Materiales y reactivos

Montaje de la pila de compostaje

Tres contenedores con capacidad de 20kg

Aislamiento e identificacin de microorganismos autctonos de la composta

Se realizara la toma de muestra cada semana por 3 semanas, a cada una de las pilas iniciales, total de
muestras = 9

Aislamiento
3 Frascos con 90ml de agua destilada estril
15 tubos de ensaye
Pipetas estriles de 1 y 5ml
Varilla acodada
Caja Petri con alcohol
Las placas se siembran por duplicado de las diluciones 10 -4, 10-5 y 10-6, cada semana se utilizan 18 placas
de PDA.
Total de placas para las muestras 54
Placas para resiembra de hongos filamentosos =
Total de placas PDA =
Se determina UFC, se realiza morfologa colonia, tincin Gram para bacterias, azul de lactofenol para
hongos
Colorantes Cristal violeta, safranina azul de lactofenol
Alcohol-acetona
Portaobjetos y cubreobjetos
Asa y porta asa

Medicin de la actividad ligninoltica en os hongos filamentosos identificados

Lacasa
Cultivos
El hongo se cultiva en matraces de 250ml con 100ml de medio basal (g/l)
75mg/l de CuSO4 *** esta cantidad por que esta probado que induce la produccin de la enzima
2 g/lTartrato de amonio (NH4)2 C4H4O6
10 g/L glucosa
1 g/l H2KPO4 Fosfato monopotsico
0.5 g/l MgSO4 sulfato de magnesio
1 g/l Extracto de levadura
5g/l Peptona
1 mL de solucin de minerales ( 0.16 mg sulfato de manganeso, 0.14 mg de sulfato de zinc, 0.29 mg de
cloruro de cobalto en 1 litro)
pH 5.1
Los matraces fueron inoculados con 1cm de micelio de las cajas Petri previamente homogenizados se
incuba por 7 das y para la determinacin de la actividad enzimtica los cultivos se toma una alcuota de
10ml y se centrifugan a 8000rpm durante 10 min y del sobrenadante resultante se determina la actividad
de lacasa.
http://digital.csic.es/bitstream/10261/49639/1/ES2365430A1.pdf

Para su mantenimiento, la cepa fue crecida a 28C por 7 das en cajas Petri con medio de papa-dextrosa-agar (PDA)
Los preinculos crecieron en matraces Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 100 mL de medio GMY
modificado como describe Mester et al. (1996). Este medio soporta excelente crecimiento pero
relativamente bajos niveles de produccin enzimtica (Pickard et al. 1999b) y contiene por litro: 10 g de
glucosa, 3.5 g extracto de malta, 2 g extracto de levadura, 2 g fosfato de potasio, 0.5 g sulfato de
magnesio, 0.1 g bacto peptona, 1 mL de solucin de minerales (0.5 mg sulfato de cobre, 0.16 mg sulfato
de manganeso, 0.14 mg de sulfato de zinc, 0.29 mg de cloruro de cobalto en 1 litro). El medio se ajusta a
un pH de 4.5. Los matraces fueron inoculados con 1cm de micelio de las cajas Petri previamente
homogenizados con un homogenizador (Sorvall, Norwalk, Conn) por 10 segundos. Los matraces se
colocaron en agitacin orbital a 150 rpm a 29 C

(g/L): glucosa 35; peptona 5; extracto de levadura 2,5; KH 2PO4 H2O 1, MgSO4 7H2O 0,5;
vitamina B1 0,05. Mas sulfato de cobre
http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0034-75152010000400011&script=sci_arttext

medio lquido definido qumicamente (M7GY) que comprende (por litro) 2 g de tartrato de
amonio, 0,5 g de MgSO4 7H 2 O, 1 g de KH 2 PO 4, 0,5 g de KCl, 10 g de glucosa, y 1 ml de solucin
de elementos traza [0,1 g de Na 2 B 4 O 7 H 2 O, 0,07 g de ZnSO4,0,01 g de CuSO 4 5H 2 O, 0,01 g
de MnSO 4 4H 2 O, 0,05 g de FeSO4 7H 2 O, y 0,01 g de (NH 4) 6 Mo7 O 2 4H 2 O por litro]. Los
cultivos se hicieron crecer en agitadores orbitales a 150 rpm en la oscuridad a 24 C y se
cubrieron con filtros de algodn sintticos para permitir el intercambio de aire.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3346406/

