Rev Cubana Aliment Nutr 2001;15(1):20-5

Instituto de Nutricin e Higiene de los Alimentos

VALIDACIN DE UN MTODO PARA LA DETERMINACIN DE PATULINA

EN JUGOS Y PURS DE FRUTAS POR HPLC
Eyda Otero Fernndez-Trevejo,1 Jos Antonio Arias Verds2 y Ramn Sersa Espinosa3

RESUMEN
Se valid el mtodo de la Association of Official Analytical Chemist (AOAC) para la
determinacin de patulina en jugo de manzana por cromatografa lquida de alta presin
(HPLC) con detector ultravioleta a 275 nm y una columna RP18, para jugo de manzana y
pur de frutas. Se emple como fase mvil una mezcla al 10 % acetonitrilo-agua con una
velocidad de flujo de 2,7 mL/min. La patulina present un tiempo de retencin de
14,8 0,3 min. La ecuacin de regresin fue Y = 1952,5X + 1673,5 y el coeficiente de
correlacin lineal de 0,9991. Se obtuvo un recobrado medio del 82,51 % y un coeficiente
de variacin del 3,33 % para los niveles de contaminacin ensayados. La repetibilidad de
una muestra contaminada con 33 g/L de patulina fue de 3,12 g/L. Se estableci para
los jugos el lmite de deteccin en 1,72 g/L y el de cuantificacin en 5,2 g/L. Los purs
de frutas fueron previamente diluidos y centrifugados, proponindose para el mango una
purificacin adicional por columna. Fue diseado un control de calidad interno para el
procesamiento de las muestras.

DeCS: PATULINA; CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESION; ANALISIS

DE REGRESIN.

La patulina es una micotoxina produ- los estudios en animales de experimenta-

cida como metabolito secundario por un cin en especies de no roedores.
gran nmero de hongos de los gneros La patulina puede detectarse en fru-
Penicillium y Aspergillus, entre los que se tas, hortalizas, cereales enmohecidos y
encuentra incluido el P. expansum. Se le piensos, no obstante, no puede excluirse la
confiere alta toxicidad para clulas de plan- presencia de esta micotoxina en las frutas
tas y animales. Presenta carcter aparentemente sanas. El grado de conta-
hepatotxico, nefrotxico e inmunotxico. minacin est relacionado con el grado de
Aunque su carcinogenicidad no ha sido de- podredumbre y la patulina apenas se ex-
mostrada, los expertos proponen continuar tiende fuera de los tejidos alterados; por

1
Licenciada en Bioqumica. Aspirante a Investigadora.
2
Licenciado en Qumica. Investigador Auxiliar.
3
Tcnico en Qumica.

20
consiguiente, la exposicin humana no es identificacin y cuantificacin se inyecta-
posible sino a partir de frutas elaboradas.1,2 ron 20 L de extracto en un cromatgrafo
Estudios realizados en diferentes pa- lquido de alta presin Knauer, con una
ses indican una moderada a alta incidencia bomba isocrtica de doble pistn acoplado
de patulina, particularmente en productos a un detector Shidmazu UV-visible mode-
de manzana, aunque los niveles de conta- lo SPD-6AV y un integrador Shidmazu
minacin son generalmente bajos. Ocasio- modelo C R6A Chromatopac. Se emple
nalmente, altas concentraciones de patulina una columna cromatogrfica de 25 cm x 4 mm,
se han encontrado, alcanzando 1 000 g/L o rellena con Spherisol C18 de 100 A y 5 g de
ms. Varios pases han establecido un lmi- tamao de partcula. La columna se alma-
te regulatorio de 50 g/L, valor que reco- cen con el 80 % de acetonitrilo agua
mienda la Organizacin Mundial de la Sa- bidestilada. Se trabaj con el flujo de la
lud. fase mvil en 2,7 mL/min. Se estableci
Varios mtodos analticos han sido la longitud de onda del detector UV a 275 nm y
publicados entre los que se encuentran la la sensibilidad a 0,04 unidades de
cromatografa de capa delgada3-5 con reve- absorbancia en la escala completa.
lado de color, la cromatografa de gases Para verificar la linealidad de la res-
con agentes derivatizantes y ms reciente- puesta del detector UV con respecto a la
mente la cromatografa lquida de alta pre- concentracin de patulina, se construy una
sin (HPLC) con detector UV o arreglo de curva de calibracin con 4 puntos por tri-
diodo.6,7 plicado a partir de una solucin interme-
El objetivo de este trabajo fue estable- dia de 8,26 g/mL en frascos volumtricos
cer y validar un mtodo de anlisis de de 10 mL con las concentraciones siguien-
patulina en jugos y compotas de manzanas tes: 0,248; 0,496; 1,24 y 2,478 g/mL. La
por HPLC con deteccin ultravioleta. determinacin de la concentracin del pa-
trn de patulina para la construccin de la
curva fue realizada segn procedimiento de
MTODOS la AOAC.8
Para ensayar el mtodo se emplearon
Se realiz la validacin del mtodo muestras de 1 kg de jugo de manzana y de
oficial de la Association of Official pur de mango, las cuales son representa-
Analytical Chemists (AOAC) para la deter- tivas de otras frutas como pera, melocotn
minacin de patulina en jugo de manzana y fruta bomba en cuanto a las interferencias
por HPLC,6 segn los principios del Codex. presentes. Las muestras se dividieron en 5 por-
Este mtodo es aplicado para la de- ciones, una porcin fue utilizada como blan-
teccin y cuantificacin de patulina en jugo co muestra y las restantes fueron contami-
de manzana y fue extrapolado a otras ma- nadas con 33; 103,16; 51, 63 y 21,16 g/L.
trices como pur de peras y mango. La La primera porcin contaminada se utiliz
patulina fue extrada con acetato de etilo y para los estudios de repetibilidad y el resto
purificada por particin en una solucin para conocer la exactitud del mtodo. Cada
de carbonato de sodio. La muestra extra- porcin de ensayo fue subdividida en mues-
da se sec con sulfato de sodio anhidro. tras de 5 mL cada una. Se estableci el
Despus de evaporar el acetato de etilo, lmite de deteccin como la cantidad que
la patulina se redisolvi en 300 L de fase equivale a 3 veces la desviacin causada
mvil (10 % acetonitrilo-agua). Para la por el ruido de fondo de una muestra de

