5 0 0,5 1

Component 1

Figure 14. Graphic representation of principal components analysis of P

The last PCA (Figure 15) was carried out to study the degree of association among the
variables Fe content in femur and tibia, Fe absorption and retention, pH of cecal and colonic
contents and the morphological parameters of both portions in the large bowel. Total explained
variance was of 75,30%, also with Fe is again observed the association by proximity of both pH
of cecal and colonic contents and an inverse relationship between the decrease of these two
variables with the increase of Fe absorption and retention. The multiple regression model
brought up to interpret Fe absorption from the pH values of the cecal content and crypt depth
of the of the proximal colon, can be assessed in the present figure. Finally, Fe content in femur
and tibia showed a high relationship of proximity with the values obtained for Fe absorption and
retention. Therefore, we can assume that an increase in the intestinal captivation of Fe might
be corresponded with a higher Fe content in femur and tibia. Equally but not in a direct way, Fe
content in femur and tibia is positively associated with the high values of cell density of the
distal colon and crypt depth of the proximal colon, and inversely with the low pH values of the
cecal and colonic contents.

329
 1
cell density
proximal colon
crypts depth distal
colon

0,5

pH cecum cell density distal

Component 2

colon

Fe femur Fe absorption
0
pH colon
Fe retention
crypts depth proximal colon

Fe tibia

-0,5

-1
-1 -0,5 0 0,5 1

Component 1

Figure 15. Graphic representation of principal components analysis of Fe

The mechanisms that involve the mineral absorption in the large intestine mediated by
the presence of NDO in the diet could be included in two. The first due to the formation of
soluble complexes as a consequence of pH decrease, and a second mechanism related to the
increase of the surface to mineral absorption, as a reflection of the trophic effect of NDO on
cecum and colon mucosa. In the present study, the relationship between acidification of
intestinal lumen and the increase of mineral absorption has been clearly showed for Mg and Fe.
For both minerals groups fed prebiotic 1,2 and 10% (4 and 6) and synbiotic (7, 8 and 9) diets
displayed higher values in their absorption than the other diets. Mg and Fe also obtained high
correlation factors between apparent absorption and pH of cecal and colonic contents, and in
the regression equations pH was shown as a predictive variable of its intestinal absorption.
Likewise, for Ca it was obtained a significant correlation factor between pH of colonic content
and mineral absorption. However the highest correlation factor was observed with crypt depth
of distal colon. It was the only of the studied variables which displayed a lineal relationship
increasing, and groups fed prebiotic (4, 5 and 6) and synbiotic 5 and 10% (8 and 9) diets
showed higher values of absorption and crypt depth. Moreover, Mg and Fe absorption were
correlated linearly with other parameters of colonic mucosa, such as crypt depth in the proximal
portion (Mg and Fe) and cell density in distal colon (Mg). The fact that some minerals interact
between them, showing a competition for absorption places, could be not reflected in the
results obtained in this study.

330
 It is known that Fe shows a competition with Ca and Mn for the intestinal absorption
(Lnnerdal, 1989; Hallber and Rossander-Hulthen, 1993), and increasing dietary Ca and P
inhibit Mg absorption from the intestine (Ohta et al., 1994a). However for the three minerals
(Ca, Mg and Fe), it has been shown that dietary 4-GOS supplementation enhanced apparent
absorption in groups fed prebiotic and synbiotic diets if compared with the group fed control
diet. Taking into account that has been described intestinal absorption competition among the
minerals (Ca and Fe and Ca and Mg), the places for their absorption have been different, such
as proximal colon for Mg and Fe and distal colon for Ca.
No clear relationships were found between apparent absorption of P and the two
factors involved on its absorption and derived from the intestinal fermentation of 4-GOS (pH
and increase of absorption surface), as correlation and regression studies have shown.
Nevertheless, an increase of P absorption in some groups (fed probiotics and prebiotics 1,2 and
10% diets) has been described with respect to the control group. This suggests that other
factors not evaluated could enhance P absorption. Thus Brommage et al. (1993) described an
increase of Ca, Mg and Zn absorption related with the presence of dietary lactulose. It would be
presumable to think that during thermal process of infant formula some amount of this
compound could be produced (Sarri et al., 2001), with demonstrated prebiotic effect (Sahota
et al., 1982; Kawaguchi et al., 1993) which could stimulate P absorption.
Finally, the four figures of principal components analysis display graphically the two
mechanisms through 4-GOS improve mineral absorption. Component 1 shows the effect of pH
decrease in the soluble complexes of Ca, Mg and Fe formation and easily absorbable by
intestinal mucosa. Component 2 summarised the different effects that colonic mucosa (increase
of crypt depth and cell density) has on mineral absorption and its deposition on bones (more
evident on tibia), that is due in the last instance to 4-GOS fermentation.