Determinacin de la actividad de la lacasa

La actividad de la solucin de enzima se mide como sigue:
La actividad se determina por la oxidacin de 2-2`-Azino-bis (3-ethilbenzatiazolin-6-sufonico) ABTS como
sustrato. La mezcla de reaccin contiene 400l de buffer de acetato de sodio 50mM pH 4.5, 400l de H2O
destilada, 100 l de solucin de ABTS 10mM y 100l de sobrenadante.
Testigo contiene 100l de sobrenadante, 400l de buffer de acetato de sodio 50mM pH4.5 y 500l de H2O
destilada.
La oxidacin de ABTS se sigue por el incremento de la absorbancia a 420nm, la actividad enzimtica se
mide cada 15 segundos, por 3 minutos.

http://www.ops.org.bo/textocompleto/rnbiofa20071504.pdf
La actividad lacasa se determin por la oxidacin de ABTS 5 mM en
tampn acetato sdico 100 mM, pH 5,0 siguiendo la formacin de su radical
catinico a 436 nm (436 29.300 M1 cm1)
http://dspace.uah.es/dspace/bitstream/handle/10017/6283/TESIS%20ANA%20ISABEL%20CA%C3%91AS
%20PORTILLA.pdf?sequence=1

- Se prepar una solucin de enzima 1:100 V/V con amortiguador de pH de acetatos 0.1 M a pH 5 y se
incubaron a 25 oC.
- Se prepar una solucin de ABTS 5 mM e incub a 25 oC.
- El testigo se hizo mezclando 0.1 mL de solucin de lacasa, 0.1 mL de amortiguador de pH de acetatos 1M
a pH 5 y 0.8 mL de agua destilada.
- Las muestras se prepararon con 0.1 mL de solucin de lacasa, 0.1 mL de amortiguador de pH de acetatos
1 M a pH 5, 0.7 mL de agua destilada y 0.1 mL de ABTS 5 mM.
- Las muestras se mezclaron perfectamente y se ley el cambio de absorbancia a 414 nm cada 15
segundos, por 3 minutos, usando un espectrofotmetro UV-Vsible Beckman DU 640.
- Se grafic el cambio de absorbancia contra el tiempo.
- La pendiente correspondi a la velocidad inicial (Vo) de oxidacin del ABTS con lacasa.
- Se calcul la actividad tomando en cuenta el coeficiente de extincin molar del
ABTS (36 000 M-1 cm-1) (Tiller et al, 1999) y la dilucin de la lacasa.

Lignina peroxidasa
La determinacin de la enzima lignina peroxidasa (LiP) radic en la oxidacin de 80 L de alcohol
veratrlico (Aldrich D-13) 10mM en presencia de 20 L de H2O2 (Merck) 4mM, 400 L de buffer tartrato
(Riedel-Dehaen.Seelze-Hannover) 0,25M y 1500 L del extracto enzimtico. Esta reaccin complet un
volumen de 2 mL. La lectura se realiz a 310 nm antes
y despus de los 3 min de reaccin. El blanco para esta medicin es la misma proporcin de reactivos y de
extracto enzimtico descritos anteriormente. Sin embargo, los 20 L de H2O2 son reemplazados por agua
destilada. Las unidades enzimticas (U/L) de LiPse calculan empleando la Ecuacin
Manganeso peroxidasa
Para la cuantificacin de MnP se utiliz el mtodo descrito por Rubilar (2007). En un tubo ependorf se
adicionaron, en el orden indicado 50L de cada uno de los siguientes reactivos:
Rojo de fenol 0.01%(p/v), lactato de sodio 25 mM, MnSO4 100 M, albmina de huevo 0.1%(p/v),
succinato de sodio 20 mM pH 4.5, posteriormente se adicionaron 700 L de muestra y 50 L de H2O2 100
M y se agit la mezcla de reaccin, consecutivamente los tubos se metieron a una incubadora a 30C
durante 10 minutos, posteriormente transcurrido el tiempo de reaccin, esta se detuvo por la adicin de
40 L de NaOH 2N y se ley a una absorbancia a una longitud de onda de 610 nm, utilizando como blanco
de reactivos todos los componentes de la mezcla excepto los 50 L de H2O2 que se remplazaron por 50 L
de agua desionizada.
Una unidad de MnP se define como la cantidad de enzima capaz de oxidar 1mol de Rojo de fenol por
minuto bajo las condiciones de la prueba (Saparrat et al., 2002). Para calcular las unidades de actividad
enzimtica, se utiliz un coeficiente de extincin de 4.460 M-1. cm-1 reportado por Michel et al. (1991).