21
 FIG. 1. Curva de calibracin.

jugo de manzana sin contaminar y el de Bajo las condiciones descritas en este

cuantificacin como 3 veces el lmite de artculo, 24,8 ng de patulina producen la se-
deteccin del mtodo y se implant un sis- al, con un tiempo de retencin de 14,8
tema de control interno de la calidad. 0,3 min (fig. 2).
Los resultados fueron sometidos a tra- En la figura 3 se presenta un croma-
tamientos estadsticos. Se realiz una prue- tograma de una muestra de jugo de manza-
ba de Student para determinar los lmites
superiores e inferiores de la pendiente de
la curva de calibracin, y una prueba de
Duncan con un nivel de significacin del 5 %,
para determinar si existan diferencias sig-
nificativas entre los valores de recobrado
obtenidos para los 3 niveles de contamina-
cin empleados en los estudios de exacti-
tud.

RESULTADOS

La figura 1 presenta la curva de cali-

bracin y la ecuacin de regresin que re-
laciona las reas promedio de cada pico
calculadas por integracin electrnica y la
cantidad de patulina en el intervalo de 4,96 a
49,6 ng, con un coeficiente de regresin
lineal de 0,9991. Los lmites superior e
inferior de la pendiente fueron de 2 085 a 1 820
respectivamente, con una varianza de 41,66. FIG. 2. Cromatograma de un patrn de 24,8 ng de patulina.

22
 El lmite de deteccin y cuantificacin
se estableci en 1,72 y 5,16 g/L de patuli-
na, respectivamente para los jugos de man-
zana, pera y melocotn.
Una muestra de jugo de manzana de
25 g/L de patulina enviada como material
de referencia, para el estudio intercalibra-
cin FAPAS, dio como resultado 25,3 g/L
de patulina, muy cercano al valor real, lo
cual demuestra la competencia tcnica del
mtodo.10
En el procesamiento de las muestras
de pur de mango y pera fue necesario di-
luir con 5 mL de agua y centrifugar a
3 000 r.p.m. durante 15 min para eliminar
los slidos disueltos y otras interferencias
previo a la extraccin; a pesar de ello, en
el mango continuaron presentes interfe-
rencias asociadas con determinados
pigmentos que impedan una adecuada se-
paracin de los picos, por lo que fue nece-
sario realizar una segunda purificacin de
los extractos mediante cartuchos de 1 g de
FIG. 3. Cromatograma de una muestra de jugo de manzana con- silicagel. El extracto se pas por columna
taminada con 3 g/L. disuelto en 2 mL de tolueno. La patulina
fue eluida con una mezcla tolueno-acetato
na contaminada con 33 g/L, donde se ob- de etilo 70:30. Despus de evaporar el sol-
serva una buena resolucin entre los picos vente, se reconstruyeron las muestras en
del hidroximetilfurfural (contaminante na- 600 L de fase mvil. Los lmites de detec-
tural de las frutas), la patulina y otras cin y cuantificacin establecidos para es-
interferencias provenientes de la matriz y tos casos fueron de 3,45 y 10,4 g/L res-
los solventes, con una repetibilidad de pectivamente.
3,12 g/L y un coeficiente de variacin del
5,33 %.
En la tabla aparecen los recobrados de DISCUSIN
las muestras de jugo de manzana contami-
nadas con patulina en recorrido entre 21,16 a El tiempo de retencin de la patulina
103,26 g/L. Los valores de recuperacin se retras debido a cambios en la composi-
media se encontraron entre 81,09 y 83,54 %, cin de la fase mvil dados por la evapora-
con un coeficiente de variacin mximo del cin del acetonitrilo al ser sometido a la
3,49 %. Entre las medias de los 3 niveles desgasificacin, lo cual se resolvi ajustan-
de contaminacin, no hubo diferencias sig- do la concentracin de dicha fase.
nificativas, establecindose un recobrado El mtodo validado muestra mejor
medio 82,51 %, una desviacin tpica de precisin que el informado en otro estudio
2,74 y un coeficiente de variacin de 3,33 %. (8,6 %) que utiliz una muestra de jugo de

