Guia 2. Filtracion Por Membrana y Control de Crecimiento

POSGRADO INGENIERIA SANITARIA Y AMBIENTAL
CURSO MICROBIOLOGIA. GUA DE LABORATORIO 2.
CUANTIFICACIN MICROBIANA
Tcnica filtracin por membrana
La estimacin de poblaciones microbianas en matrices acuosas, puede llevarse a

cabo por tcnicas que implican la concentracin del analito(microorganismos) a
partir de un volumen pre-establecido de muestra; la presencia de
microorganismos patgenos se evala mediante la cuantificacin de
microorganismos indicadores que brindan informacin valiosa respecto a las
eficiencias de los procesos de tratamiento y/o de la bondad del agua para
consumo (inocuidad).
Este mtodo se fundamenta en el principio de exclusin por tamao, en el cual

se hace pasar una muestra de agua (preferiblemente con baja turbiedad) por un
elemento filtrante conocido como membrana, la cual tiene un tamao de poro de
0,45 micromtros que retendr bacterias y microorganismos de mayor tamao;
se coloca el elemento filtrante sobre la superficie de un medio de cultivo
selectivo que favorezca el crecimiento de los microorganismos de inters.
Materiales
Embudos de filtracin estriles
Pinzas para membrana
Membrana estril nitrocelulosa o equivalente con tamao de poro de 0,45
micras
Agua de dilucin
Medio de cultivo selectivo (Ejemplo: endo, cromocult, Colistant)
Incubadoras
Probetas estriles en caso de requerirse
Procedimiento
Recolecte una muestra de agua de acuerdo con las indicaciones del
instructor.
Reconozca los materiales y equipos. Rotule adecuadamente las cajas petri.
Colocar una membrana filtrante estril, sobre el porta filtro, usando pinzas
estriles (cuadriculada hacia arriba). Ensamblar nuevamente el embudo.
Homogeneizar la muestra agitndola con movimientos de arriba hacia
abajo.
Hacer un lavado preliminar para humedecer la membrana con 20 50 mL.
Encender la bomba y proceder a filtrar al vaco que no se exceda una
presin de 15 PSI
Verter la cantidad de la muestra requerida o establecida (100 mL, 50 mL,
20 mL) en el vaso (embudo) del filtro y filtrar con vacio
Lavar el embudo con aproximadamente 50 mL de agua peptona estril al
0,1% u otro diluyente.
Remover el filtro, y con una pinza estril transferir la membrana a la placa
de Petri que contiene el medio de cultivo correspondiente al
microorganismo que se va a identificar. La membrana se coloca
suavemente sobre la superficie del agar con el fin de evitar la formacin
de burbujas.
Esperar 10 minutos para permitir la adhesin de la membrana al filtro.
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Realizar un control positivo y un control negativo dependiendo del

microorganismo a analizar.
Resultados
1. Realice una comparacin de los recuentos de las muestras de agua
analizadas por los diferentes grupos.
2. Discuta los resultados en funcin del origen de la muestra y el indicador
microbiano empleado.
CONTROL DE CRECIMIENTO MICROBIANO
El control del crecimiento de microorganismos puede efectuarse limitando el

crecimiento mediante un proceso denominado INHIBICIN o destruyendo los
organismos por ESTERILIZACIN. Los agentes antimicrobianos son compuestos
qumicos, que matan o inhiben el crecimiento; de esta manera tenemos
compuestos bactericidas, fungicidas y virucidas cuando afectan bacterias, mohos
y virus respectivamente. El efecto sobre los microorganismos vara dependiendo
del tipo de compuesto, su concentracin y el tiempo de exposicin. Aplicado a
bacterias se observa un efecto bacteriosttico cuando se inhibe el crecimiento
pero no hay muerte celular, estos compuestos pueden frenar la sntesis de
protenas y actan unindose a los ribosomas, sin embargo estas uniones no son
permanentes y cuando se disminuye la concentracin del compuesto, puede
observarse crecimiento celular.
Los agentes bactericidas eliminan las clulas pero no generan lisis celular
(prdida de la integridad celular, generalmente por rompimiento de la pared),
este tipo de compuesto no se elimina por dilucin puesto que se unen
fuertemente a sus objetivos celulares. Los agentes denominados bacteriolticos
provocan la muerte celular por lisis que se establece por el decrecimiento en el
nmero de clulas o en la turbidez del medio de crecimiento.
Materiales
Caja de petri con medio no selectivo
Cepas de bacteria gram positiva y gram negativa
Hisopo estril
Papel filtro estril (crculos aprox. 1 cm dimetro)
Pinzas estriles
Soluciones comerciales de compuestos (hipoclorito, perxido, etanol,
creolina)
Incubadora
Mechero
Procedimiento
1. Identifique y rotule adecuadamente cada uno de los materiales
2. Limpie y desinfecte su mesn de trabajo
3. Encienda el mechero y en un rea cercana a la llama, destape el hisopo
estril e imprgnelo con la suspensin del microorganismo
4. Extienda el microorganismo en toda la superficie de una placa de petri con
medio no selectivo
5. Impregne un disco de papel estril con una de las soluciones
desinfectantes y colquelos en la placa inoculada, permita al papel
escurrir adecuadamente.
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6. Repita el procedimiento con los dems productos asegurndose de que los

papeles queden lo suficientemente distanciados unos de otros y alejados
del borde de la caja.
7. Lleve a incubacin a 35 grados Celsius por 24 horas
RESULTADOS
1. Compare el crecimiento de los microorganismos problema, discuta el
fundamento o principio activo de cada uno de los compuestos empleados
en funcin del efecto observado.
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