Prueba de antagonismo una vez que se identifiquen los hongos con mejor actividad ligninolitica
Medio PDA # de placas segn el nmero de hongos encontrados con caractersticas deseadas
Asa y porta asa

Realizar un screening de antagonismos entre los microrganismos propios de la composta y los hongos,
por el mtodo del disco central (Reynaldi et al., 2004).
1 Se siembra en el centro de una placa con medio PDA el hongo a probar.
2 Sembrar por tcnica de punto a una distancia de 2.5 cm del hongo, cada una de las colonias
bacterianas o fngicas de la composta original. Se incuban a 37 C de 24 a 48horas para bacterias
y a 28 C 5 a 7 das para hongos.
3 Pasado el tiempo de incubacin se mide el dimetro de las colonias.
 4 Se usan como control placas que solo contengan al hongo y a los microorganismos propios de la
composta original.
5 Se descartaran aquellos hongos que presenten antagonismo, ya sea que se vean inhibidos por
microorganismos autctonos o bien si ocurre el caso contrario, que los hongos a probar inhiban en
forma considerable a los microorganismos autctonos.
Las pruebas de interaccin entre los microorganismos presentes en la composta se realizaran para
asegurar que no existe competencia, ni produccin de sustancias inhibidoras secretadas al medio. Esto
permitir incorporar a los microorganismos seleccionados en una concentracin significativa y probar el
efecto acelerador en el proceso de compostaje. Se permitir descartar los microorganismos que presenten
algn grado de inhibicin mutua.

Medicin de variables fisicoqumicas

Determinacin de pH de 2 a 3 veces por semana por definir

3 tubos de centrifuga
3 frascos de boca ancha
Potencimetro
Centrifuga
Balanza
Soluciones buffer para calibracin

Mtodo potenciomtrico para determinar el pH. Desarrollado por Bates, 1954; Willard, Merrit y Dean, 1958.
1 Pesar 1 g de suelo y colocarlo en un tubo de centrfuga
2 Agregar 10 ml de agua destilada y Agitar
3 Centrifugar a 5000 rpm durante 10 minutos
4 Decantar el sobrenadante y clocarlo en los frascos de boca ancha
5 Calibrar el potencimetro con las soluciones buffer
6 Leer el pH en el potencimetro

Medicin de la temperatura

Termmetro si es posible se toma todos los dias

1 Introducir aproximadamente 30 a 40 cm un termmetro en tres secciones de la composta.

2 Dejar 3 a 5 minutos para registrar la temperatura.

Determinacin de humedad
3 Recipiente de aluminio
Balanza analtica
Desecador
Estufa
1 Utilizar un recipiente o papel aluminio a peso constante.
2 Agregar aprox. 2 g de suelo y dejar en la estufa a 80C por 24 h.

Determinacin de nitrgeno total (Microkjendalh)

El nitrgeno de las muestras se digiere con cido sulfrico caliente ms un agente cataltico que favorece
la reaccin convirtiendo todo el nitrgeno orgnico e inorgnico a nitrgeno amoniacal. El amonio se libera
al agregar un lcali y destilar la muestra por arrastre de vapor en cido brico, con el cual se forman los
iones amonio y borato. La titulacin es indirecta con cido valorado.