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 TABLA: Recobrados de patulina en jugo de manzana

Niveles de contaminacin
Parmetros 103,26 g/L 51,63 g/L 21,16 g/L

Valor medio (g/L) 85,71 42,81 17,16

Porcentaje de
recuperacin 83,54 82,91 81,09
DE 1,96 2,89 1,78
CV (%) 2,36 3,49 2,19

manzana contaminada con 30 g/L de prdidas fueron observadas cuando la eva-

patulina, determinada por HPLC con de- poracin del solvente llegaba a sequedad
tector de arreglo de diodo.9 en un evaporador rotatorio, siendo ms con-
Dicho mtodo present porcentajes de veniente una segunda etapa de secado bajo
recuperacin similares a los informados por corriente de nitrgeno. Estas 2 afectacio-
otros autores,3,4,6 que incluyen la cromato- nes en el recobrado se establecieron como
grafa en capa fina. Recuperaciones entre 90 y los puntos crticos de control del mtodo.
101 % aparecen en la literatura, pero con Para determinar patulina en jugos y
coeficientes de variacin ms elevados.9-11
pur de frutas, el mtodo descrito es rpi-
El lmite de cuantificacin es similar
do, simple, sensible, confiable y adecuado.
al del mtodo oficial suizo1 y est por de-
bajo del mtodo oficial francs1 que utiliza Se recomienda que para procesar 10 muestras
en la purificacin columnas de silicagel. de jugo o pur se realice en paralelo 1
En las muestras contaminadas de ju- blanco y 2 duplicados de una muestra con-
gos y purs que permanecieron un tiempo taminada con un nivel de 50 g/L de
mayor de 2 min en contacto con la solucin patulina, cuyos recobrados deben encontrar-
de carbonato de sodio, se presentaron reco- se entre 79 y 85 % con un coeficiente de
brados con valores entre 50 y 60 %. Otras variacin entre los duplicados menor del 5 %.

SUMMARY
The method used by the Association of Official Analytical Chemists (AOAC) for the determination of patulin
in apple juice by high pressure liquid chromatography (HPLC) with an ultraviolet detector at 275 nm and a RP18
column for apple juice and fruit puree was validated. 10 % acetonitrile-water mixture with a flow velocity of
2.7 mL/min. was used as a mobile phase. Patulin presented a time of retention of 14.8 0.3 min. The
regression equation was Y = 1952.5X + 1673.5 and the coefficient of lineal correlation was 0.9991. It was
obtained a mean recovery of 82.51 % and a variation coefficient of 3.33 % for the tested contamination levels.
The repeatability of a contaminated sample with 33 g/L of patulin was 3.l2 g/L. A limit of detection
of 1.72 g/L and a limit of quantification of 5.2 g/L were established for juices. The fruit purees were
previously diluted and centrifuged. An additional purification per column was proposed for mango. An internal
quality control was designed for processing samples.

Subject headings: PATULIN; CHROMATOGRAPHY, HIGH PRESSURE LIQUID; REGRESSION ANALYSIS.

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Recibido: 24 de octubre del 2000. Aprobado: 28 de noviembre del 2000.

Lic. Eyda Otero Fernndez-Trevejo. Instituto de Nutricin e Higiene de los Alimentos. Infanta No. 1158, munici-
pio Centro Habana, Ciudad de La Habana 10300, Cuba.

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