331
CONCLUSIONS

Conclusions to the first objective:

1.1. The in vitro fermentation of four types of non-digestible oligosaccharides available by

the species of bifidobacteria Bifidobacterium bifidum, B. breve, B. infantis and B.
longum, shows the galactooligosaccharide 4-galactosyllactose as the most suitable for
bifidobacteria growth.
1.2. The species of infant bifidobacteria that show a larger growth after seven days of
incubation in the presence of 4-galactosyllactose are B. breve and B. bifidum.

Conclusion to the second objective:

2. The bifidobacteria (B. bifidum and B. longum) added to the studied probiotic infant show a
viability above the minimum recommended level (106 cfu/g) during the period of
consumption, estimated in 14 days.

Conclusion to the third objective:

3. The administration of the probiotic infant formula (B. bifidum and B. longum) from the
fourth month to the first year of life, increase significantly fecal bifidobacteria counts, at
seven and nine months of age with regard to those fed control infant formula.

Conclusions to the fourth objective:

4.1. All problem diets stimulate to a great or minor extent mineral absorption, diets formed
by prebiotic 10% and synbiotic 5 and 10% infant formulas increase more clearly Ca, Mg
and Fe absorption than control group. The absorption of phosphorous is larger in the
group fed prebiotic 10% infant formula.
4.2. The supplementation with increasing concentrations of 4-GOS (1,2, 5 and 10%) to the
diets do not raise proportionally the mineral absorption.

Conclusion to the fifth objective:

5. The addition of probiotics (B. bifidum and B. longum) and prebiotics (4-galactosyllactose)
in infant formulas to rats, modify the epithelium of the colon both in the proximal and
distal portions. This modification lead to an increase in the crypts depth and the
number of cells per crypt (cell density). The use of galactoologosaccharides at different
concentrations is not related to a modification in the epithelium of the colon. It is

332
 observed no modification in the epithelium of the cecum due to the probiotics and
prebiotics addition to the infant formulas.

Conclusions to the sixth objective:

6.1. The decrease of pH in the content of the cecum and colon due to the fermentation of
4-galactosyllactose present in the diet, is clearly related to a higher Ca, Mg and Fe
absorption.
6.2. The increase of the mineral absorption shows a high correlation factor to the histology
parameters measured in the mucosa of the large intestine. The absorption of Ca takes
place in the distal colon, the absorption of Fe in the proximal colon, and the absorption
of Mg in the proximal and distal colon.
6.3. The use of probiotics and prebiotics in infant formulas, increases the content of Ca, P
and Fe in the femur and tibia with respect to the group fed with control diet.

Conclusion to the seventh objective:

7. The deposit of Ca, P and Fe in the femur and tibia is related to the increase of crypts depth
and the number of epithelial cells in the colon, and to the decrease of pH of the cecal
and colonic contents. With regard to the increase of Mg deposition, it is only affected in
the tibia and is related with crypts depth and the increase in the number of epithelial
cells in the colon.

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