Equipo
Digestor y destilador microkjendahl

Reactivos
* H2SO4 concentrado
* Catalizador: 50 g K2SO4 + 2 g HgO. Mezclar en un molino de bolas hasta obtener un polvo
completamente homogneo.
* Solucin NaOH 32%. Disolver 320 g de NaOH en 1000 ml de agua destilada.
* H3BO3 2%. 20 g de H3BO3 en 1000 ml de agua destilada.
* HCl 0.01 N. 1 ml HCl en 1000 ml de agua destilada. Normalizar con borato de sodio utilizando rojo de
metilo como indicador.
* Rojo de metilo 0.2%. Disolver 200 mg de rojo de metilo en etanol absoluto y aforar a 100 ml
* Azul de metileno 0.2%. Disolver 100 mg de azul de metileno en 50 ml etanol absoluto.
* Solucin indicadora. Mezclar 100 ml de rojo de metilo 0.2% con 50 ml de azul de metileno 0.2%.

Metodologa

En base a la materia orgnica del suelo:

% materia orgnica g de suelo
0.0 2.4 1.00
2.5 7.0 0.50
8.0 0.25

* Adicionar a la muestra pesada 2 g de mezcla catalizadora y 5 ml de H 2SO4 .

* Digerir en el equipo de digestin con extractor de vapores hasta que clarifique.
* Una vez clarificado continuar en digestin por 1.5 2.0 h y dejar enfriar.
* Disolver el residuo en poca cantidad de agua destilada y transferir al tubo del destilador, lavando el
matraz 2-3 veces con agua destilada.
* Colocar 5 ml de cido brico 5% y 2 gotas de indicador en un matraz Erlenmeyer de 250 ml.
* Adicionar 10 ml de NaOH 32% al tubo destilador e iniciar la destilacin por arrastre de vapor colectando
75 100 ml
* Titular el destilado con HCl 0.01 N hasta que el indicador vire de verde a violeta.

Clculo
V2 V1 14.007 N
%N 100
m

Donde:
V2 = Volumen de HCl gastado en la muestra (ml)
V1 = Volumen de HCl gastado en el blanco (ml)
N = Normalidad del HCl (meq/ml)
m = Masa de la muestra (mg)

Tomado de A.O.A.C. 42.014.1970. Oficial methods of anlisis 11 th Ed. Association of Official Analytical
Chemist. Washington, D.C. USA.

Determinacin de fsforo
El fsforo como tal no se encuentra. La forma orgnica se encuentra principalmente en el humus y materia
orgnica y vara de 0.0 0.2%. La inorgnica se encuentra como compuestos de hierro, aluminio, calcio,
flor, etc. Y son ms abundantes que los orgnicos.
El fsforo es un macronutriente esencial para las plantas y, junto con el nitrgeno y el potasio, forma parte
de los fertilizantes de uso generalizado en todo el mundo. El fsforo forma parte de ADN, ARN, pilinas y
fosfolpidos.Mtodo Bray y Kurtz, 1945
Determina fsforo asimilable en suelos. La combinacin de HCl y NH 4F extrae las formas solubles de
fsforo (principalmente PO4). El NH4F disuelve los PO4 debido ala formacin de un in complejo con stos
compuestos en solucin cida. El mtodo es bueno con suelos cidos y aceptable en neutros y ligeramente
alcalinos.
NOTA: El material usado debe ser de vidrio pirex y los frascos para reactivos deben ser neutros o de
Nalgene. El agua debe ser bidestilada o desmineralizada. El material usado debe ser lavado con mezcla
crmica antes de utilizarse.

Reactivos
* Mezcla crmica. 100 g K 2Cr2O7 en 1 l de agua destilada. Calentar hasta disolucin completa y enfriar.
Agregar (en fro) gota a gota 100 ml de H2SO4 concentrado.
* Solucin madre de NH4F 1 N. 37 g de NH4F en agua destilada y aforar a 1 l. guardar en un recipiente de
polipropileno.
* HCl 0.5 N. Diluir 20.2 ml de HCl concentrado en hasta completar 500ml de agua
* Solucin extractora. Agregar 460 ml de agua a 15 ml de solucin madre de NH 4F y 25 ml de HCl 0.5 N.
Almacenar en recipiente de polipropileno. Se conserva hasta por un ao.
* HCl 10 N. Disolver 404 ml HCl concentrado hasta completar 500 ml con agua destilada.
* Solucin molibdato de amonio-HCl. Disolver 15 g de molibdato de amonio tetrahidratado en 350 ml de
agua destilada. Aadir lentamente y con agitacin constante 300 ml de HCl 10 N. Enfriar a temperatura
ambiente y aforar a 1 l con agua destilada. Guardar en frasco mbar con tapn esmerilado. Debe
prepararse cada 2 meses.
* Solucin madre de SnCl2. Pesar 5 g de SnCl22H2O y disolver en 12.5 ml de HCl concentrado. Calentar en
bao Mara hasta completa disolucin. Guardar en frasco mbar con tapn esmerilado y en refrigeracin.
Dura 6 semanas.
* Solucin SnCl2 diluida. Agregar 0.1 ml de solucin madre de SnCl 2 a 33 ml de agua destilada. Preparar
cada 4 h.
* Solucin tipo fosfatos. Pesar 0.4389 g de KH 2PO4. Disolver en agua destilada y aforar a 1 l. Concentracin
100 mg/ml (cada ml tiene 100 ppm)

Procedimiento
1. Pesar 1 g de suelo y agregar 7 ml de solucin extractora, agitar vigorosamente y filtrar. Si queda
turbio, volver a filtrar hasta que quede transparente (medir el filtrado con probeta o colectar en
probeta)
2. Tomar 1 ml de filtrado, agregar 6 ml de agua y 2 ml de molibdato de amonio y mezclar bien.
3. Agregar 1 ml de SnCl2 y agitar. Leer a 640 nm despus de 10 min.
4. Para el blanco, tomar 2 ml de solucin extractora, agregar 5 ml de agua y 2 ml de molibdato de
amonio. Mezclar bien y agregar 1 ml de la solucin de SnCl 2. Mezclar y calibrar el espectrofotmetro
a ceros.
5. Para la curva patrn tomar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 ml de la solucin tipo de fosfatos y aforar a
100 ml, con lo cual se obtienen soluciones desde 1 hasta 10 ppm.
6. Tomar 1 ml de cada dilucin. Agregar 1 ml de solucin extractora, 5 ml de agua y 2 ml de molibdato
de amonio. Agitar bien.
7. Agregar 1 ml de SnCl2 diluido. Mezclar y leer despus de 10 min.
NOTA: Todas las lecturas debern ser ledas antes de 20 min. Por cada lote ledo se prepara un blanco.

De la curva de calibracin se obtuvo la siguiente ecuacin:

Y = mx + b
Y = 0.0424x 0.02
Donde:
Y = absorbancia (nm)
x = Concentracin de fsforo (ppm)

Tomado de Muoz, I.D., C.A. Mendoza, G.F. Lpez, A.A. Soler, M.M. Hernndez. 2000. Manual de mtodos de
anlisis de suelos. UNAM-Iztacala. Mxico, D.F.

Contenido de materia orgnica

Se basa en la oxidacin de la materia orgnica mediante un agente aadido en exceso, este agente ser
valorado posteriormente. La oxidacin se hace con dicromato de potasio y cido sulfrico, con la
consecuente formacin de cido crmico, el cual se valorar con sulfato ferroso.

Reactivos
Dicromato de potasio. Pesar 49.04 g (previamente seco 105C, 3 h) en 1 L de agua
FeSO4 0.5 N. Pesar 139 g (FeSO47H2O) en 500 ml de agua y 45 ml H2SO4, enfriar y aforar a 1 l con agua.
Solucin indicadora. Disolver 0.5 g de difenilamina en 20 ml de agua destilada + 100 ml H 2SO4
concentrado

Mtodo
1. Pesar 0.5 g de muestra (0.2 si el color es muy obscuro)
2. Adicionar 5 ml de dicromato de potasio
3. Adicionar 10 ml de H2SO4 concentrado y agitar.
4. Dejar reposar 30 min.
5. Agregar 100 ml agua destilada
 6. Adicionar 5 ml H3PO4
7. Agitar por aprox. 1 min.
8. Poner 5 gotas de difenilamina
9. Titular con FeSO4 0.5 N

Clculo
V2 10 N FeSO4
5
V1
% MO 0.69

m

donde:

V1 = Gasto de FeSO4 en el blanco (ml)

V2 = Gasto de FeSO4 en la muestra (ml)
NFeSO4 = Normalidad del FeSO4 (meq/ml)
m = Masa de la muestra (g)
0.69 = Factor de conversin de carbono orgnico a materia orgnica